EP1071791A1 - Clonage et expression du gene de la beta-glucosidase d'aspergillus oryzae bgii - Google Patents

Clonage et expression du gene de la beta-glucosidase d'aspergillus oryzae bgii

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Publication number
EP1071791A1
EP1071791A1 EP99915824A EP99915824A EP1071791A1 EP 1071791 A1 EP1071791 A1 EP 1071791A1 EP 99915824 A EP99915824 A EP 99915824A EP 99915824 A EP99915824 A EP 99915824A EP 1071791 A1 EP1071791 A1 EP 1071791A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bgii
sequence
activity
glucosidase
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99915824A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christine Riou
Ziya GÜNATA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1071791A1 publication Critical patent/EP1071791A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to the cloning of nucleic acid sequences coding for a ⁇ -glucosidase of fungal origin weakly inhibited by glucose, and to the use of said sequences for the production of this enzyme by genetic engineering.
  • ⁇ -D-glucoside glucohydrolases commonly known as ⁇ -glucosidases, catalyze the hydrolysis of alkyl- and aryl- ⁇ -D-glucosides, as well as that of various oligosaccharides, and cellobiose.
  • ⁇ -glucosidases for the recycling of cellulose by enzymatic saccharification.
  • cellobiose ⁇ -D-glucose (1 ⁇ 4) glucose
  • endo- ⁇ -1, 4-glucanase: EC 3.2.1.4, and exo- cellobiohydrolase: EC 3.2.1.91 inhibits these latter enzymes.
  • the hydrolysis of cellobiose by a ⁇ -glucosidase as it is formed therefore makes it possible to avoid its accumulation in the medium, and to increase the rate of saccharification.
  • the inventors' team has thus previously produced from filamentous fungi, such as Aspergillus niger and Aspergill us oryzae, a ⁇ -glucosidase very weakly inhibited by glucose.
  • This enzyme is the subject of PCT application WO 97/02341, on behalf of the NATIONAL INSTITUTE FOR AGRONOMIC RESEARCH (Inventors: GUNATA et al.), which indicates that it is present in corresponding fractions at a molecular weight estimated at approximately 30,000, obtained by exclusion chromatography from the culture medium of Aspergillus oryzae; the protein obtained by ion exchange chromatography has an isoelectric point of approximately 4.2, and its optimum pH is between 4.5 and 6.0.
  • the inhibition constant (Ki) of this enzyme for glucose is of the order of 1M.
  • BGII carried out by the Inventors, made it possible to specify its characteristics.
  • Its affinity constant (Km) for pNP ⁇ G was evaluated at 0.55 mM, its inhibition constant for glucose at 1.36 M, and its inhibition constant for gluconolactone at 12.5 mM. His activity is stimulated by ethanol. The properties of this enzyme are recalled in more detail in Example 1 below.
  • BGII ⁇ -glucosidase is produced in small quantities by Aspergillus. It is stated in the
  • the inventors thus isolated the BGII gene, and observed, by analyzing the deduced polypeptide sequence, that this enzyme was related to the yeast exo- ⁇ -1, 3-glucanases.
  • This gene will hereinafter be called EXG1.
  • the sequence of this gene is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 1; the polypeptide sequence of its translation product is represented under the number SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to a nucleic acid fragment characterized in that it comprises a sequence coding for a ⁇ -glucohydrolase homologous to the ⁇ -glucosidase BGII from Aspergil l us oryzae.
  • ⁇ -glucohydrolase homologous to ⁇ -glucosidase BGII from Aspergill us oryzae means a ⁇ -glucohydrolase whose peptide sequence has at least 60%, preferably at least 70% and advantageously at least 80% identity with the sequence of the mature form of the peptide encoded by the EXG1 gene from Aspergill us oryzae, and represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2.
  • said sequence codes for a ⁇ -glucohydrolase which has the spectrum of activity of ⁇ -glucosidase BGII as defined above, (active on ⁇ -1,3-, ⁇ -1,6- ⁇ - 1,4-, ⁇ -1,3, ⁇ -1,4 and ⁇ -1,6- glucosides), and is not very sensitive to inhibition by glucose, i.e. whose inhibition constant ( Ki) for glucose is greater than about 900 mM.
  • the present invention also includes nucleic acid fragments coding for a fragment of at least 24 consecutive amino acids of the polypeptide SEQ ID NO: 2, as well as their complement, and nucleic acid fragments which hybridize specifically, under conditions stringent, with the sequence fragment SEQ ID NO: 1, or its complement. They are in particular nucleic acid fragments of at least 18 bp homologous or complementary to any sequence present in the coding regions of said fragment and absent from the coding regions of the known genes of exo- ⁇ -1, 3-glucanases.
  • fragments can in particular be used as hybridization probes, and / or amplification primers, to screen libraries of genomic DNA or cDNA, in particular DNA libraries of fungi, and very particularly of ascomycetes. , in order to isolate and clone the sequences coding for ⁇ -glucohydrolases homologous to BGII.
  • the present invention also encompasses recombinant vectors comprising at least one insert consisting of a nucleic acid fragment according to the invention.
  • the nucleic acid fragments in accordance with the invention can in particular be used to transform eukaryotic or prokaryotic host cells, in particular in order to express therein a ⁇ -glucohydrolase homologous to BGII.
  • the present invention also encompasses said cells and said transformed host organisms.
  • Host cells and organisms which can be used for this purpose are, for example bacteria such as Escherichia coli, or fungi, such as
  • Kluveromyces Pichia, Yarrowia, Hansenula, etc.
  • sequence coding for ⁇ -glucohydrolase can be placed under the control of its own transcription regulation sequences, or under the control of heterologous sequences which are active in the host cell.
  • a subject of the present invention is also recombinant vectors, characterized in that they result from the insertion of at least one nucleic acid fragment in accordance with the invention, into an appropriate vector.
  • These recombinant vectors can be used to transform host cells, in accordance with the invention.
  • Control sequences and vectors suitable for the expression of sequences of interest in different types of host cells are known per se.
  • X-Glc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-glucopyranoside
  • the gene coding for ⁇ -glucohydrolase is preferably placed under the control of a strong promoter, such as gpdA p , pcbC pr or penDE p from A. nidulans or glaA p from A. Niger.
  • a strong promoter such as gpdA p , pcbC pr or penDE p from A. nidulans or glaA p from A. Niger.
  • a strong promoter such as those described by RADZIO and KUCK [Process Biochem., 32, pp. 529-539, (1997)]; GOUKA et al. [Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 1-11, (1997)]; GOMI et al. [Agric. Biol. Chem. , 51, pp.
  • CHRISTENSEN Aspergill us oryzae as a host for production of industrial enzymes, pp. 251-259; in: KA POWELL, A. RENWICK, and JFPEBERDY (eds.), The genus Aspergillus. Plenum Press, New York, (1994)].
  • yeasts such as S. cerevisiae
  • expression systems such as those described by BITTER et al. [Methods Enzymol., 153, pp. 516-544, (1989)] or TUITE [Expression of heterologous genes, pp. 169-212. In MF TUITE, and SG OLIVER (ed.), Biotechnology Handbooks, Vol. 4, Saccharomyces. , Plenum Press, New York, (1991)].
  • the gene coding for ⁇ -glucohydrolase can be placed under the control of regulatory elements such as the strong constitutive promoters and terminators of the ADH or PGK genes; one can also use a strong promoter induced in the stationary growth phase [RIOU et al. , Yeast, 13, pp. 903-915, (1997)].
  • regulatory elements such as the strong constitutive promoters and terminators of the ADH or PGK genes; one can also use a strong promoter induced in the stationary growth phase [RIOU et al. , Yeast, 13, pp. 903-915, (1997)].
  • To obtain the secretion of ⁇ -glucohydrolase one can use its own signal sequences, or else heterologous sequences, such as for example the factor ⁇ (MF ⁇ l) of S. cerevisiae [VAN RENSBURG et al, J. Biotechnol., 55, pp. 43-53, (1997)], or else the signal sequence of the EXG1 genes
  • the DNA fragments, recombinant vectors and transformed cells obtained in accordance with the present invention can be advantageously used for all applications where it is necessary to have a ⁇ -glucosidase activity which is not very sensitive to inhibition by glucose. , and in particular in all the uses of BGII which are described in PCT Application WO 97/02341 mentioned above.
  • transformed cells obtained in accordance with the present invention expressing a ⁇ -glucohydrolase homologous to BGII
  • a ⁇ -glucohydrolase homologous to BGII can be used for the industrial production of this enzyme, which can be recovered from the cell culture medium. They can also be used directly, for the synthesis of alkyl glucosides, for the hydrolysis of ⁇ -D-glucosides precursors of flavor in fruit juices, for the de-amerization of citrus juices, or for hydrolysis enzymatic of cellulose or its derivatives.
  • ⁇ -glucohydrolases homologous to BGII can be used for the industrial production of this enzyme, which can be recovered from the cell culture medium. They can also be used directly, for the synthesis of alkyl glucosides, for the hydrolysis of ⁇ -D-glucosides precursors of flavor in fruit juices, for the de-amerization of citrus juices, or for hydrolysis enzymatic of cellulose or its derivatives.
  • BGII can be advantageously used in the context from the manufacture of fermented drinks such as wine or beer, not only to improve the release of aromas, but also to eliminate glucans present in the fermentative mixture.
  • these glucans prevent the natural sedimentation of the particles in the grape must and cause the clogging of the membranes during the stages of filtration of fermented must (VAN RENSBURG et al., 1997); in beer, there are in particular ⁇ - 1, 3-1, 4-glucans, coming from cereals used as raw material, and which cause the same problems.
  • the degradation of these glucans into fermentable sugars by the endo- ⁇ -1, 3-glucanases and the exo- ⁇ -1, 3-glucanases of wine and beer yeasts is limited by the spectrum of action of these enzymes.
  • This use can be implemented for example by adding a preparation of ⁇ -glucohydrolase homologous to BGII (possibly associated with one or more other enzymes having endo-glucanase activity) to wine or to beer, after alcoholic fermentation, and before filtration; alcoholic fermentation can also be carried out in the presence of at least one transformed microorganism expressing a ⁇ -glucohydrolase homologous to BGII, and optionally one or more other enzymes having endo-glucanase activity: it may for example be a strain of S. cerevisiae expressing the EXG1 gene of A. oryzae, in synergy with the BGL2 gene of S. cerevisiae [MRSA et al. , J.
  • ⁇ -glucosidase BGII is prepared from strain 12559 of A. oryzae from the collection of the Centraalbureau Voor Schimmel Cultures (CBS, Netherlands). This strain is stored on PDA solid medium ("Potato Dextrose Agar", DIFCO). For the production of the enzyme, it is cultivated on a base medium containing the following compounds (w / v): 0.2% NaN0 3 , 0.2% KC1, 0.1% KH 2 P0 flick, 0, 1% NH 4 N0 3 , 0.1% (NH 4 ) H 2 P0 4 , 0.05% MgS0 4 , 7H 2 0, 0.05% yeast extract (DIFCO). This medium is sterilized for 20 minutes at 120 ° C. The carbon source used (quercetin) is sterilized separately (20 minutes, 120 ° C), then mixed with the minimum medium to a final concentration of 0.5% (w / v).
  • the cultures after sowing with 10 5 spores of A. oryzae / ml, suspended in a solution of TWEEN 80 at 0.15% (w / v), are carried out at 28 ° C, with stirring (125 revolutions / minute). Samples are taken at various times throughout the cultures to monitor the kinetics of production of the enzyme. The samples are centrifuged (10,000 g, 5 minutes). The culture supernatant is used for the assay of ⁇ -glucosidase activity.
  • the assay of ⁇ -glucosidase activity is carried out by incubation for 30 minutes at 50 ° C from 1 to 100 ⁇ l of enzymatic sample in a final reaction volume of 1 ml containing 5 mM of p-nitrophenol 10
  • ⁇ -glucopyranoside in 0.1 M acetate buffer, pH5.
  • the ⁇ -glucosidase activity is determined by estimating the amount of p-nitrophenol (pNP) released after addition of 2 ml of Na 2 C0 3 and reading of the absorbance at 400 nm. It is expressed in units per ml of enzyme solution (U / ml). One unit corresponds to the number of micromoles of pNP released per minute under the above conditions ( ⁇ mol / min).
  • the concentrated crude extract is placed on a filtration column (1.6 x 90 cm) packed with ULTROGEL AcA44 (IBF), having an exclusion threshold of 10 to 130 kDa, previously equilibrated with 10 mM acetate buffer, pH 6, containing 50 mM NaCl and 8 mM EDTA, at 4 ° C. Elution is carried out with the same buffer at a constant flow rate of 20 ml / h.
  • the recovered eluate is fractionated using an automatic collector (PHARMACIA) set to 2.5 ml / fraction.
  • the chromatographic profile reveals 2 distinct activity peaks, corresponding to the BGI and BGII ⁇ -glucosidases described in PCT application WO 97/02341.
  • the fractions exhibiting the BGII activity peak are combined, concentrated and desalted by ultrafiltration on a CENTRIPLUS PM 10 membrane (AMICON). 11
  • the fractions of the BGII peak, pooled at the end of the filtration chromatography, concentrated and desalted, are injected onto a TSK DEAE-5PW (BECKMAN) column (7.5 x 75 mm) balanced with a 10 mM citrate-phosphate buffer. , pH 6, containing 1 mM EDTA. Chromatography is performed in HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). After injection of the sample, the column is washed for 10 minutes with the same buffer, then another 10 minutes with the same buffer containing 0.13 M NaCl. The BGII is then eluted with a linear gradient of 0.13 to 0.25 M NaCl, for 15 minutes.
  • the optimum temperature and the optimum pH were determined as described in PCT Application WO 97/02341.
  • the BGII activity is maximum for a temperature of 50 ° C., and a pH of 5.
  • the activity curves are represented in FIGS. 1A (activity at pH 5, as a function of temperature) and 1B (activity at 50 ° C as a function of pH).
  • FIGS. 1A and 1B also respectively represent the stability curves (O) of the purified homogeneous BGII after 4 hours of incubation at pH 5 at temperatures varying from 20 to 80 ° C., and after 24 hours of incubation at 20 ° C at pH varying from 2.5 to 8. These curves show that under these conditions, the purified BGII is stable up to 45 ° C, and still shows 50% activity at 50 ° C, and that it is stable between pH 4 and 13
  • the inhibitory effect of glucose or ⁇ -gluconolactone on BGII purified to homogeneity was determined, under optimal conditions of BGII activity (50 ° C, pH 5, 30 minutes), using the same experimental protocol. than that described in PCT Application WO 97/02341.
  • WO 97/02341 have been confirmed or supplemented with the preparation of homogeneously purified BGII.
  • the hydrolysis of the substrates was estimated by measuring the release of pNP at 400 nm or by measuring the reducing sugars at 540 nm [MILLER, Anal. Chem. 21,
  • Aryl-glycosides (5 mM) p-Nitrophenyl- ⁇ -D-glucoside ⁇ GIc 100 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-xyloside ⁇ Xyl 50 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside ⁇ Gal 8.2 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-glucoside ⁇ GIc 1.6 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-cellobioside ⁇ GIc 3.3 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-gentiobioside ⁇ GIc 3.2 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-maltopyranoside ⁇ GIc 1.8 p -Nitrophenyl- -L-maltopyranoside ⁇ GIen 1.3 p -arabi ⁇ ofuranopyranoside ⁇ Ara 1.5 p -Nitrophenyl- ⁇ -D-glucuronide
  • BGII has a wide spectrum of activity since it is capable of efficiently hydrolyzing ⁇ -D-glucosides having bonds of different types, such as laminaribiose ( ⁇ -1,3), gentiobiose ( ⁇ -1,6), and cellooligosaccharides ( ⁇ -1,4).
  • BGII hydrolyzes maltose ( ⁇ -1,4) at 68% of the optimal hydrolysis rate of laminaribiose, it nevertheless seems more specific for ⁇ bonds; in particular, it does not hydrolyze pNP ⁇ G. On the other hand, it hydrolyzes pNP- ⁇ -xyloside (pNP ⁇ X), at 50% of the rate 15
  • inhibitors such as SDS, NBS,
  • the enzymatic activity is not (or only slightly) affected by other substances such as EDTA, pCMB, dicyclohexyl carbodiimide, reagent K from Woodward, DTT, DMSO, and N-acetylimidazole .
  • Co 2+ is not necessary for enzymatic activity. However, this is significantly stimulated by
  • Mn 2+ the hydrolysis of the substrate pNP ⁇ G is increased by 77%, in the presence of 5 mM of Mn 2+ .
  • Ethanol stimulates the activity of BGII; this stimulation is maximum for ethanol concentrations of the same order as those encountered in wine: the hydrolysis of pNP ⁇ G is thus increased by 30% in the presence of 15% (v / v) of ethanol, and by 15% in the presence of
  • the sequencing of the BGII protein was started from the preparation of purified protein with homogeneity described in Example 1 above.
  • the N-terminal end of the protein being partially blocked, a first sequencing resulted only in a sequence of 7 N-terminal amino acids.
  • the BGII protein was digested with endo H (endo-peptidase from S. aureus), which made it possible to sequence 4 additional small peptides.
  • oligonucleotide primers were derived from the sequences of 7 N-terminal amino acids of the BGII protein, and 6 C-terminal amino acids of peptide # 35.
  • the sequence of the degenerate oligonucleotide derived from the N-terminal peptide sequence of BGII is as follows: 5 'TT (CT) GA (CT) TA (CT) AA (CT) GGC GA (AG) AA 3' its Tm is from 54.8 ° C.
  • the sequence of the degenerate oligonucleotide derived from the C-terminal peptide sequence of # 35 is as follows: 5 'AT (CT) CC (CT) GC (CT) AC (CT) GT (CT) TC 3' its Tm is of 54 ° C.
  • primers made it possible to amplify by PCR (30 sec 94 ° C, 30 sec 50 ° C, 1 min 72 ° C, 35 cycles), from the total genomic DNA of A. oryzae, a 601 bp DNA fragment.
  • the deduced polypeptide sequence obtained in this way contained, in its N-terminal part, 5 amino acids out of 7 of the sequence N-terminal of BGII determined by direct sequencing of the protein. In contrast, the C-terminal part of the deduced polypeptide sequence did not correspond to that of peptide # 35.
  • the inventors searched in the nucleic acid sequence for the presence of splicing sequences and introns, and thus located an entire intron of 64 bp inside the amplified fragment. After elimination of the intron sequence, the deduced C-terminal polypeptide sequence contained 19 of the 21 amino acids of peptide sequence # 35.
  • the protein has a molecular mass of 43 kDa, and that the genes already isolated from Aspergillus oryzae present on average 4 to 6 introns of 50 to 80 bp [UNKLES, In: Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi. J.R. Kinghorn and G. Turner (Eds), Blackie Académie and Professional, Glasgow, pp. 28-53, (1992)], the total size of the gene corresponding to BGII has been estimated at approximately 1500 bp. To clone the complete gene, the total genomic DNA of A. oryzae was digested with the restriction enzyme BamHI; the EXG1 gene was recovered by reverse PCR, from the fragments obtained, using primers chosen from the partial sequence obtained as indicated above.
  • BamHI restriction enzyme
  • the putative signal peptide, of 14 amino acids is framed on the polypeptide sequence of Figure 2. Analysis of the polypeptide sequence further shows the absence of glycosylation sites.
  • the inventors compared the polypeptide sequence with those present in the databases, using the BLASTP software [ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, (1997)].
  • FIG. 3 represents the alignment of peptide sequences obtained using the software
  • PBU26160 precursor of the glycoprotein gp43 of
  • EXG_CANAL exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Candida albicans
  • EXG_YARLI exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Yarrowia lipolytica
  • KLEXG1 exo-1,3- ⁇ -glucanase from Kluyveromyces lactis
  • HPEXG1 exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Hansenula polymorpha
  • ABEXG1G2 exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Agaricus bisporus;
  • SPR1_YEAST exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Saccharomyces cerevisiae, specific for sporulation
  • SOEXG1 exo-1, 3- ⁇ -glucanase from Schwanniomyces occidentalis;
  • EXG1_YEAST exo-1 3- ⁇ -glucanase 1 from Sa ccharomyces cerevisiae
  • EXG2_YEAST exo-1 3- ⁇ -glucanase 2 from Sa ccharomyces cerevisiae.
  • RNAs of A. oryzae grown on quercetin were isolated and the messenger RNA (mRNA) purified.
  • the cDNAs are prepared by reverse transcription, and the specific cDNA corresponding to the gene sought is amplified using oligonucleotide primers derived from the 601 bp fragment of the BGII gene. The thus amplified cDNA is cloned into the vector pAMP10 (GIBCO-BRL) and sequenced. 21
  • the cDNA sequence compared to the genomic ADB sequence made it possible to demonstrate the presence of a single 64 bp intron (FIG. 2 a) and to locate the polyadenylation site (TCA in bold, FIG. 2 b). 200 bases downstream from the STOP codon ( Figure 2 b).
  • the coding sequence thus obtained can be expressed in microorganisms, such as E. coli and S. cerevisiae.

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Abstract

L'invention est relative au clonage d'un gène codant pour une β-glucohydrolase fongique homologue de la β-glucosidase BGII, et à son utilisation pour l'expression de ladite β-glucohydrolase. L'invention concerne également les utilisations de la β-glucohydrolase produite par des cellules transformées par ledit gène.

Description

CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE LA /?-GLUCOSIDASE D'ASPERGILLUS ORYZAE BGII
La présente Invention est relative au clonage de séquences d' acide nucléique codant pour une β-glucosidase d'origine fongique faiblement inhibée par le glucose, et à l'utilisation desdites séquences pour la production de cette enzyme par génie génétique.
Les β-D-glucoside glucohydrolases, couramment dénommées β-glucosidases, catalysent l'hydrolyse des alkyl- et aryl-β-D-glucosides, ainsi que celle de différents oligosaccharides, et du cellobiose.
L'utilisation de ces enzymes a été proposée par exemple dans l'industrie agro-alimentaire pour augmenter la qualité organoleptique de produits dérivés de fruits, en libérant des molécules responsables de l'arôme par l'hydrolyse enzymatique de leurs précurseurs glycosidiques non-odorants, ou bien en éliminant des glycosides responsables de saveurs non désirées (par exemple la naringine, responsable de l'amertume des jus d' agrume) .
Il a également été proposé d'utiliser des β-glucosidases pour le recyclage de la cellulose par saccharification enzymatique. En effet, le cellobiose (β-D-glucose (1→4) glucose), formé à partir de la cellulose sous l'action des cellulases (endo-β-1, 4- glucanase : EC 3.2.1.4, et exo-cellobiohydrolase : EC 3.2.1.91), inhibe ces dernières enzymes. L'hydrolyse du cellobiose par une β-glucosidase au fur et à mesure de sa formation, permet donc d'éviter son accumulation dans le milieu, et d'augmenter le taux de saccharification.
Cependant, l'activité de la plupart des β-glucosidases est fortement inhibée par le glucose, et également par le cellobiose, ce qui constitue un obstacle important à leur utilisation. II a donc été entrepris de rechercher des β-glucosidases moins sensibles à l'inhibition par le glucose, afin de les utiliser dans les applications ci-dessus .
L' équipe des Inventeurs a ainsi précédemment produit a partir de champignons filamenteux, comme Aspergillus niger et Aspergill us oryzae, une β-glucosidase très faiblement inhibée par le glucose.
Cette enzyme, dénommée BGII, fait l'objet de la Demande PCT WO 97/02341, au nom de L'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (Inventeurs : GUNATA et al.), qui indique qu'elle est présente dans des fractions correspondant à une masse moléculaire estimée à environ 30 000, obtenues par chromatographie d'exclusion a partir du milieu de culture d' Aspergillus oryzae ; la protéine obtenue par chromatographie d'échange d'ions possède un point isoélectrique d'environ 4,2, et son pH optimum est compris entre 4,5 et 6,0. La constante d' inhibition (Ki) de cette enzyme pour le glucose est de l'ordre de 1M. Elle est également peu inhibée par la gluconolactone, et possède un large spectre d'activité sur différents β-D- glucosides. La purification, à partir de la levure Candida pel ta ta , d'une β-glucosidase possédant des propriétés similaires a ultérieurement été décrite par une autre équipe [SAHA et BOTHAST, Appl . Environ . Microbiol . 62, 3165-3170 (1996)]. Une analyse plus poussée de la β-glucosidase
BGII, effectuée par les Inventeurs, a permis de préciser ses caractéristiques. La masse moléculaire de la protéine purifiée par chromatographie d'échange d'ions, déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, est de 43 kDa, son activité est optimale à un pH de 5, et une température de 50°C. Elle est active sur les β-1,3-, β-1,6- et β-1, 4-glucosιdes ainsi que sur les α-1,3, α-1,4 et α-1, 6-glucosιdes . Sa constante d'affinité (Km) pour le pNPβG a été évaluée a 0,55 mM, sa constante d' inhibition pour le glucose a 1,36 M, et sa constante d' inhibition pour la gluconolactone a 12,5 mM. Son activité est stimulée par l'éthanol. Les propriétés de cette enzyme sont rappelées de manière plus détaillée dans l'exemple 1 ci-après.
La β-glucosidase BGII est produite en faible quantité par les Aspergillus . Il est indiqué dans la
Demande PCT WO 97/02341, que cette production peut être augmentée en utilisant de la quercétine en tant que source de carbone pour la culture des Aspergillus .
Pour contrôler encore mieux l'obtention et l'utilisation de la BGII, les Inventeurs ont maintenant entrepris de cloner le gène codant pour cette enzyme, afin d'optimiser son expression.
Les Inventeurs ont ainsi isolé le gène de la BGII, et ont constaté, en analysant la séquence polypeptidique déduite, que cette enzyme était apparentée aux exo-β-1, 3-glucanases de levures. Ce gène sera dénommé ci-après EXG1. La séquence de ce gène est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; la séquence polypeptidique de son produit de traduction est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2.
La présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour une β-glucohydrolase homologue de la β-glucosidase BGII d' Aspergil l us oryzae .
On entend par : « β-glucohydrolase homologue de la β-glucosidase BGII d' Aspergill us oryzae » une β-glucohydrolase dont la séquence peptidique présente au moins 60%, de préférence au moins 70% et avantageusement au moins 80% d'identité avec la séquence de la forme mature du peptide codé par le gène EXG1 d' Aspergill us oryzae, et représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Ceci englobe notamment, outre les séquences d'acide nucléique codant pour la β-glucosidase BGII elle- même, ou pour ses différents variants et formes alléliques présents chez les Aspergillus tels qu' Aspergillus oryzae ou Aspergillus πiger, les séquences d' acide nucléique codant pour des β-glucohydrolases de même type d'autres champignons, et en particulier des champignons filamenteux de la famille des Ascomycètes ou des Basidiomycètes .
De préférence, ladite séquence code pour une β-glucohydrolase qui possède le spectre d'activité de la β-glucosidase BGII telle que définie ci-dessus, (active sur les β-1,3-, β-1,6- β-1,4-, α-1,3, α-1,4 et α-1,6- glucosides), et est peu sensible à l'inhibition par le glucose, c'est à dire dont la constante d'inhibition (Ki) pour le glucose est supérieure à environ 900 mM.
La présente invention englobe également des fragments d'acide nucléique codant pour un fragment d'au moins 24 acides aminés consécutifs du polypeptide SEQ ID NO: 2, ainsi que leurs complémentaires, et des fragments d'acide nucléique s'hybridant spécifiquement, en conditions stringentes, avec le fragment de séquence SEQ ID NO:l, ou son complémentaire. Il s'agit en particulier de fragments d'acide nucléique d'au moins 18 pb homologues ou complémentaires de toute séquence présente dans les régions codantes dudit fragment et absente des régions codantes des gènes connus des exo-β- 1, 3-glucanases .
Ces fragments peuvent en particulier être utilisés comme sondes d'hybridation, et/ou amorces d'amplification, pour cribler des banques d'ADN génomique ou d'ADNc, en particulier des banques d'ADN de champignons, et tout particulièrement d' ascomycètes, afin d' isoler et cloner les séquences codant pour des β-glucohydrolases homologues de BGII .
La présente invention englobe aussi des vecteurs recombinants comprenant au moins un insert constitué par un fragment d'acide nucléique conforme à 1 ' invention. Les fragments d' acide nucléique conformes à l'invention peuvent notamment être utilisés pour transformer des cellules-hôtes eucaryotes ou procaryotes, en particulier afin d'y exprimer une β-glucohydrolase homologue de BGII . La présente invention englobe également lesdites cellules et lesdits organismes hôtes transformés .
Des cellules et organismes hôtes utilisables dans ce but sont par exemple des bactéries telles que Escherichia coli , ou des champignons, tels que
Sa ccharomyces , Schi zosaccharomyces , Candida , Aspergill us,
Kluveromyces , Pichia , Yarrowia , Hansenula , etc.
La séquence codant pour la β-glucohydrolase peut être placée sous contrôle de ses propres séquences de régulation de la transcription, ou sous contrôle de séquences hétérologues, actives dans la cellule-hôte.
Selon l'utilisation envisagée, on peut par exemple exprimer ladite séquence sous contrôle d'un promoteur constitutif, ou au contraire, sous contrôle d'un promoteur inductible.
La présente invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils résultent de l'insertion d'au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, dans un vecteur approprié. Ces vecteurs recombinants sont utilisables pour transformer des cellules-hôtes, conformément à 1 ' invention.
Des séquences de contrôle et des vecteurs appropriés pour l'expression de séquences d'intérêt dans différents types de cellules-hôtes sont connus en eux mêmes .
A titre d'exemples non limitatifs, on peut notamment utiliser, pour cloner et exprimer chez E . coli une β-glucohydrolase homologue de BGII, des vecteurs de type pUC, qui permettent le clonage de gènes d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) ; les clones positifs peuvent être sélectionnés par révélation grâce à X-Glc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucopyranoside) qui donne un produit de dégradation bleu ; ou bien des vecteurs de type pQE (QIAGEN) , qui permettent l'expression de polypeptides flanqués à l'une de leurs extrémités de 6 résidus histidine (6xHis tag) , qui peuvent ensuite être purifiés par chromatographie d'affinité sur une colonne Ni-NTA, ou des vecteurs de type pET (NOVAGEN) .
Pour l'expression chez des champignons filamenteux, on place de préférence le gène codant pour la β-glucohydrolase sous contrôle d'un promoteur fort, tel que gpdAp, pcbCp r ou penDEp d ' A . nidulans ou glaAp d'A. niger. On peut par exemple utiliser des systèmes tels que ceux décrits par RADZIO et KUCK [Process Biochem., 32, pp. 529-539, (1997)]; GOUKA et al . [Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 1-11, (1997)] ; GOMI et al . [Agric. Biol. Chem. , 51, pp. 2549-2555, (1987)] et CHRISTENSEN [Aspergill us oryzae as a host for production of industrial enzymes, pp. 251-259 ; in : K.A. POWELL, A. RENWICK, and J.F.PEBERDY (eds.), The genus Aspergillus. Plénum Press, New York, (1994)].
Pour l'expression dans des levures telles que S. cerevisiae, on peut par exemple utiliser des systèmes d'expression tels que ceux décrits par BITTER et al . [Methods Enzymol., 153, pp. 516-544, (1989)] ou TUITE [Expression of heterologous gènes, pp. 169-212. In M. F. TUITE, and S. G. OLIVER (éd.), Biotechnology Handbooks, Vol. 4, Saccharomyces . , Plénum Press, New York, (1991) ] . Le gène codant pour la β-glucohydrolase peut être placé sous contrôle d'éléments de régulation tels que les promoteurs constitutifs forts et terminateurs des gènes ADH ou PGK ; on peut également utiliser un promoteur fort induit en phase stationnaire de croissance [RIOU et al . , Yeast, 13, pp. 903-915, (1997)]. Pour obtenir la sécrétion de la β-glucohydrolase, on peut utiliser ses propres séquences signal, ou bien des séquences hétérologues, comme par exemple le facteur α (MFαl) de S. cerevisiae [VAN RENSBURG et al , J. Biotechnol., 55, pp. 43-53, (1997)], ou bien la séquence signal des gènes EXG1 de S. cerevisiae [CID et al . , Yeast, 10, pp. 747-756, (1994)] ou XOG1 de C. albicans [DEL MAR GONZALEZ et al . , Microbiology-UK, 143, pp. 3023-3032, (1997)]. La sélection des souches peut se faire au niveau du gène ura3. On peut également exprimer la β-glucohydrolase dans d'autres levures que S. cerevisiae [GELLISSEN et al . , Gène, 190, pp. 87-97, (1997)] et cloner le gène par expression chez S . cerevisiae selon la méthode de JACOBS et al . [Gène, 198, pp. 289-296, (1997)].
Les fragments d'ADN, vecteurs recombinants, et cellules transformées obtenus conformément à la présente invention peuvent être avantageusement mis en œuvre pour toutes les applications où il est nécessaire de disposer d'une activité β-glucosidase peu sensible à l'inhibition par le glucose, et en particulier dans toutes les utilisations de la BGII qui sont décrites dans la Demande PCT WO 97/02341 mentionnée ci-dessus.
Par exemple, des cellules transformées obtenues conformément à la présente invention, exprimant une β-glucohydrolase homologue de BGII, peuvent être utilisées pour la production industrielle de cette enzyme, qui peut être récupérée à partir du milieu de culture cellulaire. Elles peuvent également être utilisées directement, pour la synthèse d'alkyl- glucosides, pour l'hydrolyse de β-D-glucosides précurseurs d'arôme dans des jus de fruits, pour la désamérisation des jus d'agrumes, ou pour l'hydrolyse enzymatique de la cellulose ou de ses dérivés. En outre, des β-glucohydrolases homologues de
BGII peuvent être avantageusement utilisées dans le cadre de la fabrication de boissons fermentées telles que le vin ou la bière, non seulement pour améliorer la libération des arômes, mais également pour éliminer des glucanes présents dans le mélange fermentaire. En effet, dans le vin, ces glucanes préviennent la sédimentation naturelle des particules dans le moût de raisin et entraînent le colmatage des membranes lors des étapes de filtration des moûts fermentes (VAN RENSBURG et al . , 1997) ; dans la bière, on trouve en particulier des β- 1 , 3-1, 4-glucanes, provenant des céréales utilisées comme matière première, et qui causent les mêmes problèmes. La dégradation de ces glucanes en sucres fermentescibles par les endo-β-1, 3-glucanases et les exo-β-1, 3-glucanases des levures de vin et de bière est limitée par le spectre d'action de ces enzymes.
Les propriétés de la BGII mises en évidence par les Inventeurs, à savoir son activité non seulement sur des liaisons β-1,3 et β-1,6, mais également sur des liaisons β-1,4, ainsi que la stimulation de cette activité par l'éthanol, rendent donc son utilisation dans ce domaine particulièrement intéressante. Cette utilisation peut être mise en œuvre par exemple en ajoutant une préparation de β-glucohydrolase homologue de BGII (éventuellement associée à une ou plusieurs autres enzymes possédant une activité endo-glucanase) au vin ou à la bière, après la fermentation alcoolique, et avant la filtration ; on peut également effectuer la fermentation alcoolique en présence d'au moins un microorganisme transformé exprimant une β-glucohydrolase homologue de BGII, et éventuellement une ou plusieurs autres enzymes possédant une activité endo-glucanase : il peut par exemple s'agir d'une souche de S. cerevisiae exprimant le gène EXG1 d'A. oryzae, en synergie avec le gène BGL2 de S . cerevisiae [MRSA et al . , J. Bacteriol., 175, pp. 2102-2106, (1993) ] . La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'isolement du gène EXG1 d'A. oryzae. II doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE I : PURIFICATION A HOMOGENEITE ET CARACTERISATION DE LA β-GLUCOSIDASE BGII
La β-glucosidase BGII est préparée à partir de la souche 12559 d'A. oryzae provenant de la collection du Centraalbureau Voor Schimmel Cultures (CBS, Pays-Bas) . Cette souche est conservée sur milieu solide PDA ("Potato Dextrose Agar", DIFCO) . Pour la production de l'enzyme, elle est cultivée sur un milieu de base contenant les composés suivants (p/v) : 0,2% NaN03, 0,2% KC1, 0,1% KH2P0„, 0,1% NH4N03, 0,1% (NH4)H2P04, 0,05% MgS04, 7H20, 0,05% extrait de levure (DIFCO). Ce milieu est stérilisé 20 minutes à 120°C. La source de carbone utilisée (quercétine) est stérilisée à part (20 minutes, 120°C) , puis mélangée au milieu minimum à une concentration finale de 0,5% (p/v) .
Les cultures, après ensemencement par 105 spores d'A. oryzae/ml, en suspension dans une solution de TWEEN 80 à 0,15% (p/v), sont réalisées à 28°C, sous agitation (125 tours/minute) . Des prélèvements sont effectués à différents temps tout au long des cultures pour suivre la cinétique de production de l'enzyme. Les prélèvements sont centrifugés (10000 g, 5 minutes) . Le surnageant de culture est utilisé pour le dosage de l'activité β-glucosidase.
Le dosage de l'activité β-glucosidase s'effectue par incubation pendant 30 minutes à 50°C de 1 à 100 μl d'échantillon enzymatique dans un volume final réactionnel de 1 ml contenant 5 mM de p-nitrophénol 10
β-glucopyranoside (pNPβG) dans le tampon acétate 0,1 M, pH5. L'activité β-glucosidase est déterminée par l'estimation de la quantité de p-nitrophénol (pNP) libérée après addition de 2 ml de Na2C03 et lecture de l'absorbance à 400 nm. Elle est exprimée en unité par ml de solution enzymatique (U/ml) . Une unité correspond au nombre de micromoles de pNP libérées par minute dans les conditions précitées (μmol/min) .
La cinétique de production de la β-glucosidase totale extracellulaire, estimée par l'hydrolyse du pNPβG, est suivie lors du développement du champignon. Lorsque le maximum d'activité est atteint, après 14 jours de culture, les protéines totales contenues dans le filtrat de culture ont été précipitées avec 85% (p/v) de sulfate d'ammonium. Cet extrait brut concentré a alors subi deux étapes de purification : une chromatographie d'exclusion et une chromatographie d'échange d'anions. - Chromatographie d'exclusion :
L'extrait brut concentré est déposé sur une colonne de filtration (1,6 x 90 cm) garnie d'ULTROGEL AcA44 (IBF), présentant un seuil d'exclusion de 10 à 130 kDa, préalablement équilibrée avec du tampon acétate 10 mM, pH 6, contenant 50 mM de NaCl et 8 mM d'EDTA, à 4°C. L'élution est réalisée avec le même tampon sous un débit constant de 20 ml/h. L'éluat récupéré est fractionné à l'aide d'un collecteur automatique (PHARMACIA) réglé sur 2,5 ml/fraction.
Le profil chromatographique fait apparaître 2 pics d'activité distincts, correspondant aux β-glucosidases BGI et BGII décrites dans la Demande PCT WO 97/02341. Les fractions présentant le pic d'activité BGII sont regroupées, concentrées et dessalées par ultrafiltration sur membrane CENTRIPLUS PM 10 (AMICON) . 11
- Chromatographie d'échange d'anions :
Les fractions du pic BGII, regroupées à l'issue de la chromatographie de filtration, concentrées et dessalées, sont injectées sur une colonne TSK DEAE-5PW (BECKMAN) (7,5 x 75 mm) équilibrée avec un tampon citrate-phosphate 10 mM, pH 6, contenant 1 mM d'EDTA. La chromatographie est réalisée en CLHP (Chromatographie Liquide à Haute Pression). Après injection de l'échantillon, la colonne est lavée pendant 10 minutes avec le même tampon, puis encore 10 minutes avec le même tampon contenant 0,13 M de NaCl. La BGII est alors éluée avec un gradient linéaire de 0,13 à 0,25 M de NaCl, pendant 15 minutes. Des fractions de 1 ml sont collectées sous un débit constant de 2 ml/minute. L'élution des protéines contenues dans l'effluent de la colonne est suivie à 280 nm. Les fractions correspondant à l'activité BGII sont regroupées, concentrées et dessalées par ultrafiltration sur membranes CENTRIPLUS PM 30 (AMICON) .
La chromatographie d'échange d'anions sur TSK DEAE-5PW en CLHP des fractions du pic BGII a permis de purifier l'enzyme à homogénéité. L'activité BGII est éluée entre 0,198 et 0,212 M de NaCl, avec un maximum à 0,203 M. Cette solution d'enzyme est utilisée comme préparation purifiée pour la suite des expérimentations.
Les résultats de la purification sont résumés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Etape Protéines Activité Activité Taux de totales totale spécifique Rendement de purification (mg) (U) (U/mg) (%) purification
Filtrat de culture 193,8 1142 5,9 100 1
Sulfate d'ammonium 80,4 1040 12,9 91 2,2
ULTROGEL AcA 44 2,4 140 58,3 12,5 9,9 TSK DEAE-5PW 0,05 53,3 1066 4,5 176,9
A partir de dix litres de filtrat de culture sur quercétine, 50 microgrammes de BGII pure ont été obtenus, correspondant à 4,5% de l'activité β-glucosidase totale sécrétée par le champignon et à 0,026% des 12
protéines totales contenues dans les dix litres de filtrat de culture.
- Détermination de la pureté de l'enzyme et de sa masse moléculaire Après la chromatographie d'échange d'anions, la pureté de la protéine a été vérifiée et sa masse moléculaire déterminée :
- par filtration sur gel, en conditions non- dénaturantes, la masse moléculaire a été évaluée à 40 kDa, par comparaison avec des marqueurs de masses moléculaires connues (SIGMA) ; par électrophorèse, en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) , sur un gel d'acrylamide à 10% et coloration au nitrate d'argent (Kit AMERSHAM) , on observe une seule bande, dont la masse moléculaire a été évaluée à 43 kDa à l'aide de marqueurs de masses moléculaires connues (BIORAD) .
Ceci indique que la BGII est une protéine monomérique . - pH et température d'activité optimale :
La température optimale et le pH optimal ont été déterminés comme décrit dans la Demande PCT WO 97/02341. L'activité BGII est maximale pour une température de 50°C, et un pH de 5. Les courbes d'activité sont représentées sur les figures 1A (activité à pH 5 , en fonction de la température) et 1B (activité à 50°C en fonction du pH) .
Les figures 1A et 1B représentent également respectivement les courbes de stabilité (O) de la BGII purifiée à homogénéité après 4 heures d' incubation à pH 5 à des températures variant de 20 à 80°C, et après 24 heures d'incubation à 20°C à des pH variant de 2,5 à 8. Ces courbes montrent que dans ces conditions, la BGII purifiée est stable jusqu'à 45°C, et montre encore 50% d'activité à 50°C, et qu'elle est stable entre pH 4 et 13
6,5 et conserve encore 60% de son activité à pH 2,5. La stabilité à plus long terme de la BGII purifiée à homogénéité a également été testée à 4°C et à pH 5. Dans ces conditions elle demeure stable pendant plus de 6 mois. En outre, rajoutée à un moût de raisin à pH 2,9, et incubée à 20 °C, comme indiqué dans la Demande PCT WO 97/02341, elle conserve la majeure partie de son activité après une semaine.
Z-El Le pi de l'enzyme pure, mesuré par isoélectrofocalisation, a été évalué à 4,2.
- Inhibition par le glucose ou la δ-gluconolactone :
L'effet inhibiteur du glucose ou de la δ-gluconolactone sur la BGII purifiée à homogénéité, a été déterminé, dans les conditions optimales de l'activité BGII (50°C, pH 5, 30 minutes), en utilisant le même protocole expérimental que celui décrit dans la Demande PCT WO 97/02341. La constante d'inhibition (Ki) de la BGII pour le glucose vis-à-vis du pNPβG, déterminée par la représentation de DIXON, a été évaluée à 1,36 M, et la constante d'inhibition pour la δ-gluconolactone, a été évaluée de la même manière à 12,5 mM.
- Spectre d'activité:
Les mesures d'activité de la BGII vis-à-vis de différents substrats, décrites dans la Demande PCT
WO 97/02341 ont été confirmées ou complétées avec la préparation de BGII purifiée à homogénéité.
L'hydrolyse des substrats a été estimée par mesure de la libération de pNP à 400 nm ou par mesure des sucres réducteurs à 540 nm [MILLER, Anal. Chem. 21,
426-428,(1959)]. Le Tableau II ci-dessous résume les résultats obtenus pour différents saccharides ou aryl- glycosides . 14
TABLEAU II
Liaison du Taux
Substrat groupe glycosyl d'hydrolyse initial (%)
Saccharides (2 mg/ml)
Laminaribiose [3-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1 ,3)Glc 100
Gentiobiose [6-O-D-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucose] β(1,6)Glc 100
Cellobiose [4-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1,4)Glc 87.8
Cellotriose [4-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1 ,4)Glc 75
Cellotetraose [4-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1,4)Glc 62
Cellopentaose [4-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1 ,4)Glc 48
Xylobiose [4-O-β-D-xylopyranosyl-D-xylose] β(1.4)Xyl 43
Lactose [4-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucose] β(1 ,4)Gal 73
Sophorose [ 2-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucose] β(1 ,2)Glc 26
Nigérose [ 3-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose] α(1,3)Glc 72
Isomaltose [ 6-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose] α(1 ,6)Glc 70
Maltose [4-O- -D-glucopyranosyl-D-glucose] α(1 ,4)Glc 68
Sucrose [1 -O-α-D-glucopyranosyl-β-D-fructofuranoside] α(1 ,2)Glc 0
Tréhalose [1 -O-α-D-glucopyranosyl-α-D-glucose] (1 ,1 )Glc 0
Laminarine [β-(1,3)-D-glucane] (soluble) β(1,3)Glc 11
Salicine [2-hydroxymethyl-phényl-β-D-glucose] βGIc 0
Aryl-glycosides (5 mM) p-Nitrophényl-β-D-glucoside βGIc 100 p -Nitrophényl-β-D-xyloside βXyl 50 p -Nitrophényl-β-D-galactoside βGal 8.2 p -Nitrophényl-α-D-glucoside αGIc 1.6 p -Nitrophényl-β-D-cellobioside βGIc 3.3 p -Nitrophényl-β-D-gentiobioside βGIc 3.2 p -Nitrophényl-β-D-maltopyranoside βGIc 1.8 p -Nitrophényl- -L-maltopyranoside αGIc 1.3 p -Nitrophényl- -L-arabiπofuranopyranoside αAra 1.5 p -Nitrophényl-β-D-glucuronide βGIcA 2.5
Ces résultats montrent que la BGII présente un large spectre d'activité puisqu'elle est capable d'hydrolyser efficacement des β-D-glucosides présentant des liaisons de différents types, tels que le laminaribiose (β-1,3), le gentiobiose (β-1,6), et les cellooligosaccharides (β-1,4).
Bien que la BGII hydrolyse le maltose (α-1,4) à 68% du taux d'hydrolyse optimale du laminaribiose, elle semble toutefois plus spécifique des liaisons β ; en particulier, elle n' hydrolyse pas le pNPαG. Par contre, elle hydrolyse le pNP-β-xyloside (pNPβX) , à 50% du taux 15
d'hydrolyse optimale du pNPβG, et le xylobiose, à 43% du taux d'hydrolyse optimale du laminaribiose.
Les constantes d'affinité (Km) de la BGII vis- à-vis du pNPβG (Km=0,55 mM) , du laminariobiose (Km=3,5 mM) , du gentiobiose (Km=5 mM) , du cellobiose (Km=7'mM), et du géranyl β-O-glucoside (Km=15,8 mM) ont été déterminées par la représentation de LINEWEAVER-BURK.
Le taux décroissant d'hydrolyse des cellooligosaccharides (cellobiose à cellopentaose) et l'hydrolyse beaucoup plus faible de polysaccharides solubles tels que la laminarine, montrent que la BGII possède une activité exoglucosidase .
L'hydrolyse d'autres β-glucanes solubles et insolubles par la BGII est beaucoup plus faible que celle du laminaribiose (de 0 à 15%) . Cependant, un effet synergique de la BGII avec les β-glucanases a été mis en évidence comme suit :
De la cellulose (SIGMACELL type 50, Sigma), ou bien de la laminarine, du curdlane, du pustulane, du lichenane, du laminarane ou du glucane de levure
(provenant tous de chez SIGMA) sont hydrolyses, en utilisant les mêmes conditions que celles des expérimentations résumées dans le Tableau II, par un mélange obtenu par addition de 0,1 U/ml de BGII pure à une préparation commerciale de laminarase (0,1 U/ml, Sigma) ou de cellulase (0,1 U/ml, Sigma). On constate que l'hydrolyse du substrat et la production de glucose à partir de celui-ci sont augmentées de 20 à 100% par rapport à celles observées, dans les mêmes conditions, avec la BGII seule.
- Inhibiteurs et activateurs
Les effets de différents cations, ainsi que ceux d'inhibiteurs et activateurs potentiels, sur l'activité de la BGII ont été étudiés. On observe une inactivation de l'enzyme en présence des ions Ag2+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, et Fe3+, ainsi 16
qu'en présence d'inhibiteurs tels que le SDS, le NBS, le
DEPC, la castanospermine, la déoxynoj irimycine, et la méthyldéoxynojirimycine. En revanche l'activité enzymatique n'est pas (ou peu) affectée par d'autres substances telles que l'EDTA, le pCMB, le dicyclohexyl carbodiimide, le réactif K de Woodward, le DTT, le DMSO, et le N-acétylimidazole.
La présence de cations tels que Ca2+, Mg2+, ou
Co2+, n'est pas nécessaire à l'activité enzymatique. Celle-ci est toutefois significativement stimulée par
Mn2+ : l'hydrolyse du substrat pNPβG est augmentée de 77%, en présence de 5 mM de Mn2+.
L'éthanol stimule l'activité de la BGII ; cette stimulation est maximale pour des concentrations en éthanol du même ordre que celles rencontrées dans le vin : l'hydrolyse du pNPβG est ainsi augmentée de 30% en présence de 15% (v/v) d' éthanol, et de 15% en présence de
20% (v/v) d' éthanol.
EXEMPLE II : ISOLEMENT DU GENE EXG1 DE LA β-GLUCOSIDASE BGII
- Séquençage partiel de la protéine
Le séquençage de la protéine BGII a été entrepris à partir de la préparation de protéine purifiée à homogénéité décrite dans l'exemple 1 ci-dessus. L'extrémité N-terminale de la protéine étant en partie bloquée, un premier séquençage n'a abouti qu'à une séquence de 7 acides aminés N-terminaux.
Pour obtenir des informations complémentaires sur la séquence, la protéine BGII a été digérée avec l'endo H (endo-peptidase de S . aureus) , ce qui a permis de séquencer 4 petits peptides supplémentaires.
Les séquences peptidiques obtenues sont présentées dans le Tableau III ci-dessous. 17
TABLEAU III
N-terminale F D Y N G E N
C-terminale :
#13 S F V S A G D D Q R
#15 A V E W A G A A G L K
#34 G A I Q W Q Q G D T V E Q #35 Y L G S D T V A A I E A I N E P N I P G G
La comparaison de la séquence du peptide #35 avec les bases de données à l'aide du logiciel BLAST [ALTSCHUL et al.,' J. Mol. Biol. 215, 403-10,(1990)], a révélé l'existence d'homologies avec une exo-β-1,3- glucanase de S. cerevisiae. - Isolement d'un fragment du gène de la BGII
Des amorces oligonucléotidiques dégénérées ont été dérivées à partir des séquences de 7 acides aminés N-terminaux de la protéine BGII, et de 6 acides aminés C-terminaux du peptide #35.
La séquence de 1 ' oligonucléotide dégénéré dérivé de la séquence peptidique N-terminale de BGII est la suivante : 5' TT(CT)GA(CT)TA(CT)AA(CT)GGC GA(AG)AA 3' son Tm est de 54, 8°C.
La séquence de 1 ' oligonucléotide dégénéré dérivé de la séquence peptidique C-terminale de #35 est la suivante : 5' AT(CT)CC(CT)GC(CT)AC(CT)GT(CT)TC 3' son Tm est de 54°C.
Ces amorces ont permis d'amplifier par PCR (30 sec 94°C, 30 sec 50°C, 1 min 72°C, 35 cycles), à partir de l'ADN génomique total d'A. oryzae, un fragment d'ADN de 601 pb.
Après le clonage direct du fragment PCR dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA) , et son séquençage, la séquence nucléique a été traduite en séquence polypeptidique. La séquence polypeptidique déduite obtenue de la sorte contenait, dans sa partie N-terminale, 5 acides aminés sur 7 de la séquence N-terminale de BGII déterminée par séquençage direct de la protéine. En revanche, la partie C-terminale de la séquence polypeptidique déduite ne correspondait pas à celle du peptide #35. Les Inventeurs ont alors recherché dans la séquence nucléique la présence de séquences d'épissage et d'introns, et ont ainsi localisé un intron entier de 64 pb à l'intérieur du fragment amplifié. Après élimination de la séquence de l' intron, la séquence polypeptidique C-terminale déduite contenait 19 des 21 acides aminés de la séquence peptidique #35.
- Isolement du gène entier
Sachant que la protéine présente une masse moléculaire de 43 kDa, et que les gènes déjà isolés chez Aspergillus oryzae présentent en moyenne 4 à 6 introns de 50 à 80 pb [UNKLES, In: Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi . J.R. Kinghorn and G. Turner (Eds), Blackie Académie and Professional, Glasgow, pp. 28-53, (1992)], la taille totale du gène correspondant à la BGII a été estimée à environ 1500 pb. Pour cloner le gène complet, l'ADN génomique total d'A. oryzae a été digéré avec l'enzyme de restriction BamHI ; le gène EXG1 a été récupéré par PCR inverse, à partir des fragments obtenus, en utilisant des amorces choisies à partir de la séquence partielle obtenue comme indiqué ci-dessus.
Un fragment de 2348 pb contenant la séquence complète du gène EXG1 a ainsi été obtenu. La séquence de ce fragment est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l, et celle de son produit de traduction est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Ces séquences sont également représentées sur la Figure 2. Légende de la figure 2 :
Dans la séquence nucléotidique, les positions présumées de la boite CAAT, de la boite TATA, et du site de polyadénylation sont indiqués en caractères gras. La 19
séquence codante est représentée en lettres minuscules ; l' intron est souligné.
Le peptide signal putatif, de 14 acides aminés est encadré sur la séquence polypeptidique de la Figure 2. L'analyse de la séquence polypeptidique montre en outre l'absence de sites de glycosylation.
Les Inventeurs ont comparé la séquence polypeptidique avec celles présentes dans les bases de données, à l'aide du logiciel BLASTP [ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, (1997)].
Cette comparaison, effectuée sur la séquence du peptide mature, a fait apparaître des homologies de séquence avec une protéine excrétée de Paracoccidioides brasiliensis [CISALPINO et a l . , J. Biol . Chem. 271, 4553- 4560, (1996)] (53% d'identité, 70% de similarité), ainsi qu'avec des exo-β-1, 3-glucanases de différentes levures, telles que Candida albicans [CHAMBERS et al . , J. Gen. Microbiol. 139, 325-334, (1993)] (45% d'identité, 61% de similarité), S. cerevisiae [MUTHUKUMAR et al . , J. Bacteriol. 175, 386-394, (1993)] ; [VAZQUEZ de ALDANA et al . , Gène 97, 173-182, (1991)] ; (41% d'identité, 57% de similarité avec EXG1 ; 36% d'identité, 52% de similarité avec EXG2), ainsi qu'avec les exo-β-1, 3-glucanases récemment mises en évidence [ESTEBAN et al., Yeast, 15, 91-109, (1999)] chez les levures Kluyveromyces lactis (40% d'identité, 58% de similarité), Hansenula polymorpha (47% d'identité, 61% de similarité), Schwanniomyces occiden talis (42% d'identité, 57% de similarité), et avec 1' exo-β-1, 3-glucanase du champignon filamenteux Agaricus sporus [VAN de RHEE et al . , Curr . Genêt. 30, 166-173, (1996)] (42% d'identité, 55% de similarité), et aussi avec une endo-β-1, 6-glucanase d'un autre champignon filamenteux, Tri choderma harzianum [LORA et al . , Mol. Gen. Genêt. 247, 639-345, (1995)] (26% d'identité, 38% de similarité) . 20
La figure 3 représente l'alignement de séquences peptidiques obtenu en utilisant le logiciel
CLUSTAL (HIGGINS et SHARP, Gène, 73, 237-244, 1988).
Légende de la Figure 3 : AOEXG1 = BGII
PBU26160 : précurseur de la glycoprotéine gp43 de
Paracoccidioides brasiliensis :
EXG_CANAL : exo-1, 3-β-glucanase de Candida albicans ;
EXG_YARLI : exo-1, 3-β-glucanase de Yarrowia lipolytica ; KLEXG1 : exo-1, 3-β-glucanase de Kluyveromyces lactis ;
HPEXG1 : exo-1 , 3-β-glucanase de Hansenula polymorpha ;
ABEXG1G2 : exo-1 , 3-β-glucanase de Agaricus bisporus ;
SPR1_YEAST : exo-1, 3-β-glucanase de Saccharomyces cerevisiae , spécifique de la sporulation ; SOEXG1 : exo-1, 3-β-glucanase de Schwanniomyces occidentalis ;
EXG1_YEAST exo-1, 3-β-glucanase 1 de Sa ccharomyces cerevisiae EXG2_YEAST exo-1, 3-β-glucanase 2 de Sa ccharomyces cerevisiae .
Les résidus identiques dans au moins 3 séquences sont représentés sur fond noir les résidus correspondant à une substitution conservative sont indiqués sur fond gris ; les discontinuités introduites dans les séquences pour optimiser l'alignement sont représentées par des pointillés. - Isolement de l'ADNc
En parallèle, les ARN totaux d'A. oryzae cultivé sur quercétine ont été isolés et les ARN messagers (ARNm) purifiés.
Les ADNc sont préparés par transcription inverse, et l'ADNc spécifique correspondant au gène recherché est amplifié à l'aide d'amorces oligonucléotidiques dérivées du fragment de 601 pb du gène de la BGII . L'ADNc ainsi amplifié est clone dans le vecteur pAMPlO (GIBCO-BRL) et séquence. 21
La séquence de l'ADNc comparée à la séquence de l'ADB génomique a permis de démontrer la présence d'un seul intron de 64 pb (figure 2 a) et de localiser le site de polyadénylation (TCA en gras, figure 2 b) à 200 bases en aval du codon STOP (figure 2 b) .
La séquence codante ainsi obtenue peut être exprimée chez des microorganismes, tels que E . coli et S. cerevisiae.

Claims

22
REVENDICATIONS
1) Fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu' il comprend une séquence codant pour une β-glucohydrolase homologue de la β-glucosidase BGII d' Aspergillus oryzae .
2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2.
3) Vecteur recombinant, comprenant au moins un insert constitué par un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Cellule transformée par un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
5) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour la production d'une β-glucohydrolase homologue de la β-glucosidase BGII d' Aspergillus oryzae .
6) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour la synthèse d' alkyl-glucosides . 7) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour l'hydrolyse de β-D-glucosides précurseurs d'arôme.
8) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour la désamérisation de jus d'agrumes.
9) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour l'hydrolyse enzymatique de la cellulose ou de ses dérivés.
10) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 4, pour l'élimination des glucanes lors de la préparation d'une boisson fermentée.
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