DD293139A5

DD293139A5 - METHOD FOR CHARACTERIZING CERTAIN DNA SEQUENCES

Info

Publication number: DD293139A5
Application number: DD33009989A
Authority: DD
Inventors: Detlev Krueger; Viktoras Butkus; Monika Reuter; Claus-Dietmar Pein; Sigrid Hansen; Cornelia Schroeder
Original assignee: Humboldt-Universitaet Zu Berlin,Direktorat Fuer Forschung,De
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1991-08-22

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung bestimmter DNA-Sequenzen. Die Erfindung findet auf den Gebieten der Molekularbiologie und Gentechnik Anwendung. Ihr Wesen besteht darin, die DNA-Molekuele, deren nichtmethylierte Erkennungsorte durch eine entsprechende Restriktionsendonuklease geschnitten werden sollen, im Reaktionsgemisch mit einer zweiten, unmethylierten DNA-Species (vor allem Oligonukleotid-Duplexe, die den Erkennungsort enthalten) zu inkubieren. Auf diese Weise wird die methylierungsanzeigende Restriktionsendonuklease befaehigt, alle unmethylierten Erkennungsorte zu schneiden, waehrend spezifisch methylierte Erkennungsorte nach wie vor nicht angegriffen werden. Als sehr guenstig erweist sich dieses Verfahren fuer den Nachweis der Dcm-Methylierung mit Hilfe der Restriktionsendonuklease EcoRII.{Molekularbiologie; Gentechnik; DNA; DNA-Methylierung; Oligonukleotid-Duplexe; Restriktionsendonuklease; Dcm-Methylierung; EcoRII; BstNI; MvaI}The invention relates to a method for characterizing certain DNA sequences. The invention finds application in the fields of molecular biology and genetic engineering. Its essence is to incubate the DNA molecules whose non-methylated recognition sites are to be cut by an appropriate restriction endonuclease in the reaction mixture with a second, unmethylated DNA species (especially oligonucleotide duplexes containing the recognition site). In this way, the methylation-indicating restriction endonuclease is able to cut all unmethylated recognition sites, while specifically methylated recognition sites are still unaffected. This method proves to be very favorable for the detection of Dcm methylation with the aid of the restriction endonuclease EcoRII {Molecular Biology; genetic engineering; DNA; DNA methylation; Oligonucleotide duplexes; Restriction endonuclease; Dcm methylation; RII; BstNI; MvaI}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der biologischen Methylierung von DNA in spezifischen Nukleotidsequenzen. Sie ist somit anwendbar in der molekularbiologischen Forschung und in der Gentechnologie.The invention relates to a method for detecting the biological methylation of DNA in specific nucleotide sequences. It is thus applicable in molecular biology research and gene technology.

Characterization of the known prior art

Die biologische Methylierung bestimmter Nukleotidsequenzen in DNA-Molekülen, die zur Entstehung von 6-Methyladenin, 5-Methylcytosin oder N4-Methylcytosin in den entsprechenden DNA-Erkennungsorten führt, verändert die Wechselwirkung der DNA mit Proteinen. Sie hat wichtige funktioneile Konsequenzen für eine Vielzahl von molekularbiologischen Regulationsprozessen und verändert die Empfindlichkeit des DNA-Ortss gegenüber dem Schneiden durch bestimmte Restriktionsendonukleasen (KRÜGER, Biol. Zentralblatt 107 [1988] 257-266).The biological methylation of certain nucleotide sequences in DNA molecules, which leads to the formation of 6-methyladenine, 5-methylcytosine or N4-methylcytosine in the corresponding DNA recognition sites, alters the interaction of the DNA with proteins. It has important functional consequences for a large number of molecular biological regulatory processes and alters the sensitivity of the DNA site to cutting by certain restriction endonucleases (KRUGER, Biol. Zentralblatt 107 [1988] 257-266).

Eine bevorzugte Methode zum Nachweis der spezifischen DNA-Methylierung besteht in der vergleichenden Verdauung der DNA mit solchen isoschizomeren Restriktionsendonukleasen, die durch die spezifische Methylierung des DNA-Ortes in unterschiedlichem Maße gehemmt werden. Beispielsweise wird die Methylierung des internalen Cytosins in der Sequenz 5'-CCGG-S' zu 5-Methylcytosin mit Hilfe des Paares isoschizomerer Restriktionsendonukleasen Mspl und Hpall nachgewiesen, die beide diesen DNA-Ort erkennen. Nur das zweite Enzym wird durch die beschriebene Methylierung gehemmt, und zeigt diese somit an. Die Dom-Methylierung (Methylierung des internalen Cytosins in der Sequenz ö'-CCA/TGG-S' zu 5-Methylcytosin) wird durch vergleichende Verdauung mit den isochizomeren Restriktionsendonukleasen BstNI oder Mval (die durch diese Methylierung nicht am Schneiden gehindert werden) und EcoRII (die durch die Methylierung gehemmt wird und diese somit anzeigt) nachgewiesen (Mc CLELLAND und NELSON, Gene 74 [1988] 291-304).A preferred method of detecting specific DNA methylation is by comparative digestion of the DNA with such isoschizomeric restriction endonucleases, which are inhibited to varying degrees by the specific methylation of the DNA site. For example, the methylation of internal cytosine in the sequence 5'-CCGG-S 'to 5-methylcytosine is detected using the pair of isoschizomeric restriction endonucleases Mspl and Hpall, both of which recognize this DNA site. Only the second enzyme is inhibited by the methylation described, and thus indicates this. Dom methylation (methylation of the internal cytosine in the sequence δ'-CCA / TGG-S 'to 5-methylcytosine) is achieved by comparative digestion with the isochizomeric restriction endonucleases BstNI or Mval (which are not precluded by this methylation) and EcoRII (which is inhibited by the methylation and thus indicating this) has been detected (Mc CLELLAND and NELSON, Gene 74 [1988] 291-304).

Die Aussagefähigkeit der beschriebenen Methode wird jedoch durch den Befund eingeschränkt, daß bestimmte DNA-Species durch methylierungsanzeigende Restriktionsendonukleasen schlecht geschnitten werden, obwohl sie gar nicht die spezifische Methylierung tragen. Dies führt zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse, daß Methylierungen der DNA angenommen werden, die tatsächlich gar nicht vorhanden sind. Beispielsweise sind die DNAs der Bakterienviren T3 und T7 gegenüber EcoRII-Verdauung resistent, obwohl sie nicht spezifisch methyliert sind (KRÜGER et al., Eur. J. Biochem. 150 [1985] 323-330). Die vorliegende Erfindung schafft eine Möglichkeit, um eine sichere und aussagekräftige Bestimmung der spezifischen DNA-Methylierung unter Nutzung isochizomerer Restriktionsendonukleasen praktikabel zu machen.However, the significance of the method described is limited by the finding that certain DNA species are poorly cut by methylation-indicating restriction endonucleases, even though they do not carry the specific methylation at all. This leads to misinterpretation of the results that methylations of the DNA are assumed, which are actually not present. For example, the DNAs of the bacterial viruses T3 and T7 are resistant to EcoRII digestion, although they are not specifically methylated (KRÜGER et al., Eur. J. Biochem 150 (1985) 323-330). The present invention provides a way to make a safe and meaningful determination of specific DNA methylation practicable using isochimeric restriction endonucleases.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, das Vorliegen spezifischer Methylierungen in DNA-Molekülen sicherer und aussagefähiger als bisher zu bestimmen.The aim of the invention is to determine the presence of specific methylations in DNA molecules safer and more meaningful than before.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem es möglich wird, bestimmte DNA-Sequenzen hinsichtlich ihrer Methylierung zu charakterisieren. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß eine zweite DNA-Species (vor allem Oligonukleotid-Duplexe), die Erkennungsorte für die entsprechende Restriktionsendonuklease enthalten, zum Inkubationsgemisch von zu untersuchender DNA und Restriktionsendonuklease gegeben werden. Die Inkubation erfolgt unter den für die jeweilige Restriktionsendonuklease üblichen (Puffer- und Kofaktorkonzentrationen, pH-Wert, Temperatur, Zeitdauer der Inkubation) Bedingungen (MANIATIS et al.. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982). Überraschenderweise wird damit eine a-priori-Resistenz unmethylierter Erkennungsorte in der zu untersuchenden DNA aufgehoben, während spezifisch methylierte Erkennungsorte auch unter diesen Bedingungen nicht durch die Restriktionsendonuklease geschnitten werden. Damit wird erstmals eine sichere Unterscheidung zwischen spezifisch methylierten und unmethylierten DNA-Erkennungsorten für eine bestimmte methylierungsanzeigende Restriktionsendonuklease möglich.The invention has for its object to develop a method by which it is possible to characterize certain DNA sequences in terms of their methylation. The object has been achieved by adding a second DNA species (especially oligonucleotide duplexes) containing recognition sites for the corresponding restriction endonuclease to the incubation mixture of DNA to be examined and restriction endonuclease. The incubation is carried out under conditions customary for the respective restriction endonuclease (buffer and cofactor concentrations, pH, temperature, incubation time) conditions (MANIATIS et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982 ). Surprisingly, this avoids a priori resistance of unmethylated recognition sites in the DNA to be examined, while specifically methylated recognition sites are not cut by the restriction endonuclease even under these conditions. For the first time, a reliable distinction between specifically methylated and unmethylated DNA recognition sites for a particular methylation-indicating restriction endonuclease becomes possible.

Als besonders vorteilhaft hat sich dieses Verfahren im Falle des Nachweises der Dcm-Methylierung mit Hilfe der Restriktionsendonuklease EcoRII erwiesen. Eine Reihe von DNA-Species ist a priori gegenüber dieser Restriktionsendonuklease vollständig oder partiell resistent (z. B. DNAs der Bakterienviren T3, T7, M13 und des M1 3-abgeleiteten gentechnischen Vektors mp 18). Unter Nutzung der vorliegenden Erfindung kann eine solche a-priori-Resistenz ausgeschaltet und die tatsächliche spezifische Methylierung nachgewiesen werden.This method has proved to be particularly advantageous in the case of detection of Dcm methylation with the aid of the restriction endonuclease EcoRII. A number of DNA species are completely or partially resistant a priori to this restriction endonuclease (eg DNAs of the bacterial viruses T3, T7, M13 and the M1 3-derived gene vector mp 18). Using the present invention, such a priori resistance can be eliminated and the actual specific methylation detected.

embodiment

Die DNA des Bakterienvirus M13 besitzt 2 und des von M13 abgeleiteten Klonierungsvektors mp 18 5 Erkennungsorte für die Methylase Dem (YANISCH-PERRON et al., Gene 33 [1985] 103-119).The DNA of the bacterial virus M13 has 2 and the M13-derived cloning vector mp 18 5 recognition sites for the methylase dem (YANISCH-PERRON et al., Gene 33 [1985] 103-119).

Diese Erkennungsorte werden durch die Restriktionsendonukleasen BstNI und Mval normal geschnitten. Auch nach Replikation der DNA in Dcm-negativen Wirtszellen, wodurch jede Dcm-Methylierung ausgeschlossen ist, sind die M13-DNA und die mp 18-DNA hochgradig resistent gegen die isochizomere Restriktionsendonuklease EcoRII (KRÜGER et al., unpublizierte Daten). Koinkubation solcher M13- bzw. mp 18-DNAs mit Oligonukleotidduplexen, die die Dcm-Erkennungssequenz besitzen, führt in Gegenwart von EcoRII zur spezifischen Spaltung aller Dcm-Erkennungsorte in der M 13-DNA und in der mp18-DNA. In einem Restriktionsansatz werden 300ng M13-bzw. mp18-DNA,40ng des 14 Basenpaare langen Oligonukleotidduplexes der Sequenz 5'-GCCAA CCTGG CTCT-3' und 3 Einheiten EcoRII (Bethesda Research Laboratories) in 20μΙ Reaktionspuffer mit den Endkonzentrationen 5OmMTHs-HCI (pH 7,4), 5OmM KCI₁OOmMNaCI₁BmMMgCI₂JmM DTT bei einer Temperatur von 37⁰CfUr 60 min inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion (5 min Inkubation bei 65⁰C) erfolgt die Auftrennung der DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Sichtbarmachung der Fragmente nach Äthidiumbromidbehandlung des Gels und UV-Bestrahlung.These recognition sites are normal cut by the restriction endonucleases BstNI and Mval. Even after replication of the DNA in Dcm-negative host cells, ruling out any Dcm methylation, the M13 DNA and the mp18 DNA are highly resistant to the isochiomeric restriction endonuclease EcoRII (KRÜGER et al., Unpublished data). Coincubation of such M13 or mp 18 DNAs with oligonucleotide duplexes having the Dcm recognition sequence, in the presence of EcoRII, results in the specific cleavage of all Dcm recognition sites in the M 13 DNA and in the mp18 DNA. In a restriction approach, 300ng M13 resp. mp18 DNA, 40ng of the 14 base pair oligonucleotide duplex of the sequence 5'-GCCAA CCTGG CTCT-3 'and 3 units of EcoRII (Bethesda Research Laboratories) in 20μΙ reaction buffer with final concentrations of 50mMTHs-HCl (pH 7.4), 50mM KCI ₁ OOmMNaCl ₁ BmMMgCI ₂ JmM DTT at a temperature of 37 ⁰ CfUr incubated for 60 min. After stopping the reaction (5 min incubation at 65 ⁰ C), the separation of the DNA fragments by agarose gel electrophoresis followed by visualization of the fragments after Äthidiumbromidbehandlung the gel and UV irradiation.

Unter den gleichen Bedingungen kommt es bei Inkubation von Dcm-spezifisch methylierter DNA (z.B. pBR322 Dcm⁺oderM13 Dcm⁺ DNA) mit EcoRII in Gegenwart des Oligonukleotidduplexes nicht zur Stimulierung der DNA-Verdauung, d. h. Oligonukleotidzugabe vermittelt nur die EcoRII-abhängige Spaltung unmethylierter DNA-Erkennungsorte.Under the same conditions, incubation of Dcm-specific methylated DNA (eg pBR322 Dcm ⁺ or M13 Dcm ⁺ DNA) with EcoRII in the presence of the oligonucleotide duplex does not stimulate DNA digestion, ie oligonucleotide addition mediates only the EcoRII-dependent cleavage of unmethylated DNA. recognition sites.

Claims

1. A method for the characterization of certain DNA sequences, characterized in that the specific methylation of the DNA sites is determined by using isochizomeric restriction endonucleases with the addition of a second DNA species.

2. The method according to claim 1, characterized in that as a second DNA species biologically replicated DNA molecules, parts of such molecules or oligonucleotide duplexes are used which have recognition sites for the corresponding restriction endonuclease and carry no protective methylation.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that primarily the natural Dcm methylation of the DNA, which consists in the presence of 5-M ethyl cytosine in the internal position of the nucleotide sequence 5'-CCA / TGG, by the restriction endonuclease EcoRII safe is detected.