EP0399024A1 - ANTI-INTERLEUKINE 1$g(a) AND 1$g(b) MONOCLONAL ANTIBODIES, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND APPLICATIONS OF SAID ANTIBODIES TO THE DETECTION OF INTERLEUKINES 1$g(a) AND 1$g(b) AND TO THERAPY - Google Patents

ANTI-INTERLEUKINE 1$g(a) AND 1$g(b) MONOCLONAL ANTIBODIES, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND APPLICATIONS OF SAID ANTIBODIES TO THE DETECTION OF INTERLEUKINES 1$g(a) AND 1$g(b) AND TO THERAPY

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EP0399024A1
EP0399024A1 EP90900216A EP90900216A EP0399024A1 EP 0399024 A1 EP0399024 A1 EP 0399024A1 EP 90900216 A EP90900216 A EP 90900216A EP 90900216 A EP90900216 A EP 90900216A EP 0399024 A1 EP0399024 A1 EP 0399024A1
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EP
European Patent Office
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antibodies
ache
antibody
monoclonal antibodies
monoclonal
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Withdrawn
Application number
EP90900216A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Yveline Frobert
Jacques Grassi
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
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Definitions

  • the present invention relates to anti-interleukin monoclonal antibodies, and in particular anti-interleukin 1 ⁇ and 1 ⁇ antibodies, to their production process, to anti-interleukin 1 ⁇ and 1 ⁇ / acetylcholinesterase monoclonal antibody conjugates, to enzymo-immunometric tests (EIA) for detecting and quantifying interleukins 1a and 1 ⁇ using said antibodies and / or conjugates and for various other applications of said antibodies and / or conjugates, in particular for therapeutic applications.
  • EIA enzymo-immunometric tests
  • Lymphokines are powerful pharmacological agents which result from the interaction between lymphocytes and the specific antigen which sensitizes them; they can modify, induce or suppress the functions of many cell types; they also play an essential role during inflammatory reactions and in the phenomena of bone resorption, fibrosis and chemotaxis. In addition, they are involved in the control of hematopoiesis and the regulation of immune responses. Lymphokines are produced by T cells, however it is known that some of them such as interleukin-1 can be produced by non-leukocyte cells.
  • Interleukin-1 (cf. IMMUNOLOGY, Jeanêt BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3rd Edition 1986) is a mediator which constitutes a biological signal for the presentation of the antigen associated with the histotope, which marks the monocyte-T lymphocyte cooperation.
  • the activity of IL-1 is traditionally measured in a proliferation test of mouse thymocytes C3H / HeJ (resistant to LPS) in the presence of PHA (I ⁇ g / ml). In the absence of IL-1, the thymocytes stimulated by the PHA are blocked in the Go / G1 phase. They can however divide if interleukin-2 is added, which suggests that the main action of IL-1 is the induction of interleukin-2 synthesis.
  • Human IL-1 is a glycoprotein with a molecular weight estimated at 18 kDa, with a major contaminant at 15 kDa.
  • two peptide fractions of molecular weights 2 and 4 kDa which exhibit the biological activity of IL-1 were isolated from normal urine.
  • IL-1 appears to be produced by a wide variety of cell types excluding T cells, such as monocytes, macrophages, keratinocytes, astrocytes, melanocytes, mesangial cells, B lymphoblasts.
  • T cells such as monocytes, macrophages, keratinocytes, astrocytes, melanocytes, mesangial cells, B lymphoblasts.
  • IL-1 participates in the activation of B cells, stimulates the proliferation of fibroblasts and synoviocytes, raises the body temperature by acting on thermoregulatory centers and induces the production of proteins of inflammation by hepatocytes.
  • An IL-1 gene encoding a precursor of 270 amino acids has recently been cloned. Plasmids containing this gene induce the production of a carboxy-terminal peptide of 156 amino acids, having the activities of IL-1. While in the aforementioned reference, the hypothesis of a family of molecules of neighboring structure was put forward, DINARELLO [J. CLIN. IMMUNOL.
  • IL-1 represents an important family of biologically active proteins derived from mononuclear cells, which are involved in inflammatory reactions and in immune responses.
  • Two distinct species of human IL-1 have been identified: IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ [MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641-647]; these two species have the same molecular weight, similar biological effects and the same receptors on target cells [WOOD et al., J. IMMUNOL. (1985),
  • Patent Applications also describe anti-IL-1 ⁇ and / or anti-IL-1 ⁇ antibodies.
  • the OTSUKA PHARMA-CEUTICAL 267 611 European Patent Application describes monoclonal anti-IL-1 ⁇ antibodies and monoclonal anti-IL-1 ⁇ antibodies.
  • the affinity constant of these antibodies is of the order of 3.6 ⁇ 10 -8 M / l.
  • the European Patent Application IMMUNEX 245,052 describes more particularly a method of detecting the inflammation during which IL-1 intervenes, comprising (a) the reaction of a sample of biological fluid possibly containing IL- 1 with a first antibody specific for a first antigenic site characteristic of IL-1 and (b) detecting the reaction between the first antibody and IL-1.
  • the antibodies more particularly described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 15A4) and a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 7B4).
  • the antibodies described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 15A4) and a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 7B4).
  • the antibodies described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with
  • European Patent Application DAINIPPON 220 063 describes an antibody directed against IL-1, said antibody being used in particular in the context of a competitive method or an immunometric method.
  • This antibody only makes it possible, within the framework of these assays, to obtain sensitivities of the order of 0.1 ng / ml for the competitive method and of the order of 0.2 ng / ml for the immunometric method.
  • French Patent No. 83 13389 in the name of the Applicant, has proposed conjugates in which an antibody, an antigen or a hapten is covalently linked to acetylcholinesterase, for the production of enzymoimmunoassays, thanks to the properties of the enzyme, carrying out enzyme assays of very small quantities, of the order of a nanogram.
  • the anti-PS1 monoclonal antibodies present in the supernatants of hybridoma cultures bind to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the corresponding biotinylated component of the PSI; - This biotinylated antigen strongly binds avidin, which itself binds the labeled AChE to biotin; - the activity of the fixed AChE is measured by the colorimetric method of ELLMAN.
  • the Authors have shown that the AChE system significantly improves the detection limits of monoclonal antibodies. This screening method applies perfectly to the quantitative determination of different PS1 polypeptides by competition.
  • the present invention has therefore given itself the aim of providing means suitable for enabling the performance of highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests, of detection and quantification of IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , these means also being capable of therapeutic applications and in vivo diagnostic applications.
  • the subject of the present invention is monoclonal antibodies specific for IL-1 ⁇ and 1 ⁇ , which result from the immunization of mammals, in particular rodents, and more particularly of mice, with IL-1 ⁇ or -1 ⁇ as appropriate, which specifically recognize natural or recombinant IL-1 ⁇ or natural or recombinant IL-1 ⁇ , which show practically no cross-reaction between the two IL-1, characterized in that said monoclonal antibodies have a dissociation constant of less than 5.10 - 10 , in that they consist of several groups which recognize distinct regions of IL-1 ⁇ or -1 ⁇ , in that the antibodies of certain groups are capable of binding in a compatible manner with all the antibodies of the other groups, to know : - anti-IL-1 ⁇ antibodies are made up of three groups (A, B and C) which recognize three distinct regions of interleukin-1 ⁇ , all the antibodies in a group being capable of binding in a compatible manner with all those of the other two groups but not being compatible with another antibody of the same group;
  • - anti-IL-1 ⁇ antibodies are made up of four groups (A, B, C and D), the first two (A and B) having a behavior similar to that of anti-IL-1 ⁇ antibodies, including group antibodies C are compatible with a single antibody from each of the first two groups and whose antibodies from the fourth group (D) are incompatible with any of the antibodies from the first three groups, and do not bind to the recombinant native IL-1 ⁇ , recognize a modified interleukin-1 ⁇ , and react with an IL-1 ⁇ -AChE conjugate;
  • anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ antibodies recognize the IL-1 ⁇ or 1 ⁇ / acetylcholinesterase (AChE) conjugates.
  • the monoclonal antibodies specific for interleukins-1 ⁇ and 1 ⁇ are obtained from mammals such as, in particular, rodents, and more particularly mice, which are immunized by appropriate injections of interleukin- 1 ⁇ or -1 ⁇ , then spleen cells of immunized mammals are fused, according to an appropriate technique, with mammalian myeloma cells of the same species, the resulting hybridomas are cultured and those in the supernatants of which were detected anti-interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ antibodies, as the case may be, are subcloned to obtain cell lines secreting anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies or anti-IL-1 ⁇ , according to the interleukihe against which they were directed.
  • the interleukin-1 ⁇ or -1 ⁇ used to immunize the abovementioned mammals can be both a purified natural interleukin and a recombinant interleukin.
  • hybridomas used to obtain the anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies in accordance with the invention were the subject of a deposit dated December 8, 1988 with the NATIONAL COLLECTION OF CULTURES OF MICROORGANISMS (CNCM) held by the INSTITUT PASTEUR.
  • the deposited hybridomas are identified by the following numbers: I-823, I-824, I-825, I-826, I- 827, 1-828, 1-829.
  • the present invention also relates to conjugates of acetylcholinesterase and of anti-IL-1 ⁇ or -1 ⁇ monoclonal antibodies or of fragments of these antibodies, in particular of Fab 'fragments.
  • the present invention further relates to a process for producing Fab 'fragments of anti-interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ monoclonal antibodies in accordance with the present invention.
  • said monoclonal antibodies are treated with pepsin in an acid medium, to obtain fragments F (ab ') 2 which are isolated by chromatography on a molecular sieve, then these fragments F (ab') 2 are subjected to a controlled reduction process, by an appropriate reducing agent such as, in particular, ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA), to provide a Fab 'fragment which is purified by passage through a column chromatography column.
  • an appropriate reducing agent such as, in particular, ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA)
  • the present invention also relates to a method for producing AChE conjugates and anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies and AChE conjugates and fragments of said monoclonal antibodies, in particular Fab 'fragments , which is characterized in that at least one incorporated or natural thiol group- ment present in the antibody or one of its fragments, is coupled to at least one maleimido group incorporated in AChE, via an appropriate coupling agent such as, in particular, an ester of N-succinimide such as N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
  • an appropriate coupling agent such as, in particular, an ester of N-succinimide such as N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
  • the present invention further relates to enzyme immunoassays by competition for the detection of Il-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in cell culture supernatants and in biological fluids, characterized in that a monoclonal antibody anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ according to the invention, used as first antibody, and IgG, carried by an appropriate solid support, used as second antibody, are brought into contact with conjugates of IL-1 -AChE, which play the role of tracers, and of interleukin-1-1 ⁇ or -1 ⁇ , after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
  • the present invention also relates to highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests for the detection of Il-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in cell culture supernatants and biological fluids, characterized in that antibodies monoclonal (mAb) anti-IL-1 ⁇ and / or anti-IL-1 ⁇ according to the invention and carried by an appropriate support, are brought into contact with IL-1 ⁇ or -1 ⁇ and with the Acm-AChE conjugate , after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
  • mAb monoclonal
  • IL-1 ⁇ or -1 ⁇ is added to the antibody simultaneously with the conjugate Acm-AChE and the two monoclonal antibodies react simultaneously with IL-1 ⁇ or - 1 ⁇ .
  • the IL-1 ⁇ or -1 ⁇ is first introduced and reacts with the antibody, then the Acm-AChE conjugate is then introduced and the activity
  • AChE is revealed by any appropriate means.
  • the suitable supports are in particular microtiter plates or supports in the form of particles allowing the fixing of said antibodies.
  • the subject of the present invention is, moreover, a kit for carrying out immunoenzymatic tests by competition in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
  • At least one bottle containing appropriate doses of anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibody and / or anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibody;
  • the present invention also relates to a kit for carrying out the enzymo-immunometric tests in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
  • the present invention further relates to agents for therapeutic purposes, characterized in that they consist of, or comprise as active constituents, anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies and / or anti-IL antibodies -1 ⁇ and / or their fragments, co to the invention, alone or conjugated or hybrid or associated with other substances.
  • a particularly advantageous therapeutic application of said anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies is their activity of inhibiting IL-1.
  • the present invention also relates to diagnostic agents capable of being used for in vivo diagnosis, characterized in that they comprise anti-IL-1 ⁇ antibodies and / or anti-IL-1 ⁇ antibodies or their fragments , associated with an antigen and / or a hapten and / or another antibody or antibody fragment, and / or labeled with stable or radioactive labels.
  • FIG. 4 the in vitro release of IL-1 ⁇ ( ⁇ , ⁇ ) and IL-1 ⁇ ( ⁇ , ) established by specific EIAs in the supernatants of unstimulated human monocytes, lymphocytes and neutrophils ( ⁇ , ⁇ ) and stimulated by LPS ( ⁇ , ), purified by centrifugal elutriation.
  • EXAMPLE 1 Implementation of the tests in accordance with the invention; preparation of reagents (monoclonal antibodies and conjugates) and reagent selection parameters.
  • the acetylcholinesterase (AChE) obtained from the electric eel Electrophorus electricus was purified by affinity chromatography by the method described by MASSOULIE and BON [Eur. J. BIOCHEM (1976), 68, pages 531-539].
  • the tetrameric form of the enzyme, or G4 form has been used to label interleukins and antibodies.
  • AChE activity was measured using the colorimetric method of ELLMAN et al. [BIOCHEM. PHARM. (1961), 7, pages 88-95].
  • An ELLMAN unit is defined as the quantity of enzyme producing an increase in absorbance of 1 DO at 25 ° C, for 1 minute, in 1 ml of medium and for an optical step length of 1 cm; it corresponds to approximately 8 ng of enzyme and to 7.32 enzymatic units (one enzymatic unit corresponds to the quantity of enzyme which hydrolyzes 1 ⁇ mol of acetylcholine at 25 ° C. for 1 minute).
  • AChE concentrations were determined enzymatically using a catalytic constant of 4.4 x 10 7 moles h -1 per site and a molecular mass of 80 kDa for the catalytic subunit.
  • a detection limit of 1.8 attomole (10 -18 mole) of enzyme can be calculated for the G4 form (i.e. the amount of AChE which produces an increase in absorbance of 0.01 DO for 1 hour, in 20 ⁇ l of ELLMAN medium, for a step length of 0.5 cm.
  • Anti-interleukin-1 ⁇ and 1- ⁇ antibodies were produced in Biozzi High Responder (HR) mice using the following immunization process: on day 0, 15 ⁇ g of recombinant interleukin la or 1 ⁇ emulsified in Freund's complete adjuvant was injected into the pad of one leg. The mice were treated with aspirin (0.1 mg / day) to avoid side effects such as hyperthermia. A first booster injection (in the pad of a paw) was administered on day 21 and the mice were bled a week later. The presence of murine anti-interleukin antibodies in the corresponding sera was checked by testing their capacity to fix interleukin-1-AChE conjugates.
  • HR Biozzi High Responder
  • mice received an intravenous booster injection (7 ⁇ g of interleukin) 3 and 2 days before the fusion.
  • Corresponding mouse spleen cells were fused with NSI mouse myeloma cells, as described in the article by GRASSI et al. cited in the preamble.
  • the interleukins 1a and 1 ⁇ were covalently coupled to AChE via a heterobifunctional reagent, namely N-succinimidyl-4- (N- maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) using a known technique for labeling bovine acid growth factor (aFGF) and rat pro-lactin.
  • SMCC N-succinimidyl-4- (N- maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • aFGF bovine acid growth factor
  • rat pro-lactin bovine acid growth factor
  • This method involves the reaction of a thiol group (previously introduced into interleukins) with a maleimido group incorporated into the enzyme after the reaction with SMCC.
  • the interleukins were thiolated by reaction of their primary amine groups with N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate (SATA)
  • AChE Maleimido groups were introduced into AChE (form G4) by reaction with SMCC; if not used immediately, the AChE-SMCC preparation can be frozen at -80 ° C and stored without losing its reactive properties, for at least several weeks.
  • the thiolated interleukins were coupled to the preparation of AChE-SMCC (form G4) by mixing the two reagents immediately after they were isolated by molecular sieve chromatography or as soon as they were thawed. At this stage, a molecular ratio (SH-interleukin / G4-SMCC) of 50/1 was used.
  • Monoclonal antibodies have been purified from ascites fluids by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate, according to a technique described in the prior art. The purity of the preparation was checked by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing and reducing conditions. Two different labeling methods were used to couple purified mAbs to AChE.
  • Biotin has been covalently linked to mAbs as defined above by reaction of an activated biotin N-hydroxysuccinimide ester (IBF, France) with the primary amino groups of the antibodies.
  • the activated ester was dissolved in anhydrous dimethylformamide and added to an alkaline solution of the antibody to be labeled: 40 ⁇ l of a 5 mg / ml solution of biotin ester in DMF, to 1 mg of was added.
  • antibody dissolved in 2 ml of 0.1M borate buffer, pH 8.5. After 30 minutes at room temperature, 2 ml of EIA buffer (which will be defined later) was added. This preparation was used to determine the "binding compatibility" of the various mAbs without undergoing further purifications. It was stored frozen at -20oC.
  • Acm Fab 'fragments were covalently coupled to AChE via the SMCC using a technique derived from that described by ISHIKAWA et al. [J. IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327] for labeling antibody fragments with other enzymes.
  • the principle of the method used is very similar to that used to label the interleukins, which has been described above, except that, in the present case, the thiol groups involved in the coupling reaction are naturally present in the Fab 'fragments obtained by reduction of the corresponding F (ab') 2 fragment.
  • Fragments F (ab ′) 2 were obtained by treatment of Acm with pepsin in an acid medium (acetate buffer pH 4.3). They were isolated from the crude preparation treated with pepsin, by chromatography on molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of 0.5 m Biogel equilibrated in 0.1 M phosphate buffer, pH 6, containing 5.10 -3 M EDTA. The purity of fraction F (ab ') 2 was verified by polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing denaturing conditions. These measurements showed that more than 80% of the total protein content was composed of fragments of F (ab ') 2.
  • Fragments F (ab ') 2 were reduced in the presence of 0.1M ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA) at 37 ° C for 1 hour.
  • ⁇ MEA ⁇ -mercaptoethylamine
  • the excess ⁇ MEA was removed by chromatography on a molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of Sephadex G25, as described above for the thiolated interleukins.
  • the concentration of Fab 'fragments was measured by UV spectrometry using the extinction coefficient at 280 nm, 1.48 g - 1 . L cm -1 and as molecular weight 46000.
  • the content of thiol groups in the Fab 'preparation was determined by reaction with DTNB, as for the thiolated interleukins. Depending on the mAb used, values of between 1 and 4 SH groups have been found per molecule of Fab '.
  • AChE form G4
  • SMCC cyclopentadiene carboxylate
  • the coupling of the enzyme with Fab 'fragments was carried out by mixing the AChE-SMCC preparation (immediately after it was isolated by chromatography on molecular sieve or thawed) with an excess of Fab 'fragments. Usually a molar ratio of 50 is used at this stage (i.e. thiol groups of Fab '/ G4-SMCC). After reaction for 3 hours at 30 ° C, the G4-Fab 'conjugates were isolated by chromatography on molecular sieve on a 0.5 m Biogel column.
  • the conjugate was eluted in the form of a single homogeneous peak, the corresponding fraction was collected and stored in the frozen state at -20oC. No significant loss of enzymatic activity was observed during the entire coupling process. The stability of the conjugates proved to be excellent because they could be stored either in the frozen state at -20o C, or in the lyophilized state, or in the liquid state at + 4oC, without losing their enzymatic or immunological properties. . 5. SCREENING OF CULTURE SURNANTANTS:
  • the presence of anti-interleukin-1 antibodies in supernatants of hybridoma cultures was detected using an enzyme immunoassay similar to that described above.
  • the culture supernatants were incubated in microtiter plates coated with a second anti-mouse IgG antibody, together with conjugates of interleukin 1-AChE.
  • the anti-interleukin 1 mAbs optionally present in the supernatants bind simultaneously to the IL-1-AChE conjugate and to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the AChE activity on the plates.
  • the presence of AChE on the solid phase was further revealed (after a washing step) by adding the substrate and measuring by colorimetry.
  • the preparation and characteristics of the second solid phase antibody are well known; 50 ⁇ l of each supernatant present on the microtitration plates comprising 96 wells, were transferred under sterile conditions into microtitration plates of the same dimensions, coated with the second antibody. 50 ⁇ l of conjugate ford interleukin 1-AChE (1 ELLMAN unit / ml) dissolved in EIA buffer were then added and the mixture was allowed to react overnight at + 4 ° C. At the end of this first reaction period, the plates were washed thoroughly before adding 200 ⁇ l of ELLMAN reagent to each well.
  • the binding compatibility of two different mAbs on a single molecule of Interleukin-1 was determined in an immunometric test in which one of the mAbs was immobilized on a solid phase while the other was labeled with biotin molecules .
  • These tests were carried out as follows: all the dilutions were carried out in EIA buffer and 100 ⁇ l of a solution at 100 ng / ml of recombinant interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ were added to wells of microtitration plates coated with one of the Acm. After one hour of reaction at room temperature with stirring, 100 ⁇ l of a 10 ⁇ g / ml solution of another biotin-labeled mAb were added.
  • Monoclonal antibodies from culture supernatants or ascites fluids were first tested in a competitive immunoassay using IL-1-AChE conjugates as tracers.
  • immunometric tests were developed involving the simultaneous use of anti-interleukin mAbs, either coating a solid phase or marked with AChE.
  • All the reagents used in the immunoassay were diluted in the EIA buffer mentioned above, the composition of which is as follows: 0.1 M phosphate, pH 7.6, containing 0.4 M NaCl, 10 -3 M EDTA, 0.1% BSA and 0.01% sodium azide. All the concentrations mentioned in the immunoassays refer to the concentration of the reagents in the "initial volume" (50 ⁇ l for the competition test, 100 ⁇ l for the immunometric test) before mixing with the other reagents.
  • the working dilutions of the mAbs were determined beforehand by carrying out antibody dilution curves from culture supernatants or ascites fluids.
  • Immunometric tests were carried out in microtiter plates comprising 96 wells, coated with one of the monoclonal antibodies. The coating was carried out exactly as described above for the second antibody in solid phase. Briefly, the wells of the microtitration plates were filled with 200 ⁇ l of a 10 ⁇ g / ml solution of mAb dissolved in 5 ⁇ 10 -2 M phosphate buffer, 7.4 mH. After allowing the reaction to occur overnight at room temperature, the plates were washed thoroughly with 10 -2 phosphate buffer, pH 7.4 containing TWEEN 20, 0.05%. The solid phase was then saturated by adding 300 ⁇ l of EIA buffer to each well for at least 4 hours at room temperature. Plates were stored at 4 ° C in this saturation buffer until that they be used. When stored under these conditions, no changes in their fixing properties were observed for at least a period of four months. The immunometric tests were carried out using two different procedures.
  • the first protocol (called “Simultaneous Protocol") consisted in adding 100 ⁇ l of interleukin-1 in solution (introduced in the form of a recombinant standard or a sample) into wells of microtitration plates, together with 100 ⁇ l of Acm-AChE conjugates (usually at a concentration of 10 ELLMAN units / ml).
  • the two antibodies (the solid phase antibody and the antibody labeled with AChE) react simultaneously with interleukin-1.
  • interleukin-1 is dissolved standard recombinant in the corresponding diluent, i.e. culture medium, plasma or serum.
  • AChE fixed to the solid phase was determined by adding 200 ⁇ l of ELLMAN reagent.
  • a second protocol (called “sequential protocol”) consists in reacting interleukin-1 and the Acm-AChE conjugate separately.
  • first incubation period 200 ⁇ l of interleukin-1 (introduced in the form of a standard or sample) dissolved in EIA buffer or any other appropriate diluent (culture medium, plasma, etc.) .) react with the solid phase.
  • EIA buffer or any other appropriate diluent (culture medium, plasma, etc.) .
  • the plates are washed before adding 200 ⁇ l of Acm-AChE conjugate (usually at 10 ELLMANN units / ml) dissolved in EIA buffer.
  • the plates are washed again and the AChE activity is revealed as described above.
  • Standard curves "imprecision profiles" were established by performing all the measurements (non-specific fixation as well as standard measurements) eight times. For each dose, the precision was expressed in terms of coefficient of variation (CV%) and was plotted as a function of the dose logarithm.
  • MDC minimum detectable concentration
  • An immunoreactive substance detected by immunometric tests in biological media has been characterized by fractionating samples by molecular sieve chromatography using FPLC equipment and a Superose 12 column equilibrated with EIA buffer. Standard recombinant IL-1 and samples were injected in a volume of 500 ⁇ l and at a flow rate of 24 ml / hour and then 0.8 ml fractions were collected. At the end of the chromatography, 100 ⁇ l of each of the fractions was tested by implementing the IL-1 ⁇ and / or IL-1 ⁇ test as described above.
  • Mononuclear leukocytes (lymphocytes and monocytes) and polymorphonuclear (neutrophils) from peripheral blood were obtained by centrifugation on FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMICALS) and were then subjected to countercurrent centrifugal elutriation to allow the production of lymphocytes, pure monocytes and neutrophils.
  • FICOLLPAQUE PARMACIA FINE CHEMICALS
  • the elutriation buffer consisted of a saturated PBS solution from Dulbecco supplemented with 0.25% BSA and 2 mM EDTA.
  • the platelets were washed after half an hour of elutriation, at the injection rate.
  • the fractionation of mononuclear leukocytes was carried out as follows: pure lymphocytes were obtained by increasing the flow rate from 8 to 20 ml / min.
  • the mouse whose serum had the highest titer in the enzyme immunoassays was selected for fusion.
  • the corresponding spleen cells were fused with NSI myeloma cells as described above.
  • One week after the fusion approximately 500 wells presented hybridomas which were actively multiplying for the two interleukins.
  • the presence of anti-interleukin mouse antibodies was verified in all the culture supernatants by testing their capacity to fix the corresponding IL-1-AChE conjugate. In a primary screening, 90 and 116 strongly positive culture supernatants were detected for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ respectively.
  • the corresponding hybridomas were subcloned by limiting dilutions in order to obtain a cell line secreting antibodies, stable, unique for each culture. Finally, 36 and 11 cell lines were respectively stabilized for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ . All the clones were characterized by a number preceded by the letter ⁇ or ⁇ according to the interleukin against which they had been directed. They were cultured as ascites tumors and the monoclonal antibodies were purified from ascites fluid by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate. The isotypes were determined from ascites fluid by the OUCHTERLONY double diffusion technique. All of the mAbs were IgGs having a K light chain, with IgG 1 being by far the most common (see Tables I and II below).
  • Example 1 The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1.
  • the solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed.
  • the mAbs with the same definition have been grouped into three categories (A to C). All mAbs are in the IgG 1 subclass except mAb 100 (group A) and mAbs 50 and 176 (group B) which are IgG 2 .
  • Example 1 The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1. The solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed. To clarify the presentation, mAbs with the same type of fixation have been grouped into four categories (A to D). The IgG subclass of each mAb is mentioned in the last column. Culture supernatants as well as ascites fluids have been used in competitive enzyme immunoassays involving IL-1-AChE conjugates as tracers. In most cases (except for the ⁇ 26 and ⁇ 54 clones), standard curves could be established using recombinant IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ as standards.
  • One of its essential aims is to develop immunometric tests at two sites for both IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , so that it is necessary to determine which pairs of MAbs which could be attached simultaneously to each interleukin.
  • These binding complementarity studies were carried out using immunometric tests in which one of the mAbs was immobilized on the solid phase while the other was labeled with biotin molecules.
  • labeling with biotin was chosen because it is a completely simple which allows the marking of a large number of AMC
  • Tables I and II above present the results of these additional tests for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ respectively.
  • IL-1 ⁇ we see that there are three groups of mAbs which recognize epitopes which are found in three different regions of the molecules of IL-1 ⁇ . These groups, which have been designated by A, B and C, contain 10, 25 and 1 monoclonal antibodies, respectively. All the mAbs of a group have a binding compatible with all the mAbs of the other two groups, while they do not bind simultaneously to each other or with mAbs of the same group. In the case of IL-1 ⁇ , the situation is less clear. In fact, there are four different groups.
  • the mAbs which gave the best results were marked and the tests were continued. with them using the corresponding immobilized mAbs.
  • the antibodies ⁇ 5, ⁇ 29, ⁇ 100, ⁇ 147 (group A), ⁇ 176, ⁇ 39 (group B), and ⁇ 101 (group C) were successively labeled and tested.
  • FIG. 1 summarizes the main characteristics of the tests for detecting IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in the case of an overnight incubation at 4 ° C. and d 'a simultaneous process.
  • the two tests seem very sensitive because minimum detectable concentrations lower than 4 pg / ml could be calculated for each interleukin by using a period of 30 minutes for the enzymatic measurement. Increased sensitivity is observed when the enzymatic reaction (revelation step) lasts longer. In such a case, minimum detectable concentrations below 2 pg / ml can be obtained (see Table IV below).
  • the identity between the substance detected in the culture supernatants (or the intracellular extracts of cells) and the recombinant IL-1 used to establish the standard curves is confirmed by three types of control experiments. The first is represented by the dilutions of samples in culture medium, which gave dilution curves parallel to the standard curves. This is shown in Table V below, which presents the results of two different tests relating to IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , carried out at different dilutions. Similar results were obtained with all of the samples tested.
  • Samples A and B were diluted as indicated in Table V and tested for IL- la and IL-1 ⁇ by EIA. Both the dilutions and the standard curve were made in culture medium (RPMI + 10% fetal calf serum). The raw data were multiplied by the dilution factor before being listed in the Table, in order to clearly show the parallelism between the standard curve and the dilution curves of the samples.
  • Sample A supernatant of alveolar macrophages in a culture stimulated by TNF ⁇ .
  • Sample B intracellular extract of alveolar macrophages in culture.
  • the third experiment consisted in the analysis of culture supernatant after fractionation by chromatography on molecular sieves; this analysis shows that the immunoreactive substance is eluted in the form of a single homogeneous peak, as already indicated above, which corresponds exactly to the peak observed with the recombinant interleukins.
  • FIG. 7 shows different chromatographic profiles obtained for supernatants of stimulated alveolar macrophages, both in the test for detecting IL-1 ⁇ and in the test for detecting IL-1 ⁇ . Similar results have been observed with other culture supernatants or with intracellular extracts. Taken as a whole, all these data clearly indicate that the two tests effectively allow a quantitative determination of interleukins 1 in these environments.
  • EXAMPLE 4 Measurement of IL-1 ⁇ and iL-1 ⁇ in plasma and serum.
  • JURKAT cells for example (cell line derived from a human T lymphoma) secrete IL-2 when they are stimulated by IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ in the presence of phytohemagglutin (PHA) ).
  • Certain anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ antibodies are capable of inhibiting the effect of IL-1 either because they recognize the site involved in the binding with the receptor or because the formation of the IL-1 complex - antibody disrupts the biological process.
  • the anti-IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ antibodies according to the invention (10 ⁇ g / ml) are incubated in the presence of IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ (10 ng / ml) for 18 hours at 4 ° C. .
  • a control is carried out by incubating IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ (10 ng / ml) without antibodies under the same conditions.
  • the concentration of IL-1 at the time of stimulation is 1 ng / ml.
  • the concentration of IL-2 in cell culture supernatants is measured using an immunometric assay developed at SPI, the principle of which is identical to those developed for IL-1.
  • results are expressed as a percentage of inhibition compared to two controls, one is carried out in the absence of IL-1 (PHA alone) and represents 100% inhibition, the other is carried out in the absence of antibody. and represents 0% inhibition.
  • IL-1 ⁇ acts on cells via a membrane receptor with which it specifically binds.
  • Monoclonal antibodies can inhibit the binding of IL-1 ⁇ to receptors if they recognize the part of the IL-1 ⁇ molecule involved in the complex. By inhibiting the binding with the receptor they also inhibit the biological effect.
  • the iodine-labeled IL-1 is incubated for one hour at 4 ° C. with the antibodies at a concentration of
  • the mixture is brought into contact with EL4 cells (murine Thymoma cell line) for 8 hours at + 4 ° C.
  • the cells are then washed with an appropriate buffer and the fixed radioactivity is measured with a solid scintillation counter (multigramma LKB). The results are expressed as a percentage of inhibition relative to a control (100% binding) for which the IL-1 ⁇ labeled with iodine 125 has not been incubated with an antibody.
  • EXAMPLE 6 Demonstration of the sensitivity of the monoclonal antibodies in accordance with the invention; comparative test with tests using the antibodies of the prior art.
  • Example 2 above shows that in the optimal reactions of the tests in accordance with the invention, the minimum detectable concentrations are less than 2 pg / ml (see in particular Table IV).
  • Example 1 the sensitivity of the tests was. characterized by the dose of IL-1 which induces a statistically significant reduction in the fixation observed in the absence of competitor (Bo), that is to say
  • MEDGENIX immunoradiometric assay: anti-IL-1 ⁇ antibody labeled with iodine 125
  • the curve is obtained as visible in FIG. 9, which includes the concentrations of IL-1 ⁇ on the abscissa in pg / ml and on the ordinate the radioactivity bound (in cpm) and which shows that the detection limit is of the order of 15 pg / ml.
  • the sensitivity of the immunometric tests is calculated as the dose of IL-1, which corresponds to non-specific binding + 3 standard deviations (with a confidence rate of 99%). This therefore corresponds to a significantly lower sensitivity than that of the tests in accordance with the invention, as specified above, which is of the order of 2 pg / ml.

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Abstract

Anticorps monoclonaux anti-interleukines-1. Les anticorps concernés sont des anticorps monoclonaux anti-IL-1alpha et anti-IL-1beta. L'invention concerne également des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1alpha/AChE et des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1beta/AChE, ainsi que des conjugués AChE-fragments des anticorps. Lesdits anticorps monoclonaux et conjugués présentent de nombreuses applications: tests enzymo-immunométriques, agents de diagnostic, agents à visées thérapeutiques.Monoclonal anti-interleukin-1 antibodies. The antibodies concerned are anti-IL-1alpha and anti-IL-1beta monoclonal antibodies. The invention also relates to anti-IL-1alpha / AChE monoclonal antibody conjugates and anti-IL-1beta / AChE monoclonal antibody conjugates, as well as AChE-antibody fragment conjugates. Said monoclonal and conjugated antibodies have numerous applications: enzyme-immunometric tests, diagnostic agents, agents for therapeutic purposes.

Description

ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α ET 1β, ET EN THERAPEUTIQUE.  MONOCLONAL ANTI-INTERLEUKINS 1α AND 1β ANTIBODIES, THEIR PRODUCTION PROCESS AND APPLICATIONS OF SAID ANTIBODIES TO DETECTION OF INTERLEUKINS 1α AND 1β, AND THERAPEUTICS
La présente invention est relative à des anticorps monoclonaux anti-interleukines, et notamment anti- interleukines 1α et 1β, à leur procédé de production, à des conjugués anticorps monoclonaux anti-interleukines 1α et 1β/acétylcholinestérase, à des tests enzymo-immunomé- triques (EIA) de détection et de quantification des interleukines la et 1β utilisant lesdits anticorps et/ou conjugués et à diverses autres applications desdits anticorps et/ou conjugués, notamment à des applications thérapeutiques.  The present invention relates to anti-interleukin monoclonal antibodies, and in particular anti-interleukin 1α and 1β antibodies, to their production process, to anti-interleukin 1α and 1β / acetylcholinesterase monoclonal antibody conjugates, to enzymo-immunometric tests (EIA) for detecting and quantifying interleukins 1a and 1β using said antibodies and / or conjugates and for various other applications of said antibodies and / or conjugates, in particular for therapeutic applications.
Les lymphokines sont de puissants agents pharmacologiques qui résultent de l'interaction entre les lymphocytes et l'antigène spécifique qui les sensibilise ; elles peuvent modifier, induire ou supprimer les fonctions de nombreux types cellulaires ; elles jouent aussi un rôle essentiel au cours des réactions inflammatoires et dans les phénomènes de résorption osseuse, de fibrose et de chimiotactisme. De plus, elles interviennent dans le contrôle de l'hématopoïèse et la régulation des réponses immunitaires. Les lymphokines sont produites par les lymphocytes T, étant cependant connu que certaines d'entre elles telles l'interleukine-1 peuvent être produites par des cellules non-leucocytaires.  Lymphokines are powerful pharmacological agents which result from the interaction between lymphocytes and the specific antigen which sensitizes them; they can modify, induce or suppress the functions of many cell types; they also play an essential role during inflammatory reactions and in the phenomena of bone resorption, fibrosis and chemotaxis. In addition, they are involved in the control of hematopoiesis and the regulation of immune responses. Lymphokines are produced by T cells, however it is known that some of them such as interleukin-1 can be produced by non-leukocyte cells.
L'interleukine-1 (cf. IMMUNOLOGIE, JeanFrançois BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3ème Edition 1986) est un médiateur qui constitue un signal biologique de la présentation de l'antigène associé à l'histotope, qui marque la coopération monocytes-lymphocytes T. L'activité de l'IL-1 est traditionnellement mesurée dans un test de prolifération de thymocytes de souris C3H/HeJ (résistantes au LPS) en présence de PHA (Iμg/ml). En l'absence d'IL-1, les thymocytes stimulés par 1a PHA sont bloqués en phase Go/G1. Ils peuvent cependant se diviser si l'on ajoute de l'interleukine-2, ce qui suggère que l'action principale de l'IL-1 est l'induction de la synthèse de l'interleukine-2. Interleukin-1 (cf. IMMUNOLOGY, JeanFrançois BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3rd Edition 1986) is a mediator which constitutes a biological signal for the presentation of the antigen associated with the histotope, which marks the monocyte-T lymphocyte cooperation. The activity of IL-1 is traditionally measured in a proliferation test of mouse thymocytes C3H / HeJ (resistant to LPS) in the presence of PHA (Iμg / ml). In the absence of IL-1, the thymocytes stimulated by the PHA are blocked in the Go / G1 phase. They can however divide if interleukin-2 is added, which suggests that the main action of IL-1 is the induction of interleukin-2 synthesis.
L' IL-1 humaine est une glycoprotéine de poids moléculaire estimé à 18 kDa, avec un contaminant majeur à 15 kDa. En outre, deux fractions peptidiques de poids moléculaires 2 et 4 kDa qui présentent l'activité biologique de l'IL-1 ont été isolées de l'urine normale.  Human IL-1 is a glycoprotein with a molecular weight estimated at 18 kDa, with a major contaminant at 15 kDa. In addition, two peptide fractions of molecular weights 2 and 4 kDa which exhibit the biological activity of IL-1 were isolated from normal urine.
L' IL-1 semble être produite par une grande variété de types cellulaires à l'exclusion des lymphocytes T, tels que les monocytes, les macrophages, les kératinocytes, les astrocytes, les mélanocytes, les cellules mésangiales, les lymphoblastes B.  IL-1 appears to be produced by a wide variety of cell types excluding T cells, such as monocytes, macrophages, keratinocytes, astrocytes, melanocytes, mesangial cells, B lymphoblasts.
Les effets biologiques de l'IL-1 ne se limi- tent pas à l'induction de la synthèse de l'IL-2. L'IL-1 participe à l'activation des cellules B, stimule la prolifération des fibroblastes et des synoviocytes, élève la température corporelle par action sur les centres thermorégulateurs et induit la production de protéines de l'inflammation par les hépatocytes . Un gène de l'IL-1 codant pour un précurseur de 270 amino-acides a récemment été clone. Les plasmides contenant ce gène induisent la production d'un peptide carboxy-terminal de 156 aminoacides, ayant les activités de l'IL-1. Alors que dans la référence précitée, l'hypothèse d'une famille de molécules de structure voisine était avancée, DINARELLO [J. CLIN. IMMUNOL. (1985), 5, pages 285-297] et OPPENHEIM et al. [IMMUNOL. TODAY (1986), 9, pages 45-46] ont montré que l'IL-1 représente une famille importante de protéines biologiquement actives dérivées de cellules mononucléaires, qui sont impliquées dans des réactions inflammatoires et dans des réponses immunes. Deux espèces distinctes d' IL-1 humaines ont été identifiées : l'IL-1α et l'IL-1β [MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641- 647] ; ces deux espèces ont le même poids moléculaire, des effets biologiques similaires et les mêmes récepteurs sur les cellules-cibles [WOOD et al., J. IMMUNOL. (1985),The biological effects of IL-1 are not limited to the induction of IL-2 synthesis. IL-1 participates in the activation of B cells, stimulates the proliferation of fibroblasts and synoviocytes, raises the body temperature by acting on thermoregulatory centers and induces the production of proteins of inflammation by hepatocytes. An IL-1 gene encoding a precursor of 270 amino acids has recently been cloned. Plasmids containing this gene induce the production of a carboxy-terminal peptide of 156 amino acids, having the activities of IL-1. While in the aforementioned reference, the hypothesis of a family of molecules of neighboring structure was put forward, DINARELLO [J. CLIN. IMMUNOL. (1985), 5, pages 285-297] and OPPENHEIM et al. [IMMUNOL. TODAY (1986), 9, pages 45-46] have shown that IL-1 represents an important family of biologically active proteins derived from mononuclear cells, which are involved in inflammatory reactions and in immune responses. Two distinct species of human IL-1 have been identified: IL-1α and IL-1β [MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641-647]; these two species have the same molecular weight, similar biological effects and the same receptors on target cells [WOOD et al., J. IMMUNOL. (1985),
134, pages 895-903 et KILIAN, J. IMMUNOL. (1986), 136, pp. 4509]. Jusqu'à présent, la présence de l'IL-1 dans des milieux de culture et dans des fluides biologiques est essentiellement mesurée, comme indiqué plus haut, à l'aide de bio-essais tels que le test de co-stimulation de thymocytes murins ou la lignée cellulaire EL4 de thy- mome de souris. Ces méthodes, qui utilisent les propriétés d'activation des lymphocytes de l'IL-1, ont cependant leurs limites : elles ne permettent pas d'établir la distinction entre l'IL-1α et l'IL-1β et la présence d'autres substances actives telles que l'IL-2, les lectines et les facteurs de croissance, peut interférer avec le bioessai. 134, pages 895-903 and KILIAN, J. IMMUNOL. (1986), 136, pp. 4509]. So far, the presence of IL-1 in culture media and in biological fluids is essentially measured, as indicated above, using bioassays such as the thymocyte co-stimulation test. murine or mouse thyroid cell line EL4. These methods, which use the activation properties of IL-1 lymphocytes, have their limits, however: they do not make it possible to distinguish between IL-1α and IL-1β and the presence of other active substances such as IL-2, lectins and growth factors, may interfere with the bioassay.
FERRUA et al. [J. OF IMMUNOL. METH. (1988) FERRUA et al. [J. OF IMMUNOL. METH. (1988)
114, pages 41-48] signalent que l'existence d'IL-1 recombinante et le développement de la technologie des hybridomes ont permis à plusieurs équipes de Chercheurs [GAFFNEY et al., 1987 ; KASAHARA et al., 1987 ; KENNEY et al., 1987 ; KOICHIRO et al., 1987] de mettre au point des immuno-essais sandwich n'utilisant pas d'isotopes, pour la détection d'IL-1α et d' IL-1β avec une limite de détection comparable à celle de la plupart des tests biologiques, et proposent à leur tour une méthode de détection de l'IL-α et de l'IL-1β ; cette méthode utilise deux immuno-essais enzymatiques sandwich par colorimétrie, séparés, qui permettent une détection de l'IL-1α et de l'IL-1β à des taux inférieurs à la picomole. Cependant, les anticorps mis en oeuvre sont des anticorps polyclo- naux de lapin ou de mouton. 114, pages 41-48] indicate that the existence of recombinant IL-1 and the development of hybridoma technology have enabled several teams of researchers [GAFFNEY et al., 1987; KASAHARA et al., 1987; KENNEY et al., 1987; KOICHIRO et al., 1987] to develop non-isotope sandwich immunoassays for the detection of IL-1α and IL-1β with a detection limit comparable to that of most biological tests, and in turn propose a method for detecting IL-α and IL-1β; this method uses two enzymatic sandwich immunoassays by colorimetry, separate, which allow detection of IL-1α and IL-1β at rates lower than picomole. However, the antibodies used are polyclonal rabbit or sheep antibodies.
Il est cependant clair qu'il serait préférable de pouvoir tirer parti des propriétés des anticorps monoclonaux et notamment de leurs plus grandes spécificité et sensibilité pour déterminer séparément l'IL-1α et l'IL- 1β. TANAKA et al. [EUR. J. IMMUNOL. (1987), 17, pages 1527-1530] ont proposé de doser l'IL-1α et l'IL-1β produites in vitro par des cellules mononucléaires de sang périphérique à l'aide d'un immuno-essai enzymatique sandwich qui utilise un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal : des billes de polystyrène revêtues d' IgGl monoclonaux anti-IL-1α humaine ou d' IgGl anti-IL- 1β humaine de lapin sont incubées avec de l'IL-1α recombinante humaine, de l'IL-1β recombinante humaine ou des surnageants de culture de cellules mononucléaires puis, après le lavage, avec des conjugués Fab' anti-IL-1α humaine/peroxydase ou du conjugué Fab' anti-IL-1β humaine/peroxydase purifié, par affinité, le second anticorps mis en oeuvre étant un anticorps polyclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β de lapin. It is however clear that it would be preferable to be able to take advantage of the properties of the monoclonal antibodies and in particular of their greater specificity and sensitivity in order to determine IL-1α and IL-1β separately. TANAKA et al. [EUR. J. IMMUNOL. (1987), 17, pages 1527-1530] proposed to assay IL-1α and IL-1β produced in vitro by peripheral blood mononuclear cells using an enzyme-linked sandwich immunoassay which uses a polyclonal antibody and a monoclonal antibody: polystyrene beads coated with anti-human IL-1α monoclonal IgGl or rabbit human anti-IL-1β IgGl are incubated with recombinant human IL-1α, Recombinant human IL-1β or culture supernatants of mononuclear cells and then, after washing, with Fab 'anti-human IL-1α / peroxidase conjugates or Fab' anti-human IL-1β / purified peroxidase Fab 'conjugate, the second antibody used being a polyclonal anti-IL-1α or anti-IL-1β rabbit antibody.
D'autres Demandes de Brevets décrivent également des anticorps anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β.  Other Patent Applications also describe anti-IL-1α and / or anti-IL-1β antibodies.
La Demande de Brevet européen OTSUKA PHARMA- CEUTICAL 267 611 décrit des anticorps monoclonaux anti- IL-1α et des anticorps monoclonaux anti-IL-1β. La constante d'affinité de ces anticorps est de l'ordre de 3,6.10-8 M/l. The OTSUKA PHARMA-CEUTICAL 267 611 European Patent Application describes monoclonal anti-IL-1α antibodies and monoclonal anti-IL-1β antibodies. The affinity constant of these antibodies is of the order of 3.6 × 10 -8 M / l.
La Demande de Brevet européen IMMUNEX 245 052 décrit plus particulièrement une méthode de détection de l'inflammation au cours de laquelle l'IL-1 intervient, comprenant (a) la réaction d'un échantillon de fluide biologique contenant éventuellement de l'IL-1 avec un premier anticorps spécifique d'un premier site antigénique caractéristique de l'IL-1 et (b) la détection de la réaction entre le premier anticorps et l'IL-1. Les anticorps plus particulièrement décrits dans cette Demande IMMUNEX sont un anticorps monoclonal qui réagit spécifiquement avec l'IL-1α (anticorps monoclonal dénommé 15A4) et un anticorps monoclonal qui réagit spécifiquement avec l'IL-1β (anticorps monoclonal dénommé 7B4). Cependant, les anticorps décrits dans cetteThe European Patent Application IMMUNEX 245,052 describes more particularly a method of detecting the inflammation during which IL-1 intervenes, comprising (a) the reaction of a sample of biological fluid possibly containing IL- 1 with a first antibody specific for a first antigenic site characteristic of IL-1 and (b) detecting the reaction between the first antibody and IL-1. The antibodies more particularly described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1α (monoclonal antibody called 15A4) and a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1β (monoclonal antibody called 7B4). However, the antibodies described in this
Demande ne permettent pas de doser des concentrations en interleukines inférieures au nanogramme/ml. Request does not allow dosing of interleukin concentrations lower than the nanogram / ml.
La Demande de Brevet européen DAINIPPON 220 063, pour sa part, décrit un anticorps dirigé contre l'IL-1, ledit anticorps étant notamment utilisé dans le cadre d'une méthode par compétition ou d'une méthode immunométrique. Cet anticorps ne permet d'obtenir, dans le cadre de ces dosages que des sensibilités de l'ordre de 0,1 ng/ml pour la méthode par compétition et de l'ordre de 0,2 ng/ml pour la méthode immunométrique.  European Patent Application DAINIPPON 220 063, for its part, describes an antibody directed against IL-1, said antibody being used in particular in the context of a competitive method or an immunometric method. This antibody only makes it possible, within the framework of these assays, to obtain sensitivities of the order of 0.1 ng / ml for the competitive method and of the order of 0.2 ng / ml for the immunometric method.
De manière générale, tous les anticorps de l'Art antérieur ne présentent pas une affinité suffisante, pour leur application dans des dosages très sensibles d' IL-1 (de l'ordre du picogramme).  In general, all the antibodies of the prior art do not have sufficient affinity for their application in very sensitive assays of IL-1 (of the order of the picogram).
Le Brevet français Nº 83 13389, au nom de la Demanderesse, a proposé pour la réalisation de dosages enzymoimmunologiques, des conjugués dans lesquels un anticorps, un antigène ou un haptène est lié par covalence à l'acétylcholinestérase, ce nouveau conjugué permettant, grâce aux propriétés de l'enzyme, la réalisation de dosages enzymoimmunologiques de quantités très faibles, de l'ordre du nanogramme.  French Patent No. 83 13389, in the name of the Applicant, has proposed conjugates in which an antibody, an antigen or a hapten is covalently linked to acetylcholinesterase, for the production of enzymoimmunoassays, thanks to the properties of the enzyme, carrying out enzyme assays of very small quantities, of the order of a nanogram.
GRASSI et al. ont décrit [ANAL. BIOCHEM. (1988), 168, pages 436-450] une application de conjugués conformes a ce Brevet, constitués par des antigènes marqués par l'acétylcholinestérase, au criblage d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines périphériques du photosystème 1 (PSI), qui est un complexe de membrane. Les Auteurs ont également testé cette méthode dans des immunoessais par compétition, ce qui leur a permis de quantifier de façon très précise des polypeptides de PSI dans différents extraits biologiques. Le test immunoenzy- matique comprend, pour le criblage d'une série d'anticorps monoclonaux aptes à reconnaître les différents polypeptides qui composent les deux classes de polypeptides dont est constitué le PS1, les trois étapes suivantes : GRASSI et al. have described [ANAL. BIOCHEM. (1988), 168, pages 436-450] an application of conjugates conforming to this patent, constituted by antigens labeled with acetylcholinesterase, to the screening of monoclonal antibodies directed against the peripheral proteins of photosystem 1 (PSI), which is a membrane complex. The Authors also tested this method in competitive immunoassays, which allowed them to very precisely quantify PSI polypeptides in different biological extracts. The immunoenzymatic test comprises, for the screening of a series of monoclonal antibodies capable of recognizing the different polypeptides which make up the two classes of PS1 polypeptides, the following three steps:
- les anticorps monoclonaux anti-PSl présents dans les surnageants des cultures d'hybridomes se fixent à la phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte du composant biotinylé correspondant du PSI ; - cet antigène biotinylé fixe fortement l'avidine, qui fixe elle-même l'AChE marquée à la biotine ; - l'activité de l'AChE fixée est mesurée par la méthode colorimétrique d'ELLMAN. Les Auteurs ont montré que le système à l'AChE améliore de façon très sensible les limites de détection des anticorps monoclonaux. Cette méthode de criblage s'applique parfaitement à la détermination quantitative de différents polypeptides du PS1 par compétition.  - the anti-PS1 monoclonal antibodies present in the supernatants of hybridoma cultures bind to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the corresponding biotinylated component of the PSI; - This biotinylated antigen strongly binds avidin, which itself binds the labeled AChE to biotin; - the activity of the fixed AChE is measured by the colorimetric method of ELLMAN. The Authors have shown that the AChE system significantly improves the detection limits of monoclonal antibodies. This screening method applies perfectly to the quantitative determination of different PS1 polypeptides by competition.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des moyens propres à permettre la réalisation d'essais enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection et de quantification d'IL-1α et d'IL-1β, ces moyens étant en outre susceptibles d'applications thérapeutiques et d'applications diagnostiques in vivo .  The present invention has therefore given itself the aim of providing means suitable for enabling the performance of highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests, of detection and quantification of IL-1α and IL-1β, these means also being capable of therapeutic applications and in vivo diagnostic applications.
La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux spécifiques des IL-1α et 1ß, qui résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de ron- geurs, et plus particulièrement de souris, par des IL-1α ou -1β selon le cas, qui reconnaissent spécifiquement les IL-1α naturelles ou recombinantes ou les IL-1β naturelles ou recombinantes, qui ne présentent pratiquement pas de réaction croisée entre les deux IL-1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux ont une constante de dissociation inférieure à 5.10-10 , en ce qu'ils se composent de plusieurs groupes qui reconnaissent des régions distinctes des IL-1α ou -1β, en ce que les anticorps de certains groupes sont aptes à se lier de façon compatible avec tous les anticorps des autres groupes, à savoir : - les anticorps anti-IL-1α se composent de trois groupes (A, B et C) qui reconnaissent trois régions distinctes de l'interleukine-1α, tous les anticorps d'un groupe étant aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes mais n'étant pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe ; The subject of the present invention is monoclonal antibodies specific for IL-1α and 1β, which result from the immunization of mammals, in particular rodents, and more particularly of mice, with IL-1α or -1β as appropriate, which specifically recognize natural or recombinant IL-1α or natural or recombinant IL-1β, which show practically no cross-reaction between the two IL-1, characterized in that said monoclonal antibodies have a dissociation constant of less than 5.10 - 10 , in that they consist of several groups which recognize distinct regions of IL-1α or -1β, in that the antibodies of certain groups are capable of binding in a compatible manner with all the antibodies of the other groups, to know : - anti-IL-1α antibodies are made up of three groups (A, B and C) which recognize three distinct regions of interleukin-1α, all the antibodies in a group being capable of binding in a compatible manner with all those of the other two groups but not being compatible with another antibody of the same group;
- les anticorps anti-IL-1β se composent de quatre groupes (A, B, C et D) dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des anticorps anti-IL-1α, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes, et ne se lient pas à l'IL-1β native recombinante, reconnaissent une interleukine-1β modifiée, et réagissent avec un conjugué IL-1β-AChE ;  - anti-IL-1β antibodies are made up of four groups (A, B, C and D), the first two (A and B) having a behavior similar to that of anti-IL-1α antibodies, including group antibodies C are compatible with a single antibody from each of the first two groups and whose antibodies from the fourth group (D) are incompatible with any of the antibodies from the first three groups, and do not bind to the recombinant native IL-1β , recognize a modified interleukin-1β, and react with an IL-1β-AChE conjugate;
et en ce que lesdits anticorps anti-IL-1α et anti-IL-1β reconnaissent les conjugués IL-1α ou 1β/acétyl- cholinestérase (AChE). and in that said anti-IL-1α and anti-IL-1β antibodies recognize the IL-1α or 1β / acetylcholinesterase (AChE) conjugates.
Ces anticorps ne présentent pratiquement pas de réaction croisée (<0,01 %) entre les deux IL-1.  These antibodies show practically no cross-reaction (<0.01%) between the two IL-1s.
Les anticorps monoclonaux spécifiques des in- terleukines-1α et 1β, conformes à l'invention, sont obtenus à partir de mammifères tels que, notamment, des rongeurs, et plus particulièrement des souris, qui sont immunisés par des injections appropriées d'interleukine- 1α ou -1β, puis des cellules de rates des mammifères immunisés sont fusionnées, selon une technique appropriée, avec des cellules de myélome de mammifères de la même espèce, les hybridomes résultants sont mis en culture et ceux dans les surnageants desquels ont été détectés des anticorps anti-interleukine-1α ou 1β, selon le cas, sont sous-clonés pour obtenir des lignées cellulaires sécrétant des anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β, selon l'interleukihe contre laquelle ils ont été dirigés. The monoclonal antibodies specific for interleukins-1α and 1β, in accordance with the invention, are obtained from mammals such as, in particular, rodents, and more particularly mice, which are immunized by appropriate injections of interleukin- 1α or -1β, then spleen cells of immunized mammals are fused, according to an appropriate technique, with mammalian myeloma cells of the same species, the resulting hybridomas are cultured and those in the supernatants of which were detected anti-interleukin-1α or 1β antibodies, as the case may be, are subcloned to obtain cell lines secreting anti-IL-1α monoclonal antibodies or anti-IL-1β, according to the interleukihe against which they were directed.
L'interleukine-1α ou -1β mise en oeuvre pour immuniser les mammifères susdits, peut être aussi bien une interleukine naturelle purifiée, qu'une interleukine recombinante .  The interleukin-1α or -1β used to immunize the abovementioned mammals can be both a purified natural interleukin and a recombinant interleukin.
Les hybridomes mis en oeuvre pour l'obtention des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β conformes à l'invention ont fait l'objet d'un dépôt en date du 8 Décembre 1988 auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR. Les hybridomes déposés sont identifiés par les N° suivants : I-823, I-824, I-825, I-826, I- 827, 1-828, 1-829.  The hybridomas used to obtain the anti-IL-1α and anti-IL-1β monoclonal antibodies in accordance with the invention were the subject of a deposit dated December 8, 1988 with the NATIONAL COLLECTION OF CULTURES OF MICROORGANISMS (CNCM) held by the INSTITUT PASTEUR. The deposited hybridomas are identified by the following numbers: I-823, I-824, I-825, I-826, I- 827, 1-828, 1-829.
La présente invention a également pour objet des conjugués d' acétylcholinestérase et d' anticorps monoclonaux anti IL-1α ou -1β ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'.  The present invention also relates to conjugates of acetylcholinesterase and of anti-IL-1α or -1β monoclonal antibodies or of fragments of these antibodies, in particular of Fab 'fragments.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1α ou 1β conformes à la présente invention. Conformément à ce procédé, lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F (ab' ) 2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel,notamment, que la β-mercaptoéthylamine (βMEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.  The present invention further relates to a process for producing Fab 'fragments of anti-interleukin-1α or 1β monoclonal antibodies in accordance with the present invention. In accordance with this method, said monoclonal antibodies are treated with pepsin in an acid medium, to obtain fragments F (ab ') 2 which are isolated by chromatography on a molecular sieve, then these fragments F (ab') 2 are subjected to a controlled reduction process, by an appropriate reducing agent such as, in particular, β-mercaptoethylamine (βMEA), to provide a Fab 'fragment which is purified by passage through a column chromatography column.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β et de conjugués d'AChE et de fragments desdits anticorps monoclonaux, notamment de fragments Fab', qui est caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturelle- ment présent dans l'anticorps ou l'un de ses fragments, est couplé à au moins un groupe maléimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-succinimide comme le N-succinimidyl-4- (N-maléimido-méthyl) cyclohexane-1- carboxylate (SMCC) . The present invention also relates to a method for producing AChE conjugates and anti-IL-1α or anti-IL-1β monoclonal antibodies and AChE conjugates and fragments of said monoclonal antibodies, in particular Fab 'fragments , which is characterized in that at least one incorporated or natural thiol group- ment present in the antibody or one of its fragments, is coupled to at least one maleimido group incorporated in AChE, via an appropriate coupling agent such as, in particular, an ester of N-succinimide such as N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
La présente invention a, en outre, pour objet des tests immunoenzymatiques par compétition de détection de l'Il-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biologiques, caractérisés en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β conforme à l'invention, utilisé comme premier anticorps, et des IgG, portées par un support solide approprié, utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d'IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-1-1α ou -1β, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.  The present invention further relates to enzyme immunoassays by competition for the detection of Il-1α and IL-1β in cell culture supernatants and in biological fluids, characterized in that a monoclonal antibody anti-IL-1α or anti-IL-1β according to the invention, used as first antibody, and IgG, carried by an appropriate solid support, used as second antibody, are brought into contact with conjugates of IL-1 -AChE, which play the role of tracers, and of interleukin-1-1α or -1β, after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
La présente invention a également pour objet des tests enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection de l'-Il-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérisés en ce que des anticorps monoclonaux (Acm) anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β conformes à l'invention et portés par un support approprié, sont mis en contact avec de l'IL-1α ou -1β et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.  The present invention also relates to highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests for the detection of Il-1α and IL-1β in cell culture supernatants and biological fluids, characterized in that antibodies monoclonal (mAb) anti-IL-1α and / or anti-IL-1β according to the invention and carried by an appropriate support, are brought into contact with IL-1α or -1β and with the Acm-AChE conjugate , after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
Selon un mode de mise en oeuvre de ces tests enzymo-immunométriques, l'IL-1α ou -1β est ajoutée à l'anticorps simultanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec l'IL-1α ou -1β.  According to one embodiment of these enzymo-immunometric tests, IL-1α or -1β is added to the antibody simultaneously with the conjugate Acm-AChE and the two monoclonal antibodies react simultaneously with IL-1α or - 1β.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de ces tests enzymo-immunométriques, l'IL-1α ou -1β est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activitéAccording to another embodiment of these enzyme-immunometric tests, the IL-1α or -1β is first introduced and reacts with the antibody, then the Acm-AChE conjugate is then introduced and the activity
AChE est révélée par tous moyens appropriés. AChE is revealed by any appropriate means.
Les supports appropriés sont notamment des plaques de microtitration ou des supports sous forme de particules permettant la fixation desdits anticorps.  The suitable supports are in particular microtiter plates or supports in the form of particles allowing the fixing of said antibodies.
La présente invention a, de plus, pour objet un kit pour la réalisation des tests immuno-enzymatiques par compétition conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :  The subject of the present invention is, moreover, a kit for carrying out immunoenzymatic tests by competition in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
. une série de plaques de microtitration revêtues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin antisouris ;  . a series of microtiter plates coated with an antibody consisting of anti-mouse rabbit IgG;
au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1β ;  at least one bottle containing appropriate doses of anti-IL-1α monoclonal antibody and / or anti-IL-1β monoclonal antibody;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-1α et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1β et d'AChE ;  . at least one bottle containing conjugates of IL-1α and AChE and / or at least one bottle containing conjugates of IL-1β and AChE;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;  . appropriate amounts or doses of an AChE revealing substrate;
. des quantités ou doses appropriées d' IL-1α et/ou d'IL-1β.  . appropriate amounts or doses of IL-1α and / or IL-1β.
La présente invention a également pour objet un kit pour la réalisation des tests enzymo-immuno- métriques conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :  The present invention also relates to a kit for carrying out the enzymo-immunometric tests in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
. une série de plaques de microtitration revêtues d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonaux anti-IL-1β ;  . a series of microtiter plates coated with anti-IL-1α monoclonal antibodies and / or anti-IL-1β monoclonal antibodies;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou 1β ;  . at least one bottle containing conjugates of AChE and anti-IL-1α and / or 1β monoclonal antibodies;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;  . appropriate amounts or doses of an AChE revealing substrate;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β. La présente invention a, de plus, pour objet des agents à visées thérapeutiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β et/ou leurs fragments, co à l'invention, seuls ou conjugués ou hybrides ou associés avec d'autres substances. . appropriate amounts or doses of IL-1α and / or IL-1β. The present invention further relates to agents for therapeutic purposes, characterized in that they consist of, or comprise as active constituents, anti-IL-1α monoclonal antibodies and / or anti-IL antibodies -1β and / or their fragments, co to the invention, alone or conjugated or hybrid or associated with other substances.
Conformément à l'invention, une application thérapeutique particulièrement intéressante desdits anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β est leur activité d'inhibition de l'IL-1.  According to the invention, a particularly advantageous therapeutic application of said anti-IL-1α and anti-IL-1β monoclonal antibodies is their activity of inhibiting IL-1.
La présente invention a également pour objet des agents de diagnostic aptes à être mis en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-1α et/ou des anticorps anti- IL-1β ou leur fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.  The present invention also relates to diagnostic agents capable of being used for in vivo diagnosis, characterized in that they comprise anti-IL-1α antibodies and / or anti-IL-1β antibodies or their fragments , associated with an antigen and / or a hapten and / or another antibody or antibody fragment, and / or labeled with stable or radioactive labels.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.  In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention, dans le premier desquels il sera fait référence aux dessins annexés dont les Figures 1 à 7 représentent respectivement, par des courbes :  The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of implementation of the invention, in the first of which reference will be made to the appended drawings, of which Figures 1 to 7 represent respectively, by curves:
- La Figure 1 : l'effet non-spécifique de plasma sur des courbes standard d'un immunoessai d'IL-1α, dans le cadre d'une comparaison entre deux couples différents d'anticorps monoclonaux.  - Figure 1: the non-specific effect of plasma on standard curves of an IL-1α immunoassay, in the context of a comparison between two different pairs of monoclonal antibodies.
- La Figure 2 : l'évolution de la courbe étalon de l'IL-1β en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation). - La Figure 3 : l'évolution des "profils d'imprécision" dans le test relatif à l'IL-1β en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation). - Figure 2: the evolution of the standard curve of IL-1β as a function of the time allocated to the enzymatic reaction (revelation step). - Figure 3: the evolution of the "imprecision profiles" in the test relating to IL-1β as a function of the time devoted to the enzymatic reaction (revelation step).
- La Figure 4 : la libération in vitro d' IL- 1α (♢, ♦) et d'IL-1β (■, ) établie par les EIA spécifiques dans les surnageants de monocytes, lymphocytes et neutrophiles humains non stimulés (♢, ■) et stimulés par le LPS (♦, ), purifiés par élutriation centrifuge. - Figure 4: the in vitro release of IL-1α (♢, ♦) and IL-1β (■, ) established by specific EIAs in the supernatants of unstimulated human monocytes, lymphocytes and neutrophils (♢, ■) and stimulated by LPS (♦, ), purified by centrifugal elutriation.
- La Figure 5 : la répartition de l'immunoréactivité de l'IL-1α à la suite d'une chromotagraphie sur tamis moléculaire "SUPEROSE 12" de surnageant de culture ou de plasma.  - Figure 5: the distribution of the immunoreactivity of IL-1α following a chromotagraphy on molecular sieve "SUPEROSE 12" of culture or plasma supernatant.
- La Figure 6 : la limite de détection d'un kit de l'Art antérieur, utilisant une méthode de dosage de l'IL-1α par compétition.  - Figure 6: the detection limit of a kit of the prior art, using a method of assaying IL-1α by competition.
- La Figure 7 : la limite de détection d'un kit de l'Art antérieur, utilisant une méthode immunoradiométrique de dosage de l'IL-1β.  - Figure 7: the detection limit of a kit of the prior art, using an immunoradiometric assay method for IL-1β.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessins sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.  It should be understood, however, that these examples and drawings are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : Mise en oeuvre des tests conformes à l'invention ; préparation des réactifs (anticorps monoclonaux et conjugués) et paramètres de sélection des réactifs. EXAMPLE 1: Implementation of the tests in accordance with the invention; preparation of reagents (monoclonal antibodies and conjugates) and reagent selection parameters.
1. PURIFICATION ET CONTROLE DE L'ACETYLCHOLINESTERASE : 1. PURIFICATION AND CONTROL OF ACETYLCHOLINESTERASE:
L'acétylcholinestérase (AChE) obtenue à partir de l'anguille électrique Electrophorus electricus, a été purifiée par chromatographie d'affinité par la méthode décrite par MASSOULIE et BON [Eur. J. BIOCHEM (1976), 68, pages 531-539]. La forme tétramère de l'enzyme, ou forme G4, a été utilisée pour marquer les interleukines et les anticorps. L'activité AChE a été mesurée à l'aide de la méthode colorimétrique d'ELLMAN et al. [BIOCHEM. PHARM. (1961), 7, pages 88-95]. Une unité ELLMAN est définie comme étant la quantité d'enzyme produisant une augmentation de l'absorbance de 1 DO à 25°C, pendant 1 minute, dans 1 ml de milieu et pour une longueur de pas optique d'1 cm ; elle correspond à environ 8 ng d'enzyme et à 7,32 unités enzymatiques (une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 μmole d' acétylcholine à 25°C pendant 1 minute). Les concentrations d'AChE ont été déterminées par voie enzymatique en utilisant une constante catalytique de 4,4 x 107 moles h-1 par site et une masse moléculaire de 80 kDa pour la sous-unité catalytique. A partir de ces valeurs, une limite de détection de 1,8 attomole (10-18 mole) d'enzyme peut être calculée pour la forme G4 (c'est-à-dire la quantité d'AChE qui produit une augmentation d' absorbance de 0,01 DO pendant 1 heure, dans 20 μl de milieu de ELLMAN, pour une longueur de pas de 0,5 cm. The acetylcholinesterase (AChE) obtained from the electric eel Electrophorus electricus, was purified by affinity chromatography by the method described by MASSOULIE and BON [Eur. J. BIOCHEM (1976), 68, pages 531-539]. The tetrameric form of the enzyme, or G4 form, has been used to label interleukins and antibodies. AChE activity was measured using the colorimetric method of ELLMAN et al. [BIOCHEM. PHARM. (1961), 7, pages 88-95]. An ELLMAN unit is defined as the quantity of enzyme producing an increase in absorbance of 1 DO at 25 ° C, for 1 minute, in 1 ml of medium and for an optical step length of 1 cm; it corresponds to approximately 8 ng of enzyme and to 7.32 enzymatic units (one enzymatic unit corresponds to the quantity of enzyme which hydrolyzes 1 μmol of acetylcholine at 25 ° C. for 1 minute). AChE concentrations were determined enzymatically using a catalytic constant of 4.4 x 10 7 moles h -1 per site and a molecular mass of 80 kDa for the catalytic subunit. From these values, a detection limit of 1.8 attomole (10 -18 mole) of enzyme can be calculated for the G4 form (i.e. the amount of AChE which produces an increase in absorbance of 0.01 DO for 1 hour, in 20 μl of ELLMAN medium, for a step length of 0.5 cm.
2. IMMUNISATION ET PROCESSUS DE PRODUCTION D' HYBRIDOMES :  2. IMMUNIZATION AND HYBRIDOMA PRODUCTION PROCESS:
Des anticorps anti-interleukine-1α et 1-β ont été produits chez des souris de race Biozzi High Responder (HR) en utilisant le processus d'immunisation suivant : au jour 0, 15 μg d'interleukine recombinante la ou 1β émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund ont été injectés dans le coussinet d'une patte. Les souris ont été traitées par de l'aspirine (0,1 mg/jour) pour éviter les effets secondaires tels que l'hyperthermie. Une première injection de rappel (dans le coussinet d'une patte) a été administrée au jour 21 et les souris ont été saignées une semaine plus tard. La présence d'anticorps anti-interleukine murins dans les sérums correspondants a été contrôlée en testant leur capacité de fixer des conjugués interleukine-1- AChE. Ces tests ont été réalisés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, en mettant en oeuvre le même processus que celui qui sera utilisé ultérieurement pour cribler les surnageants de cultures d' hybridomes. On a choisi pour chaque interleukine-1, la souris présentant le titre le plus élevé dans l'immunoessai-enzymatique, pour la préparation d'anticorps monoclonaux. A ce stade, des titres compris entre 1/1000 et 1/10000 ont été obser- vés. Les souris sélectionnées ont reçu une injection intraveineuse de rappel (7μg d' interleukine) 3 et 2 jours avant la fusion. Des cellules de rate des souris correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris NSI, comme décrit dans l'Article de GRASSI et al. cité dans le préambule. Anti-interleukin-1α and 1-β antibodies were produced in Biozzi High Responder (HR) mice using the following immunization process: on day 0, 15 μg of recombinant interleukin la or 1β emulsified in Freund's complete adjuvant was injected into the pad of one leg. The mice were treated with aspirin (0.1 mg / day) to avoid side effects such as hyperthermia. A first booster injection (in the pad of a paw) was administered on day 21 and the mice were bled a week later. The presence of murine anti-interleukin antibodies in the corresponding sera was checked by testing their capacity to fix interleukin-1-AChE conjugates. These tests were carried out in microtitration plates coated with a second anti-mouse IgG antibody, using the same process as that which will be used subsequently to screen the supernatants of hybridoma cultures. We chose for each interleukin-1, the mouse with the highest titer in the enzyme immunoassay, for the preparation of monoclonal antibodies. At this stage, titles between 1/1000 and 1/10000 have been observed. The selected mice received an intravenous booster injection (7 μg of interleukin) 3 and 2 days before the fusion. Corresponding mouse spleen cells were fused with NSI mouse myeloma cells, as described in the article by GRASSI et al. cited in the preamble.
3. MARQUAGE D' INTERLEUKINES PAR L'AChE :  3. LABELING OF INTERLEUKINS BY AChE:
Les interleukines la et 1β ont été couplées par covalence à l'AChE par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, à savoir le N-succinimidyl-4- (N- maléimido-méthyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , en mettant en oeuvre une technique connue pour le marquage du facteur de croissance acide bovin (aFGF) et de la pro- lactine de rat. Cette méthode comprend la réaction d'un groupe thiol (préalablement introduit dans les interleukines) avec un groupe maleimido incorporé dans l'enzyme après la réaction avec le SMCC. Les interleukines ont été thiolées par réaction de leurs groupes aminé primaire avec du N-succinimidyl-S-acétyl-thioacétate (SATA) dans un milieu alcalin.  The interleukins 1a and 1β were covalently coupled to AChE via a heterobifunctional reagent, namely N-succinimidyl-4- (N- maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) using a known technique for labeling bovine acid growth factor (aFGF) and rat pro-lactin. This method involves the reaction of a thiol group (previously introduced into interleukins) with a maleimido group incorporated into the enzyme after the reaction with SMCC. The interleukins were thiolated by reaction of their primary amine groups with N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate (SATA) in an alkaline medium.
- Incorporation de groupes thiols dans les interleukines : - Incorporation of thiol groups in the interleukins:
10 μl d'une solution à 2,7 mg/ml de SATA dans du diméthylformamide (DMF) anhydre sont ajoutés à 100 μg d' interleukines la ou 1β dissoutes dans 200μl de tampon borate 0,1 M, pH 8. Le mélange réagit pendant 30 minutes à 25ºCC avant que lui soient ajoutés 200μl d'une solution d' hydroxylamine 1 M, pH 7. Au bout d'une nouvelle durée de réaction de 30 minutes à 25°C, les réactifs en excès 10 μl of a solution at 2.7 mg / ml of SATA in anhydrous dimethylformamide (DMF) are added to 100 μg of interleukins la or 1β dissolved in 200 μl of 0.1 M borate buffer, pH 8. The mixture reacts for 30 minutes at 25 ° C before adding 200 μl of a 1 M hydroxylamine solution, pH 7. After a further reaction time of 30 minutes at 25 ° C, the excess reagents
(SATA et hydroxylamine) sont éliminés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne Sephadex G25 (15 x 1 cm.) équilibrée par un tampon phosphate 10-1 M, pH 6, contenant 5.10-3 M d'EDTA. Avant et pendant la chromatographie, l'éluat est maintenu sous un courant continu d'azote pour éliminer l'oxygène dissous et éviter une éventuelle oxydation des groupes thiols. Des fractions contenant des interleukines thiolées sont réunies. La concentration des interleukines est évaluée par spectrométrie U.V. en supposant que le coefficient d'extinction à 280 nm est de lg-1L cm-1 et que le poids moléculaire est de 17000. Leur teneur en groupes thiols a été déterminée par colorimétrie (à 412 nm) après réaction avec de l'acide 3-5' dithiobis nitrobenzoïque (DTMB) 0,5 mM. Ces mesures ont fait apparaître qu'environ un groupe thiol a été incorporé par molécule d' interleukine. (SATA and hydroxylamine) are eliminated by chromatography on a molecular sieve on a Sephadex G25 column (15 x 1 cm.) Balanced by a 10 -1 M phosphate buffer, pH 6, containing 5.10 -3 M EDTA. Before and during the chromatography, the eluate is maintained under a continuous stream of nitrogen to remove the dissolved oxygen and avoid possible oxidation of the thiol groups. Fractions containing thiolated interleukins are combined. The interleukin concentration is evaluated by UV spectrometry assuming that the extinction coefficient at 280 nm is lg-1L cm -1 and that the molecular weight is 17000. Their content of thiol groups has been determined by colorimetry (at 412 nm) after reaction with 3-5 'dithiobis nitrobenzoic acid (DTMB) 0.5 mM. These measurements revealed that approximately one thiol group was incorporated per molecule of interleukin.
Incorporation de groupes maleimido dans l'AChE et couplage avec les interleukines thiolées :  Incorporation of maleimido groups in AChE and coupling with thiolated interleukins:
Des groupes maleimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec du SMCC ; si elle n'est pas utilisée immédiatement, la préparation d'AChE- SMCC peut être congelée à -80°C et être conservée sans perdre ses propriétés réactives, pendant au moins plusieurs semaines. Les interleukines thiolées ont été couplées à la préparation d'AChE-SMCC (forme G4) en mélangeant les deux réactifs immédiatement après qu' ils ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire ou dès qu'ils ont été décongelés. A ce stade, on a utilisé un rapport moléculaire (SH-interleukine/G4-SMCC) de 50/1. Après réaction pendant 3 heures à 30°C, l'interleukine qui n'a pas réagi est éliminée par chromatographie sur une colonne (90 x 1.5 cm) de Biogel A 0,5 M. Les conjugués sont conservés à l'état congelé à - 20ºC. Aucune perte d'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage. Il ne s'est pas produit de modification significative des propriétés immunologiques ou enzymatiques des conjugués, dans ces conditions de conservation, en l'espace d'une année. 4. MARQUAGE D'ANTICORPS MONOCLONAUX par l'AChE : Maleimido groups were introduced into AChE (form G4) by reaction with SMCC; if not used immediately, the AChE-SMCC preparation can be frozen at -80 ° C and stored without losing its reactive properties, for at least several weeks. The thiolated interleukins were coupled to the preparation of AChE-SMCC (form G4) by mixing the two reagents immediately after they were isolated by molecular sieve chromatography or as soon as they were thawed. At this stage, a molecular ratio (SH-interleukin / G4-SMCC) of 50/1 was used. After reaction for 3 hours at 30 ° C., the unreucted interleukin is eliminated by chromatography on a column (90 x 1.5 cm) of Biogel A 0.5 M. The conjugates are stored in the frozen state at - 20ºC. No loss of enzyme activity was observed during the entire coupling process. There was no significant change in the immunological or enzymatic properties of the conjugates, under these storage conditions, within one year. 4. MARKING OF MONOCLONAL ANTIBODIES by AChE:
Des anticorps monoclonaux (Acm) ont été purifiés à partir de fluides ascitiques par précipitation par de l'acide caprylique et du sulfate d'ammonium, selon une technique décrite dans l'Art antérieur. La pureté de la préparation a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes et réductrices. Deux méthodes de marquage différentes ont été utilisées pour coupler des Acm purifiés à de l'AChE.  Monoclonal antibodies (mAbs) have been purified from ascites fluids by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate, according to a technique described in the prior art. The purity of the preparation was checked by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing and reducing conditions. Two different labeling methods were used to couple purified mAbs to AChE.
4.a) Marquage d'Acm par la biotine 4.a) Marking of AMC with biotin
La biotine a été liée par covalence à des Acm tels que définis ci-dessus par réaction d'un N-hydroxy- succinimide ester de biotine activé (IBF, France) avec les groupes aminé primaire des anticorps. L'ester activé a été dissous dans du diméthylformamide anhydre et ajouté à une solution alcaline de l'anticorps à marquer : on a ajouté 40μl d'une solution à 5mg/ml d'ester de biotine dans du DMF, à 1 mg d'anticorps dissous dans 2 ml de tampon borate 0,1M, pH 8,5. Au bout de 30 minutes à la température ambiante, on a ajouté 2 ml de tampon EIA (qui sera défini plus loin). Cette préparation a été utilisée pour déterminer la "compatibilité de fixation" des différents Acm sans subir d'autres purifications. Elle a été conservée à l'état congelé à -20ºC.  Biotin has been covalently linked to mAbs as defined above by reaction of an activated biotin N-hydroxysuccinimide ester (IBF, France) with the primary amino groups of the antibodies. The activated ester was dissolved in anhydrous dimethylformamide and added to an alkaline solution of the antibody to be labeled: 40 μl of a 5 mg / ml solution of biotin ester in DMF, to 1 mg of was added. antibody dissolved in 2 ml of 0.1M borate buffer, pH 8.5. After 30 minutes at room temperature, 2 ml of EIA buffer (which will be defined later) was added. This preparation was used to determine the "binding compatibility" of the various mAbs without undergoing further purifications. It was stored frozen at -20ºC.
4. b) Marquage covalent de fragments Fab' par l'AChE 4. b) Covalent labeling of Fab 'fragments by AChE
Des fragments Fab' d'Acm ont été couplés par covalence à l'AChE par l'intermédiaire du SMCC en mettant en oeuvre une technique dérivée de celle décrite par ISHIKAWA et al. [J. IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327] pour le marquage de fragments d'anticorps par d'autres enzymes. Le principe de la méthode mise en oeuvre est très semblable à celui utilisé pour marquer les interleukines, qui a été décrit plus haut, à ceci près que, dans le cas présent, les groupes thiols impliqués dans la réaction de couplage sont naturellement présents dans les fragments Fab' obtenus par réduction du fragment F(ab')2 correspondant. Acm Fab 'fragments were covalently coupled to AChE via the SMCC using a technique derived from that described by ISHIKAWA et al. [J. IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327] for labeling antibody fragments with other enzymes. The principle of the method used is very similar to that used to label the interleukins, which has been described above, except that, in the present case, the thiol groups involved in the coupling reaction are naturally present in the Fab 'fragments obtained by reduction of the corresponding F (ab') 2 fragment.
. Préparation de fragments F(ab')2 :  . Preparation of fragments F (ab ') 2:
Des fragments F(ab')2 ont été obtenus par traitement d'Acm par de la pepsine en milieu acide (tampon acétate pH 4,3). Ils ont été isolés de la préparation brute traitée par la pepsine, par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de Biogel A 0,5 m équilibrée dans du tampon phosphate 0,1M, pH 6, contenant 5.10-3M d'EDTA. La pureté de la fraction F(ab')2 a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes non réductrices. Ces mesures ont montré que plus de 80 % de la teneur totale en protéines étaient composés de fragments de F(ab')2. Fragments F (ab ′) 2 were obtained by treatment of Acm with pepsin in an acid medium (acetate buffer pH 4.3). They were isolated from the crude preparation treated with pepsin, by chromatography on molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of 0.5 m Biogel equilibrated in 0.1 M phosphate buffer, pH 6, containing 5.10 -3 M EDTA. The purity of fraction F (ab ') 2 was verified by polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing denaturing conditions. These measurements showed that more than 80% of the total protein content was composed of fragments of F (ab ') 2.
. Préparation de fragments Fab'  . Preparation of Fab 'fragments
Des fragments F(ab')2 ont été réduits en présence de β-mercaptoéthylamine 0, 1M (βMEA) à 37°C pendant 1 heure. La βMEA en excès a été éliminée par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de Sephadex G25, comme décrit précédemment pour les interleukines thiolées. La concentration en fragments Fab' a été mesurée par spectrométrie U.V. en prenant pour coefficient d'extinction à 280 nm, 1,48 g- 1 . L cm-1 et comme poids moléculaire 46000. La teneur en groupes thiols de la préparation de Fab' a été déterminée par réaction avec le DTNB, comme pour les interleukines thiolées. Selon l'Acm utilisé, on a trouvé des valeurs comprises entre 1 et 4 groupes SH par molécule de Fab'. Fragments F (ab ') 2 were reduced in the presence of 0.1M β-mercaptoethylamine (βMEA) at 37 ° C for 1 hour. The excess βMEA was removed by chromatography on a molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of Sephadex G25, as described above for the thiolated interleukins. The concentration of Fab 'fragments was measured by UV spectrometry using the extinction coefficient at 280 nm, 1.48 g - 1 . L cm -1 and as molecular weight 46000. The content of thiol groups in the Fab 'preparation was determined by reaction with DTNB, as for the thiolated interleukins. Depending on the mAb used, values of between 1 and 4 SH groups have been found per molecule of Fab '.
. Incorporation de groupes maleimido dans l'AChE et . Incorporation of maleimido groups in AChE and
couplage avec des fragments Fab'  coupling with Fab 'fragments
Des groupes maleimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec le SMCC, suivie de purification. Le couplage de l'enzyme avec des fragments Fab' a été réalisé par mélange de la préparation AChE- SMCC (immédiatement après qu'elle a été isolée par chromatographie sur tamis moléculaire ou décongelée) avec un excès de fragments Fab'. On utilise habituellement un rapport molaire de 50 à ce stade (c'est-à-dire groupes thiols de Fab' /G4-SMCC). Après réaction pendant 3 heures à 30°C, les conjugués G4-Fab' ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne de Biogel A 0,5 m. Le conjugué a été élue sous la forme d'un seul pic homogène, la fraction correspondante a été recueillie et conservée à l'état congelé à -20ºC. Aucune perte significative de l'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage. La stabilité des conjugués s'est avérée excellente car ils ont pu être conservés soit à l'état congelé à -20º C, soit à l'état lyophilisé , soit à l'état liquide à +4ºC, sans perdre leurs propriétés enzymatiques ou immunologiques. 5. CRIBLAGE DES SURNAGEANTS DE CULTURE : Maleimido groups were introduced into AChE (form G4) by reaction with SMCC, followed by purification. The coupling of the enzyme with Fab 'fragments was carried out by mixing the AChE-SMCC preparation (immediately after it was isolated by chromatography on molecular sieve or thawed) with an excess of Fab 'fragments. Usually a molar ratio of 50 is used at this stage (i.e. thiol groups of Fab '/ G4-SMCC). After reaction for 3 hours at 30 ° C, the G4-Fab 'conjugates were isolated by chromatography on molecular sieve on a 0.5 m Biogel column. The conjugate was eluted in the form of a single homogeneous peak, the corresponding fraction was collected and stored in the frozen state at -20ºC. No significant loss of enzymatic activity was observed during the entire coupling process. The stability of the conjugates proved to be excellent because they could be stored either in the frozen state at -20º C, or in the lyophilized state, or in the liquid state at + 4ºC, without losing their enzymatic or immunological properties. . 5. SCREENING OF CULTURE SURNANTANTS:
La présence d'anticorps anti-interleukine-1 dans des surnageants de cultures d' hybridomes a été détectée en mettant en oeuvre un test immunoenzymatique analogue à celui décrit plus haut. Les surnageants de culture ont été incubés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, conjointement avec des conjugués d' interleukine 1-AChE. Pendant cette étape, les Acm anti-interleukine 1 éven- tuellement présents dans les surnageants se lient simultanément au conjugué IL-1-AChE et à la phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte de l'activité AChE sur les plaques. La présence de l'AChE sur la phase solide a en outre été révélée (après une étape de lavage) par addition du substrat et mesure par colorimétrie. La préparation et les caractéristiques du second anticorps en phase solide sont bien connues ; 50 μl de chaque surnageant présent sur les plaques de microtitration comportant 96 puits, ont été transférés dans des conditions stériles dans des plaques de microtitration de mêmes dimensions, revêtues du second anticorps. 50μl de conju gué interleukine 1-AChE (1 unité ELLMAN/ml) dissous dans du tampon EIA ont alors été ajoutés et on a laissé réagir le mélange pendant une nuit à +4°C. A la fin de cette première période de réaction, les plaques ont été soigneusement lavées avant d'ajouter 200μl de réactif d'ELLMAN dans chaque puits. A ce stade les puits contenant de l'activité AChE liée à la phase solide ont développé une forte coloration jaune qui indique la présence d'anticorps anti-IL-1 dans le surnageant correspondant. L'absorbance à 414 nm de chaque puits a été mesurée 30 minutes ou une heure plus tard en utilisant un lecteur automatique de plaques (TITERTEK, Finlande). Ce processus de criblage permet une sélection très rapide et efficace des hybridomes attendu que des quantités d'Acm de l'ordre du nanograme sont facilement détectées, le criblage de 2 000 surnageants ne requérant pas plus de 4 heures de travail pour une personne. The presence of anti-interleukin-1 antibodies in supernatants of hybridoma cultures was detected using an enzyme immunoassay similar to that described above. The culture supernatants were incubated in microtiter plates coated with a second anti-mouse IgG antibody, together with conjugates of interleukin 1-AChE. During this step, the anti-interleukin 1 mAbs optionally present in the supernatants bind simultaneously to the IL-1-AChE conjugate and to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the AChE activity on the plates. The presence of AChE on the solid phase was further revealed (after a washing step) by adding the substrate and measuring by colorimetry. The preparation and characteristics of the second solid phase antibody are well known; 50 μl of each supernatant present on the microtitration plates comprising 96 wells, were transferred under sterile conditions into microtitration plates of the same dimensions, coated with the second antibody. 50μl of conjugate ford interleukin 1-AChE (1 ELLMAN unit / ml) dissolved in EIA buffer were then added and the mixture was allowed to react overnight at + 4 ° C. At the end of this first reaction period, the plates were washed thoroughly before adding 200 μl of ELLMAN reagent to each well. At this stage, the wells containing AChE activity linked to the solid phase have developed a strong yellow coloration which indicates the presence of anti-IL-1 antibodies in the corresponding supernatant. The absorbance at 414 nm from each well was measured 30 minutes or an hour later using an automatic plate reader (TITERTEK, Finland). This screening process allows a very rapid and efficient selection of hybridomas since quantities of mAb of the order of nanograme are easily detected, the screening of 2000 supernatants requires no more than 4 hours of work for a person.
6. DETERMINATION DE LA COMPATIBILITE DE FIXATION POUR  6. DETERMINATION OF FIXING COMPATIBILITY FOR
CHAQUE PAIRE D'Acm  EACH PAIR OF ACM
La compatibilité de fixation de deux Acm différents sur une seule molécule d' Interleukine-1 a été déterminée dans un test immunométrique dans lequel l'un des Acm a été immobilisé sur une phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine. Ces tests ont été effectués comme suit : toutes les dilutions ont été réalisées dans du tampon EIA et 100 μl d'une solution à 100 ng/ml d'interleukine-1α ou 1β recombinante ont été ajoutés à des puits de plaques de microtitration revêtus de l'un des Acm. Au bout d'une heure de réaction à la température ambiante sous agitation, 100 μl d'une solution 10 μg/ml d'un autre Acm marqué à la biotine, ont été ajoutés. Après une nouvelle période de 3 heures de réaction à la température ambiante sous agitation, les plaques ont été soigneusement lavées. La présence éventuelle d'anticorps marqués à la biotine sur la phase solide a été ensuite révélée par addition d'un mélange d'avidine et d'AChE biotinylée. Une fixation non spécifique d'AChE sur la phase solide a été évaluée dans des expériences témoins au cours descruelles 100 μl de tampon ont remplacé l'interleukine-1. Lorsque l'on a obtenu une fixation simultanée des Acm immobilisés sur la phase solide et des ACM marqués à la biotine, il s'est développé une forte couleur jaune après addition du réactif d'ELLMAN. The binding compatibility of two different mAbs on a single molecule of Interleukin-1 was determined in an immunometric test in which one of the mAbs was immobilized on a solid phase while the other was labeled with biotin molecules . These tests were carried out as follows: all the dilutions were carried out in EIA buffer and 100 μl of a solution at 100 ng / ml of recombinant interleukin-1α or 1β were added to wells of microtitration plates coated with one of the Acm. After one hour of reaction at room temperature with stirring, 100 μl of a 10 μg / ml solution of another biotin-labeled mAb were added. After a further 3 hour reaction period at room temperature with stirring, the plates were washed thoroughly. The possible presence of biotin-labeled antibodies on the solid phase was then revealed by adding a mixture of avidin and biotinylated AChE. A non-specific binding of AChE to the solid phase was evaluated in control experiments during cruel 100 μl of buffer replaced interleukin-1. When a simultaneous fixation of the immobilized mAbs on the solid phase and of the biotin-labeled mAbs was obtained, a strong yellow color developed after addition of the ELLMAN reagent.
7. ESSAIS IMMUNOENZYMATIOUES DE DETECTION DE L'IL-1α ET DE L'IL-1β 7. IMMUNOENZYMATIOUS ASSAYS FOR THE DETECTION OF IL-1α AND IL-1β
Deux types différents d'EIA pour les interleukines-1α et 1β ont été développés.  Two different types of EIA for interleukins-1α and 1β have been developed.
Des anticorps monoclonaux provenant de surnageants de culture ou de fluides ascitiques ont tout d'abord été testés dans un immuno-essai par compétition en utilisant des conjugués IL-1-AChE comme traceurs. Dans une deuxième étape, ont été développés des essais immunométriques impliquant l'utilisation simultanée d'Acm anti-interleukines, soit revêtant une phase solide, soit marqués par de l'AChE. Tous les réactifs utilisés dans l'immuno-essai ont été dilués dans le tampon EIA dont il a été question plus haut, dont la composition est la suivante : phosphate 0,1 M, pH 7,6, contenant 0,4 M NaCl, 10-3 M EDTA, 0,1 % BSA et 0,01 % azide de sodium. Toutes les concentrations mentionnées dans les immuno-essais se réfèrent à la concentration des réactifs dans le "volume initial" (50 μl pour l'essai par compétition, 100 μl pour l'essai immunométrique) avant mélange avec les autres réactifs. Monoclonal antibodies from culture supernatants or ascites fluids were first tested in a competitive immunoassay using IL-1-AChE conjugates as tracers. In a second step, immunometric tests were developed involving the simultaneous use of anti-interleukin mAbs, either coating a solid phase or marked with AChE. All the reagents used in the immunoassay were diluted in the EIA buffer mentioned above, the composition of which is as follows: 0.1 M phosphate, pH 7.6, containing 0.4 M NaCl, 10 -3 M EDTA, 0.1% BSA and 0.01% sodium azide. All the concentrations mentioned in the immunoassays refer to the concentration of the reagents in the "initial volume" (50 μl for the competition test, 100 μl for the immunometric test) before mixing with the other reagents.
- Immuno-essais par compétition utilisant des conjugués IL-1-AChE. - Competition immunoassays using IL-1-AChE conjugates.
Des immuno-essais par compétition classiques utilisant des Acm comme premiers anticorps et des conjugués IL-1-AChE comme traceurs, ont été réalisés comme décrit dans la Littérature en relation avec les haptènes ou les antigènes. Ces essais ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits, revêtues d'un second anticorps constitué par des IgG de lapin anti-souris. Ce second anticorps en phase solide assure une séparation entre les fractions liées et les fractions libres du traceur pendant le cours de l'immunoréaction spécifique. Le volume total de la réaction était de 150 μl, chaque composant (traceur, Acm et IL-1 recombinante) a été ajouté en un volume de 50 μl . Les conjugués IL-1-AChE ont été utilisés à une concentration de 1 unité ELLMAN/ml. Les dilutions de travail des Acm ont été déterminées au préalable en réalisant des courbes de dilution d'anticorps à partir de surnageants de culture ou de fluides ascitiques. La sensibilité des tests a été caractérisée par la dose d'IL-1 soit qui induit une diminution de 50 % de la fixation observée en l'absence de compétiteur (B/Bo = 50 %) , soit qui induit une diminution statistiquement significative de la fixation observée en l'absence de compétiteur (Bo), soit Bo-3 déviations standard (taux de confiance 99 %). Conventional competitive immunoassays using mAbs as the first antibodies and IL-1-AChE conjugates as tracers have been performed as described in the literature in relation to haptens or antigens. These tests were carried out in microtiter plates comprising 96 wells, coated with a second antibody constituted by rabbit anti-mouse IgG. This second solid phase antibody ensures separation between the bound fractions and the free fractions of the tracer during the course of the specific immunoreaction. The total volume of the reaction was 150 μl, each component (tracer, mAb and recombinant IL-1) was added in a volume of 50 μl. The IL-1-AChE conjugates were used at a concentration of 1 ELLMAN unit / ml. The working dilutions of the mAbs were determined beforehand by carrying out antibody dilution curves from culture supernatants or ascites fluids. The sensitivity of the tests was characterized by the dose of IL-1 which either induced a reduction of 50% in the fixation observed in the absence of a competitor (B / Bo = 50%), or which induced a statistically significant reduction in the fixation observed in the absence of a competitor (Bo), ie Bo-3 standard deviations (confidence rate 99%).
- Essais immunométriques utilisant des conjugués Acm¬- Immunometric tests using Acm¬ conjugates
AChE. AChE.
Des essais immunométriques ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits, revêtues de l'un des anticorps monoclonaux. Le revêtement a été réalisé exactement comme décrit plus haut pour le second anticorps en phase solide. En bref, les puits des plaques de microtitration ont été remplis de 200 μl d'une solution à 10 μg/ml d'Acm dissous dans du tampon phosphate 5 x 10-2M, mH 7,4. Après avoir laissé la réaction se produire pendant une nuit à la température ambiante, les plaques ont été soigneusement lavées avec du tampon phosphate 10-2, pH 7,4 contenant du TWEEN 20, 0,05 %. La phase solide a alors été saturée en ajoutant dans chaque puits 300 μl de tampon EIA pendant au moins 4 heures à la température ambiante. Les plaques ont été conservées à 4° C dans ce tampon de saturation jusqu'à ce qu'elles soient utilisées. Lorsqu'elles ont été conservées dans ces conditions, il n'a pas été observé de modifications de leurs propriétés de fixation pendant au moins une période de quatre mois. Les essais immunométriques ont été réalisés en utilisant deux processus différents. Immunometric tests were carried out in microtiter plates comprising 96 wells, coated with one of the monoclonal antibodies. The coating was carried out exactly as described above for the second antibody in solid phase. Briefly, the wells of the microtitration plates were filled with 200 μl of a 10 μg / ml solution of mAb dissolved in 5 × 10 -2 M phosphate buffer, 7.4 mH. After allowing the reaction to occur overnight at room temperature, the plates were washed thoroughly with 10 -2 phosphate buffer, pH 7.4 containing TWEEN 20, 0.05%. The solid phase was then saturated by adding 300 μl of EIA buffer to each well for at least 4 hours at room temperature. Plates were stored at 4 ° C in this saturation buffer until that they be used. When stored under these conditions, no changes in their fixing properties were observed for at least a period of four months. The immunometric tests were carried out using two different procedures.
Le premier protocole (dénommé "Protocole simultané") a consisté à ajouter 100 μl d' interleukine-1 en solution (introduite sous la forme d'un standard recombinant ou d'un échantillon) dans des puits de plaques de microtitration, conjointement avec 100 μl de conjugués Acm-AChE (habituellement à une concentration de 10 unités ELLMAN/ml). Dans cette méthode, les deux anticorps (l'anticorps en phase solide et l'anticorps marqué par l'AChE) réagissent simultanément avec l'interleukine- 1. Selon la nature de l'échantillon à tester, on dissout 1'interleukine-1 recombinante standard dans le diluant correspondant, c'est-à-dire du milieu de culture, du plasma ou du sérum. Dans toute la mesure du possible, tous les diluants utilisés doivent être dépourvus d' interleukine-1α ou 1β. Pour le plasma ou le sérum, ceci est possible en sélectionnant les fluides individuels pour lesquels les tests immunométriques ne pourraient pas détecter de quantités significatives d'IL-1α ou d'IL-1β. Lorsque les EIA sont réalisés dans ces milieux, on utilise de l'immunoglobuline de souris (introduite à une dilution de 1/20 dans de l'ascite d'ERLICH) ajoutée pendant l'immuno réaction pour neutraliser les anticorps humains anti-souris présents dans ces fluides. Une fixation non spécifique a été évaluée dans des puits séparés dans lesquels 100 μl de tampon ou d'un diluant approprié avaient été ajoutés à la place de l'interleukine-1 recombinante. La réaction a alors eu lieu pendant des périodes de temps variables à différentes températures, sous agitation ou sans agitation. A la fin de cette étape d'immunm-réaction, les plaques ont été soigneusement lavées en utilisant un tampon phosphate-Tween. L'activitéThe first protocol (called "Simultaneous Protocol") consisted in adding 100 μl of interleukin-1 in solution (introduced in the form of a recombinant standard or a sample) into wells of microtitration plates, together with 100 μl of Acm-AChE conjugates (usually at a concentration of 10 ELLMAN units / ml). In this method, the two antibodies (the solid phase antibody and the antibody labeled with AChE) react simultaneously with interleukin-1. According to the nature of the sample to be tested, interleukin-1 is dissolved standard recombinant in the corresponding diluent, i.e. culture medium, plasma or serum. As far as possible, all diluents used should be free of interleukin-1α or 1β. For plasma or serum, this is possible by selecting the individual fluids for which the immunometric tests could not detect significant amounts of IL-1α or IL-1β. When the EIAs are carried out in these media, mouse immunoglobulin (introduced at a dilution of 1/20 in ERLICH ascites) is used added during the immunoreaction to neutralize the human anti-mouse antibodies present. in these fluids. Non-specific binding was evaluated in separate wells in which 100 μl of buffer or of an appropriate diluent had been added in place of the recombinant interleukin-1. The reaction then took place for varying periods of time at different temperatures, with stirring or without stirring. At the end of this immuno-reaction step, the plates were carefully washed using phosphate-Tween buffer. The activity
AChE fixée à la phase solide a été déterminée par addition de 200 μl de réactif d'ELLMAN. AChE fixed to the solid phase was determined by adding 200 μl of ELLMAN reagent.
Un second protocole (dénommé "Protocole séquentiel") consiste à faire réagir l'interleukine-1 et le conjugué Acm-AChE séparément. Au cours d'une première période d'incubation, 200 μl d'interleukine-1 (introduite sous forme d'étalon ou d'échantillon) dissous dans du tampon EIA ou tout autre diluant approprié (milieu de culture, plasma, etc...) réagissent avec la phase solide. A la fin de cette première incubation, les plaques sont lavées avant d'ajouter 200 μl de conjugué Acm-AChE (habituellement à 10 unités ELLMANN/ml) dissous dans du tampon EIA. Après une seconde période de réaction, les plaques sont lavées à nouveau et l'activité AChE est révélée comme décrit plus haut.  A second protocol (called "sequential protocol") consists in reacting interleukin-1 and the Acm-AChE conjugate separately. During a first incubation period, 200 μl of interleukin-1 (introduced in the form of a standard or sample) dissolved in EIA buffer or any other appropriate diluent (culture medium, plasma, etc.) .) react with the solid phase. At the end of this first incubation, the plates are washed before adding 200 μl of Acm-AChE conjugate (usually at 10 ELLMANN units / ml) dissolved in EIA buffer. After a second reaction period, the plates are washed again and the AChE activity is revealed as described above.
Des "profils d'imprécision" de courbes standard ont été établis en réalisant toutes les mesures (fixation non spécifique aussi bien que mesures standards) à huit reprises. Pour chaque dose, la précision a été exprimée en termes de coefficient de variation (CV %) et a été mise sous forme de courbe en fonction du logarithme de la dose.  Standard curves "imprecision profiles" were established by performing all the measurements (non-specific fixation as well as standard measurements) eight times. For each dose, the precision was expressed in terms of coefficient of variation (CV%) and was plotted as a function of the dose logarithm.
La sensibilité des essais immunométriques a été caractérisée par leur "concentration détectable minimum" (MDC) qui correspond à la concentration d' IL-1 produisant une augmentation statistiquement significative de la fixation observée en l'absence d'IL-1 recombinante standard. La MDC a été calculée comme étant la dose d'IL- 1 qui correspond à la fixation non spécifique + 3 déviations standard (avec un taux de confiance de 99 %).  The sensitivity of the immunometric tests was characterized by their "minimum detectable concentration" (MDC) which corresponds to the concentration of IL-1 producing a statistically significant increase in the binding observed in the absence of standard recombinant IL-1. The MDC was calculated as the dose of IL-1 which corresponds to non-specific fixation + 3 standard deviations (with a confidence rate of 99%).
8. TESTS FPLC 8. FPLC TESTS
Une substance immuno-réactive détectée par des essais immunométriques dans des milieux biologiques (surnageant de culture, plasma) a été caractérisée en fractionnant les échantillons par chromatographie sur tamis moléculaire à l'aide d'un équipement FPLC et d'une colonne de Superose 12 équilibrée par du tampon EIA. On a injecté de l'IL-1 recombinante étalon et des échantillons sous un volume de 500 μl et à un débit de 24 ml/heure puis on a collecté des fractions de 0,8 ml. A la fin de la chromatographie, on a testé 100 μl de chacune des fractions en mettant en oeuvre le test IL-1α et/ou IL-1β comme décrit plus haut. An immunoreactive substance detected by immunometric tests in biological media (culture supernatant, plasma) has been characterized by fractionating samples by molecular sieve chromatography using FPLC equipment and a Superose 12 column equilibrated with EIA buffer. Standard recombinant IL-1 and samples were injected in a volume of 500 μl and at a flow rate of 24 ml / hour and then 0.8 ml fractions were collected. At the end of the chromatography, 100 μl of each of the fractions was tested by implementing the IL-1α and / or IL-1β test as described above.
9. PREPARATION D'ECHANTILLONS DESTINES A ETRE SOUMIS A 9. PREPARATION OF SAMPLES FOR SUBMISSION
DES EIA POUR LA DETECTION D' IL-1α ET D'IL-1β  EIAs FOR THE DETECTION OF IL-1α AND IL-1β
- Surnageants de cellules elutriées. - Supernatants of elutriated cells.
Des leucocytes mononucléaires (lymphocytes et monocytes) et polymorphonucléaires (neutrophiles) de sang périphérique ont été obtenus par centrifugation sur du FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMICALS) et ont été ensuite soumis à une élutriation centrifuge à contre-courant pour permettre l'obtention de lymphocytes, de monocytes et de neutrophiles purs. Pour ce faire, on a injecté des celIules mononucléaires ou polymorphonucléaires dans une chambre de séparation d'un rotor élutriateur de BECKMAN Mononuclear leukocytes (lymphocytes and monocytes) and polymorphonuclear (neutrophils) from peripheral blood were obtained by centrifugation on FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMICALS) and were then subjected to countercurrent centrifugal elutriation to allow the production of lymphocytes, pure monocytes and neutrophils. To do this, mononuclear or polymorphonuclear cells were injected into a separation chamber of a BECKMAN elutriator rotor
(JE-6), à un débit de 8 ou 20 ml/minute respectivement, à une vitesse constante du rotor de 2 500 tours/minute. Le tampon d' élutriation était constitué par une solution saturée de PBS de Dulbecco supplémentée par 0,25 % de BSA et 2mM d'EDTA. Les plaquettes ont été lavées après une demi-heure d' élutriation, au débit d'injection. Le fractionnement de leucocytes mononucléaires a été réalisé comme suit : des lymphocytes purs ont été obtenus en augmentant le débit de 8 à 20 ml/min. 50 ml de milieu ont été collectés à chaque étape, centrifugés (350 x g, 10 min.) et le culot de cellules a été lavé une fois dans une solution isotonique et finalement remis en suspension dans le milieu d'incubation (RPMI 1640 avec de la L-glu- tamine, 7,5 % de sérum bovin foetal et penstrep) . Des fractions de lymphocytes purs (monocytes, < 0,5 %) ou des fractions de monocytes enrichis (lymphocytes, < 20%) ont été collectées et ajustées à 10 x 106 ou 1 x 106 cellules/ml, respectivement. Les neutrophiles ont été débarrassés de monocytes contaminants en augmentant le débit de 20 à 25 ml/min en utilisant des paliers de 0,25 ml/min et en collectant des fractions de 5 ml. Des neutrophiles purs ont alors été collectés en une fraction unique en arrêtant le rotor. La fraction de neutrophiles a été lavée une fois dans une solution isotonique et finalement remise en suspension dans le milieu d'incubation à 20 x 106 cellules/ml. Des incubations ont été réalisées dans des tubes de culture en propylène de 12 x 75 mm à 37° C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Des comptages de cellules différentiels de leucocytes ont été réalisés par : (JE-6), at a flow rate of 8 or 20 ml / minute respectively, at a constant rotor speed of 2,500 revolutions / minute. The elutriation buffer consisted of a saturated PBS solution from Dulbecco supplemented with 0.25% BSA and 2 mM EDTA. The platelets were washed after half an hour of elutriation, at the injection rate. The fractionation of mononuclear leukocytes was carried out as follows: pure lymphocytes were obtained by increasing the flow rate from 8 to 20 ml / min. 50 ml of medium were collected at each stage, centrifuged (350 xg, 10 min.) And the cell pellet was washed once in an isotonic solution and finally resuspended in the incubation medium (RPMI 1640 with L-glutamine, 7.5% fetal bovine serum and penstrep). Fractions of pure lymphocytes (monocytes, <0.5%) or enriched monocyte fractions (lymphocytes, <20%) were collected and adjusted to 10 x 10 6 or 1 x 10 6 cells / ml, respectively. Neutrophils were cleared of contaminating monocytes by increasing the flow rate from 20 to 25 ml / min using steps of 0.25 ml / min and collecting 5 ml fractions. Pure neutrophils were then collected in a single fraction by stopping the rotor. The neutrophil fraction was washed once in an isotonic solution and finally resuspended in the incubation medium at 20 x 10 6 cells / ml. Incubations were carried out in 12 x 75 mm propylene culture tubes at 37 ° C., in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 . Differential leukocyte cell counts were performed by:
1) cytométrie en flux en utilisant des caractéristiques de dispersion de lumière à angle aigu et à angle droit,  1) flow cytometry using acute and right angle light scattering characteristics,
2) par coloration non spécifique à l'estérase et au colorant de WRIGHT,  2) by non-specific staining with esterase and the WRIGHT dye,
3) par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine et  3) by immunofluorescence with monoclonal antibodies conjugated to fluorescein and
4) par analyse au microscope en contraste de phases, pour la contamination des plaquettes.  4) by phase contrast microscope analysis for contamination of platelets.
La viabilité des cellules a été établie en routine à l'aide du test d'exclusion au bleu trypan dans chaque expérience et a été supérieure à 95 %. Des cellules ont été cultivées aussi bien en l'absence qu'en présence de 5 μg/ml de lipopolysaccharide (LPS) ; les cultures cellulaires ont été réalisées en présence de 0,1 μm d'indométhacine. A différents intervalles de temps, les milieux de culture ont été centrifugés (600 x g, 10 min., 4° C) et immédiatement congelés à - 20° C jusqu'à la mesure de l'IL-1α et de l'IL-1β en utilisant des EIA sélectifs. EXEMPLE 2 : Caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-Cell viability was routinely established using the trypan blue exclusion test in each experiment and was greater than 95%. Cells were cultured both in the absence and in the presence of 5 μg / ml of lipopolysaccharide (LPS); cell cultures were carried out in the presence of 0.1 μm indomethacin. At different time intervals, the culture media were centrifuged (600 xg, 10 min., 4 ° C) and immediately frozen at -20 ° C until the measurement of IL-1α and IL- 1β using selective EIAs. EXAMPLE 2 Characterization of anti-monoclonal antibodies
IL-1 et réalisation d'essais immunométriques IL-1 and carrying out immunometric tests
Pour chaque interleukine, la souris dont le sérum présentait le titre le plus élevé dans les essais immunoenzymatiques, a été sélectionnée pour la fusion. Les cellules de rate correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de NSI comme décrit plus haut. Une semaine après la fusion, environ 500 puits présentaient des hybridomes qui se multipliaient activement pour les deux interleukines. La présence d'anticorps de souris anti-interleukine a été vérifiée dans tous les surnageants de culture en testant leur capacité à fixer le conjugué correspondant IL-1-AChE. Dans un criblage primaire, 90 et 116 surnageants de culture fortement positifs ont été détectés respectivement pour l'IL-1α et l'IL-1β. Les hybridomes correspondants ont été sous-clo- nés par des dilutions limitantes pour obtenir une lignée cellulaire sécrétant des anticorps, stable, unique pour chaque culture. Finalement, 36 et 11 lignées cellulaires ont été stabilisées respectivement pour l' IL-1α et l'IL- 1β. Tous les clones ont été caractérisés par un nombre précédé par la lettre α ou β selon l'interleukine contre laquelle ils avaient été dirigés. Ils ont été cultivés en tant que tumeurs ascitiques et les anticorps monoclonaux ont été purifiés à partir de fluide ascitique par précipitation par de l'acide caprylique et du sulfate d' ammonium. Les isotypes ont été déterminés à partir du fluide ascitique par la technique de double diffusion d'OUCHTERLONY. Tous les Acm étaient des IgG possédant une chaîne légère K, la sous-classe IgG1 étant de loin la plus commune (cf. Tableaux I et II ci-après). For each interleukin, the mouse whose serum had the highest titer in the enzyme immunoassays was selected for fusion. The corresponding spleen cells were fused with NSI myeloma cells as described above. One week after the fusion, approximately 500 wells presented hybridomas which were actively multiplying for the two interleukins. The presence of anti-interleukin mouse antibodies was verified in all the culture supernatants by testing their capacity to fix the corresponding IL-1-AChE conjugate. In a primary screening, 90 and 116 strongly positive culture supernatants were detected for IL-1α and IL-1β respectively. The corresponding hybridomas were subcloned by limiting dilutions in order to obtain a cell line secreting antibodies, stable, unique for each culture. Finally, 36 and 11 cell lines were respectively stabilized for IL-1α and IL-1β. All the clones were characterized by a number preceded by the letter α or β according to the interleukin against which they had been directed. They were cultured as ascites tumors and the monoclonal antibodies were purified from ascites fluid by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate. The isotypes were determined from ascites fluid by the OUCHTERLONY double diffusion technique. All of the mAbs were IgGs having a K light chain, with IgG 1 being by far the most common (see Tables I and II below).
Les tests de compatibilité de fixation ont été réalisés comme décrit plus haut dans l'exemple 1. Les cercles pleins indiquent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués. Pour clarifier la présentation, les Acm présentant la même définition ont été groupés en trois catégories (A à C). Tous les Acm sont de la sous-classe IgG1 sauf l'Acm 100 (groupe A) et les Acm 50 et 176 (groupe B) qui sont des IgG2. The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1. The solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed. To clarify the presentation, the mAbs with the same definition have been grouped into three categories (A to C). All mAbs are in the IgG 1 subclass except mAb 100 (group A) and mAbs 50 and 176 (group B) which are IgG 2 .
TABLEAU II : RESULTATS DES TESTS DE COMPATIBILITE DE FIXATION POUR LES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI IL- 1β.  TABLE II: RESULTS OF FIXING COMPATIBILITY TESTS FOR MONOCLONAL ANTI-IL-1β ANTIBODIES.
Les tests de compatibilité de fixation ont été réalisés comme décrit plus haut dans l'exemple 1. Les cercles pleins indiquent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués. Pour clarifier la présentation, les Acm présentant le même type de fixation ont été groupés en quatre catégories (A à D). La sousclasse d'IgG de chaque Acm est mentionnée dans la dernière colonne. Des surnageants de culture aussi bien que des fluides ascitiques ont été utilisés dans des essais immunoenzymatiques par compétition impliquant des conjugués IL-1-AChE comme traceurs. Dans 1a plupart des cas (sauf en ce qui concerne les clones β26 et β54), des courbes standard ont pu être établies en utilisant l'IL-1α et l'IL-1β recombinantes comme étalons. Lorsqu'elle est définie en termes de B/Bg = 50 %, la sensibilité de ces essais est comprise entre 4 et 100 ng/ml. Dans les meilleurs cas, la concentration minimale détectable de 1 ng/ml a pu être calculée. Tous les Acm se sont avérés être très spécifiques de l'interleukine contre laquelle ils avaient été dirigés car on n'a pu mesurer qu'une réactivité croisée inexistante ou très faible entre l'IL-1α et l'IL-1β. On trouvera à titre indicatif dans le tableau III qui va suivre, les caractéristiques de quelques-uns de ces essais par compétition pour l'IL-1α, ainsi que les résultats obtenus avec des anticorps polyclonaux de mouton ou de lapin. The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1. The solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed. To clarify the presentation, mAbs with the same type of fixation have been grouped into four categories (A to D). The IgG subclass of each mAb is mentioned in the last column. Culture supernatants as well as ascites fluids have been used in competitive enzyme immunoassays involving IL-1-AChE conjugates as tracers. In most cases (except for the β26 and β54 clones), standard curves could be established using recombinant IL-1α and IL-1β as standards. When defined in terms of B / Bg = 50%, the sensitivity of these tests is between 4 and 100 ng / ml. In the best cases, the minimum detectable concentration of 1 ng / ml could be calculated. All the mAbs were found to be very specific for the interleukin against which they had been directed because only a non-existent or very weak cross-reactivity could be measured between IL-1α and IL-1β. The characteristics of some of these competition trials for IL-1α, as well as the results obtained with polyclonal sheep or rabbit antibodies, will be found in table III which follows.
TABLEAU III : PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DESTABLE III: MAIN CHARACTERISTICS OF
ESSAIS IMMUNOENZYMATIQUES PAR COMPETITION POUR L' IL-1α EN UTILISANT SOIT DES ANTICORPS POLYCLONAUX SOIT DES ANTICORPS MONOCLONAUX ET DES CONJUGUES D' IL-1a-AChE. COMPETITION IMMUNOENZYMATICS FOR IL-1α USING EITHER POLYCLONAL ANTIBODIES OR MONOCLONAL ANTIBODIES AND IL-1a-AChE CONJUGATES.
* B/Bo : 50 % correspond à la dose qui induit une diminution de 50 % de la fixation du traceur observée en l'absence de compétiteur.  * B / Bo: 50% corresponds to the dose which induces a reduction of 50% in the binding of the tracer observed in the absence of a competitor.
La présente invention a pour l'un de ses buts essentiels de développer des essais immunométriques en deux sites aussi bien pour l'IL-1α que pour l'IL-1β, en sorte qu' il convient de déterminer quelles sont les paires d'Acm qui pourraient se fixer simultanément à chaque interleukine. Ces études de complémentarité de fixation ont été réalisées à l'aide de tests immunométriques dans lesquels l'un des Acm était immobilisé sur la phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine. A ce stade, le marquage par la biotine a été choisi car il s'agit d'une méthode tout à fait simple qui permet le marquage d'un grand nombre d'AcmOne of its essential aims is to develop immunometric tests at two sites for both IL-1α and IL-1β, so that it is necessary to determine which pairs of MAbs which could be attached simultaneously to each interleukin. These binding complementarity studies were carried out using immunometric tests in which one of the mAbs was immobilized on the solid phase while the other was labeled with biotin molecules. At this stage, labeling with biotin was chosen because it is a completely simple which allows the marking of a large number of AMC
(plus de 40) en quelques minutes. En outre, l'utilisation subséquente d'un mélange d'avidine et d'AChE marquée par la biotine permet une détection sensible d'anticorps biotinylés immobilisés sur la phase solide. (over 40) in minutes. In addition, the subsequent use of a mixture of avidin and biotin-labeled AChE allows sensitive detection of biotinylated antibodies immobilized on the solid phase.
Les tableaux I et II ci-dessus présentent les résultats de ces tests complémentaires pour l'IL-1α et l'IL-1β respectivement. Dans le cas de l'IL-1α, on voit qu'il existe trois groupes d'Acm qui reconnaissent des epitopes qui se trouvent dans trois régions différentes des molécules d'IL-1α. Ces groupes, qui ont été désignés par A, B et C, contiennent respectivement 10, 25 et 1 anticorps monoclonaux. Tous les Acm d'un groupe présentent une fixation compatible avec tous les Acm des deux autres groupes, tandis qu'ils ne se fixent pas simultanément entre eux ou avec des Acm du même groupe. Dans le cas de l ' IL-1β, la situation est moins claire . En fait , on observe quatre groupes différents. Dans les deux premiers groupes (dénommés A et B, contenant respectivement 4 et 3 Acm) on observe un comportement logique, analogue à celui observé pour l'IL-1α (cf. Tableau II). Le troisième groupe (C) contient deux Acm qui sont compatibles uniquement avec un Acm des groupes A et B (β 28 et β 36 respectivement). Enfin, le groupe D contient 2 Acm qui ne permettent l'immobilisation d'aucun des autres Acm en phase solide. Après avoir déterminé tous les couples possibles d'Acm présentant une fixation compatible, il s'agit à présent de sélectionner pour chaque interleukine le couple présentant les propriétés optimales en vue de développer un essai immunométrique sensible, spécifique et fiable. Cette sélection doit être réalisée en utilisant des conjugués covalents Acm-AChE (et non des Acm marqués à la biotine) car ils permettent une détection plus sensible des interleukines. Dans le cas de l'IL-1β, comme il n'existait que 29 possibilités différentes, cette sélection a été facile à réaliser et il a été pro posé de choisir de préparer les 9 conjugués Acm-AChE correspondants. Ceci s'est avéré cependant plus difficile dans le cas de l'IL-1α car la préparation de 36 conjugués Acm-AChE aussi bien que la vérification des 570 possibilités différentes existantes représente un travail considérable. C'est la raison pour laquelle il a été procédé différemment : au cours d'une première étape, quelques conjugués Acm-AChE ont été préparés et ont été ensuite testés contre toutes les phases solides pertinentes. Au vu des résultats correspondants, les Acm qui ont procuré les résultats les meilleurs (c'est-à-dire la fixation la plus importante de conjugués Acm-AChe pour une dose donnée d' interleukine) ont été marqués et on a poursuivi les tests avec eux en utilisant les Acm immobilisés corres- pondants. Ainsi, les anticorps α5, α29, α100, α147 (groupe A), α176, α39 (groupe B), et α101 (groupe C) ont été sucessivement marqués et testés. Tables I and II above present the results of these additional tests for IL-1α and IL-1β respectively. In the case of IL-1α, we see that there are three groups of mAbs which recognize epitopes which are found in three different regions of the molecules of IL-1α. These groups, which have been designated by A, B and C, contain 10, 25 and 1 monoclonal antibodies, respectively. All the mAbs of a group have a binding compatible with all the mAbs of the other two groups, while they do not bind simultaneously to each other or with mAbs of the same group. In the case of IL-1β, the situation is less clear. In fact, there are four different groups. In the first two groups (called A and B, containing 4 and 3 mAbs respectively) a logical behavior is observed, analogous to that observed for IL-1α (cf. Table II). The third group (C) contains two mAbs which are compatible only with a group A and B mAb (β 28 and β 36 respectively). Finally, group D contains 2 mAbs which do not allow the immobilization of any of the other mAbs in solid phase. After having determined all the possible pairs of mAb having a compatible fixation, it is now a question of selecting for each interleukin the couple having the optimal properties with a view to developing a sensitive, specific and reliable immunometric test. This selection must be carried out using covalent Acm-AChE conjugates (and not Biot-labeled mAbs) because they allow more sensitive detection of interleukins. In the case of IL-1β, since there were only 29 different possibilities, this selection was easy to make and it was pro asked to choose to prepare the 9 corresponding Acm-AChE conjugates. This proved to be more difficult in the case of IL-1α, however, since the preparation of 36 Acm-AChE conjugates as well as the verification of the 570 different existing possibilities represents considerable work. This is the reason why it was done differently: during a first step, some Acm-AChE conjugates were prepared and were then tested against all the relevant solid phases. In view of the corresponding results, the mAbs which gave the best results (ie the most significant binding of Acm-AChe conjugates for a given dose of interleukin) were marked and the tests were continued. with them using the corresponding immobilized mAbs. Thus, the antibodies α5, α29, α100, α147 (group A), α176, α39 (group B), and α101 (group C) were successively labeled and tested.
Ce processus a permis de mettre en évidence un petit nombre de couples qui permettent une détermination plus sensible de chaque IL-1. Pour l'IL-1α, les résultats les meilleurs ont été obtenus en utilisant soit αlOl (en tant que phase solide ou traceur) ou des traceurs du groupe A avec des phases solides du groupe B. Dans le cas de l'IL-1β, un couple composé de β79 comme phase solide et de β70-AChE comme traceur s'est avéré significativement supérieur à tous les autres couples. Une sélection finale du couple optimal a été réalisée en tenant compte non seulement de l'intensité du signal mais également d'autres critères incluant l'absence de réactivité croisée avec d'autres interleukines ou des substances apparentées, un taux de fixation non spécifique, une influence non spécifique exercée par les milieux biologiques (plasma ou sérum). Les critères de spécificité ne sont pas essentiels car tous les couples testés présentent une réactivité croisée très faible avec les autres interleukines (IL-1α ou IL-1β et IL-2). Toutefois, la se lection de couples présentant une faible fixation non spécifique est importante car ceci a une influence critique sur la sensibilité du test. De même, il est nécessaire de minimiser les effets non spécifiques dûs aux milieux biologiques afin de renforcer la validité des mesures réalisées dans ces milieux. Enfin, les couples suivants ont été sélectionnés : α185 en phase solide + α29-AChE pour IL-1α et β79 en phase solide + β70-AChE pour IL-1β. Dans le cas de l'IL-1β, ce choix a été réalise essentiellement parce que ce couple est caractérisé par une fixation non spécifique très faible et est très peu sensible aux effets non spécifiques. Cette dernière caractéristique est représentée à la figure 1 annexée et le tableau IV résume les principales caractéristiques des tests de détection d'IL-1α et d' IL-1β dans le cas d'une incubation d'une nuit à 4° C et d'un processus simultané. Les deux essais semblent très sensibles car des concentrations minimales détectables inférieures à 4 pg/ml ont pu être calculées pour chaque interleukine en utilisant une période de 30 minutes pour la mesure enzymatique. Une sensibilité accrue est observée lorsque la réaction enzymatique (étape de révélation) dure plus longtemps. En pareil cas, des concentrations minimales détectables inférieures à 2 pg/ml peuvent être obtenues (cf. tableau IV ci-après). This process made it possible to highlight a small number of couples which allow a more sensitive determination of each IL-1. For IL-1α, the best results have been obtained using either αlOl (as solid phase or tracer) or tracers from group A with solid phases from group B. In the case of IL-1β , a couple composed of β79 as a solid phase and β70-AChE as a tracer was found to be significantly superior to all the other couples. A final selection of the optimal couple was made taking into account not only the signal intensity but also other criteria including the absence of cross-reactivity with other interleukins or related substances, a non-specific binding rate, a non-specific influence exerted by biological media (plasma or serum). The specificity criteria are not essential because all the couples tested exhibit very low cross-reactivity with the other interleukins (IL-1α or IL-1β and IL-2). However, the se The selection of couples with low non-specific fixation is important because this has a critical influence on the sensitivity of the test. Likewise, it is necessary to minimize the non-specific effects due to biological media in order to reinforce the validity of the measurements carried out in these media. Finally, the following pairs were selected: α185 in solid phase + α29-AChE for IL-1α and β79 in solid phase + β70-AChE for IL-1β. In the case of IL-1β, this choice was made essentially because this couple is characterized by a very weak non-specific fixation and is very little sensitive to non-specific effects. This last characteristic is shown in attached FIG. 1 and Table IV summarizes the main characteristics of the tests for detecting IL-1α and IL-1β in the case of an overnight incubation at 4 ° C. and d 'a simultaneous process. The two tests seem very sensitive because minimum detectable concentrations lower than 4 pg / ml could be calculated for each interleukin by using a period of 30 minutes for the enzymatic measurement. Increased sensitivity is observed when the enzymatic reaction (revelation step) lasts longer. In such a case, minimum detectable concentrations below 2 pg / ml can be obtained (see Table IV below).
L'évolution des courbes étalons en fonction du temps dévolue à la mesure enzymatique est représentée à la figure 2 annexée. The evolution of the standard curves as a function of the time allocated to the enzymatic measurement is shown in Figure 2 attached.
Cette augmentation de sensibilité est accompagnée d'une augmentation de la précision de la mesure dans la partie inférieure de la courbe étalon, comme le montre la figure 4 qui présente l'évolution des "profils d'imprécision" en fonction du temps. Les meilleurs résultats (en termes de sensibilité) ont été obtenus en utilisant une immuno-réaction pendant une nuit à + 4º C ; toutefois, des courbes étalon excellentes ont été obtenues en utilisant des périodes de réaction de plus courte durée (de 3 à 5 heures à + 4°C). Dans tous les cas, on a observé des concentrations minimales détectables infé- rieures à 10 pg/ml. La réalisation des essais à la température ambiante ou à 37° C n'a eu aucune incidence sur leurs résultats.  This increase in sensitivity is accompanied by an increase in the precision of the measurement in the lower part of the standard curve, as shown in FIG. 4 which shows the evolution of the "imprecision profiles" as a function of time. The best results (in terms of sensitivity) have been obtained using an immunoreaction overnight at + 4º C; however, excellent standard curves were obtained using shorter reaction periods (3 to 5 hours at + 4 ° C). In all cases, minimum detectable concentrations were observed below 10 pg / ml. Performing the tests at room temperature or 37 ° C had no impact on their results.
EXEMPLE 3 : Mesure de l'IL-1a et de l'IL-1b dans des milieux de culture.  EXAMPLE 3 Measurement of IL-1a and IL-1b in culture media.
La détermination des deux interleukines dans les surnageants de cultures stimulées a été réalisée à l'aide de courbes étalons. Il y a lieu d'observer que la présence de sérum de veau foetal 10 % dans le milieu de culture a induit une diminution significative de la fixation non spécifique sans altérer la pente des courbes étalons.  The determination of the two interleukins in the supernatants of stimulated cultures was carried out using standard curves. It should be observed that the presence of 10% fetal calf serum in the culture medium induced a significant reduction in non-specific binding without altering the slope of the standard curves.
Ces tests ont révélé que les essais permettent effectivement de détecter des substances immuno-réactives IL-1-like dans les surnageants de cultures, l'apparition de cette immuno-réactivité étant en relation avec la stimulation des cellules. Un exemple typique est présenté à la figure 4 annexée dans laquelle on a dessiné, en fonction du temps, les variations des concentrations d' IL-1α et d' IL-1β dans les supernageants de leucocytes elutriés humains (monocytes, lymphocytes ou neutrophiles) stimulés par 5 μg/ml de lipopolysaccharide. Pour confirmer la validité des mesures effectuées, les mêmes échantillons ont été testés à l'aide d'un bio-essai basé sur la mesure de la libération de PGE2 par des fibroblastes stimulés aussi bien par l'IL-1α que par l'IL-1β. Les courbes étalons correspondantes sont présentées à la figure 5 annexée. Les résultats obtenus, représentés à la figure 6, confirment qualitativement les résultats des mesures immunométriques, ce qui démontre la spécificité des immuno-essais. These tests have revealed that the tests indeed make it possible to detect immunoreactive substances IL-1-like in the supernatants of cultures, the appearance of this immunoreactivity being in relation to the stimulation of the cells. A typical example is presented in attached FIG. 4 in which, as a function of time, the variations in the concentrations of IL-1α and IL-1β have been drawn in the supernatants of human elutriated leukocytes (monocytes, lymphocytes or neutrophils) stimulated by 5 μg / ml of lipopolysaccharide. To confirm the validity of the measurements carried out, the same samples were tested using a bioassay based on the measurement of the release of PGE2 by fibroblasts stimulated both by IL-1α and by IL -1β. The corresponding standard curves are presented in Figure 5 attached. The results obtained, represented in FIG. 6, confirm qualitatively the results of the immunometric measurements, which demonstrates the specificity of the immunoassays.
L'identité entre la substance détectée dans les surnageants de culture (ou les extraits intracellulaires de cellules) et l'IL-1 recombinante utilisée pour établir les courbes-étalons est confirmée par trois types d'expérimentations de contrôle. Le premier est représenté par les dilutions d'échantillons dans du milieu de culture, lesquelles ont donné des courbes de dilution parallèles aux courbes-étalons. C est ce que montre le tableau V ci-après, qui présente les résultats de deux différents tests relatifs à l'IL-1α et à l'IL-1β, réalisés à différentes dilutions. Des résultats similaires ont été obtenus avec tous les échantillons testés.  The identity between the substance detected in the culture supernatants (or the intracellular extracts of cells) and the recombinant IL-1 used to establish the standard curves is confirmed by three types of control experiments. The first is represented by the dilutions of samples in culture medium, which gave dilution curves parallel to the standard curves. This is shown in Table V below, which presents the results of two different tests relating to IL-1α and IL-1β, carried out at different dilutions. Similar results were obtained with all of the samples tested.
TABLEAU V : DEMONSTRATION DU PARALLELISME ENTRE LA COURBE ETALON ET LA COURBE DE DILUTION DES ECHANTILLONS.  TABLE V: DEMONSTRATION OF THE PARALLELISM BETWEEN THE STANDARD CURVE AND THE DILUTION CURVE OF THE SAMPLES.
Les échantillons A et B ont été dilués comme indiqué dans le tableau V et testés pour y détecter l'IL- la et l'IL-1β par EIA. Les dilutions aussi bien que la courbe étalon ont été réalisées dans du milieu de culture (RPMI + 10 % de sérum de veau foetal). Les données brutes ont été multipliées par le facteur de dilution avant d'être énumérées dans le Tableau, afin de faire apparaître clairement le parallélisme entre la courbe-étalon et les courbes de dilution des échantillons. Samples A and B were diluted as indicated in Table V and tested for IL- la and IL-1β by EIA. Both the dilutions and the standard curve were made in culture medium (RPMI + 10% fetal calf serum). The raw data were multiplied by the dilution factor before being listed in the Table, in order to clearly show the parallelism between the standard curve and the dilution curves of the samples.
Echantillon A : surnageant de macrophages alvéolaires dans une culture stimulée par TNFα.  Sample A: supernatant of alveolar macrophages in a culture stimulated by TNFα.
Echantillon B : extrait intracellulaire de macrophages alvéolaires en culture.  Sample B: intracellular extract of alveolar macrophages in culture.
Ces résultats sont également confirmés par des expériences de récupération qui démontrent que des quantités connues d'IL-1 recombinante introduites dans des échantillons peuvent être effectivement mesurées. Pendant la totalité des expérimentations réalisées dans des milieux de culture, le taux de récupération était compris entre 86 % et 93 %.  These results are also confirmed by recovery experiments which demonstrate that known amounts of recombinant IL-1 introduced into samples can be effectively measured. During all of the experiments carried out in culture media, the recovery rate was between 86% and 93%.
La troisième expérimentation a consisté en l'analyse de surnageant de culture après fractionnement par chromatographie sur tamis moléculaire ; cette analyse montre que la substance immuno-réactive est éluée sous la forme d'un pic unique homogène, comme déjà indiqué plus haut, qui correspond exactement au pic observé avec les interleukines recombinantes. C'est ce que montre la figure 7 où sont présentés différents profils chromatographiques obtenus pour des surnageants de macrophages alvéolaires stimulés, aussi bien dans le test de détection de l'IL-1α que dans le test de détection de l'IL-1β. Des résultats similaires ont été observés avec d'autres surnageants de culture ou avec des extraits intracellulaires. Prises dans leur ensemble, toutes ces données indiquent nettement que les deux tests permettent effectivement une détermination quantitative des interleukines 1 dans ces milieux. EXEMPLE 4 : Mesure de l'IL-1α et de l'iL-1β dans le plasma et le sérum. The third experiment consisted in the analysis of culture supernatant after fractionation by chromatography on molecular sieves; this analysis shows that the immunoreactive substance is eluted in the form of a single homogeneous peak, as already indicated above, which corresponds exactly to the peak observed with the recombinant interleukins. This is shown in FIG. 7, which shows different chromatographic profiles obtained for supernatants of stimulated alveolar macrophages, both in the test for detecting IL-1α and in the test for detecting IL-1β. Similar results have been observed with other culture supernatants or with intracellular extracts. Taken as a whole, all these data clearly indicate that the two tests effectively allow a quantitative determination of interleukins 1 in these environments. EXAMPLE 4 Measurement of IL-1α and iL-1β in plasma and serum.
En utilisant ces EIA spécifiques, des tests de détermination des taux d' IL-1α et d' IL-1β dans le plasma ou le sérum de donneurs sains ou de patients souffrant de troubles rhumatoïdes, ont été réalisés. Ces mesures ont été effectuées, comme indiqué plus haut, en présence d' IgG de souris afin de neutraliser les anticorps IgG humains anti-souris éventuellement présents dans ces fluides. Cette précaution est tout à fait nécessaire car d' autres expérimentations ont montré que les mesures réalisées en l'absence d'IgG murines pourraient conduire à une surestimation importante des taux d'IL-1, spécialement dans les fluides de patients atteints de troubles rhumatoïdes.  Using these specific EIAs, tests to determine the levels of IL-1α and IL-1β in the plasma or serum of healthy donors or of patients suffering from rheumatoid disorders were carried out. These measurements were carried out, as indicated above, in the presence of mouse IgG in order to neutralize the human anti-mouse IgG antibodies possibly present in these fluids. This precaution is absolutely necessary because other experiments have shown that the measurements carried out in the absence of murine IgG could lead to a significant overestimation of the levels of IL-1, especially in the fluids of patients suffering from rheumatoid disorders. .
Des tests réalisés dans le plasma ou le sérum de volontaires sains ont révélé qu' il est possible de sélectionner des fluides ne contenant pas de quantités détectables d' IL-1α ou d'IL-1β. Ces plasmas ou ces sérums réunis peuvent être utilisés comme diluants pour établir des courbes-étalons appropriées. L'établissement de ces courbes a permis de mesurer les taux d'IL-1 dans ces fluides et de détecter des concentrations d' interleukines comprises entre 5 pg/ml et quelques ng/ml aussi bien chez des donneurs apparemment sains que chez des patients. Bien que les résultats représentés à la figure 6 qui donnent un profil typique obtenu avec un plasma ne soient pas satisfaisants puisque la substance immuno-réactive est éluée à un poids moléculaire de beaucoup supérieur à celui qui correspond à l'IL-1 recombinante (> 500 000) néanmoins, ces tests de détermination des IL-1 conviennent également aux dosages dans le plasma et le sérum. EXEMPLE 5 : Activité inhibitrice exercée par les anticorps conformes à l'invention à l'égard de l'activité biologique de l'IL-1 (activité neutralisante). Tests carried out in the plasma or serum of healthy volunteers have revealed that it is possible to select fluids which do not contain detectable amounts of IL-1α or IL-1β. These plasmas or sera combined can be used as diluents to establish appropriate standard curves. The establishment of these curves made it possible to measure the levels of IL-1 in these fluids and to detect concentrations of interleukins of between 5 pg / ml and a few ng / ml both in apparently healthy donors and in patients . Although the results represented in FIG. 6 which give a typical profile obtained with a plasma are not satisfactory since the immunoreactive substance is eluted at a molecular weight much higher than that which corresponds to the recombinant IL-1 (> 500,000), however, these IL-1 determination tests are also suitable for plasma and serum assays. EXAMPLE 5 Inhibitory activity exerted by the antibodies in accordance with the invention with regard to the biological activity of IL-1 (neutralizing activity).
L'activité inhibitrice exercée par les anticorps monoclonaux anti-IL-1 conformes à l'invention, à l'égard de l'activité biologique de l'IL-1, a été mise en évidence à l'aide de deux séries de tests :  The inhibitory activity exerted by the anti-IL-1 monoclonal antibodies in accordance with the invention, with regard to the biological activity of IL-1, was demonstrated using two series of tests :
1. Les tests d'inhibition de l'induction du récepteur de l'IL-2.  1. The IL-2 receptor induction inhibition tests.
De tels tests ont été décrits notamment par Such tests have been described in particular by
KAYE et al., JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1984), 133. N° 3, pages 1339-1345. KAYE et al., JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1984), 133. N ° 3, pages 1339-1345.
- Principe :  - Principle:
Les cellules de JURKAT, par exemple, (lignée cellulaire issue d'un lymphome T humain) sécrètent de l'IL-2 quand elles sont stimulées par de l'IL-1α ou de l'IL-1β en présence de phytohémagglutine (PHA). Certains anticorps anti-IL-1α ou anti-IL-1β sont capables d'inhiber l'effet des IL-1 soit parce qu'ils reconnaissent le site impliqué dans la liaison avec le récepteur soit parce que la formation du complexe IL-1- anticorps perturbe le processus biologique.  JURKAT cells, for example (cell line derived from a human T lymphoma) secrete IL-2 when they are stimulated by IL-1α or IL-1β in the presence of phytohemagglutin (PHA) ). Certain anti-IL-1α or anti-IL-1β antibodies are capable of inhibiting the effect of IL-1 either because they recognize the site involved in the binding with the receptor or because the formation of the IL-1 complex - antibody disrupts the biological process.
- Procédure expérimentale :  - Experimental procedure:
Les anticorps anti-IL-1α ou IL-1β conformes à l'invention (10 μg/ml) sont incubés en présence d'IL-1α ou d'IL-1β (10 ng/ml) pendant 18 heures à 4°C. Un contrôle est effectué en incubant dans les mêmes conditions de l'IL-1α ou de l'IL-1β (10 ng/ml) sans anticorps.  The anti-IL-1α or IL-1β antibodies according to the invention (10 μg / ml) are incubated in the presence of IL-1α or IL-1β (10 ng / ml) for 18 hours at 4 ° C. . A control is carried out by incubating IL-1α or IL-1β (10 ng / ml) without antibodies under the same conditions.
On stimule ensuite les cellules JURKAT We then stimulate the JURKAT cells
(5.105 cellules/ml) en présence de PHA (0,8 μg/ml), par les différentes préparations ci-dessus pendant 24 h à 37°C, sous 5 % CO2. Dans les conditions des expériences, la concentration des IL-1 au moment de la stimulation est de 1 ng/ml. La concentration de l'IL-2 dans les surnageants de culture cellulaire est mesurée à l'aide d'un dosage immunométrique mis au point à la SPI dont le principe est identique à ceux développés pour les IL-1. (5.10 5 cells / ml) in the presence of PHA (0.8 μg / ml), by the various preparations above for 24 h at 37 ° C, under 5% CO 2 . Under the conditions of the experiments, the concentration of IL-1 at the time of stimulation is 1 ng / ml. The concentration of IL-2 in cell culture supernatants is measured using an immunometric assay developed at SPI, the principle of which is identical to those developed for IL-1.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport à deux témoins, l'un est réalisé en absence d'IL-1 (PHA seul) et représente le 100 % d'inhibition, l'autre est réalisé en absence d'anticorps et représente le 0 % d'inhibition.  The results are expressed as a percentage of inhibition compared to two controls, one is carried out in the absence of IL-1 (PHA alone) and represents 100% inhibition, the other is carried out in the absence of antibody. and represents 0% inhibition.
-  -
2. Les tests d'inhibition de la liaison des IL-1 aux récepteurs cellulaires, notamment aux cellules T.  2. Tests of inhibition of the binding of IL-1 to cellular receptors, in particular to T cells.
Des tests de ce type sont décrits, notamment. dans : Tests of this type are described, in particular. in :
- LOWENTHAL et al., J. EXP . MED. (1986), 164, page 1060, et  - LOWENTHAL et al., J. EXP. MED. (1986), 164, page 1060, and
- SECKINGER et al., THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1987), 119, pages 1546-1549.  - SECKINGER et al., THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1987), 119, pages 1546-1549.
- Principe :  - Principle:
L'IL-1α agit sur des cellules par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire avec lequel il se lie spécifiquement. On peut étudier la liaison de l'IL-1α marquée à l'iode 125. Les anticorps monoclonaux peuvent inhiber la liaison de l'IL-1α aux récepteurs s'ils reconnaissent la partie de la molécule d'IL-1α impliquée dans le complexe. En inhibant la liaison avec le récepteur ils inhibent aussi l'effet biologique.  IL-1α acts on cells via a membrane receptor with which it specifically binds. We can study the binding of IL-1α labeled to iodine 125. Monoclonal antibodies can inhibit the binding of IL-1α to receptors if they recognize the part of the IL-1α molecule involved in the complex. By inhibiting the binding with the receptor they also inhibit the biological effect.
- Protocole expérimental :  - Experimental protocol :
L' IL-1 marquée à l'iode 125 est incubé pendant une heure à 4°C avec les anticorps à une concentration de The iodine-labeled IL-1 is incubated for one hour at 4 ° C. with the antibodies at a concentration of
200 ng/ml. A la fin de la réaction, le mélange est mis au contact des cellules EL4 (lignée cellulaire de Thymome murin) pendant 8 heures à + 4°C. 200 ng / ml. At the end of the reaction, the mixture is brought into contact with EL4 cells (murine Thymoma cell line) for 8 hours at + 4 ° C.
Les cellules sont ensuite lavées avec un tampon approprié et la radioactivité fixée est mesurée avec un compteur à scintillation solide (multigramma LKB). Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport à un témoin (100 % de liaison) pour lequel l'IL-1α marquée à l'iode 125 n'a pas été incubé avec un anticorps. The cells are then washed with an appropriate buffer and the fixed radioactivity is measured with a solid scintillation counter (multigramma LKB). The results are expressed as a percentage of inhibition relative to a control (100% binding) for which the IL-1α labeled with iodine 125 has not been incubated with an antibody.
EXEMPLE 6 : Mise en évidence de la sensibilité des anticorps monoclonaux conformes à l'invention ; essai comparatif avec des tests utilisant les anticorps de l'Art antérieur.  EXAMPLE 6 Demonstration of the sensitivity of the monoclonal antibodies in accordance with the invention; comparative test with tests using the antibodies of the prior art.
L'Exemple 2 ci-dessus, montre que dans les réactions optimales des tests conformes à l'invention, les concentrations minimales détectables sont inférieures à 2 pg/ml (voir en particulier le Tableau IV). Example 2 above shows that in the optimal reactions of the tests in accordance with the invention, the minimum detectable concentrations are less than 2 pg / ml (see in particular Table IV).
1. Dosage par compétition : comparaison avec le test AMERSHAM de dosage de l'IL-1α :  1. Dosage by competition: comparison with the AMERSHAM test for the dosage of IL-1α:
Comme précisé dans l'exemple 1, la sensibilité des tests a été. caractérisée par la dose d'IL-1 qui induit une diminution statistiquement significative de la fixation observée en l'absence de compétiteur (Bo), soit As specified in Example 1, the sensitivity of the tests was. characterized by the dose of IL-1 which induces a statistically significant reduction in the fixation observed in the absence of competitor (Bo), that is to say
Bo-3 déviations standard (taux de confiance 99 %). Bo-3 standard deviations (99% confidence rate).
Un essai a été réalisé dans les conditions définies par AMERSHAM ; (dosage radioimmunologique, IL-1α marquée à l'iode 125) : on obtient la courbe comme visible à la figure 8, qui comprend en abscisse les concentrations d'IL-1α en pg/ml et en ordonnée, B/Bo en % et qui montre que la limite de détection est de l'ordre de 80 pg/ml. Ceci correspond donc à une sensibilité nettement inférieure à celle des tests conformes à l'invention, comme précisé ci-dessus.  A test was carried out under the conditions defined by AMERSHAM; (radioimmunoassay, IL-1α labeled with iodine 125): the curve is obtained as visible in FIG. 8, which includes the concentrations of IL-1α in pg / ml and on the y-axis, B / Bo in% and which shows that the detection limit is of the order of 80 pg / ml. This therefore corresponds to a significantly lower sensitivity than that of the tests in accordance with the invention, as specified above.
2. Essai immunométrique : comparaison avec le test MEDGENIX.  2. Immunometric test: comparison with the MEDGENIX test.
Un essai a été réalisé dans les conditions définies par MEDGENIX (dosage immunoradiométrique : anticorps anti-IL-1β marqué à l'iode 125) : on obtient la courbe comme visible à la figure 9, qui comprend en abscisse les concentrations en IL-1β en pg/ml et en ordonnée la radioactivité liée (en cpm) et qui montre que la limite de détection est de l'ordre de 15 pg/ml. Comme précisé dans l'Exemple 1, la sensibilité des tests immunométriques est calculée comme étant la dose d'IL-1, qui correspond à la fixation non spécifique + 3 déviations standard (avec un taux de confiance de 99 %). Ceci correspond donc à une sensibilité nettement inférieure à celle des tests conformes à l'invention, comme précisé ci-dessus, qui est de l'ordre de 2 pg/ml.  A test was carried out under the conditions defined by MEDGENIX (immunoradiometric assay: anti-IL-1β antibody labeled with iodine 125): the curve is obtained as visible in FIG. 9, which includes the concentrations of IL-1β on the abscissa in pg / ml and on the ordinate the radioactivity bound (in cpm) and which shows that the detection limit is of the order of 15 pg / ml. As specified in Example 1, the sensitivity of the immunometric tests is calculated as the dose of IL-1, which corresponds to non-specific binding + 3 standard deviations (with a confidence rate of 99%). This therefore corresponds to a significantly lower sensitivity than that of the tests in accordance with the invention, as specified above, which is of the order of 2 pg / ml.
Ces deux tests montrent bien que les anticorps monoclonaux conformes à l'invention qui présentent une constante de dissociation inférieures à 5.10-10 permettent de manière inattendue d' accroître la sensibilité des tests de dosage dans lesquels ils sont mis en oeuvre. These two tests clearly show that the monoclonal antibodies according to the invention which exhibit dissociation constant lower than 5.10 -10 unexpectedly increase the sensitivity of the assay tests in which they are used.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d' être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS
1.- Anticorps monoclonaux spécifiques des IL- 1α et 1β, qui résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de rongeurs, et plus particulièrement de souris, par des IL-1α ou -1β selon le cas, qui reconnaissent spécifiquement les IL-1α naturelles ou recombinantes ou les IL-1β naturelles ou recombinantes qui ne présentent pratiquement pas de réaction croisée entre les deux IL-1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux ont une constante de dissociation inférieure à 5.10-10, en ce qu'ils se composent de plusieurs groupes qui reconnaissent des régions distinctes des IL-1α ou -1β et dont les anticorps de certains groupes sont aptes à se lier de façon compatible avec tous les anticorps des autres groupes, à savoir : 1.- Monoclonal antibodies specific for IL-1α and 1β, which result from the immunization of mammals, in particular rodents, and more particularly of mice, with IL-1α or -1β as the case may be, which specifically recognize IL- 1α natural or recombinant or IL-1β natural or recombinant which show practically no cross-reaction between the two IL-1, characterized in that said monoclonal antibodies have a dissociation constant less than 5.10 -10 , in that they consist of several groups which recognize distinct regions of IL-1α or -1β and whose antibodies of certain groups are capable of binding in a compatible manner with all the antibodies of the other groups, namely:
- les anticorps anti-IL-1α se composent de trois groupes (A, B et C) qui reconnaissent trois régions distinctes de l' interleukine-1α, tous les anticorps d'un groupe étant aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes mais n'étant pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe ;  - anti-IL-1α antibodies consist of three groups (A, B and C) which recognize three distinct regions of interleukin-1α, all the antibodies of a group being capable of binding in a compatible manner with all those of the other two groups but not being compatible with another antibody of the same group;
- les anticorps anti-IL-1β se composent de quatre groupes dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des anticorps anti-IL-1α, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes, et ne se lient pas à l'IL-1β native recom- binante, reconnaissent une interleukine-1β modifiée, et réagissent avec un conjugué IL-1β-AChE ;  - anti-IL-1β antibodies are made up of four groups, the first two (A and B) having a behavior similar to that of anti-IL-1α antibodies, whose group C antibodies are compatible with a single antibody of each of the first two groups and whose antibodies of the fourth group (D) are incompatible with any of the antibodies of the first three groups, and do not bind to the recombinant native IL-1β, recognize a modified interleukin-1β , and react with an IL-1β-AChE conjugate;
et en ce que lesdits anticorps anti-IL-1α et anti-IL-1β reconnaissent les conjugués IL-1α ou 1β/acétyl- cholinestérase (AChE). and in that said anti-IL-1α and anti-IL-1β antibodies recognize the IL-1α or 1β / acetylcholinesterase (AChE) conjugates.
2.- Conjugués d'acétylcholinestérase et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou -1β ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'. 2.- Conjugates of acetylcholinesterase and anti-IL-1α or -1β monoclonal antibodies or fragments of these antibodies, in particular Fab 'fragments.
3.- Procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1α ou -1β selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F(ab')2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis en ce que ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel, notamment, que la β-mercaptoéthylamine (βMEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.  3.- Method for producing Fab 'fragments of anti-interleukin-1α or -1β monoclonal antibodies according to claim 1, characterized in that said monoclonal antibodies are treated with pepsin in an acid medium, to obtain F (ab ') 2 which are isolated by chromatography on a molecular sieve, then in that these F (ab') 2 fragments are subjected to a controlled reduction process, by an appropriate reducing agent such as, in particular, β-mercaptoethylamine (βMEA) , to provide a Fab 'fragment which is purified by passage through a molecular sieve chromatography column.
4.- Procédé de production de conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux entiers anti-IL-1α ou anti-IL- 1β et de conjugués d'AChE et de fragments d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β, notamment de fragments Fab' selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturellement présent dans l'un des fragments, est couplé à au moins un groupe maleimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-hydroxy-succinimide.  4.- Method for producing AChE conjugates and whole anti-IL-1α or anti-IL-1β monoclonal antibodies and AChE conjugates and fragments of anti-IL-1α or anti-IL monoclonal antibodies -1β, in particular of Fab 'fragments according to claim 2, characterized in that at least one thiol group incorporated or naturally present in one of the fragments, is coupled to at least one maleimido group incorporated in AChE, by l 'Intermediate of a suitable coupling agent such as, in particular, an ester of N-hydroxy-succinimide.
5.- Test immunoenzymatique par compétition de détection de l'IL-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biologiques, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β approprié, utilisé comme premier anticorps, et des IgG portées par un support approprié utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d' IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-1α ou -1β, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.  5.- Enzyme immunoassay by competition for the detection of IL-1α and IL-1β in cell culture supernatants and in biological fluids, characterized in that a monoclonal antibody anti-IL-1α or anti IL-1β suitable, used as first antibody, and IgG carried by an appropriate support used as second antibody, are brought into contact with conjugates of IL-1-AChE, which play the role of tracers, and interleukin -1α or -1β, after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
6.- Test enzymo-immunométrique hautement spécifique et sensible, de détection de 1'IL-1α et de 1'IL- 1β dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérisé en ce que des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β portés par un support approprié sont mis en contact avec de l'IL-1α ou -1β et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés. 6.- Highly specific and sensitive enzymo-immunometric test for the detection of IL-1α and IL- 1β in cell culture supernatants and biological fluids, characterized in that monoclonal anti-IL-1α and / or anti-IL-1β antibodies carried by an appropriate support are brought into contact with IL-1α or - 1β and with Acm-AChE conjugate, after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
7.- Test selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'IL-1α ou -1β est ajoutée à l'anticorps simultanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec l'IL-1α ou -1β.  7.- Test according to claim 6, characterized in that the IL-1α or -1β is added to the antibody simultaneously with the conjugate Acm-AChE and the two monoclonal antibodies react simultaneously with the IL-1α or -1β .
8.- Test selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'IL-1α ou -1β est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps fixé sur le support, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité AChe est révélée par tous moyens appropriés.  8.- Test according to claim 6, characterized in that the IL-1α or -1β is first introduced and reacts with the antibody fixed on the support, then the Acm-AChE conjugate is then introduced and the AChe activity is revealed by any appropriate means.
9.- Kit pour la réalisation des tests immuno- enzymatiques par compétition selon la revendication 5, caractérisé en ce qu' il comprend :  9. Kit for carrying out immunoenzymatic tests by competition according to claim 5, characterized in that it comprises:
. une série de plaques de microtitration revê- tues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin antisouris ;  . a series of microtiter plates coated with an antibody constituted by anti-mouse rabbit IgG;
au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1β ;  at least one bottle containing appropriate doses of anti-IL-1α monoclonal antibody and / or anti-IL-1β monoclonal antibody;
. au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1α et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1β et d'AChE ;  . at least one bottle containing conjugates of IL-1α and AChE and / or at least one bottle containing conjugates of IL-1β and AChE;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;  . appropriate amounts or doses of an AChE revealing substrate;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β.  . appropriate amounts or doses of IL-1α and / or IL-1β.
10.- Kit pour la réalisation des tests immunométriques selon l'une quelconques des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : 10.- Kit for carrying out immunometric tests according to any one of claims 6 to 8, characterized in that it comprises:
. une série de plaques de microtitration revêtues d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonaux anti-IL-1β ; . a series of microtiter plates coated with anti-IL-1α monoclonal antibodies and / or anti-IL-1β monoclonal antibodies;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou 1β ;  . at least one bottle containing conjugates of AChE and anti-IL-1α and / or 1β monoclonal antibodies;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;  . appropriate amounts or doses of an AChE revealing substrate;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β.  . appropriate amounts or doses of IL-1α and / or IL-1β.
11.- Agents à visées thérapeutiques caractérisés en ce qu'ils sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β et/ou leurs fragments, seuls ou conjugués ou hybrides ou associés avec d'autres substances.  11.- Agents for therapeutic purposes characterized in that they consist of, or include as active constituents, anti-IL-1α monoclonal antibodies and / or anti-IL-1β antibodies and / or their fragments, alone or conjugated or hybrid or associated with other substances.
12.- Agents de diagnostic aptes à être mis en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β ou leurs fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.  12.- Diagnostic agents capable of being used for in vivo diagnosis, characterized in that they comprise anti-IL-1α antibodies and / or anti-IL-1β antibodies or their fragments, associated with an antigen and / or a hapten and / or another antibody or antibody fragment, and / or labeled with stable or radioactive labels.
13.- Hybridomes mis en oeuvre pour la préparation des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, déposés auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 8 Décembre 1988 et identifiés dans cette Collection sous les N° 1-823, 1-824, 1-825, 1-826, 1-827, 1-828, I- 829.  13.- Hybridomas used for the preparation of anti-IL-1α and anti-IL-1β monoclonal antibodies according to any one of claims 1 and 2, deposited with the NATIONAL COLLECTION OF MICROORGANISM CULTURES (CNCM) held by INSTITUT PASTEUR, dated December 8, 1988 and identified in this Collection under N ° 1-823, 1-824, 1-825, 1-826, 1-827, 1-828, I- 829.
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