EP0870030A1 - Polypeptides with interleukin 16 activity, process for the preparation and use thereof - Google Patents

Polypeptides with interleukin 16 activity, process for the preparation and use thereof

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Publication number
EP0870030A1
EP0870030A1 EP96944582A EP96944582A EP0870030A1 EP 0870030 A1 EP0870030 A1 EP 0870030A1 EP 96944582 A EP96944582 A EP 96944582A EP 96944582 A EP96944582 A EP 96944582A EP 0870030 A1 EP0870030 A1 EP 0870030A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
polypeptide
nucleic acid
sequence
ser
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96944582A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Reinhard Kurth
Michael Baier
Norbert Bannert
Karin Metzner
Albrecht Werner
Kurt Lang
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Bundesrepublik Deutschland Vertreten Durch Das Bun
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Bundesrepublik Deutschland
Bundesministerium fuer Gesundheit
Boehringer Mannheim GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Bundesrepublik Deutschland, Bundesministerium fuer Gesundheit, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0870030A1 publication Critical patent/EP0870030A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5446—IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • LL-16 Interleukin-16 is a lymphokine, which is also known as "lymphocyte chemoattracting factor” (LCF) or “immunodeficiency virus suppressing lymphokine” (ISL).
  • LCF lymphocyte chemoattracting factor
  • ISL immunodeficiency virus suppressing lymphokine
  • IL-16 and its properties are described in WO 94/28134, WO 96/31607 and by Cruikshank, W W, et al, Proc Natl Acad. Be USA 91 (1994) 5109-51 13 and described by Baier, M, et al., Nature 378 (1995) 563.
  • the recombinant production of IL-16 is also described there.
  • IL-16 is a protein with a molecular mass of 13.385 D.
  • the object of the present invention is to improve the activity of LL-16 and to provide LL-16 forms which show low immunogenicity and are advantageously suitable for therapeutic use.
  • the object of the invention is achieved by a nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity can be achieved in a prokaryotic or eukaryotic host cell, said nucleic acid in the region coding for said polypeptide
  • a) corresponds to the DNA sequence nucleotides 54-1175 from SEQ LD NO 1 or its complementary strand
  • Such a nucleic acid preferably encodes a polypeptide with improved LL-16 activity, particularly preferably improved natural LL-16 from primates, such as human LL-16 or LL-16 of a monkey species or another mammal, such as a mouse.
  • Fig. 2 of WO 94/28134 does not describe the correct sequence of LL-16.
  • the start codon "ATG” does not begin with nucleotide 783, but with nucleotide 54.
  • This reading frame is obtained if an A is inserted after nucleotide 156, a C after nucleotide 398 and a G after nucleotide 780.
  • the correct reading frame is shown in SEQ LD NO: 1.
  • This sequence shows still further differences from FIG. 2 of WO 94/28134. However, these are only nucleotide exchanges (eg 313 G in A, 717 C in A).
  • the nucleic acid according to the invention also codes for a polypeptide which can be processed in its production.
  • Such a polypeptide which is thus extended compared to the LL-16 known from WO 94/28134, shows an improved activity.
  • Monomeric LL-16 with improved activity has a molecular weight of 13.9-39 kD, preferably approximately 15-35 kD, and is thus up to three times as large as the C-terminal LL-16 described in WO 94/28134 Fragment
  • the sequence of LL-16 can differ to a certain extent from the protein sequences encoded by such DNA sequences.
  • sequence variations of LL-16 muteins can be amino acid exchanges, deletions or additions.
  • amino acid sequence of LL-16 is preferably at least 75%, particularly preferably at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ LD NO 1
  • Variants of parts of the amino and nucleic acid sequence SEQ LD NO 1 / SEQ ID NO.2 are for example in the international application WO 96/31607 and German patent application 195 47 933 5 described
  • Particularly preferred IL-16 muteins with improved activity begin at the N-terminus with amino acids 235-244 from SEQ LD NO.1 / 2 or a part thereof. Particularly preferred N-termini are described in SEQ LD NO 3-12
  • the LL muteins with improved activity at the C-terminus can be shortened by preferably 1-20 amino acids.
  • IL-16 is to be understood as meaning a polypeptide with the activity of LL-16 or preferably with an improved activity.
  • LL-16 preferably shows the stated effect in the test method described in international application WO 96/31607 or stimulates cell division according to WO 94/28134
  • viruses preferably HTV-1, HLV-2 or SIV.
  • hybridize under stringent conditions means that two nucleic acid fragments hybridize with one another under standardized hybridization conditions, as described, for example, in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli” in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
  • Such conditions are, for example, hybridization in 6.0 x SSC at about 45 ° C, followed by a washing step at 2 x SSC at 50 ° C.
  • the salt concentration in the washing step can be selected, for example, between 2.0 x SSC at 50 ° C for low stringency and 0.2 x SSC at 50 ° for high stringency.
  • the temperature of the wash step can be varied between room temperature, approx. 22 ° C for low stringency and 65 ° C for high stringency.
  • LL-16 is preferably produced recombinantly in prokaryotic or eukaryotic host cells. Such production methods are described, for example, in WO 94/28134 and WO 96/31607, which are also the subject of the disclosure of the present invention for this purpose. However, in order to define and reproducibly obtain the forms of LL-16 according to the invention by recombinant production, additional measures must be taken via the recombinant production processes familiar to the person skilled in the art.
  • Recombinant LL-16 can be produced by the methods familiar to the person skilled in the art.
  • a DNA is first produced which is able to produce a protein which has the activity of LL-16.
  • the DNA is cloned into a vector that can be transferred to a host cell and replicable there.
  • a vector contains operator elements which are necessary for the expression of the DNA sequence.
  • This vector which contains the LL-16 sequence and the operator elements, is transferred into a vector which is able to express the DNA of LL-16.
  • the host cell is cultivated under conditions which are suitable for the amplification of the vector, and LL-16 is obtained. Appropriate measures are taken to ensure that the protein can assume an active tertiary structure in which it shows LL-16 properties
  • the nucleic acid sequence of the protein can also be modified. Such modifications are, for example.
  • the protein is preferably expressed in microorganisms, in particular in prokaryotes, and there in E. coli
  • the expression vectors must contain a promoter which allows expression of the protein in the host organism.
  • promoters are known to the person skilled in the art and are, for example, lac promoter (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp promoter (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), ⁇ PL promoter (Shimatake et al, Nature 292 (1981) 128) and T5 promoter (U.S. Patent No. 4,689,406).
  • Synthetic promoters such as the tac promoter (US Pat. No. 4,551,433) are also suitable.
  • Coupled promoter systems such as the T7 RNA polymerase / promoter system are also suitable (Studier et al, J Mol. Biol. 189 (1986) 113). .
  • Hybrid promoters comprising a bacteriophage promoter and the operator region of the microorganism are also suitable (EP-A 0 267 851).
  • an effective ribosome binding site is required.
  • this ribosome binding site is referred to as the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual
  • a DNA sequence which codes for the N-terminal part of an endogenous bacterial protein or another stable protein is usually attached to the 5'- End of the sequence coding for LL-16 fused. Examples include lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185
  • the fusion proteins are preferably cleaved with enzymes (Carter P. in Ladisch, MR et al. Eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society (1990) 181-193).
  • cleavage sites are the IgA protease cleavage site (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), the ubiquitin cleavage site (Miller et al., Bio / Technology 7 (1989) 698), the enterokinase cleavage site (Maroux et al., J. Biol. Chem. 241 (1971) 5031) and the Factor Xa cleavage site (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810).
  • the proteins expressed in this way in bacteria are obtained in a conventional manner by digesting the bacteria and isolating the proteins.
  • a fusion product is preferably used, which consists of the signal sequence which is suitable for the secretion of proteins in the host organisms used and the nucleic acid which codes for the protein.
  • the protein is either secreted into the medium (for gram-positive bacteria) or into the periplasmic space (for gram-negative bacteria).
  • a cleavage site is expediently provided, which allows the protein to be split off either during processing or in an additional step.
  • signal sequences originate, for example, from ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).
  • Terminators are DNA sequences that signal the end of a transcription process. They are usually characterized by two structural peculiarities: an inversely repetitive G / C-rich region, the intramolecular can form a double helix and a number of U (or T) residues. Examples are the main terminator in the DNA of phage fd (Beck and Zink, Gene 16 (1981) 35-58) and rrnB (Brosius et al, J Mol Biol 148 (1981) 107-127)
  • the expression vectors usually contain a selectable marker in order to select transformed cells.
  • selectable markers are, for example, the resistance genes for ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, kanamycin, neomycin and tetracycline (Davies et al, Ann Rev Microbiol 32 (1978) 469)
  • ⁇ Bable markers are the genes for essential substances of the biosynthesis of substances necessary for the cell, such as histidine, tryptophan and leucine
  • vectors are described for the following bacteria: Bacillus subtilis (Palva et al, Proc Natl Acad Sei USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al, Gene 40 (1985) 183, Studier et al, J Mol Biol 189 (1986) 1 13), Streptococcus cremoris (Powell et al, Appl Environ Microbiol 54 (1988) 655), Streptococcus lividans and Streptomyces lividans (U.S. Patent No. 4,747,056)
  • yeast integrating YIp (yeast integrating plasmids) - vectors, replicating YRp (yeast replicon plasmids) - vectors and episomal YEp (yeast episomal plasmids) - vectors take place. Details on this are described, for example, in SM Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57
  • Another object of the invention is a prokaryotic or eukaryotic host cell which is transformed or transfected with a nucleic acid which codes for an LL-16 polypeptide according to the invention in such a way that the host cell expresses said polypeptide.
  • a host cell usually contains one biologically functional nucleic acid vector, preferably a DNA vector, a plasmid DNA which contains this nucleic acid
  • the invention furthermore relates to human interleukin-16 or interleukin-16 from primates, preferably human LL-16 with improved activity, as is obtainable as a product of prokaryotic or eukaryotic expression essentially free of other human proteins.
  • LL-16 is a protein which occurs as a monomer or as a multimer consisting of monomeric LL-16 (hereinafter also referred to as subunits).
  • the molecular weight of a monomeric LL-16 subunit is preferably 13.9-39 kD, particularly preferably 15-35 kD.
  • nucleic acid and protein sequence of LL-16 described in WO 94/28134 do not correspond to the natural human sequences. This is just an LL-16 fragment with a non-natural N-terminus.
  • a protein which is either identical to the natural protein or differs only slightly from the natural protein and / or shows at least comparable, preferably improved activity and immunogenicity.
  • natural unprocessed or not yet secreted LL-16 contrary to the previous assumption, is a larger protein with a molecular weight of 13.9-39 kD. Its sequence is contained in the sequence records.
  • polypeptides of the invention can additionally contain a defined content of metal ions, the number of metal ions per subunit preferably being 0.5 to 2.
  • metal ions are suitable as metal ions in the sense of the invention, which are added in a defined amount in the preparation of the multimeric forms of LL-16.
  • alkaline earth metals and elements of the subgroups are suitable.
  • Alkaline earth metals, cobalt, zinc, selenium, manganese, nickel, copper, iron, magnesium, calcium, molybdenum and silver are particularly suitable.
  • the ions can be one, two, three or tetravalent. Divalent ions such as Cu (II) ions are particularly preferred.
  • the ions are preferably added as solutions of MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl 2 , Sr (N ⁇ 3) 2 , Na 2 MoO 4 , AgCl 2 or Cu (II) acetate.
  • the polypeptide according to the invention can be prepared by cultivating a prokaryotic or eukaryotic host cell which has been transformed or transfected with a nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 under suitable nutrient conditions and, if appropriate, isolating the desired polypeptide. If the preparation of the polypeptide in If a gene therapy treatment is to take place in vivo, the polypeptide is of course not isolated from the cell.
  • polypeptides according to the invention are particularly suitable for the treatment of pathological conditions which are caused by viral replication, in particular retroviral replication, and for immunomodulation.
  • pathological conditions which are caused by viral replication, in particular retroviral replication, and for immunomodulation.
  • diagnostic test methods are also described in the latter
  • the polypeptides according to the invention can preferably be used for immunosuppression. This immunosuppression is preferably carried out by inhibiting the helper function of the THQ and / or TH] and TH2 cells.
  • the polypeptides according to the invention are accordingly of therapeutic value in all diseases in which an immune-regulatory component is postulated in the pathogenesis, in particular hyperimmunity.
  • myocarditis, endocarditis and pericarditis can be considered as EL-16-treatable diseases in cardiology / angiology, for example in pulmonology wise bronchitis, asthma, in hematology autoimmune Europe and transplant rejection, in gastroenterology chronic gastritis, in endocrinology diabetes mellitus type I, in nephrology glomerulonephritis, diseases in the rheumatic type, diseases in ophthalmology, in neurology, such as multiple sclerosis , in dermatology eczema.
  • the polypeptides according to the invention can be used in autoimmune diseases, allergies and to avoid transplant rejections
  • Another object of the invention is the use of the nucleic acids according to the invention in the context of gene therapy.
  • Vector systems suitable for this are, for example, retroviral or non-viral vector systems
  • Another object of the invention is a polyclonal or monoclonal anti-LL-16 antibody or an immunoactive fragment thereof and methods for producing such antibodies and their use for the determination of LL-16 and for the determination of viral infections in eukaryotic cells and in particular in Suction cell material.
  • LL-16 can also be used to determine virus-activated mammalian cells, in particular T cells.
  • the production of such antibodies is carried out by immunization with a polypeptide according to the invention, which preferably corresponds essentially to the sequence amino acids 1-244 from SEQ LD NO 1/2 and which binds to such a peptide.
  • An antibody is preferably used which does not bind to the polypeptide of the sequence amino acids 245-374 from SEQ LD NO 1/2.
  • the production of such an antibody is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art
  • RNA isolation kit RNA isolation kit, Stratagene
  • the lysate was kept on ice for 15 min.
  • the aqueous phase was then mixed with 6 ml of isopropanol to precipitate the RNA and Stored for 2 hours at -20 ° C.
  • the precipitate was finally washed once with pure ethanol and dissolved in 150 ⁇ l H2O.
  • the yield was determined photometrically and was 120 ⁇ g
  • the mixture for the cDNA synthesis contained 10 ⁇ g RNA, 0.2 ⁇ g oligo-dT, 13 mM DTT and 5 ⁇ l “bulk first strand reaction mix” (first-strand cDNA synthesis kit, Pharmacia) in an amount of 15 ⁇ l.
  • the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then stored at -20 ° C for later use
  • Amplification, cloning of LL-16 cDNA and production of an expression clone are carried out as described in WO 94/28134 or WO 96/31607, taking into account the changed sequences.
  • an N-terminal extension by several histidine residues is required
  • Pre-cultures are prepared from stock cultures (plate smear or ampoules stored at -20 ° C), which are shaken and incubated at 37 ° C.
  • the volume in the next higher dimension is 1-10% by volume.
  • Ampicillin 50-100 mg / l
  • Enzymatically digested protein and / or yeast extract as the N and C source and glycerol and / or glucose as the additional C source are used as nutrients.
  • the medium is buffered to pH 7 and metal salts are added in physiologically acceptable concentrations to stabilize the fermentation process.
  • the fermentation is carried out as a feed batch with a mixed yeast extract / C-source dosage.
  • the fermentation temperature is 25-37 ° C.
  • the aeration rate, speed control and dosage rate keep the dissolved oxygen partial pressure (p ⁇ 2) ⁇ 20%
  • the column was then rinsed with 300 ml of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.0 and the LL-16 fusion protein then with a gradient of 0 M to 300 mM imidazole, pH 7.0 in 50 mM sodium phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.0 (2 * 0.5 1 gradient volume) eluted.
  • Fractions containing LL-16 were identified by SDS-PAGE and combined.
  • 300 mg of the fusion protein thus obtained were dialyzed at 4 ° C. against 20 1 20 mM imidazole, pH 5.5 and then for 30 minutes to remove turbidity. centrifuged at 20,000 g. The supernatant from the centrifugation was then adjusted to pH 8.5 with NaOH, 0.3 mg of thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. The gap was then adjusted to pH 6.5 with HCl and the conductivity was adjusted to 1.7 mS by dilution with H 2 O.
  • the sample was applied to a Q-Sepharose FF column (45 ml; Pharmacia), which had previously been equilibrated with 20 mM imidazole, pH 6.5.
  • LL-16 was eluted with a gradient of 0 to 0.3 M NaCl in 20 mM imidazole, pH 6.5.
  • Fractions containing LL-16 were identified by SDS-PAGE, pooled and the LL-16 identity confirmed by mass analysis and N-terminal sequence analysis.
  • the LL-16 obtained in this way had a purity of more than 95% in SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the analytical Superdex 75 FPLC column (Pharmacia) was treated with 25 mM Na phosphate, 0.5 M NaCl, 10% glycerol, pH 7.0 and a flow rate of 1 ml / min. eluted.
  • the amount of protein applied in a volume of 100 to 150 ⁇ l was 1.5 to 15 ⁇ g protein.
  • the detection took place at 220 nm.
  • a Vydac, Protein & Peptide C18, 4x180 mm column was used for purity analysis using RP-HPLC.

Abstract

A nucleic acid can be used to achieve the expression of a polypeptide with interleukin 16 activity in a prokaryotic or eukaryotic host cell. Said nucleic acids in the area coding for said polypeptide corresponds (a) to the DNA sequence of nucleotides 54-1175 from SEQ ID NO:1 or to the complementary strand thereof, (b) hydridises under standard hybridisation conditions with the DNA of the sequence of nucleotides 54-785 of SEQ ID NO:1, (c) hybridises under stringent hydridisation conditions with the DNA of the sequence of nucleotides 786-1175 of SEQ ID NO:1 and starts at the 5' end the DNA sequence of nucleotides 756-785 of SEQ ID NO:1 or a part thereof which codes for a part of the sequence of aminoacids 235-244 of SEQ ID NO: 1, or (d) is a nucleic acid sequence which would hydridise under stringent hybridisation conditions, without the degeneration of the genetic code, with the nucleic acid sequences defined by (a) and (b). Said nucleic acid codes for proteins with improved interleukin 16 activity.

Description

Polypeptide mit EL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung Polypeptides with EL-16 activity, process for their preparation and use
Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL- 16- Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel¬ lung und ihre VerwendungThe invention relates to polypeptides with IL-16 activity, processes for their preparation and their use
LL-16 (Interleukin- 16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der WO 96/31607 sowie von Cruikshank, W W , et al , Proc Natl Acad. Sei USA 91 (1994) 5109-51 13 und von Baier, M , et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer molekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsieb¬ chromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), wird die "chemoattraetant activity" zugeschrieben Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben Die von Cruikshank et al in J Immunol 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattraetant activity" und die von Baier beschrie¬ bene Aktivität von rekombinantem humanem LL-16 sind jedoch sehr geringLL-16 (Interleukin-16) is a lymphokine, which is also known as "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) or "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL). IL-16 and its properties are described in WO 94/28134, WO 96/31607 and by Cruikshank, W W, et al, Proc Natl Acad. Be USA 91 (1994) 5109-51 13 and described by Baier, M, et al., Nature 378 (1995) 563. The recombinant production of IL-16 is also described there. According to this, IL-16 is a protein with a molecular mass of 13.385 D. Cruikshank also found that ISL in molecular sieve chromatography as a multimeric form with a molecular weight of 50-60 or 55-60 kD elutes this multimeric form, which is a cationic homotetramer (product information AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), the "chemoattraetant activity" is attributed. Baier describes a homodimeric form of IL-16 with a molecular weight of 28 kD. The method described by Cruikshank et al in J Immunol 146 (1991) 2928-2934 described "chemoattraetant activity" and the activity of recombinant human LL-16 described by Baier are, however, very low
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von LL-16 zu verbessern und LL-16- Formen bereitzustellen, die geringe Immunogenitat zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti¬ sche Anwendung geeignet sind.The object of the present invention is to improve the activity of LL-16 and to provide LL-16 forms which show low immunogenicity and are advantageously suitable for therapeutic use.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelost durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin- 16- Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure im für das genannte Poly¬ peptid codierenden BereichThe object of the invention is achieved by a nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity can be achieved in a prokaryotic or eukaryotic host cell, said nucleic acid in the region coding for said polypeptide
a) der DNA-Sequenz Nukleotide 54-1175 aus SEQ LD NO 1 oder ihrem komple¬ mentären Strang entspricht, b) mit der DNA der Sequenz Nukleotide 54-785 aus SEQ LD NO 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert, c) mit der DNA der Sequenz Nukleotide 786- 1175 aus SEQ LD NO.1 unter stringen¬ ten Bedingungen hybridisiert und am 5'-Ende mit den Nukleotiden 756-785 aus SEQ LD NO:l oder einem Teil davon beginnt, der für einen Teil der Sequenz Aminosäure 235-244 aus SEQ LD NO. l codiert, oder d) eine Nukleinsäuresequenz ist, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den durch a) oder b) definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren wurdea) corresponds to the DNA sequence nucleotides 54-1175 from SEQ LD NO 1 or its complementary strand, b) hybridized with the DNA of the sequence nucleotides 54-785 from SEQ LD NO 1 under stringent conditions, c) hybridized with the DNA of the sequence nucleotides 786-1175 from SEQ LD NO.1 under stringent conditions and at the 5 'end begins with nucleotides 756-785 from SEQ LD NO: 1 or a part thereof, which for part of the sequence amino acid 235-244 from SEQ LD NO. l coded, or d) is a nucleic acid sequence which would hybridize under stringent conditions without the degeneration of the genetic code with the nucleic acid sequences defined by a) or b)
In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert die Nukleinsäure, welche durch b) definiert ist, zusätzlich noch unter stringenten Bedingungen mit der DNA der Nukleotide 786-1 175 aus SEQ LD NO: l.In a preferred embodiment, the nucleic acid defined by b) additionally hybridizes under stringent conditions with the DNA of nucleotides 786-1 175 from SEQ LD NO: 1.
Vorzugsweise codiert eine solche Nukleinsäure ein Polypeptid mit verbesserter LL-16- Aktivi¬ tät, besonders bevorzugt verbessertes natürliches LL-16 von Primaten, wie humanes LL-16 oder LL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z.B Maus.Such a nucleic acid preferably encodes a polypeptide with improved LL-16 activity, particularly preferably improved natural LL-16 from primates, such as human LL-16 or LL-16 of a monkey species or another mammal, such as a mouse.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß LL-16-Formen mit einer gegenüber den in der WO 94/28134 beschriebenen LL-16 N-terminal verlängerten Sequenz nach wie vor aktiv sind. Solche LL-16-Formen zeigen aufgrund einer verlängerten Halbwertszeit sogar eine erhöhte Aktivität in vivo.Surprisingly, it has been shown that LL-16 forms with an extended sequence compared to the LL-16 N-terminal described in WO 94/28134 are still active. Such LL-16 forms even show increased activity in vivo due to an extended half-life.
Fig. 2 der WO 94/28134 beschreibt nicht die korrekte Sequenz von LL-16. Das Startcodon "ATG" beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Der korrekte Leserahmen ist in SEQ LD NO:l gezeigt. Diese Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich allerdings nur um Nukleotidaustausche (z.B. 313 G in A, 717 C in A). Die erfindungsgemäße Nukleinsäure codiert auch für ein Polypeptid, welches bei seiner Herstellung prozessiert werden kann. Ein solches Polypeptid, welches damit gegenüber dem aus der WO 94/28134 bekannten LL-16 verlängert ist, zeigt eine verbesserte Aktivität. Monomeres LL-16 mit verbesserter Aktivität besitzt ein Molekulargewicht von 13,9-39 kD, vorzugsweise ca. 15-35 kD, und ist damit etwa bis zu dreimal so groß wie das in der WO 94/28134 beschriebene C-terminale LL-16-Frag- ment LL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein¬ sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden Solche Sequenzvariationen von LL-16 Muteinen können Aminosaureaustausche, -deletionen oder -additionen sein Vorzugsweise ist die Aminosauresequenz von LL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenig¬ stens 90% identisch mit der Aminosauresequenz von SEQ LD NO 1 Varianten von Teilen der Amino- und Nukleinsäuresequenz SEQ LD NO 1 / SEQ ID NO.2 sind beispielsweise in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 und der deutschen Patentanmeldung 195 47 933 5 beschriebenFig. 2 of WO 94/28134 does not describe the correct sequence of LL-16. The start codon "ATG" does not begin with nucleotide 783, but with nucleotide 54. This reading frame is obtained if an A is inserted after nucleotide 156, a C after nucleotide 398 and a G after nucleotide 780. The correct reading frame is shown in SEQ LD NO: 1. This sequence shows still further differences from FIG. 2 of WO 94/28134. However, these are only nucleotide exchanges (eg 313 G in A, 717 C in A). The nucleic acid according to the invention also codes for a polypeptide which can be processed in its production. Such a polypeptide, which is thus extended compared to the LL-16 known from WO 94/28134, shows an improved activity. Monomeric LL-16 with improved activity has a molecular weight of 13.9-39 kD, preferably approximately 15-35 kD, and is thus up to three times as large as the C-terminal LL-16 described in WO 94/28134 Fragment The sequence of LL-16 can differ to a certain extent from the protein sequences encoded by such DNA sequences. Such sequence variations of LL-16 muteins can be amino acid exchanges, deletions or additions. However, the amino acid sequence of LL-16 is preferably at least 75%, particularly preferably at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ LD NO 1 Variants of parts of the amino and nucleic acid sequence SEQ LD NO 1 / SEQ ID NO.2 are for example in the international application WO 96/31607 and German patent application 195 47 933 5 described
Besonders bevorzugte IL-16 Muteine mit verbesserter Aktivität beginnen am N-Terminus mit den Aminosäuren 235-244 aus SEQ LD NO.1/2 bzw einem Teil davon Besonders bevorzugte N-Termini sind in SEQ LD NO 3-12 beschriebenParticularly preferred IL-16 muteins with improved activity begin at the N-terminus with amino acids 235-244 from SEQ LD NO.1 / 2 or a part thereof. Particularly preferred N-termini are described in SEQ LD NO 3-12
In einer bevorzugten Ausführungsform können die LL-Muteine mit verbesserter Aktivität am C-Terminus um vorzugsweise 1-20 Aminosäuren verkürzt sein.In a preferred embodiment, the LL muteins with improved activity at the C-terminus can be shortened by preferably 1-20 amino acids.
Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nuklein- saurederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsaure-Analoga sind solche Ver¬ bindungen, bei denen das Zuckerphosphatgerust durch andere Einheiten, wie z B Amino¬ säuren, ersetzt ist Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA- Bindungen sind, sind die oben beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybri- disierung nicht anwendbar Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschriebenFor the purposes of the invention, nucleic acids are understood to mean, for example, DNA, RNA and nucleic acid derivatives and analogs. Preferred nucleic acid analogs are those compounds in which the sugar phosphate framework is replaced by other units, such as, for example, amino acids. Such compounds are referred to as PNA and are described in WO 92/20702 since, for example, PNA-DNA bonds are stronger as DNA-DNA bonds, the stringent conditions described above for PNA-DNA hybridization are not applicable. However, suitable hybridization conditions are described in WO 92/20703
Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von LL-16 oder vorzugsweise mit einer verbesserten Aktivität zu verstehen Vorzugsweise zeigt LL-16 in dem in der internationalen Anmeldung WO 96/31607 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zellteilung gemäß WO 94/28134In the context of the invention, the expression “IL-16” is to be understood as meaning a polypeptide with the activity of LL-16 or preferably with an improved activity. LL-16 preferably shows the stated effect in the test method described in international application WO 96/31607 or stimulates cell division according to WO 94/28134
LL-16 bindet an CD4+ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren Die Funktion von LL-16 ist nicht durch seine Präsenta¬ tion im MHC-Komplex limitiert. Insbesondere zeigt LL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:LL-16 binds to CD4 + lymphocytes and can suppress the replication of viruses such as HIV-1, HIV-2 and SIV. The function of LL-16 is not limited by its presentation in the MHC complex. In particular, LL-16 exhibits one or more of the following properties:
Bindung an T-Zeüen über den CD4-Rezeptor,Binding to T cells via the CD4 receptor,
Stimulierung der Expression von LL-2-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4+-Lymphozyten,Stimulation of the expression of LL-2 receptor and / or HLA-DR antigen on CD4 + lymphocytes,
- Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von LL-2,Stimulation of the proliferation of T helper cells in the presence of LL-2,
- Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3-Antikörpern stimulierten T- Helferzellen,Suppression of the proliferation of T helper cells stimulated with anti-CD3 antibodies,
Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HTV-1, HLV-2 oder SIV.Suppression of replication of viruses, preferably HTV-1, HLV-2 or SIV.
Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäu- refragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 x SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 x SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 x SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 x SSC bei 50° für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Strin¬ genz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.The expression "hybridize under stringent conditions" means that two nucleic acid fragments hybridize with one another under standardized hybridization conditions, as described, for example, in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Such conditions are, for example, hybridization in 6.0 x SSC at about 45 ° C, followed by a washing step at 2 x SSC at 50 ° C. To select the stringency, the salt concentration in the washing step can be selected, for example, between 2.0 x SSC at 50 ° C for low stringency and 0.2 x SSC at 50 ° for high stringency. In addition, the temperature of the wash step can be varied between room temperature, approx. 22 ° C for low stringency and 65 ° C for high stringency.
LL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und WO 96/31607, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von LL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden.LL-16 is preferably produced recombinantly in prokaryotic or eukaryotic host cells. Such production methods are described, for example, in WO 94/28134 and WO 96/31607, which are also the subject of the disclosure of the present invention for this purpose. However, in order to define and reproducibly obtain the forms of LL-16 according to the invention by recombinant production, additional measures must be taken via the recombinant production processes familiar to the person skilled in the art.
Die Herstellung von rekombinantem LL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho¬ den erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von LL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur LL-16-Sequenz Operator-Elemente, die zur Expression der DNA- Sequenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die LL-16-Sequenz und die Operator-Eiemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von LL-16 zu exprimie- ren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und LL-16 gewonnen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es LL-16-Eigenschaften zeigtRecombinant LL-16 can be produced by the methods familiar to the person skilled in the art. For this purpose, a DNA is first produced which is able to produce a protein which has the activity of LL-16. The DNA is cloned into a vector that can be transferred to a host cell and replicable there. In addition to the LL-16 sequence, such a vector contains operator elements which are necessary for the expression of the DNA sequence. This vector, which contains the LL-16 sequence and the operator elements, is transferred into a vector which is able to express the DNA of LL-16. The host cell is cultivated under conditions which are suitable for the amplification of the vector, and LL-16 is obtained. Appropriate measures are taken to ensure that the protein can assume an active tertiary structure in which it shows LL-16 properties
Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein die exakte LL-16- Aminosaurese¬ quenz aus SEQ LD NO: l enthält. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschaften zeigen Insbesondere geeignet sind Pro¬ teine, die N-terminal Aminosäuren deletiert habenIt is not necessary for the expressed protein to contain the exact LL-16 amino acid sequence from SEQ LD NO: 1. Proteins which essentially contain the same sequence and show analogous properties are also suitable. Proteins which have deleted N-terminal amino acids are particularly suitable
Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein Derartige Modifikationen sind beispielsweise.The nucleic acid sequence of the protein can also be modified. Such modifications are, for example.
- Veränderung der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen- Change of nucleic acid to introduce different restriction enzyme recognition sequences to facilitate the steps of ligation, cloning and mutagenesis
- Veränderung der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle- Change the nucleic acid to incorporate preferred codons for the host cell
- Ergänzung der Nukleinsäure um zusatzliche Operator-Elemente, um die Expressi¬ on in der Wirtszelle zu optimierenSupplementing the nucleic acid with additional operator elements in order to optimize the expression in the host cell
Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro- karyonten, und dort in E coliThe protein is preferably expressed in microorganisms, in particular in prokaryotes, and there in E. coli
Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei¬ spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λPL Promotor (Shimatake et al , Nature 292 (1981) 128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto¬ ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr 4,551,433) Ebenso geeignet sind ge¬ koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al , J Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusatzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manualThe expression vectors must contain a promoter which allows expression of the protein in the host organism. Such promoters are known to the person skilled in the art and are, for example, lac promoter (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp promoter (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ PL promoter (Shimatake et al, Nature 292 (1981) 128) and T5 promoter (U.S. Patent No. 4,689,406). Synthetic promoters such as the tac promoter (US Pat. No. 4,551,433) are also suitable. Coupled promoter systems such as the T7 RNA polymerase / promoter system are also suitable (Studier et al, J Mol. Biol. 189 (1986) 113). . Hybrid promoters comprising a bacteriophage promoter and the operator region of the microorganism are also suitable (EP-A 0 267 851). In addition to the promoter, an effective ribosome binding site is required. For E. coli, this ribosome binding site is referred to as the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).
Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie- ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende der für LL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185To improve the expression, it is possible to express the protein as a fusion protein. In this case, a DNA sequence which codes for the N-terminal part of an endogenous bacterial protein or another stable protein is usually attached to the 5'- End of the sequence coding for LL-16 fused. Examples include lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185
(1990) 161 - 166).(1990) 161-166).
Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen gespalten (Carter P. in Ladisch, M.R. et al. eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society (1990) 181-193). Beispiele für Spaltstellen sind die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698), die Enterokinase-Spaltstelle (Maroux et al., J. Biol. Chem. 241 (1971) 5031) und die Faktor-Xa- Spaltstelle (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810).After expression of the vector, preferably a biologically functional plasmid or a viral vector, the fusion proteins are preferably cleaved with enzymes (Carter P. in Ladisch, MR et al. Eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society (1990) 181-193). Examples of cleavage sites are the IgA protease cleavage site (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), the ubiquitin cleavage site (Miller et al., Bio / Technology 7 (1989) 698), the enterokinase cleavage site (Maroux et al., J. Biol. Chem. 241 (1971) 5031) and the Factor Xa cleavage site (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810).
Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.The proteins expressed in this way in bacteria are obtained in a conventional manner by digesting the bacteria and isolating the proteins.
In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts¬ organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri- plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für LL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent¬ weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 7212).In a further embodiment it is possible to secrete the proteins as active proteins from the microorganisms. For this purpose, a fusion product is preferably used, which consists of the signal sequence which is suitable for the secretion of proteins in the host organisms used and the nucleic acid which codes for the protein. The protein is either secreted into the medium (for gram-positive bacteria) or into the periplasmic space (for gram-negative bacteria). Between the signal sequence and the sequence coding for LL-16, a cleavage site is expediently provided, which allows the protein to be split off either during processing or in an additional step. Such signal sequences originate, for example, from ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).
Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw T)-Resten Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al , J Mol Biol 148 (1981) 107 - 127)The vectors also contain terminators. Terminators are DNA sequences that signal the end of a transcription process. They are usually characterized by two structural peculiarities: an inversely repetitive G / C-rich region, the intramolecular can form a double helix and a number of U (or T) residues. Examples are the main terminator in the DNA of phage fd (Beck and Zink, Gene 16 (1981) 35-58) and rrnB (Brosius et al, J Mol Biol 148 (1981) 107-127)
Zusatzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al , Ann Rev Microbiol 32 (1978) 469) Ebenso geeignete selektier¬ bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not¬ wendigen Stoffen wie z B Histidin, Tryptophan und LeucinIn addition, the expression vectors usually contain a selectable marker in order to select transformed cells. Such selectable markers are, for example, the resistance genes for ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, kanamycin, neomycin and tetracycline (Davies et al, Ann Rev Microbiol 32 (1978) 469) ¬ Bable markers are the genes for essential substances of the biosynthesis of substances necessary for the cell, such as histidine, tryptophan and leucine
Es sind eine Vielzahl von geeigneten baktenellen Vektoren bekannt Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben Bacillus subtilis (Palva et al , Proc Natl Acad Sei USA 79 (1982) 5582), E coli (Aman et al , Gene 40 (1985) 183, Studier et al , J Mol Biol 189 (1986) 1 13), Streptococcus cremoris (Powell et al , Appl Environ Microbiol 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr 4,747,056)A large number of suitable bacterial vectors are known. For example, vectors are described for the following bacteria: Bacillus subtilis (Palva et al, Proc Natl Acad Sei USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al, Gene 40 (1985) 183, Studier et al, J Mol Biol 189 (1986) 1 13), Streptococcus cremoris (Powell et al, Appl Environ Microbiol 54 (1988) 655), Streptococcus lividans and Streptomyces lividans (U.S. Patent No. 4,747,056)
Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto¬ ren sind in J Sambrook et al , Molecular Cloning a laboratory manual (1989), Cold Spπng Harbor Laboratory Press, New York, N Y beschriebenFurther genetic engineering processes for the production and expression of suitable vectors are described in J Sambrook et al, Molecular Cloning a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY
Eine Expression von rekombinanter LL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich Als eukaryonti sches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YIp (yeast integra- ting plasmids)- Vektoren, replizierende YRp (yeast replicon plasmids)- Vektoren und episomale YEp (yeast episomal plasmids)- Vektoren erfolgen Näheres hierzu ist beispielsweise in S M Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschriebenExpression of recombinant LL-16 is possible not only in prokaryotic microorganisms but also in eukaryotes (such as, for example, CHO cells, yeast or insect cells). The yeast system or insect cells is preferred as the eukaryotic expression system. Expression in yeast can be via three types of yeast vectors (integrating YIp (yeast integrating plasmids) - vectors, replicating YRp (yeast replicon plasmids) - vectors and episomal YEp (yeast episomal plasmids) - vectors take place. Details on this are described, for example, in SM Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryonti sehe Wirts¬ zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemaßes LL-16-Polypeptιd codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert Eine solche Wirtszelle enthalt üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsaurevektor, vorzugsweise einen DNA- Vektor, eine Plasmid-DNA welche diese Nukleinsäure enthalt Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist humanes Interleukin- 16 oder Interleukin- 16 aus Primaten, vorzugsweise humanes LL-16 mit verbesserter Aktivität, wie es als Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression im wesentlichen frei von anderen Human¬ proteinen erhältlich ist. LL-16 ist ein Protein, welches monomer oder als Multimer bestehend aus monomerem LL-16 (im weiteren auch ais Untereinheiten bezeichnet) vorkommt. Das Molekulargewicht einer monomeren LL-16-Untereinheit beträgt vorzugsweise 13,9-39 kD, besonders bevorzugt 15-35 kD. Weiter bevorzugt ist ein monomeres LL-16-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 15-30 kD, welches nicht in weitere Untereinheiten aufspaltbar ist.Another object of the invention is a prokaryotic or eukaryotic host cell which is transformed or transfected with a nucleic acid which codes for an LL-16 polypeptide according to the invention in such a way that the host cell expresses said polypeptide. Such a host cell usually contains one biologically functional nucleic acid vector, preferably a DNA vector, a plasmid DNA which contains this nucleic acid The invention furthermore relates to human interleukin-16 or interleukin-16 from primates, preferably human LL-16 with improved activity, as is obtainable as a product of prokaryotic or eukaryotic expression essentially free of other human proteins. LL-16 is a protein which occurs as a monomer or as a multimer consisting of monomeric LL-16 (hereinafter also referred to as subunits). The molecular weight of a monomeric LL-16 subunit is preferably 13.9-39 kD, particularly preferably 15-35 kD. A monomeric LL-16 polypeptide with a molecular weight of 15-30 kD, which cannot be split into further subunits, is further preferred.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein¬ säure und Proteinsequenz von LL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein LL-16-Fragment mit nicht-natürlichem N-Terminus. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterscheidet und/oder mindestens vergleichbare, vorzugsweise verbesserte Akti¬ vität und Immunogenität zeigt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß natürliches unpro- zessiertes bzw. noch nicht sekretiertes LL-16 entgegen der bisherigen Annahme ein größeres Protein mit einem Molekulargewicht von 13,9-39 kD ist. Seine Sequenz ist in den Sequenz¬ protokollen enthalten.Surprisingly, it has been shown that the nucleic acid and protein sequence of LL-16 described in WO 94/28134 do not correspond to the natural human sequences. This is just an LL-16 fragment with a non-natural N-terminus. For therapeutic use, however, it is preferred to use a protein which is either identical to the natural protein or differs only slightly from the natural protein and / or shows at least comparable, preferably improved activity and immunogenicity. Surprisingly, it was found that natural unprocessed or not yet secreted LL-16, contrary to the previous assumption, is a larger protein with a molecular weight of 13.9-39 kD. Its sequence is contained in the sequence records.
Die Nukleinsäuresequenz von LL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Vorzugsweise ist ein Teil des 5'-Endes in der Größenordnung von 20-240, vorzugsweise 20-90 Codons, vorzugsweise 20-50 Codons, besonders bevorzugt ca. 35, 75, 234, 237 oder 239 Codons deletiert. Ein von einer solchen Nukleinsäure codiertes LL-16 (monomere Form, Untereinheit) hat dann ein Molekulargewicht von ca. 13,9-39 kD. Diese monomere Form von LL-16 kann in einer bevorzugten Ausführungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche mul- timeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen.The nucleic acid sequence of LL-16 can receive deletions, mutations and additions within the scope of the invention. Preferably, part of the 5 'end is of the order of 20-240, preferably 20-90 codons, preferably 20-50 codons, particularly preferably approximately 35, 75, 234, 237 or 239 codons deleted. An LL-16 encoded by such a nucleic acid (monomeric form, subunit) then has a molecular weight of approximately 13.9-39 kD. In a preferred embodiment, this monomeric form of LL-16 can be multimerized. This can increase the activity of IL-16. Such multiple forms are preferably dimeric, tetrameric or octameric forms.
In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein¬ heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.In a further embodiment, the polypeptides of the invention can additionally contain a defined content of metal ions, the number of metal ions per subunit preferably being 0.5 to 2.
Als Metallionen im Sinne der Erfindung, die bei der Herstellung der multimeren Formen von LL-16 in definierter Menge zugesetzt werden, sind eine Vielzahl von Metaliionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Calcium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwertig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen wie Cu(II) Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl2, Sr(Nθ3)2, Na2MoO4, AgCl2 oder Cu(II)-Acetat.A large number of metal ions are suitable as metal ions in the sense of the invention, which are added in a defined amount in the preparation of the multimeric forms of LL-16. As has been shown, both alkaline earth metals and elements of the subgroups are suitable. Alkaline earth metals, cobalt, zinc, selenium, manganese, nickel, copper, iron, magnesium, calcium, molybdenum and silver are particularly suitable. The ions can be one, two, three or tetravalent. Divalent ions such as Cu (II) ions are particularly preferred. The ions are preferably added as solutions of MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl 2 , Sr (Nθ3) 2 , Na 2 MoO 4 , AgCl 2 or Cu (II) acetate.
Solche multimeren Formen, deren Herstellung in Gegenwart von Metallionen und metall- ionenhaltige Formen von LL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschriebenSuch multimeric forms, their production in the presence of metal ions and forms of LL-16 containing metal ions are described in German Patent Application No. 195 47 933.5
Das erfindungsgemaße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird Falls die Herstellung des Poly¬ peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly¬ peptid naturlich nicht aus der Zelle isoliert.The polypeptide according to the invention can be prepared by cultivating a prokaryotic or eukaryotic host cell which has been transformed or transfected with a nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 under suitable nutrient conditions and, if appropriate, isolating the desired polypeptide. If the preparation of the polypeptide in If a gene therapy treatment is to take place in vivo, the polypeptide is of course not isolated from the cell.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemaßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Tragermittel enthaltAnother object of the invention is a pharmaceutical composition which contains a polypeptide according to the invention in an amount and / or specific activity sufficient for therapeutic use and optionally a pharmaceutically suitable diluent, adjuvant and / or carrier
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo¬ gischen Zustanden, die durch virale Repiikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur¬ sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind ebenfalls in der WO 94/28134 sowie der WO 96/31607 beschrieben. In letzterer sind auch diagnosti¬ sche Testverfahren beschriebenThe polypeptides according to the invention are particularly suitable for the treatment of pathological conditions which are caused by viral replication, in particular retroviral replication, and for immunomodulation. Such therapeutic applications are also described in WO 94/28134 and WO 96/31607. Diagnostic test methods are also described in the latter
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk¬ tion der THQ und/oder TH] und TH2 Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dem¬ nach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulatori- sche Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunitat. Als EL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/ Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispiels- weise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Transplantatab- stoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumatischen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Polypeptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantatabstoßungen ver¬ wendet werdenThe polypeptides according to the invention can preferably be used for immunosuppression. This immunosuppression is preferably carried out by inhibiting the helper function of the THQ and / or TH] and TH2 cells. The polypeptides according to the invention are accordingly of therapeutic value in all diseases in which an immune-regulatory component is postulated in the pathogenesis, in particular hyperimmunity. Diseases such as myocarditis, endocarditis and pericarditis can be considered as EL-16-treatable diseases in cardiology / angiology, for example in pulmonology wise bronchitis, asthma, in hematology autoimmune Europe and transplant rejection, in gastroenterology chronic gastritis, in endocrinology diabetes mellitus type I, in nephrology glomerulonephritis, diseases in the rheumatic type, diseases in ophthalmology, in neurology, such as multiple sclerosis , in dermatology eczema. In particular, the polypeptides according to the invention can be used in autoimmune diseases, allergies and to avoid transplant rejections
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemaßen Nuklein¬ säuren im Rahmen der Gentherapie Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale VektorsystemeAnother object of the invention is the use of the nucleic acids according to the invention in the context of gene therapy. Vector systems suitable for this are, for example, retroviral or non-viral vector systems
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-LL-16- Antikorper oder ein immunoaktives Fragment davon sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von LL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Saugerzellmaterial Mit LL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsge¬ maßen Polypeptid, welches vorzugsweise im wesentlichen der Sequenz Aminosäuren 1-244 aus SEQ LD NO 1/2 entspricht und welches an ein solches Peptid bindet Vorzugsweise wird ein Antikörper verwendet, der nicht an das Polypeptid der Sequenz Aminosäuren 245-374 aus SEQ LD NO 1/2 bindet Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fach¬ mann gelaufigen Verfahren durchgeführtAnother object of the invention is a polyclonal or monoclonal anti-LL-16 antibody or an immunoactive fragment thereof and methods for producing such antibodies and their use for the determination of LL-16 and for the determination of viral infections in eukaryotic cells and in particular in Suction cell material. LL-16 can also be used to determine virus-activated mammalian cells, in particular T cells. The production of such antibodies is carried out by immunization with a polypeptide according to the invention, which preferably corresponds essentially to the sequence amino acids 1-244 from SEQ LD NO 1/2 and which binds to such a peptide. An antibody is preferably used which does not bind to the polypeptide of the sequence amino acids 245-374 from SEQ LD NO 1/2. The production of such an antibody is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art
Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin¬ dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreibenThe following examples and publications as well as the sequence listing explain the invention, the scope of protection of which results from the patent claims. The methods described are to be understood as examples which also describe the subject matter of the invention even after modifications
Beispiel 1example 1
Klonierung, Expression und Reinigung von IL-16Cloning, Expression and Purification of IL-16
1.1 RNA Isolierung1.1 RNA isolation
5 x lO^PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 μg/ml Concanavalin A und 180 U/ml LL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslosung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 1) wurde das Lysat 15 min auf Eis gehalten Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufallen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 μl H2O gelost Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 μg5 x 10 ^ PBMC (from humans or monkeys) were cultivated for 48 hours with 10 μg / ml concanavalin A and 180 U / ml LL-2. To produce the RNA, the cells were washed once with PBS and then with 5 ml of denaturing solution (RNA isolation kit, Stratagene) lysed After addition of 1 ml of Na acetate, 5 ml of phenol and 1 ml of chloroform / isoamyl alcohol (24 l), the lysate was kept on ice for 15 min. The aqueous phase was then mixed with 6 ml of isopropanol to precipitate the RNA and Stored for 2 hours at -20 ° C. The precipitate was finally washed once with pure ethanol and dissolved in 150 μl H2O. The yield was determined photometrically and was 120 μg
1.2 cDNA Synthese1.2 cDNA synthesis
Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 μg RNA, 0,2 μg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 μl "bulk first Strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 μl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur spateren Verwendung gelagertThe mixture for the cDNA synthesis contained 10 μg RNA, 0.2 μg oligo-dT, 13 mM DTT and 5 μl “bulk first strand reaction mix” (first-strand cDNA synthesis kit, Pharmacia) in an amount of 15 μl. The mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then stored at -20 ° C for later use
Amplifikation, Klonierung von LL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der WO 96/31607 beschrieben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen Für die Reinigung nach Beispiel 3 ist eine N-terminale Verlängerung um mehrere Histidinreste erforderlichAmplification, cloning of LL-16 cDNA and production of an expression clone are carried out as described in WO 94/28134 or WO 96/31607, taking into account the changed sequences. For the purification according to Example 3, an N-terminal extension by several histidine residues is required
Beispiel 2Example 2
10 I Fermentation eines E. coli Expressionsklons für LL-16 und Hochdruckaufschluß10 l fermentation of an E. coli expression clone for LL-16 and high pressure digestion
Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu¬ ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden Das Ubenmpfvolumen in die nächst¬ höhere Dimension betragt jeweils 1-10 Voi -% Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetztPre-cultures are prepared from stock cultures (plate smear or ampoules stored at -20 ° C), which are shaken and incubated at 37 ° C. The volume in the next higher dimension is 1-10% by volume. For selection against plasmid loss, in advance - and main culture Ampicillin (50-100 mg / l) used
Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusatzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch vertraglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed- batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt Die Fermentations¬ temperatur betragt 25-37°C Über Beluftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosage- geschwindigkeit wird der geloste Sauerstoffpartialdruck (pθ2) < 20% gehaltenEnzymatically digested protein and / or yeast extract as the N and C source and glycerol and / or glucose as the additional C source are used as nutrients. The medium is buffered to pH 7 and metal salts are added in physiologically acceptable concentrations to stabilize the fermentation process. The fermentation is carried out as a feed batch with a mixed yeast extract / C-source dosage. The fermentation temperature is 25-37 ° C. The aeration rate, speed control and dosage rate keep the dissolved oxygen partial pressure (pθ2) <20%
Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt Mittels LPTG wird die Expression des LL-16 induziert Nach einer Fermentationsdauer von ca 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.The growth is determined by determining the optical density (OD) at 528 nm. The expression of the LL-16 is induced by means of LPTG. After a fermentation period of approx. 10 hours, the biomass is harvested by centrifugation when the OD is at a standstill. The biomass is taken up in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA 100 mM sodium chloride, pH 7 and digested on a continuous high pressure press at 1000 bar. The suspension thus obtained is centrifuged off again and the supernatant, which contains the dissolved IL-16, is processed further.
Beispiel 3Example 3
Reinigung von rekombinantem humanem LL-16Purification of recombinant human LL-16
550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl2> pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und anschließend 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel-Chelat-Sepharose-Säule (V=60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 μMol NiCl2/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert wor¬ den war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das LL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imidazol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2* 0,5 1 Gradientenvolu¬ men) eluiert. LL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und ver¬ einigt.550 ml of digestion supernatant in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.2 were mixed with 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl 2> pH 8.0, 30 min. stirred and then 30 min. centrifuged at 20,000 g. 400 ml of the supernatant were applied to a nickel-chelate-Sepharose column (V = 60 ml; Pharmacia), which was previously loaded with 30 μmol NiCl 2 / ml gel and with 50 mM sodium phosphate, 0.2 M NaCl, pH 8, 0 had been equilibrated. The column was then rinsed with 300 ml of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.0 and the LL-16 fusion protein then with a gradient of 0 M to 300 mM imidazole, pH 7.0 in 50 mM sodium phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.0 (2 * 0.5 1 gradient volume) eluted. Fractions containing LL-16 were identified by SDS-PAGE and combined.
300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 1 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün¬ nung mit H2O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von LL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. LL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, vereinigt und die LL-16-Identität über Massenanalyse und N-terminale Sequenzanalyse bestätigt.300 mg of the fusion protein thus obtained were dialyzed at 4 ° C. against 20 1 20 mM imidazole, pH 5.5 and then for 30 minutes to remove turbidity. centrifuged at 20,000 g. The supernatant from the centrifugation was then adjusted to pH 8.5 with NaOH, 0.3 mg of thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. The gap was then adjusted to pH 6.5 with HCl and the conductivity was adjusted to 1.7 mS by dilution with H 2 O. The sample was applied to a Q-Sepharose FF column (45 ml; Pharmacia), which had previously been equilibrated with 20 mM imidazole, pH 6.5. LL-16 was eluted with a gradient of 0 to 0.3 M NaCl in 20 mM imidazole, pH 6.5. Fractions containing LL-16 were identified by SDS-PAGE, pooled and the LL-16 identity confirmed by mass analysis and N-terminal sequence analysis.
Das so erhaltene LL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein¬ heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min. eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 μl betrug 1,5 bis 15 μg Protein. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4x180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0, 1% TFA in H2O) inner¬ halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.The LL-16 obtained in this way had a purity of more than 95% in SDS-PAGE under reducing conditions. The analytical Superdex 75 FPLC column (Pharmacia) was treated with 25 mM Na phosphate, 0.5 M NaCl, 10% glycerol, pH 7.0 and a flow rate of 1 ml / min. eluted. The amount of protein applied in a volume of 100 to 150 μl was 1.5 to 15 μg protein. The detection took place at 220 nm. A Vydac, Protein & Peptide C18, 4x180 mm column was used for purity analysis using RP-HPLC. Elution is carried out by a linear gradient from 0% to 80% B (solvent B: 90% acetonitrile in 0.1% TFA; solvent A: 0.1% TFA in H2O) within 30 min. with a flow rate of 1 ml / min. The detection took place at 220 nm.
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WO 92/20703WO 92/20703
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Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166 Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166
SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
ALLGEMEINE ANGABEN:GENERAL INFORMATION:
(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:
(A) NAME: Bundesrepublik Deutschland vertreten durch den Bundesminister fuer Gesundheit(A) NAME: Federal Republic of Germany represented by the Federal Minister of Health
(B) STRASSE: -(B) ROAD: -
(C) ORT: Bonn(C) LOCATION: Bonn
(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-54108(F) POSTAL NUMBER: D-54108
(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-116(B) ROAD: Sandhofer Str. 112-116
(C) ORT: Mannheim(C) LOCATION: Mannheim
(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-68305(F) POSTAL NUMBER: D-68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Polypeptide mit IL-16-Aktιvitaet, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung(ii) DESCRIPTION OF THE INVENTION: Polypeptides with IL-16 activity, process for their preparation and use
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 12(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 12
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:(iv) COMPUTER READABLE VERSION:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk(A) DISK: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30B (EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:(vi) DATA OF THE URN REGISTRATION:
(A) ANMELDENUMMER: DE 195 48 295.6(A) REGISTRATION NUMBER: DE 195 48 295.6
(B) ANMELDETAG: 22-DEC-1995(B) REGISTRATION DAY: 22-DEC-1995
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:(vi) DATA OF THE URN REGISTRATION:
(A) ANMELDENUMMER: DE 196 03 492.2(A) REGISTRATION NUMBER: DE 196 03 492.2
(B) ANMELDETAG: 31-JAN-1996(B) REGISTRATION DAY: JAN 31, 1996
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:(vi) DATA OF THE URN REGISTRATION:
(A) ANMELDENUMMER: DE 196 13 866.3(A) REGISTRATION NUMBER: DE 196 13 866.3
(B) ANMELDETAG: 06-APR-1996(B) REGISTRATION DAY: APR 06, 1996
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:(vi) DATA OF THE URN REGISTRATION:
(A) ANMELDENUMMER: DE 196 13 886.8(A) REGISTRATION NUMBER: DE 196 13 886.8
(B) ANMELDETAG: 06-APR-1996(B) REGISTRATION DAY: APR 06, 1996
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 1178 Basenpaare(A) LONG: 1178 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Doppelstrang(C) STRAND FORM: double strand
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) MERKMAL:(ix) FEATURE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS(A) NAME / KEY: CDS
(B) LAGE:54..1178(B) LOCATION: 54..1178
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
TTCCTCGAGA GCTGTCAACA CAGGCTGAGG AATCTCAAGG CCCAGTGCTC AAG ATG 56TTCCTCGAGA GCTGTCAACA CAGGCTGAGG AATCTCAAGG CCCAGTGCTC AAG ATG 56
Met 1Met 1
CCT AGC CAG CGA GCA CGG AGC TTC CCC CTG ACC AGG TCC CAG TCC TGT 104 Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser Cys 5 10 15CCT AGC CAG CGA GCA CGG AGC TTC CCC CTG ACC AGG TCC CAG TCC TGT 104 Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser Cys 5 10 15
GAG ACG AAG CTA CTT GAC GAA AAG ACC AGC AAA CTC TAT TCT ATC AGC 152 Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser 20 25 30GAG ACG AAG CTA CTT GAC GAA AAG ACC AGC AAA CTC TAT TCT ATC AGC 152 Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser 20 25 30
AGC CAA GTG TCA TCG GCT GTC ATG AAA TCC TTG CTG TGC CTT CCA TCT 200 Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser 35 40 45AGC CAA GTG TCA TCG GCT GTC ATG AAA TCC TTG CTG TGC CTT CCA TCT 200 Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser 35 40 45
TCT ATC TCC TGT GCC CAG ACT CCC TGC ATC CCC AAG GAA GGG GCA TCT 248 Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser 50 55 60 65TCT ATC TCC TGT GCC CAG ACT CCC TGC ATC CCC AAG GAA GGG GCA TCT 248 Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser 50 55 60 65
CCA ACA TCA TCA TCC AAC GAA GAC TCA GCT GCA AAT GGT TCT GCT GAA 296 Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala GluCCA ACA TCA TCA TCC AAC GAA GAC TCA GCT GCA AAT GGT TCT GCT GAA 296 Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu
70 75 8070 75 80
ACA TCT GCC TTG GAC ACA GGG TTC TCG CTC AAC CTT TCA GAG CTG AGA 344 Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg 85 90 95ACA TCT GCC TTG GAC ACA GGG TTC TCG CTC AAC CTT TCA GAG CTG AGA 344 Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg 85 90 95
GAA TAT ACA GAG GGT CTC ACG GAA GCC AAG GAA GAC GAT GAT GGG GAC 392 Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp 100 105 110GAA TAT ACA GAG GGT CTC ACG GAA GCC AAG GAA GAC GAT GAT GGG GAC 392 Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp 100 105 110
CAC AGT TCC CTT CAG TCT GGT CAG TCC GTT ATC TCC CTG CTG AGC TCA 440 His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser 115 120 125CAC AGT TCC CTT CAG TCT GGT CAG TCC GTT ATC TCC CTG CTG AGC TCA 440 His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser 115 120 125
GAA GAA TTA AAA AAA CTC ATC GAG GAG GTG AAG GTT CTG GAT GAA GCA 488 Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala 130 135 140 145GAA GAA TTA AAA AAA CTC ATC GAG GAG GTG AAG GTT CTG GAT GAA GCA 488 Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala 130 135 140 145
ACA TTA AAG CAA TTA GAC GGC ATC CAT GTC ACC ATC TTA CAC AAG GAG 536 Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys GluACA TTA AAG CAA TTA GAC GGC ATC CAT GTC ACC ATC TTA CAC AAG GAG 536 Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu
150 155 160150 155 160
GAA GGT GCT GGT CTT GGG TTC AGC TTG GCA GGA GGA GCA GAT CTA GAA 584 Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu 165 170 175GAA GGT GCT GGT CTT GGG TTC AGC TTG GCA GGA GGA GCA GAT CTA GAA 584 Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu 165 170 175
AAC AAG GTG ATT ACG GTT CAC AGA GTG TTT CCA AAT GGG CTG GCC TCC 632 Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser 180 185 190AAC AAG GTG ATT ACG GTT CAC AGA GTG TTT CCA AAT GGG CTG GCC TCC 632 Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser 180 185 190
CAG GAA GGG ACT ATT CAG AAG GGC AAT GAG GTT CTT TCC ATC AAC GGC 680 Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly 195 200 205CAG GAA GGG ACT ATT CAG AAG GGC AAT GAG GTT CTT TCC ATC AAC GGC 680 Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly 195 200 205
AAG TCT CTC AAG GGG ACC ACG CAC CAT GAT GCC TTG GCA ATC CTC CGC 728 Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg 210 215 220 225AAG TCT CTC AAG GGG ACC ACG CAC CAT GAT GCC TTG GCA ATC CTC CGC 728 Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg 210 215 220 225
CAA GCT CGA GAG CCC AGG CAA GCT GTG ATT GTC ACA AGG AAG CTG ACT 776 Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu ThrCAA GCT CGA GAG CCC AGG CAA GCT GTG ATT GTC ACA AGG AAG CTG ACT 776 Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr
230 235 240230 235 240
CCA GAG GCC ATG CCC GAC CTC AAC TCC TCC ACT GAC TCT GCA GCC TCA 824 Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser 245 250 255CCA GAG GCC ATG CCC GAC CTC AAC TCC TCC ACT GAC TCT GCA GCC TCA 824 Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser 245 250 255
GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACA GCA GAG GCC ACA 872 Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr 260 265 270GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACA GCA GAG GCC ACA 872 Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr 260 265 270
GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG CTG GGC TTC AGC 920 Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser 275 280 285GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG CTG GGC TTC AGC 920 Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser 275 280 285
CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG CCT CTC ACC ATT 968 Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile 290 295 300 305CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG CCT CTC ACC ATT 968 Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile 290 295 300 305
AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAA AGT GAG ACA GTC CAG 1016 Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val GinAAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAA AGT GAG ACA GTC CAG 1016 Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val Gin
310 315 320310 315 320
CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC ATG CAG GGC CTC 1064 Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly Leu 325 330 335CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC ATG CAG GGC CTC 1064 Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly Leu 325 330 335
ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG CCT GAT GGA CCT 1112 Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro 340 345 350ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG CCT GAT GGA CCT 1112 Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro 340 345 350
GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC AAG GAA ACC ACA 1160 Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr Thr 355 360 365GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC AAG GAA ACC ACA 1160 Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr Thr 355 360 365
GCT GCT GGA GAC TCC TAG 1178GCT GCT GGA GAC TCC DAY 1178
Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 375 Aminosäuren(A) LENGTH: 375 amino acids
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein(ii) MOLECULE TYPE: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
Met Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser 1 5 10 15Met Pro Ser Gin Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gin Ser 1 5 10 15
Cys Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile 20 25 30Cys Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile 20 25 30
Ser Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro 35 40 45Ser Ser Gin Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala 50 55 60Ser Ser Ile Ser Cys Ala Gin Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala 50 55 60
Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala 65 70 75 80Ser Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala 65 70 75 80
Glu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu LeuGlu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu
85 90 9585 90 95
Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly 100 105 110Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly 100 105 110
Asp His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser 115 120 125Asp His Ser Ser Leu Gin Ser Gly Gin Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser 115 120 125
Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu 130 135 140Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu 130 135 140
Ala Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys 145 150 155 160Ala Thr Leu Lys Gin Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys 145 150 155 160
Glu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp LeuGlu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu
165 170 175165 170 175
Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala 180 185 190Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala 180 185 190
Ser Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn 195 200 205Ser Gin Glu Gly Thr Ile Gin Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn 195 200 205
Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu 210 215 220Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu 210 215 220
Arg Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala AlaArg Gin Ala Arg Glu Pro Arg Gin Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala
245 250 255245 250 255
Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala 260 265 270Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala 260 265 270
Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe 275 280 285Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe 275 280 285
Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr 290 295 300Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr 290 295 300
Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val 305 310 315 320Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gin Ser Glu Thr Val 305 310 315 320
Gin Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin GlyGin Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gin Leu Gly Gly Thr Ala Met Gin Gly
325 330 335325 330 335
Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly 340 345 350Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly 340 345 350
Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr 355 360 365Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gin Ser Lys Glu Thr 355 360 365
Thr Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375Thr Ala Ala Gly Asp Ser * 370 375
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 7 Aminosäuren(A) LONG: 7 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(il) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:(Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala 1 5Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala 1 5
[2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:[2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 4:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 6 Aminosäuren(A) LONG: 6 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:(il) TYPE OF MOLECULE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Arg Lys Leu Thr Pro Glu 1 5Arg Lys Leu Thr Pro Glu 1 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 5 Aminosäuren(A) LONG: 5 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(il) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5
Arg Lys Leu Thr Pro 1 5Arg Lys Leu Thr Pro 1 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:(1) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 4 Aminosäuren(A) LONG: 4 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(il) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
Arg Lys Leu Thr 1Arg Lys Leu Thr 1
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 7:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren(A) LENGTH: 3 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(11) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:(11) MOLECULE TYPE: Peptide (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
Arg Lys Leu 1Arg Lys Leu 1
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 8:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 7 Aminosäuren(A) LONG: 7 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
Leu Thr Pro Glu Ala Met Pro 1 5Leu Thr Pro Glu Ala Met Pro 1 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 9:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 6 Aminosäuren(A) LONG: 6 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
Leu Thr Pro Glu Ala Met 1 5Leu Thr Pro Glu Ala Met 1 5
[ 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:[2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 5 Aminosäuren(A) LONG: 5 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:
Leu Thr Pro Glu Ala 1 5 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:Leu Thr Pro Glu Ala 1 5 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren(A) LENGTH: 4 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:
Leu Thr Pro GluLeu Thr Pro Glu
11
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren(A) LENGTH: 3 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:(Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:
Leu Thr Pro 1 Leu Thr Pro 1

Claims

PatentansprücheClaims
Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin- 16- Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure im für das genannte Polypeptid codierenden BereichNucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity can be achieved in a prokaryotic or eukaryotic host cell, said nucleic acid in the region coding for said polypeptide
a) der DNA-Sequenz Nukleotide 54-1175 SEQ ID NO 1 oder ihrem komplementä¬ ren Strang entspricht, b) hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit der DNA der Sequenz Nukleotide 54-785 aus SEQ ID NO.l, c) hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz Nukleotide 786-1175 aus SEQ ID NO 1 und am 5'-Ende mit der DNA-Sequenz Nukleotide 756-786 aus SEQ DD NO 1 oder einem Teil davon beginnt, der für einen Teil der Sequenz Aminosäure 235-244 aus SEQ ID NO 1 codiert, oder d) eine Nukleinsäuresequenz ist, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den durch a) und b) definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren wurdea) corresponds to the DNA sequence nucleotides 54-1175 SEQ ID NO 1 or its complementary strand, b) hybridizes under stringent conditions with the DNA of the sequence nucleotides 54-785 from SEQ ID NO.1, c) hybridizes under stringent conditions begins with the DNA sequence nucleotides 786-1175 from SEQ ID NO 1 and at the 5 'end with the DNA sequence nucleotides 756-786 from SEQ DD NO 1 or a part thereof, which is part of the sequence amino acid 235-244 from SEQ ID NO 1, or d) is a nucleic acid sequence which would hybridize under stringent conditions without the degeneration of the genetic code to the nucleic acid sequences defined by a) and b)
Nukleinsäure nach Anspruch 1, die Interleukin- 16 von Primaten codiertThe nucleic acid of claim 1 encoding primate interleukin-16
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, welche mit einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 1 oder 2 so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiertProkaryotic or eukaryotic host cell which is transformed or transfected with a nucleic acid according to claims 1 or 2 in such a way that the host cell expresses said polypeptide
Biologisch funktioneller Nukleinsaurevektor, der eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 enthaltBiologically functional nucleic acid vector containing a nucleic acid according to claim 1 or 2
Polypeptid mit EL- 16- Aktivität, welches von einer Nukleinsäure codiert wird, welchePolypeptide with EL-16 activity which is encoded by a nucleic acid which
a) der DNA-Sequenz Nukleotide 54-1175 SEQ ID NO 1 oder ihrem komplementä¬ ren Strang entspricht, b) hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit der DNA der Sequenz Nukleotide 54-785 aus SEQ ID NO 1, c) hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz Nukleotide 786- 1175 aus SEQ ID NO 1 und am 5'-Ende mit der DNA-Sequenz Nukleotide 756- 786 aus SEQ ID NO 1 oder einem Teil davon beginnt, der für einen Teil der Sequenz Aminosäure 235-244 aus SEQ ID NO 1 codierta) corresponds to the DNA sequence nucleotides 54-1175 SEQ ID NO 1 or its complementary strand, b) hybridizes under stringent conditions with the DNA of the sequence nucleotides 54-785 from SEQ ID NO 1, c) hybridizes with stringent conditions with the DNA sequence nucleotides 786-1175 from SEQ ID NO 1 and at the 5 'end with the DNA sequence nucleotides 756- 786 starts from SEQ ID NO 1 or a part thereof which codes for a part of the sequence amino acid 235-244 from SEQ ID NO 1
Polypeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es gegenüber naturlich vor¬ kommendem humanem IL-16 eine verbesserte Aktivität und ein Molekulargewicht von 13,9-39 kD in der monomeren Form besitztPolypeptide according to claim 5, characterized in that it has an improved activity and a molecular weight of 13.9-39 kD in the monomeric form compared to naturally occurring human IL-16
Polypeptid nach den Ansprüchen 5 oder 6, wie es als Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhaltlich istA polypeptide according to claims 5 or 6 as it is obtainable as a product of prokaryotic or eukaryotic expression essentially free of other human proteins
Polypeptid mit Interleukin- 16- Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Multimeres aus einer definierten Anzahl von Untereinheiten darstellt, wobei das Polypeptid aus den Ansprüchen 5 bis 7 eine Untereinheit istPolypeptide with interleukin-16 activity, characterized in that it is a multimer from a defined number of subunits, the polypeptide from claims 5 to 7 being a subunit
Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 4 bis 32 Untereinhei¬ ten bestehtPolypeptide according to claim 8, characterized in that it consists of 4 to 32 subunits
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nahrbedingungen, gegebenenfalls in Gegenwart von Metallionen, kul¬ tiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wirdProcess for the preparation of a polypeptide according to Claims 5 to 9, characterized in that a prokaryotic or eukaryotic host cell which has been transformed or transfected with a nucleic acid sequence according to Claims 1 or 2 is cultivated under suitable nutritional conditions, if appropriate in the presence of metal ions and the desired polypeptide is isolated if necessary
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach den Ansprüchen 5 bis 9 sowie ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Tragermit¬ tel enthaltPharmaceutical composition containing a polypeptide according to claims 5 to 9 and a pharmaceutically suitable diluent, adjuvant and / or carrier
Antikörper, welcher an den Teil eines Polypeptids mit Interleukin- 16- Aktivität bindet, welches von der Sequenz Aminosäure 1-244 aus SEQ ID NO 1 dargestellt istAntibody which binds to the part of a polypeptide with interleukin-16 activity, which is represented by the sequence amino acid 1-244 from SEQ ID NO 1
Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er nicht in wesentlichem Umfang an ein Polypeptid der Sequenz Aminosäure 245-374 aus SEQ ID NO 1 bindetAntibody according to claim 12, characterized in that it does not bind to a substantial extent to a polypeptide of the sequence amino acid 245-374 from SEQ ID NO 1
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Interleukin- 16 nach den Ansprüchen 5 bis 9 in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge Pharmaceutical composition containing interleukin-16 according to claims 5 to 9 in an amount sufficient for therapeutic use
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