EP0975799A1 - Moyens pour l'identification de sequences nucleotidiques impliquees dans l'apomixie - Google Patents

Moyens pour l'identification de sequences nucleotidiques impliquees dans l'apomixie

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EP0975799A1
EP0975799A1 EP98909558A EP98909558A EP0975799A1 EP 0975799 A1 EP0975799 A1 EP 0975799A1 EP 98909558 A EP98909558 A EP 98909558A EP 98909558 A EP98909558 A EP 98909558A EP 0975799 A1 EP0975799 A1 EP 0975799A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
apomictic
plants
corn
apomixis
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98909558A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Yves Savidan
Daniel Grimanelli
Enrico Perotti
Olivier Leblanc
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CIMMYT ABC
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Cimmyt - ABC
Original Assignee
CIMMYT ABC
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Cimmyt - ABC
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Filing date
Publication date
Application filed by CIMMYT ABC, Institut de Recherche pour le Developpement IRD, Cimmyt - ABC filed Critical CIMMYT ABC
Publication of EP0975799A1 publication Critical patent/EP0975799A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to means for identifying, isolating and characterizing nucleotide sequences involved in apomixis. It relates more particularly to a process and tools making it possible to identify these sequences in the genome of apomictic plants, then to isolate and characterize them.
  • apomixis In its modern sense, apomixis, or agamospermia, includes all of the phenomena of asexual reproduction by seed. Apomictic plants are found in nearly 300 species of angiosperms belonging to more than 35 families. The different forms of apomixis, which generally affect only female reproduction, are characterized by the absence of meiotic reduction, the absence of fertilization of the oosphere, and the parthenogenetic development of embryos. Apomixis therefore leads to the production of descendants genetically identical to their mother plant.
  • apomixis The natural counterpart of apomixis is sexual reproduction, or amphimixis.
  • sexual reproduction includes processes including both reductional meiosis and syngamy.
  • Meiosis randomly distributes homologous chromosomes from parents between gametes. It also allows recombination between homologous chromosomes, via crossing-overs. Syngamy is the fusion of gametes. It allows to gather in an individual a particular combination of genetic information from both parents. Amphimixis therefore produces, by recombination of the parental genomes, genetically unique descendants.
  • the first generation corresponds to the sporophyte.
  • One or more sporophyte cells undergo meiosis, producing meiospores.
  • the meiospores develop into gametophytes, which represent the gametophytic generation, at the origin of gametes.
  • the fusion of gametes leads to the zygote, which represents the return to the sporophytic generation.
  • the female gametophyte (the embryonic sac) develops in a very differentiated multicellular structure of the sporophyte, the ovum.
  • the archesporial cell goes through two successive stages: megasporogenesis (formation of a megaspore, or meiospore, reduced from an archesporial cell) and megagametogenesis (formation of female gametophyte from a megaspore) to produce a multicellular gametophyte that contains a single gamete, the oosphere.
  • This type of development (Polygonum type) concerns almost 80% of angiosperms.
  • the different forms of apomixis correspond to a series of variations on this theme.
  • the origin of the embryo allows a first subdivision between two fundamental forms of apomixis.
  • Gametophytic apomixis In adventitious embryos, the embryos differentiate directly from somatic cells of the nucella or the seed coat of the ovum. There is therefore no alternation of the sporophytic and gametophytic generations.
  • Gametophytic apomixis is characterized by the formation of an unreduced female gametophyte, and the parthenogenetic development of the embryo from the oosphere. In the rest of the text, any reference to apomixis will refer to gametophytic apomixis. There are two main types of gametophytic apomixis, which differ in the origin of the female gametophyte. In aposporic forms, the unreduced embryo sac is derived from a somatic cell in the ovum, usually the nucella.
  • the male gametophyte (the grain of pollen) contains two sperm.
  • Both the embryo and the endosperm are sexual.
  • the embryo develops without fertilization, but the albumen remains sexed.
  • pseudogamy, or pseudogamous apomixis when fertilization of the central cell is necessary for the development of the endosperm, and autonomous apomixis when both the embryo and the endosperm develop without fertilization.
  • apomixis therefore corresponds well to asexual reproduction by seed. It results from a sum of clearly identifiable components: apomeiosis, or formation of a sac embryonic without meiotic reduction, and parthenogenesis, or formation of an embryo without fertilization of the oosphere. Apomeiosis and parthenogenesis ensure the alternation of the sporophytic and gametophytic generations, but without alternation of the nuclear phases: sporophyte and gametophyte retain the same level of ploidy.
  • apomixis is actually a mixed mode of reproduction, combining amphimixis and asexual reproduction.
  • apomixis is generally an optional phenomenon: it appears in the offspring of apomictic plants of "off-type" individuals, that is to say genetically different from their mother plant.
  • off-types can appear if one or both conditions are not met, depending on the achievement or failure of meiosis and fertilization, the classes of possible descendants in an optional apomictic plant are as follows :
  • the first term designates the state of the gametophyte, reduced (n) or unreduced (2n). translates the presence or absence of fertilization of the oosphere.
  • the category “2n + n” leads to a genetic accumulation, and the category w n + 0 "to the haploidization of the mother plant.
  • the respective proportions of these different categories vary from one species to another, and even from one plant to another within a given species.
  • the references to apomixis relate to both the optional apomictic forms and the obligatory apomictic forms producing exclusively 2n + 0 type progenies.
  • Apomixis arouses great interest in view of its potential for plant improvement.
  • the use of apomixis in the main cultivated plants would represent a simple way of fixing heterosis. This is potentially a revolution in the manipulation of reproductive systems.
  • Arabidopsis thaliana is the most used model ((9), (10) and
  • orthologous genes means genes which have diverged from a common gene, or from genes paralogs, along with the species that carry them.
  • the targeted genes have the same functions with respect to apomixis.
  • the genus Tripsacum belongs to the Andropogonee tribe. It is the only known relative of the genus Zea on the American continent (4) and (11) have carried out the most complete study of the modes of reproduction in Tripsacum. This work made it possible to specify the following points: - all polyploid accessions reproduce by diplosporic apomixis,
  • the non-reduction in apomictic forms is mainly of Antennaria type, with rare occurrence of Taraxacum type, - the embryonic bags in diplosporic forms come directly from megasporocytes by 3 successive mitoses, the failure of meiosis in diplosporic forms is associated with the absence of callose deposits around megasporocytes,
  • the invention therefore aims to provide a method for identifying in a grass, and more particularly in a corn, a gene orthologous to a gene involved in apomixis. It also aims to provide a method of isolating the sequence of this gene.
  • the invention further relates to the use of this sequence to isolate the corresponding orthologous gene sequences in apomictic plants and the applications of these sequences in transgenesis.
  • the method according to the invention for identifying in a grass, and more particularly in a corn, a nucleotide sequence orthologous of sequence responsible for all or part of the apomictic development in an apomictic form, is characterized in that one maps in the grass genome, more specifically that of a corn, mutations having a phenotypic expression close to or similar to that observed in an apomictic form, to identify those of these mutations which appear orthologs of genes involved in apomixis.
  • a related phenotype is identified here based on four characteristics of the diplosporic forms, which can be observed either independently or in conjunction: (a) mutations are specific to megasporogenesis and do not affect male reproductive function, (b) they lead to the formation of unreduced gametes from an archesporial cell, (c) they are characterized by the absence of callose deposits around the mother cells of the megaspore, (d) the control points which act normally during the formation of the embryo sac appear inactive, and the embryo sacs are normally formed despite the failure of a stage during megasporogenesis.
  • the reference in the method defined above to the identification of nucleotide sequences includes the identification of loci or genes in an embodiment of the method of the invention, or mapping in the genome of the grass, more especially that of a corn, meiotic mutations to identify those which appear orthologs of genes involved in apomixis.
  • the invention relates in particular to a method of identification in a grass, more particularly in a corn, of a sequence of genes orthologous to that of the gene controlling apomeiosis in apomictic forms, characterized in that the expression is studied phenotypic and that localize the position of different meiotic mutations in the grass genome, more specifically of a corn, using molecular markers capable of locating the loci responsible for apomeiosis in said apomictic form.
  • the localized mutations according to the invention are cloned and sequenced.
  • the inventors have in particular demonstrated that the genes involved in the expression of apomixis in Tripsacum have one or more orthologs in the corn genome.
  • the use according to the invention of the same set of markers in maize and Tripsacum has made it possible to identify candidate genes having both (1) the same genomic location as the genes controlling diplosporia, in the sense that they are located in the same chromosomal region of a segment which, in maize, is homeologous to that controlling diplosporia in Tripsacum, and (2) a related phenotype, depending on criteria previously mentioned.
  • the location concerns the elongate and afd loci in the corn genome.
  • the method of the invention is further characterized in that it includes labeling using transposons of localized meiotic mutations.
  • the invention relates in particular to labeling using transposons of the elongate locus.
  • transposons whose sequence is known makes it possible to create a mutation for a gene of which only the phenotypic expression is known.
  • the insertion of the transposon into the gene that one seeks to isolate is often characterized by the loss of its function. In the case of recessive alleles, it is frequently characterized by the appearance of the recessive phenotype in heterozygous plants.
  • Particularly interesting transposons include the transposable elements of the Mutator type, or Ac / Ds.
  • the localized mutations are cloned and sequenced.
  • a mutated gene can be isolated by locating the site of insertion of the transposon, the different loci in which transposons have been inserted being cloned by the conventional techniques of Mendelian analysis and molecular biology (12) and (13), and sequences if desired.
  • the site is first characterized phenotypically for the expression of the ell allele. It is then located by genetic mapping, and its position compared to that of the loci controlling diplosporia in Tripsacum. The loci are then labeled via transposons, isolated and then sequenced.
  • the invention also relates to the use of at least part of a sequence as defined above to identify, then isolate, the sequence of orthologous genes in apomictic forms.
  • the invention relates, as such, to the isolated nucleotide sequences. These sequences are characterized in that they are orthologs of sequences responsible for all or part of the development in an apomictic form.
  • the invention also includes the sequences homologous, in terms of function, to those identified above.
  • the invention relates in particular to a nucleotide sequence of this type corresponding to the mutated elongate gene.
  • Nucleic acids containing one or more sequences as defined above associated with regulatory sequences necessary for expression in plant material also form part of the invention.
  • the invention also includes the cloning and expression vectors comprising such nucleic acids as well as the cellular hosts containing these vectors, for example Agrobacterium tumefaciens.
  • the invention also relates to the use of such sequences, where appropriate in conjunction with other alleles characteristic of apomictic forms, for transforming the genome of plant material, plant cells, plants, at various stages of development, and seeds. , in order to give them an apomictic development.
  • Said alleles correspond to genes other than the orthologous genes targeted by the invention.
  • the invention relates in particular to a process for the production of apomictic plants, characterized in that a sequence of the mutated elongate gene as defined above is used.
  • This transformed plant material falls within the scope of the invention and is characterized in that it contains in its genome at least the part of said sequence involved in apomictic development, if necessary in conjunction with other alleles characteristic of apomictic forms.
  • the cells, plants and seeds concerned belong to the family of grasses. This is particularly corn.
  • the transformation of plant material, cells, plants and seeds is obtained by operating advantageously according to conventional transgenic techniques. For example, for obtaining transgenic corn plants.
  • the genetic transformation of corn whatever the method used (electroporation; Agrobacterium, microfibers, particle cannon), generally requires the use of undifferentiated cells in rapid divisions which have retained the ability to regenerate whole plants.
  • This type of cell makes up the embryogenic friable callus (called type II) of corn.
  • type II embryogenic friable callus
  • These calluses are obtained from immature embryos of genotype Hl II or (A188 x B73) according to the method and on the media described by Armstrong (1994). The calluses thus obtained are multiplied and maintained by successive subcultures every fortnight on the initiation medium.
  • Seedlings are then regenerated from these calluses by modifying the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by Vain et al. (1989). These plants are then acclimatized in the greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the preceding paragraph describes obtaining and regenerating the cell lines necessary for transformation; a method of genetic transformation leading to the stable integration of the modified genes into the plant genome is described here.
  • This method is based on the use of a particle gun; the target cells are fragments of calluses described in paragraph 1. These fragments with an area of 10 to 20 mm 2 were placed, 4 h before bombardment, at the rate of 16 fragments per dish in the center of a petri dish containing a culture medium identical to the initiation medium, supplemented with 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol.
  • the plasmids carrying the genes to be introduced are purified on a Qiagen column, following the manufacturer's instructions. They are then precipitated on tungsten particles (M10) following the protocol described by Klein et al,
  • Suitable selective agents generally consist of active compounds of certain herbicides (Basta ®, Roundup ®,) or certain antibiotics (Hygromycin, Kanamycin ).
  • Calls are obtained after 3 months or sometimes earlier, calluses whose growth is not inhibited by the selection agent, usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
  • the frequency of obtaining such calluses is approximately 0.8 cal per bombarded box.
  • calluses are identified, individualized, amplified and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid interference with non- transformed all these operations are carried out on culture media containing the selective agent. The plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the invention thus provides means for disposing of a population of apomictic plants and having active transposable elements.
  • hybridization probes produced from said sequences as well as the primers which can be used in PCR techniques, therefore form part of the invention.
  • Such probes and primers correspond in particular to those developed from the elongate sequence.
  • hybridization or PCR techniques are advantageously carried out according to conventional methods.
  • the invention also relates to a method for identifying and isolating a gene responsible for diplosporia in apomictic Tripsacum, characterized in that at least part of the sequence of the elongate locus is used.
  • the method of the invention is further characterized in that the sequence isolated from apomictic Tripsacum is used for the functional analysis of the relationship between this sequence and the expression of apomixis.
  • a mutagenesis method is used, as illustrated in the examples, making it possible to confirm the relationship between the sequence isolated in apomictic Tripsacum from the sequence of the elongate gene and the phenotypic expression of apomixis.
  • the relationship between said sequence and the expression of apomeiosis is confirmed in particular.
  • FIGS. 1 to 5 respectively represent: - Figure 1, the genetic mapping of the chromosome segment controlling diplosporia in an apomictic tetraploid Tripsacum, and the comparison with sexed diploid plants in Tripsacum and maize, - Figure 2, the construction of a mapping population for the mutation ell, (elongate),
  • FIG. 3 the construction of a mutagenesis population for labeling the elongate locus
  • the population includes 175 FI plants, of which 56 have been used for mapping.
  • the mapping population includes 232 FI maize plants - Tripsacum.
  • the apomictic plant was used as a male.
  • the allele must be simplex in the tetraploid, that is to say differentiable from the 3 others.
  • FIG. 1 represents the genetic mapping of the chromosomal segment controlling apomeiosis, and the comparison with the diploid sexual plants in Tripsacum and maize.
  • "Apo" corresponds to the locus responsible for apomeiosis.
  • the position of umc71 on chromosome 6 in maize is indicated approximately, the allele on chromosome 6 having been removed from the latest versions of the UMC card.
  • the probes detecting alleles linked to the chromosomal segment controlling diplosporia in Tripsacum all detect alleles belonging to the same linkage group on the corn map. It is the long arm of chromosome 6. Some of them also detect alleles in other regions of the genome, in particular chromosomes 3 and 8.
  • the locations on the corn map of the various probes linked to apomeiosis are given in the following table:
  • meiosis mutants There are very many meiosis mutants in corn.
  • the phenotypic criteria retained in the choice of the candidate genes were as follows: (1) the presence of clearly differentiated archesporial cells (2) the total absence of induction of meiosis in these cells, or the failure thereof at an early stage (3) the capacity to produce a functional gametophyte independently of the failure of meiosis, (4) the absence or at least a very marked drop in callose deposits around the megaspore mother cell.
  • potential candidates that is to say having all or some of the characteristics mentioned above, those whose position in the corn genome was unknown or imprecise were mapped using as reference loci those detected by the probes used for the mapping of apomeiosis in Tripsacum.
  • chromosome 8 The precise location of the elongate locus was unknown until the invention. However, it was known to belong to the long arm of chromosome 8 in corn. It was therefore not located directly on the corn chromosome arm identified by Leblanc et al. as homeologist of the one controlling apomeiosis. Located on chromosome 8, however, it potentially belongs to a segment which happens to be duplicated between the distal part of the long arm of chromosome 6 and certain parts of chromosome 8 (15).
  • Figure 2 describes the construction of a mapping population for the ell mutation
  • Ell / ell were backcrossed on three ell / ell homozygous plants. For each family, 50 plant plants were put in the field, self-fertilized, and evaluated for their phenotype. Ell / ell seeds are expected to be normal, with ell / ell seeds showing a malformed albumen. In order to confirm the elongate phenotypes, ten to twenty embryos inside the seeds showing a defective albumen were removed, and analyzed by flow cytometry using the protocol proposed by Galbraiht et al (20). The ell mutation was obtained from the Maize Genetic Stock Center, Urbana, Illinois, in the form of seeds from the self-fertilization of plants homozygous for the ell allele in an otherwise undetermined genetic background.
  • the homozygous wild phenotype line, 23, was used for the population construction. Link detection and estimation of recombination rates were obtained using Mapmaker 2.0 software, for machintosh. - Comparison of the phenotypic expression of apomeiotic and elo ⁇ grate plants
  • the phenotypic expression of the elongate mutation in archesporial cells of homozygous ell / ell plants was analyzed by cytoembryology techniques previously described by Leblanc et al. (11). Immature inflorescences were collected on four types of material: (1) sexed diploid Tripsacum, (2) apomictic tetraploid Tripsacum, accessions described in Leblanc et al (11), (3) a line of homozygous corn Ell / Ell de wild phenotype (23), and (4) a homozygous ell / ell line.
  • Transposon labeling consists in using transposons whose sequence is known in order to create a mutation for a gene of which only the phenotypic expression is known.
  • the insertion of the transposon into the gene that one seeks to isolate is often characterized by the loss of its function. In the case of recessive alleles, it is frequently characterized by the appearance of the recessive phenotype in heterozygous plants.
  • the mutated gene can then itself be cloned by locating the site of insertion of the transposon.
  • the mutated gene can then be isolated by locating the transposon insertion site, the different loci where transposons were inserted being cloned by conventional Mendelian analysis and molecular biology techniques. The following experiments were carried out with the Mutator system (21).
  • the population used for labeling the elongate locus using transposons is shown diagrammatically in FIG. 3 (f: frequency of appearance; [EL] and [el]: dominant and recessive phenotypes; El *: marked allele. plants homozygous for the recessive mutation are crossed on plants homozygous for the wild allele, Ell. In the population of gametes produced by the parent EL1 / Ell, one or more mutations are found at the elongate locus. When the insertion leads to the loss of the function of this allele, we then find some FI plants of genotype ell / Ell, but phenotype ell. The gene is then marked.
  • Figure 4 allows the comparison of the development of archesporial cells in these different types of materials (A: megaspore mother cell in 23, corn of genotype Ell / Ell; B: megaspore mother cell in corn homozygous ell / ell ; C: megaspore mother cell in a sexed diploid Tripsacum; D: megaspore mother cell in an apomictic tetraploid Tripsacum).
  • A megaspore mother cell in 23, corn of genotype Ell / Ell
  • B megaspore mother cell in corn homozygous ell / ell
  • C megaspore mother cell in a sexed diploid Tripsacum
  • D megaspore mother cell in an apomictic tetraploid Tripsacum
  • the developmental stages observed have been identified and synchronized between the different forms observed, based on the size and morphology of the external integuments of the ovum (11).
  • a population of 12,500 FI plants produced according to Figure 3 were put in the field at the CIMMYT experimental station in Tlatizapan, Mexico.
  • the 12,500 plants were fertilized by a corn hybrid devoid of active Mutator (hybrid CML135 * CML 62).
  • the ears of 12500 were observed at maturity in order to detect those expressing the elongrate mutation although heterozygous at this locus.
  • the corresponding embryos were analyzed by flow cytometry. Two plants identified as TTE1-5 and TTE1-7 were identified as having deficient endosperm associated with a triploid embryo.
  • Example 3 obtaining and using a mutagenesis population making it possible to confirm the relationship between the candidate allele and the phenotype expression of all or part of the apomictic development
  • the general diagram and the materials used are presented in Figure 5.
  • the lines containing Mutator elements were obtained from M. Freeling, University of California at Berkeley.
  • the BC2-28 dihaploid plants used here are those previously described by Leblanc et al (6). These are apomictic plants, with a haploid genome from each of the two parents of corn and Tripsacum origin. We have used these plants to introduce Mutator elements into apomictic material.
  • a population of a thousand apomictic BC2-28 plants was first formed, from a single apomictic dihaploid plant, and by selecting from its progeny plants of type 2n + 0. We thus create a thousand copies of the same apomictic polyhaploid genotype. These thousand plants were crossed by Mutator stocks. In the offspring obtained, we selected for non-type plants 2n + n, that is to say having incorporated a genome from the Mutator stocks. These stocks have around 200 copies of the different types of Mutator s. We therefore hope to recover an average of 100 copies from apomictic plants. The selection of BC2-28 plants and apomictic BC3-38 off-types was made on a simple morphological criterion.
  • Dihaploids indeed have a very recognizable phenotype, and very different from that which results from the accumulation of an additional corn genome (6).
  • BC2-28 x Mutators seeds
  • the whole was put in the field on the CIMMYT experimental station in Tlaltizapan, Morelos state, during the summer of 1996.
  • the 2n + n off-types were selected one month after germination.
  • Around 7,500 2n + n plants were obtained, i.e. almost 20% of off-types.
  • This population was crossed by a corn hybrid (CML135 * CML62) devoid of active Mutator elements, producing a population about 150,000 seeds, representing the reverse genetics population.
  • This population represents an ideal material for analyzing the effect of a given sequence on the expression of apomixis.
  • the Tripsacum alleles responsible for the expression of this characteristic are here in simplex condition (a single copy in the genome). It is therefore sufficient to verify the allele-function relationship to control the phenotypic effect of the insertion of a transposon in this sequence. If the mutation induces a loss of function, then the sequence-function relationship has been established with certainty. Since the sequences of both the transposons and the gene studied are known, it is possible to identify the plants mutated for this allele by standard PCR techniques.
  • Rhoades M. M.
  • E. Dempsey 1966 Induction of chromosome doubling at meiosis by the elongate gene in maize. Genetics 54: 505-522.
  • Galbraith D. W., K. R. Harkins, J. M.

Abstract

Le procédé de l'invention pour identifier chez les graminées, et plus spécialement chez le maïs, une séquence de nucléotides impliquée dans l'apomixie chez les plantes apomictiques est caractérisé en ce qu'on identifie dans le génome de la graminée, par analyse phénotypique, cartographie génétique et marquage par l'intermédiaire de transposons, des mutations méiotiques dont on montre que le gène correspondant est orthologue de gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie. Utilisation du gène cloné chez la graminée pour identifier et isoler la séquence du gène orthologue chez des plantes apomictiques. Utilisation ou modification de la séquence isolée chez les formes apomictiques pour induire un développement apomictique chez des plantes sexuées.

Description

Moyens pour l'identification de séquences nuclêotidiques impliquées dans l'apomixie
L'invention a pour objet des moyens pour identifier, isoler et caractériser des séquences nuclêotidiques impliquées dans l'apomixie. Elle vise plus particulièrement un procédé et des outils permettant d'identifier ces séquences dans le génome de plantes apomictiques, puis de les isoler et de les caractériser.
Elle se rapporte également aux applications transgéniques réalisées à l'aide de ces séquences, et aux produits obtenus.
Dans son acception moderne, l'apomixie, ou agamospermie, regroupe l'ensemble des phénomènes de reproduction asexuée par graine. On trouve des plantes apomictiques chez près de 300 espèces d'angiospermes appartenant à plus de 35 familles. Les différentes formes d'apomixie, qui n'affectent généralement que la reproduction femelle, se caractérisent par l'absence de réduction méiotique, l'absence de fécondation de l'oosphère, et le développement parthénogénétique des embryons. L'apomixie conduit donc à la production de descendants génétiquement identiques à leur plante mère.
La contrepartie naturelle de l'apomixie est la reproduction sexuée, ou amphimixie. Par opposition à l'apomixie, la reproduction sexuée inclut les processus comprenant à la fois méiose réductionnelle et syngamie .
La méiose répartit au hasard entre les gamètes les chromosomes homologues issus des parents . Elle permet aussi la recombinaison entre chromosomes homologues, par l'intermédiaire des crossing-overs . La syngamie est la fusion des gamètes . Elle permet de réunir dans un individu une combinaison particulière de l'information génétique issue des deux parents. L' amphimixie produit donc, par recombinaison des génomes parentaux, des descendants génétiquement uniques .
Dans les cycles de développement des plantes, on observe ainsi l'alternance de deux générations successives, séparées par la méiose et la fécondation. La première génération correspond au sporophyte. Une ou plusieurs cellules du sporophyte subissent la méiose, produisant les méiospores . Les méiospores se développent en gamétophytes, qui représentent la génération gamétophytique, à l'origine des gamètes. La fusion des gamètes conduit au zygote, qui représente le retour à la génération sporophytique.
Chez les angiospermes sexuées, le gamétophyte femelle (le sac embryonnaire) se développe dans une structure multicellulaire très différenciée du sporophyte, l'ovule. Au cours du développement de l'ovule, une cellule particulière, la cellule archesporiale, passe par deux étapes successives: la mégasporogenèse (formation d'une mégaspore, ou méiospore, réduite à partir d'une cellule archesporiale) et la mégagamétogenese (formation du gametophyte femelle à partir d'une mégaspore) pour produire un gametophyte pluricellulaire qui contient un seul gamète, l'oosphère. Ce type de développement (type Polygonum) concerne près de 80% des angiospermes. Les différentes formes d'apomixie correspondent à une série de variations sur ce thème .
L'origine de l'embryon permet une première subdivision entre deux formes fondamentales d'apomixie.
Dans les cas d'embryonnie adventive, les embryons se différentient directement à partir de cellules somatiques du nucelle ou du tégument de l'ovule. Il n'y a donc pas d'alternances des générations sporophytiques et gamétophytiques . L'apomixie gamétophytique, par contre, se caractérise par la formation d'un gametophyte femelle non-réduit, et le développement parthénogénétique de l'embryon à partir de l'oosphère. Dans la suite du texte, toute référence a l'apomixie se rapportera à l'apomixie gamétophytique. On observe deux grands types d'apomixie gamétophytique, qui diffèrent par l'origine du gametophyte femelle. Chez les formes aposporiques, le sac embryonnaire non-réduit est dérivé d'une cellule somatique de l'ovule, généralement du nucelle. Chez les formes diplosporiques, il est issu d'une cellule générâtive, la cellule archesporiale. L'apoméiose recouvre à la fois aposporie et diplosporie. Il existe en fait une grande diversité de processus conduisant à la formation d'un gametophyte non-réduit.
Chez les angiospermes sexués, le gametophyte mâle (le grain de pollen) contient deux spermatozoïdes. L'un féconde l'oosphère, donnant naissance à l'embryon, tandis que l'autre s'unit au noyau de la cellule centrale, à l'origine de l'albumen. L'embryon et l'albumen sont donc tous deux sexués. On parle de double fécondation, caractéristique propre des angiospermes. Chez la majorité des plantes apomictiques, l'embryon se développe sans fécondation, mais l'albumen demeure sexué. On parle de pseudogamie, ou apomixie pseudogame, lorsque la fécondation de la cellule centrale est nécessaire au développement de l'albumen, et d'apomixie autonome lorsqu'à la fois l'embryon et l'albumen se développent sans fécondation. Au niveau embryonnaire, l'apomixie correspond donc bien à une reproduction asexuée par graine. Elle résulte d'une somme de composantes clairement identifiables: l'apoméiose, ou formation d'un sac embryonnaire sans réduction méiotique, et la parthénogenèse, ou formation d'un embryon sans fécondation de l'oosphère. Apoméiose et parthénogenèse assurent l'alternance des générations sporophytiques et gamétophytiques, mais sans alternance des phases nucléaires : sporophyte et gametophyte conservent le même niveau de ploïdie.
Au niveau d'une plante, cependant, l'apomixie est en fait un mode de reproduction mixte, associant amphimixie et reproduction asexuée. En effet, l'apomixie est en règle générale un phénomène facultatif: il apparaît dans les descendances de plantes apomictiques des individus "hors-types", c'est-à-dire génétiquement différents de leur plante mère. Pour qu'il y ait développement apomictique au sens strict, il faut que les deux conditions de non-réduction et non-fécondation soient réunies. Des hors-types peuvent apparaître si l'une ou les deux conditions ne sont pas remplies, en fonction de la réalisation ou de l'échec de la méiose et de la fécondation, les classes de descendances possibles chez une plante apomictique facultative sont les suivantes:
Dans la définition des hybrides de type "n+n" , ou w2n+n" , etc...., le premier terme désigne l'état du gametophyte, réduit (n) ou non réduit (2n) . Le deuxième terme traduit la présence ou l'absence de fécondation de l'oosphère. La catégorie w2n+0" représente donc l'apomixie stricto sensu, et la catégorie wn+n" 1 ' amphimixie . La catégorie "2n+n" conduit à une accumulation géno ique, et la catégorie wn+0" à l'haploidisation de la plante mère. Les proportions respectives de ces différentes catégories sont variables d'une espèce à l'autre, et même d'une plante à l'autre au sein d'une espèce donnée. Dans la suite de la description, les références à l'apomixie concernent aussi bien les formes apomictiques facultatives que les formes apomictiques obligatoires produisant exclusivement des descendances de type 2n+0.
Le déterminisme génétique de l'apomixie est encore très mal compris. On admet aujourd'hui que les angiospermes à reproduction asexuée descendent d'ancêtres à reproduction sexuée, et que le passage d'une forme de reproduction à une autre relève d'un déterminisme génétique. L'apomixie résulterait donc de l'expression de gènes ou d'allèles d'apomixie, c'est-à-dire présents et exprimés chez les plantes apomictiques, mais absents ou non fonctionnels chez les plantes sexuées. La grande majorité des travaux sur le contrôle génétique de l'apomixie concernent l'apoméiose, et plus fréquemment l' aposporie. Il existe actuellement un consensus assez large sur le principe d'une hérédité mendélienne de l'aposporie (voir références (1) et (2), les références bibliographiques étant données en fin de description) . On dispose de peu de connaissances sur la diplosporie, mais les résultats existants (3, 4) montrent que l'hypothèse admise chez les plantes aposporiques est sans doute applicable aux plantes diplosporiques . Dans ces différents modèles, le mode d'action des gènes concernés reste une énigme. Ces analyses tendent cependant à montrer que le gène responsable de l'apoméiose pourrait à lui seul déclencher l'ensemble du processus apomictique.
L'apomixie suscite un grand intérêt eu égard à son potentiel pour 1 ' amélioration des plantes . L'utilisation de l'apomixie chez les principales plantes cultivées représenterait une manière simple de fixer l'hétérosis. Il s'agit potentiellement d'une révolution quant à la manipulation des systèmes de reproduction.
De nombreux programmes ont vu le jour, dont l'objectif est de caractériser les "gènes d'apomixie", et de les introduire dans les plantes cultivées. Les travaux les plus anciens, et probablement les plus avancés, utilisent des plantes naturellement apomictiques. Les allëles correspondants y sont présents, et fonctionnels. Leur transfert dans des espèces cultivées importantes peut se faire soit par l'intermédiaire de croisements interspécifiques entre une espèce cultivée et un apparenté apomictique, soit en isolant les gênes correspondants, pour les introduire ensuite dans l'espèce cible par transgénie ( (5) ; (6) ;
(7) et (8) ) .
Une autre approche, en développement rapide, consiste à générer l'apomixie chez des espèces sexuées, par différentes méthodes de mutagenèse. Arabidopsis thaliana est le modèle le plus utilisé ( (9) , (10) et
(8) ) . Des travaux équivalents sont en cours chez le pétunia, Pétunia hybrida (10) , et Hieracium (8) . Dans tous ces cas de figures, l'hypothèse fondamentale est qu'un contrôle génétique simple est en cause, et que le transfert, ou la modification d'un nombre très faible d'allèles fournit les conditions suffisantes à l'expression de l'apomixie. On entend ici l'apomixie comme la résultante des événements précédemment mentionnés: échec de la méiose et parthénogenèse.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à rechercher chez le mais des gènes orthologues de celui ou ceux impliqués dans l'expression de 1 ' apomixie chez les espèces du genre Tripsacum, genre apparenté au mais. Dans la description et les revendications, on entend, par "gènes orthologues", des gènes qui auraient divergé d'un gène commun, ou de gènes paralogues, en même temps que les espèces qui les portent. Les gènes visés ont les mêmes fonctions par rapport à 1 ' apomixie .
Le genre Tripsacum appartient à la tribu des Andropogonees. C'est le seul apparenté connu du genre Zea sur le continent américain (4) et (11) ont réalisé l'étude la plus complète des modes de reproduction chez Tripsacum. Ces travaux ont permis de préciser les points suivants : - toutes les accessions polyploïdes se reproduisent par apomixie diplosporique,
- la non-réduction chez les formes apomictiques est principalement de type Antennaria, avec occurrence rare de type Taraxacum, - les sacs embryonnaires chez les formes diplosporiques sont issus directement des mégasporocytes par 3 mitoses successives, l'échec de la méiose chez les formes diplosporiques est associé à l'absence de dépôts de callose autour des mégasporocytes,
- l'analyse d'une population FI entre maïs et une forme diplosporique de Tripsacum indique une hérédité simple de l'apoméiose,
- différents allèles détectés par des sondes moléculaires de mais ont été cartographies à proximité du locus responsable de l'apoméiose ; il s'agit des sondes umc28, csu68, et umc62,
- ces sondes permettent d'établir une relation partielle d'homologie entre le chromosome responsable de l'apoméiose chez Tripsacum et la partie distale du bras long du chromosome 6 chez le mais.
Les travaux des inventeurs les ont conduits à proposer et à montrer que les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum possèdent un ou plusieurs gènes orthologues dans le génome des graminées sexuées, en particulier dans le génome du maïs . Cette approche a permis de développer une stratégie générale conduisant à identifier, puis cloner des séquences nuclêotidiques responsables de l'apomixie, et de mettre au point de nouveaux outils pour sa réalisation.
L'invention a donc pour but de fournir un procédé pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, un gène orthologue d'un gène impliqué dans l'apomixie. Elle a également pour but de fournir un procédé d'isolement de la séquence de ce gène.
L'invention vise en outre l'utilisation de cette séquence pour isoler les séquences de gènes orthologues correspondantes chez des plantes apomictiques et les applications de ces séquences en transgénèse.
Elle a en outre pour but un procédé permettant de confirmer la relation fonctionnelle entre les séquences isolées chez des plantes apomictiques et l'expression phenotypique de l'apomixie.
Le procédé selon l'invention, pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, une séquence de nucléotides orthologue de séquence responsable de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique, est caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations possédant une expression phenotypique proche ou similaire à celle observée chez une forme apomictique, pour identifier celles de ces mutations qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
On identifie ici un phénotype apparenté sur la base de quatre caractéristiques des formes diplosporiques, qui peuvent être observées soit indépendamment, soit en conjonction: (a) les mutations sont spécifiques de la mégasporogenèse et n'affectent pas la fonction reproductive mâle, (b) elles conduisent à la formation de gamètes non-réduits à partir d'une cellule archesporiale, (c) elles se caractérisent par l'absence de dépôts de callose autour des cellules mère de la mégaspore, (d) les points de contrôle qui agissent normalement lors de la formation du sac embryonnaire semblent inactifs, et les sacs embryonnaires sont normalement formés malgré l'échec d'une étape au cours de la mégasporogenèse.
La référence dans le procédé défini ci-dessus à 1 ' identification de séquences de nucléotides englobe 1 ' identification de loci ou de gènes dans un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, ou cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans 1 ' apomixie .
L'invention vise notamment un procédé d'identification chez une graminée, plus spécialement chez un maïs, d'une séquence de gènes orthologues de celle du gène contrôlant l'apoméiose chez les formes apomictiques, caractérisé en ce qu'on étudie l'expression phenotypique et qu'on localise la position de différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de l'apoméiose chez ladite forme apomictique.
D'une manière générale, les mutations localisées selon 1 ' invention sont clonées et séquencées .
Les inventeurs ont mis en particulier en évidence que les gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie chez Tripsacum possèdent un ou plusieurs orthologues dans le génome du maïs. L'utilisation selon l'invention d'un même jeu de marqueurs chez maïs et Tripsacum, a permis d'identifier des gènes candidats présentant à la fois (1) la même localisation genomique que les gènes contrôlant la diplosporie, en ce sens qu'ils sont situés dans la même région chromosomique d'un segment qui, chez le maïs, est homéologue de celui contrôlant la diplosporie chez Tripsacum, et (2) un phénotype apparenté, fonction de critères précédemment mentionnés. De manière préférée, la localisation concerne les loci elongate et afd dans le génome du maïs .
Le procédé de 1 ' invention est encore caractérisé en ce qu'il comprend l'étiquetage à l'aide de transposons des mutations méiotiques localisées. L ' invention vise en particulier 1 ' étiquetage à 1 ' aide de transposons du locus elongate .
L'utilisation de transposons dont on connaît la séquence permet de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phenotypique. L'insertion du transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractérise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d'allèle récessifs, elle se caractérise fréquement par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétérozygotes. Des transposons particulièrement intéressants comprennent les éléments transposables des type Mutator, ou Ac/Ds. On procède avantageusement au clonage et séquençage des mutations localisées.
Ainsi, un gène muté peut être isolé en repérant le site d'insertion du transposon, les différents loci où ont été insérés des transposons étant clones par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire (12) et (13), et séquences si on le souhaite .
Dans le cas par exemple du site correspondant plus particulièrement au locus elongate, on caractérise tout d'abord phenotypiquement le site pour l'expression de l'allèle ell . Il est ensuite localisé par cartographie génétique, et sa position comparée à celle des loci contrôlant la diplosporie chez Tripsacum. Les loci sont ensuite marqués par l'intermédiaire de transposons, isolés, puis séquences.
L'invention vise également l'utilisation d'au moins une partie d'une séquence telle que définie ci- dessus pour identifier, puis isoler, la séquence des gènes orthologues chez des formes apomictiques .
L'invention vise, en tant que telles, les séquences nuclêotidiques isolées. Ces séquences sont caractérisées en ce qu'elles sont orthologues de séquences responsables de tout ou partie du développement chez une forme apomictique . L ' invention comprend également les séquences homologues, en termes de fonction, de celles identifiées ci-dessus. L ' invention vise notamment une séquence de nucléotides de ce type correspondant au gène muté d' elongate.
Les acides nucléiques contenant une ou plusieurs séquences telles que définies ci-dessus associées à des séquences régulatrices nécessaires à l'expression dans le matériel végétal font également partie de l'invention.
L ' invention comprend également les vecteurs de clonage et d'expression comportant de tels acides nucléiques ainsi que les hôtes cellulaires contenant ces vecteurs, par exemple Agrobacterium tumefaciens.
L'invention vise également l'utilisation de telles séquences, le cas échéant en conjonction avec d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques, pour transformer le génome d'un matériel végétal, cellules végétales, plantes, à divers stades de développement, et graines, afin de leur conférer un développement apomictique. Les dits allèles correspondent à des gènes autres que les gènes orthologues visés par 1 ' invention.
L'invention concerne notamment un procédé de production de plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence du gène muté d' elongate telle que définie ci-dessus. Ce matériel végétal transformé, en tant que tel, entre dans le champ de l'invention et est caractérisé par le fait qu'il renferme dans son génome au moins la partie de ladite séquence impliquée dans un développement apomictique, le cas échéant en conjonction avec d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques .
Les cellules, plantes et graines visées appartiennent à la famille des graminées. Il s'agit en particulier de maïs.
La transformation du matériel végétal, cellules, plantes et graines, est obtenue en opérant avantageusement selon les techniques classiques de transgénie . A titre d'exemple, pour l'obtention de plantes de maïs transgéniques.
A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation; Agrobacterium, microfibres, canon à particules) , requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières . Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hl II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (1994) . Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d' initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées .
B. utilisation du canon à particules pour la transformation génétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit 1 ' obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation ; on décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante . Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules ; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gènes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein et al,
Nature, 1987, 327, pages 70-73. Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer
(1992) . Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais ®, puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta®, Round up®,) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine ... ) .
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules . Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées .
C. Utilisation d'AgroJacterium tumefaciens pour la transformation génétique du maïs.
La technique utilisée est celle décrite par
Ishida et al . (Nature Biotechnology, 1996, 14 : 745-750) ou par Horsch et al . , Science, 1984, 223, pages 496-498.
L'invention fournit ainsi des moyens pour disposer d'une population de plantes apomictiques et possédant des éléments transposables actifs.
En particulier, elle fournit les moyens pour induire un développement apomictique chez une plante sexuée et notamment chez le maïs . Dans une autre application selon l'invention, on utilise au moins une partie d'une séquence telle que définie ci-dessus, pour identifier et isoler la séquence du locus orthologue chez des formes apomictiques .
Les sondes d'hybridation élaborées à partir desdites séquences, ainsi que les amorces utilisables dans les techniques PCR, font donc partie de l'invention. De telles sondes et amorces correspondent notamment à celles élaborées à partir de la séquence d 'elongate .
Les techniques d'hybridation ou de PCR sont avantageusement réalisées selon les méthodes classiques.
L ' invention vise également un procédé d'identi ication et d'isolement d'un gène responsable de la diplosporie chez les Tripsacum apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la séquence du locus elongate .
Le procédé de 1 ' invention est encore caractérisé en ce qu'on utilise la séquence isolée chez les Tripsacum apomictiques pour l'analyse fonctionnelle de la relation entre cette séquence et l'expression de l'apomixie. On utilise en particulier un procédé de mutagênèse, comme illustré dans les exemples, permettant de confirmer la relation entre la séquence isolée chez les Tripsacum apomictiques à partir de la séquence du gène elongate et l'expression phenotypique de l'apomixie. Selon l'invention, on confirme en particulier la relation entre ladite séquence et l'expression de 1 ' apoméiose .
D'autres caractéristiques et avantages de 1 ' invention sont donnés dans les exemples qui suivent . Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 5, qui représentent respectivement : - la figure 1, la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez un Tripsacum tétraploïde apomictique, et la comparaison avec des plantes diploïdes sexuées chez Tripsacum et le maïs, - la figure 2, la construction d'une population de cartographie pour la mutation ell , ( elongate) ,
- la figure 3, la construction d'une population de mutagenèse pour le marquage du locus elongate,
- la figure 4, la caractérisation phenotypique des mégasporocytes chez des plantes homozygotes pour l'allèle ell et des plantes de maïs possédant l'allèle sauvage au locus elongate, et la comparaison avec des formes sexuées et apomictiques chez Tripsacum.
- la figure 5, la construction d'une population de mutagenèse chez des hybrides mais - Tripsacum, permettant l'analyse fonctionnelle de la relation entre la séquence isolée chez les plantes apomictiques et l'expression de l'apomixie.
Exemple 1 : Cartographie génétique de 1 ' apoméiose chez Tripsacum
On rapporte ci-après la réalisation d'une carte génétique du segment de chromosome contrôlant 1 ' apoméiose chez des formes apomictiques et sexuées du genre Tripsacum. 1) Matériels Cartographie des Tripsacum diploïdes : les deux parents utilisés sont des plantes diploïdes sexuées
(2n=36) de la collection ORSTOM-CIMMYT, maintenue sur la station expérimentale de Tlaltizapan, Etat de Morelos, au Mexique. Il s'agit d'un Tripsacum maizar Hem. and
Randolph, accession CIMMYT #99-1114 et d'un Tripsacum dactyloides var. méridionale de et and Timothy, accession CIMMYT #575-5136. La population comprend 175 plantes FI, parmi lesquelles 56 ont été utilisées pour la cartographie .
- Cartographie de 1 ' apoméiose : la population de cartographie comprend 232 plantes FI mais - Tripsacum. Le parent maïs (Hl) est un hybride de maïs (2n=2x=20) entre deux lignées CIMMYT (CML 135 par CML 139) . L'autre est un Tripsacum dactyloides tétraploïde et apomictique (2n=4x=72) , accession CIMMYT #65-1234. La plante apomictique a été utilisée comme mâle.
2) Méthodes
. Analyse des modes de reproduction : Elle est effectuée d'après Leblanc et al. (4)
. Détection de marqueurs moléculaires de type RFLP liés à 1 ' apoméiose :
La stratégie suivie correspond globalement à celle décrite par Michelmore et al. (14) pour la détection de marqueurs moléculaires liés à une réponse phenotypique déterminée . Les sondes ont été obtenues auprès de l'Université de Missouri, Columbia.
Une centaine de sondes RFLP ont été choisies sur les cartes génétiques existantes pour le maïs, pour obtenir une densité d'environ 20-30 cM entre deux marqueurs (voir (4) , annexe 4) . Différentes cartes de référence ont été utilisées : la carte UMC (University of Missouri Colombia ; Maize DataBase, carte UMC95) , une carte de l'Université de Cornell (15) et différentes cartes produites au CIMMYT (16) . Un test de chi2 a été utilisé pour détecter les liaisons potentielles, et les taux de recombinaisons ont été évalués d'après Allard
(17) . Le parent donneur du segment contrôlant l'apoméiose étant une plante tétraploïde hétérozygote, trois conditions sont nécessaires à la détection d'une liaison entre la diplosporie et un allèle RFLP : (1) existence d'un polymorphisme RFLP entre les deux parents à ce locus, (2) hétérozygotie pour cet allèle chez Tripsacum,
(3) l'allèle doit être simplex chez le tétraploïde, c'est-à-dire différenciable des 3 autres.
- Cartographie des diploïdes
On a utilisé une population de cartographie FI entre deux parents hétérozygotes appartenant à deux espèces distinctes. Les méthodes de cartographie sont telles que décrites par Ritter et al (18) . 3) Résultats
Identification de marqueurs RFLP liés à 1 ' apoméiose La figure 1 représente la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant l'apoméiose, et la comparaison avec les plantes diploïdes sexuées chez Tripsacum et le maïs. "Apo" correspond au locus responsable de l'apoméiose. La position d'umc71 sur le chromosome 6 du maïs est indiquée de manière approximative, l'allèle sur le chromosome 6 ayant été retiré des dernières versions de la carte UMC. La carte a été développée à partir de 52 plantes de la population FI entre maïs et Tripsacum. Dans cette population, méiose et diplosporie sont en ségrégation 1:1 (24 plantes apomictiques contre 28 plantes sexuées, chi2= 0,31, P=0,6). Quatre-vingt quatre sondes, sélectionnées sur la carte UMC pour couvrir aussi largement que possible le génome du maïs, ont été testées. 90% d'entre elles détectent au moins un polymorphisme entre maïs et Tripsacum. Trois sondes, présentant un allèle polymorphe et spécifique du bulk apomictique, ont été testées sur l'ensemble de la population FI. Un allèle, détecté par la sonde umc28, s'est avéré lié à l'apoméiose. Dans une deuxième étape, quatorze sondes proches du locus umc28 sur la carte UMC ont été testées. Quatre d'entre elles, umc71, umc62, csu68, et cdo202, détectent des allèles RFLP qui sont à la fois liés à la diplosporie, et en complète co-ségrégation entre eux.
- Cartographie comparée entre diploïdes sexués et tétraploïdes apomictiques Les cinq marqueurs liés à la diplosporie ont été cartographies sur la population diploïde . Tous ont pu l'être sur un même parent (575-5136) . On remarque que les cinq marqueurs sont tous strictement liés chez la plante tétraploïde, mais sont séparés par des taux de recombinaison importants à la fois chez le parent diploïde et le maïs.
- Cartographie comparée maïs - Tripsacum:
Les sondes détectant des allèles liés au segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez Tripsacum détectent toutes des allèles appartenant au même groupe de liaison sur la carte du maïs. Il s'agit du bras long du chromosome 6. Certaines d'entre elles détectent aussi des allèles dans d'autres régions du génome, en particulier les chromosomes 3 et 8. Les localisations sur la carte maïs des différentes sondes liées à l'apoméiose sont données dans le tableau suivant:
Clones Localisatii
UMC38* 6L; 8L; 3L
UMC62 6L
UMC71 6L; 8L
UMC28 6L
CSU68 6L; 8L; 3L
CDO202 6L; 8L, 3L
*: non liée à la diplosporie, mais appartient au même groupe de liaison.
Exemple 2 : Identification de gènes orthologues chez le maïs On a recherché chez le maïs, les gènes qui conduisent chez Tripsacum à l'expression de l'apoméiose. On a donc cherché à identifier chez le maïs des gènes candidats présentant à la fois (1) la même localisation genomique que l'apoméiose et (2) un phénotype apparenté à 1 ' apoméiose .
Il existe de très nombreux mutants de méiose chez le maïs . Les critères phénotypiques retenus dans le choix des gènes candidats ont été les suivants : (1) la présence de cellules archésporiales clairement différenciées (2) l'absence totale d'induction de la méiose chez ces cellules, ou l'échec de celle-ci à un stade précoce (3) la capacité à produire un gametophyte fonctionnel indépendamment de l'échec de la méiose, (4) l'absence ou pour le moins une baisse très marquée des dépôts de callose autour de la cellule mère de la mégaspore. Parmi les candidats potentiels, c'est à dire présentant tout ou partie des caractéristiques précédemment citées, ceux dont la position dans le génome du maïs était inconnue ou imprécise ont été cartographiées en utilisant comme loci de références ceux détectés par les sondes utilisées pour la cartographie de l'apoméiose chez Tripsacum.
- Matériels et Méthodes Les travaux dont les résultats sont rapportés ci-après ont été réalisés sur elongrate ( ell) , qui est un mutant de méiose récessif (19) . Chez les plantes homozygotes pour le locus ell , les chromosomes restent décondensés durant la métaphase et 1 ' anaphase de première division, entraînant diverses anomalies chromosomiques dont une proportion importante de gamétophytes non réduits (de 30 à 70 %, fonction entre autres du fond génétique dans lequel on place la mutation) . La fécondation par le pollen d'une plante normale conduit à un embryon triploïde, et à un albumen pentaploïde déficient.
La localisation précise du locus elongate était inconnue jusqu'à l'invention. On savait cependant qu'il appartenait au bras long du chromosome 8 du maïs. Il n'était donc pas localisé directement sur le bras de chromosome de maïs identifié par Leblanc et al. comme homeologue de celui contrôlant l'apoméiose. Localisé sur le chromosome 8, il appartient cependant potentiellement à un segment qui se trouve être dupliqué entre la partie distale du bras long du chromosome 6 et certaines parties du chromosome 8 (15) .
La figure 2 décrit la construction d'une population de cartographie pour la mutation ell
( elongate) . Trois plantes FI de génotype hétérozygote
Ell/ell ont été rétrocroisées sur trois plantes homozygotes ell/ell . Pour chaque famille, 50 plantes plantes ont été mises au champ, autofécondées, et évaluées pour leur phénotype. Les graines Ell/ell sont attendues normales, les graines ell/ell présentant un albumen malformé. Afin de confirmer les phénotypes elongate, dix à vingt embryons à l'intérieur des graines présentant un albumen déficient ont été prélevés, et analysés en cytométrie de flux en utilisant le protocole proposé par Galbraiht et al (20) . La mutation ell a été obtenue auprès du Maize Genêtic Stock Center, Urbana, Illinois, sous la forme de graines issues de 1' autofécondation de plantes homozygotes pour l'allèle ell dans un fond génétique par ailleurs indéterminé. On a utilisé la lignée homozygote de phénotype sauvage, 23, pour la construction de la population. La détection de liaison et l'estimation des taux de recombinaison ont été obtenues à l'aide du logiciel Mapmaker 2.0, pour machintosh. - Comparaison de l'expression phenotypique des plantes apoméiotiques et eloπgrate
L'expression phenotypique de la mutation elongate dans les cellules archésporiales de plantes homozygotes ell/ell a été analysée par des techniques de cytoembryologie précédemment décrites par Leblanc et al. (11) . Des inflorescences immatures ont été récoltées sur quatre types de matériels: (1) des Tripsacum diploïdes sexués, (2) des Tripsacum tétraploïdes apomictiques, accessions décrites dans Leblanc et al (11) , (3) une lignée de maïs homozygote Ell/Ell de phénotype sauvage ( 23) , et (4) une lignée homozygote ell/ell.
. Etiquetage et isolement de la séquence du locus elongate à l'aide d'éléments transposables . L'étiquetage par transposon consiste à utiliser des transposons dont on connaît la séquence afin de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phenotypique. L'insertion du transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractérise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d' allèle récessifs, elle se caractérise fréquemment par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétérozygotes. Le gène muté peut ensuite être lui-même clone en repérant le site d'insertion du transposon. Le gène muté peut alors être lui-même isolé en repérant le site d'insertion du transposon, les différents loci où ont été insérés des transposons étant clones par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire. Les expériences ci-après ont été réalisées avec le système Mutator (21) . La population utilisée pour l'étiquetage du locus elongate à l'aide de transposons est schématisée sur la figure 3 (f : fréquence d'apparition; [EL] et [el] : phénotypes dominant et récessif ; El* : allèle marqué. Les plantes homozygotes pour la mutation récessive sont croisées sur des plantes homozygotes pour l'allèle sauvage, Ell. Dans la population de gamètes produite par la parent ELl/Ell, on retrouve une ou plusieurs mutations au locus elongate . Lorsque l'insertion conduit à la perte de la fonction de cet allèle, on retrouve alors quelques plantes FI de génotype ell/Ell, mais de phénotype ell. Le gène est alors marqué .
Résultats:
- Cartographie du locus elongate :
Dans les populations en ségrégation, les phénotypes ell et Ell ségrègent en proportions 1:1 (Chi2= 0.5 ; P=0.6). Différentes sondes RFLP appartenant aux chromosomes 3, 6, et majoritairement 8 ont été testées avec trois enzymes de restriction, EcoRl, BamHl, et HindIII, sur 50 plantes de la population. Les sondes détectant des polymorphismes intéressants ont ensuite été analysées sur 100 individus supplémentaires. Umc28, umc62, et umc71 ne présentent pas d' allèles polymorphes liés au elongate avec les trois enzymes testées. Csu68 et cdo202, par contre, détectent des allèles liés au locus elongate . Les liaisons entre les trois loci, estimées en pourcentage de recombinaison, sont les suivantes:
- Caractérisation phenotypique:
La figure 4 permet la comparaison des développements des cellules archesporiales chez ces différents types de matériels (A: cellule mère de la mégaspore chez 23, un maïs de génotype Ell/Ell; B: cellule mère de la mégaspore chez un maïs homozygote ell/ell; C: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum diploïde sexué; D: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum tétraploïde apomictique) . Les stades de développement observés on été identifiés et synchronisés entre les différentes formes observées en se basant sur la taille et la morphologie des téguments externes de l'ovule (11). Pour les formes sexuées chez maïs et Tripsacum: , on observe des caractéristiques de développement tout à fait similaires : même morphologie à la fois des cellules et des noyaux (entre autre: cellule mère de la mégaspore de formes rectangulaires, paroies marquées épaisses, dépôts de callose très marqués au niveau des parois cellulaires, depuis la cellule mère des mégaspores jusqu'à la formation de la mégaspore). On observe cette même similarité en comparant les formes diplosporiques chez Tripsacum aux plantes de maïs homozygotes Ell/Ell : même morphologie à la fois des noyaux et des cellules (développement direct de la cellule mère de la mégaspore en sac embryonnaire, paroie cellulaires fines, noyaux très clairement différents de ceux observés chez les formes sexuées, et très comparables entre les formes diplosporiques chez Tripsacum et les plantes ell/ell chez le maïs, et absence ou très faibles dépôts de callose au niveau la cellule mère de la mégaspore) .
- Etiquetage par transposon du locus elongate: Une population de 12500 plantes FI produites selon la figure 3 ont été mises au champs sur la station expérimentale du CIMMYT à Tlatizapan, Mexique. Les 12500 plantes ont été fécondées par un hybride de maïs dépourvu de Mutator actif (hybride CML135 * CML 62) . Les épis des 12500 ont été observés à maturité afin de détecter ceux exprimant la mutation elongrate bien qu'hétérozygotes à ce locus. Pour les plantes présentant des albumens déficients, les embryons correspondants ont été analysés en cytométrie de flux. Deux plantes identifiées comme TTE1-5 et TTE1-7 ont été identifiées comme possédant des albumens déficients associés à un embryon triploïde. Ces plantes expriment le phénotype elongate chez des plantes hétérozygotes ell/Ell . Chez ces plantes l'allèle sauvage au locus a été étiqueté par un des transposons de type Mutator. Les graines produites par croisement de ces deux plantes par l'hybride CML135*CML62 forment une population dans laquelle cet allèle marqué ségrège au locus elongate : la moitié des plantes issues de ce croisement sont de génotype ell/El ( ell issu de la plante TTE1, El issu de CML135*CML62) , l'autre moitié étant de génotype Ell* /El , où Ell* est l'allèle marqué par le transposon et issu des plantes TTE1. On peut alors identifier et cloner le gène au locus elongate en analysant la co-ségrégation des différentes copies des éléments transposables présents chez ces plantes et du locus elongate tel que localisé avec les sondes RFLP mentionnées ultérieurement.
- Exemple 3: obtention et procédé d'utilisation d'une population de mutagenèse permettant de confirmer la relation entre l'allèle candidat et l'expression phénotype de tout ou partie du développement apomictique
Le schéma général et les matériels utilisés sont présentés figure 5. Les lignées contenant des éléments Mutator ont été obtenues auprès de M. Freeling, Université de Californie à Berkeley. Les plantes dihaploïdes BC2-28 utilisées ici sont celles précédemment décrites par Leblanc et al (6) . Il s'agit de plantes apomictiques, possédant un génome haploïde de chacun des deux parents d'origine maïs et Tripsacum. Nous avons utilisé ces plantes pour introduire des éléments Mutator dans un matériel apomictique.
Une population de mille plantes BC2-28 apomictiques a tout d'abord été constituée, à partir d'une unique plante dihaploïde apomictique, et en sélectionnant dans ses descendances les plantes de types 2n+0. Nous créons ainsi mille copies du même génotype polyhaploïde apomictique . Ces mille plantes ont été croisées par les stocks Mutator. Dans la descendance obtenue, nous avons sélectionné pour les plantes hors- types 2n+n, c'est-à-dire ayant incorporé un génome issu des stocks Mutator. Ces stocks possèdent environ 200 copies des différents types de Mutator s . On espère donc en récupérer en moyenne 100 copies dans les plantes apomictiques. La sélection des plantes BC2-28 et des hors-types BC3-38 apomictiques s'est faite sur un simple critère morphologique. Les dihaploïdes possèdent en effet un phénotype très reconnaissable, et très différent de celui qui résulte de l'accumulation d'un génome de maïs supplémentaire (6) . Au total, environ 35000 graines (BC2- 28 x Mutators) ont été obtenues. L'ensemble a été mis au champ sur la station expérimentale du CIMMYT à Tlaltizapan, état de Morelos, au cours de l'été 1996. Les hors-type 2n+n ont été sélectionnés un mois après germination. Environ 7500 plantes 2n+n ont été obtenues, soit près de 20% de hors-types. Cette population a été recroisée par un hybride de maïs (CML135*CML62) dépourvu d'éléments Mutator actifs, produisant une population d'environ 150000 graines, représentant la population de génétique inverse.
Cette population représente un matériel idéal pour analyser l'effet d'une séquence donnée sur l'expression de l'apomixie. En effet, les allèles Tripsacum responsables de l'expression de ce caractère sont ici en condition simplex (une seule copie dans le génome) . Il suffit donc pour vérifier la relation allèle-fonction de contrôler l'effet phenotypique de l'insertion d'un transposon dans cette séquence. Si la mutation induit une perte de fonction, on a alors établi avec certitude la relation séquence-fonction. Les séquences à la fois des transposons et du gène étudié étant connues, on peut identifier les plantes mutées pour cet allèle par des techniques de PCR classiques.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, une séquence de nucléotides orthologue de séquence responsable de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique, caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations présentant un phénotype proche ou similaire de celui observé chez une forme apomictique, pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on localise la position de différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de 1 ' apoméiose chez ladite forme apomictique.
4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise des marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de la diplosporie chez Tripsacum.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite localisation concerne les loci elongate et afd.
6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre 1 ' étiquetage par transposon des mutations méiotiques localisées. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que 1 ' étiquetage par transposon est réalisé au locus elongate à l'aide des éléments transposables du type Mutator ou Ac/Ds .
8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le clonage et le séquençage des mutations localisées.
9/ Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on clone les gènes mutés, après avoir repéré le site d'insertion du transposon par analyse de ségrégation, et qu'on les séquence si souhaité .
10/ Séquences de nucléotides, caractérisées en ce qu'elles sont orthologues de séquences responsables de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique et les séquences homologues . 11/ Séquence de nucléotides selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle correspond au gène muté d ' elongate .
12/ Acides nucléiques contenant une ou plusieurs séquences telles que définies dans la revendication 10 ou 11, associées à des séquences régulatrices nécessaires à l'expression dans un matériel végétal .
13/ Vecteurs de clonage et d'expression comportant des acides nucléiques selon la revendication 12.
14/ Hôtes cellulaires contenant un vecteur selon la revendication 13.
15/ Utilisation d'une séquence selon la revendication 10 ou 11, le cas échéant en conjonction avec d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques, pour introduction dans le génome d'un matériel végétal, cellules végétales, plantes à divers stades de développement et graines, afin de leur conférer un développement apomictique.
16/ Cellule végétale de graminées, en particulier de maïs, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 impliquée dans un développement apomictique.
17/ Plante de la famille des graminées, en particulier maïs, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11, impliquée dans un développement apomictique.
18/ Graine de graminées, en particulier de maïs, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 impliquée dans un développement apomictique.
19/ Procédé de production de plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence de nucléotides selon la revendication 11.
20/ Utilisation d'au moins une partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 pour identifier et isoler les séquences des loci orthologues chez des formes apomictiques . 21/ Sondes d'hybridation et amorces moléculaires caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'une séquence selon la revendication 10 ou 11.
22/ Sondes d'hybridation et amorces moléculaires selon la revendication 18, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de la séquence d ' elongate .
23/ Procédé d'identification et d'isolement de gènes responsables de l'apoméiose chez les Tripsacum apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la séquence du locus elongate . 24/ Procédé d'utilisation d'une population de mutagenèse pour confirmer la relation entre une séquence isolée chez Tripsacum selon la revendication 20 et 1 ' expression de 1 ' apomixie .
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