CA2282085A1 - Moyens pour l'identification de sequences nucleotidiques impliquees dans l'apomixie - Google Patents
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Abstract
Le procédé de l'invention pour identifier chez les graminées, et plus spécialement chez le maïs, une séquence de nucléotides impliquée dans l'apomixie chez les plantes apomictiques est caractérisé en ce qu'on identifie dans le génome de la graminée, par analyse phénotypique, cartographie génétique et marquage par l'intermédiaire de transposons, des mutations méiotiques dont on montre que le gène correspondant est orthologue de gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie. Utilisation du gène cloné chez la graminée pour identifier et isoler la séquence du gène orthologue chez des plantes apomictiques. Utilisation ou modification de la séquence isolée chez les formes apomictiques pour induire un développement apomictique chez des plantes sexuées.
Description
Moyens pour l'identification de séquences nucléotidiques impliquées dans l~apomixie L'invention a pour objet des moyens pour identifier, isoler et caractériser des séquences nuclêotidiques impliquées dans l'apomixie.
Elle vise plus particulièrement un procédé et des outils permettant d'identifier ces séquences dans le gênome de plantes apomictiques, puis de les isoler et de les caractériser.
Elle se rapporte également aux applications transgéniques réalisées à l'aide de ces séquences, et aux produits obtenus.
Dans son acception moderne, l'apomixie, ou agamospermie, regroupe l'ensemble des phénomènes de reproduction asexuée par graine. On trouve des plantes apomictiques chez près de 300 espèces d'angiospermes appartenant à plus de 35 familles. Les différentes formes d'apomixie, qui n'affectent génêralement que la reproduction femelle, se caractérisent par l'absence de réduction méiotique, l'absence de fécondation de l'oosphère, et le développement parthénogénétique des
Elle vise plus particulièrement un procédé et des outils permettant d'identifier ces séquences dans le gênome de plantes apomictiques, puis de les isoler et de les caractériser.
Elle se rapporte également aux applications transgéniques réalisées à l'aide de ces séquences, et aux produits obtenus.
Dans son acception moderne, l'apomixie, ou agamospermie, regroupe l'ensemble des phénomènes de reproduction asexuée par graine. On trouve des plantes apomictiques chez près de 300 espèces d'angiospermes appartenant à plus de 35 familles. Les différentes formes d'apomixie, qui n'affectent génêralement que la reproduction femelle, se caractérisent par l'absence de réduction méiotique, l'absence de fécondation de l'oosphère, et le développement parthénogénétique des
2 embryons. L'apomixie conduit donc â la production de descendants génétiquement identiques à leur plante mëre.
La contrepartie naturelle de l'apomixie est la reproduction sexuée, ou amphimixie. Par opposition â
l'apomixie, la reproduction sexuée inclut les processus comprenant à la fois méiose réductionnelle et syngamie.
La méiose répartit au hasard entre les gamètes les chromosomes homologues issus des parents. Elle permet aussi la recombinaison entre chromosomes homologues, par l'intermédiaire des crossing-overs. La syngamie est la fusion des gamëtes. Elle permet de réunir dans un individu une combinaison particulière de l'information génétique issue des deux parents. L'amphimixie produit donc, par recombinaison des génomes parentaux, des descendants génétiquement uniques.
Dans les cycles de développement des plantes, on observe ainsi l'alternance de deux générations successives, séparées par la méiose et la fêcondation. La première gênération correspond au sporophyte. Une ou plusieurs cellules du sporophyte subissent la méiose, produisant les méiospores. Les méiospores se développent en gamétophytes, qui représentent la génération gamétophytique, à l'origine des gamètes. La fusion des gamètes conduit au zygote, qui représente le retour à la gênération sporophytique.
Chez les angiospermes sexuées, le gamétophyte femelle (le sac embryonnaire) se développe dans une
La contrepartie naturelle de l'apomixie est la reproduction sexuée, ou amphimixie. Par opposition â
l'apomixie, la reproduction sexuée inclut les processus comprenant à la fois méiose réductionnelle et syngamie.
La méiose répartit au hasard entre les gamètes les chromosomes homologues issus des parents. Elle permet aussi la recombinaison entre chromosomes homologues, par l'intermédiaire des crossing-overs. La syngamie est la fusion des gamëtes. Elle permet de réunir dans un individu une combinaison particulière de l'information génétique issue des deux parents. L'amphimixie produit donc, par recombinaison des génomes parentaux, des descendants génétiquement uniques.
Dans les cycles de développement des plantes, on observe ainsi l'alternance de deux générations successives, séparées par la méiose et la fêcondation. La première gênération correspond au sporophyte. Une ou plusieurs cellules du sporophyte subissent la méiose, produisant les méiospores. Les méiospores se développent en gamétophytes, qui représentent la génération gamétophytique, à l'origine des gamètes. La fusion des gamètes conduit au zygote, qui représente le retour à la gênération sporophytique.
Chez les angiospermes sexuées, le gamétophyte femelle (le sac embryonnaire) se développe dans une
3 structure multicellulaire très différenciée du sporophyte, l'ovule. Au cours du développement de l'ovule, une cellule particulière, la cellule archésporiale, passe par deux étapes successives: la mégasporogenèse (formation d'une mégaspore, ou méiospore, rêduite â partir d'une cellule archésporiale) et la mégagamétogenèse (formation du gamétophyte femelle â
partir d'une mégaspore) pour produire un gamétophyte pluricellulaire qui contient un seul gamète, l'oosphère.
Ce type de développement (type Polygonum) concerne près de 80% des angiospermes. Les différentes formes d'apomixie correspondent à une série de variations sur ce thème.
L'origine de l'embryon permet une première subdivision entre deux formes~fondamentales d'apomixie.
Dans les cas d'embryonnie adventive, les embryons se différentient directement â partir de cellules somatiques du pucelle ou du tégument de l'ovule. I1 n'y a donc pas d'alternances des générations sporophytiques et 2o gamétophytiques. L'apomixie gamêtophytique, par contre, se caractérise par la formation d'un gamétophyte femelle non-réduit, et le développement parthénogénétique de l'embryon à partir de l'oosphère. Dans la suite du texte, toute référence à l'apomixie se rapportera à l'apomixie gamétophytique.
partir d'une mégaspore) pour produire un gamétophyte pluricellulaire qui contient un seul gamète, l'oosphère.
Ce type de développement (type Polygonum) concerne près de 80% des angiospermes. Les différentes formes d'apomixie correspondent à une série de variations sur ce thème.
L'origine de l'embryon permet une première subdivision entre deux formes~fondamentales d'apomixie.
Dans les cas d'embryonnie adventive, les embryons se différentient directement â partir de cellules somatiques du pucelle ou du tégument de l'ovule. I1 n'y a donc pas d'alternances des générations sporophytiques et 2o gamétophytiques. L'apomixie gamêtophytique, par contre, se caractérise par la formation d'un gamétophyte femelle non-réduit, et le développement parthénogénétique de l'embryon à partir de l'oosphère. Dans la suite du texte, toute référence à l'apomixie se rapportera à l'apomixie gamétophytique.
4 On observe deux grands types d'apomixie gamétophytique, qui diffèrent par l'origine du gamétophyte femelle. Chez les formes aposporiques, le sac embryonnaire non-réduit est dérivé d'une cellule somatique de l'ovule, généralement du nucelle. Chez les formes diplosporiques, il est issu d'une cellule générative, la cellule archésporiale. L'apoméiose recouvre à la fois aposporie et diplosporie. I1 existe en fait une grande diversité de processus conduisant à la io formation d'un gamétophyte non-réduit.
Chez les angiospermes sexués, le gamétophyte mâle (le grain de pollen) contient deux spermatozoides.
L'un féconde l'oosphère, donnant naissance à l'embryon, tandis que l'autre s'unit au noyau de la cellule centrale, à l'origine de l'albumen. L'embryon et l'albumen sont donc tous deux sexués. On parle de double fécondation, caractéristique propre des angiospermes.
Chez la majorité des plantes apomictiques, l'embryon se développe sans fécondation, mais l'albumen demeure sexué.
2o On parle de pseudogamie, ou apomixie pseudogame, lorsque la fécondation de la cellule centrale est nécessaire au développement de l'albumen, et d'apomixie autonome lorsqu'à la fois l'embryon et l'albumen se développent sans fécondation.
Au niveau embryonnaire, l'apomixie correspond donc bien à une reproduction asexuée par graine. Elle résulte d'une somme de composantes clairement identifiables: l'apoméiose, ou formation d'un sac embryonnaire sans réduction méiotique, et la parthénogenèse, ou formation d'un embryon sans fécondation de l'oosphère. Apoméiose et parthénogenèse assurent l'alternance des générations sporophytiques et
Chez les angiospermes sexués, le gamétophyte mâle (le grain de pollen) contient deux spermatozoides.
L'un féconde l'oosphère, donnant naissance à l'embryon, tandis que l'autre s'unit au noyau de la cellule centrale, à l'origine de l'albumen. L'embryon et l'albumen sont donc tous deux sexués. On parle de double fécondation, caractéristique propre des angiospermes.
Chez la majorité des plantes apomictiques, l'embryon se développe sans fécondation, mais l'albumen demeure sexué.
2o On parle de pseudogamie, ou apomixie pseudogame, lorsque la fécondation de la cellule centrale est nécessaire au développement de l'albumen, et d'apomixie autonome lorsqu'à la fois l'embryon et l'albumen se développent sans fécondation.
Au niveau embryonnaire, l'apomixie correspond donc bien à une reproduction asexuée par graine. Elle résulte d'une somme de composantes clairement identifiables: l'apoméiose, ou formation d'un sac embryonnaire sans réduction méiotique, et la parthénogenèse, ou formation d'un embryon sans fécondation de l'oosphère. Apoméiose et parthénogenèse assurent l'alternance des générations sporophytiques et
5 gamétophytiques, mais sans alternance des phases nucléaires: sporophyte et gamétophyte conservent le même niveau de ploidie.
Au niveau d'une plante, cependant, l'apomixie est en fait un mode de reproduction mixte, associant amphimixie et reproduction asexuée. En effet, l'apomixie est en règle gênérale un phënomène facultatif: il apparaît dans les descendances de plantes apomictiques des individus "hors-types", c'est-à-dire génétiquement différents de leur plante mère. Pour qu'il y ait développement apomictique au sens strict, il faut que les deux conditions de non-réduction et non-fécondation soient réunies. Des hors-types peuvent apparaître si l'une ou les deux conditions ne sont pas remplies. en fonction de la réalisation ou de l'êchec de la méiose et de la fécondation, les classes de descendances possibles chez une plante apomictique facultative sont les suivantes:
Fcondation Non-fcondation Miose n+n n+0 Apomiose 2n+n 2n+0
Au niveau d'une plante, cependant, l'apomixie est en fait un mode de reproduction mixte, associant amphimixie et reproduction asexuée. En effet, l'apomixie est en règle gênérale un phënomène facultatif: il apparaît dans les descendances de plantes apomictiques des individus "hors-types", c'est-à-dire génétiquement différents de leur plante mère. Pour qu'il y ait développement apomictique au sens strict, il faut que les deux conditions de non-réduction et non-fécondation soient réunies. Des hors-types peuvent apparaître si l'une ou les deux conditions ne sont pas remplies. en fonction de la réalisation ou de l'êchec de la méiose et de la fécondation, les classes de descendances possibles chez une plante apomictique facultative sont les suivantes:
Fcondation Non-fcondation Miose n+n n+0 Apomiose 2n+n 2n+0
6 Dans la définition des hybrides de type "n+n", ou "2n+n", etc...., le premier terme désigne l'état du gamétophyte, réduit (n) ou non réduit (2n). Le deuxiëme terme traduit la présence ou l'absence de fécondation de l'oosphère. La catégorie "2n+0" représente donc l'apomixie stricto sensu, et la catégorie "n+n"
l'amphimixie. La catégorie "2n+n" conduit à une accumulation génomique, et la catégorie "n+0" â
lo l'haploidisation de la plante mère. Les proportions respectives de ces différentes catégories sont variables d'une espèce â l'autre, et même d'une plante à l'autre au sein d'une espêce donnée. Dans la suite de la description, les références â l'apomixie concernent aussi bien les formes .apomictiques facultatives que les formes apomictiques obligatoires produisant exclusivement des descendances de type 2n+0.
Le déterminisme génétique de l'apomixie est encore très mal compris. On admet aujourd'hui que les 2o angiospermes à reproduction asexuée descendent d'ancêtres à reproduction sexuée, et que le passage d'une forme de reproduction à une autre relêve d'un déterminisme génétique. L'apomixie résulterait donc de l'expression de gènes ou d'allèles d'apomixie, c'est-à-dire présents et exprimés chez les plantes apomictiques, mais absents ou non fonctionnels chez les plantes sexuées.
l'amphimixie. La catégorie "2n+n" conduit à une accumulation génomique, et la catégorie "n+0" â
lo l'haploidisation de la plante mère. Les proportions respectives de ces différentes catégories sont variables d'une espèce â l'autre, et même d'une plante à l'autre au sein d'une espêce donnée. Dans la suite de la description, les références â l'apomixie concernent aussi bien les formes .apomictiques facultatives que les formes apomictiques obligatoires produisant exclusivement des descendances de type 2n+0.
Le déterminisme génétique de l'apomixie est encore très mal compris. On admet aujourd'hui que les 2o angiospermes à reproduction asexuée descendent d'ancêtres à reproduction sexuée, et que le passage d'une forme de reproduction à une autre relêve d'un déterminisme génétique. L'apomixie résulterait donc de l'expression de gènes ou d'allèles d'apomixie, c'est-à-dire présents et exprimés chez les plantes apomictiques, mais absents ou non fonctionnels chez les plantes sexuées.
7 La grande majorité des travaux sur le contrôle gênétique de l'apomixie concernent l'apoméiose, et plus fréquemment l'aposporie. I1 existe actuellement un consensus assez large sur le principe d'une hérëdité
mendêlienne de l'aposporie (voir références (1) et (2), les références bibliographiques étant données en fin de description). On dispose de peu de connaissances sur la diplosporie, mais les résultats existants (3, 4) montrent que l'hypothèse admise chez les plantes aposporiques est l0 sans doute applicable aux plantes diplosporiques. Dans ces différents modëles, le mode d'action des gènes concernés reste une énigme. Ces analyses tendent cependant â montrer que le gène responsable de l'apoméiose pourrait à lui seul déclencher l'ensemble du processus apomictique.
L' apomixie suscite un grand intérêt eu égard â
son potentiel pour l'amélioration des plantes.
L'utilisation de l'apomixie chez les principales plantes cultivées représenterait une manière simple de fixer l'hétérosis. I1 s'agit potentiellement d'une révolution quant à la manipulation des systèmes de reproduction.
De nombreux programmes ont vu le jour, dont l'objectif est de caractériser les "gènes d'apomixie", et de les introduire dans les plantes cultivées.
Les travaux les plus anciens, et probablement les plus avancés, utilisent des plantes naturellement
mendêlienne de l'aposporie (voir références (1) et (2), les références bibliographiques étant données en fin de description). On dispose de peu de connaissances sur la diplosporie, mais les résultats existants (3, 4) montrent que l'hypothèse admise chez les plantes aposporiques est l0 sans doute applicable aux plantes diplosporiques. Dans ces différents modëles, le mode d'action des gènes concernés reste une énigme. Ces analyses tendent cependant â montrer que le gène responsable de l'apoméiose pourrait à lui seul déclencher l'ensemble du processus apomictique.
L' apomixie suscite un grand intérêt eu égard â
son potentiel pour l'amélioration des plantes.
L'utilisation de l'apomixie chez les principales plantes cultivées représenterait une manière simple de fixer l'hétérosis. I1 s'agit potentiellement d'une révolution quant à la manipulation des systèmes de reproduction.
De nombreux programmes ont vu le jour, dont l'objectif est de caractériser les "gènes d'apomixie", et de les introduire dans les plantes cultivées.
Les travaux les plus anciens, et probablement les plus avancés, utilisent des plantes naturellement
8 apomictigues. Les allèles correspondants y sont présents, et fonctionnels. Leur transfert dans des espèces cultivées importantes peut se faire soit par l'intermédiaire de croisements interspécifiques entre une espèce cultivée et un apparenté apomictique, soit en isolant les gènes correspondants, pour les introduire ensuite dans l'espêce cible par transgénie ( (5) ; (6) ;
(7) et (8) ) .
Une autre approche, en développement rapide, l0 consiste à générer l'apomixie chez des espèces sexuées, par différentes mêthodes de mutagenèse. Arabidopsis thaliana est le modèle le plus utilisé ((9), (10) et (8)). Des travaux équivalents sont en cours chez le pétunia, Petunia hybrida (10), et Hieracium (8). Dans tous ces cas de figures, l'hypothèse fondamentale est qu'un contrôle génétique simple est en cause, et que le transfert, ou la modification d'un nombre três faible d'allêles fournit les conditions suffisantes à
l'expression de l'apomixie. On entend ici l'apomixie comme la résultante des évênements précédemment mentionnés: échec de la mêiose et parthénogenëse.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à rechercher chez le mais des gènes orthologues de celui ou ceux impliqués dans l'expression de l'apomixie chez les espëces du genre Tripsacum, genre apparenté au mais. Dans la description et les revendications, on entend, par "gènes orthologues", des gënes qui auraient divergé d' un gène commun, ou de gènes
(7) et (8) ) .
Une autre approche, en développement rapide, l0 consiste à générer l'apomixie chez des espèces sexuées, par différentes mêthodes de mutagenèse. Arabidopsis thaliana est le modèle le plus utilisé ((9), (10) et (8)). Des travaux équivalents sont en cours chez le pétunia, Petunia hybrida (10), et Hieracium (8). Dans tous ces cas de figures, l'hypothèse fondamentale est qu'un contrôle génétique simple est en cause, et que le transfert, ou la modification d'un nombre três faible d'allêles fournit les conditions suffisantes à
l'expression de l'apomixie. On entend ici l'apomixie comme la résultante des évênements précédemment mentionnés: échec de la mêiose et parthénogenëse.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à rechercher chez le mais des gènes orthologues de celui ou ceux impliqués dans l'expression de l'apomixie chez les espëces du genre Tripsacum, genre apparenté au mais. Dans la description et les revendications, on entend, par "gènes orthologues", des gënes qui auraient divergé d' un gène commun, ou de gènes
9 paralogues, en même temps que les espèces qui les portent. Les gènes visés ont les mêmes fonctions par rapport à l~apomixie.
Le genre Tripsacum appartient â la tribu des Andropogonées. C'est le seul apparenté connu du genre Zea sur le continent américain (4) et (11) ont réalisé
l'étude la plus complète des modes de reproduction chez Tripsacum. Ces travaux ont permis de préciser les points suivants:
- toutes les accessions polyploides se reproduisent par apomixie diplosporique, - la non-réduction chez les formes apomictiques est principalement de type .Antennaria, avec occurrence rare de type Taraxacum, - les sacs embryonnaires chez les formes diplosporiques sont issus directement des mégasporocytes par 3 mitoses successives, - l'échec de la méiose chez les formes diplosporiques est associé à l'absence de dépôts de callose autour des mégasporocytes, - l'analyse d'une population F1 entre maïs et une forme diplosporique de Tripsacum indique une hérédité
simple de l'apoméiose, - différents allèles détectés par des sondes moléculaires de maïs ont étê cartographiés à proximité du locus responsable de l'apoméiose ; il s'agit des sondes umc28, csu68, et umc62, - ces sondes permettent d'établir une relation partielle d'homologie entre le chromosome responsable de 5 1'apoméiose chez Tripsacum et la partie distale du bras long du chromosome 6 chez le maïs.
Les travaux des inventeurs les ont conduits à
proposer et à montrer que les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum possèdent un ou plusieurs gènes
Le genre Tripsacum appartient â la tribu des Andropogonées. C'est le seul apparenté connu du genre Zea sur le continent américain (4) et (11) ont réalisé
l'étude la plus complète des modes de reproduction chez Tripsacum. Ces travaux ont permis de préciser les points suivants:
- toutes les accessions polyploides se reproduisent par apomixie diplosporique, - la non-réduction chez les formes apomictiques est principalement de type .Antennaria, avec occurrence rare de type Taraxacum, - les sacs embryonnaires chez les formes diplosporiques sont issus directement des mégasporocytes par 3 mitoses successives, - l'échec de la méiose chez les formes diplosporiques est associé à l'absence de dépôts de callose autour des mégasporocytes, - l'analyse d'une population F1 entre maïs et une forme diplosporique de Tripsacum indique une hérédité
simple de l'apoméiose, - différents allèles détectés par des sondes moléculaires de maïs ont étê cartographiés à proximité du locus responsable de l'apoméiose ; il s'agit des sondes umc28, csu68, et umc62, - ces sondes permettent d'établir une relation partielle d'homologie entre le chromosome responsable de 5 1'apoméiose chez Tripsacum et la partie distale du bras long du chromosome 6 chez le maïs.
Les travaux des inventeurs les ont conduits à
proposer et à montrer que les gènes responsables de l'apomixie chez Tripsacum possèdent un ou plusieurs gènes
10 orthologues dans le génome des graminées sexuëes, en particulier dans le génome du maïs. Cette approche a permis de développer une stratégie générale conduisant â
identifier, puis cloner des sêquences nucléotidiques responsables de l'apomixie, et de mettre au point de nouveaux outils pour sa réalisation.
L'invention a donc 'pour but de fournir un procédé pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, un gène orthologue d'un gène impliqué dans l'apomixie.
2o Elle a également pour but de fournir un procëdé
d'isolement de la séquence de ce gène.
L'invention vise en outre l'utilisation de cette séquence pour isoler les séquences de gênes orthologues correspondantes chez des plantes apomictiques et les applications de ces sëquences en transgénèse.
Elle a en outre pour but un procédé permettant de confirmer la relation fonctionnelle entre les WO 98/36090 PCT/F'R98/00308
identifier, puis cloner des sêquences nucléotidiques responsables de l'apomixie, et de mettre au point de nouveaux outils pour sa réalisation.
L'invention a donc 'pour but de fournir un procédé pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, un gène orthologue d'un gène impliqué dans l'apomixie.
2o Elle a également pour but de fournir un procëdé
d'isolement de la séquence de ce gène.
L'invention vise en outre l'utilisation de cette séquence pour isoler les séquences de gênes orthologues correspondantes chez des plantes apomictiques et les applications de ces sëquences en transgénèse.
Elle a en outre pour but un procédé permettant de confirmer la relation fonctionnelle entre les WO 98/36090 PCT/F'R98/00308
11 séquences isolées chez des plantes apomictiques et l'expression phénotypique de l'apomixie.
Le procêdé selon l'invention, pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, une séquence de nucléotides orthologue de séquence responsable de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique, est caractérisé
en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations possédant une expression phénotypique proche ou similaire â celle observée chez une forme apomictique, pour identifier celles de ces mutations qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
On identifie ici un phénotype apparenté sur la base de quatre caractéristiques des formes diplosporiques, qui peuvent être observées soit indépendamment, soit en conjonction: (a) les mutations sont spécifiques de la mégasporogenèse et n'affectent pas la fonction reproductive mâle, (b) elles conduisent à la formation de gamètes non-réduits â partir d'une cellule archésporiale, (c) elles se caractérisent par l'absence de dépôts de callose autour des cellules mère de la mégaspore, (d) les points de contrôle qui agissent normalement lors de la formation du sac embryonnaire semblent inactifs, et les sacs embryonnaires sont
Le procêdé selon l'invention, pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, une séquence de nucléotides orthologue de séquence responsable de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique, est caractérisé
en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations possédant une expression phénotypique proche ou similaire â celle observée chez une forme apomictique, pour identifier celles de ces mutations qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
On identifie ici un phénotype apparenté sur la base de quatre caractéristiques des formes diplosporiques, qui peuvent être observées soit indépendamment, soit en conjonction: (a) les mutations sont spécifiques de la mégasporogenèse et n'affectent pas la fonction reproductive mâle, (b) elles conduisent à la formation de gamètes non-réduits â partir d'une cellule archésporiale, (c) elles se caractérisent par l'absence de dépôts de callose autour des cellules mère de la mégaspore, (d) les points de contrôle qui agissent normalement lors de la formation du sac embryonnaire semblent inactifs, et les sacs embryonnaires sont
12 normalement formés malgré l'échec d'une étape au cours de la mégasporogenèse.
La référence dans le procédé dêfini ci-dessus à
l'identification de séquences de nucléotides englobe l'identification de loci ou de gènes dans un mode de mise en oeuvre du procédê de l'invention, ou cartographie dans le gênome de la graminêe, plus spécialement celui d'un mais, des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l0 l'apomixie.
L'invention vise notamment un procédé
d'identification chez une graminée, plus spécialement chez un mais, d'une séquence de gênes orthologues de celle du gène contrôlant l'apoméiose chez les formes apomictiques, caractérisê en ce qu'on étudie l'expression phénotypique et qu'on localise la position de différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de l'apoméiose chez ladite forme apomictique.
D'une manière générale, les mutations localisées selon l'invention sont clonées et séquencées.
Les inventeurs ont mis en particuïier en évidence que les gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie chez Tripsacurn possêdent un ou plusieurs orthologues dans le génome du mais.
La référence dans le procédé dêfini ci-dessus à
l'identification de séquences de nucléotides englobe l'identification de loci ou de gènes dans un mode de mise en oeuvre du procédê de l'invention, ou cartographie dans le gênome de la graminêe, plus spécialement celui d'un mais, des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l0 l'apomixie.
L'invention vise notamment un procédé
d'identification chez une graminée, plus spécialement chez un mais, d'une séquence de gênes orthologues de celle du gène contrôlant l'apoméiose chez les formes apomictiques, caractérisê en ce qu'on étudie l'expression phénotypique et qu'on localise la position de différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de l'apoméiose chez ladite forme apomictique.
D'une manière générale, les mutations localisées selon l'invention sont clonées et séquencées.
Les inventeurs ont mis en particuïier en évidence que les gènes impliqués dans l'expression de l'apomixie chez Tripsacurn possêdent un ou plusieurs orthologues dans le génome du mais.
13 L'utilisation selon l'invention d'un même jeu de marqueurs chez mais et Tripsacum, a permis d'identifier des gènes candidats présentant à la fois (1) la même localisation génomique que les gènes contrôlant la diplosporie, en ce sens qu'ils sont situés dans la même région chromosomique d'un segment qui, chez le maïs, est homéologue de celui contrôlant la diplosporie chez Tripsacum, et (2) un phénotype apparenté, fonction de critères précédemment mentionnés. De manière préférée, la lo localisation concerne les loti elongate et afd dans le génome du mais.
Le procêdê de l'invention est encore caractérisé en ce qu'il comprend l'étiquetage à l'aide de transposons des mutations méiotiques localisées.
L'invention vise en particulier l'étiquetage à l'aide de transposons du locus elongate.
L'utilisation de transposons dont on connaît la séquence permet de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion du transposon dans le gêne que l'on cherche à isoler se caractêrise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d'allèle recessifs, elle se caractérise fréquement par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétêrozygotes. Des transposons particulièrement intêressants comprennent les éléments transposables des type Mutator, ou Ac/Ds.
Le procêdê de l'invention est encore caractérisé en ce qu'il comprend l'étiquetage à l'aide de transposons des mutations méiotiques localisées.
L'invention vise en particulier l'étiquetage à l'aide de transposons du locus elongate.
L'utilisation de transposons dont on connaît la séquence permet de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion du transposon dans le gêne que l'on cherche à isoler se caractêrise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d'allèle recessifs, elle se caractérise fréquement par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétêrozygotes. Des transposons particulièrement intêressants comprennent les éléments transposables des type Mutator, ou Ac/Ds.
14 On procède avantageusement au clonage et séquençage des mutations localisées.
Ainsi, un gène muté peut être isolé en repérant le site d'insertion du transposon, les différents loci où
ont été insérés des transposons étant clonés par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire (12) et (13), et sêquencés si on le souhaite.
Dans le cas par exemple du site correspondant l0 plus particulièrement au locus elongate, on caractérise tout d'abord phénotypiquement le site pour l'expression de l'allèle e11. I1 est ensuite localisé par cartographie génétique, et sa position comparée â celle des loci contrôlant la diplosporie chez Tripsacum. Les loci sont ensuite marqués par l'intermédiaire de transposons, isolés, puis séquencés.
L'invention vise également l'utilisation d'au moins une partie d'une séquence telle que définie ci-dessus pour identifier, puis isoler, la séquence des gënes orthologues chez des formes apomictiques.
L'invention vise, en tant que telles, les séquences nucléotidiques isolées. Ces séquences sont caractérisêes en ce qu'elles sont orthologues de séquences responsables de tout ou partie du développement chez une forme apomictique. L'invention comprend également les sêquences homologues, en termes de fonction, de celles identifiées ci-dessus.
L'invention vise notamment une séquence de nucléotides de ce type correspondant au gène muté
d'elongate.
Les acides nucléiques contenant une ou 5 plusieurs séquences telles que définies ci-dessus associées à des séquences régulatrices nécessaires à
l'expression dans le matériel végétal font également partie de l'invention.
L'invention comprend ëgalement les vecteurs de l0 clonage et d'expression comportant de tels acides nucléiques ainsi que les hôtes cellulaires contenant ces vecteurs, par exemple Agrobacterium tumefaciens.
L'invention vise également l'utilisation de telles séquences, le cas échéant en conjonction avec
Ainsi, un gène muté peut être isolé en repérant le site d'insertion du transposon, les différents loci où
ont été insérés des transposons étant clonés par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire (12) et (13), et sêquencés si on le souhaite.
Dans le cas par exemple du site correspondant l0 plus particulièrement au locus elongate, on caractérise tout d'abord phénotypiquement le site pour l'expression de l'allèle e11. I1 est ensuite localisé par cartographie génétique, et sa position comparée â celle des loci contrôlant la diplosporie chez Tripsacum. Les loci sont ensuite marqués par l'intermédiaire de transposons, isolés, puis séquencés.
L'invention vise également l'utilisation d'au moins une partie d'une séquence telle que définie ci-dessus pour identifier, puis isoler, la séquence des gënes orthologues chez des formes apomictiques.
L'invention vise, en tant que telles, les séquences nucléotidiques isolées. Ces séquences sont caractérisêes en ce qu'elles sont orthologues de séquences responsables de tout ou partie du développement chez une forme apomictique. L'invention comprend également les sêquences homologues, en termes de fonction, de celles identifiées ci-dessus.
L'invention vise notamment une séquence de nucléotides de ce type correspondant au gène muté
d'elongate.
Les acides nucléiques contenant une ou 5 plusieurs séquences telles que définies ci-dessus associées à des séquences régulatrices nécessaires à
l'expression dans le matériel végétal font également partie de l'invention.
L'invention comprend ëgalement les vecteurs de l0 clonage et d'expression comportant de tels acides nucléiques ainsi que les hôtes cellulaires contenant ces vecteurs, par exemple Agrobacterium tumefaciens.
L'invention vise également l'utilisation de telles séquences, le cas échéant en conjonction avec
15 d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques, pour transformer le génome d'un matériel végétal, cellules végétales, plantes, à divers stades de développement, et graines, afin de leur conférer un développement apomictique. Les dits allèles correspondent à des gènes autres que les gènes orthologues visés par l'invention.
L'invention concerne notamment un procédé de production de plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence du gène muté d'elongate telle que dêfinie ci-dessus.
L'invention concerne notamment un procédé de production de plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence du gène muté d'elongate telle que dêfinie ci-dessus.
16 Ce matériel végétal transformé, en tant que tel, entre dans le champ de l'invention et est caractérisé par le fait qu'il renferme dans son génome au moins la partie de ladite séquence impliquée dans un développement apomictique, le cas échéant en conjonction avec d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques.
Les cellules, plantes et graines visées appartiennent à la famille des graminées. I1 s'agit en particulier de mais.
La transformation du matériel vëgêtal, cellules, plantes et graines, est obtenue en opérant avantageusement selon les techniques classiques de transgénie.
A titre d'exemple, pour l'obtention de plantes de maïs transgéniques.
A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du mais, quelle que soit la méthode employée (électroporation; Agrobacteriurn, microfibres, canon â particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservê une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de mais.
Les cellules, plantes et graines visées appartiennent à la famille des graminées. I1 s'agit en particulier de mais.
La transformation du matériel vëgêtal, cellules, plantes et graines, est obtenue en opérant avantageusement selon les techniques classiques de transgénie.
A titre d'exemple, pour l'obtention de plantes de maïs transgéniques.
A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du mais, quelle que soit la méthode employée (électroporation; Agrobacteriurn, microfibres, canon â particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservê une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de mais.
17 Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hl II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (1994). Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénêrées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofêcondées.
H. Utilisation du canon à particules pour la transformation géaétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nêcessaires â la transformation ; on décrit ici une mëthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante.
Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à
particules ; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mmz ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de
Des plantules sont ensuite régénêrées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofêcondées.
H. Utilisation du canon à particules pour la transformation géaétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nêcessaires â la transformation ; on décrit ici une mëthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante.
Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à
particules ; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mmz ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de
18 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gênes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein et al, Nature, 1987, 327, pages 70-73. Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles â l'aide du canon et selon le protocole dëcrit par J. Finer (1992).
l0 Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées â l'aide de Scellofrais ~, puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta°, Round up~,) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine...).
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, 2o des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisês, amplifiés puis cultivés de façon à régénêrer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non WO 98/36090 PCT/F'R98/00308
l0 Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées â l'aide de Scellofrais ~, puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta°, Round up~,) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine...).
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, 2o des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisês, amplifiés puis cultivés de façon à régénêrer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non WO 98/36090 PCT/F'R98/00308
19 transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisêes ou autofécondées.
C. ütilisation d'Agrobacterium tumefaciens pour la transformation gênétique du maïs.
La technique utilisée est celle décrite par Ishida et al. (Nature Biotechnology, 1996, 14 . 745-750) ou par Horsch et al., Science, 1984, 223, pages 496-498.
L'invention fournit ainsi des moyens pour disposer d'une population de plantes apomictiques et possëdant des éléments transposables actifs.
En particulier, elle fournit les moyens pour induire un développement apomictique chez une plante sexuée et notamment chez le maïs.
Dans une autre application selon l'invention, on utilise au moins une partie d'une séquence telle que définie ci-dessus, pour identifier et isoler la séquence du locus orthologue chez des formes apomictiques.
Les sondes d'hybridation élaborées â partir desdites séquences, ainsi que les amorces utilisables dans les techniques PCR, font donc partie de l'invention.
De telles sondes et amorces correspondent notamment à celles élaborées à partir de la séquence d'elongate.
Les techniques d'hybridation ou de PCR sont 5 avantageusement réalisées selon les méthodes classiques.
L'invention vise également un procédé
d'identification et d'isolement d'un gène responsable de la diplosporie chez les Tripsacum apomictiques, caractêrisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la 10 séquence du locus elongate.
Le procédé de l'invention est encore caractérisé en ce qu'on utilise la sêquence isolée chez les Tripsacum apomictiques pour l'analyse fonctionnelle de la relation entre cette séquence et l'expression de 15 l'apomixie. On~ utilise en particulier un procédé de mutagénëse, comme illustrê dans les exemples, permettant de confirmer la relation entre la séquence isolée chez les Tripsacum apomictiques â partir de la séquence du gëne elongate et l'expression phénotypique de l'apomixie.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisêes ou autofécondées.
C. ütilisation d'Agrobacterium tumefaciens pour la transformation gênétique du maïs.
La technique utilisée est celle décrite par Ishida et al. (Nature Biotechnology, 1996, 14 . 745-750) ou par Horsch et al., Science, 1984, 223, pages 496-498.
L'invention fournit ainsi des moyens pour disposer d'une population de plantes apomictiques et possëdant des éléments transposables actifs.
En particulier, elle fournit les moyens pour induire un développement apomictique chez une plante sexuée et notamment chez le maïs.
Dans une autre application selon l'invention, on utilise au moins une partie d'une séquence telle que définie ci-dessus, pour identifier et isoler la séquence du locus orthologue chez des formes apomictiques.
Les sondes d'hybridation élaborées â partir desdites séquences, ainsi que les amorces utilisables dans les techniques PCR, font donc partie de l'invention.
De telles sondes et amorces correspondent notamment à celles élaborées à partir de la séquence d'elongate.
Les techniques d'hybridation ou de PCR sont 5 avantageusement réalisées selon les méthodes classiques.
L'invention vise également un procédé
d'identification et d'isolement d'un gène responsable de la diplosporie chez les Tripsacum apomictiques, caractêrisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la 10 séquence du locus elongate.
Le procédé de l'invention est encore caractérisé en ce qu'on utilise la sêquence isolée chez les Tripsacum apomictiques pour l'analyse fonctionnelle de la relation entre cette séquence et l'expression de 15 l'apomixie. On~ utilise en particulier un procédé de mutagénëse, comme illustrê dans les exemples, permettant de confirmer la relation entre la séquence isolée chez les Tripsacum apomictiques â partir de la séquence du gëne elongate et l'expression phénotypique de l'apomixie.
20 Selon l'invention, on confirme en particulier la relation entre ladite séquence et l'expression de l'apoméiose.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à
5, qui représentent respectivement .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à
5, qui représentent respectivement .
21 - la figure 1, la cartographie génêtique du segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez un Tripsacum tétraploïde apomictique, et la comparaison avec des plantes diploïdes sexuées chez Tripsacum et le mais, - la figure 2, la construction d'une population de cartographie pour la mutation e11, (elongate), - la figure 3, la construction d'une population de mutagenèse pour le marquage du locus elongate, - la figure 4, la caractérisation phénotypique l0 des mégasporocytes chez des plantes homozygotes pour l'allèle e11 et des plantes de mais possëdant l'allèle sauvage au locus elongate, et la comparaison avec des formes sexuées et apomictiques chez Tripsacum.
la figure 5, la construction d'une population de mutagenêse chez des hybrides mais-Tripsacum, permettant l'analyse fonctionnelle de la relation entre la séquence isolée chez les plantes apomictiques et l'expression de l'apomixie.
Exemple 1 Cartographie génétique de l'apoméiose chez Tripsacum On rapporte ci-aprës la rêalisation d'une carte génétique du segment de chromosome contrôlant l'apoméiose chez des formes apomictiques et sexuêes du genre Tripsacum.
1) Matériels
la figure 5, la construction d'une population de mutagenêse chez des hybrides mais-Tripsacum, permettant l'analyse fonctionnelle de la relation entre la séquence isolée chez les plantes apomictiques et l'expression de l'apomixie.
Exemple 1 Cartographie génétique de l'apoméiose chez Tripsacum On rapporte ci-aprës la rêalisation d'une carte génétique du segment de chromosome contrôlant l'apoméiose chez des formes apomictiques et sexuêes du genre Tripsacum.
1) Matériels
22 - Cartographie des Tripsacum diploïdes: les deux parents utilisés sont des plantes diploïdes sexuées (2n=36) de la collection ORSTOM-CIMMYT, maintenue sur la station expérimentale de Tlaltizapan, Etat de Morelos, au Mexique. I1 s'agit d'un Tripsacum maizar Hern. and Randolph, accession CIMMYT #99-1114 et d'un Tripsacum dactyloides var. meridionale de Wet and Timothy, accession CIMMYT #575-5136. La population comprend 175 plantes F1, parmi lesquelles 56 ont étê utilisëes pour la cartographie.
- Cartographie de l'apoméiose: la population de cartographie comprend 232 plantes F1 maïs-Tripsacum. Le parent maïs (H1) est un hybride de maïs (2n=2x=20) entre deux lignées CIMMYT (CML 135 par CML 139). L'autre est un Tripsacum dactyloides tétraploide et apomictique (2n=4x=72), accession CIMMYT #65-1234. La plante apomictique a êté utilisée comme mâle.
2) Méthodes Analyse des modes de reproduction . Elle est effectuée d'après Leblanc et al. {4) . Détection de marqueurs molêculaires de type RFLP liês à
l'apoméiose:
La stratêgie suivie correspond globalement â
celle décrite par Michelmore et al. (14) pour la détection de marqueurs moléculaires liés à une réponse phénotypique déterminée.
- Cartographie de l'apoméiose: la population de cartographie comprend 232 plantes F1 maïs-Tripsacum. Le parent maïs (H1) est un hybride de maïs (2n=2x=20) entre deux lignées CIMMYT (CML 135 par CML 139). L'autre est un Tripsacum dactyloides tétraploide et apomictique (2n=4x=72), accession CIMMYT #65-1234. La plante apomictique a êté utilisée comme mâle.
2) Méthodes Analyse des modes de reproduction . Elle est effectuée d'après Leblanc et al. {4) . Détection de marqueurs molêculaires de type RFLP liês à
l'apoméiose:
La stratêgie suivie correspond globalement â
celle décrite par Michelmore et al. (14) pour la détection de marqueurs moléculaires liés à une réponse phénotypique déterminée.
23 Les sondes ont été obtenues auprès de l'Université de Missouri, Columbia.
Une centaine de sondes RFLP ont été choisies sur les cartes génétiques existantes pour le maïs, pour obtenir une densité d'environ 20-30 cM entre deux marqueurs (voir (4), annexe 4). Différentes cartes de référence ont été utilisées . la carte UMC (University of Missouri Colombia ; Maize DataBase, carte UMC95), une carte de l'Université de Cornell (15) et diffêrentes cartes produites au CIMMYT ( 16 ) . Un test de chi2 a été
utilisë pour détecter les liaisons potentielles, et les taux de recombinaisons ont été évalués d'après Allard (17). Le parent donneur du segment contrôlant l'apoméiose étant une plante tétraploîde hétérozygote, trois conditions sont nécessaires à la détection d' une liaison entre la diplosporie et un allèle RFLP . (1) existence d'un polymorphisme RFLP entre les deux parents à ce locus, (2) hétérozygotie pour cet allèle chez Tripsacum, (3) l'allèle doit être simplex chez le tétraploide, c'est-à-dire différenciable des 3 autres.
- Cartographie des diploïdes On a utilisé une population de cartographie F1 entre deux parents hétérozygotes appartenant à deux espèces distinctes. Les méthodes de cartographie sont telles que dëcrites par Ritter et al (18).
Une centaine de sondes RFLP ont été choisies sur les cartes génétiques existantes pour le maïs, pour obtenir une densité d'environ 20-30 cM entre deux marqueurs (voir (4), annexe 4). Différentes cartes de référence ont été utilisées . la carte UMC (University of Missouri Colombia ; Maize DataBase, carte UMC95), une carte de l'Université de Cornell (15) et diffêrentes cartes produites au CIMMYT ( 16 ) . Un test de chi2 a été
utilisë pour détecter les liaisons potentielles, et les taux de recombinaisons ont été évalués d'après Allard (17). Le parent donneur du segment contrôlant l'apoméiose étant une plante tétraploîde hétérozygote, trois conditions sont nécessaires à la détection d' une liaison entre la diplosporie et un allèle RFLP . (1) existence d'un polymorphisme RFLP entre les deux parents à ce locus, (2) hétérozygotie pour cet allèle chez Tripsacum, (3) l'allèle doit être simplex chez le tétraploide, c'est-à-dire différenciable des 3 autres.
- Cartographie des diploïdes On a utilisé une population de cartographie F1 entre deux parents hétérozygotes appartenant à deux espèces distinctes. Les méthodes de cartographie sont telles que dëcrites par Ritter et al (18).
24 3) Résultats - Identification de marqueurs RFLP liés à
l'apoméiose La figure 1 représente la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant l'apoméiose, et la comparaison avec les plantes diploides sexuées chez Tripsacum et le mais. "Apo" correspond au locus responsable de l'apoméiose. La position d'umc71 sur l0 le chromosome 6 du maïs est indiquêe de maniêre approximative, l'allèle sur le chromosome 6 ayant été
retiré des dernières versions de la carte U'MC. La carte a été développée à partir de 52 plantes de la population F1 entre maïs et Tripsacum. Dans cette population, méiose et diplosporie sont en ségrégation 1:1 (24 plantes apomictiques contre 28 plantes sexuées, chi2= 0,31, P=0,6). Quatre-vingt quatre sondes, sélectionnées sur la carte UMC pour couvrir aussi largement que possible le gênome du maïs, ont été testées. 90% d'entre elles détectent au moins un polymorphisme entre maïs et Tripsacum. Trois sondes, présentant un allèle polymorphe et spécifique du bulk apomictique, ont étê testées sur l'ensemble de la population F1. Un allèle, détecté par la sonde umc28, s'est avérê lié à l'apoméiose. Dans une deuxième étape, quatorze sondes proches du locus umc28 sur la carte UMC ont été testêes. Quatre d'entre elles, umc7l, umc62, csu68, et cdo202, détectent des allèles RFLP qui sont à la fois liés â la diplosporie, et en complète co-ségrégation entre eux.
- Cartographie comparée entre diploides sexués et tétraploïdes apomictiques 5 Les cinq marqueurs liés â la diplosporie ont été cartographiés sur la population diploide. Tous ont pu l'être sur un même parent (575-5136). On remarque que les cinq marqueurs sont tous strictement liés chez la plante tétraploïde, mais sont séparés par des taux de 10 recombinaison importants à la fois chez le parent diploïde et le maïs.
- Cartographie comparée mais-Tripsacum:
Les sondes détectant des allèles liés au segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez 15 Tripsacum détectent toutes des allèles appartenant au même groupe de liaison sur la carte du maïs. Il s'agit du bras long du chromosome 6. Certaines d'entre elles détectent aussi des allêles dans d'autres régions du gênome, en particulier les chromosomes 3 et 8. Les 20 localisations sur la carte maïs des différentes sondes liées à l'apoméiose sont données dans le tableau suivant:
Clones Localisation UMC38* 6L; 8L; 3L
UMC71 6L; 8L
CSU68 6L; 8L; 3L
CD0202 6L; 8L, 3L
*: non liée à la diplosporie, mais appartient au même groupe de liaison.
Exemple 2 . Identification de gènes orthologues chez le maïs On a recherché chez le mais, les gènes qui conduisent chez Tripsacum à l'expression de l'apomêiose.
On a donc cherché à identifier chez le maïs des gënes candidats présentant à la fois (1) la même localisation gênomique que l'apoméiose et (2) un phénotype apparenté â
l'apoméiose.
Il existe de très nombreux mutants de méiose chez le mais. Les critères phénotypiques retenus dans le choix des gènes candidats ont étê les suivants . (1) la présence de cellules archésporiales clairement différenciées (2) l'absence totale d'induction de la méiose chez ces cellules, ou l'êchec de celle-ci à un stade précoce (3) la capacité à produire un gamétophyte fonctionnel indépendamment de l'êchec de la méiose, (4) l'absence ou pour le moins une baisse très marquée des dépôts de callose autour de la cellule mëre de la mégaspore. Parmi les candidats potentiels, c'est à dire présentant tout ou partie des caractéristiques précédemment citées, ceux dont la position dans le génome du maïs était inconnue ou imprécise ont été
cartographiées en utilisant comme loci de références ceux détectês par Ies sondes utilisées pour la cartographié de l'apoméiose chez Tripsacum.
- Matériels et Mëthodes Les travaux dont les résultats sont rapportés ci-après ont été réalisés sur elongate (ell), qui est un mutant de méiose récessif (19). Chez les plantes homozygotes pour le locus e11, les chromosomes restent dêcondensés durant la métaphase et l'anaphase de première division, entraînant diverses anomalies chromosomiques dont une proportion importante de gamétophytes non rêduits (de 30 à 70 %, fonction entre autres du fond génétique dans lequel on place la mutation). La fécondation par le pollen d'une plante normale conduit à
un embryon triploïde, et à un albumen pentaploïde déficient.
La localisation précise du locus elongate était inconnue jusqu'à l'invention. On savait cependant qu'il appartenait au bras long du chromosome 8 du mais. I1 n'était donc pas localisé directement sur le bras de chromosome de maïs identifié par Leblanc et al. comme homéologue de celui contrôlant l'apoméiose. Localisë sur le chromosome 8, il appartient cependant potentiellement â un segment qui se trouve être dupliqué entre la partie distale du bras long du chromosome 6 et certaines parties du chromosome 8 (15).
La figure 2 décrit la construction d'une population de cartographie pour la mutation e11 (elongate). Trois plantes F1 de génotype hétérozygote E1I/e11 ont été rétrocroisêes sur trois plantes homozygotes e11/ell. Pour chaque famille, 50 plantes plantes ont été mises au champ, autofëcondées, et évaluées pour leur phénotype. Les graines E11/e11 sont attendues normales, les graines ell/e11 présentant un albumen malformé. Afin de confirmer les phénotypes elongate, dix à vingt embryons â l'intérieur des graines présentant un albumen déficient ont été prélevês, et analysés en cytométrie de flux en utilisant le protocole proposé par Galbraiht et al (20) . La mutation e11 a été
obtenue auprès du Maize Genetic Stock Center, Urbana, Illinois, sous la forme de graines issues de l'autofécondation de plantes homozygotes pour l'allèle e1I dans un fond genétique par ailleurs indéterminé. On a utilisë la lignée homozygote de phénotype sauvage, W23, pour la construction de la population. La détection de liaison et l'estimation des taux de recombinaison ont étê
obtenues à l'aide du logiciel Mapmaker 2.0, pour machintosh.
- Comparaison de l'expression phénotypique des plantes apoméiotiques et elongate L'expression phénotypique de la mutation elongate dans les cellules archésporiales de plantes homozygotes e11/e11 a été analysée par des techniques de cytoembryologie précédemment décrites par Leblanc et al.
(11) . Des inflorescences immatures ont êtê récoltées sur quatre types de matêriels: (1) des Tripsacum diploïdes sexués, (2) des Tripsacum tétraploides apomictiques, accessions décrites dans Leblanc et al (11), (3) une lignée de maïs homozygote Ell/E11 de phénotype sauvage (W23), et (4) une lignée homozygote ell/ell.
Étiquetage et isolement de la séquence du locus elongate à l'aide d'éléments transposables.
L'étiquetage par transposon consiste à utiliser des transposons dont on connaît la séquence afin de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion du transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractêrise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d'allèle recessifs, elle se caractérise frêquemment par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétérozygotes. Le gène muté peut ensuite être lui-même cloné en repérant le site d'insertion du transposon. Le gène muté peut alors être lui-même isolé en repërant le site d'insertion du transposon, les différents loci oü
WO 98/36090 PCT/F'R98/00308 ont été insêrés des transposons étant clonés par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire. Les expériences ci-aprës ont étë
réalisées avec le système Mutator (21).
5 La population utilisée pour l'étiquetage du locus elongate à l'aide de transposons est schëmatisée sur la figure 3 (f : fréquence d' apparition; (EL] et [el]
phënotypes dominant et récessif ; E1* . allèle marqué.
Les plantes homozygotes pour la mutation récessive sont lo croisées sur des plantes homozygotes pour l'allèle sauvage, E11. Dans la population de gamêtes produite par la parent EL1/E11, on retrouve une ou plusieurs mutations au locus elongate. Lorsque l'insertion conduit â la perte de la fonction de cet allële, on retrouve alors quelques 15 plantes F1 de génotype ell/E11, mais de phénotype ell. Le gêne est alors marquê.
Résultats:
- Cartographie du locus elongate:
Dans les populations en ségrégation, les 20 phénotypes e11 et E11 ségrègent en proportions 1:1 (Chi2=
0.5 ; P=0.6). Différentes sondes RFLP appartenant aux chromosomes 3, 6, et majoritairement 8 ont étê testées avec trois enzymes de restriction, EcoRl, BamHl, et HindIII, sur 50 plantes de la population. Les sondes
l'apoméiose La figure 1 représente la cartographie génétique du segment chromosomique contrôlant l'apoméiose, et la comparaison avec les plantes diploides sexuées chez Tripsacum et le mais. "Apo" correspond au locus responsable de l'apoméiose. La position d'umc71 sur l0 le chromosome 6 du maïs est indiquêe de maniêre approximative, l'allèle sur le chromosome 6 ayant été
retiré des dernières versions de la carte U'MC. La carte a été développée à partir de 52 plantes de la population F1 entre maïs et Tripsacum. Dans cette population, méiose et diplosporie sont en ségrégation 1:1 (24 plantes apomictiques contre 28 plantes sexuées, chi2= 0,31, P=0,6). Quatre-vingt quatre sondes, sélectionnées sur la carte UMC pour couvrir aussi largement que possible le gênome du maïs, ont été testées. 90% d'entre elles détectent au moins un polymorphisme entre maïs et Tripsacum. Trois sondes, présentant un allèle polymorphe et spécifique du bulk apomictique, ont étê testées sur l'ensemble de la population F1. Un allèle, détecté par la sonde umc28, s'est avérê lié à l'apoméiose. Dans une deuxième étape, quatorze sondes proches du locus umc28 sur la carte UMC ont été testêes. Quatre d'entre elles, umc7l, umc62, csu68, et cdo202, détectent des allèles RFLP qui sont à la fois liés â la diplosporie, et en complète co-ségrégation entre eux.
- Cartographie comparée entre diploides sexués et tétraploïdes apomictiques 5 Les cinq marqueurs liés â la diplosporie ont été cartographiés sur la population diploide. Tous ont pu l'être sur un même parent (575-5136). On remarque que les cinq marqueurs sont tous strictement liés chez la plante tétraploïde, mais sont séparés par des taux de 10 recombinaison importants à la fois chez le parent diploïde et le maïs.
- Cartographie comparée mais-Tripsacum:
Les sondes détectant des allèles liés au segment chromosomique contrôlant la diplosporie chez 15 Tripsacum détectent toutes des allèles appartenant au même groupe de liaison sur la carte du maïs. Il s'agit du bras long du chromosome 6. Certaines d'entre elles détectent aussi des allêles dans d'autres régions du gênome, en particulier les chromosomes 3 et 8. Les 20 localisations sur la carte maïs des différentes sondes liées à l'apoméiose sont données dans le tableau suivant:
Clones Localisation UMC38* 6L; 8L; 3L
UMC71 6L; 8L
CSU68 6L; 8L; 3L
CD0202 6L; 8L, 3L
*: non liée à la diplosporie, mais appartient au même groupe de liaison.
Exemple 2 . Identification de gènes orthologues chez le maïs On a recherché chez le mais, les gènes qui conduisent chez Tripsacum à l'expression de l'apomêiose.
On a donc cherché à identifier chez le maïs des gënes candidats présentant à la fois (1) la même localisation gênomique que l'apoméiose et (2) un phénotype apparenté â
l'apoméiose.
Il existe de très nombreux mutants de méiose chez le mais. Les critères phénotypiques retenus dans le choix des gènes candidats ont étê les suivants . (1) la présence de cellules archésporiales clairement différenciées (2) l'absence totale d'induction de la méiose chez ces cellules, ou l'êchec de celle-ci à un stade précoce (3) la capacité à produire un gamétophyte fonctionnel indépendamment de l'êchec de la méiose, (4) l'absence ou pour le moins une baisse très marquée des dépôts de callose autour de la cellule mëre de la mégaspore. Parmi les candidats potentiels, c'est à dire présentant tout ou partie des caractéristiques précédemment citées, ceux dont la position dans le génome du maïs était inconnue ou imprécise ont été
cartographiées en utilisant comme loci de références ceux détectês par Ies sondes utilisées pour la cartographié de l'apoméiose chez Tripsacum.
- Matériels et Mëthodes Les travaux dont les résultats sont rapportés ci-après ont été réalisés sur elongate (ell), qui est un mutant de méiose récessif (19). Chez les plantes homozygotes pour le locus e11, les chromosomes restent dêcondensés durant la métaphase et l'anaphase de première division, entraînant diverses anomalies chromosomiques dont une proportion importante de gamétophytes non rêduits (de 30 à 70 %, fonction entre autres du fond génétique dans lequel on place la mutation). La fécondation par le pollen d'une plante normale conduit à
un embryon triploïde, et à un albumen pentaploïde déficient.
La localisation précise du locus elongate était inconnue jusqu'à l'invention. On savait cependant qu'il appartenait au bras long du chromosome 8 du mais. I1 n'était donc pas localisé directement sur le bras de chromosome de maïs identifié par Leblanc et al. comme homéologue de celui contrôlant l'apoméiose. Localisë sur le chromosome 8, il appartient cependant potentiellement â un segment qui se trouve être dupliqué entre la partie distale du bras long du chromosome 6 et certaines parties du chromosome 8 (15).
La figure 2 décrit la construction d'une population de cartographie pour la mutation e11 (elongate). Trois plantes F1 de génotype hétérozygote E1I/e11 ont été rétrocroisêes sur trois plantes homozygotes e11/ell. Pour chaque famille, 50 plantes plantes ont été mises au champ, autofëcondées, et évaluées pour leur phénotype. Les graines E11/e11 sont attendues normales, les graines ell/e11 présentant un albumen malformé. Afin de confirmer les phénotypes elongate, dix à vingt embryons â l'intérieur des graines présentant un albumen déficient ont été prélevês, et analysés en cytométrie de flux en utilisant le protocole proposé par Galbraiht et al (20) . La mutation e11 a été
obtenue auprès du Maize Genetic Stock Center, Urbana, Illinois, sous la forme de graines issues de l'autofécondation de plantes homozygotes pour l'allèle e1I dans un fond genétique par ailleurs indéterminé. On a utilisë la lignée homozygote de phénotype sauvage, W23, pour la construction de la population. La détection de liaison et l'estimation des taux de recombinaison ont étê
obtenues à l'aide du logiciel Mapmaker 2.0, pour machintosh.
- Comparaison de l'expression phénotypique des plantes apoméiotiques et elongate L'expression phénotypique de la mutation elongate dans les cellules archésporiales de plantes homozygotes e11/e11 a été analysée par des techniques de cytoembryologie précédemment décrites par Leblanc et al.
(11) . Des inflorescences immatures ont êtê récoltées sur quatre types de matêriels: (1) des Tripsacum diploïdes sexués, (2) des Tripsacum tétraploides apomictiques, accessions décrites dans Leblanc et al (11), (3) une lignée de maïs homozygote Ell/E11 de phénotype sauvage (W23), et (4) une lignée homozygote ell/ell.
Étiquetage et isolement de la séquence du locus elongate à l'aide d'éléments transposables.
L'étiquetage par transposon consiste à utiliser des transposons dont on connaît la séquence afin de créer une mutation pour un gène dont on ne connaît que l'expression phénotypique. L'insertion du transposon dans le gène que l'on cherche à isoler se caractêrise souvent par la perte de sa fonction. Dans le cas d'allèle recessifs, elle se caractérise frêquemment par l'apparition du phénotype récessif chez des plantes hétérozygotes. Le gène muté peut ensuite être lui-même cloné en repérant le site d'insertion du transposon. Le gène muté peut alors être lui-même isolé en repërant le site d'insertion du transposon, les différents loci oü
WO 98/36090 PCT/F'R98/00308 ont été insêrés des transposons étant clonés par les techniques classiques d'analyse Mendélienne et de biologie moléculaire. Les expériences ci-aprës ont étë
réalisées avec le système Mutator (21).
5 La population utilisée pour l'étiquetage du locus elongate à l'aide de transposons est schëmatisée sur la figure 3 (f : fréquence d' apparition; (EL] et [el]
phënotypes dominant et récessif ; E1* . allèle marqué.
Les plantes homozygotes pour la mutation récessive sont lo croisées sur des plantes homozygotes pour l'allèle sauvage, E11. Dans la population de gamêtes produite par la parent EL1/E11, on retrouve une ou plusieurs mutations au locus elongate. Lorsque l'insertion conduit â la perte de la fonction de cet allële, on retrouve alors quelques 15 plantes F1 de génotype ell/E11, mais de phénotype ell. Le gêne est alors marquê.
Résultats:
- Cartographie du locus elongate:
Dans les populations en ségrégation, les 20 phénotypes e11 et E11 ségrègent en proportions 1:1 (Chi2=
0.5 ; P=0.6). Différentes sondes RFLP appartenant aux chromosomes 3, 6, et majoritairement 8 ont étê testées avec trois enzymes de restriction, EcoRl, BamHl, et HindIII, sur 50 plantes de la population. Les sondes
25 dëtectant des polymorphismes intéressants ont ensuite été
analysées sur 100 individus supplémentaires. Umc28, umc62, et umc71 ne présentent pas d'allëles polymorphes liés au elongate avec les trois enzymes testées. Csu68 et cdo202, par contre, détectent des allèles liés au locus elongate. Les liaisons entre les trois loci, estimées en pourcentage de recombinaison, sont les suivantes:
cdo 202 csu68 elongate 9.3 7.4 csu68 1.9 - Caractérisation phénotypique:
La figure 4 permet la comparaison des dêveloppements des cellules archesporiales chez ces différents types de matériels (A: cellule mère de la mégaspore chez W23, un maïs de génotype E11/E11; B:
cellule mère de la mégaspore chez un maïs homozygote ell/ell; C: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum diploïde sexué; D: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum tétraploïde apomictique). Les stades de développement observés on été identifiés et synchronisés entre les différentes formes observées en se basant sur la taille et la morphologie des téguments externes de l~ovule (11). Pour les formes sexuées chez maïs et 2o Tripsacum:, on observe des caractéristiques de développement tout à fait similaires . même morphologie à
la fois des cellules et des noyaux (entre autre: cellule mère de la mêgaspore de formes rectangulaires, paroies marquées épaisses, dépôts de callose très marqués au niveau des parois cellulaires, depuis la cellule mère des mégaspores jusqu'à la formation de la mégaspore). On observe cette même similarité en comparant les formes diplosporiques chez Tripsacum aux plantes de mais homozygotes E11/E11: même morphologie à la fois des noyaux et des cellules (dêveloppement direct de la cellule mère de la mëgaspore en sac embryonnaire, paroie cellulaires fines, noyaux très clairement différents de ceux observés chez les formes sexuées, et très comparables entre les formes diplosporiques chez Tripsacum et les plantes ell/ell chez le maïs, et absence ou très faibles dépôts de callose au niveau la cellule mère de la mégaspore).
- Étiquetage par transposon du locus elongate:
Une population de 12500 plantes F1 produites selon la figure 3 ont été mises au champs sur la station expérimentale du CIMMYT â Tlatizapan, Mexique. Les 12500 plantes ont été fécondées par un hybride de mais dépourvu de Mutator actif (hybride CML135 * CML 62). Les épis des 12500 ont êté observés â maturité afin de détecter ceux exprimant la mutation elongate bien qu'hétérozygotes à ce locus. Pour les plantes prësentant des albumens déficients, les embryons correspondants ont été analysés en cytométrie de flux. Deux plantes identifiées comme TTEl-5 et TTE1-7 ont été identifiées comme possédant des albumens déficients associés à un embryon triploïde. Ces plantes expriment le phénotype elongate chez des plantes hétérozygotes elI/E11. Chez ces plantes l'allèle sauvage au locus a été étiquetê par un des transposons de type Mutator. Les graines produites par croisement de ces deux plantes par l'hybride CML135*CML62 forment une population dans laquelle cet allèle marqué ségrège au locus elongate: la moitié des plantes issues de ce croisement sont de génotype e1I/E1 (e11 issu de la plante TTE1, E1 issu de CML135*CML62), l'autre moitié étant de génotype E11*/E1, où E11* est l'allèle marqué par le transposon et issu des plantes TTE1. On peut alors identifier et cloner lo le gène au locus elongate en analysant la co-ségrégation des différentes copies des élements transposables présents chez ces plantes et du locus elongate tel que localisé avec les sondes RFLP mentionnées ultérieurement.
- Exemple 3: obtention et rocédé d'utilisation d'une population de mutagenèse permettant de confirmer la relation entre l'allèle candidat et l'ex ression phénotype de tout ou partie du développement apomictique Le schéma général et les matériels utilisés sont présentés figure 5. Les lignées contenant des éléments Mutator ont été obtenues auprès de M. Freeling, Universitë de Californie à Berkeley. Les plantes dihaploïdes BC2-28 utilisées ici sont celles précédemment décrites par Leblanc et al (6). I1 s'agit de plantes apomictiques, possédant un gênome haploïde de chacun des deux parents d'origine maïs et Tripsacum. Nous avons utilisé ces plantes pour introduire des éléments Mutator dans un matériel apomictique.
Une population de mille plantes BC2-28 apomictiques a tout d'abord été constituée, à partir d'une unique plante dihaploïde apomictique, et en sélectionnant dans ses descendances les plantes de types 2n+0. Nous créons ainsi mille copies du même génotype polyhaploïde apomictigue. Ces mille plantes ont étê
croisées par les stocks Mutator. Dans la descendance obtenue, nous avons sélectionné pour les plantes hors-types 2n+n, c~est-à-dire ayant incorporé un génome issu des stocks Mutator. Ces stocks possëdent environ 200 copies des différents types de Mutators. On espêre donc en récupérer en moyenne 100 copies dans les plantes apomictiques. La sélection des plantes BC2-28 et des hors-types BC3-38 apomictiques s'est faite sur un simple critëre morphologique. Les dihaploîdes possêdent en effet un phénotype très reconnaissable, et très différent de celui qui résulte de l'accumulation d'un génome de maïs supplémentaire (6). Au total, environ 35000 graines (BC2-28 x Mutators) ont été obtenues . L' ensemble a été mis au champ sur la station expérimentale du CIMMYT â
Tlaltizapan, état de Morelos, au cours de l'étê 1996. Les hors-type 2n+n ont été sélectionnês un mois aprës germination. Environ 7500 plantes 2n+n ont été obtenues, soit près de 20% de hors-types. Cette population a été
recroisée par un hybride de mais (CML135*CML62) dépourvu d'éléments Mutator actifs, produisant une population d'environ 150000 graines, représentant la population de génétique inverse.
Cette population reprêsente un matériel idéal pour analyser l'effet d'une séquence donnêe sur l'expression 5 de l'apomixie. En effet, les allèles Tripsacum responsables de l' expression de ce caractère sont ici en condition simplex (une seule copie dans le génome). I1 suffit donc pour vérifier la relation allêle-fonction de contrôler l'effet phénotypique de l'insertion d'un l0 transposon dans cette séquence. Si la mutation induit une perte de fonction, on a alors établi avec certitude la relation séquence-fonction. Les séquences à la fois des transposons et du gëne étudié étant connues, on peut identifier les plantes mutées pour cet allèle par des 15 techniques de PCR classiques.
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analysées sur 100 individus supplémentaires. Umc28, umc62, et umc71 ne présentent pas d'allëles polymorphes liés au elongate avec les trois enzymes testées. Csu68 et cdo202, par contre, détectent des allèles liés au locus elongate. Les liaisons entre les trois loci, estimées en pourcentage de recombinaison, sont les suivantes:
cdo 202 csu68 elongate 9.3 7.4 csu68 1.9 - Caractérisation phénotypique:
La figure 4 permet la comparaison des dêveloppements des cellules archesporiales chez ces différents types de matériels (A: cellule mère de la mégaspore chez W23, un maïs de génotype E11/E11; B:
cellule mère de la mégaspore chez un maïs homozygote ell/ell; C: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum diploïde sexué; D: cellule mère de la mégaspore chez un Tripsacum tétraploïde apomictique). Les stades de développement observés on été identifiés et synchronisés entre les différentes formes observées en se basant sur la taille et la morphologie des téguments externes de l~ovule (11). Pour les formes sexuées chez maïs et 2o Tripsacum:, on observe des caractéristiques de développement tout à fait similaires . même morphologie à
la fois des cellules et des noyaux (entre autre: cellule mère de la mêgaspore de formes rectangulaires, paroies marquées épaisses, dépôts de callose très marqués au niveau des parois cellulaires, depuis la cellule mère des mégaspores jusqu'à la formation de la mégaspore). On observe cette même similarité en comparant les formes diplosporiques chez Tripsacum aux plantes de mais homozygotes E11/E11: même morphologie à la fois des noyaux et des cellules (dêveloppement direct de la cellule mère de la mëgaspore en sac embryonnaire, paroie cellulaires fines, noyaux très clairement différents de ceux observés chez les formes sexuées, et très comparables entre les formes diplosporiques chez Tripsacum et les plantes ell/ell chez le maïs, et absence ou très faibles dépôts de callose au niveau la cellule mère de la mégaspore).
- Étiquetage par transposon du locus elongate:
Une population de 12500 plantes F1 produites selon la figure 3 ont été mises au champs sur la station expérimentale du CIMMYT â Tlatizapan, Mexique. Les 12500 plantes ont été fécondées par un hybride de mais dépourvu de Mutator actif (hybride CML135 * CML 62). Les épis des 12500 ont êté observés â maturité afin de détecter ceux exprimant la mutation elongate bien qu'hétérozygotes à ce locus. Pour les plantes prësentant des albumens déficients, les embryons correspondants ont été analysés en cytométrie de flux. Deux plantes identifiées comme TTEl-5 et TTE1-7 ont été identifiées comme possédant des albumens déficients associés à un embryon triploïde. Ces plantes expriment le phénotype elongate chez des plantes hétérozygotes elI/E11. Chez ces plantes l'allèle sauvage au locus a été étiquetê par un des transposons de type Mutator. Les graines produites par croisement de ces deux plantes par l'hybride CML135*CML62 forment une population dans laquelle cet allèle marqué ségrège au locus elongate: la moitié des plantes issues de ce croisement sont de génotype e1I/E1 (e11 issu de la plante TTE1, E1 issu de CML135*CML62), l'autre moitié étant de génotype E11*/E1, où E11* est l'allèle marqué par le transposon et issu des plantes TTE1. On peut alors identifier et cloner lo le gène au locus elongate en analysant la co-ségrégation des différentes copies des élements transposables présents chez ces plantes et du locus elongate tel que localisé avec les sondes RFLP mentionnées ultérieurement.
- Exemple 3: obtention et rocédé d'utilisation d'une population de mutagenèse permettant de confirmer la relation entre l'allèle candidat et l'ex ression phénotype de tout ou partie du développement apomictique Le schéma général et les matériels utilisés sont présentés figure 5. Les lignées contenant des éléments Mutator ont été obtenues auprès de M. Freeling, Universitë de Californie à Berkeley. Les plantes dihaploïdes BC2-28 utilisées ici sont celles précédemment décrites par Leblanc et al (6). I1 s'agit de plantes apomictiques, possédant un gênome haploïde de chacun des deux parents d'origine maïs et Tripsacum. Nous avons utilisé ces plantes pour introduire des éléments Mutator dans un matériel apomictique.
Une population de mille plantes BC2-28 apomictiques a tout d'abord été constituée, à partir d'une unique plante dihaploïde apomictique, et en sélectionnant dans ses descendances les plantes de types 2n+0. Nous créons ainsi mille copies du même génotype polyhaploïde apomictigue. Ces mille plantes ont étê
croisées par les stocks Mutator. Dans la descendance obtenue, nous avons sélectionné pour les plantes hors-types 2n+n, c~est-à-dire ayant incorporé un génome issu des stocks Mutator. Ces stocks possëdent environ 200 copies des différents types de Mutators. On espêre donc en récupérer en moyenne 100 copies dans les plantes apomictiques. La sélection des plantes BC2-28 et des hors-types BC3-38 apomictiques s'est faite sur un simple critëre morphologique. Les dihaploîdes possêdent en effet un phénotype très reconnaissable, et très différent de celui qui résulte de l'accumulation d'un génome de maïs supplémentaire (6). Au total, environ 35000 graines (BC2-28 x Mutators) ont été obtenues . L' ensemble a été mis au champ sur la station expérimentale du CIMMYT â
Tlaltizapan, état de Morelos, au cours de l'étê 1996. Les hors-type 2n+n ont été sélectionnês un mois aprës germination. Environ 7500 plantes 2n+n ont été obtenues, soit près de 20% de hors-types. Cette population a été
recroisée par un hybride de mais (CML135*CML62) dépourvu d'éléments Mutator actifs, produisant une population d'environ 150000 graines, représentant la population de génétique inverse.
Cette population reprêsente un matériel idéal pour analyser l'effet d'une séquence donnêe sur l'expression 5 de l'apomixie. En effet, les allèles Tripsacum responsables de l' expression de ce caractère sont ici en condition simplex (une seule copie dans le génome). I1 suffit donc pour vérifier la relation allêle-fonction de contrôler l'effet phénotypique de l'insertion d'un l0 transposon dans cette séquence. Si la mutation induit une perte de fonction, on a alors établi avec certitude la relation séquence-fonction. Les séquences à la fois des transposons et du gëne étudié étant connues, on peut identifier les plantes mutées pour cet allèle par des 15 techniques de PCR classiques.
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(21) Robertson, D. S., 1980 The timing of Mu activity in maize. Genetics 94: 969-978.
Claims (24)
1/ Procédé pour identifier chez une graminée, et plus spécialement chez un maïs, une séquence de nucléotides orthologue de séquence responsable de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique, caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement celui d'un maïs, des mutations présentant un phénotype proche ou similaire de celui observé chez une forme apomictique, pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cartographie dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, des mutations méiotiques pour identifier celles qui apparaissent orthologues de gènes impliqués dans l'apomixie.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on localise la position de différentes mutations méiotiques dans le génome de la graminée, plus spécialement d'un maïs, à l'aide de marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de l'apoméiose chez ladite forme apomictique.
4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise des marqueurs moléculaires capables de localiser les loci responsables de la diplosporie chez Tripsacum.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite localisation concerne les loci elongate et afd.
6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étiquetage par transposon des mutations méiotiques localisées.
7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étiquetage par transposon est réalisé au locus elongate à l'aide des éléments transposables du type Mutator ou Ac/Ds.
8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le clonage et le séquençage des mutations localisées.
9/ Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on clone les gènes mutés, après avoir repéré le site d'insertion du transposon par analyse de ségrégation, et qu'on les séquence si souhaité.
10/ Séquences de nucléotides, caractérisées en ce qu'elles sont orthologues de séquences responsables de tout ou partie du développement apomictique chez une forme apomictique et les séquences homologues.
11/ Séquence de nucléotides selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle correspond au gène muté d'elongate.
12/ Acides nucléiques contenant une ou plusieurs séquences telles que définies dans la revendication 10 ou 11, associées à des séquences régulatrices nécessaires à l'expression dans un matériel végétal.
13/ Vecteurs de clonage et d'expression comportant des acides nucléiques selon la revendication 12.
14/ Hôtes cellulaires contenant un vecteur selon la revendication 13.
15/ Utilisation d'une séquence selon la revendication 10 ou 11, le cas échéant en conjonction avec d'autres allèles caractéristiques des formes apomictiques, pour introduction dans le génome d'un matériel végétal, cellules végétales, plantes à divers stades de développement et graines, afin de leur conférer un développement apomictique.
16/ Cellule végétale de graminées, en particulier de mais, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 impliquée dans un développement apomictique.
17/ Plante de la famille des graminées, en particulier mais, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11, impliquée dans un développement apomictique.
18/ Graine de graminées, en particulier de mais, caractérisée en ce qu'elle comporte dans son génome au moins la partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 impliquée dans un développement apomictique.
19/ Procédé de production de plantes apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence de nucléotides selon la revendication 11.
20/ Utilisation d'au moins une partie d'une séquence selon la revendication 10 ou 11 pour identifier et isoler les séquences des loci orthologues chez des formes apomictiques.
21/ Sondes d'hybridation et amorces moléculaires caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'une séquence selon la revendication 10 ou 11.
22/ Sondes d'hybridation et amorces moléculaires selon la revendication 18, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de la séquence d'elongate.
23/ Procédé d'identification et d'isolement de gènes responsables de l'apoméiose chez les Tripsacum apomictiques, caractérisé en ce qu'on utilise au moins une partie de la séquence du locus elongate.
24/ Procédé d'utilisation d'une population de mutagénèse pour confirmer la relation entre une séquence isolée chez Tripsacum selon la revendication 20 et l'expression de l'apomixie.
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