EP1141341A1 - Construction d'acides nucleiques recombinants circularises au moyen d'agents compactant l'adn - Google Patents

Construction d'acides nucleiques recombinants circularises au moyen d'agents compactant l'adn

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Publication number
EP1141341A1
EP1141341A1 EP00900521A EP00900521A EP1141341A1 EP 1141341 A1 EP1141341 A1 EP 1141341A1 EP 00900521 A EP00900521 A EP 00900521A EP 00900521 A EP00900521 A EP 00900521A EP 1141341 A1 EP1141341 A1 EP 1141341A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
vector
insert
ligation
recombinant nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00900521A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michèle AMOUYAL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1141341A1 publication Critical patent/EP1141341A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Definitions

  • the present invention relates to the construction of circularized recombinant nucleic acids, of the type consisting of a vector and an insert which may be of a size greater than a few kilobases.
  • the invention also relates to the process for the preparation of such constructs and the kits for their implementation, as well as the recombinant nucleic acids which can be obtained by this process.
  • DNA vectors intended to be transferred into prokaryotic or eukaryotic cells is aimed at any in vitro and in vivo use of these sequences, such as the analysis of the biological effects of the DNA sequence (effect of DNA or its expression ), RNA expression, protein expression, amplification of hybridization probes for medical diagnosis, cell therapy or gene therapy, vaccination, etc.
  • a recombinant vector consisting of inserting a DNA fragment into a vector, goes through a step of reclosing the vector in vi tro.
  • the ends of the finalized vector must be close to each other. These ends move within a sphere of radius equal to the length of the fragment and having for center one of the ends. This volume is all the greater the larger the size of the finalized vector. Consequently, the probability of meeting the two ends decreases with the length of the finalized vector.
  • the insertion of the fragment into the vector it will be done if the probability of meeting between the ends of the insert and those of the original vector is high. The insertion therefore depends on the concentration at the ends.
  • the proportion of products inserted and cyclized depends on the length of the vector finalized for the intramolecular process of reclosing, and on the total concentration of free ends, as regards the intermolecular process of ligation.
  • the very first generation vectors are vectors of bacterial origin, derived from plasmids. Other vectors take more specific account of the specificities of eukaryotic genes, in particular their size. This is the case of cosmids, hybrid compounds of phage ⁇ and plasmids replicating in E. Coli, and YACs whose host organism is yeast.
  • the cosmids allow insertion up to 45 kb, the YACs up to 10000 kb. These vectors are intended for the analysis of genomic DNA libraries or for chromosomal analysis. Their effectiveness is linked to the range of different fragments that they can accommodate. They would be of heavy use if it was a question of inserting there only one precise fragment and of amplifying it. Thus, to preserve their stability, the insertion vector must keep a minimum size (33kb for the cosmids, 150kb for the YACs).
  • the manipulation of such lengths of DNA involves many difficulties (breaks, shearing, etc.), while the sequence considered is frequently of smaller size, reaching only a few kb when the complementary DNA is preferred to the Genomic DNA.
  • replication in E. coli large vectors such as cosmids, as well as the stability of YACs in yeast are limited, which leads to sequence rearrangements. For cosmids, the efficiency of DNA packaging and phage ⁇ infection offsets this drawback to some extent.
  • Another insertion technique consists in using adjuvants of a chemical nature, such as polyethylene glycol (Zi merman SB and Pheiffer BH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5852 (1983), or even chloride of Hexamine cobalt (Maniatis et al., Molecular cloning / a laboratory manual, second edition, 1989) for blunt-end ligations, which are less easy than their cohesive-end counterparts, and require higher DNA and ligase concentrations.
  • the purpose of these chemical adjuvants is to promote aggregation between insert and vector (intermolecular reaction), and to decrease the concentrations of DNA and ligase, and they are not intended for the construction of large vectors.
  • large vector should be understood to mean a vector of at least 10 kb, in which an insert of several kilobases is integrated.
  • Cosmides and YAC meet analytical needs and are looking for the widest possible range of insertion of DNA banks.
  • Ligation aids currently used, are never proteins naturally designed to condense DNA and this is not to promote the insertion of large fragments and the reclosing of the recombinant.
  • the object of the present invention is to facilitate the circularization and the preparation of more particularly large vectors.
  • one of the advantages of the invention lies in the field of cloning which generally includes a prior stage of cyclization of the recombinant in vitro.
  • the efficiency of cyclization depends on the size of the recombinant, and is improved by compaction of the DNA.
  • vector construction goes through a step of closing this vector in vitro. The effectiveness of this closure depends on the size of the DNA fragment.
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of circularized recombinant nucleic acids, of the type consisting of a vector and an insert, characterized in that: a) the ligation of the insert and of the vector is carried out in the presence of a DNA compaction agent, and b) the recombinant nucleic acids consisting of the vector and the insert are selected by any suitable means.
  • an application of the method of the invention is the cloning of an insert in a vector under the conditions defined above, allowing advantageously to obtain a large recombinant vector.
  • the process of the invention is very particularly suitable for the preparation of circularized recombinant nucleic acids of moderate size or of large size. That is to say of a size greater than a few kb, preferably greater than 5 kb and most preferably greater than 8 or 10 kb.
  • step (b) the term “appropriate means of selection” should be understood to mean the transfer of the products of the ligation into a cell medium suitable for cloning DNA, for example e. Coli or yeast, in the presence of an antibiotic, such as picillin or tetracycline, if the vector carries a gene for resistance to an antibiotic, and a test for the presence of the insert, for example in the case of the lacZ control gene, hydrolysis of the X-gal compound by the ⁇ -galactosidase produced.
  • a cell medium suitable for cloning DNA for example e. Coli or yeast
  • an antibiotic such as picillin or tetracycline
  • the step does not necessarily include a specific test for the presence of the insert, the insertion being able to be verified by DNA sequencing after obtaining the vectors by the method of the invention.
  • Histones are the most abundant proteins in the nucleus; they are small (11 to 25 kDa) and have a very basic character (pH> 10). There are five types of Histones called respectively Hl, H2A, H2B, H3 and H4, and these five types are found with variants in all eukaryotes (except Hl which does not seem to exist in yeast, and which is replaced by histone H5 in some organisms). In vivo, H2a, H2b, H3 and H4 assemble in the form of an octamer. DNA wraps twice around the octameric heart to form a nucleosomal structure.
  • the histone Hl is not part of this nucleus, but serves to lock the DNA around the octamer.
  • the compaction of DNA by histones would have in particular the effect of bringing together two distant transcriptional regulation sites on the chromosome, and of allowing the formation of a chromatin loop by direct interaction between these sites.
  • the expression of a gene can thus be controlled remotely from these genes (Amouyal, Biochimie (1991), 73, p.1261-1268).
  • the ligation of the insert and the original vector is carried out in the presence of products compacting the DNA.
  • the insertion vector contains an origin of replication and advantageously a selection gene, for growth and selection in the cell type considered.
  • DNA compaction agents are proteins, protein mixtures, or protein derivatives. By the term proteins, we mean natural and synthetic proteins.
  • the DNA compacting products are proteins or any agent having the same properties, and more particularly histone proteins or related proteins.
  • the DNA compaction agent can be chosen from all the proteins known to compact DNA, in particular viral or phage envelope proteins, proteins of the bacterial chromoid.
  • the DNA compaction agent is chosen from histones, viral or phage envelope proteins, proteins of the bacterial chromoid (HU, H-NS, etc.), non-histone chromosomal proteins, HMGs, any mixture of these compounds, or any derivatives thereof. or a mixture of said condensing agents.
  • the DNA compaction agent is a mixture of histones.
  • the inventor has shown that a mixture of histones or one histone in isolation leads to similar results.
  • the histone H1 of different structure, and not being a histone forming the octamer, but rather a locking histone, used in isolation does not seem to bring as good results as the other histones. This is explained because H1, because of its different structure, does not bind to linear DNA, but preferably binds to superwound DNA (Van Holde et al., Biophysical journal, 1997, 72,. 1388-1395).
  • the compaction agents are added to the ligation medium.
  • This medium comprises the DNA in solution in the ligation buffer. Ligation is ensured by adding a ligation enzyme to the ligation medium.
  • the ligase used is E. Coli T4 DNA Ligase.
  • a characteristic of the invention lies in the concentration (C) of compaction agents present in the ligation medium.
  • This concentration (C) of compaction agent is determined so as not to cause stiffening of the DNA. If this happened, the DNA could not bend, there could be no contact between the ends of the finalized vector, and ligation would be prevented.
  • the amount of compaction agent is defined by calculation and tested by retardation gel, so as not to saturate a DNA-control fragment with proteins.
  • This concentration (C) can be expressed in mg of proteins per nanogram of total DNA contained in the ligation mixture and per base pair of recombinant. It depends on the length of DNA to be ligated, and the inventor has defined several laws, corresponding to each of the protein agents used: Thus for the natural mixture of Sigma histones,
  • (C) 10 "x mg / ng DNA / bp in which x is between 8 and 15. The value x depends on the nature of the compaction agent used.
  • the efficiency of cloning is always improved if the concentration is in a interval framing the value thus defined from 20 to 1000%, and preferably between 33 to 200%.
  • Y varies between 0.2 and 10, preferably between 0.33 and 2.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method for the preparation of large recombinant nucleic acids circularized as defined above.
  • This kit includes the following reagents:
  • preferential compaction agent it will be used either a mixture of histones, an isolated histone.
  • Another characteristic of the invention relates to the parameters for implementing the method and the kit which are the subject of the invention.
  • the ligation is carried out under the usual conditions, with the following modifications.
  • the protein agent Prior to ligation, the protein agent is dissolved in the ligation buffer, whether or not containing glycerol (or diluted in the ligation medium, if it is provided in the form of a solution). It is incorporated into the ligation medium in the proportions defined by the law indicated above.
  • the kit comprises a stabilizing agent incorporated into the ligation medium at the same time as the protein, and intended to prevent denaturation, aggregation and / or adsorption of the protein on the walls of the reaction tube to these strong dilutions.
  • a kit according to the invention therefore comprises:
  • this dilution buffer is glycerol or any compound having the same characteristics.
  • a preferred kit according to the present invention comprises:
  • the stabilizing agent if present, is glycerol.
  • the invention also relates to the recombinants, preferably large, capable of being obtained by the method described above.
  • a recombinant can consist of a vector containing an origin of replication, optionally a selection gene, the insert possibly associated with an indicator gene making it possible to reveal the presence of the insert such as the ⁇ -galactosidase gene or a gene. Selection.
  • the invention finds applications of course in the field of cloning, but also in the field of gene therapy and in particular in the field of gene vaccination.
  • the invention relates more particularly to a large circularized recombinant nucleic acid greater than a few kilobases consisting of a vector and an insert.
  • said insert comprises one or more cDNAs coding for one or more proteins necessary for the correction of a genetic deficiency, placed under the control of the sequences allowing their in vivo expression.
  • said insert comprises one or more DNA coding for one or more antigens, placed under the control of the sequences allowing their expression in vivo. More particularly, said insert comprises one or more and preferably all of the DNA sequences coding for the antigens capable of inducing an immune reaction.
  • the vector is a non-viral vector, while possibly containing viral elements.
  • Other advantages and characteristics of the invention will appear on reading the following examples, given without limitation, and relating to the construction of a large recombinant by means of proteins compacting DNA, and to its cloning in E Coli and which refer to the annexed drawings in which:
  • FIG. 1 represents the complexation of the protein to the fR4 fragment under the ligation conditions, followed by delaying the electrophoretic migration of the fragment in 0.4% agarose gel.
  • FIG. 2 represents the digestion by EcoRI of the three R4-LZ recombinants with insert obtained in test 11.
  • FIG. 3 represents the digestion with EcoRI of 6 of the 20 K-LZ recombinants (example lb).
  • FIG. 4 represents the increase in the quantity of ligation products in the presence of histones, 0.4% agarose gel.
  • FIG. 5 represents the test for sensitivity to nucleases possibly present in the preparation of histones
  • EXAMPLE 1 LIGATION IN THE PRESENCE OF A MIXTURE OF HISTONES, SELECTION AND AMPLIFICATION OF THE LIGATION PRODUCTS BY E.COLI.
  • This first R4-LZ recombinant with a size of 12034 base pairs is derived from the ligation of two fragments fR4 and fLZ.
  • This fragment is derived from the plasmid pREP4 (invitrogen) by complete digestion of the plasmid of 10183pb with the restriction enzymes SalI (positions 7 and 1091) and Spel (unique site at 9250).
  • the fragments obtained by digestion have respective sizes of 8159, 1084 and 940 bp.
  • the 8159pb fragment contains the origin of replication colEl and the ampicillin resistance gene of E. coli. It is separated from the other fragments by electrophoretic migration on a low melting point agarose gel (Seaplaque LMP agarose FMC Bioproducts), excision and extraction of the corresponding band.
  • fLZ This fragment is derived from a plasmid of 6206pb containing the lacZ gene under the control of an E promoter.
  • coli construction derived from the plasmid pUT79 from the company Cayla,doch).
  • the two fragments fR4 and fLZ are mixed in the proportions indicated subsequently in 20 ⁇ l of ligation buffer for the T4 DNA ligase of E. coli. These ligation conditions are close to those conventionally used (see Current Protocols and Maniatis).
  • the protein is added to the mixture of fragments, at the desired concentration.
  • the T4 DNA ligase is added after incubation over a period of between 0 to 20 minutes, and more particularly between 3 and 5 minutes.
  • the DH5a strain is a strain deficient in RecAl protein, which does not promote recombination and rearrangement of DNA within the cell
  • the strain is transformed with 10 ⁇ l of the ligation mixture according to a variant of the Hanahan method (J.
  • Histone concentration A first value for the histone concentration was determined by calculating the quantity of the natural mixture of histones assumed to be necessary for the formation of a nucleosome every 200 base pairs, and by deliberately choosing to take only part of the amount of protein thus determined (a quarter in this example) to avoid saturation of the protein fragment. The resulting law is as follows:
  • Each ligation was carried out in the presence of 3 protein concentrations, the quantity deriving from this law, and two quantities framing it at 50% and 200%.
  • Lane 5 Fragment fR4 + 0.2 ⁇ g of protein
  • the ligations take place at the three corresponding concentrations.
  • the first tests for obtaining a recombinant whose sequence has not undergone rearrangement is the resistance to ampicillin conferred on the cell and its capacity to express b-galactosidase (blue colonies in the presence of X- gal)
  • E. coli The transformation of E. coli was carried out with the ligation mixture containing only one of the two fragments, in the presence or absence of histones, to confirm the electrophoretic purity of the fragments and the absence of reclosure within the cell.
  • a delay gel was made on the fR4 fragment before each ligation with this fragment to monitor the complexation of DNA by the protein. The separation is done on standard agarose gel of 0.4%. This gel is carried out under the same conditions as the ligation experiments, in 20 ⁇ l deposited on gel and is shown in FIG. 4, in which:
  • Lane 1 ligation mixture (recombinant R4- LZ) without histones (fragments fR4-8159pb- and fLZ- 3875pb) arrowed)
  • the first 13 tests were carried out on the basis of the amount of protein determined by retardation gel from the complexation of the single fR4 fragment, instead of the law resulting from these experiments.
  • the size (8159bp) of the fR4 fragment represents only 2/3 of the total size of the recombinant.
  • the law is only followed by two thirds (law 2/3).
  • the most recent tests, which are also the most efficient were carried out taking into account the amount of protein (1/3 more) that had to be added to complex the entire vector and the insert in the same way as the single fragment.
  • lacZ inserts were tested by the capacity of the selected colony, to hydrolyze the X-gal compound (blue coloration) and by obtaining a correct enzyme cleavage profile (EcoRI test) as detailed in the legend.
  • Figure 2 The presence of lacZ inserts was tested by the capacity of the selected colony, to hydrolyze the X-gal compound (blue coloration) and by obtaining a correct enzyme cleavage profile (EcoRI test) as detailed in the legend. Figure 2.
  • Test 2 dilution of the protein from a stock solution of 100 mg / ml in the dilution buffer containing 50% glycerol, stored at -20 ° C, to test the effect of storage. For all other tests, the protein solution was freshly prepared from the lyophilized powder.
  • fragment fR4 150ng fragment fLZ: 190ng (3 times more molecules fLZ than molecules fR4, lO ⁇ l)
  • Test 4 was carried out with 20 ⁇ l of ligation mixture. After addition of the ligase, half of the mixture was frozen at -20 ° C for further processing (test 4 '). Freezing does not appear to affect the efficacy of histones.
  • Glycerol is usually added to the storage buffer, as above, to prevent denaturation and aggregation of proteins during successive freeze-thaw cycles.
  • the protein dilution buffer (ligation buffer) was added 0.1% glycerol to prevent aggregation or the denaturation of the protein as soon as it is dissolved, as well as to avoid losing the protein on the walls of the tube in the final dilutions.
  • the glycerol was added late (after the first series of ligation of test 11, that is to say after ten minutes).
  • kits may include (whatever the protein used) a dilution buffer including glycerol (or any other agent having the same properties) as well as a dilution buffer without glycerol (which is also the ligation buffer ).
  • the example shows it as much the cloning of an insert of 3875bp in a vector of 8159pb as the cloning of a fragment of 8159pb in a vector of 3875pb.
  • Example 1b Cloning of a fragment of 6785 bp.
  • This fragment is derived from the digestion of the plasmid pBlueScript KS (Stratagene) by Spel and Sali. It contains an origin of replication for E. coli and resistance to ampicillin from E. coli.
  • Example le Reclosure of a fragment of 8159 bp.
  • Test 2 was carried out with 150 ng of fragment fR4 instead of 370 ng for test 1 and 10 ⁇ l of ligation medium. The protein was solubilized in the presence of glycerol in test 1, without glycerol in test 2.
  • EXAMPLE 2 LIGATION IN THE PRESENCE OF ISOLATED HISTONES AND CLONING OF THE RECOMBINANT OF 12034 bp FROM E. COLI.
  • the two histones which have been used are the histone H1 of calf thymus (type III-SS, ref. H4524, Sigma) and the histone H2b of calf thymus (type VII-S, ref. H4255, Sigma).
  • Tests 1, 2, 3 quantity of histone Hl equivalent in moles to the quantity of histone Hl present in the mixture (tests 1 and 2, law 2/3, test 3: exact law) - Tests 4 and 5: amount of H1 histones equivalent in moles to the total amount of histones present in the natural mixture, replacing the other histones Test 5: quantity of DNA 5 times less than in the other tests
  • Tests 1 'and 2' with glycerol, 2/3 law Tests l ', 2' and 3 'were carried out in parallel with tests 1, 2 and 3 carried out in the presence of the protein Hl (same preparation of DNA, buffer, and culture dishes) and in parallel with test 14 with the mixture of histones).
  • histone H2b alone increases the cloning efficiency.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour la préparation d'acides nucléiques recombinants circularisés, du type constitués d'un vecteur et d'un insert pouvant être d'une taille supérieure à quelque kilobases. L'invention concerne également les kits pour la préparation desdits acides nucléiques ainsi que les acides nucléiques recombinants susceptibles d'être obtenus par ce procédé.

Description

CONSTRUCTION D'ACIDES NUCLEIQUES RECOMBINANTS CIRCULARISES AU MOYEN D'GENTS COMPACTANT L'ADN
La présente invention est relative à la construction d'acides nucléiques recombinants circularisés , du type constitués d'un vecteur et d'un insert pouvant être d'une taille supérieure à quelque kilobases.
L'invention concerne aussi le procédé de préparation de telles constructions et les kits pour leur mise en œuvre, ainsi que les acides nucléiques recombinants susceptibles d'être obtenus par ce procédé.
La construction des vecteurs ADN destinés à être transférés dans les cellules procaryotes ou eucaryotes, vise toute utilisation in vi tro et in vivo de ces séquences, comme l'analyse des effets biologiques de la séquence ADN (effet de l'ADN ou de son expression), expression d'ARN, expression de protéines, amplification de sondes d'hybridation pour le diagnostic médical, thérapie cellulaire ou thérapie génique, vaccination, etc....
La construction de vecteur recombinant, consistant à insérer un fragment d'ADN dans un vecteur, passe par une étape de refermeture du vecteur in vi tro . Pour qu'il y ait refermeture, les extrémités du vecteur finalisé doivent être proches l'une de l'autre. Ces extrémités se déplacent au sein d'une sphère de rayon égal à la longueur du fragment et ayant pour centre l'une des extrémités. Ce volume est d'autant plus grand que la taille du vecteur finalisé est élevée. Par conséquent, la probabilité de rencontre des deux extrémités décroit avec la longueur du vecteur finalisé. Quant à l'insertion du fragment dans le vecteur, elle se fera si la probabilité de rencontre entre les extrémités de l' insert et celles du vecteur d'origine est élevée. L'insertion dépend donc de la concentration en extrémités .
En d'autres termes, la proportion de produits insérés et cyclisés dépend de la longueur du vecteur finalisé pour le processus intramoléculaire de refermeture, et de la concentration totale en extrémités libres, pour ce qui concerne le processus intermoléculaire de ligation.
Les vecteurs de toute première génération sont des vecteurs d'origine bactérienne, dérivés de plasmides. D'autres vecteurs tiennent compte plus précisément des spécificités des gènes eucaryotes, en particulier de leur taille. C'est le cas des cosmides, composés hybrides de phage λ et de plasmides se répliquant dans E. Coli, et des YAC dont l'organisme hôte est la levure.
Les cosmides permettent l'insertion jusqu'à 45 kb, les YAC jusqu'à lOOOkb. Ces vecteurs sont destinés à l'analyse des banques d'ADN génomique ou à l'analyse chromosomique. Leur efficacité est liée à l'éventail de fragments différents qu'ils peuvent accueillir. Ils seraient d'un emploi lourd s'il s'agissait de n'y insérer qu'un fragment précis et de l'amplifier. Ainsi, pour préserver leur stabilité, le vecteur d'insertion doit conserver une taille minimale (33kb pour les cosmides, 150kb pour les YAC) . Or, la manipulation de telles longueurs d'ADN comporte de nombreuses difficultés (cassures, cisaillement, etc.), alors que la séquence considérée est fréquemment de taille inférieure, n'atteignant que quelques kb lorsque l'ADN complémentaire est préféré à l'ADN génomique. En outre, la réplication dans E. Coli de vecteurs de taille importante tels que les cosmides, ainsi que la stabilité des YAC dans la levure, sont limitées, ce qui conduit à des remaniements de séquence. Pour les cosmides, l'efficacité de l'empaquetage de l'ADN et de l'infection par le phage λ compense cet inconvénient dans une certaine mesure.
Une autre technique d'insertion consiste à utiliser des adjuvants de nature chimique, tel le polyéthylène glycol (Zi merman S.B. and Pheiffer B. H., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 80, 5852 (1983), ou encore le chloride d'Hexamine cobalt (Maniatis et al., molecular cloning / a laboratory manual , second édition, 1989) pour les ligations à bouts francs. Ces ligations sont moins aisées que leurs homologues à bouts cohésifs, et exigent des concentrations en ADN et ligase plus élevées . Ces adjuvants chimiques ont pour but de favoriser 1 ' aggrégation entre insert et vecteur (réaction intermoléculaire) , et de diminuer les concentrations en ADN et ligase, et ils ne s'adressent pas à la construction de vecteurs de grande taille .
A ce jour, il n'existe pas de technique permettant de faciliter la circularisation et la préparation de vecteurs valable aussi bien pour les tailles modérées, quelques milliers de paires de bases, que pour des tailles plus importantes, au dessus de 10 kb.
Par vecteur de grande taille, il faut entendre un vecteur d'au moins 10 kb, dans lequel est intégré un insert de plusieurs kilobases.
Cosmides et YAC répondent à des besoins d'analyse et recherchent un éventail d'insertion aussi large que possible des banques d'ADN. Les adjuvants à la ligation, actuellement employés, ne sont jamais des protéines naturellement conçues pour condenser l'ADN et il ne s'agit pas de favoriser l'insertion de fragments de grande taille et la refermeture du recombinant.
La présente invention a pour but de faciliter la circularisation et la préparation de vecteurs plus particulièrement de grande taille.
Dans la méthode selon la présente invention, c'est la présence de protéine de compaction lors de la ligation qui augmente le taux de produits de ligation et la probabilité d'amplifier le produit correct.
En effet, un des intérêt de l'invention réside dans le domaine du clonage qui comporte généralement une étape préalable de cyclisation du recombinant in vitro. L'efficacité de la cyclisation dépend de la taille du recombinant, et est améliorée par la compaction de l'ADN. En effet, la construction de vecteur passe par une étape de fermeture de ce vecteur in vitro. L'efficacité de cette fermeture dépend de la taille du fragment d'ADN.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'acides nucléiques recombinants circularisés, du type constitués d'un vecteur et d'un insert caractérisé en ce que : a) on réalise la ligation de 1 ' insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN, et b) on sélectionne par tout moyen approprié les acides nucléiques recombinants constitués du vecteur et de 1' insert.
Ainsi, une application du procédé de l'invention est le clonage d'un insert dans un vecteur dans les conditions définies ci-dessus, permettant avantageusement d'obtenir un vecteur recombinant de grande taille .
Le procédé de l'invention est tout particulièrement adapté à la préparation d'acides nucléiques recombinants circularises de taille modérée ou de grande taille. C'est à dire d'une taille supérieure à quelques kb, de préférence supérieure à 5 kb et tout préférenciellement supérieure à 8 ou 10 kb .
Lors de l'étape (b) , il faut entendre par moyen approprié de sélection, le transfert des produits de la ligation dans un milieu cellulaire approprié au clonage de l'ADN, par exemple e . Coli ou la levure, en présence d'un antibiotique, comme 1 ' a picilline ou la tetracycline, si le vecteur porte un gène de résistance à un antibiotique, et un test pour la présence de l' insert, par exemple, dans le cas du gène-témoin lacZ, l'hydrolyse du composé X-gal par la β-galactosidase produite.
Mais tout autre moyen de sélection, en particulier ceux adaptés à la production d'ADN aux normes pharmaceutiques pour la thérapie génique ou cellulaire, peut être utilisé. De même, l'étape ne comporte pas nécessairement de test spécifique pour la présence de 1' insert, l'insertion pouvant être vérifiée par séquençage de l'ADN après obtention des vecteurs par le procédé de 1 ' invention.
Les histones sont les protéines les plus abondantes du noyau ; elles sont de petite taille (11 à 25 kDa) et possèdent un caractère très basique (pH>10) . Il existe cinq types d'Histones appelés respectivement Hl , H2A, H2B, H3 et H4 , et ces cinq types se retrouvent avec des variantes chez tous les eucaryotes (excepté Hl qui ne semble pas exister chez la levure, et qui est remplacé par l'histone H5 dans certains organismes). In vivo, H2a, H2b, H3 et H4 s'assemble sous forme d'octamère. L'ADN s'enroule deux fois autour du cœur octamérique pour former une structure nucléosomique . L'histone Hl ne fait pas partie de ce noyau, mais sert à verrouiller l'ADN autour de l'octamère. Dans la cellule eucaryote, la compaction de l'ADN par les histones aurait notamment pour effet de rapprocher deux sites de régulation transcriptionnelle éloignés sur le chromosome, et de permettre la formation d'une boucle de chromatine par interaction directe entre ces sites. L'expression d'un gène peut ainsi être commandée à distance de ces gènes (Amouyal, Biochimie (1991), 73, p.1261-1268) .
Selon l'invention, la ligation de 1 ' insert et du vecteur d'origine est effectuée en présence de produits compactant l'ADN. Le vecteur d'insertion contient une origine de réplication et avantageusement un gène de sélection, pour la croissance et la sélection dans le type cellulaire considéré.
Les agents de compaction de l'ADN sont des protéines, des mélanges de protéines, ou des dérivés des protéines. Par le terme protéines, il faut entendre protéines naturelles et synthétiques. Les produits compactant l'ADN sont des protéines ou tout agent présentant les mêmes propriétés, et plus particulièrement des protéines histones ou protéines apparentées. Outre les histones, l'agent de compaction de l'ADN peut être choisi parmi toutes les protéines connues pour compacter l'ADN, notamment les protéines d'enveloppe virales ou de phages, les protéines du chromoïde bactérien
(HU, H-NS, etc.), les protéines chromosomales non histone, les HMG, etc., tout mélange de ces composés, ou tout dérivés de ceux-ci. Par conséquent, pour l'étape (a) du procédé selon l'invention, l'agent de compaction de l'ADN est choisi parmi les histones, les protéines d'enveloppe virales ou de phages, les protéines du chromoïde bactérien (HU, H-NS, etc.), les protéines chromosomales non histone, les HMG, tout mélange de ces composés, ou tous dérivés de ceux-ci . ou un mélange desdits agents de condensation.
De manière préférentielle, l'agent de compaction de l'ADN est un mélange d' histones.
L'Inventeur a démontré qu'un mélange d'histones ou une histone isolément conduisaient à des résultats analogues. L'histone Hl , de structure différente, et n'étant pas une histone formant l'octamère, mais plutôt une histone de verrouillage, utilisé isolément ne semble pas apporter d'aussi bons résultats que les autres histones . Ceci s'explique car Hl , du fait de sa structure différente, ne se fixe pas sur l'ADN linéaire, mais se fixe de préférence sur de l'ADN superenroulé (Van Holde et al., Biophysical journal, 1997, 72, .1388-1395) .
Dans un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les agents de compaction sont ajouté au milieu de ligation. Ce milieu comprend l'ADN en solution dans le tampon de ligation. La ligation est assurée par addition d'une enzyme de ligation au milieu de ligation. De manière préférée, mais non limitative, la ligase utilisée est la E. Coli T4 DNA Ligase. Une caractéristique de l'invention réside dans la concentration (C) d'agents de compaction présents dans le milieu de ligation.
Cette concentration (C) en agent de compaction est déterminée de façon à ne pas entraîner une rigidification de l'ADN. Si cela se produisait, l'ADN ne pourrait se courber, il ne pourrait y avoir contact entre les extrémités du vecteur finalisé, et la ligation serait empêchée . Pour une protéine ou un mélange de protéines donné, la quantité d'agent de compaction est définie par calcul et testé par gel de retardement, de manière à ne pas saturer un fragment d'ADN-témoin en protéines.
Cette concentration (C) peut être exprimée en mg de protéines par nanogramme d'ADN total contenu dans le mélange de ligation et par paire de base de recombinant. Elle dépend de la longueur d'ADN à liguer, et l'Inventeur a défini plusieurs lois, correspondant à chacun des agents protéiques employés : Ainsi pour le mélange naturel d' histones Sigma,
(C) = 1,5.10-11 mg/ng ADN/pb pour l'histone H2b Sigma, (C) = 1,5.10~12 mg/ng ADN/pb
Par extrapolation, l'Inventeur a défini la loi suivante qui peut s'appliquer à toutes les protéines compactantes utilisées :
(C) = 10"x mg/ng ADN/pb dans laquelle x est compris entre 8 et 15. La valeure x est fonction de la nature de l'agent de compaction utilisé.
Pratiquement, l'efficacité du clonage est toujours améliorée si la concentration se trouve dans un intervalle encadrant la valeur ainsi définie de 20 à 1000 %, et de manière préférée entre 33 à 200 %.
Le procédé selon la présente invention se caractérise donc en ce que la concentration (C) en agent de compaction est déterminée par la loi suivante : (C) = ( 10~x mg/ng ADN/pb ) X Y dans laquelle : x est compris entre 8 et 15, et de préférence entre 10 et 12 , et
Y varie entre 0,2 et 10, de préférence entre 0,33 et 2.
La présente invention est aussi relative à un kit pour la mise en œuvre de la méthode de préparation d'acides nucléiques recombinants de grande taille circularise telle que définie auparavant. Ce kit comprend les réactifs suivants :
- un tampon de ligation,
- une ligase, - un agent de compaction défini précédemment.
Comme agent préférentiel de compaction, il sera utilisé soit un mélange d'histones, une histone isolée.
Une autre caractéristique de l'invention concerne les paramètres de mise en œuvre de la méthode et du kit objet de l'invention. La ligation est conduite dans les conditions usuelles, avec les modifications suivantes.
Les conditions usuelles dépendent de la ligase employée et des indications fournies par la société commercialisant l'enzyme. Pour la T4 DNA ligase commercialisée par NEB Biolabs, la ligase est employée avec un tampon :
5mM Tris-Hcl ImM MgCl2 litiM DTT 0,1 m ATP 2,5μg/ml BSA
Préalablement à la ligation, l'agent protéique est mis en solution dans le tampon de ligation contenant ou non du glycerol (ou dilué dans le milieu de ligation, s'il est fourni sous forme de solution) . Il est incorporé dans le milieu de ligation dans les proportions définies par la loi indiquée auparavant.
De façon préférentielle, le kit comprend un agent stabilisant incorporé au milieu de ligation en même temps que la protéine, et destiné à empêcher la dénaturation, l'agrégation et/ou l'adsorption de la protéine sur les parois du tube reactionnel à ces fortes dilutions. Un kit selon l'invention comprend donc :
- un tampon de ligation,
- une ligase, - un agent de compaction,
- éventuellement un agent stabilisant pour la protéine .
De manière privilégiée , ce tampon de dilution est le glycerol ou tout composé présentant les mêmes caractéristiques .
Un kit préféré selon la présente invention comprend :
- la ligase est la E. Coli T4 ligase , - le tampon de ligation correspondant ,
- une ou plus ieurs histones comme agent de compaction,
- l ' agent stabilisant , s ' il est présent , est du glycerol . L'invention concerne aussi les recombinants, de préférence grande taille, susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus. Un tel recombinant peut être constitué par un vecteur contenant une origine de réplication, éventuellement un gène de sélection, 1 ' insert éventuellement associé à un gène indicateur permettant de révéler la présence de 1 ' insert comme le gène de la β- galactosidase ou un gène de sélection.
L'invention trouve des applications bien entendu en matière de clonage, mais aussi dans le domaine de la thérapie génique et notamment en matière de vaccination génique. Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique recombinant circularise de grande taille supérieure à quelques kilobases constitué d'un vecteur et d'un insert. Dans une première forme de réalisation de l'invention destinée à la thérapie génique, ledit insert comprend un ou plusieurs ADNc codant pour une ou plusieurs protéines nécessaires à la correction d'une déficience génétique, placé (s) sous le contrôle des séquences permettant leur expression in vivo .
Dans une seconde forme de réalisation de l'invention destinée à la vaccination génique, ledit insert comprend un ou plusieurs ADN codant pour un ou plusieurs antigènes, placé(s) sous le contrôle des séquences permettant leur expression in vivo . Plus particulièrement, ledit insert comprend une ou plusieurs et de préférence la totalité des séquences d'ADN codant pour les antigènes susceptibles d'induire une réaction immunitaire.
Selon une forme de réalisation préférée, le vecteur est un vecteur non viral, tout en pouvant contenir des éléments viraux. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre non limitatif, et concernant la construction d'un recombinant de grande taille au moyen de protéines compactant 1 'ADN, et de son clonage dans E. Coli et qui font référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente la complexation de la protéine au fragment fR4 dans les conditions de ligation, suivie par retardement de la migration électrophorétique du fragment en gel d'agarose 0,4%.
- la Essai 1
- lb Essai 4
- le Essai 1 avec protéine purifiée Hl (exemple 2) La figure 2 représente la digestion par EcoRI des trois recombinants R4-LZ avec insert obtenus dans l'essai 11.
La figure 3 représente la digestion par EcoRI de 6 des 20 recombinants K-LZ (exemple lb) . La figure 4 représente l'augmentation de la quantité de produits de ligation en présence d'histones, gel d'agarose 0,4 % .
La figure 5 représente le test de sensibilité aux nucléases éventuellement présentes dans la préparation d'histones
EXEMPLE 1 : LIGATION EN PRESENCE D'UN MELANGE D'HISTONES, SELECTION ET AMPLIFICATION DES PRODUITS DE LIGATION PAR E.COLI.
Deux recombinants de taille différente ont été construits. Le premier (recombinant R4-LZ) a une taille de 12034 paires de bases, et le second, plus petit, (recombinant K-LZ) a une taille de 6785pb Exemple la Clonage d'un recombinant de
12034 pb.
I - Matériel et Méthodes
1.1. Fragments .
Ce premier recombinant R4-LZ d'une taille de 12034 paires de bases est issu de la ligation de deux fragments fR4 et fLZ .
- Fragment de 8159 paires de bases : fR4.
Ce fragment est issu du plasmide pREP4 (invitrogen) par digestion complète du plasmide de 10183pb par les enzymes de restriction Sali (positions 7 et 1091) et Spel (site unique à 9250) .
Les fragments obtenus par digestion ont des tailles respectives de 8159, 1084 et 940pb.
Le fragment de 8159pb contient l'origine de replication colEl et le gène de résistance à 1 ' ampicilline d'E. coli. Il est séparé des autres fragments par migration électrophorétique sur gel d'agarose à bas point de fusion (Seaplaque LMP agarose FMC Bioproducts ) , excision et extraction de la bande correspondante.
- Fragment de 3875 paires de bases : fLZ Ce fragment est issu d'un plasmide de 6206pb contenant le gène lacZ sous le contrôle d'un promoteur d'E. coli (construction dérivée du plasmide pUT79 de la société Cayla, Toulouse) .
Par digestion aux sites uniques Spel (position 29) et Sali (position 3904 suivie d'une séparation électrophorétique, le fragment de 3875pb contenant le gène lacZ sous contrôle du promoteur bactérien, est séparé du fragment de 233 lpb. 1.2. Protéine compactante.
Il s'agit de la préparation de type IIA (référence H9250 Sigma) contenant toutes les histones de sérum de veau sans fractionnement. Cette préparation commercialisée sous forme lyophilisée est mise en solution dans le tampon de ligation juste avant emploi, dans les concentrations indiquées ultérieurement .
1.3. Ligations .
Les deux fragments fR4 et fLZ sont mélangés dans les proportions indiquées ultérieurement dans 20 μl de tampon de ligation pour la T4 DNA ligase d'E. coli. Ces conditions de ligation sont voisines de celles classiquement employées (voir Current Protocols et Maniatis) .
Lorsque c'est nécessaire, la protéine est ajoutée au mélange des fragments, à la concentration souhaitée. La T4 DNA ligase est ajoutée après incubation dans un laps de temps compris entre 0 à 20 minutes, et plus particulièrement entre 3 et 5 minutes.
1.4. Transformation cellulaire par le milieu de ligation.
La souche DH5a est une souche déficiente en protéine RecAl, ce qui ne favorise pas les recombinaisons et réarrangements de l'ADN au sein de la cellule
(notamment, les plasmides restent sous forme monomère tandis que les délétions sont évitées, page 4-13 Maniatis) .
La souche est transformée par lOμl du mélange de ligation selon une variante de la méthode d'Hanahan ( J.
Mol. Biol. 166, 557, 1983) conduisant à une efficacité de 107 colonies/μg d'ADN. La sélection des cellules contenant le recombinant se fait sur milieu LB avec une concentration de 200μg/ml d' ampicilline , et des boîtes de Pétri recouvertes de 200μl d'X-gal en solution dans le DMF .
1.5. Concentration en histones. Une première valeur de la concentration en histones a été déterminée en calculant la quantité du mélange naturel d'histones supposée nécessaire à la formation d'un nucléosome toutes les 200 paires de base, et en choisissant délibérément de ne prendre qu'une partie de la quantité de protéine ainsi déterminée (le quart dans cet exemple) pour éviter la saturation du fragment en protéine. La loi qui en dérive est la suivante :
(C) = 1.2 10"11 mg de mélange d'histones / ng d'ADN/ pb du recombinant Cette loi a été appliquée à la complexation du fragment le plus long, c'est-à-dire fR4 dans le cas présent. La complexation a été suivie par gel de retardement dans un gel à 0.4% d'agarose, en présence de la concentration déterminée et deux autres concentrations l'encadrant à 50% et 200% (Figure 1) .
La loi réajustée à partir de ces gels et qui a été employée par la suite est très proche de la valeur calculée :
(C) = 1.5 10-11 mg du mélange d'histones /ng d'ADN / pb de recombinant
Chaque ligation a été effectuée en présence de 3 concentrations de protéine, la quantité dérivant de cette loi, et deux quantités l'encadrant à 50% et 200%.
Sur ces gels, on a :
- Voie 1 : Fragment fR4 sans protéines (excepté dans le gel correspondant à l'essai 4), - Voie 2 Fragment fR4 + 0,025 μg de protéine,
- Voie 3 Fragment fR4 + 0,05 μg de protéine,
- Voie 4 Fragment fR4 + 0,1 μg de protéine,
Voie 5 : Fragment fR4 + 0,2 μg de protéine
(essai 4)
Pour 500 ng de fragment fR4 , 0,025 μg , 0,05 μg et 0,1 μg du mélange d' histone remplissent les conditions.
Les ligations se déroulent aux trois concentrations correspondantes .
1.6. Vérification de l'absence de remaniements de séquence .
Les premiers tests pour l'obtention d'un recombinant dont la séquence n'a pas subi de réarrangements est la résistance à 1 ' ampicilline conférée à la cellule et sa capacité à exprimer la b-galactosidase (colonies bleues en présence d'X-gal)
Une vérification supplémentaire est effectuée par digestion enzymatique. Ainsi, la coupure par EcoRI d'un recombinant R4-LZ correctement lié et refermé, doit résulter en 6 fragments de taille respective : 4172, 3076,
2875, 2021, 393 et 283pb.
Ces résultats sont illustrés par la figure 2, dans laquelle :
- Voie 1 : marqueur φx174/HaeIII
- Voie 2 : marqueur 1Kb
- Voie 3, 5, 7 : recombinants sans coupure
Voie 4, 6, 8 : digestion de ces mêmes recombinants par EcoRI
1.7. Autres tests préliminaires.
La transformation d'E. coli a été effectuée avec le mélange de ligation ne contenant qu'un seul des deux fragments, en présence ou absence d'histones, pour confirmer la pureté électrophorétique des fragments et l'absence de refermeture au sein de la cellule. Un gel de retardement a été effectué sur le fragment fR4 avant chaque ligation avec ce fragment pour monitorer la complexation de l'ADN par la protéine. La séparation se fait sur gel d'agarose standard de 0.4%. Ce gel est effectué dans les mêmes conditions que les expériences de ligation, dans 20μl déposés sur gel et est repris dans la figure 4, dans laquelle :
- Voie 1 : mélange de ligation (recombinant R4- LZ) sans histones (fragments fR4-8159pb- et fLZ- 3875pb) fléchés)
- Voie 2 mélange de ligation en présence de 0,025 μg d'histones
- Voie 3 mélange de ligation en présence de 0,05 μg d'histones
- Voie 4 recombinant R4-LZ purifié
- Voie 5 marqueur 1Kb (Gibco BRL)
- Voie 6 marqueur φx174RF/HaeIII (Gibco BRL)
II - Résultats
Les 13 premiers essais ont été réalisés en se fondant sur la quantité de protéine déterminée par gel de retardement à partir de la complexation du seul fragment fR4, au lieu de la loi résultant de ces expériences. Or, la taille (8159pb) du fragment fR4 , ne représente que les 2/3 de la taille totale du recombinant. En employant cette valeur pour les ligations, la loi n'est suivie qu'aux deux tiers (loi aux 2/3) . Les essais les plus récents, qui sont aussi les plus performants ont été réalisés en tenant compte de la quantité de protéine (1/3 de plus) qu'il fallait ajouter pour complexer l'ensemble du vecteur et de l' insert de la même manière que le seul fragment.
La présence d'inserts lacZ a été testée par la capacité de la colonie sélectionnée, à hydrolyser le composé X-gal (coloration bleue) et par l'obtention d'un profil correct de coupure enzymatique (test EcoRI) comme détaillé dans la légende de figure 2.
Le nombre de recombinants R4-LZ (12034pb) obtenus à partir des ligations en présence du mélange d'histones est donné ci-dessous :
Essai 1 2 3 4 4' 5 6
(- protéine) 0 0 0 0 0 0
(+ protéine)
Nbre total 3,0,0 0,0,1 2,0,0 1,4,0,0 l 7,3,0,0 0,0,1 0,0,0
Avec insert lacZ 3,0,0 0,0,1 0,0,0 0,0,0,0 I 0,2,0,0 0,0,1 0,0,0
Essai 7 8 9 10 11 11'
(- protéine) 0 0 0 0 0 0
(+ protéine)
Nbre total 0,0,0 0,0,0 0,1,0 3,5,3 0,3,2 1,1,0
Avec insert 0,0,0 0,0,0 0,1,0 1,1,0 0,3,2 0,0,0
Essai 12 12' 12" 12'" 13
(-protéine) l(sans insert) 0
(+protéine)
Nbre total 1,2,2 1,2,2 4,3,3 1,3,1 0,0,0
Avec insert 0,2,1 1,0,0 3,2,1 0,2,1
Essai 14 15
(- protéine) 0 0 (+protéine)
Nbre total 11,8,2 0,1,0
Avec insert 9, 2,2 0,1,0
11.1. Essais 1-6, 9-13 : loi aux 2/3
- Essai 4 et 4' : 4 quantités de protéine ont été testée; 50, 100, 200, 400%
- Essai 7 : quantité de protéine 3 fois plus forte (150, 300, 600%)
- Essai 8 : quantité de protéine 10 fois plus forte (500, 1000, 2000%)
(pour compenser un éventuel défaut de complexation due à une concentration en ADN plus faible) - Essais 14 et 15 : loi exacte
11.2. Effet du stockage et de la congélation de la protéine :
- Essai 2 : dilution de la protéine à partir d'une solution-stock de lOOmg/ml dans le tampon de dilution contenant 50% de glycerol, conservée à -20°C, pour tester l'effet du stockage. Pour tous les autres essais, la solution de protéine a été fraîchement préparée à partir de la poudre lyophilisée.
II.3. Quantité d'ADN :
- Essais 1-5, 9-14 : fragment fR4 : 370ng fragment fLZ : 190ng
(quantités équimoléculaires de vecteur et d' insert, lOμl de milieu de ligation)
- Essais 6, 7 et 15 : fragment fR4 150ng fragment fLZ 75ng (quantités équimoléculaires 2.5 fois plus faibles, lOμl)
- Essai 8 : fragment fR4 :150ng fragment fLZ : 190ng (3 fois plus de molécules fLZ que de molécules fR4, lOμl)
11.4. Ordre d'addition de certains composants dans le milieu de ligation : - Essai 3 : le fragment fLZ a été ajouté en même temps que la ligase, après incubation de fR4 avec les histones comme dans les gels de retardement. Ce procédé a été évité par la suite car il favorise probablement la refermeture du vecteur sans insert.
11 . 5 . Ef fet de la congélation du mélange de ligation :
- Essais 4 et 4 ' :
L'essai 4 a été réalisé avec 20μl de mélange de ligation. Après addition de la ligase, la moitié du mélange a été congelée à -20°C pour une transformation ultérieure (essai 4') . La congélation ne semble pas nuire à l'efficacité des histones.
II.6. Présence de glycerol dans le tampon de dilution :
- Essais 9, 10, 11', 12', 12''', 14, 15
Le glycerol est habituellement additionné au tampon de stockage, comme ci-dessus, pour empêcher la dénaturation et 1 ' aggrégation des protéines lors des cycles successifs de congélation-décongélation. De même, le tampon de dilution de la protéine (tampon de ligation) a été additionné 0,1% de glycerol pour prévenir 1 ' aggrégation ou la dénaturation de la protéine dès sa mise en solution, ainsi que pour éviter de perdre la protéine sur les parois du tube dans les dilutions finales. Dans l'essai 11', le glycerol a été ajouté tardivement (après la première série de ligation de l'essai 11, c'est-à-dire après une dizaine de minutes) .
II.7. Temps d'incubation avec les histones : - Essais 11' , 12 ' , 12 ' ' ' : 15 minutes au lieu de 5 minutes au maximum
On sélectionne toujours une part de recombinants ne possédant pas la séquence attendue par clonage dans E. Coli, même en l'absence d'adjuvants protéiques . Ces défauts sont engendrés au moment de la ligation in vi tro, ou part replication incorrecte de l'ADN par la cellule.
Dans cet exemple, la présence de recombinants incorrects est témoignée par la présence de colonies blanches . Dans le but de déterminer si la présence de ces recombinants incorrects est due spécifiquement à l'empli d'une préparation protéique, notamment à la présence éventuelle de nucléases, et à la dégradation partielle de l'ADN qui pourrait en résulter un test de sensibilité de l'ADN aux nucléases dans la préparation d'histones employée a été effectué. Pour cela, le fragment fR4 ou le plasmide pR4 sont incubés avec les quantités de protéine indiquées voies 3 à 10. Les résultats sont illustrés par la figure 5, dans laquelle :
- Voie 3 fragment fR4 (500 ng)
- Voie 4 fragment fR4 + 0,025 μg d'histones
- Voie 5 fragment fR4 + 0,05 μg d'histones
- Voie 6 fragment fR4 + 0,1 μg d'histones
- Voie 7 plasmide pR4 (500 ng) - Voie 8 : plasmide pR4 + 5 μg d'histones
- Voie 9 : plasmide pR4 + 0,025 μg d'histones
- Voie 10 : plasmide pR4 + 0,05 μg d'histones
- Voie 11, 12, 13 : comme voies 8, 9, 10. Incubation à 20°C pendant lh.30 au lieu de 2Oh.
- Voie 1 et 14 : marqueur 1Kb (Gibco BRL)
- Voie 2 et 15 : marqueur φx174RF/HaeIII (Gibco BRL)
Aucune digestion nucléasique n'a été détectée dans ces conditions.
Les conditions expérimentales les plus performantes (celles qui permettent d'obtenir avec certitude, ne serait-ce qu'un seul recombinant, même si par ailleurs les autres conditions sont modifiées, ou celles qui introduisent une amélioration de l'efficacité de clonage) , sont réunies lorsque les quantités de protéine sont déterminées à partir de la loi définie ci-dessus, lorsque la solution de protéine est fraîchement préparée, le temps d'incubation court (moins de 5 minutes) et les concentrations en ADN suffisantes (370ng de fragment fR4 et 190ng de fragment fLZ pour lOμl de milieu de ligation pour l'exemple ci-dessus).
La présence de glycerol au moment de la mise en solution de la protéine semble bénéfique à l'efficacité du clonage, dans le cas du mélange naturel d'histones. Elle ne semble pas l'être particulièrement avec les histones isolées (Hl ou H2b) , exemple 2). C'est pourquoi le kit pourra comporter (quelle que soit la protéine employée) un tampon de dilution incluant du glycerol (ou tout autre agent ayant les mêmes propriétés) ainsi qu'un tampon de dilution sans glycerol (qui est également le tampon de ligation) .
Remarque : L'exemple la représente tout autant le clonage d'un insert de 3875pb dans un vecteur de 8159pb que le clonage d'un fragment de 8159pb dans un vecteur de 3875pb.
Exemple lb : Clonage d'un fragment de 6785 pb.
I - Matériel et Méthodes .
1.1. Fragments . - Fragment de 2910 paires de bases : fK.
Ce fragment est issu de la digestion du plasmide pBlueScript KS (Stratagene) par Spel et Sali. Il contient une origine de replication pour E. coli et la résistance à 1 ' ampicilline d'E. coli.
1.2. Vérification de l'absence de remaniements de séquence.
La coupure par EcoRI du recombinant K-LZ, doit se traduire par 3 fragments de 3426, 3076 et 283pb. De la même manière, ces résultats sont illustrés par la figure 3
(Agarose 1%, marqueurs 1Kb (et/ou φx174) sur les voies de droite) .
II - Résultats .
Les essais ont été réalisés avec des quantités équimoléculaires de vecteur fK (180ng/10μl, 2910pb) et d' insert fLZ (245ng/10μl, 3875pb) aux mêmes concentrations en vecteur et insert que dans l'exemple précédent (recombinant R4-LZ) . Les quantités de protéine employées correspondent à 33%, 67% et 134% de la quantité indiquée par la loi indiquée ci-dessus (loi aux 2/3) . Le nombre de recombinants K-LZ (6785pb) obtenus par ligation en présence d'un mélange d'histones et clonage dans E. coli est rapporté ci-dessous :
Essai 1 Essai 2
(- protéine) 8 2 (+protéine) Nbre total 4, 7, 20 n.t., 5, 5 Avec insert n.t. , n.t. , 17 n.t, 5, 4
La présence d'histones au moment de la ligation améliore également l'efficacité de clonage.
Exemple le : Refermeture d'un fragment de 8159 pb.
Il s'agit du fragment fR4 de 8159 pb déjà décrit .
Essai 1 Essai 2
(- protéine) 0 0
(+ protéine) 5, 1, 9 0, 0, 0
L'essai 2 a été effectué avec 150ng de fragment fR4 au lieu de 370ng pour l'essai 1 et 10 μl de milieu de ligation. La protéine a été solubilisée en présence de glycerol dans l'essai 1, sans glycerol dans l'essai 2. EXEMPLE 2 : LIGATION EN PRESENCE D'HISTONES ISOLEES ET CLONAGE DU RECOMBINANT DE 12034 pb A PARTIR D'E. COLI.
Les deux histones qui ont été employées sont l'histone Hl de thymus de veau (type III-SS, réf. H4524, Sigma) et l'histone H2b de thymus de veau (type VII-S, réf. H4255, Sigma) .
La loi qui a été calculée pour Hl , l'a été sur la base d'une quantité équivalente en moles à la quantité présente dans le mélange naturel, c'est à-dire 6 fois moins
(masse moléculaire du mélange M=130 268, masse moléculaire de la protéine Hl M= 21 500) . Cette loi a été testée par gel de retardement (Figure le)
Exemple 2a : ligation en présence d'histone Hl
Le nombre de recombinants obtenus est le suivant :
Essai 1 2 3 4 5
(-protéine) l(ss insert) 0 0 0 0
(+protéine)
Nbre total 1,2,4 2,0,0 0,0,0 0,0,0 0,0,0
Avec insert 0,1,1 0,0,0 0,0,0 0,0,0 0,0,0
Essais 1 , 2, 3 : quantité d'histone Hl équivalente en moles à la quantité d'histone Hl présente dans le mélange (essais 1 et 2 , loi aux 2/3, essai 3 : loi exacte) - Essais 4 et 5 : quantité d'histones Hl équivalente en moles à la quantité totale d'histones présente dans le mélange naturel, en remplacement des autres histones Essai 5 : quantité d'ADN 5 fois moins importante que dans les autres essais
- Essai 1 et 2 : Glycerol ajouté au tampon de dilution de l'histone Hl
- Essais 3 : sans glycerol ajouté . L'histone Hl n'accroît pas l'efficacité du clonage aussi clairement que le mélange naturel d'histones, dans les mêmes conditions .
Exemple 2b : ligation en présence de l'histone
H2b.
Dans ce cas, la protéine (M = 13 774) représente le dixième du mélange (M = 130 268), et la loi devient : (C) = 1.5 10""12 mg H2b /ng ADN /pb de recombinant
Le nombre de recombinants obtenus est le suivant :
Essai l' 3' 4 4'
(- protéine) 1 0 0 5 (sans insert)
(+ protéine)
Nbre total 1,1,2 5,1,0 25,0,0 26,5,7 12,18,9
Avec insert 0,0,0 2,0,0 15,0,0 13,3,3 4, 6,2
- Essais 4, 4', 3' : sans glycerol, loi exacte
- Essais 1 ' et 2 ' : avec glycerol, loi aux 2/3 Les essais l', 2' et 3' ont été réalisés en parallèle aux essais 1, 2 et 3 effectués en présence de la protéine Hl (même préparation d'ADN, de tampon, et de boîtes de culture) et en parallèle à l'essai 14 avec le mélange d'histones) .
Contrairement à l'histone Hl , l'histone H2b accroît à elle seule l'efficacité de clonage.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de préparation d'acides nucléiques recombinants circularises, du type constitués d'un vecteur et d'un insert caractérisé en ce que : a) on réalise la ligation de 1 ' insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN, et b) on sélectionne les acides nucléiques recombinants constitués du vecteur et de l' insert.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les acides nucléiques recombinants circularises présentent une taille supérieure à quelques kb, de préférence supérieure à 8 ou 10 kb.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de compaction de l'ADN est une protéine ou un mélange de protéines .
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent de compaction de l'ADN est choisi parmi les histones, les protéines d'enveloppe virales ou de phages, les protéines du chromoïde bactérien
(HU, H-NS, etc.), les protéines chromosomales non histone, les HMG, un mélange de ces composés, ou des dérivés de ceux-ci .
5) Procédé selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration (C) en agent de compaction n'entraîne pas une rigidification de 1 'AD . 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration (C) en agent de compaction est déterminée par la loi suivante :
(C) = ( 10~x mg/ng ADN/pb ) X Y dans laquelle : x est compris entre 8 et 15 et de préférence entre 10 et 12, et Y est compris entre 0,2 et 10 et de préférence entre 0,33 et 2.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape (a) de ligation de 1 ' insert et du vecteur en présence d'un agent de compaction de l'ADN s'effectue dans un milieu de ligation constitué d'une ligase et d'un tampon correspondant .
8) Procédé selon l'une des revendication 1 à 7, caractérisé en ce que la ligase est la E. Coli T4 ligase.
9) Kit pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : une ligase,
- un tampon de ligation correspondant à la ligase, un agent de compaction - éventuellement un agent stabilisant.
10) Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que :
- la ligase est la E. Coli T4 ligase, - le tampon de ligation adapté, l'agent de compaction est un mélange d'histones, ou un histone isolé,
- l'agent stabilisant, s'il est présent est le glycerol .
11) Un acide nucléique recombinant circularise de grande taille supérieure à quelques kilobases constitué d'un vecteur et d'un insert susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
12) Un acide nucléique recombinant circularise de grande taille supérieure à quelques kilobases selon la revendication 11, caractérisé en ce que 1 ' insert comprend un ou plusieurs ADNc codant pour une ou plusieurs protéines nécessaires à la correction d'une déficience génétique, placé (s) sous le contrôle des séquences permettant leur expression in vivo .
13) Un acide nucléique recombinant circularise de grande taille supérieure à quelques kilobases selon la revendication 11, caractérisé en ce que 1 ' insert comprend un ou plusieurs ADN codant pour un ou plusieurs antigènes, placé (s) sous le contrôle des séquences permettant leur expression in vivo .
14) Un acide nucléique recombinant circularise de grande taille supérieure à quelques kilobases selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur non viral.
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