EP1135526A2 - Method for identifying cytosine methylation patterns in genomic dna - Google Patents

Method for identifying cytosine methylation patterns in genomic dna

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EP1135526A2
EP1135526A2 EP99962069A EP99962069A EP1135526A2 EP 1135526 A2 EP1135526 A2 EP 1135526A2 EP 99962069 A EP99962069 A EP 99962069A EP 99962069 A EP99962069 A EP 99962069A EP 1135526 A2 EP1135526 A2 EP 1135526A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
positions
genomic dna
individuals
methylcytosine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99962069A
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German (de)
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Inventor
Kathrin Berlin
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA.
  • the genetic information that is obtained by completely sequencing genomic DNA as a base sequence describes the genome of a cell only incompletely.
  • 5-Methylcytosine nucleobases which result from the reversible methylation of DNA in the cell, are an epigenetic information carrier and are used, for example, to regulate promoters.
  • the methylation state of a genome represents the current status of gene expression, similar to an mRNA expression pattern.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, genomic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Unfortunately, in the case of PCR amplification, the epigenetic information carried by the 5-methylcytosines is completely lost, and there is no method for obtaining this information through an amplification step.
  • DD 293 139 A5 describes a method for characterizing certain DNA sequences in which the DNA molecules whose unmethylated recognition sites are to be cut by a corresponding restriction endonuclease are mixed with a second, unmethylated DNA species (especially Oligonucleotide duplexes containing the recognition site) incubated.
  • WO 97/46705 A1 discloses a method for the detection of a methylated nucleic acid containing CpG, wherein the sample containing nucleic acid is brought into contact with a reagent which modifies unmethylated cytosine, the nucleic acid containing CpG in the sample is amplified by means of CpG-specific oligonucleotide primers, the oligonucleotide primer between modified me- distinguishes thylated and unmethylated nucleic acids and detects the methylated nucleic acids.
  • US Pat. No. 5,824,471 A1 describes a method for determining deviations between two nucleic acid strands, a multiplicity of duplexes being formed from the two strands or parts thereof and this duplex being brought into contact with a first and a second different bacteriophage resolvase, and wherein it is then determined from which bacteriophage resolvase the duplex is cleaved, the differences being determined in this way.
  • Sequence information also has to be determined less and less because the genome projects whose goal is the complete sequence of different organisms is to progress rapidly. Although only about 5% of the human genome is currently fully sequenced, an additional 5% is added every year because other genome projects are coming to an end, which frees up sequencing resources. The sequencing of the human genome is expected to be completed by 2006.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a new, very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 60: 2299-2301).
  • An analyte molecule is embedded in a matrix that absorbs in the UV. The matrix is evaporated into a vacuum by a short laser pulse and the analyte is thus transported unfragmented into the gas phase.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • the flight time is converted into the mass of the ions.
  • this technology is able to distinguish molecules with a mass difference of 1 Da in the mass range from 1,000 to 4,000 Da. Due to the natural distribution of isotopes, most biomolecules are already about 5 Da wide.
  • this mass spectrometric method is ideally suited for the analysis of biomolecules. Products to be analyzed that are to be differentiated must reasonably be at least 5 Da apart. In this mass range, 600 molecules could be distinguished. In the range between 4,000 and 100,000 Da, isotope resolution is no longer achieved, but this range is also applicable. bar.
  • IR infrared
  • the use of an infrared (IR) laser coupled with the MALDI analysis of DNA has recently been described (Berkenkamp, S., Kirpkar, F. and Hillenkamp, F. 1998. Infrared MALDI mass spectrometry of large nucleic acids. Science. 281: 260 -262). This combination made it possible to detect DNA fragments with a size of up
  • Chemical mismatch cleavage is a method with which small differences between two DNA single strands can be shown (Cotton, RGH, Rodriguez, NR and Campbell, RD 1988. Reactivity of cytosine and thy- mme in smgle-base-pair mismatches with hydroxylammes and osmium tetroxide and lts application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 4397-4401; Cotton, RGH 1993. Current methods for mutat on detection. Mut. Res. 285: 125-144; Saleeba , JA and Cotton, RGH 1993. Chemical cleavage of mismatch to detect mutations. Methods in Enzymology.
  • Muts Another possibility to identify non-complementary base pairs in heteroduplex DNA is to use enzymes such as Muts, which bind to non-complementary base pairs' Smith, J. and Modrich, P. 1996. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repa r protems. Proc. Natl. Acad. Be. USA 93: 4374-4379; Parsons, BL and Heflich, RH 1997. Evaluation of MutS as a tool for direct measurement of point mutations in genomic DNA. Courage. Res. 374: 277-285).
  • Muts which bind to non-complementary base pairs' Smith, J. and Modrich, P. 1996. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repa r protems. Proc. Natl. Acad. Be. USA 93: 4374-4379; Parsons, BL and Heflich, RH 1997. Evaluation of MutS as a tool for direct measurement of point mutations in genomic DNA. Courage. Res. 374
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the inexpensive and parallelisable detection of epigenetic information carriers in the form of 5-methylcytosine bases in genomic DNA.
  • the object is achieved according to the invention by a method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA, the following method steps being carried out: a) the genomic DNA of a cell, a cell line, a tissue or an individual is chemically treated in such a way that cytosine and 5-Methylcytosine react differently and there is a different base pairing behavior of the two products in the duplex, b) the same nucleic acid section is amplified by means of a polymerase reaction, c) the same nucleic acid section is treated at least one further cell, cell line, tissue or individual or any one Reference DNA corresponding to steps a) and b), d) is formed from the at least two amplificates Steps b) and c) heteroduplex, e) a displayable marker is introduced into the heteroduplex by a reaction which is specific for non-complementary base pairs.
  • a disulfite bisulfite, pyrosulfite
  • step a a disulfite (bisulfite, pyrosulfite) is used in step a) as a reagent for the selective conversion of cytosine to uracil, 5-methylcytosine remaining unchanged.
  • genomic DNA from several individuals, tissues, cell lines or cells is amplified together in step b).
  • genomic DNA from several individuals, tissues, cell lines or cells is amplified separately and then treated together in accordance with step e).
  • step d) by forming heteroduplexes with a completely methylated reference DNA, base mismatches occur at the positions at which cytosine was found in the genomic DNA. It is also preferred that in step d), by forming heteroduplexes with a completely demethylated reference DNA, base mismatches occur at the positions at which 5-methylcytosine was found in the genomic DNA.
  • the base mismatches lead to a specific or sufficiently selective backbone cleavage at these positions by means of "chemical mismatch cleavage" (chemical change at non-complementary positions).
  • the DNA is cleaved enzymatically specifically or sufficiently selectively at the base mismatches.
  • 1 DNA fragments are obtained in step e), the size of which allows conclusions to be drawn about the cleavage positions and thus the position of the methylcytosines and / or the methylation positions which vary between different individuals, tissues, cell lines or cells allowed.
  • fragments are analyzed using matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • the fragments are analyzed by means of electrospray ionization mass spectrometry (ESI). It is particularly preferred that the size of the fragments generated in step e) is adapted to the performance of the mass spectrometer.
  • EI electrospray ionization mass spectrometry
  • PCRs of a gene segment are carried out and the primers are gradually reset in such a way that the fragment size to be expected falls in at least one of these PCRs in the mass range detectable by mass spectrometry.
  • one of the PCR primers is gradually repositioned relative to the other around the maximum detectable mass range of the mass spectrometer.
  • step b) a PCR primer is provided with a chemical function so that the PCR product can be immobilized on a surface.
  • the PCR product produced in step b) is transferred to different reaction vessels and the surfaces of the reaction vessels are chemically such that the PCR product can be bound to them.
  • PCR products produced in step c) are transferred from different individuals into different reaction vessels prepared as described above.
  • an enzyme is used for step e) which forms a complex with a non-complementary base pair. It is particularly preferred that this enzyme is MutS.
  • the enzyme carries a label by which a complex can be illustrated.
  • the label is a fluorescent label, a chemiluminescent label, a mass day or a photochemically removable mass day.
  • an amplified DNA sample according to step c) in claim 1 which shows a difference to an amplified DNA sample in step b) in claim 1, is followed by a DNA sample itself in a second run of the method Step b) in claim 1 and is compared with all other DNA samples to be examined.
  • a preselection of the gene sections to be examined in detail by mass spectrometry is carried out by means of fluorescent labeling or chemiluminescent labeling of the immobilized DNA strand, the absence of which after carrying out steps d) and e) of claim 1 and a washing step the presence of indicates methylated cytosms in the examined genomic DNA section.
  • the present invention furthermore relates to a kit for carrying out the process according to the invention.
  • rens comprising DNA from at least two different individuals, tissues, cell lines or cells as well as reagents to show the variable methylation positions.
  • the invention further comprises completely methylated and / or demethylated DNA and reagents which are required for the detection of methylated cytosines in any DNA sample.
  • the method according to the invention serves to identify 5-methylcytosine positions in genomic DNA, which can be of very different origins.
  • genomic DNA is first treated chemically so that there is a difference in the reaction of the cytosine bases to the 5-
  • Methylcytosine bases results.
  • Possible reagents are e.g. B. disulfite (also called bisulfite or pyrosulfite), hydrazine and permanganate.
  • the genomic DNA is treated with disulfite in the presence of hydroquinone or hydroquinone derivatives, the cytosine bases being selectively converted to uracil after subsequent alkaline hydrolysis. 5-Methylcytosine remains unchanged under these conditions.
  • a certain section of the pretreated genomic DNA is now amplified in a polymerase reaction.
  • the polymerase chain reaction is used here.
  • the same section of another genomic DNA sample is then amplified equally.
  • the two amplificates are combined, which partially forms heteroduplexes.
  • this is done in such a way that one of the PCR primers is used for immobilization has a suitable function and that only one strand of the amplificate of the first sample is immobilized and then hybridization with the amplificate of the second sample takes place.
  • a multiplicity of different amplified products of the same nucleic acid section are hybridized in this way against the immobilized single strand from the amplified product of the first sample, which was distributed over many wells of a microtiter plate. A hybridization experiment can now be carried out in each well.
  • a procedure is carried out which leaves a detectable mark at the positions in which a base mismatch occurs in the heteroduplex.
  • this is carried out by chemical mismatch cleavage, which leads to a backbone fracture at the positions where a base mismatch occurs.
  • the fragments obtained in this way can be analyzed by any method that can show the size of DNA fragments. Such a method should ideally allow conclusions to be drawn about any position in the amplified nucleic acid section of the sample at which a base mismatch occurred in the heteroduplex.
  • Base mismatches in the heteroduplex are particularly present when cytosine was present in the DNA from a sample at this position, which was converted to uracil, but in the other 5-methylcytosine, which remained unchanged in the chemical pretreatment.
  • the method can be used for the comparison of two or more genomic DNA samples, in this case the analysis of the fragments only provides the differences in the methylation pattern between the two samples in each case amplified nucleic acid section. However, it is also possible to use a completely methylated or demethylated DNA as a reference. In this case, analysis of the fragments provides all 5-methylcytosine positions in the respective amplified nucleic acid section.
  • mass spectrometry is used for the fragment analysis.
  • the fragments can be analyzed in the MALDI mass spectrometer.
  • the solutions can be analyzed using electrospray ionization mass spectrometry (ESI).
  • ESI electrospray ionization mass spectrometry
  • the base mismatches - as an alternative to the analysis of fragments after a backbone cleavage in the heteroduplex - can also be detected by an enzyme that forms a complex with a non-complementary base pair.
  • this enzyme is MutS, which is a label, e.g. B. carries a fluorescent, chemiluminescent or mass marking.
  • the presence of base mismatch is detected by means of a fluorescence or chemiluminescence label.
  • an immobilized DNA strand from the amplificate of sample 1 is provided with a fluorescent label at the end not used for immobilization.
  • Heteroduplexes are formed with the amplificate of sample 2, using a chemical mismatch
  • the fluorescent label disappears after a denaturing washing step, if the strand is not cleaved, the label is retained. Only the amplificates that have been cleaved are subsequently examined in more detail by mass spectrometry.
  • the genomic DNA to be examined comes from a
  • the cell line or, if possible, only one cell is divided into two reaction vessels and the one half enzymatically either completely methylated on the cytosine or demethylated.
  • the enzyme is thermally inactivated and then both parts are put together again and treated with disulfite and then alkali. After purification, it is amplified by means of PCR.
  • Variant 1 The above method is carried out in such a way that a primer is used in the PCR which is functionalized in such a way that a simple and specific immobilization is made possible after the PCR. Immobilization takes place on beads or on the surface of a microtiter plate. This allows the simple separation of components of the polymerase and mismatch cleavage reactions. After the chemical mismatch cleavage reaction, the duplex is thermally denatured and the solution is pipetted off. The DNA fragments are applied from this solution to a reversed phase material and purified.
  • the fragments reveal a "ladder" of peaks, which indicates the methylated positions. Due to the symmetrical methylation at CpG positions, there are theoretically always two peaks per CpG, which originate from the sense and the antisense strand.
  • Variant 2 The reactions are carried out in solution and purification after the individual reaction steps is carried out, if necessary, using a reversed phase material.
  • Variant 3 Several individuals or cell types are examined in parallel. A reference DNA is completely demethylated and then treated with disulfite. she is amplified by PCR after purification. Again, a primer is used which has a function suitable for immobilization. The solution is distributed onto the wells of a microtiter plate and immobilized. This is followed by hybridization against the PCR products from samples also treated with disulfite, one for each well (see also detailed example with 97 individuals).
  • Variant 4 In the event that the mass spectrometer cannot cover the measuring range that would be required for the analysis of the entire PCR product for methylations, the area of interest can also be scanned step by step by performing several PCRs and one of the primers in each case the respective measuring range of the mass spectrometer is approached closer to the other. This means, for example, that only the area that lies between the primer of the respective and the next PCR to be shifted is always detected. The process can be combined with the other variants.
  • DNA from different individuals or cell lines is pooled and treatment with disulfite is carried out as described above. After alkaline hydrolysis of the bisulfite adducts and purification of the product DNA, this is amplified by means of PCR. It is then purified again and, after a few minutes of reannealing at 25 ° C., the PCR product is cleaved with Os0 4 at the positions using a C mismatch (chemical mismatch cleavage). A mismatch C against A always occurs if before the bisulfite Treatment only in some individuals where a methylated cytosine was present.
  • C mismatch chemical mismatch cleavage
  • any SNPs single nucleotide polymorphisms will also result in the cleavage of the DNA in this process. These must be differentiated from the methylation positions to be found, which is ensured by the method described above for finding all methylated cytosines.
  • the product DNA is now examined by mass spectrometry as described above. If the initially generated PCR product has a greater length than can be detected using the available technology on the part of mass spectrometry, it is possible that the fragments produced by the chemical mismatch cleavage cannot be detected. To avoid this, several PCRs can be carried out iteratively, i.e. one primer is always kept constant, while the other primer is always positioned in several steps closer to the other primer by the detection limit of the mass spectrometer (primer walking).
  • the product is purified and amplified using PCR.
  • One of the PCR primers is provided at the 5 'end with a chemical modification that is used for immobilization.
  • the product of this PCR is placed in the 96 chambers of a microtiter plate and the binding of the PCR products with the surface induced. Since only one primer is provided with the chemical modification for the binding, only one DNA strand binds to the surface. The plate is washed to remove binding chemistry reagents and complementary strands.
  • the plate with the reference DNA piece is now prepared.
  • the same genomic section is treated analogously with disulfite in each of the 96 other individuals and then amplified.
  • Two normal, unmodified primers of the same sequence as for the reference individual are used for this PCR.
  • the 96 PCR products are placed in the 96 wells of the prepared plate.
  • the complementary strands of the 96 individuals are hybridized to the reference DNA by heating and slow cooling (formation of the heteroduplex). Eliminate the 96 individuals and reagents from previous reactions.
  • An Os0 4 solution is added to each of the 96 wells, incubated and then a backbone break in a heteroduplex with a non-complementary base pair, one base of which is C, is induced with piperidine.
  • the heteroduplex that is to say in one of the individuals, has only one strand of methyl cytosine instead of one cytosine.
  • the cytosine of one individual was converted into an uracil before the PCR, which results in a mismatch in the heteroduplex with the counter strand of another individual.
  • the assay therefore does not directly yield all methylated cytosines of a genomic section, but only those that are variable between different individuals, tissues, cell lines or individual cells.
  • a good variant is to take the solution after melting the heteroduplex in a pipette tip that is equipped with a reversed-phase material.
  • the DNA products bind to this by forming hydrophobic interactions via their trialkylammonium counterions and can thus be cleaned of chemical mismatch cleavage reagents in several washing steps. With 30% acetonitrile, the DNA products can be detached from the reverse phase material. It makes sense to place the products directly on a prepared matrix on a MALDI target. After drying, the target is introduced into the mass spectrometer and the products are analyzed.
  • Example 5 Preselection by means of fluorescent labeling of gene segments relevant for methylation detection
  • the genomic DNA to be investigated is immobilized on beads or a correspondingly coated microtiter plate after the bisulfite reaction as described above with subsequent PCR amplification, in which one of the primers in turn has a function which is useful for the subsequent immobilization.
  • Fully demethylated DNA, treated as the sample DNA is used as the reference DNA and forms a heteroduplex with the immobilized sample DNA.
  • a single fluorescence-labeled base is appended enzymatically, for example with terminal transferase, to the 3 'ends of the product.
  • This method can also be used for simple, fluorescence-based detection of 5-methylcytosines in small gene segments, e.g. B. promoters can be used. However, only the statement can be made as to whether or not there are methylations in the region in question, but not how many and at which positions. However, there is a relatively small amount of experimentation and good parallelism.
  • the exact position of the methylcytosines can then be determined by mass spectrometry analogously to one of the examples given above.
  • the heteroduplexes immobilized in a microtiter plate are first brought together with a solution of MutS, to which a fluorescent dye is bound. Only the vessels in which MutS mismatch positions, which shows that after several washing steps the fluorescence is still detectable, are subsequently subjected to chemical mismatch cleavage and analyzed in the mass spectrometer. This saves time in the mass spectrometer and the cost of purification by avoiding the analysis of samples without demonstrable epigenetic information.

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Abstract

The invention relates to a method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA. The method is characterised by the following steps: a) the genomic DNA of a cell, a cell line, a tissue or an individual is chemically treated in such a way that the cytosine and 5-methylcytosine react differently and the two products present different base pairing behaviour in the duplex; b) the same nucleic acid section is amplified by means of a polymerase reaction; c) the same nucleic acid section of at least one other cell, cell line, tissue or individual or of any given reference DNA is treated according to steps a) and b); d) heteroduplexes are formed from the at least two amplification products obtained in steps b) and c); and e) a detectable marking is introduced into the heteroduplexes by means of a reaction that is specific to non-complementary base pairs.

Description

Verfahren zur Identifikation von Cytosin- Methylierungsmustern in genomischer DNA Method for the identification of cytosine methylation patterns in genomic DNA
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von 5-Methylcytosin-Positionen in genomischer DNA.The invention relates to a method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA.
Die genetische Information, die durch vollständige Sequenzierung genomischer DNA als Basenabfolge erhalten wird, beschreibt das Genom einer Zelle nur unvollständig. 5-Methylcytosin-Nucleobasen, die durch reversible Methy- lierung von DNA in der Zelle entstehen, sind ein epigenetischer Informationsträger und dienen beispielsweise zur Regulation von Promotoren. Der Methylierungszustand eines Genoms repräsentiert den gegenwärtigen Status der Genexpression, ähnlich wie ein mRNA Expressionsmuster.The genetic information that is obtained by completely sequencing genomic DNA as a base sequence describes the genome of a cell only incompletely. 5-Methylcytosine nucleobases, which result from the reversible methylation of DNA in the cell, are an epigenetic information carrier and are used, for example, to regulate promoters. The methylation state of a genome represents the current status of gene expression, similar to an mRNA expression pattern.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei- spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Se- quenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Unglücklicherweise geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, die die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren, und es existiert kein Verfah- ren diese Information durch einen Amplifikationsschritt zu erhalten.5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, genomic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Unfortunately, in the case of PCR amplification, the epigenetic information carried by the 5-methylcytosines is completely lost, and there is no method for obtaining this information through an amplification step.
Es sind mehrere Verfahren bekannt, die diese Probleme lösen. Meist wird eine chemische Reaktion oder enzymatische Behandlung der genomischen DNA durchgeführt, infolge derer sich die Cytosin- von den Methylcytosin-Nucleobasen unterscheiden lassen. Eine gängige Methode ist die Umsetzung von genomischer DNA mit Disulfit (auch als Bisulfit oder Pyrosulfit bezeichnet) , die nach alkalischer Hydrolyse in zwei Schritten zu einer Umwandlung der Cytosin Basen in Uracil führt (Shapiro, R., Cohen, B., Servis, R. Nature 227, 1047 (1970) . 5-Methylcytosin bleibt unter diesen Bedingungen unverändert. Die Umwandlung von C in U führt zu einer Veränderung der Basensequenz, aus der sich durch Sequenzierung nun die ursprünglichen 5-Methyl- cytosine ermitteln lassen (nur diese liefern noch eine Bande in der C-Spur) .Several methods are known to solve these problems. Usually a chemical reaction or enzymatic Treatment of genomic DNA carried out, as a result of which the cytosine from the methyl cytosine nucleobases can be distinguished. A common method is the conversion of genomic DNA with disulfite (also known as bisulfite or pyrosulfite), which leads to conversion of the cytosine bases into uracil in two steps after alkaline hydrolysis (Shapiro, R., Cohen, B., Servis, R Nature 227, 1047 (1970). 5-Methylcytosine remains unchanged under these conditions. The conversion of C into U leads to a change in the base sequence, from which the original 5-methylcytosines can now be determined by sequencing (only these deliver another gang in the C-track).
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, ist mitsamt der dazugehörigen Literatur dem folgenden Übersichtsartikel zu entnehmen: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1998).An overview of the other known possibilities for detecting 5-methylcytosine can be found, together with the associated literature, in the following review article: Rein, T., DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1998).
In der DD 293 139 A5 wird ein Verfahren zur Charakterisierung bestimmter DNA-Sequenzen beschrieben, bei dem die DNA-Moleküle, deren nichtmethylierte Erkennungsorte durch eine entsprechende Restriktionsendonuklease geschnitten werden sollen, im Reaktionsgemisch mit einer zweiten, un- methylierten DNA-Species (vor allem Oligonukleotid- Duplexe, die den Erkennungsort enthalten) inkubiert.DD 293 139 A5 describes a method for characterizing certain DNA sequences in which the DNA molecules whose unmethylated recognition sites are to be cut by a corresponding restriction endonuclease are mixed with a second, unmethylated DNA species (especially Oligonucleotide duplexes containing the recognition site) incubated.
Die WO 97/46705 AI offenbart ein Verfahren zum Nachweis einer methylierten, CpG enthaltenden Nukleinsäure, wobei man die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, welches unmethyliertes Cytosin modifiziert, die CpG enthaltende Nukleinsäure in der Probe mittels CpG-spezifischen Oligonukleotidprimern amplifiziert, wobei der Oligonukleotikprimer zwischen modifizierten me- thylierten und nichtmethylierten Nukleinsäuren unterscheidet und die methylierten Nukleinsäuren nachweist.WO 97/46705 A1 discloses a method for the detection of a methylated nucleic acid containing CpG, wherein the sample containing nucleic acid is brought into contact with a reagent which modifies unmethylated cytosine, the nucleic acid containing CpG in the sample is amplified by means of CpG-specific oligonucleotide primers, the oligonucleotide primer between modified me- distinguishes thylated and unmethylated nucleic acids and detects the methylated nucleic acids.
Ferner beschreibt US 5,824,471 AI ein Verfahren zur Be- Stimmung von Abweichungen zwischen zwei Nukleinsaure- strangen, wobei eine Vielzahl von Duplexen aus den beiden Strängen oder deren Teile gebildet und diese Duplex mit einer ersten und einer zweiten unterschiedlichen Bakteriophagen Resolvase in Kontakt gebracht wird und wobei man dann feststellt, von welcher Bakteriophagen Resolvase die Duplex gespalten wird, wobei hierdurch die Unterschiede ermittelt werden.Furthermore, US Pat. No. 5,824,471 A1 describes a method for determining deviations between two nucleic acid strands, a multiplicity of duplexes being formed from the two strands or parts thereof and this duplex being brought into contact with a first and a second different bacteriophage resolvase, and wherein it is then determined from which bacteriophage resolvase the duplex is cleaved, the differences being determined in this way.
Nicht immer jedoch ist es erforderlich, tatsachlich die gesamte Sequenz eines Gens oder Genabschnitts zu ermitteln, wie dies bei einer Sequenzierung das Ziel ist. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn wenige 5-Methyl- cytosin-Positionen innerhalb einer längeren Basensequenz für eine Vielzahl von unterschiedlichen Proben abzutasten sind. Die Sequenzierung liefert hier in großem Umfang redundante Information und ist zudem sehr teuer. Dies ist auch schon dann der Fall, wenn die Sequenz bereits bekannt ist und ausschließlich Methylierungspositionen dargestellt werden sollen. Auch ist es denkbar, daß in eini- gen Fallen überhaupt nur die Unterschiede im Methylie- rungsmuster zwischen verschiedenen genomischen DNA-Proben von Interesse sind und daß auf die Ermittlung einer Vielzahl übereinstimmender methylierter Positionen wie auch auf die Sequenzierung verzichtet werden kann. Für die hier angeführten Fragestellungen existiert bislang kein Verfahren, das ohne Sequenzierung jeder einzelnen Probe kostengünstig die gewünschten Ergebnisse liefert.However, it is not always necessary to actually determine the entire sequence of a gene or gene segment, as is the goal in sequencing. This is particularly the case when a few 5-methyl-cytosine positions are to be scanned for a large number of different samples within a longer base sequence. Sequencing provides redundant information on a large scale and is also very expensive. This is also the case when the sequence is already known and only methylation positions are to be shown. It is also conceivable that in some cases only the differences in the methylation pattern between different genomic DNA samples are of interest and that the determination of a large number of matching methylated positions and the sequencing can be dispensed with. To date, there has been no method for the questions mentioned here that can cost-effectively deliver the desired results without sequencing each individual sample.
Sequenzinformation muß auch deshalb immer weniger neu er- mittelt werden, weil die Genomprojekte, deren Ziel die vollständige Sequenz verschiedener Organismen ist, zügig voranschreiten. Vom menschlichen Genom sind zwar derzeit erst etwa 5 % fertig sequenziert, jedoch kommen jetzt, weil andere Genomprojekte dem Ende zuneigen und dadurch Sequenzierressourcen frei werden, jedes Jahr weitere 5 % dazu. Mit der Vervollständigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms wird bis zum Jahre 2006 gerechnet.Sequence information also has to be determined less and less because the genome projects whose goal is the complete sequence of different organisms is to progress rapidly. Although only about 5% of the human genome is currently fully sequenced, an additional 5% is added every year because other genome projects are coming to an end, which frees up sequencing resources. The sequencing of the human genome is expected to be completed by 2006.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massen- spektrometrie (MALDI) ist eine neue, sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons . Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analytmolekül wird in ei- ne im UV absorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix ins Vakuum verdampft und der Analyt so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet. Derzeit ist diese Technologie in der Lage im Massenbereich von 1.000 bis 4.000 Da Moleküle mit einer Massendifferenz von 1 Da zu unterscheiden. Durch die natürliche Verteilung von Isotopen sind die meisten Biomoleküle jedoch schon etwa 5 Da breit. Technisch ist diese massenspektrometri- sche Methode also vorzüglich für die Analyse von Biomolekülen geeignet. Vernünftigerweise müssen zu analysierende Produkte, die unterschieden werden sollen, mindestens 5 Da auseinander liegen. In diesem Massenbereich könnten also 600 Moleküle unterschieden werden. Im Bereich zwischen 4.000 und 100.000 Da wird zwar nicht mehr Isotopenauflösung erzielt, jedoch ist dieser Bereich auch anwend- bar. Kürzlich ist der Einsatz eines infrarot (IR) Lasers gekoppelt mit der MALDI Analyse von DNA beschrieben worden (Berkenkamp, S., Kirpkar, F. and Hillenkamp, F. 1998. Infrared MALDI mass spectrometry of large nucleic acids. Science. 281: 260-262). Durch diese Kombination wurde es möglich DNA Fragmente mit einer Große von bis zu 2.500 Basen zu detektieren.Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) is a new, very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 60: 2299-2301). An analyte molecule is embedded in a matrix that absorbs in the UV. The matrix is evaporated into a vacuum by a short laser pulse and the analyte is thus transported unfragmented into the gas phase. An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones. The flight time is converted into the mass of the ions. Currently, this technology is able to distinguish molecules with a mass difference of 1 Da in the mass range from 1,000 to 4,000 Da. Due to the natural distribution of isotopes, most biomolecules are already about 5 Da wide. Technically, this mass spectrometric method is ideally suited for the analysis of biomolecules. Products to be analyzed that are to be differentiated must reasonably be at least 5 Da apart. In this mass range, 600 molecules could be distinguished. In the range between 4,000 and 100,000 Da, isotope resolution is no longer achieved, but this range is also applicable. bar. The use of an infrared (IR) laser coupled with the MALDI analysis of DNA has recently been described (Berkenkamp, S., Kirpkar, F. and Hillenkamp, F. 1998. Infrared MALDI mass spectrometry of large nucleic acids. Science. 281: 260 -262). This combination made it possible to detect DNA fragments with a size of up to 2,500 bases.
Chemical mismatch cleavage ist eine Methode mit welcher kleine Unterschiede zwischen zwei DNA Einzelstrangen aufgezeigt werden können (Cotton, R.G.H., Rodriguez, N.R. and Campbell, R.D. 1988. Reactivity of cytosine and thy- mme in smgle-base-pair mismatches with hydroxylamme and osmium tetroxide and lts application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 4397-4401; Cotton, R.G.H. 1993. Current methods for mutat on de- tection. Mut. Res. 285: 125-144; Saleeba, J.A. and Cotton, R.G.H. 1993. Chemical cleavage of mismatch to de- tect mutations. Methods in Enzymology. 217: 286-295; Smooker, P.M. and Cotton, R.G.H. 1993. The use of chemi- cal reagents in the detection of DNA mutations. Mutations Res. 288: 65-77). Die chemische Reaktivität von C und T gegenüber Osmiumtetroxid und von C gegenüber Hydroxylamm ist erhöht, wenn diese nicht mit ihren jeweiligen komple- mentaren Basen gepaart sind. Durch die anschließende Behandlung mit Piperidm wird der Nuklemsaurestrang an der modifizierten Position gebrochen.Chemical mismatch cleavage is a method with which small differences between two DNA single strands can be shown (Cotton, RGH, Rodriguez, NR and Campbell, RD 1988. Reactivity of cytosine and thy- mme in smgle-base-pair mismatches with hydroxylammes and osmium tetroxide and lts application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 4397-4401; Cotton, RGH 1993. Current methods for mutat on detection. Mut. Res. 285: 125-144; Saleeba , JA and Cotton, RGH 1993. Chemical cleavage of mismatch to detect mutations. Methods in Enzymology. 217: 286-295; Smooker, PM and Cotton, RGH 1993. The use of chemical reagents in the detection of DNA mutations Mutations Res. 288: 65-77). The chemical reactivity of C and T towards osmium tetroxide and C towards hydroxylamm is increased if these are not paired with their complementary bases. Subsequent treatment with piperidm breaks the nuclear acid strand at the modified position.
Eine weitere Möglichkeit nicht komplementäre Basenpaare in Heteroduplex DNA aufzuzeigen, besteht im Einsatz von Enzymen wie Muts, die an nicht komplementäre Basenpaare binden 'Smith, J. und Modrich, P. 1996. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repa r protems. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 4374-4379; Parsons, B.L. und Heflich, R.H. 1997. Evaluation of MutS as a tool for direct measurement of point mutations in genomic DNA. Mut. Res. 374: 277-285) .Another possibility to identify non-complementary base pairs in heteroduplex DNA is to use enzymes such as Muts, which bind to non-complementary base pairs' Smith, J. and Modrich, P. 1996. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repa r protems. Proc. Natl. Acad. Be. USA 93: 4374-4379; Parsons, BL and Heflich, RH 1997. Evaluation of MutS as a tool for direct measurement of point mutations in genomic DNA. Courage. Res. 374: 277-285).
Derzeit fehlt ein schnelles, kostengünstiges und automatisierbares Verfahren zur Auffindung von methylierten Cytosinen in genomischer DNA. Ein solches Verfahren ist aber von großem Interesse, da unterschiedliche Methylie- rungsmuster auf vielfältige Weise zur Charakterisierung von Zelltypen und damit zur Diagnose und Klassifizierung von Krankheiten (wie beispielsweise Tumoren) herangezogen werden können als auch zum Beispiel für Studien der Zelldifferenzierung genutzt werden könnten.There is currently no fast, inexpensive and automatable method for finding methylated cytosines in genomic DNA. Such a method is of great interest, however, since different methylation patterns can be used in a variety of ways to characterize cell types and thus to diagnose and classify diseases (such as tumors), and could also be used, for example, for studies of cell differentiation.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur kostengünstigen und parallelisierbaren Auffindung von epigenetischen Informationsträgern in Form von 5- Methylcytosin-Basen in genomischer DNA zu schaffen.The object of the present invention is therefore to provide a method for the inexpensive and parallelisable detection of epigenetic information carriers in the form of 5-methylcytosine bases in genomic DNA.
Die Aufgabe wir erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Identifikation von 5-Methylcytosin-Positionen in genomischer DNA gelöst, wobei man folgende Verfahrensschritte ausführt : a) man behandelt die genomische DNA einer Zelle, einer Zellinie, eines Gewebes oder eines Individuums chemisch derart, daß Cytosin und 5-Methylcytosin unterschiedlich reagieren und sich in der Duplex ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten der beiden Produkte ergibt, b) man amplifiziert denselben Nukleinsäure Abschnitt mittels einer Polymerasereaktion, c) man behandelt den gleichen Nukleinsäure Abschnitt mindestens einer weiteren Zelle, Zellinie, Gewebes oder Individuums oder einer beliebigen Referenz-DNA entsprechend den Schritten a) und b) , d) man bildet aus den mindestens zwei Amplifikaten der Schritte b) und c) Heteroduplexes, e) man führt durch eine Reaktion, die spezifisch ist für nicht komplementäre Basenpaare, eine aufzeigbare Markierung in die Heteroduplex ein.The object is achieved according to the invention by a method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA, the following method steps being carried out: a) the genomic DNA of a cell, a cell line, a tissue or an individual is chemically treated in such a way that cytosine and 5-Methylcytosine react differently and there is a different base pairing behavior of the two products in the duplex, b) the same nucleic acid section is amplified by means of a polymerase reaction, c) the same nucleic acid section is treated at least one further cell, cell line, tissue or individual or any one Reference DNA corresponding to steps a) and b), d) is formed from the at least two amplificates Steps b) and c) heteroduplex, e) a displayable marker is introduced into the heteroduplex by a reaction which is specific for non-complementary base pairs.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß man es zur Identifikation von Unterschieden im Cytosin-Methylierungsmuster zwischen verschiedenen Zellen, Zellinien, Geweben und Individuen anwendet und nur Positionen aufzeigt, in denen die Cytosin-Methylierung zwischen unterschiedlichen Zellen, Zellinien, Geweben oder Individuen variabel ist.It is preferred according to the invention that it is used to identify differences in the cytosine methylation pattern between different cells, cell lines, tissues and individuals and only shows positions in which the cytosine methylation is variable between different cells, cell lines, tissues or individuals.
Weiterhin ist bevorzugt, daß man im Schritt a) gemäß ein Disulfit (Bisulfit, Pyrosulfit) als Reagenz zur selekti- ven Umwandlung von Cytosin in Uracil einsetzt, wobei 5- Methylcytosin unverändert bleibt.It is further preferred that a disulfite (bisulfite, pyrosulfite) is used in step a) as a reagent for the selective conversion of cytosine to uracil, 5-methylcytosine remaining unchanged.
Es ist ferner bevorzugt, daß man genomische DNA mehrerer Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen im Schritt b) gemeinsam amplifiziert.It is also preferred that genomic DNA from several individuals, tissues, cell lines or cells is amplified together in step b).
Weiterhin ist bevorzugt, daß man genomische DNA mehrerer Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen separat amplifiziert und anschließend gemeinsam gemäß Schritt e) be- handelt.It is further preferred that genomic DNA from several individuals, tissues, cell lines or cells is amplified separately and then treated together in accordance with step e).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, daß man durch Bildung von Heteroduplexes aus der DNA verschiedener Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen an den Positionen Ba- senfehlpaarungen erzeugt, an denen in der genomischen DNA ein 5-Methylcytosin lokalisiert war.It is also preferred according to the invention that by forming heteroduplexes from the DNA of various individuals, tissues, cell lines or cells, base mismatches are generated at the positions at which a 5-methylcytosine was localized in the genomic DNA.
Bevorzugt ist auch, daß im Schritt d) durch Bildung von Heteroduplexes mit einer vollständig methylierten Refe- renz-DNA an den Positionen Basenfehlpaarungen auftreten, an denen sich in der genomischen DNA Cytosin befand. Bevorzugt ist außerdem, daß im Schritt d) durch Bildung von Heteroduplexes mit einer vollständig demethylierten Referenz-DNA an den Positionen Basenfehlpaarungen auftre- ten, an denen sich in der genomischen DNA 5-Methylcytosin befand.It is also preferred that in step d) by forming heteroduplexes with a completely methylated reference DNA, base mismatches occur at the positions at which cytosine was found in the genomic DNA. It is also preferred that in step d), by forming heteroduplexes with a completely demethylated reference DNA, base mismatches occur at the positions at which 5-methylcytosine was found in the genomic DNA.
Erfindungsgemäß ist weiterhin bevorzugt, daß die Basenfehlpaarungen mittels "chemical mismatch cleavage" (chemische Veränderung an nicht komplementären Positionen) zu einer spezifischen oder hinreichend selektiven Rückgratspaltung an diesen Positionen führen.According to the invention, it is further preferred that the base mismatches lead to a specific or sufficiently selective backbone cleavage at these positions by means of "chemical mismatch cleavage" (chemical change at non-complementary positions).
Außerdem ist bevorzugt, daß man die DNA an den Basenfehl- paarungen enzymatisch spezifisch oder hinreichend selektiv spaltet.It is also preferred that the DNA is cleaved enzymatically specifically or sufficiently selectively at the base mismatches.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist auch bevorzugt, daß man im Schritt e) 1 DNA-Fragmente erhält, deren Größe ei- nen Rückschluß auf die Spaltungspositionen und damit auf die Position der Methylcytosine und/oder die zwischen verschiedenen Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen veränderlichen Methylierungspositionen erlaubt.In the method according to the invention, it is also preferred that 1 DNA fragments are obtained in step e), the size of which allows conclusions to be drawn about the cleavage positions and thus the position of the methylcytosines and / or the methylation positions which vary between different individuals, tissues, cell lines or cells allowed.
Bevorzugt ist, daß man die Analyse der GrößeIt is preferred that the size analysis
(Molekulargewichte) der DNA-Fragmente mittels Massenspek- trometrie durchführt.(Molecular weights) of the DNA fragments carried out by means of mass spectrometry.
Besonders bevorzugt ist dabei, daß man die Fragmente mit- tels Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI) analysiert.It is particularly preferred that the fragments are analyzed using matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI).
Besonders bevorzugt ist ferner, daß man die Fragmente mittels Electrospray Ionisations Massenspektrometrie (ESI) analysiert. Insbesondere bevorzugt ist es, daß man die Größe der im Schritt e) erzeugten Fragmente der Leistungsfähigkeit des Massenspektrometers anpaßt.It is also particularly preferred that the fragments are analyzed by means of electrospray ionization mass spectrometry (ESI). It is particularly preferred that the size of the fragments generated in step e) is adapted to the performance of the mass spectrometer.
Ganz besonders bevorzugt ist es, daß man mehrere PCRs eines Genabschnittes ausführt und die Primer schrittweise derart neu setzt, daß die zu erwartende Fragmentgröße jeweils mindestens in einer dieser PCRs in den mittels Mas- senspektrometrie nachweisbaren Massenbereich fällt.It is very particularly preferred that several PCRs of a gene segment are carried out and the primers are gradually reset in such a way that the fragment size to be expected falls in at least one of these PCRs in the mass range detectable by mass spectrometry.
Besonders bevorzugt ist es, daß man einen der PCR-Primer schrittweise um den maximal nachweisbaren Massenbereich des Massenspektrometers relativ zu dem anderen neu positioniert .It is particularly preferred that one of the PCR primers is gradually repositioned relative to the other around the maximum detectable mass range of the mass spectrometer.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß man im Schritt b) einen Primer der PCR mit einer chemischen Funktion versieht, so daß sich das PCR Produkt an einer Oberfläche immobilisieren läßt.It is preferred according to the invention that in step b) a PCR primer is provided with a chemical function so that the PCR product can be immobilized on a surface.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es auch, daß man das im Schritt b) hergestellte PCR Produkt in verschiedene Reaktionsgefäße überführt und die Oberflächen der Reaktionsgefäße chemisch so geartet sind, daß das PCR Produkt dar- an gebunden werden kann.It is also preferred according to the invention that the PCR product produced in step b) is transferred to different reaction vessels and the surfaces of the reaction vessels are chemically such that the PCR product can be bound to them.
Besonders bevorzugt ist es auch, daß man im Schritt c) hergestellte PCR Produkte verschiedener Individuen in verschiedene, wie oben beschrieben zubereitete Reaktions- gefäße überführt.It is also particularly preferred that PCR products produced in step c) are transferred from different individuals into different reaction vessels prepared as described above.
Außerdem ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man für den Schritt e) ein Enzym einsetzt, welches mit einem nicht komplementären Basenpaar einen Komplex bildet. Ganz besonders st dabei bevorzugt, daß dieses Enzym MutS ist .In addition, it is preferred according to the invention that an enzyme is used for step e) which forms a complex with a non-complementary base pair. It is particularly preferred that this enzyme is MutS.
Weiterhin ist bevorzugt, daß das Enzym eine Markierung tragt, durch welche ein Komplex veranschaulicht werden kann.It is further preferred that the enzyme carries a label by which a complex can be illustrated.
Bevorzugt ist erfmdungsgemaß auch, daß die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemilummeszenzmarkie- rung, ein Massentag oder ein photochemisch abspaltbares Massentag ist.It is also preferred according to the invention that the label is a fluorescent label, a chemiluminescent label, a mass day or a photochemically removable mass day.
Weiterhin ist erfmdungsgemaß bevorzugt, daß man eine amplifizierte DNA-Probe gemäß Schritt c) in Anspruch 1, welche einen Unterschied zu einer ampliflzierten DNA- Probe im Schritt b) in Anspruch 1 aufzeigt, in einem zweiten Durchlauf des Verfahrens selbst eine DNA-Probe nach Schritt b) in Anspruch 1 wird und mit allen anderen zu untersuchenden DNA-Proben vergleicht.It is further preferred according to the invention that an amplified DNA sample according to step c) in claim 1, which shows a difference to an amplified DNA sample in step b) in claim 1, is followed by a DNA sample itself in a second run of the method Step b) in claim 1 and is compared with all other DNA samples to be examined.
Auch ist erfmdungsgemaß bevorzugt, daß man eine Vorse- lektion der massenspektrometπsch im Detail zu untersuchenden Genabschnitte über eine Fluoreszenzmarkierung oder Chemiluminiszenzmarkierung des immobilisierten DNA- Stranges durchfuhrt, deren Fehlen nach Durchfuhrung der Schritte d) und e) des Anspruchs 1 und eines Waschschritts das Vorhandensem von methylierten Cytosmen im untersuchten genomischen DNA-Abschnitt anzeigt.It is also preferred according to the invention that a preselection of the gene sections to be examined in detail by mass spectrometry is carried out by means of fluorescent labeling or chemiluminescent labeling of the immobilized DNA strand, the absence of which after carrying out steps d) and e) of claim 1 and a washing step the presence of indicates methylated cytosms in the examined genomic DNA section.
Ferner ist erfmdungsgemaß bevorzugt, daß man eine Vorselektion der massenspektrometrisch im Detail zu untersuchenden Genabschnitte über eine unspezifischere Variante gemäß den Ansprüchen 20 bis 23 durchfuhrt.It is also preferred according to the invention that a preselection of the gene sections to be examined in detail by mass spectrometry is carried out using a more unspecific variant according to claims 20 to 23.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfah- rens, umfassend DNA von mindestens zwei möglichst verschiedenen Individuen, Geweben, Zellinien oder Zellen sowie Reagenzien um die variablen Methylierungspositionen aufzuzeigen.The present invention furthermore relates to a kit for carrying out the process according to the invention. rens, comprising DNA from at least two different individuals, tissues, cell lines or cells as well as reagents to show the variable methylation positions.
Das erfindungsgemäße umfaßt ferner vollständig methylier- te und/oder demethylierte DNA und Reagenzien, die zum Nachweis von methylierten Cytosinen in einer beliebigen DNA-Probe erforderlich sind.The invention further comprises completely methylated and / or demethylated DNA and reagents which are required for the detection of methylated cytosines in any DNA sample.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Identifikation von 5-Methylcytosin-Positionen in genomischer DNA, die unterschiedlichsten Ursprungs sein kann. Die genomische DNA wird zunächst chemisch so behandelt, daß sich ein Un- terschied in der Reaktion der Cytosin-Basen zu den 5-The method according to the invention serves to identify 5-methylcytosine positions in genomic DNA, which can be of very different origins. The genomic DNA is first treated chemically so that there is a difference in the reaction of the cytosine bases to the 5-
Methylcytosin-Basen ergibt. Mögliche Reagenzien sind hier z. B. Disulfit (auch als Bisulfit oder Pyrosulfit bezeichnet), Hydrazin und Permanganat. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird die genomische DNA mit Di- sulfit in Gegenwart von Hydrochinon oder Hydrochinonderi- vaten behandelt, wobei selektiv nach anschließender alkalischer Hydrolyse die Cytosin-Basen in Uracil umgewandelt werden. 5-Methylcytosin bleibt unter diesen Bedingungen unverändert. Nach einem Aufreinigungsprozeß, der der Ab- trennung des überschüssigen Disulfits dient, wird nun ein bestimmter Abschnitt der vorbehandelten genomischen DNA in einer Polymerasereaktion amplifiziert. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird hier die Polymerase- kettenreaktion eingesetzt. Anschließend wird derselbe Ab- schnitt einer anderen genomischen DNA-Probe gleichermaßen amplifiziert. Die beiden Amplifikate werden zusammengegeben, wodurch sich partiell Heteroduplexes ausbilden. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt dies derart, daß einer der PCR-Primer eine zur Immobilisierung geeignete Funktion trägt und daß nur ein Strang aus dem Amplifikat der ersten Probe immobilisiert wird und anschließend eine Hybridisation mit dem Amplifikat der zweiten Probe erfolgt. In einer weiteren bevorzugten Va- riante wird eine Vielzahl unterschiedlicher Amplifikate desselben Nukleinsäure-Abschnittes auf diese Art und Weise gegen den immobilisierten Einzelstrang aus dem Amplifikat der ersten Probe hybridisiert, welches auf viele Wells einer Mikrotiterplatte verteilt wurde. In jedem Well kann nun ein Hybridisationsexperiment durchgeführt werden.Methylcytosine bases results. Possible reagents are e.g. B. disulfite (also called bisulfite or pyrosulfite), hydrazine and permanganate. In a preferred variant of the method, the genomic DNA is treated with disulfite in the presence of hydroquinone or hydroquinone derivatives, the cytosine bases being selectively converted to uracil after subsequent alkaline hydrolysis. 5-Methylcytosine remains unchanged under these conditions. After a purification process which serves to remove the excess disulfite, a certain section of the pretreated genomic DNA is now amplified in a polymerase reaction. In a preferred variant of the method, the polymerase chain reaction is used here. The same section of another genomic DNA sample is then amplified equally. The two amplificates are combined, which partially forms heteroduplexes. In a preferred variant of the method, this is done in such a way that one of the PCR primers is used for immobilization has a suitable function and that only one strand of the amplificate of the first sample is immobilized and then hybridization with the amplificate of the second sample takes place. In a further preferred variant, a multiplicity of different amplified products of the same nucleic acid section are hybridized in this way against the immobilized single strand from the amplified product of the first sample, which was distributed over many wells of a microtiter plate. A hybridization experiment can now be carried out in each well.
Nach der Hybridisation wird ein Verfahren durchgeführt, das an den Positionen, in denen eine Basenfehlpaarung in der Heteroduplex auftritt, eine nachweisbare Markierung hinterläßt. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird dies durch Chemical Mismatch Cleavage durchgeführt, das an den Positionen, an denen eine Basenfehlpaarung auftritt, zu einem Rückgratbruch führt. Die dadurch er- haltenen Fragmente lassen sich durch ein beliebiges Verfahren, das die Größe von DNA-Fragmenten aufzeigen kann, analysieren. Ein solches Verfahren sollte idealerweise Rückschlüsse auf jede Position in dem amplifizierten Nu- kleinsäureabschnitt der Probe erlauben, an denen eine Ba- senfehlpaarung in der Heteroduplex auftrat. Basenfehlpaarungen in der Heteroduplex sind insbesondere dann vorhanden, wenn in der DNA aus einer Probe an dieser Position Cytosin vorhanden war, das in Uracil umgewandelt wurde, in der anderen jedoch 5-Methylcytosin, das bei der chemi- sehen Vorbehandlung unverändert blieb. Das Verfahren kann sowohl für den Vergleich zweier oder mehrerer genomischer DNA Proben genutzt werden, in diesem Fall liefert die Analyse der Fragmente nur die Unterschiede im Methylie- rungsmuster zwischen den beiden Proben im jeweiligen amplifizierten Nukleinsäure Abschnitt. Es ist aber auch möglich, eine vollständig enzymatisch am C methylierte oder demethylierte DNA als Referenz einzusetzen. In diesem Fall liefert die Analyse der Fragmente alle 5- Methylcytosin-Positionen im jeweiligen amplifizierten Nukleinsäure Abschnitt.After hybridization, a procedure is carried out which leaves a detectable mark at the positions in which a base mismatch occurs in the heteroduplex. In a preferred variant of the method, this is carried out by chemical mismatch cleavage, which leads to a backbone fracture at the positions where a base mismatch occurs. The fragments obtained in this way can be analyzed by any method that can show the size of DNA fragments. Such a method should ideally allow conclusions to be drawn about any position in the amplified nucleic acid section of the sample at which a base mismatch occurred in the heteroduplex. Base mismatches in the heteroduplex are particularly present when cytosine was present in the DNA from a sample at this position, which was converted to uracil, but in the other 5-methylcytosine, which remained unchanged in the chemical pretreatment. The method can be used for the comparison of two or more genomic DNA samples, in this case the analysis of the fragments only provides the differences in the methylation pattern between the two samples in each case amplified nucleic acid section. However, it is also possible to use a completely methylated or demethylated DNA as a reference. In this case, analysis of the fragments provides all 5-methylcytosine positions in the respective amplified nucleic acid section.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahren wird Massenspektrometrie für die Fragmentanalyse einge- setzt. Die Fragmente können nach vorheriger Aufreinigung im MALDI-Massenspektrometer analysiert werden. Alternativ können die Lösungen mit Electrospray Ionisations Massenspektrometrie (ESI) analysiert werden. Je nach Leistungsfähigkeit der Methode und des eingesetzten Instrumentes kann es erforderlich sein, den betreffenden Nukleinsäure- abschnitt in mehreren Teilschritten zu untersuchen, indem in mehreren PCRs ein Primer schrittweise neu positioniert wird und sich damit unterschiedliche Teilamplifikate ergeben ("Primer Walking").In a particularly preferred variant of the method, mass spectrometry is used for the fragment analysis. After purification, the fragments can be analyzed in the MALDI mass spectrometer. Alternatively, the solutions can be analyzed using electrospray ionization mass spectrometry (ESI). Depending on the performance of the method and the instrument used, it may be necessary to examine the nucleic acid section in question in several steps by repositioning a primer step by step in several PCRs and thus producing different partial amplificates ("primer walking").
In einer Variante des Verfahrens können die Basenfehlpaa- rungen - alternativ zur Analyse von Fragmenten nach einer Rückgratspaltung in der Heteroduplex - auch durch ein Enzym nachgewiesen werden, das mit einem nicht komplementä- ren Basenpaar einen Komplex bildet. In einer bevorzugten Variante ist dieses Enzym MutS, das eine Markierung, z. B. eine Fluoreszenz-, Chemiluminiszenz- oder Massenmarkierung, trägt.In a variant of the method, the base mismatches - as an alternative to the analysis of fragments after a backbone cleavage in the heteroduplex - can also be detected by an enzyme that forms a complex with a non-complementary base pair. In a preferred variant, this enzyme is MutS, which is a label, e.g. B. carries a fluorescent, chemiluminescent or mass marking.
In einer weiteren Variante des Verfahrens wird das Vorhandensein von Basenfehlpaarung, das heißt in diesem Fall auch von relevanter Information in dem amplifizierten Nukleinsäure Abschnitt, durch eine Fluoreszenz- oder Chemi- luminiszenzmarkierung nachgewiesen. In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird ein immobilisierter DNA Strang aus dem Amplifikat der Probe 1 an dem nicht zur Immobilisierung dienenden Ende mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen. Mit dem Amplifikat der Probe 2 werden Heteroduplexes gebildet, die einem Chemical MismatchIn a further variant of the method, the presence of base mismatch, that is to say in this case also of relevant information in the amplified nucleic acid section, is detected by means of a fluorescence or chemiluminescence label. In a preferred one As a variant of the method, an immobilized DNA strand from the amplificate of sample 1 is provided with a fluorescent label at the end not used for immobilization. Heteroduplexes are formed with the amplificate of sample 2, using a chemical mismatch
Cleavage unterworfen werden. Findet eine Rückgratspaltung am immobilisierten Strang statt, so verschwindet nach einem denaturierenden Waschschritt die Fluoreszenzmarkierung, wird der Strang nicht gespalten, so bleibt die Markierung erhalten. Nur die Amplifikate, die gespalten wurden, werden nachfolgend massenspektrometrisch näher untersucht .Be subjected to cleavage. If there is a backbone cleavage on the immobilized strand, the fluorescent label disappears after a denaturing washing step, if the strand is not cleaved, the label is retained. Only the amplificates that have been cleaved are subsequently examined in more detail by mass spectrometry.
BeispieleExamples
Beispiel 1example 1
Verfahren zur Auffindung aller methylierten Cytosin-Method of finding all methylated cytosine
PositionenPositions
Die zu untersuchende genomische DNA stammend aus einerThe genomic DNA to be examined comes from a
Zellinie oder möglichst nur einer Zelle wird auf zwei Reaktionsgefäße aufgeteilt und die eine Hälfte enzymatisch entweder vollständig am Cytosin methyliert oder demethy- liert. Das Enzym wird thermisch inaktiviert und anschlie- ßend werden beide Teile wieder zusammengegeben und mit Disulfit und nachfolgend Alkali behandelt. Nach einer Aufreinigung wird mittels PCR amplifiziert.The cell line or, if possible, only one cell is divided into two reaction vessels and the one half enzymatically either completely methylated on the cytosine or demethylated. The enzyme is thermally inactivated and then both parts are put together again and treated with disulfite and then alkali. After purification, it is amplified by means of PCR.
Das nun durchgeführte chemical mismatch cleavage, das für C Mismatches spezifisch ist, führt zu einer Spaltung an den Positionen einer jeweiligen Heteroduplex, an denen ein ursprünglich methyliertes C vorgelegen hat, falls einer vollständigen Demethylierung der einen Hälfte der genomischen Probe durchgeführt wurde. Umgekehrt erfolgt ei- ne Spaltung an allen ursprünglich nicht methylierten Positionen, falls eine vollständige Methylierung der einen Hälfte der genomischen Probe zuvor durchgeführt wurde. Zur Sicherheit können auch sowohl Methylierung als auch Demethylierung als Referenz durchgeführt werden, in diesem Fall müssen diese jedoch in zwei PCRs getrennt eingesetzt werden.The chemical mismatch cleavage now carried out, which is specific for C mismatches, leads to cleavage at the positions of a respective heteroduplex at which an originally methylated C was present if complete demethylation of one half of the genomic sample was carried out. Conversely, ne cleavage at all originally non-methylated positions if a complete methylation of one half of the genomic sample was carried out beforehand. For safety reasons, both methylation and demethylation can also be carried out as a reference, but in this case they have to be used separately in two PCRs.
Variante 1: Das obige Verfahren wird so durchgeführt, das in der PCR ein Primer eingesetzt wird, der so funktiona- lisiert ist, daß nach der PCR eine einfache und spezifische Immobilisierung ermöglicht wird. Die Immobilisierung erfolgt an beads oder an der Oberfläche einer Mikrotiter- platte. Dies erlaubt die einfache Abtrennung von Bestand- teilen der Polymerase- und mismatch cleavage Reaktionen. Nach der chemical mismatch cleavage Reaktion wird die Duplex thermisch denaturiert und die Lösung abpipettiert . Die DNA-Fragmente werden aus dieser Lösung auf ein rever- sed phase Material aufgebracht und gereinigt.Variant 1: The above method is carried out in such a way that a primer is used in the PCR which is functionalized in such a way that a simple and specific immobilization is made possible after the PCR. Immobilization takes place on beads or on the surface of a microtiter plate. This allows the simple separation of components of the polymerase and mismatch cleavage reactions. After the chemical mismatch cleavage reaction, the duplex is thermally denatured and the solution is pipetted off. The DNA fragments are applied from this solution to a reversed phase material and purified.
Im Massenspektrometer ergeben die Fragmente eine "Leiter" von Peaks, die auf die methylierten Positionen schließen läßt. Es fallen aufgrund der symmetrischen Methylierung an CpG Positionen theoretisch immer zwei Peaks je CpG an, die jeweils vom sense und vom antisense-Strang stammen.In the mass spectrometer, the fragments reveal a "ladder" of peaks, which indicates the methylated positions. Due to the symmetrical methylation at CpG positions, there are theoretically always two peaks per CpG, which originate from the sense and the antisense strand.
Variante 2: Die Reaktionen werden in Lösung durchgeführt und eine Aufreinigung nach den einzelnen Reaktionsschritten erfolgt, wenn notwendig, jeweils über ein reversed phase Material.Variant 2: The reactions are carried out in solution and purification after the individual reaction steps is carried out, if necessary, using a reversed phase material.
Variante 3: Mehrere Individuen oder Zelltypen werden parallel untersucht. Eine Referenz-DNA wird vollständig de- methyliert und anschließend mit Disulfit behandelt. Sie wird nach Aufreinigung mittels PCR amplifiziert. Dabei wird wiederum ein Primer verwendet, der eine zur Immobilisierung geeignete Funktion trägt. Die Lösung wird auf die wells einer Mikrotiterplatte verteilt und immobili- siert. Dann erfolgt eine Hybridisierung gegen die PCR- Produkte aus ebenfalls mit Disulfit behandelten Proben, jeweils eine je Well (siehe auch ausführliches Beispiel mit 97 Individuen) .Variant 3: Several individuals or cell types are examined in parallel. A reference DNA is completely demethylated and then treated with disulfite. she is amplified by PCR after purification. Again, a primer is used which has a function suitable for immobilization. The solution is distributed onto the wells of a microtiter plate and immobilized. This is followed by hybridization against the PCR products from samples also treated with disulfite, one for each well (see also detailed example with 97 individuals).
Variante 4: In dem Fall, daß das Massenspektrometer den Meßbereich nicht abdecken kann, der für die Analyse des gesamten PCR-Produktes auf Methylierungen erforderlich wäre, kann der Bereich von Interesse auch schrittweise abgetastet werden, indem mehrere PCRs durchgeführt werden und jeweils einer der Primer um den jeweiligen Meßbereich des Massenspektrometers näher an den anderen herangesetzt wird. Damit wird beispielsweise immer nur der Bereich erfaßt, der zwischen dem zu verschiebenden Primer der jeweiligen und der nächsten PCR liegt. Das Verfahren ist mit den anderen Varianten kombinierbar.Variant 4: In the event that the mass spectrometer cannot cover the measuring range that would be required for the analysis of the entire PCR product for methylations, the area of interest can also be scanned step by step by performing several PCRs and one of the primers in each case the respective measuring range of the mass spectrometer is approached closer to the other. This means, for example, that only the area that lies between the primer of the respective and the next PCR to be shifted is always detected. The process can be combined with the other variants.
Beispiel 2Example 2
Verfahren zur Auffindung von Positionen mit variablerProcedure for finding positions with variable
Cytosin-MethylierungCytosine methylation
DNA verschiedener Individuen oder Zellinien wird gepoolt und wie oben beschrieben eine Behandlung mit Disulfit durchgeführt. Nach alkalischer Hydrolyse der Bisulfit- Addukte und Aufreinigung der Produkt-DNA wird diese mit- tels PCR amplifiziert. Anschließend wird erneut aufgereinigt und das PCR-Produkt nach einigen Minuten Reannealing bei 25 °C mit Os04 an den Positionen mit einem C Mismatch gespalten (chemical mismatch cleavage) . Ein Mismatch C gegen A tritt immer dann auf, wenn vor der Bisulfit- Behandlung nur in einigen Individuen dort ein methylier- tes Cytosin vorhanden war. Gleichsam werden bei diesem Prozeß auch etwaige SNPs ( Single nucleotide polymor- phisms) zur Spaltung der DNA führen. Diese müssen von den aufzufindenden Methylierungspositionen unterschieden werden, was durch das oben beschriebene Verfahren zur Auffindung aller methylierten Cytosine gewährleistet ist.DNA from different individuals or cell lines is pooled and treatment with disulfite is carried out as described above. After alkaline hydrolysis of the bisulfite adducts and purification of the product DNA, this is amplified by means of PCR. It is then purified again and, after a few minutes of reannealing at 25 ° C., the PCR product is cleaved with Os0 4 at the positions using a C mismatch (chemical mismatch cleavage). A mismatch C against A always occurs if before the bisulfite Treatment only in some individuals where a methylated cytosine was present. At the same time, any SNPs (single nucleotide polymorphisms) will also result in the cleavage of the DNA in this process. These must be differentiated from the methylation positions to be found, which is ensured by the method described above for finding all methylated cytosines.
Die Produkt DNA wird nun massenspektrometrisch wie oben beschrieben untersucht. Wenn das anfangs generierte PCR- Produkt eine größere Länge aufweist als mit der zur Verfügung stehenden Technologie seitens der Massenspektrome- trie nachzuweisen ist, so ist es möglich, daß die durch das chemical mismatch cleavage produzierten Fragmente nicht nachweisbar sind. Um dies zu umgehen, können mehrere PCRs iterativ durchgeführt werden, das heißt das ein Primer immer konstant gehalten wird, während der andere Primer immer in mehreren Schritten jeweils um die Nachweisgrenze des Massenspektrometers näher an dem anderen Primer positioniert wird (Primer walking) .The product DNA is now examined by mass spectrometry as described above. If the initially generated PCR product has a greater length than can be detected using the available technology on the part of mass spectrometry, it is possible that the fragments produced by the chemical mismatch cleavage cannot be detected. To avoid this, several PCRs can be carried out iteratively, i.e. one primer is always kept constant, while the other primer is always positioned in several steps closer to the other primer by the detection limit of the mass spectrometer (primer walking).
Beispiel 3Example 3
Verfahren mit 97 IndividuenProcedure with 97 individuals
Ein genomischer Abschnitt eines IndividuumsA genomic section of an individual
(Referenzindividuum) wird mit Disulfit behandelt und damit die Cytosine nach anschließender alkalischer Hydrolyse des Bisulfitadduktes in Uracile umgewandelt. Die Me- thylcytosine bleiben bei dieser Reaktionsfolge unangeta- stet. Das Produkt wird aufgereinigt und mittels PCR amplifiziert. Einer der PCR-Primer ist am 5'Ende mit einer chemischen Modifikation versehen, die zur Immobilisierung dient. Das Produkt dieser PCR wird in die 96 Kammern einer Mikrotiterplatte gegeben und die Bindung der PCR Produkte mit der Oberfläche induziert. Da nur ein Primer mit der chemischen Modifikation für die Bindung versehen ist, bindet nur ein DNA Strang an die Oberfläche. Die Platte wird gewaschen um Reagenzien der Bin- dungschemie und die komplementären Stränge zu beseitigen. Somit ist die Platte mit dem Referenz-DNA-Stück vorbereitet. Der gleiche genomische Abschnitt wird in jedem der 96 anderen Individuen analog mit Disulfit behandelt und anschließend amplifiziert. Für diese PCR werden je zwei normale, unmodifizierte Primer der gleichen Sequenz wie für das Referenzindividuum verwendet. Die 96 PCR Produkte werden in die 96 Wells der vorbereiteten Platte gegeben. Durch Aufheizen und langsames Abkühlen werden die komplementären Stränge der 96 Individuen an die Referenz DNA hybridisiert (Bildung der Heteroduplex) . Die 96 Individuen und Reagenzien vorheriger Reaktionen zu beseitigen. Eine Os04-Lösung wird in jedes der 96 Wells zugegeben, inkubiert und anschließend mit Piperidin ein Rückgratbruch in einer Heteroduplex mit einem nicht komplementä- ren Basenpaar, von der eine Base C ist, induziert. Dies ist immer dann der Fall, wenn nur in einem Strang der Heteroduplex, das heißt in einem der Individuen, ein Me- thylcytosin anstelle eines Cytosins vorgelegen hat. In diesem Fall wurde nur das Cytosin des einen Individuums vor der PCR in ein Uracil überführt, wodurch sich in der Heteroduplex mit dem Gegenstrang eines anderen Individuums ein Mismatch ergibt. Der Assay ergibt also nicht direkt alle methylierten Cytosine eines genomischen Abschnittes, sondern nur diejenigen, die zwischen unter- schiedlichen Individuen, Geweben, Zellinien oder einzelnen Zellen variabel sind.(Reference individual) is treated with disulfite and the cytosines are converted into uraciles after subsequent alkaline hydrolysis of the bisulfite adduct. The methyl cytosines remain untouched in this reaction sequence. The product is purified and amplified using PCR. One of the PCR primers is provided at the 5 'end with a chemical modification that is used for immobilization. The product of this PCR is placed in the 96 chambers of a microtiter plate and the binding of the PCR products with the surface induced. Since only one primer is provided with the chemical modification for the binding, only one DNA strand binds to the surface. The plate is washed to remove binding chemistry reagents and complementary strands. The plate with the reference DNA piece is now prepared. The same genomic section is treated analogously with disulfite in each of the 96 other individuals and then amplified. Two normal, unmodified primers of the same sequence as for the reference individual are used for this PCR. The 96 PCR products are placed in the 96 wells of the prepared plate. The complementary strands of the 96 individuals are hybridized to the reference DNA by heating and slow cooling (formation of the heteroduplex). Eliminate the 96 individuals and reagents from previous reactions. An Os0 4 solution is added to each of the 96 wells, incubated and then a backbone break in a heteroduplex with a non-complementary base pair, one base of which is C, is induced with piperidine. This is always the case if the heteroduplex, that is to say in one of the individuals, has only one strand of methyl cytosine instead of one cytosine. In this case, only the cytosine of one individual was converted into an uracil before the PCR, which results in a mismatch in the heteroduplex with the counter strand of another individual. The assay therefore does not directly yield all methylated cytosines of a genomic section, but only those that are variable between different individuals, tissues, cell lines or individual cells.
Die Heteroduplex wird durch Aufheizen aufgeschmolzen und die Lösung in ein Massenspektrometer überführt. Beispiel 4The heteroduplex is melted by heating and the solution is transferred to a mass spectrometer. Example 4
Überführen der Lösung ins MassenspektrometerTransfer the solution to the mass spectrometer
Eine gute Variante ist die Lösung nach dem Schmelzen der Heteroduplex in eine Pipettenspitze aufzunehmen, die mit einem reversed-phase Material bestückt ist. Die DNA Produkte binden daran, indem sie hydrophobe Wechselwirkungen über ihre Trialkylammonium-Gegenionen ausbilden und kön- nen so in mehreren Waschschritten von Reagenzien der chemical mismatch cleavage gereinigt werden. Mit 30 % Aceto- nitril können die DNA Produkte wieder vom reverse-phase Material gelöst werden. Es bietet sich dabei an, die Produkte direkt auf eine vorbereitete Matrix auf einem MALDI Target zu geben. Nach dem Eintrocknen wird das Target ins Massenspektrometer eingeführt und die Produkte analysiert.A good variant is to take the solution after melting the heteroduplex in a pipette tip that is equipped with a reversed-phase material. The DNA products bind to this by forming hydrophobic interactions via their trialkylammonium counterions and can thus be cleaned of chemical mismatch cleavage reagents in several washing steps. With 30% acetonitrile, the DNA products can be detached from the reverse phase material. It makes sense to place the products directly on a prepared matrix on a MALDI target. After drying, the target is introduced into the mass spectrometer and the products are analyzed.
Beispiel 5 Vorselektion mittels Fluoreszenzmarkierung von für die Methylierungsdetektion relevanten GenabschnittenExample 5 Preselection by means of fluorescent labeling of gene segments relevant for methylation detection
Die zu untersuchende genomische DNA wird nach der wie oben beschriebenen Bisulfit Reaktion mit nachfolgender PCR Amplifikation, bei der wiederum einer der Primer eine zur nachfolgenden Immobilisierung dienliche Funktion trägt, an Beads oder einer entsprechend beschichteten Mi- krotiterplatte immobilisiert. Vollständig demethylierte DNA, wie die Proben-DNA behandelt, wird als Referenz DNA verwendet und bildet mit der immobilisierten Proben-DNA eine Heteroduplex. Dann wird enzymatisch, beispielsweise mit terminal transferase, an die 3 '-Enden des Produktes eine einzelne fluoreszenzmarkierte Base angehängt. Die nachfolgend durchgeführte "Chemical Mismatch Cleavage" Reaktion führt in dem Fall, das sich ein C/A Mismatch in dem Produkt befindet, zu einer Spaltung des immobilisierten Stranges, so daß nach der thermischen Dehybridisie- rung alle Fluoreszenzmarkierungen im nachfolgenden Wasch- schritt entfernt werden. War also eine Methylierung innerhalb des Amplifikates vorhanden, so tritt keine Fluoreszenz in der Mikrotiterplatte oder am bead mehr auf. Diese bleibt nur dann erhalten, wenn kein Mismatch vorliegt und damit keine 5-Methylcytosine im fraglichen Gen- abschnitt vorhanden sind. Bei dem Verfahren ist zu berücksichtigen, daß z. B. SNPs ein falsch positives Signal ergeben können.The genomic DNA to be investigated is immobilized on beads or a correspondingly coated microtiter plate after the bisulfite reaction as described above with subsequent PCR amplification, in which one of the primers in turn has a function which is useful for the subsequent immobilization. Fully demethylated DNA, treated as the sample DNA, is used as the reference DNA and forms a heteroduplex with the immobilized sample DNA. Then a single fluorescence-labeled base is appended enzymatically, for example with terminal transferase, to the 3 'ends of the product. The "Chemical Mismatch Cleavage" carried out below In the event that there is a C / A mismatch in the product, the reaction cleaves the immobilized strand, so that after the thermal dehybridization, all fluorescent labels are removed in the subsequent washing step. If there was methylation within the amplified product, fluorescence no longer occurs in the microtiter plate or on the bead. This is only retained if there is no mismatch and therefore no 5-methylcytosines are present in the gene segment in question. In the process, it should be borne in mind that e.g. B. SNPs can give a false positive signal.
Sinngemäß kann dieses Verfahren auch zur einfachen, fluo- reszenzbasierten Detektion von 5-Methylcytosinen in kleinen Genabschnitten, z. B. Promotoren genutzt werden. Es kann aber nur die Aussage getroffen werden, ob in der fraglichen Region Methylierungen vorliegen oder nicht, nicht aber wieviele und an welchen Positionen. Dem steht allerdings ein relativ geringer experimenteller Aufwand und eine gute Parallelisierbarkeit entgegen.This method can also be used for simple, fluorescence-based detection of 5-methylcytosines in small gene segments, e.g. B. promoters can be used. However, only the statement can be made as to whether or not there are methylations in the region in question, but not how many and at which positions. However, there is a relatively small amount of experimentation and good parallelism.
Bei den als relevant klassifizierten Genabschnitten kann dann analog einem der oben angeführten Beispiele die ge- naue Position den Methylcytosine durch Massenspektrome- trie ermittelt werden.In the gene segments classified as relevant, the exact position of the methylcytosines can then be determined by mass spectrometry analogously to one of the examples given above.
Beispiel 6Example 6
Vorselektion von Heteroduplexes mit MismatchesPreselection of heteroduplexes with mismatches
Die in einer Mikrotiterplatte immobilisierten Heteroduplexes werden zunächst mit einer Lösung von MutS, an welches ein fluoreszenter Farbstoff gebunden ist, zusammengebracht. Nur die Gefäße, in denen sich MutS an Basen- fehlpaarungspositionen angelagert hat, was sich daduch zeigt, daß nach mehreren Waschschritten immer noch die Fluoreszenz detektierbar ist, werden nachfolgend dem chemical mismatch cleavage unterworfen und im Massenspektrometer analysiert. Dadurch wird Zeit im Massenspektrometer und die Kosten für die Aufreinigung gespart, indem die Analyse von Proben ohne nachweisbare epigenetische Information vermieden wird. The heteroduplexes immobilized in a microtiter plate are first brought together with a solution of MutS, to which a fluorescent dye is bound. Only the vessels in which MutS mismatch positions, which shows that after several washing steps the fluorescence is still detectable, are subsequently subjected to chemical mismatch cleavage and analyzed in the mass spectrometer. This saves time in the mass spectrometer and the cost of purification by avoiding the analysis of samples without demonstrable epigenetic information.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Identifikation von 5-Methylcytosin- Positionen in genomischer DNA dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Verfahrensschritte ausführt:1. A method for identifying 5-methylcytosine positions in genomic DNA, characterized in that the following method steps are carried out:
a) man behandelt die genomische DNA einer Zelle, einer Zellinie, eines Gewebes oder eines Individuums chemisch derart, daß Cytosin und 5-Methylcytosin unterschiedlich reagieren und sich in der Duplex ein unterschiedliches Basenpaarungsverhalten der beiden Produkte ergibt,a) the genomic DNA of a cell, a cell line, a tissue or an individual is chemically treated in such a way that cytosine and 5-methylcytosine react differently and the duplex results in a different base pairing behavior of the two products,
b) man amplifiziert denselben Nukleinsäure Abschnitt mittels einer Polymerasereaktion,b) the same nucleic acid section is amplified by means of a polymerase reaction,
c) man behandelt den gleichen Nukleinsäure Abschnitt mindestens einer weiteren Zelle, Zellinie, Gewebes oder Individuums oder einer beliebigen Referenz-DNA entsprechend den Schritten a) und b) ,c) treating the same nucleic acid section of at least one further cell, cell line, tissue or individual or any reference DNA in accordance with steps a) and b),
d) man bildet aus den mindestens zwei Amplifikaten der Schritte b) und c) Heteroduplexes,d) heteroduplexes are formed from the at least two amplificates of steps b) and c),
e) man führt durch eine Reaktion, die spezifisch ist für nicht komplementäre Basenpaare, eine aufzeigbare Markierung in die Heteroduplex ein.e) a demonstrable label is introduced into the heteroduplex by a reaction which is specific for non-complementary base pairs.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es zur Identifikation von Unterschieden im Cytosin-Methylierungsmuster zwischen verschiedenen Zellen, Zellinien, Geweben und Individuen anwendet und nur Positionen aufzeigt, in denen die Cytosin- Methylierung zwischen unterschiedlichen Zellen, Zellinien, Geweben oder Individuen variabel ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that it is used to identify differences in the cytosine methylation pattern between different cells, cell lines, tissues and individuals and only shows positions in which the cytosine methylation between different cells, cell lines, tissues or Individuals is variable.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt a) gemäß Anspruch 1 ein Disulfit (Bisulfit, Pyrosulfit) als Reagenz zur selektiven Umwandlung von Cytosin in Uracil einsetzt, wobei 5-Methylcytosin unverändert bleibt.3. Process according to claims 1 to 2, characterized in that in step a) according to claim 1, a disulfite (bisulfite, pyrosulfite) is used as a reagent for the selective conversion of cytosine into uracil, 5-methylcytosine remaining unchanged.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man genomische DNA mehrerer Indi- viduen, Gewebe, Zellinien oder Zellen im Schritt b) des Anspruchs 1 gemeinsam amplifiziert.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that genomic DNA of several individuals, tissue, cell lines or cells are amplified together in step b) of claim 1.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man genomische DNA mehrerer Indi- viduen, Gewebe, Zellinien oder Zellen separat amplifiziert und anschließend gemeinsam gemäß Schritt e) des Anspruchs 1 behandelt.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that one amplifies genomic DNA of several individuals, tissue, cell lines or cells separately and then treated together according to step e) of claim 1.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Bildung von Heteroduplexes aus der DNA verschiedener Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen an den Positionen Basenfehlpaarungen erzeugt, an denen in der genomischen DNA ein 5-Methylcytosin lokalisiert war.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that one generates base mismatches at which a 5-methylcytosine was localized in the genomic DNA by forming heteroduplexes from the DNA of various individuals, tissues, cell lines or cells.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt d) durch Bildung von Heteroduplexes mit einer vollständig methylierten Referenz-DNA an den Positionen Basenfehlpaarungen auftreten, an denen sich in der genomischen DNA Cytosin befand.7. The method according to claim 1, characterized in that in step d) by forming heteroduplexes with a fully methylated reference DNA occur at the positions base mismatches at which there was cytosine in the genomic DNA.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt d) durch Bildung von Heteroduplexes mit einer vollständig demethylierten Referenz-DNA an den Positionen Basenfehlpaarungen auftreten, an denen sich in der genomischen DNA 5-Methylcytosin befand. 8. The method according to claim 1, characterized in that in step d) by forming heteroduplexes with a completely demethylated reference DNA occur at the positions base mismatches at which 5-methylcytosine was in the genomic DNA.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Basenfehlpaarungen mittels "chemical mismatch cleavage" (chemische Veränderung an nicht komplementären Positionen) zu einer spezifischen oder hinreichend selektiven Rückgratspaltung an diesen Positionen führen.9. The method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that the base mismatches by means of "chemical mismatch cleavage" (chemical change at non-complementary positions) lead to a specific or sufficiently selective backbone cleavage at these positions.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA an den Basenfehlpaarungen enzymatisch spezifisch oder hinreichend selektiv spaltet.10. The method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that the DNA is cleaved at the base mismatches enzymatically specifically or sufficiently selectively.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1. bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt e) gemäß Anspruch11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that in step e) according to claim
1 DNA-Fragmente erhält, deren Größe einen Rückschluß auf die Spaltungspositionen und damit auf die Position der Methylcytosine und/oder die zwischen verschiedenen Individuen, Gewebe, Zellinien oder Zellen ver- änderlichen Methylierungspositionen erlaubt.1 receives DNA fragments, the size of which allows conclusions to be drawn about the cleavage positions and thus the position of the methylcytosines and / or the methylation positions which can be changed between different individuals, tissues, cell lines or cells.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analyse der Größe (Molekulargewichte) der DNA-Fragmente mittels Massenspektrometrie durchführt.12. The method according to claim 11, characterized in that one carries out the analysis of the size (molecular weights) of the DNA fragments by means of mass spectrometry.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fragmente mittels Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Flugzeitmassenspektrome- trie (MALDI) analysiert.13. The method according to claim 12, characterized in that the fragments are analyzed by means of matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI).
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fragmente mittels Electrospray Ionisati- ons Massenspektrometrie (ESI) analysiert.14. The method according to claim 12, characterized in that the fragments are analyzed by means of electrospray ionization mass spectrometry (ESI).
15. Verfahren nach den Ansprüchen 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Größe der im Schritt e) ge- maß Anspruch 1 erzeugten Fragmente der Leistungsfähigkeit des Massenspektrometers anpaßt.15. The method according to claims 13 or 14, characterized in that the size of the in step e) measured according to claim 1 adapts fragments of the performance of the mass spectrometer.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man mehrere PCRs eines Genabschnittes ausführt und die Primer schrittweise derart neu setzt, daß die zu erwartende Fragmentgröße jeweils mindestens in einer dieser PCRs in den mittels Massenspektrometrie nachweisbaren Massenbereich fällt.16. The method according to claim 15, characterized in that several PCRs of a gene segment are carried out and the primers are gradually reset such that the expected fragment size falls at least in one of these PCRs in the mass range detectable by mass spectrometry.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der PCR-Primer schrittweise um den maximal nachweisbaren Massenbereich des Massenspektrometers relativ zu dem anderen neu positioniert.17. The method according to claim 16, characterized in that one of the PCR primers is gradually repositioned relative to the other around the maximum detectable mass range of the mass spectrometer.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt b) einen Primer der PCR mit einer chemischen Funktion versieht, so daß sich das PCR Produkt an einer Oberfläche immobi- lisieren läßt.18. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that in step b) a PCR primer is provided with a chemical function so that the PCR product can be immobilized on a surface.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das im Schritt b) hergestellte PCR Produkt in verschiedene Reaktionsgefäße über- führt und die Oberflächen der Reaktionsgefäße chemisch so geartet sind, daß das PCR Produkt daran gebunden werden kann.19. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the PCR product produced in step b) is transferred into different reaction vessels and the surfaces of the reaction vessels are of a chemical nature such that the PCR product can be bound to it.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt c) hergestellte20. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that one produced in step c)
PCR Produkte verschiedener Individuen in verschiedene nach Anspruch 19 zubereitete Reaktionsgefäße überführt.PCR products of different individuals transferred into different reaction vessels prepared according to claim 19.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für den Schritt e) ein Enzym einsetzt, welches mit einem nicht komplementären Basenpaar einen Komplex bildet.21. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that for step e) an enzyme uses, which forms a complex with a non-complementary base pair.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Enzym MutS ist.22. The method according to claim 21, characterized in that this enzyme is MutS.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Markierung trägt, durch welche ein Komplex veranschaulicht werden kann.23. The method according to claim 21, characterized in that the enzyme bears a label by which a complex can be illustrated.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemilumineszenzmarkierung, ein Massentag oder ein photochemisch abspaltbares Massentag ist.24. The method according to claim 21, characterized in that the label is a fluorescent label, a chemiluminescent label, a mass day or a photochemically cleavable mass day.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man eine amplifizierte DNA-Probe gemäß Schritt c) in Anspruch 1, welche einen Unterschied zu einer amplifizierten DNA-Probe im Schritt b) in Anspruch 1 aufzeigt, in einem zweiten Durchlauf des Verfahrens selbst eine DNA-Probe nach Schritt b) in Anspruch 1 wird und mit allen anderen zu untersuchenden DNA-Proben vergleicht.25. The method according to any one of claims 1 to 24, characterized in that an amplified DNA sample according to step c) in claim 1, which shows a difference to an amplified DNA sample in step b) in claim 1, in a second Passing the process itself a DNA sample according to step b) in claim 1 and compared with all other DNA samples to be examined.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Vorselektion der massen- spektrometrisch im Detail zu untersuchenden Genabschnitte über eine Fluoreszenzmarkierung oder Chemi- luminiszenzmarkierung des immobilisierten DNA- Stranges durchführt, deren Fehlen nach Durchführung der Schritte d) und e) des Anspruchs 1 und eines Waschschritts das Vorhandensein von methylierten Cytosinen im untersuchten genomischen DNA-Abschnitt anzeigt . 26. The method according to any one of claims 1 to 25, characterized in that a preselection of the gene sections to be examined in detail by mass spectrometry is carried out by means of fluorescent labeling or chemiluminescent labeling of the immobilized DNA strand, the absence of which after carrying out steps d) and e) of claim 1 and a washing step indicates the presence of methylated cytosines in the examined genomic DNA section.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Vorselektion der massen- spektrometrisch im Detail zu untersuchenden Genabschnitte über eine unspezifischere Variante gemäß den Ansprüchen 20 bis 23 durchführt.27. The method according to any one of claims 1 to 25, characterized in that a preselection of the gene segments to be examined in detail by mass spectrometry is carried out via a more unspecific variant according to claims 20 to 23.
28. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend DNA von mindestens zwei möglichst verschiedenen Individuen, Geweben, Zellinien oder Zellen sowie Reagenzien um die variablen Methylierungsposi- tionen aufzuzeigen.28. Kit for carrying out a method according to claim 1, comprising DNA from at least two possible different individuals, tissues, cell lines or cells and reagents to show the variable methylation positions.
29. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch lumfassend vollständig methylierte und/oder demethy- lierte DNA und Reagenzien, die zum Nachweis von methylierten Cytosinen in einer beliebigen DNA-Probe erforderlich sind. 29. Kit for carrying out the method according to claim lumens completely methylated and / or demethylated DNA and reagents which are required for the detection of methylated cytosines in any DNA sample.
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