DE19649233A1

DE19649233A1 - Nucleic acid encoding interleukin-16 polypeptide

Info

Publication number: DE19649233A1
Application number: DE1996149233
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-11-28
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 1998-06-04

Abstract

A nucleic acid encoding an interleukin-16 (IL-16) polypeptide (amino acid sequence given below), optionally C-terminally truncated by <= 8 amino acids, is new. Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser. Also claimed are: (1) a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the nucleic acid; (2) a vector containing the nucleic acid; (3) primate IL-16 that is a product of eukaryotic expression of the nucleic acid and is free of other human proteins; (4) a human IL-16 polypeptide encoded by the nucleic acid, and (5) a method for producing an antibody against an IL-16 polypeptide, comprising immunising a mammal with an immunogen containing the first 3-20 amino acids of the above sequence as a hapten.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel lung und ihre Verwendung. Die Erfindung beschreibt prozessiertes IL-16 mit hoher Aktivität.The invention relates to polypeptides with IL-16 activity, processes for their preparation treatment and its use. The invention describes processed IL-16 with high activity.

IL-16 (Interleukin-16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 sowie von Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer mo lekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsiebchromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), wird die "chemoattractant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattractant activity" und die von Baier beschrie bene Aktivität von rekombinantem humanem IL-16 sind jedoch sehr gering.IL-16 (Interleukin-16) is a lymphokine, which is also called "lymphocyte chemoattracting factor "(LCF) or" immunodeficiency virus suppressing lymphokine "(ISL) is called. IL-16 and its properties are described in WO 94/28134, the international patent application PCT / EP96 / 01486 and by Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 and by Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563. There is also that recombinant production of IL-16 described. Thereafter, IL-16 is a protein with a mo molecular mass of 13.385 D. Cruikshank also found that ISL is in a Molecular sieve chromatography as a multimeric form with a molecular weight of 50-60 or 55-60 kD eluted. This multimeric form, which is a cationic homotetramer (Product information AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), the attributed to "chemoattractant activity". Baier developed a homodimeric form of IL-16 with a molecular weight of 28 kD. The by Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 described "chemoattractant activity" and that described by Baier However, the level of activity of recombinant human IL-16 is very low.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von IL-16 zu verbessern und IL-16- Formen bereitzustellen, die geringe Immunogenität zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti sche Anwendung geeignet sind.The object of the present invention is to improve the activity of IL-16 and IL-16 To provide forms that show low immunogenicity and advantageous for a therapeuti suitable application.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 codiert.The object of the invention is achieved by a nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity in a prokaryotic or eukaryotic Host cell can be achieved, said nucleic acid for a polypeptide with the Amino acid sequence SEQ ID NO: 2 encoded.

Eine solche Nukleinsäure codiert ein prozessiertes Polypeptid mit IL-16-Aktivität, besonders bevorzugt natürliches IL-16 von Primaten, wie humanes IL-16 oder IL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z. B. Maus. Such a nucleic acid encodes a processed polypeptide with IL-16 activity, particularly preferably natural IL-16 from primates, such as human IL-16 or IL-16 of a monkey species or another mammal, e.g. B. mouse.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Fig. 2 der WO 94/28134 nicht das korrekt prozessierte IL-16 beschreibt. Das Startcodon "ATG" der precursor-Form des Proteins beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54 oder 174. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Die Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich z. B. um Nukleotidaustausche (313 Gin A, 717 C in A). Bei der Expression in eukaryontischen Zellen wird IL-16 prozessiert. Dabei entsteht ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2. Die Kenntnis des prozessierten IL-16 erlaubt die Herstellung von IL-16 und Derivaten mit hoher Aktivität und geringer Immunogenität.It has surprisingly been found that FIG. 2 of WO 94/28134 does not describe the correctly processed IL-16. The start codon "ATG" of the precursor form of the protein does not begin with nucleotide 783, but with nucleotide 54 or 174. This reading frame results when an A is inserted after nucleotide 156, a C after nucleotide 398 and a G after nucleotide 780. The sequence shows still further differences from FIG. 2 of WO 94/28134. It is e.g. B. nucleotide exchanges (313 Gin A, 717 C in A). When expressed in eukaryotic cells, IL-16 is processed. This creates a polypeptide according to SEQ ID NO: 2. Knowledge of the processed IL-16 allows the production of IL-16 and derivatives with high activity and low immunogenicity.

IL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Amino säureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz von IL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2. Varianten von Teilen der Amino- und Nuklein säuresequenz SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO:2 sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 und den deutschen Patentanmeldungen Nr. 195 48 295.6 und 195 47 933.5 beschrieben. Wesentlich ist jedoch, daß die Polypeptide einen korrekten N-Terminus besitzen. Bevorzugt sind demnach Proteine, in denen die ersten drei bis zehn Aminosäuren des N-Terminus unverändert sind. Ebenfalls bevorzugt sind Proteine, die am C-Terminus um bis zu 8 Aminosäuren verkürzt sind.IL-16 can differ in its sequence from the protein encoded by such DNA sequences distinguish sequences to a certain extent. Such sequence variations can be amino acid exchanges, deletions or additions. Preferably the amino acid sequence is of IL-16, however, is at least 75%, particularly preferably at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Variants of parts of the amino and nuclein acid sequence SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2 are for example in the international Patent application PCT / EP96 / 01486 and German patent applications No. 195 48 295.6 and 195 47 933.5. It is essential, however, that the polypeptides are correct Possess N-terminus. Accordingly, proteins in which the first three to ten are preferred Amino acids of the N-terminus are unchanged. Also preferred are proteins that are on C-terminus are shortened by up to 8 amino acids.

Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nukleinsäu rederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsäure-Analoga sind solche Verbin dungen, bei denen das Zuckerphosphatgerüst durch andere Einheiten, wie z. B. Aminosäuren, ersetzt ist. Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben. Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA-Bindungen sind, sind die nachstehend beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybridisierung nicht anwendbar. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschrieben.For the purposes of the invention, nucleic acids include, for example, DNA, RNA and nucleic acid understand rederivate and analogues. Such nucleic acids are preferred nucleic acid analogs dungen, in which the sugar phosphate structure by other units such. B. amino acids, is replaced. Such compounds are referred to as PNA and are described in WO 92/20702 described. For example, since PNA-DNA bonds are stronger than DNA-DNA bonds, are the stringent conditions for PNA-DNA hybridization described below not applicable. Suitable hybridization conditions are, however, in WO 92/20703 described.

Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-16 zu verstehen. Vorzugsweise zeigt IL-16 in dem in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zell teilung gemäß WO 94/28134. For the purposes of the invention, the expression "IL-16" is a polypeptide with the activity of To understand IL-16. Preferably IL-16 shows that in the international patent application PCT / EP96 / 01486 test methods described the effect or stimulates the cell division according to WO 94/28134.

IL-16 bindet an CD4⁺ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren. Die Funktion von IL-16 ist nicht durch seine Präsenta tion im MIIC-Komplex limitiert.IL-16 binds to CD4⁺ lymphocytes and can replicate viruses such as Suppress HIV-1, HIV-2 and SIV. The function of IL-16 is not through its presenta limited in the MIIC complex.

Insbesondere zeigt IL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
In particular, IL-16 exhibits one or more of the following properties:

Binding to T cells via the CD4 receptor,
- Stimulation of the expression of IL-2 receptor and / or HLA-DR antigen on CD4⁺ lymphocytes,
Stimulation of the proliferation of T helper cells in the presence of IL-2,
- Suppression of the proliferation of T-stimulated with anti-CD3 antibodies Helper cells,
- Suppression of replication of viruses, preferably HIV-1, HIV-2 or SIV.

Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit Nukleinsäuren der Sequenz SEQ ID NO: 1 hybridisieren. Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäurefragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 × SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 × SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 × SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 × SSC bei 50°C für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Stringenz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.Preference is given to nucleic acids which, under stringent conditions, with nucleic acids Hybridize sequence SEQ ID NO: 1. The expression "under stringent conditions hybridize "means that two nucleic acid fragments under standardized Hybridization conditions hybridize with one another, as described for example in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Such conditions are, for example, hybridization in 6.0 × SSC at about 45 ° C., followed by one Wash step at 2 × SSC at 50 ° C. To select the stringency, the salt concentration in the Washing step, for example, between 2.0 × SSC at 50 ° C. for low stringency and 0.2 × SSC at 50 ° C for high stringency. In addition, the temperature of the im Washing step between room temperature, approx. 22 ° C, for low stringency and 65 ° C for high Stringency can be varied.

IL- 16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden. IL-16 preferably becomes recombinant in prokaryotic or eukaryotic host cells produced. Such manufacturing processes are described, for example, in WO 94/28134 and the international patent application PCT / EP96 / 01486, which is also the subject of Disclosures of the present invention. However, to the forms of the invention of IL-16 must be defined and obtained reproducibly by recombinant production additional methods known to those skilled in the art for recombinant production Measures are taken.

Die Herstellung von rekombinantem IL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho den als heterologe Expression oder als homologe Expression (nach homologer Rekombination der IL16 Nukleinsäure ins Genom des Wirtsorganismus) erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von IL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur IL-16- Sequenz Regulator-Elemente, die zur Expression der DNA-Sequenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die IL-16-Sequenz und die Regulator-Elemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von IL-16 zu exprimieren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und IL-16 gewon nen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiä re Struktur einnehmen kann, in der es IL-16-Eigenschaften zeigt.The production of recombinant IL-16 can be carried out according to the method known to the person skilled in the art as heterologous expression or as homologous expression (after homologous recombination the IL16 nucleic acid into the genome of the host organism). To do this, a DNA, which is able to produce a protein that the activity of Owns IL-16. The DNA is cloned into a vector that transfers to a host cell can be replicated there. Such a vector contains in addition to the IL-16 Sequence regulator elements required for expression of the DNA sequence. This Vector that contains the IL-16 sequence and the regulatory elements is converted into a vector transferred, which is able to express the DNA of IL-16. The host cell is under Conditions suitable for amplification of the vector were cultivated and IL-16 won nen. Suitable measures ensure that the protein is an active tertiary can assume a structure in which it shows IL-16 properties.

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:
The nucleic acid sequence of the protein can also be modified. Such modifications are, for example:

- Change the nucleic acid to different recognition sequences from Restriction enzymes to facilitate the steps of ligation, cloning and To introduce mutagenesis
- Change the nucleic acid to incorporate preferred codons for the Host cell
- Supplementation of the nucleic acid with additional operator elements to the express sion in the host cell.

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro karyonten, und dort in E. coli. Die Expression in Prokaryonten führt zu einem unglycosylier ten Polypeptid.The protein is preferably expressed in microorganisms, in particular in Pro caryotes, and there in E. coli. Expression in prokaryotes leads to an unglycosylation th polypeptide.

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ_PL Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433). Ebenso geeignet sind ge koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986)113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusätzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).The expression vectors must contain a promoter which allows expression of the protein in the host organism. Such promoters are known to the person skilled in the art and are, for example, lac promoter (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp promoter (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ _PL promoter ( Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) and T5 promoter (U.S. Patent No. 4,689,406). Synthetic promoters such as, for example, tac promoter (US Pat. No. 4,551,433) are also suitable. Coupled promoter systems such as, for example, T7 RNA polymerase / promoter system (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113) are also suitable. Hybrid promoters comprising a bacteriophage promoter and the operator region of the microorganism are also suitable (EP-A 0 267 851). An effective ribosome binding site is required in addition to the promoter. For E. coli, this ribosome binding site is referred to as the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende der für IL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990)161-166).To improve expression, it is possible to express the protein as a fusion protein In this case, a DNA sequence is usually used, which is for the N-terminal part an endogenous bacterial protein or other stable protein, at the 5 'end of the sequence coding for IL-16 fused. Examples include lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z. B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Weitere Beispiele für Spaltstellen sind die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698) und die Enterokinase-Spaltstelle.After expression of the vector, preferably a biologically functional plasmid or of a viral vector, the fusion proteins are preferably treated with enzymes (e.g. factor Xa) cleaved (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Other examples of cleavage sites are the IgA protease cleavage site (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), the ubiquitin cleavage site (Miller et al., Bio / Technology 7 (1989) 698) and the enterokinase cleavage site.

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.The proteins expressed in this way in bacteria are digested by the bacteria and protein isolation in the usual way.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für IL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J.3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 7212). In a further embodiment it is possible to select the proteins as active proteins from the To secrete microorganisms. A fusion product is preferably used for this, which from the signal sequence used for the secretion of proteins in the host organisms is suitable, and the nucleic acid which codes for the protein. The Protein is either in the medium (for gram-positive bacteria) or in the peri plasmatic space (in Gram-negative bacteria) secreted. Between the signal sequence and the sequence coding for IL-16 is suitably a cleavage site ent the protein is not split off either during processing or in an additional step allowed. Such signal sequences originate, for example, from ompA (Ghrayeb et al., EMBO J.3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw. T)-Resten. Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981)107-127).The vectors also contain terminators. Terminators are DNA sequences which signal the end of a transcription process. They are usually characterized by two structural peculiarities: an inversely repetitive G / C-rich region, the intramolecular can form a double helix and a number of U (or T) residues. Examples are the Main terminator in the DNA of phage fd (Beck and Zink, Gene 16 (1981) 35-58) as well rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).

Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Ebenso geeignete selektier bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not wendigen Stoffen wie z. B. Histidin, Tryptophan und Leucin.In addition, the expression vectors usually contain a selectable marker, um to select transformed cells. Such selectable markers are, for example Resistance genes for ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, kanamycin, neomycin and Tetracycline (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Also suitable selection bare markers are the genes for essential substances of the biosynthesis of cells manoeuvrable fabrics such as B. histidine, tryptophan and leucine.

Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056).A variety of suitable bacterial vectors are known. For example, for described the following bacterial vectors: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans and Streptomyces lividans (U.S. Patent No. 4,747,056).

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto ren sind in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. beschrieben.Other genetic engineering processes for the production and expression of suitable vectors Ren are in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. described.

Eine Expression von rekombinanter IL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YIp (yeast integra ting plasmids)-Vektoren, replizierende YRP (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YEP (yeast episomal plasmids)-Vektoren) erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben. Expression of recombinant IL-16 is except in prokaryotic microorganisms also possible in eukaryotes (such as CHO cells, yeast or insect cells). As eukaryotic expression system, the yeast system or insect cells is preferred. The Expression in yeast can be via three types of yeast vectors (integrating YIp (yeast integra ting plasmids) vectors, replicating YRP (yeast replicon plasmids) vectors and episomal YEP (yeast episomal plasmids) vectors). More information on this can be found, for example, in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryontische Wirts zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemäßes IL- 16-Polypeptid codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert. Eine solche Wirtszelle enthält üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsäurevektor, vorzugsweise einen DNA-Vektor, eine Plasmid-DNA, welche diese Nukleinsäure enthält.Another object of the invention is a prokaryotic or eukaryotic host cell, which with a nucleic acid, which for an IL-16 polypeptide according to the invention is encoded, transformed or transfected in such a way that the host cell contains said polypeptide expressed. Such a host cell usually contains a biologically functional one Nucleic acid vector, preferably a DNA vector, a plasmid DNA, these Contains nucleic acid.

Weiter bevorzugt ist ein monomeres IL-16-Polypeptid, welches nicht in weitere Untereinhei ten aufspaltbar ist.Also preferred is a monomeric IL-16 polypeptide that does not fall into other subunits is split.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein säure und Proteinsequenz von IL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein nicht natürliches IL-16-Analoges. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterschei det und/oder mindestens vergleichbare Aktivität und Immunogenität zeigt. Die Sequenz des Proteins ist in SEQ ID NO:2 beschrieben.It has surprisingly been found that the nuclein described in WO 94/28134 acid and protein sequence of IL-16 do not correspond to the natural human sequences. This is just a non-natural IL-16 analog. For a therapeutic Application, however, it is preferred to use a protein that is either with the natural protein is identical or differs only slightly from the natural protein det and / or shows at least comparable activity and immunogenicity. The sequence of the Protein is described in SEQ ID NO: 2.

Die Nukleinsäuresequenz von IL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Die monomere Form von IL-16 kann in einer bevorzugten Ausfüh rungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche multimeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen.In the context of the invention, the nucleic acid sequence of IL-16 can be deletions, mutations and get additions. The monomeric form of IL-16 can be in a preferred embodiment be multimerized. This can increase the activity of IL-16. Such multimeric forms are preferably dimeric, tetrameric or octameric forms.

In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.In a further embodiment, the polypeptides of the invention can additionally have one contain defined content of metal ions, the number of metal ions per subunit unit is preferably 0.5 to 2.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Kalzium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwer tig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr(NO₃)₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.A large number of metal ions are suitable as metal ions in the sense of the invention. As has been shown, both alkaline earth metals and elements of the subgroups are suitable. Alkaline earth metals, cobalt, zinc, selenium, manganese, nickel, copper, iron, magnesium, calcium, molybdenum and silver are particularly suitable. The ions can be one, two, three or four-valued. Divalent ions are particularly preferred. The ions are preferably added as solutions of MgCl ₂ , CaCl ₂ , MnCl ₂ , BaCl ₂ , LiCl ₂ , Sr (NO ₃ ) ₂ , Na ₂ MoO ₄ , AgCl ₂ .

Solche multimeren Formen und metallionenhaltige Formen von IL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschrieben. Such multimeric forms and forms of IL-16 containing metal ions are in German Patent application No. 195 47 933.5.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird. Falls die Herstellung des Poly peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly peptid natürlich nicht aus der Zelle isoliert.The polypeptide according to the invention can be produced in that a prokaryotic or eukaryotic host cell which has a nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 is transformed or transfected, is cultivated under suitable nutrient conditions and optionally isolating the desired polypeptide. If the production of the poly peptide is to be carried out in vivo as part of a gene therapy treatment, the poly peptide is of course not isolated from the cell.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel enthält.Another object of the invention is a pharmaceutical composition containing a Polypeptide according to the invention in a sufficient for a therapeutic application Amount and / or specific activity and optionally a pharmaceutically suitable one Contains diluent, adjuvant and / or carrier.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo gischen Zuständen, die durch virale Replikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschrieben. Hierin sind ebenfalls auch diagnostische Testverfahren beschrieben.The polypeptides according to the invention are particularly suitable for the treatment of patholo conditions caused by viral replication, especially retroviral replication are gentle, and for immune modulation. Such therapeutic applications are in the international patent application PCT / EP96 / 01486. Here are also also diagnostic test procedures described.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk tion der TH₀ und/oder TH₁ und/oder TH₂ Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind demnach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulato rische Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunität. Als IL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispielsweise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Trans plantatabstoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumati schen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Poly peptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantat abstoßungen verwendet werden.The polypeptides according to the invention can preferably be used for immunosuppression. This immunosuppression is preferably carried out by inhibiting the helper function of the TH ₀ and / or TH ₁ and / or TH ₂ cells. The polypeptides according to the invention are accordingly of therapeutic value in all diseases in which an immune-regulating component is postulated in the pathogenesis, in particular hyperimmunity. Diseases such as myocarditis, endocarditis and pericarditis can be considered as IL-16-treatable diseases in cardiology / angiology, in pulmonology, for example, bronchitis, asthma, in hematology autoimmune Europe and transplant rejection, in gastroenterology, chronic gastritis, in endocrinology, diabetes mellitus type I, in nephrology glomerulonephritis, diseases in the rheumatic form, diseases in ophthalmology, in neurology, such as multiple sclerosis, in dermatology eczema. In particular, the poly peptides according to the invention can be used in autoimmune diseases, allergies and to avoid transplant rejections.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nuklein säuren im Rahmen der Gentherapie. Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale Vektorsysteme. Another object of the invention is the use of the nuclein according to the invention acids in the context of gene therapy. Suitable vector systems for this are, for example retroviral or non-viral vector systems.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-IL-16- Antikörper oder ein immunoaktives Fragment davon, welcher an die ersten 3-20 Aminosäuren von SEQ ID NO:2 bindet, sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von IL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Säugerzellmaterial. Mit IL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsge mäßen Polypeptid. Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt, durch Immunisierung mit einem Immunogen, welches die ersten 3-20 Aminosäuren von SEQ ID NO:2 als Hapten enthält. Anschließend kann der Antikörper aus dem immunisierten Säugetier in üblicher Weise gewonnen werden und gegebenenfalls ein monoklonaler Antikörper hergestellt werden.Another object of the invention is a polyclonal or monoclonal anti-IL-16 Antibody or an immunoactive fragment thereof which is linked to the first 3-20 Amino acids of SEQ ID NO: 2 binds, as well as methods for the production of such Antibodies and their use for the determination of IL-16 as well as for the determination of viral infections in eukaryotic cells and especially in mammalian cell material. With IL-16 can also be used to determine virus-activated mammalian cells, especially T cells. Antibodies of this type are produced by immunization with an inventive method moderate polypeptide. The preparation of such an antibody is according to the expert common procedures carried out by immunization with an immunogen which the contains first 3-20 amino acids of SEQ ID NO: 2 as hapten. Then the Antibodies can be obtained from the immunized mammal in a conventional manner and if necessary, a monoclonal antibody can be produced.

Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.The following examples and publications as well as the sequence listing explain the Erfin tion, the scope of which results from the patent claims. The described Processes are to be understood as examples, which are the subject even after modifications describe the invention.

example 1 Cloning, Expression and Purification of IL-16 1.1 RNA isolation

5×10⁷PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 U/ml IL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 : 1) wurde das Lysat 15 min. auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufallen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.5 × 10 ⁷ PBMC (from humans or monkeys) were cultivated for 48 hours with 10 μg / ml concanavalin A and 180 U / ml IL-2. To produce the RNA, the cells were washed once with PBS and then lysed with 5 ml of denaturing solution (RNA isolation kit, Stratagene). After adding 1 ml of Na acetate, 5 ml of phenol and 1 ml of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), the lysate was 15 min. kept on ice. The aqueous phase was then mixed with 6 ml of isopropanol to precipitate the RNA and stored at -20 ° C. for 2 hours. The precipitate was finally washed once with pure ethanol and dissolved in 150 μl H ₂ O. The yield was determined photometrically and was 120 µg.

1.2 cDNA synthesis

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl "bulk first strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 µl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert. The mixture for the cDNA synthesis contained 10 μg RNA, 0.2 μg oligo-dT, 13 mM DTT and 5 µl "bulk first strand reaction mix" (first strand cDNA synthesis kit, Pharmacia) in a quantity of 15 µl. The mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then stored at -20 ° C for later use.

1.3 Expression clone

Amplifikation, Klonierung von IL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschrieben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen.Amplification, cloning of IL-16 cDNA and production of an expression clone are carried out as in WO 94/28134 or international patent application PCT / EP96 / 01486 described, taking into account the changed sequences.

Als Vorwärtsprimer wird ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ H) NO:3 verwendet, der eine EcoRI site, 6 His und eine Enterokinase-Spaltstelle (D₄K) enthält:
An oligonucleotide of the sequence SEQ H) NO: 3 is used as the forward primer, which contains an EcoRI site, 6 His and an enterokinase cleavage site (D ₄ K):

Als reverse primer werden entweder Oligonukleotid IL-16-R₁ (SEQ ID) NO:4):
Either oligonucleotide IL-16-R ₁ (SEQ ID) NO: 4) is used as the reverse primer:

oder Oligonukleotid IL-16-R₂ (SEQ ID) NO:5) verwendet:
or oligonucleotide IL-16-R ₂ (SEQ ID) NO: 5):

Die beiden reverse primer enthalten BamHI und HindIII Schnittstellen zur Klonierung.The two reverse primers contain BamHI and HindIII cloning sites.

Mit IL-16-R₁ wird eine Sequenz erhalten, welche für ein Protein gemäß SEQ ID NO:2 codiert.With IL-16-R ₁ a sequence is obtained which codes for a protein according to SEQ ID NO: 2.

Mit IL-16-R₂ wird eine Sequenz erhalten, welche für ein um 8 Aminosäuren am C-Terminus verkürztes IL-16 codiert. Dieses C-terminale IL-16 ist ebenfalls aktiv.With IL-16-R ₂ a sequence is obtained which codes for an IL-16 shortened by 8 amino acids at the C-terminus. This C-terminal IL-16 is also active.

Die PCR-Reaktion, Klonierung und Herstellung des Expressionsklons (Fusionsprotein mit N-terminalem Poly-His-Anteil zur Aufreinigung) erfolgen nach Standardbedingungen:
The PCR reaction, cloning and production of the expression clone (fusion protein with N-terminal poly-His portion for purification) are carried out according to standard conditions:

0,2 mM dNTP Mix, je 1 pmol/µl forward und reverse Primer, 1 × high fidelity buffer (Boehringer Mannheim, D), 1,5 mM MgCl2, 2.6 U high fidelity enzyme mix (Boehringer Mannheim, D).
20 µl Endvolumen
Maschine: Perkin Elmer GeneAmp 9600
Reaktionsverlauf:
3 min 94°C, 1 min 56°C, 2 min 72°C, dann 25 Zyklen (20 sec 94°C, 20 sec 56°C, 1 min 72°C) 0.2 mM dNTP mix, 1 pmol / µl forward and reverse primer, 1 × high fidelity buffer (Boehringer Mannheim, D), 1.5 mM MgCl2, 2.6 U high fidelity enzyme mix (Boehringer Mannheim, D).
20 µl final volume
Machine: Perkin Elmer GeneAmp 9600
Reaction process:
3 min 94 ° C, 1 min 56 ° C, 2 min 72 ° C, then 25 cycles (20 sec 94 ° C, 20 sec 56 ° C, 1 min 72 ° C)

Example 2 10 l fermentation of an E. coli expression clone for IL-16 and high pressure digestion

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden. Das Überimpfvolumen in die nächst höhere Dimension beträgt jeweils 1-10 Vol.-%. Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt.Pre-cultivation is made from stock cultures (plate smear or ampoules stored at -20 ° C) are prepared, which are shaken and incubated at 37 ° C. The vaccination volume in the next higher dimension is 1-10 vol .-% in each case. For selection against plasmid loss, in Pre- and main culture ampicillin (50-100 mg / l) used.

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt. Die Fermentations temperatur beträgt 25-37°C. Über Belüftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosagege schwindigkeit wird der gelöste Sauerstoffpartialdruck (pO₂) < 20% gehalten.Enzymatically digested protein and / or yeast extract as the N and C source and glycerol and / or glucose as the additional C source are used as nutrients. The medium is buffered to pH 7 and metal salts are added in physiologically acceptable concentrations to stabilize the fermentation process. The fermentation is carried out as a feed batch with a mixed yeast extract / C source dosage. The fermentation temperature is 25-37 ° C. The dissolved oxygen partial pressure (pO ₂ ) is kept <20% via the ventilation rate, speed control and dosing speed.

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt. Mittels IPTG wird die Expression des IL-16 induziert. Nach einer Fermentationsdauer von ca. 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.The growth is determined by determining the optical density (OD) at 528 nm. Means IPTG induces the expression of IL-16. After a fermentation period of approx. The biomass is harvested by centrifugation for 10 hours with the OD at a standstill. The biomass is taken up in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM sodium chloride, pH 7 and opened up via a continuous high pressure press at 1000 bar. The so obtained Suspension is centrifuged again and the supernatant, which contains the dissolved IL-16, becomes processed further.

Example 3 Purification of recombinant human IL-16

550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und an schließend 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel- Chelat-Sepharose-Säule (V=60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 µMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das IL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imida zol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2× 0,5 l Gradientenvolumen) eluiert. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. 550 ml of digestion supernatant in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.2 were mixed with 55 ml of 5 M NaCl, 60 mM MgCl ₂ , pH 8.0, 30 min. stirred and then 30 min. centrifuged at 20,000 g. 400 ml of the supernatant were applied to a nickel-chelate-Sepharose column (V = 60 ml; Pharmacia), which was previously loaded with 30 μmol NiCl ₂ / ml gel and with 50 mM sodium phosphate, 0.2 M NaCl, pH 8, 0 had been equilibrated. The column was then rinsed with 300 ml of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.0 and the IL-16 fusion protein then with a gradient of 0 M to 300 mM imidazole, pH 7.0 in 50 mM sodium phosphate , 0.1 M NaCl, pH 7.0 (2 × 0.5 l gradient volume) eluted. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and pooled.

100 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 l 50 mM Tris/HCl, pH 8,0 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit 0,1 mg Enterokinase (Novagen) versetzt und 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdünnung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (8 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von IL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von IL-16 wurde durch Massenanalyse und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die UV-Absorption von IL-16 bei 280 nm (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) verwendet.100 mg of the fusion protein thus obtained were dialyzed at 4 ° C. against 20 l of 50 mM Tris / HCl, pH 8.0 and then for 30 minutes to remove turbidity. centrifuged at 20,000 g. The supernatant from the centrifugation was then mixed with 0.1 mg enterokinase (Novagen) and incubated for 5 hours at 37 ° C. The gap was then adjusted to pH 6.5 with HCl and the conductivity was adjusted to 1.7 mS by dilution with H ₂ O. The sample was applied to a Q-Sepharose FF column (8 ml; Pharmacia) which had previously been equilibrated with 20 mM imidazole, pH 6.5. IL-16 was eluted with a gradient of 0 to 0.3 M NaCl in 20 mM imidazole, pH 6.5. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and pooled. The identity of IL-16 was confirmed by mass analysis and automated N-terminal sequence analysis. The UV absorption of IL-16 at 280 nm (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) was used to determine the concentration.

Das so erhaltene IL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min. eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 µl betrug 1,5 bis 15 µg Protein. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.The IL-16 thus obtained was pure on SDS-PAGE under reducing conditions of more than 95%. The analytical Superdex 75 FPLC column (Pharmacia) was used 25 mM Na phosphate, 0.5 M NaCl, 10% glycerol, pH 7.0 and a flow rate of 1 ml / min. eluted. The amount of protein applied in a volume of 100 to 150 ul was 1.5 to 15 µg protein. The detection took place at 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4×180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H₂O) inner halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.A Vydac, Protein & Peptide C18, 4 × 180 mm column was used for purity analysis using RP-HPLC. Elution is carried out by a linear gradient from 0% to 80% B (solvent B: 90% acetonitrile in 0.1% TFA; solvent A: 0.1% TFA in H ₂ O) within 30 min. with a flow rate of 1 ml / min. The detection took place at 220 nm.

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SEQUENCE LOG

Claims

1. Nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity can be achieved in a prokaryotic or eukaryotic host cell, whereby said nucleic acid for a polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or for a polypeptide with a truncated by up to 8 amino acids at the C-terminus Sequence encoded according to SEQ ID NO: 2.

2. Nucleic acid according to claim 1, which encodes interleukin-16 of primates.

3. Prokaryotic or eukaryotic host cell, which with a nucleic acid after claims 1 or 2 is transformed or transfected so that the host cell expressed polypeptide expressed.

4. Biologically functional nucleic acid vector which is a nucleic acid according to claim or contains 2.

5. Interleukin-16 from primates as it is the product of a eukaryotic expression of a Nucleic acid according to claim 1 or 2 substantially free of other human protein is available.

6. Human Interleukin-16 as it is the product of a eukaryotic expression of a Nucleic acid according to claim 1 or 2 after processing essentially free of other human proteins is available.

7. Polypeptide with interleukin-16 activity, which is encoded by a nucleic acid according to claims 1 or 2.

8. polypeptide with interleukin-16 activity according to claim 7, characterized in that that it represents a multimer of a defined number of subunits, where the polypeptide of claim 7 is a subunit.

9. Polypeptide according to claim 8, characterized in that it consists of 4 to 32 subunits ten exists.

10. Polypeptide according to claims 7 to 9, characterized in that it defines one contains the content of metal ions, the number of metal ions per subunit Is 0.5 to 2.

11. A method for producing a polypeptide according to claims 7 to 10, characterized characterized in that a prokaryotic or eukaryotic host cell with a Nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 is transformed or transfected, is cultivated under suitable nutrient conditions and against the desired polypeptide is also isolated.

12. A pharmaceutical composition comprising a polypeptide according to claims 5 to 10 and a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant and / or carrier contains tel.

13. Pharmaceutical composition containing a polypeptide according to the claims 5-10 in an amount sufficient for therapeutic use.

14. Method for producing an antibody against a polypeptide with interleukin-16 Activity, characterized in that a mammal with an immunogen which the contains first 3-20 amino acids of SEQ ID NO: 2 as hapten, is immunized and the antibody is then obtained from the mammal.