"Procédé de dosage immunologique d'une substance dans
un échantillon liquide au moyen d'anticorps antiid.iotypiques".
"Procédé de dosage immunologique d'une substance dans un échantillon liquide au moyen d'anticorps
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La présente invention est relative à un procédé de dosage immunologique d'une substance dans
un échantillon liquide, tel qu'un fluide biologique , cette substance comportant au moins un déterminant important pour son identification.
L'utilisation d'anticorps pour le dosage d'une substance avec une sensibilité et une spécificité très élevées, est bien connue et est la base des radioimmunoessai, enzyimmunoessai, fluoroimmunoessai, immunoessai par comptage de particules, etc. Dans tous les cas, on injecte un échantillon très pur de la substance à doser chez un animal et, après des injections répétées, on prélève le sang de l'animal, on sépare le sérum et l'on utilise ce dernier comme réactif pour le dosage de la substance. Le sérum contient une classe spéciale de protéines que l'animal a produites, qui se lient d'une manière spécifique à la substance que l'on
a injectée et qui, par liaison à la substance, forment des aggrégats, que l'on peut séparer par centrifugation, précipitation ou une quelconque des autres méthodes de séparation disponibles. ces protéines spéciales appartiennent à la classe connue des "immunoglobulines", dont cinq classes principales connues sous la dénomi-nation de "IgG, IgA,IgM, IgE et IgD", qui existent
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pourcentage d'immunoglobuline est adapté pour réagir
avec la substance à doser. Cette portion est appelée "anticorps". Si l'on désire doser, par exemple, des immunoglobulines de ce type appartenant à l'être humain, il suffit de purifier l'une des immunoglobulines humaines,
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chez un autre animal, par exemple un lapin, et en même temps,de séparer un sérum de lapin qui liera cette immunoglobuline humaine spécifique, qui a été injectée initialement chez le lapin. Le sérum du lapin qui réagit avec l'immunoglobuline humaine contiendra probablement des anticorps IgG de lapin et IgM de lapin, qui seront présents en des quantités de l'ordre de
1 à 2% de l'IgG ou IgM total.
Evidemment, les anticorps reconnaissant différentes substances sont différents les uns des autres et cette différence réside dans la disposition chimique d'une partie spécifique de l'immunoglobuline qui est apte à reconnaître la substance à doser. On appelle cette partie le "site de liaison d'antigène", et elle reconnaît une partie spécifique de la substance à doser, c'est-à-dire une petite chaîne de molécules appelée "déterminant". Toutefois, la plupart des substances complexes que l'on doit analyser comportent plus d'une chaîne de molécules caractéristique et comportent,par conséquent, plus d'un déterminant. Dans
la population des anticorps produits, il y aura des anticorps qui se fixent à chaque déterminant et, dans la plupart des cas, les anticorps qui se fixent à un déterminant de la substance ne se fixeront pas à un autre déterminant de celle-ci. En résumé, un antisérum contiendra des anticorps d'un grand nombre de types, chaque type d'anticorps s'agglutinant par l'intermédiaire d'un déterminant différent sur la substance et ne constituant qu'une partie des anticorps totaux, qui eux mêmes ne représentent qu'une faible proportion des immunoglobulines totales. Par conséquent, il y aura autant de sites de liaison d'antigène qu'il
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Si, maintenant, l'on sépare chaque anticorps avec un site de liaison d'antigène donné, par exemple, d'un antisérum de lapin dirigé contre de
l'IgG humaine et que l'on injecte l'un de ces anticorps, par exemple, chez une chèvre, la chèvre produira des anticorps qui reconnaîtront les anticorps de lapin.
Les anticorps de chèvre réagiront avec les déterminants qui sont communs à l'immunoglobuline de lapin mais certains des anticorps peuvent reconnaître d'une manière spécifique des déterminants localisés dans les sites de liaison d'antigène des anticorps de lapin. Ces déterminants sont habituellement appelés des "idiotopes" et l'association des différents idiotopes d'un anticorps donné est appelée un "idiotype". Les antisérums ou anticorps réagissant avec des idiotypes sont appelés "anti-idiotypiques".
Bien que l'on puisse subdiviser les immunoessais de plusieurs façons, on les divisera dans le cas présent, pour une question de.commodité, en deux types majeurs, à savoir les dosages par agglutination directe et les dosages par inhibition d'agglutination. Dans.
les dosages par agglutination directe, la substance
à doser dans sa forme naturelle est impliquée directement dans l'agglutination. Evidemment, la substance
doit comporter plus d'un déterminant. Le procédé d'agglutination implique alors un agglutinât du type anticorps-substance- anticorps-substance-anticorps,
etc., la dimension des agglutinats dépendant d'un
grand nombre de facteurs. Une fois la réaction terminée, la quantité d'anticorps restant sera inversment proportionnelle à la concentration de la substance initialement présente.
La présente invention ne concerne toutefois que les dosages du second type, c'est-à-dire
les dosages par inhibition d'agglutination. Ce
second type de dosage s'avère intéressant pour les
substances qui ne comportent qu'un seul déterminant
ou pour les substances de composition tellement proche qu'elles ne diffèrent que par un seul déterminant
important. Par exemple, ce type de dosage s'avère particulièrement intéressant pour des molécules simples, telles que la thyroxine (T4) ou la progestérone ou
pour un grand nombre d'autos hormones qui sont trop
petites pour comporter plus d'un déterminant et qui ne peuvent pas entrer dans une réaction d'agglutination.
D'une autre côté, certaines molécules de grandes dimensions, telles que l'antigène carcinoembryonnaire (CEA),
un agent de détection des affections cancéreuses, comporte un grand nombre de déterminants différents
mais il n'y a probablement qu'un petit nombre de déterminants sur le CEA qui soient réellement distinctifs,les autres déterminants apparaissant sur des substances analogues qui ne sont pas des agents de détection du cancer.
La présente invention permet d'améliorer les dosages pour molécules de structure simple et procure un nouveau moyen permettant de doser les molécules de structure complexe comportant un ou plusieurs déterminants importants pour l'identification de la molécule à doser, c'est-à-dire donnant l'individualité à celle-ci.
On décrit ci-après la technique habituellement appliquée au dosage des molécules simples, en prenant comme exemple la triiodothyronine (T3) . On peut conférer à une substance un grand nombre de déterminants, chaque déterminant étant constitué par
une molécule T3 en liant plusieurs T3 à une macromolécule, telle que du dextran ou de l'albumine. La substance dextran-T3 devient alors une substance comportant plusieurs déterminants. Si l'on ajoute maintenant des anticorps produits par exemple chez une souris dirigés contre la substance dextran-T3, ces anticorps formeront des agglutinats : anticorps-dextranT3-anticorps-dextran-T3, etc. Si l'on ajoute mainte-
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d'antigène des anticorps de souris,et de la sorte ces anticorps ne pourront plus réagir. Lorsque l'on ajoute maintenant le dextran-T3, il y aura moins d'anticorps avec un site de liaison d'antigène libre et l'agglutination sera par conséquent moins importante. La T3
libre dans le sérum humain a par conséquent inhibé l'agglutination des anticorps dirigés contre la substance dextran-T3. Cette technique est bien connue et a été décrite dans un grand nombre de brevets antérieurs.
Toutefois, cette technique comporte plusieurs inconvénients, dont les principaux sont les suivants :
1) La liaison d'une substance simple à
une molécule de plus grande dimension est souvent coûteuse et difficile, si on veut la réaliser d'une manière efficace. Bien que l'on puisse faire entrer
ces prix élevés dans le cadre de la fabrication d'une substance productrice d'anticorps, son utilisation
comme réactif "en vrac" dans un dosage peut fortement accroître le coût de celui-ci.
2) La sensibilité d'un grand nombre de dosages est limitée car les anticorps reconnaissent comme déterminants d'autres groupements que la substance simple, c'est-à-dire la substance simple combinée
à d'autres atomes ou configurations atomiques entourant cel�-ci dans la molécule de grande dimension. Par conséquent, dans les mélanges, tels que celui constitué,
par exemple, de T3, de dextran-T3 et d'anticorps, les anticorps ont une préférence pour le dextran-T3. Pour surmonter cette préférence, l'utilisateur est forcé d'avoir une quantité de T3 plus grande que la quantité théoriquement requise, c'est-à-dire de travailler avec une sensibilité réduite.
L'objet de la présente invention consiste, par conséquent, à pallier les inconvénients susmentionnés des procédés de dosage connus , à prévoir un procédé de dosage immunologique, avec une très grande sensibilité et spécificité, d'une substance dans un échantillon liquide, tel qu'un fluide biologique, cette substance pouvant aussi bien être de structure moléculaire simple, c'est-à-dire comporter un seul déterminant pour son identification, que de structure moléculaire complexe, c'est-à-dire comportant un ou plusieurs déterminants importants pour son identification.
A cet effet, suivant l'invention, on fait réagir l'échantillon liquide contenant la substance à doser, des anticorps dirigés contre ladite substance, spécifiques dudit déterminant et des anticorps antiidiotypiques dirigés contre les anticorps spécifiques et on détermine la quantité de la substance dans l'échantillon liquide en mesurant le degré d'inhibition qu'entraîne cette substance sur la réaction de liaison entre les anticorps spécifiques et anti-idiotypiques susdits, la quantité de cette substance étant proportionnelle au degré d'inhibition obtenu sur la réaction de liaison précitée.
Suivant une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, soit les anticorps anti-idiotypiques soit les anticorps spécifiques sont fixés à des particules finement divisées, telles que des particules de latex, des globules rouges, et on détermine la quantité de substance dans l'échantillon liquide, après réaction de cette substance et des anticorps spécifiques et anti-idiotypiques précités,
en fonction du degré d'agglutination résiduaire ou
de non agglutination de ces particules finement divisées.
Suivant une première forme de réalisation particulièrement avantageuse du procédé de l'invention, on accroît l'activité agglutinante des anticorps antiidiotypques par l'addition d'un agent susceptible d'accroître une telle activité, choisi,par exemple ,
dans le groupe comprenant le facteur rhumatoide,
le facteur Clq du complément et le polyéthylèneglycol.
Suivant une autre forme de réalisation particulièrement avantageuse du procédé de l'invention, dans le cas où les anticorps anti-idiotypiques
sont fixés à des particules finement divisées, on préincube l'échantillon liquide contenant la substance
à doser avec les anticorps spécifiques sous agitation
à une température de l'ordre de 37[deg.]C pendant une durée
de l'ordre de 1 minute à 18 heures.
Le procédé de la présente invention peut,
bien entendu, être également appliqué aux techniques
de dosage radioimmunologique avec marqueurs, dest-à-dire
dans les techniques qui impliquent l'utilisation d'anticorps marqués par des substances radioactives,enzymatiques ou autres.. Ces techniques de dosage immunologique , dont notamment la technique du double-anticorps, comportent également des inconvénients. Cette technique
du double-anticorps est actuellement la technique de dosage la plus largement utilisée en pratique.Cette technique consiste à insolubiliser les anticorps dirigés
conte les substances à doser en les couplant à une
phase solide, qui peut être constituée par des microplaques de polyvinyle,des billes d'agarose , des
disques de papier, etc. Ces anticorps insolubilisés, lorsqu'ils sont mélangés à l'échantillon à analyser, retiendront la substance. Après avoir écarté les molécules non liées par lavage, la présence de la substance est décelée par la liaison d'anticorps
marqués qui reconnaissent les déterminants antigéniques différents de ceux reconnus par les anticorps insolubilisés. Comme on vient de le préciser, les anticorps peuvent être marqués par un radioisotope,
une enzyme, ou bien également par un fluorochrome ou
des particules colloïdales. Ce marquage permettra de mesurer les anticorps liés, dont la quantité sera proportionnelle à la quantité de substance retenue
par les anticorps insolubilisés. Ce type de dosage comporte toutefois deux inconvénients : il ne peut être appliqué qu'à des substances comportant au moins deux déterminants antigéniques, ce qui n'est pas le cas
des petites substances telles que la T3 ou la progestérone, et il requiert deux populations d'anticorps reconnaissant des déterminants antigéniques différents. On peut, par exemple, utiliser deux anticorps monoclonaux avec des spécificités différentes. Toutefois, pour certains antigènes, il peut s'avérer difficile d'obtenir des anticorps monoclonaux avec
des spécificités qui ne se recouvrent pas. Le procédé de dosage de la présente invention permet de surmonter ces inconvénients grâce à l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques, et de pouvoir donc être utilisé également pour le dosage de substances simples ne comportant qu'un seul déterminant important permettant d'identifier celles-ci.
Par conséquent, suivant une autre forme
de réalisation de l'invention, les anticorps antiidiotypiques sont marqués au moyen d'une substance active choisie dans le groupe comprenant les radio-isotopes, les enzymes, les fluorochromes et les particules colloïdales et les anticorps spécifiques couplés à une phase solide de manière à les insolubiliser, et on ajoute l'échantillon liquide contenant la substance à doser aux anticorps insolubilisés, on
laisse réagir ces anticorps insolubilisés avec ladite substance, on ajoute à l'échantillon ainsi obtenu des anticorps anti-idiotypiques marqués, on laisse réagir ces anticorps anti-idiotypiques marqués, on sépare de la phase solide ces anticorps anti-idiotypiques marqués non liés aux anticorps insolubilisés, et on détermine la quantité de substance à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps anti-idiotypiques marqués liés à la phase solide.
Suivant une seconde forme de réalisation particulière de l'invention, les anticorps spécifiques sont marqués au moyen d'une substance active choisie dans le groupe comprenant les radioisotopes, les
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et les anticorps anti-idiotypiques couplés à une phase solide de manière à les insolubiliser, et on ajoute l'échantillon liquide contenant la substance
à doser aux anticorps insolubilisés, on laisse réagir ces anticorps insolubilisés avec ladite substance,
on ajoute à l'échantillon ainsi obtenu les anticorps spécifiques marqués, on laisse réagir ces anticorps spécifiques marqués, on sépare de la phase solide les anticorps spécifiques marqués non liés aux anticorps insolubilisés et on détermine la quantité de substance à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps spécifiques
marqués liés à la phase solide.
Suivant encore une autre forme de réalisation particulière de l'invention, les anticorps spécifiques sont couplés à une phase solide de manière à les insolubiliser et on ajoute l'échantillon liquide contenant la substance à doser aux anticorps insolubilisés,
on laisser réagir ces anticorps insolubilisés avec ladite substance, on ajoute à l'échantillon ainsi obtenu les anticorps anti-idiotypiques, on laisser réagir ces anticorps anti-idiotypiques, on sépare de la phase solide les anticorps anti-idiotypiques non liés aux anticorps insolubilisés, on ajoute à la phase solide
des anticorps dirigés contre les anticorps anti-idiotypiques, marqués au moyen, d'une substance active choisie: dans le groupe comprenant le s radioisotopes, les enzymes, les fluorochromes et les particules colloidales, on laisse réagir ces anticorps marqués, on sépare de la phase solide les anticorps marqués non liés aux anticorps anti-idiotypiques et on détermine la quantité de substance à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps marqués
liés à la phase solide.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description donnée ciaprès à titre d'exemple non limitatif de quelques formes de réalisation particulièresde l'invention.
On notera que le procédé de dosage immunologique de la présente invention est en fait facilité. par l'utilisation d'anticorps spécifiques, c'est-à-dire d'anticorps monoclonaux dont la production, notamment chez la souris, est bien connue. La caractéristique d'un anticorps monodbnal est qu'il se fixe à un déterminant spécifique sur la substance à doser. Si, par conséquent, il y a par exemple cinq déterminants
sur une molécule d'hormone de croissance humaine, cinq anticorps monoclonaux différents pourraient être induits, un pour chaque déterminant. Bien que chaque anticorps soit une IgG, son idiotype diffère, c'est-à-dire qu'il présente effectivement une composition chimique différente dans la région qui reconnaît
le déterminant. Puisque l'anticorps a une composition chimique différente, il serait alors théoriquement possible de produire un antisérum contre chaque idiotype en injectant par exemple à un lapin l'anticorps monoclonal spécifique. L'antisérum de lapin contiendra certainement des anticorps dirigés contre l'IgG
de souris mais parmi ces anticorps il y en aura une partie qui reconnaîtra l'idiotype d'une manière spécifique, c'est-à-dire que l'antisérum est anti-idiotypique. Comme le savent bien les spécialistes de la technique, ces anticorps anti-idiotypiques IgG très spécifiques peuvent être séparés et utilisés comme réactif.
Par conséquent, dans un dosage immunolo- gique spécifique de la triiodothyronine (T3), si l'on fait réagir des anticorps anti-T3 monoclonaux de souris
à titre d'anticorps spécifiques avec des anticorps anti-idiotypiques IgG de lapin dirigés contre les anticorps monoclonaux de souris, à titre d'anticorps antiidiotypiques, les anticorps anti-idiotypiques agglutineraient alors les anticorps anti-T3 monoclonaux de souris. Si, maintenant, l'on avait mélangé l'échan-tillon liquide contenant la substance à doser, c'est-àdire dans le cas présent du sérum humain, contenant
de la T3 avec des anticorps anti-T3 monoclonaux de souris, la triiodothyronine aurait réagi avec les anticorps monoclonaux de souris, en bloquant le centre idiotypdque . Par contre, lorsque l'on fait réagir, suivant l'invention, ce mélange de sérum humain contenant la T3 et d'anticorps monoclonaux de souris avec
des anticorps anti-idiotypiques de lapin, l'agglutination sera sensiblement moins forte. On déterminera, dans ce cas, la quantité de T3 dans le sérum humain
en mesurant le degré d'inhibition qu'entraîne la T3
sur la réaction de liaison entre les anticorps spécifiques et anti-idiotypiques, qui est en fait une réaction d'agglutination, la quantité de T3 étant proportionnelle au degré d'inhibition obtenu sur cette réaction d'agglutination. Dans ce procédé de dosage,
il n'est par conséquent plus nécessaire de lier la substance à doser à une macromolécule, de manière à ce qu'elle contienne un grand nombre de déterminants, et
il n'y a plus de compétition entre les déterminants comprenant la substance liée et la substance libre.
Ainsi qu'on l'a déjà précisé, précédemment, le procédé de dosage de l'invention peut être également étendu au dosage d'une substance de structure moléculaire complexe, comportant un seul ou éventuellement plusieurs déterminants importants pour son identification. Ces déterminants peuvent exister sur les parois des bactéries ou virus, ou constituent même une petite partie d'une molécule complexe. L'isolement de ces fractions ou déterminants spécifiques est actuellement technologique-ment souvent très difficile à réaliser, si pas impossible. Pour les spécialistes en matière de production d'anticorps monoclonaux, la séparation à l'état pur
de ces déterminants n'est souvent pas nécessaire pour avoir des anticorps monoclonaux hautement spécifiques. Par exemple, on peut obtenir des anticorps monoclonaux contre le déterminant de l'antigène carcinoembryonnaire
(CEA), qui est l'élément distinctif dans la détection des tumeurs cancéreuses. Lorsque l'on injecte ces anticorps monoclonaux, par exemple des anticorps anti-CEA monoclonaux de souris chez un lapin,le lapin produira des anticorps anti-idiotypiques IgG de lapin dirigés contre les anticorps monoclonaux de souris,qui eux mêmes sont dirigés contre le déterminant spécifique de CEA .
En l'absence de CEA, les anticorps antiidiotypiques de lapin formeront des agglutinats avec les anticorps monoclonaux de souris. Toutefois, lorsque l'on mélange les anticorps monoclonaux de souris avec, par exemple, un sérum humain contenant du CEA, le CEA réagira avec l'idiotype monoclonal et bloquera alors toute agglutination ultérieure entre les anticorps anti-idiotypiques de lapin et les anticorps monoclonaux de souris. Le degré de cette inhibitioin d'agglutination sera proportionnelle à la concentration de CEA dans le fluide biologique.
Suivant l'invention, la mise en réaction ou le mélange entre l'échantillon liquide contenant la substance à doser, les anticorps spécifiques et les anticorps anti-idiotypiques comprend, d'une manière générale, l'incubation de cet échantillon liquide et de ces anticorps sous agitation à une température d'environ 37[deg.]C pendant une durée très variable suivant le type de dosage ou de substance utilisé , pouvant aller par exemple de l'ordre de 15 minutes à 24 heures.
On notera également, suivant l'invention, que l'on obtiendra une meilleure sensibilité dans le dosage immunologique de la substance, dans le cas où les anticorps anti-idiotypiques sont fixés à des particules finements divisées, en préincubant l'échantillon liquide contenant la substance à doser avec les anticorps spécifiques sous agitation à une température de l'ordre de 37[deg.]C, pendant une durée de l'ordre de
1 minute à 18 heures, qui dépend principalement du type de la substance à doser. Dans le cas où l'on utilise des anticorps marqués, on préincubera l'échantillon liquide contenant la substance à doser avec ceux-ci à une température et pendant une durée similaires à celles qui viennent d'être citées.
Ainsi qu'on l'a déjà mentionné précédemment, le procédé de la présente invention peut être appliqué dans le cadre des techniques de radioimmunoessai, c'est-à-dire en utilisant des anticorps marqués, tout en ne présentant pas les inconvénients que ces techniques de radioimmunoessai actuelles comportent, telles que la technique du double anticorps, c'est-à-dire
le fait qu'elles ne peuvent être appliquées qu'à des substances comportant au moins deux déterminants antigéniques et d'obtenir des anticorps monoclonaux dont les spécificités ne se recouvrent pas. On se référera, à cet effet, en ce qui concerne la technique du double anticorps, à la figure 1 des dessins annexés.
Comme on l'a déjà expliqué, le premier anticorps est
fixé à la phase solide et le second anticorps est marqué au moyen d'un radioisotope, d'une enzyme, d'un fluorochrome ou d'une particule colloïdale. Suivant l'invention, l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques marqués, tel qu'on peut le voir sur la figure 2
des dessins annexés, permet de surmonter la limitation des techniques radioimmunologiques connues, notamment celle du double anticorps, et de permettre le dosage
de substances de structure moléculaire simple, telles
que la T3 ou la progestérone. Comme on peut le voir
sur cette figure 2, les anticorps anti-idiotypiques
sont marqués par une substance active du type radioisotope, enzyme, fluorochrome ou particule colloïdale
et les anticorps spécifiques sont couplés à une phase solide qui peut être constituée, par exemple, d'un support polymère, tel que microplaques de chlorure de polyvinyle, billes d'agarose, disques de papier ou de cellulose. On ajoute ensuite l'échantillon liquide contenant la substance ou l'antigène à doser aux anticorps insolubilisés, onlaisse réagir ces anticorps insolubilisés avec l'antigène, on ajoute à l'échantillon ainsi obtenu les anticorps anti-idiotypiques marqués,
on laisse réagir ces anticorps anti-idiotypiques marqués, on sépare de la phase solide ces anticorps antiidiotypiques marqués non liés aux anticorps insolubilisés et on détermine la quantité de substance antigénique
à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps anti-idiotypiques marqués liés à la phase solide. En fait, la liaison
de l'antigène aux anticorps empêchera la liaison des anticorps anti-idiotypiques marqués aux anticorps insolubilisés ( essai d'inhibition). Par conséquent, le signal donné par le marqueur diminuera avec l'augmentation de la quantité d'antigène.
Une autre forme de réalisation suivant l'invention consiste à utiliser des anticorps antiidiotypiques insolubilisés, les anticorps marqués étant alors les anticorps dirigés contre l'antigène
ou la substance à doser, comme on peut le voir sur la figure 3. On procède d'une manière analogue aux cas précédents mais on sépare, bien entendu, de la phase solide les anticorps spécifiques marqués non liésaux anticorps insolubilisés et on détermine la quantité de substance antigénique à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps spécifiques marqués liés à la phase solide.
Une troisième possibilité, suivant l'invention, est d'utiliser un troisième type d'anticorps, ces anticorps constituant alors les anticorps marqués, Le principe de ce dosage, finalement très similaire aux deux cas précédents, est représenté à la figure 4. On couple, en fait, dans ce cas, les anticorps spécifiques à la phase solide et on ajoute l'échantillon liquide contenant l'antigène ou la substance à doser aux anticorps ainsi insolubilisés, on laisse réagir ces anticorps insolubilisés avec la substance antigénique, on ajoute à l'échantillon ainsi obtenu des anticorps anti-idiotypiques, on laisse réagir ces anticorps anti-idiotypiques, on sépare de la phase solide les anticorps anti-idiotypiques non liés aux anticorps insolubilisés, on ajoute à la phase solide les anticorps marqués, dirigés contre les anticorps antiidiotypiques,
on laisse réagir ces anticorps marqués, qui reconnaissent en fait les immunoglobulines auxquelles appartiennent les anticorps anti-idiotypiques, on sépare de la phase solide les anticorps marqués
non liés aux anticorps anti-idiotypiques et on détermine la quantité de substance antigénique à doser dans l'échantillon liquide en fonction de l'activité résiduaire des anticorps marqués liés à la phase solide, cette phase solide pouvant également être constituée, comme dans les deux cas précédents, d'un support polymère, tel que microplaques de polyvinyle, billes d'agarose, disques de papier, etc. Dans les trois formes de réalisation susmentionnées, "la séparation des anticorps non liés de la phase solide se fait généralement par lavage dans une solution saline, ou encore par simple égouttage, décantage, précipitation ou centrifugation. Ce procédé convient particulièrement bien au dosage de molécules complexes, telles que les allergènes.
Les trois exemples concrets donnés ciaprès permettent d'illustrer davantage le procédé suivant l'invention.
Exemple 1.
Dosage d'immunoglobuline IqE (molécule complexe) en utilisant la technique d'immunoessai
par comptage, de particules (PACIA).
Vingt-sept anticorps monoclonaux différents de souris sont dirigés contre la molécule IgE
à doser dans des sérums humains et l'on choisit l'un de ces anticorps monoclonaux, que l'on appellera ciaprès B9. Les anticorps monoclonaux B9 réagissent d'une manière spécifique avec le déterminant dans la région D2 d'IgE qui contient les domaines CH3 et CH4. On purifie les anticorps monoclonaux B9 provenant du liquide d'ascite de souris par une chromatographie sur protéine A-Sépharose (Ey et collaborateurs, Immunochemistry 15, 429-436, 1978) et on les élue dans la frac-
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d'impuretés constituées d.'IgG polyclonale sans activité anti-IgE.
On injecte les anticorps monoclonaux
[100 pg dans 0,5 ml de NaCl(9 g/1) émulsifiés dans
0,5 ml d'adjuvant complet de Freund] par voie intradermique en des sites multiples toutes les deux semaines à des lapins blancs de Nouvelle-Zélande. On prélève du sang de ces animaux dix jours après la troisième injection et ensuite après chaque injection de rappel (Magnusson et collaborateurs, Clin. Allergy 11,
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piques les anticorps dirigés contre des déterminants non-idiotypiques de protéines sériques et d'IgG de souris, par des passages successifs de l'antisérum anti-idiotypique sur des colonnes de Sépharose, auquel sont liées des protéines sériques et de l'IgG de souris par du glutaraldéhyde (Cambiaso et collaborateurs, Immunochemistry 12,273-278, 1975). On purifie alors
les anticorps anti-idiotypiques IgG de lapin de l'antisérum absorbé au moyen d'une chromatographie sur protéine A-Sépharose (Magnusson et Masson, J. Allergy et Clin. Immun. 70, 326-336, 1982). On réduit ensuite les IgG purifiées en fragments F(ab')2 par une digestion peptique (Magnusson et collaborateurs, Clin.Allergy
11, 543-561, 1981).
On couple 400 pg de ces fragments F(ab')2 à 100 fil de latex carboxylé (100 g/1, Estapor K150, lot No. 501, Rhône-Poulenc, Courbevoie, France) par
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Clin. immun. 70, 326-336, 1982). Avant utilisation,
on a dilué le latex 160 fois. Les anticorps antiidiotypiques IgG de lapin se trouvent donc sous la forme d'une suspension de latex recouvert de frag-
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On dilue les sérums humains contenant l'IgE à doser dans un diluant à base de glycine contenant du NaCl ajusté à pH 9,2 avec du NaOH et additionné d'albumine de sérum bovin ( BSA) à raison de 10 mg/ml, de sérum de lapin normal (NRS) à 10%
et de fragments F(ab')2 de lapin agglutinés par du glutaraldéhyde à raison de 0,6 mg/ml pour absorber les éventuels anticorps anti-fragments F(ab') . Cette solution formée d'un diluant et d'anticorps sera appelée ci-après NRS-BSA-F. Le diluant est formé en fait de 20 mg/ml de Dextran T500 (Pharmacia, Uppsala, Suède) dans de la glycine 0,lM contenant
50 mmoles d'acide éthylène diamine tétraacétique
et 0,6 moles de NaCl, la solution étant ajustée à
pH 9,2 avec du NaOH.
Poursuivre la réaction des anticorps monoclonaux B9 avec l'IgE, on préincube les échantillons de sérum humain avec les anticorps mono- clonaux B9 pendant différentes périodes de
temps et on mesure ensuite l'activité agglutinante résiduaire de ces anticorps monoclonaux B9 vis-à-vis du latex recouvert des anticorps anti-idiotypiques spécifiques des anticorps B9. On mesure l'agglutination en comptant le nombre de particules non agglutinées dans un dispositif de comptage de particules optique relié: à un système de prélèvement d'échantillons et d'incubation automatisé (voir,
par exemple, Magnusson-et collaborateurs, 1981).
On pourrait bien entendu également mesurer directement la quantité de latex agglutinée. Dans un essai caractéristique, le dispositif aspire des portions de 30 fil du mélange d'échantillon contenant l'- IgE et d'anticorps monoclonaux B9 et les injecte
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de lapin (sous la forme de fragments F(ab') ) couplés à du latex ont été ajoutés séquentiellement
et automatiquement. Après 25 minutes d'incubation sous une agitation tourbillonnante continue à 37[deg.]C, compte les particules non agglutinées. Dans le
cas où l'on dose l' IgE sans préincubation avec B9, on ajoute B9 en même temps que le diluant. Pour l'étude de corrélation, on a utilisé la méthode de dosage d'IgE décrite précédemment par Magnusson et Collaborateurs, 1981 .
Il est nécessaire dans le choix d'une concentration appropriée en anticorps monoclonaux B9 utilisés comme substance agglutinante, d'ajuster les exigences contradictoires pour l'obtention d'une sensibilité optimale et d'une précision satisfaisante sur la gamme requise. La sensibilité optimale requiert
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dans la partie la plus inclinée de la courbe d'agglutination sigmoidale. La précision requiert , quant à elle, une gamme plus large qui ne pourrait être obtenue que si l'agglutinat en l'absence d'inhibiteur lie une proportion élevée de latex recouvert d'anticorps (Magnusson et Collaborateurs,1983). Sur la base de ces critères, on a choisi une concentration de 20 ug/litre d'anticorps monoclonaux B9,
qui provoquent 75% d'agglutination. On notera, à
cet effet, que l'on choisira d'une manière générale
une concentration en anticorps spécifiques dans l'échantillon liquide permettant d'obtenir, en l'absence de substance inhibitrice, un degré d'agglutination
d'au moins 50% avec les anticorps anti-idiotypiques.
L'inhibition exercée par l'IgE sur l'activité agglutinante des anticorps monoclonaux B9 vis-à-
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après différentes périodes de temps d'incubation entre l'IgE et les anticorps monoclonaux B9 (voir figure 4). Comme on peut le voir sur cette figure 4, la hauteur de pic, représentant en fait le nombre de particules de latex non agglutinées en unités arbitraires, augmente avec l'élévation de la concentration en IgE dans l'échantillon. C'est-à-dire qu'en fait l'addition de dose croissante d'IgE empêche proportionnellement l'activité agglutinante des anticorps monoclonaux B9 vis-à-vis du latex. Les différences entre les quatre courbes montrent l'influence du temps de préincubation entre l'IgE et les anticorps monoclonaux B9 sur la sensibilité du dosage, la dernière courbe, sans période de préincubation, donnant la moins bonne sensibilité. En fait, la sensibilité s'élève de 40 UI/ml à 6 UI/ml d'IgE lorsque l'on accroît les temps de préincubation <EMI ID=14.1>
incubation donne des courbes d'inhibition plus inclinées ( plus à pic) et, par conséquent, une meilleure précision.
On pense que le mécanisme d'inhibition
et d'agglutination obtenu provient essentiellement de l'interaction de B9 avec l'IgE, qui inhibe l'agglutination de latex anti-B9 parce que les idiotopes de B9 sont masqués par la liaison d'IgE. Toutefois, étant donné que l'IgE est une molécule symétrique et qu'elle contient tous ses épitopes en double, on pense que la simple formation d'un réseau antigène,- anticorps pourrait également participer au processus d'inhibition de l'agglutination entre les anticorps B9 et le latex anti-B9. Cette hypothèse a été examinée en utilisant du latex recouvert de fragments F(ab')2 provenant
<EMI ID=15.1>
n'auraient pas été rendus spécifiques des idiotopes C9, c'est-à-dire qui n'auraient pas été purifiés.
On a constaté que ce latex était agglutiné jusqu'à
60% par 5 pg/litre d'anticorps monoclonaux B9, ce
qui montre que l'antisérum anti-C9 non absorbé a réagi avec des déterminants antigéniques qui n'étaient pas des idiotopes. Compte tenu de ce que la préparation d'anticorps monoclonaux B9 était contaminée par
20% d'IgG polyclonale, le latex a pu participer à l'activité agglutinante vis-à-vis du latex recouvert d'anti-IgG (voir ci-dessus). Malgré cette contamination par IgGI. sans l'activité d'anticorps anti-IgE, l'addition de 40 UI/ml d'IgE a inhibé l'agglutination d'environ 10%. On peut donc conclure que la simple formation d'un complexe ou réseau d'antigène- anticorps entre les anticorps monoclonaux et leur antigène (molécule d' IgE) a contribué quelque peu au processus d'inhibition mais que le masquage de l'idiotype (B9) par la liaison de l'antigène (molécule d'IgE) joue certainement le rôle majeur.
Comme on le sait, l'utilisation de NRS-BSA-F (Collet-Cassart et Collaborateurs, 1983) comme diluant pour échantillons et témoins empêche l'agglutination non spécifique de latex recouvert de fragments F(ab')2 d'IgG de lapin. Pour vérifier d'autres facteurs d'interférence éventuels, on a essayé 20 sérums contenant de faibles doses d'IgE
<EMI ID=16.1>
cubation entre les échantillons et les anticorps monoclonaux B9. Sous ces conditions, l'IgE dans ces échantillons se trouvait en-dessous de la limite de détection. Le coefficient de variation de la concentration de particules non agglutinées était de 2%, ce qui correspondait à 0,5 unité
de hauteur de pic. Cette très faible valeur du coefficient de variation montre qu'il y a très peu d'interférences, et que l'on se trouve donc dans des conditions fiables. D'autre part, deux sérums avec des titres élevés de facteur rhumatoide; IgM et réagissant fortement avec les IgG de lapin, c'est-à-dire les anticorps anti-idiotypiques,n'agglutinaient pas le latex anti-B9, ce qui montre que l'utilisation de fragments F(ab')2 au lieu d'IgG intacte à la surface des particules de latex prévient efficacement l'agglutination causée par le facteur rhumatoide.
Récupération analytique
Dix sérums de patients contenant 10 à
770 UI/ml d'IgE ont été additionnés de 2000 UI/ml d'IgE et l'IgE de ces sérums a été dosé après une dilution de 10 fois dans du NRS-BSA-F. La récupération analytique moyenne d'IgE était de 95,8%
8,7% (déviation standard) avec un coefficient de variation de 9,1%,ce.qui montre qu'il n'y a pratiquement pas eu d'interférence entre l'IgE et le diluant NRS-BSA-F.
Corrélation.
On a dosé de l'IgE par l'essai d'inhibition idiotypique de l'invention dans 41 sérums, qui avaient déjà été dosés par agglutination directe
(latex recouvert�d'anti-IgE agglutinant l'IgE). Le temps de préincubation des sérums contenant l'IgE
avec B9 dans le dosage par inhibition était de 30 minutes. La corrélation entre les résultats de dosage d'IgE obtenus avec l'essai d'inhibition idiotypique de l'invention et l'essai d'agglutination directe est donnée par la figure 6. Comme on peut le voir sur cette figure, les résultats sont sensiblement similaires, se retrouvant pratiquement rassemblés dans une même zone. Le coefficient de corrélation entre les deux types de dosage est r = 0,96 avec une ligne de régression y = 0,77 x + 97,4 (y = essai d'inhibition; x = essai d'agglutination directe). Exemple 2. Dosage radioimmunologique d'un allerqène
<EMI ID=17.1>
Le principe de ce dosage est représenté par la figure 4 des dessins annexés.Les puits d'une plaque de chlorure de polyvinyle(Flow Laboratories)sont recouverts d'immunoglobulines anti-D. pteronyssinus humaines
(antisérum IgG) obtenues de patients allergiques.
On incube, à cet effet, les plaques pendant 6 heures à une température de 37[deg.]C avec 100 ul, par puits, d'une solution saline (9 g/litre) tamponnée à pH
9,2 avec 50 mmoles de glycine contenant 10 ug/ml d'antisérum IgG. Après lavage avec la solution saline tamponnée, des dilutions en série de l'allergène (DPT) en solution saline (9 g/litre) tamponnée
à pH 7,5 avec du Tris 0,05M et contenant 0,1% de sérum de veau foetal-(TSA-FCS) sont pipetées dans les puits, et la plaque est incubée pendant 2 heures à 37[deg.]C. Après quatre lavages avec de la solution saline (9 g/litre), on ajoute en portions de 50 ul à chaque puits des anticorps anti-idiotypiques IgG de lapin dilués dans du TSA-FCS à 2 mg/ml et on les incube pendant 8 heures à 37[deg.]C. On lave ensuite les plaques quatre fois avec de la solution saline
(9 g/litre). On mesure ensuite la quantité d'anticorps anti-idiotypiques de lapin liés à l'antisérum IgG au moyen d'anticorps marqués dirigés contre les anticorps anti-idiotypiques IgG de lapin. Des por-
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pipeté.esdans les puits incubées pendant 16 heures
à 21[deg.]C et, après lavage, on compte la radioactivité dans un compteur de rayonnement gamma. Comme on peut le voir sur la figure 7, l'inhibition de la liaison des anticorps anti-idiotypiques de lapin est proportionnelle à la concentration en allergène. Les résultats sont calculés par la formule suivante:
_ cpm de l'échantillon - cpm du contrôle A
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le contrôle A représentant la radioactivité
d'un puits sans anticorps anti-idiotypiques, c'est-à-dire la radioactivité non spécifique provenant de la liaison des anticorps de chèvre sur le support, le contrôle B la radioactivité d'un puits sans
l'allergène (DPT), c'est-à-dire en fait la radioactivité maximale et cpm signifiant le nombre de coups
par minute.
Exemple 3.
Dosaqe de thyroxine (T4) par comptage de particules (PACIA).
On prépare un antisérum de- .lapin dirigé contre l'idiotype d'anticorps anti-T4 monoclonaux
(Hybritec, Liège, Belgique), comme décrit ci-dessus
pour l'antisérum anti-idiotypique dirigé contre les anticorps anti-IgE monoclonaux. On utilise ensuite l'antisérum anti-idiotypique pour le dosage de T4
en utilisant soit du latex recouvert des anticorps anti-idiotypiques , soit du latex recouvert des anticorps monoclonaux.
Dans le premier procédé ( qui suit scrupuleusement les détails donnés pour la détermination spécifique d'IgE ; voir exemple 1) , on recouvre le
latex de fragments F(ab')2 de l'IgG anti-idiotypique , comme décrit dans le dosage d'I.gE de l'exemple 1. On mesure alors l'activité agglutinante des anticorps monoclonaux. On constate qu'une concentration de
10 ug/litre en anticorps monoclonaux, provoquant une agglutination de 80%, donne la sensibilité la plus élevée dans l'essai d'inhibition. L'inhibition exercée par la T4 solubilisée en solution saline
(9 gr/litre) sur l'activité agglutinante des anticorps anti-T4 monoclonaux est testée après différents périodes d'incubation entre T4 et les anticorps anti-T4 monoclonaux. La sensibilité
s'accroît de 40 à 20 ng/litre en augmentant la période d'incubation de 0 à 30 minutes, la sensibilité étant définie par 3 unités de hauteur de pic. Des périodes d'incubation plus longues que 30
minutes n'améliorent pas la sensibilité. La gamme dynamique s'étend de 20 à 320 ng/ml.
Dans le second procédé, on recouvre le latex d'anticorps anti-T4 monoclonaux et on utilise l'antisérum anti-idiotypique comme substance agglutinante. L'activité agglutinante de cet antisérum dilué à 1/4000 est accrue par l'addition d'un sérum rhumatoïde dilué à 1/50, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 4.427.781. On a
choisi ce sérum rhumatoïde sur la base de sa forte activité agglutinante vis-à-vis du latex recouvert d'IgG de lapin et de son manque d'activité agglutinante vis-à-vis du latex recouvert d'IgG de souris. L'inhibition exercée par T4 solubilisée en solution saline
(9 gr/litre) sur l'agglutination est testée après différents temps d'incubation entre T4 et le latex anti-T4 avant l'addition de l'anti-idiotype de lapin additionné du facteur rhumatoïde . La sensibilité s'accroît de 25 ng/ml à 1 ng/ml lorsque l'on augmente les temps de préincubation de 0 à 30 minutes. Des incubations plus longues n'améliorent pas la sensibilité au-delà de 1 ng/ml. La gamme dynamique s'étend de 1 ng/ml 100 ng/ml.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de dosage immunologique d'une substance dans un échantillon liquide, tel qu'un
fluide biologique, ladite substance comportant au
moins un déterminant important pour l'identification
de celle-ci, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en réaction dudit échantillon liquide contenant la substance à doser, d'anticorps dirigés contre ladite substance, spécifiques dudit déterminant et d'anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les anticorps spécifiques et la détermination de la quantité de la substance dans l'échantillon liquide en mesurant le degré d'inhibition qu'entraîne cette substance sur la réaction de liaison entre les anticorps spécifiques et anti-idiotypiques susdits, la quantité de cette substance étant proportionnelle au degré d'inhibition obtenu sur cette réaction de liaison.
"Method for the immunological determination of a substance in
a liquid sample with anti-antibiotic antibodies ".
"Method for the immunological determination of a substance in a liquid sample by means of antibodies
<EMI ID = 1.1>
The present invention relates to a method for the immunological determination of a substance in
a liquid sample, such as a biological fluid, this substance comprising at least one important determinant for its identification.
The use of antibodies for the determination of a substance with very high sensitivity and specificity is well known and is the basis of radioimmunoassays, enzyimmunoessai, fluoroimmunoassay, particle count immunoassay, etc. In all cases, a very pure sample of the substance to be assayed is injected into an animal and, after repeated injections, the animal's blood is drawn, the serum is separated and the serum is used as a reagent for dosage of the substance. The serum contains a special class of proteins which the animal has produced, which bind in a specific way to the substance which one
injected and which, by binding to the substance, form aggregates which can be separated by centrifugation, precipitation or any of the other separation methods available. these special proteins belong to the known class of "immunoglobulins", including five main classes known as "IgG, IgA, IgM, IgE and IgD", which exist
<EMI ID = 2.1>
percentage of immunoglobulin is adapted to react
with the substance to be dosed. This portion is called "antibody". If one wishes to assay, for example, immunoglobulins of this type belonging to the human being, it suffices to purify one of the human immunoglobulins,
<EMI ID = 3.1>
in another animal, for example a rabbit, and at the same time, to separate a rabbit serum which will bind this specific human immunoglobulin, which was initially injected into the rabbit. Rabbit serum that reacts with human immunoglobulin will likely contain rabbit IgG and rabbit IgM antibodies, which will be present in amounts of the order of
1 to 2% of total IgG or IgM.
Obviously, the antibodies recognizing different substances are different from each other and this difference lies in the chemical arrangement of a specific part of the immunoglobulin which is able to recognize the substance to be assayed. This part is called the "antigen binding site", and it recognizes a specific part of the substance to be assayed, ie a small chain of molecules called "determinant". However, most complex substances to be analyzed have more than one characteristic chain of molecules and therefore have more than one determinant. In
the population of antibodies produced, there will be antibodies which bind to each determinant and, in most cases, the antibodies which bind to one determinant of the substance will not bind to another determinant thereof. In summary, an antiserum will contain antibodies of a large number of types, each type of antibody agglutinating through a different determinant on the substance and constituting only part of the total antibodies, which themselves represent only a small proportion of total immunoglobulins. Therefore, there will be as many antigen binding sites as there
<EMI ID = 4.1>
If, now, each antibody is separated with a given antigen binding site, for example, of a rabbit antiserum directed against
human IgG and if you inject one of these antibodies, for example, into a goat, the goat will produce antibodies that will recognize rabbit antibodies.
Goat antibodies will react with determinants which are common to rabbit immunoglobulin but some of the antibodies may specifically recognize determinants located in the antigen binding sites of rabbit antibodies. These determinants are usually called "idiotopes" and the association of the different idiotopes of a given antibody is called an "idiotype". Antisera or antibodies reacting with idiotypes are called "anti-idiotypics".
Although the immunoassays can be subdivided in several ways, they will be divided in the present case, for the sake of convenience, into two major types, namely assays by direct agglutination and assays by inhibition of agglutination. In.
direct agglutination dosages, the substance
to be dosed in its natural form is directly involved in agglutination. Obviously, the substance
must have more than one determinant. The agglutination process then involves an agglutinate of the antibody-substance-antibody-substance-antibody type,
etc., the size of the agglutinates depending on a
large number of factors. Once the reaction is complete, the amount of antibody remaining will be inversely proportional to the concentration of the substance initially present.
The present invention however only relates to dosages of the second type, that is to say
assays by inhibition of agglutination. This
second type of dosage is interesting for
substances that have only one determinant
or for substances of such close composition that they differ by only one determinant
important. For example, this type of assay is particularly advantageous for simple molecules, such as thyroxine (T4) or progesterone or
for a lot of auto hormones that are too
small to have more than one determinant and which cannot enter into an agglutination reaction.
On the other hand, certain large molecules, such as the carcinoembryonic antigen (CEA),
a cancer disease detection agent, has many different determinants
but there are probably only a small number of determinants on CEA that are truly distinctive, the other determinants appearing on analogous substances which are not cancer detection agents.
The present invention improves the assays for molecules of simple structure and provides a new means for assaying molecules of complex structure comprising one or more important determinants for the identification of the molecule to be assayed, that is to say giving individuality to it.
The technique usually applied to the determination of simple molecules is described below, taking triiodothyronine (T3) as an example. A substance can be given a large number of determinants, each determinant being constituted by
a T3 molecule by linking several T3s to a macromolecule, such as dextran or albumin. The substance dextran-T3 then becomes a substance comprising several determinants. If we now add antibodies produced for example in a mouse directed against the substance dextran-T3, these antibodies will form agglutinates: antibody-dextranT3-antibody-dextran-T3, etc. If we add now-
<EMI ID = 5.1>
antigen of mouse antibodies, and thus these antibodies will no longer be able to react. When adding dextran-T3 now, there will be fewer antibodies with a free antigen binding site and therefore agglutination will be less. The T3
free in human serum therefore inhibited the agglutination of antibodies to the substance dextran-T3. This technique is well known and has been described in a large number of prior patents.
However, this technique has several drawbacks, the main ones of which are as follows:
1) The binding of a simple substance to
a larger molecule is often expensive and difficult if it is to be produced efficiently. Although we can bring in
these high prices in the course of making an antibody-producing substance, its use
as a "bulk" reagent in an assay can greatly increase the cost of the assay.
2) The sensitivity of a large number of assays is limited because the antibodies recognize as determinants of groups other than the simple substance, that is to say the simple substance combined
to other atoms or atomic configurations surrounding it in the large molecule. Therefore, in mixtures, such as the one made up,
for example, from T3, dextran-T3 and antibodies, the antibodies have a preference for dextran-T3. To overcome this preference, the user is forced to have a quantity of T3 greater than the theoretically required quantity, that is to say to work with reduced sensitivity.
The object of the present invention therefore consists in overcoming the aforementioned drawbacks of known assay methods, in providing an immunological assay method, with very high sensitivity and specificity, of a substance in a liquid sample, such as '' a biological fluid, this substance being able to be as well of simple molecular structure, that is to say to comprise only one determinant for its identification, as of complex molecular structure, that is to say comprising one or more important determinants for his identification.
To this end, according to the invention, the liquid sample containing the substance to be assayed, antibodies directed against said substance, specific to said determinant and antiidiotypic antibodies directed against specific antibodies are reacted and the amount of the substance is determined in the liquid sample by measuring the degree of inhibition which this substance causes on the binding reaction between the specific antibodies and anti-idiotypic abovementioned, the amount of this substance being proportional to the degree of inhibition obtained on the above-mentioned binding reaction .
According to a particular embodiment of the method of the invention, either the anti-idiotypic antibodies or the specific antibodies are attached to finely divided particles, such as latex particles, red blood cells, and the amount of substance in the substance is determined. the liquid sample, after reaction of this substance and of the abovementioned specific and anti-idiotypic antibodies,
depending on the degree of residual agglutination or
of non-agglutination of these finely divided particles.
According to a first particularly advantageous embodiment of the process of the invention, the agglutinative activity of the antiidiotypic antibodies is increased by the addition of an agent capable of increasing such activity, chosen, for example,
in the group comprising rheumatoid factor,
complement factor Clq and polyethylene glycol.
According to another particularly advantageous embodiment of the method of the invention, in the case where the anti-idiotypic antibodies
are fixed to finely divided particles, the liquid sample containing the substance is preincubated
to be assayed with specific antibodies under agitation
at a temperature of the order of 37 [deg.] C for a period
in the range of 1 minute to 6 p.m.
The process of the present invention can,
of course, also be applied to techniques
radioimmunoassay assay with markers, i.e.
in techniques which involve the use of antibodies labeled with radioactive, enzymatic or other substances. These immunoassay techniques, including in particular the double-antibody technique, also have drawbacks. This technique
of the double antibody is currently the most widely used assay technique in practice. This technique consists in insolubilizing the antibodies raised
tells the substances to be dosed by coupling them to a
solid phase, which can consist of polyvinyl microplates, agarose beads,
paper discs, etc. These insolubilized antibodies, when mixed with the test sample, will retain the substance. After removing unbound molecules, the presence of the substance is detected by the binding of antibodies
labeled which recognize antigenic determinants different from those recognized by insolubilized antibodies. As just mentioned, antibodies can be labeled with a radioisotope,
an enzyme, or also by a fluorochrome or
colloidal particles. This marking will make it possible to measure the bound antibodies, the quantity of which will be proportional to the quantity of substance retained
by insolubilized antibodies. However, this type of assay has two drawbacks: it can only be applied to substances comprising at least two antigenic determinants, which is not the case.
small substances such as T3 or progesterone, and it requires two populations of antibodies recognizing different antigenic determinants. One can, for example, use two monoclonal antibodies with different specificities. However, for some antigens, it may be difficult to obtain monoclonal antibodies with
specificities that do not overlap. The assay method of the present invention overcomes these drawbacks through the use of anti-idiotypic antibodies, and can therefore also be used for the assay of simple substances having only one important determinant for identifying these.
Therefore, in another form
embodiment of the invention, the antiidiotypic antibodies are labeled by means of an active substance chosen from the group comprising radioisotopes, enzymes, fluorochromes and colloidal particles and specific antibodies coupled to a solid phase so as to insolubilize them, and the liquid sample containing the substance to be assayed is added to the insolubilized antibodies,
these insolubilized antibodies are allowed to react with said substance, labeled anti-idiotypic antibodies are added to the sample thus obtained, these labeled anti-idiotypic antibodies are allowed to react, these labeled anti-idiotypic antibodies are not separated from the solid phase insolubilized, and the amount of substance to be determined in the liquid sample is determined as a function of the residual activity of the labeled anti-idiotypic antibodies linked to the solid phase.
According to a second particular embodiment of the invention, the specific antibodies are labeled by means of an active substance chosen from the group comprising radioisotopes,
<EMI ID = 6.1>
and the anti-idiotypic antibodies coupled to a solid phase so as to insolubilize them, and the liquid sample containing the substance is added
to be assayed for insolubilized antibodies, these insolubilized antibodies are allowed to react with said substance,
the labeled specific antibodies are added to the sample thus obtained, these labeled specific antibodies are allowed to react, the labeled specific antibodies not linked to the insolubilized antibodies are separated from the solid phase and the amount of substance to be determined in the liquid sample is determined depending on the residual activity of specific antibodies
marked linked to the solid phase.
According to yet another particular embodiment of the invention, the specific antibodies are coupled to a solid phase so as to insolubilize them and the liquid sample containing the substance to be assayed is added to the insolubilized antibodies,
these insolubilized antibodies are allowed to react with said substance, the anti-idiotypic antibodies are added to the sample thus obtained, these anti-idiotypic antibodies are reacted, the anti-idiotypic antibodies not linked to the insolubilized antibodies are separated from the solid phase we add to the solid phase
antibodies directed against the anti-idiotypic antibodies, labeled by means of an active substance chosen: in the group comprising the radioisotopes, enzymes, fluorochromes and colloidal particles, these labeled antibodies are allowed to react, and separated from the solid phase labeled antibodies not linked to anti-idiotypic antibodies and the quantity of substance to be determined in the liquid sample is determined according to the residual activity of the labeled antibodies
related to the solid phase.
Other details and particularities of the invention will emerge from the description given below by way of nonlimiting example of some particular embodiments of the invention.
Note that the immunoassay method of the present invention is in fact facilitated. by the use of specific antibodies, that is to say monoclonal antibodies the production of which, in particular in mice, is well known. The characteristic of a monoclonal antibody is that it binds to a specific determinant on the substance to be assayed. If, therefore, there are, for example, five determinants
on a human growth hormone molecule, five different monoclonal antibodies could be induced, one for each determinant. Although each antibody is an IgG, its idiotype differs, that is to say that it actually has a different chemical composition in the region which recognizes
the determining. Since the antibody has a different chemical composition, it would then be theoretically possible to produce an antiserum against each idiotype by injecting for example into a rabbit the specific monoclonal antibody. Rabbit antiserum will likely contain antibodies to IgG
of mice but among these antibodies there will be a part which will recognize the idiotype in a specific way, that is to say that the antiserum is anti-idiotypic. As those skilled in the art are well aware, these very specific anti-idiotypic IgG antibodies can be separated and used as a reagent.
Therefore, in a specific immunoassay of triiodothyronine (T3), if anti-mouse monoclonal anti-T3 antibodies are reacted
as specific antibodies with rabbit IgG anti-idiotypic antibodies directed against mouse monoclonal antibodies, as antiidiotypic antibodies, anti-idiotypic antibodies would then agglutinate anti-mouse monoclonal T3 antibodies. If, now, we had mixed the liquid sample containing the substance to be assayed, that is to say in this case human serum, containing
T3 with mouse anti-T3 monoclonal antibodies, triiodothyronine would have reacted with mouse monoclonal antibodies, blocking the idiotypic center. By cons, when reacting, according to the invention, this mixture of human serum containing T3 and mouse monoclonal antibodies with
anti-idiotypic rabbit antibodies, agglutination will be significantly less. We will determine, in this case, the amount of T3 in human serum
by measuring the degree of inhibition caused by T3
on the binding reaction between the specific and anti-idiotypic antibodies, which is in fact an agglutination reaction, the amount of T3 being proportional to the degree of inhibition obtained on this agglutination reaction. In this dosing process,
it is therefore no longer necessary to link the substance to be assayed to a macromolecule, so that it contains a large number of determinants, and
there is no longer any competition between the determinants comprising the bound substance and the free substance.
As already stated above, the assay method of the invention can also be extended to the assay of a substance of complex molecular structure, comprising one or possibly several important determinants for its identification. These determinants can exist on the walls of bacteria or viruses, or even constitute a small part of a complex molecule. The isolation of these specific fractions or determinants is currently technologically often very difficult to achieve, if not impossible. For specialists in the production of monoclonal antibodies, pure separation
of these determinants is often not necessary to have highly specific monoclonal antibodies. For example, one can obtain monoclonal antibodies against the determinant of carcinoembryonic antigen
(CEA), which is the distinguishing element in the detection of cancerous tumors. When these monoclonal antibodies, for example anti-mouse monoclonal anti-CEA antibodies, are injected into a rabbit, the rabbit will produce anti-idiotypic rabbit IgG antibodies against the mouse monoclonal antibodies, which themselves are directed against the determinant. specific to CEA.
In the absence of CEA, rabbit antiidiotypic antibodies will form agglutinates with mouse monoclonal antibodies. However, when the mouse monoclonal antibodies are mixed with, for example, a human serum containing CEA, the CEA will react with the monoclonal idiotype and then block any subsequent agglutination between the rabbit anti-idiotypic antibodies and the monoclonal antibodies of mice. The degree of this agglutination inhibitioin will be proportional to the concentration of CEA in the biological fluid.
According to the invention, the reaction or the mixture between the liquid sample containing the substance to be assayed, the specific antibodies and the anti-idiotypic antibodies generally comprises the incubation of this liquid sample and of these antibody with stirring at a temperature of about 37 [deg.] C for a very variable time depending on the type of assay or substance used, which can range, for example, from 15 minutes to 24 hours.
It will also be noted, according to the invention, that a better sensitivity will be obtained in the immunological assay of the substance, in the case where the anti-idiotypic antibodies are attached to finely divided particles, by preincubating the liquid sample containing the substance to be assayed with the specific antibodies, with stirring, at a temperature of about 37 [deg.] C, for a period of about
1 minute to 18 hours, which mainly depends on the type of substance to be dosed. In the case where labeled antibodies are used, the liquid sample containing the substance to be assayed will be preincubated with them at a temperature and for a duration similar to those which have just been mentioned.
As already mentioned previously, the method of the present invention can be applied in the context of radioimmunoassay techniques, that is to say using labeled antibodies, while not having the drawbacks that these current radioimmunoassay techniques include, such as the double antibody technique, i.e.
the fact that they can only be applied to substances comprising at least two antigenic determinants and to obtain monoclonal antibodies whose specificities do not overlap. For this purpose, reference is made, with regard to the double antibody technique, to FIG. 1 of the accompanying drawings.
As already explained, the first antibody is
attached to the solid phase and the second antibody is labeled using a radioisotope, an enzyme, a fluorochrome or a colloidal particle. According to the invention, the use of labeled anti-idiotypic antibodies, as can be seen in FIG. 2
of the appended drawings, overcomes the limitation of known radioimmunological techniques, in particular that of the double antibody, and allows the assay
substances of simple molecular structure, such as
than T3 or progesterone. As we can see
in this figure 2, the anti-idiotypic antibodies
are marked by an active substance of the radioisotope, enzyme, fluorochrome or colloidal particle type
and the specific antibodies are coupled to a solid phase which may consist, for example, of a polymeric support, such as microplates of polyvinyl chloride, agarose beads, paper or cellulose discs. The liquid sample containing the substance or the antigen to be assayed is then added to the insolubilized antibodies, these insolubilized antibodies are allowed to react with the antigen, the labeled anti-idiotypic antibodies are added to the sample thus obtained,
these labeled anti-idiotypic antibodies are allowed to react, these labeled antiidiotypic antibodies not linked to the insolubilized antibodies are separated from the solid phase and the amount of antigenic substance is determined
to be assayed in the liquid sample as a function of the residual activity of the labeled anti-idiotypic antibodies linked to the solid phase. In fact, the bond
of the antigen to the antibodies will prevent the binding of the labeled anti-idiotypic antibodies to the insolubilized antibodies (inhibition test). Consequently, the signal given by the marker will decrease with the increase in the amount of antigen.
Another embodiment according to the invention consists in using insoluble antiidiotypic antibodies, the labeled antibodies then being the antibodies directed against the antigen
or the substance to be assayed, as can be seen in FIG. 3. The procedure is analogous to the previous cases but, of course, the specific labeled antibodies not linked to the insolubilized antibodies are separated from the solid phase and the quantity is determined. of antigenic substance to be assayed in the liquid sample according to the residual activity of the specific labeled antibodies linked to the solid phase.
A third possibility, according to the invention, is to use a third type of antibody, these antibodies then constituting the labeled antibodies. The principle of this assay, ultimately very similar to the two previous cases, is shown in FIG. couple, in fact, in this case, the specific antibodies to the solid phase and the liquid sample containing the antigen or the substance to be assayed is added to the antibodies thus insolubilized, these insolubilized antibodies are allowed to react with the antigenic substance, we add to the sample thus obtained anti-idiotypic antibodies, these anti-idiotypic antibodies are allowed to react, the anti-idiotypic antibodies not linked to the insolubilized antibodies are separated from the solid phase, the labeled antibodies, directed against antiidiotypic antibodies,
these labeled antibodies are allowed to react, which in fact recognize the immunoglobulins to which the anti-idiotypic antibodies belong, the labeled antibodies are separated from the solid phase
not linked to anti-idiotypic antibodies and the quantity of antigenic substance to be determined in the liquid sample is determined according to the residual activity of the labeled antibodies linked to the solid phase, this solid phase can also be constituted, as in the two previous cases, of a polymer support, such as polyvinyl microplates, agarose beads, paper discs, etc. In the three above-mentioned embodiments, "the separation of the unbound antibodies from the solid phase is generally carried out by washing in a saline solution, or even by simple draining, decanting, precipitation or centrifugation. This method is particularly suitable for assaying molecules complexes, such as allergens.
The three concrete examples given below make it possible to illustrate the process according to the invention further.
Example 1.
Assay of immunoglobulin IqE (complex molecule) using the immunoassay technique
by counting, of particles (PACIA).
Twenty-seven different mouse monoclonal antibodies are raised against the IgE molecule
to be assayed in human sera and one of these monoclonal antibodies is chosen, which will be called below B9. The B9 monoclonal antibodies react specifically with the determinant in the D2 region of IgE which contains the CH3 and CH4 domains. The B9 monoclonal antibodies from the mouse ascites fluid are purified by chromatography on protein A-Sepharose (Ey et al., Immunochemistry 15, 429-436, 1978) and are eluted in the fraction.
<EMI ID = 7.1>
impurities consisting of polyclonal IgG without anti-IgE activity.
Monoclonal antibodies are injected
[100 pg in 0.5 ml NaCl (9 g / 1) emulsified in
0.5 ml of complete Freund's adjuvant] intradermally at multiple sites every two weeks to New Zealand white rabbits. Blood is drawn from these animals ten days after the third injection and then after each booster injection (Magnusson et al., Clin. Allergy 11,
<EMI ID = 8.1>
spikes the antibodies directed against non-idiotypic determinants of serum proteins and mouse IgG, by successive passages of the anti-idiotypic antiserum on Sepharose columns, to which serum proteins and mouse IgG are linked with glutaraldehyde (Cambiaso et al., Immunochemistry 12,273-278, 1975). We then purify
anti-idiotypic rabbit IgG antibodies to the antiserum absorbed by means of protein A-Sepharose chromatography (Magnusson and Masson, J. Allergy and Clin. Immun. 70, 326-336, 1982). The purified IgGs are then reduced to fragments F (ab ') 2 by peptic digestion (Magnusson et al., Clin.Allergy
11, 543-561, 1981).
400 μg of these fragments F (ab ′) are coupled 2 to 100 μl of carboxylated latex (100 g / 1, Estapor K150, lot No. 501, Rhône-Poulenc, Courbevoie, France) by
<EMI ID = 9.1>
Clin. immune. 70, 326-336, 1982). Before use,
the latex was diluted 160 times. Antiidiotypic rabbit IgG antibodies are therefore in the form of a latex suspension coated with frag-
<EMI ID = 10.1>
Human sera containing IgE to be assayed are diluted in a glycine diluent containing NaCl adjusted to pH 9.2 with NaOH and supplemented with bovine serum albumin (BSA) at a rate of 10 mg / ml, 10% normal rabbit serum (NRS)
and of rabbit F (ab ') 2 fragments agglutinated with glutaraldehyde at the rate of 0.6 mg / ml to absorb any anti-F (ab') fragment antibodies. This solution formed of a diluent and of antibodies will be called hereinafter NRS-BSA-F. The diluent is actually 20 mg / ml Dextran T500 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) in 0.1 µM glycine containing
50 mmol of ethylene diamine tetraacetic acid
and 0.6 moles of NaCl, the solution being adjusted to
pH 9.2 with NaOH.
Continue the reaction of the B9 monoclonal antibodies with IgE, the human serum samples are preincubated with the B9 monoclonal antibodies for different periods of time.
time and then the residual agglutinative activity of these monoclonal B9 antibodies is measured against the latex coated with anti-idiotypic antibodies specific for B9 antibodies. Agglutination is measured by counting the number of non-agglutinated particles in an optical particle counting device connected: to an automated sample collection and incubation system (see,
for example, Magnusson-et al., 1981).
One could of course also directly measure the amount of agglutinated latex. In a typical test, the device draws portions of wire from the mixture of sample containing the IgE and of monoclonal antibodies B9 and injects them
<EMI ID = 11.1>
of rabbit (in the form of fragments F (ab ')) coupled to latex were added sequentially
and automatically. After 25 minutes of incubation under continuous swirling at 37 [deg.] C, count the non-agglutinated particles. In the
if the IgE is measured without preincubation with B9, B9 is added at the same time as the diluent. For the correlation study, the IgE assay method described previously by Magnusson and Collaborators, 1981, was used.
In choosing an appropriate concentration of monoclonal antibodies B9 used as agglutinating substance, it is necessary to adjust the contradictory requirements in order to obtain optimal sensitivity and satisfactory precision over the required range. Optimal sensitivity requires
<EMI ID = 12.1>
in the most inclined part of the sigmoidal agglutination curve. Precision requires a wider range, which can only be obtained if agglutinate in the absence of an inhibitor binds a high proportion of latex coated with antibodies (Magnusson and Collaborateurs, 1983). Based on these criteria, a concentration of 20 µg / liter of B9 monoclonal antibodies was chosen,
which cause 75% agglutination. We note, at
this effect, which we will generally choose
a concentration of specific antibodies in the liquid sample making it possible to obtain, in the absence of an inhibiting substance, a degree of agglutination
at least 50% with anti-idiotypic antibodies.
The inhibition exerted by IgE on the agglutinative activity of monoclonal antibodies B9 vis-à-vis
<EMI ID = 13.1>
after different periods of incubation time between the IgE and the B9 monoclonal antibodies (see FIG. 4). As can be seen in this figure 4, the peak height, representing in fact the number of non-agglutinated latex particles in arbitrary units, increases with the increase in the concentration of IgE in the sample. That is to say, in fact the addition of an increasing dose of IgE proportionally prevents the agglutinative activity of the monoclonal antibodies B9 against the latex. The differences between the four curves show the influence of the preincubation time between the IgE and the B9 monoclonal antibodies on the sensitivity of the assay, the last curve, without preincubation period, giving the worst sensitivity. In fact, the sensitivity increases from 40 IU / ml to 6 IU / ml of IgE when the pre-incubation times are increased. <EMI ID = 14.1>
incubation gives more inclined (more steep) inhibition curves and, therefore, better precision.
The inhibition mechanism is believed to be
and agglutination obtained essentially comes from the interaction of B9 with IgE, which inhibits the agglutination of anti-B9 latex because the idiotopes of B9 are masked by the binding of IgE. However, given that IgE is a symmetrical molecule and that it contains all its epitopes in duplicate, it is thought that the simple formation of an antigen network, - antibody could also participate in the process of inhibition of agglutination between B9 antibodies and anti-B9 latex. This hypothesis was tested using latex coated with F (ab ') 2 fragments from
<EMI ID = 15.1>
would not have been made specific for C9 idiotopes, that is to say which would not have been purified.
It was found that this latex was agglutinated until
60% per 5 pg / liter of B9 monoclonal antibodies, this
which shows that the unabsorbed anti-C9 antiserum reacted with antigenic determinants which were not idiotopes. Considering that the preparation of B9 monoclonal antibodies was contaminated with
20% polyclonal IgG, the latex was able to participate in the agglutinative activity vis-à-vis the latex coated with anti-IgG (see above). Despite this IgGI contamination. without the activity of anti-IgE antibodies, the addition of 40 IU / ml of IgE inhibited agglutination by approximately 10%. We can therefore conclude that the simple formation of an antigen-antibody complex or network between the monoclonal antibodies and their antigen (IgE molecule) contributed somewhat to the inhibition process but that the masking of the idiotype ( B9) by the binding of the antigen (IgE molecule) certainly plays the major role.
As is known, the use of NRS-BSA-F (Collet-Cassart and Collaborateurs, 1983) as diluent for samples and controls prevents nonspecific agglutination of latex coated with F (ab ') 2 fragments of IgG from rabbit. To check for other possible interference factors, 20 sera containing low doses of IgE were tested.
<EMI ID = 16.1>
cubation between samples and B9 monoclonal antibodies. Under these conditions, the IgE in these samples was below the detection limit. The coefficient of variation of the concentration of non-agglutinated particles was 2%, which corresponded to 0.5 unit
peak height. This very low value of the coefficient of variation shows that there is very little interference, and that we are therefore in reliable conditions. On the other hand, two sera with high titers of rheumatoid factor; IgM and strongly reacting with rabbit IgG, i.e. anti-idiotypic antibodies, did not agglutinate the anti-B9 latex, which shows that the use of F (ab ') 2 fragments instead intact IgG on the surface of the latex particles effectively prevents agglutination caused by rheumatoid factor.
Analytical recovery
Ten patient sera containing 10 to
770 IU / ml of IgE were added to 2000 IU / ml of IgE and the IgE of these sera was assayed after a 10-fold dilution in NRS-BSA-F. The average analytical recovery of IgE was 95.8%
8.7% (standard deviation) with a coefficient of variation of 9.1%, which shows that there was practically no interference between the IgE and the diluent NRS-BSA-F.
Correlation.
IgE was assayed by the idiotypic inhibition assay of the invention in 41 sera, which had already been assayed by direct agglutination
(latex coated with anti-IgE agglutinating IgE). The preincubation time of sera containing IgE
with B9 in the inhibition assay was 30 minutes. The correlation between the IgE assay results obtained with the idiotypic inhibition test of the invention and the direct agglutination test is given in FIG. 6. As can be seen in this figure, the results are appreciably similar, being found practically gathered in the same area. The correlation coefficient between the two types of assay is r = 0.96 with a regression line y = 0.77 x + 97.4 (y = inhibition test; x = direct agglutination test). Example 2. Radioimmunoassay of a Allerqene
<EMI ID = 17.1>
The principle of this assay is shown in Figure 4 of the accompanying drawings. The wells of a polyvinyl chloride plate (Flow Laboratories) are covered with anti-D immunoglobulins. human pteronyssinus
(IgG antiserum) obtained from allergic patients.
The plates are incubated for this purpose for 6 hours at a temperature of 37 [deg.] C with 100 μl, per well, of a saline solution (9 g / liter) buffered to pH
9.2 with 50 mmol of glycine containing 10 ug / ml of IgG antiserum. After washing with buffered saline, serial dilutions of the allergen (TPD) in buffered saline (9 g / liter)
at pH 7.5 with 0.05M Tris and containing 0.1% fetal calf serum (TSA-FCS) are pipetted into the wells, and the plate is incubated for 2 hours at 37 [deg.] C. After four washes with saline (9 g / liter), anti-idiotypic rabbit IgG antibodies diluted in TSA-FCS at 2 mg / ml are added to each well in 50 μl portions and incubated for 8 hours at 37 [deg.] C. The plates are then washed four times with saline solution
(9 g / liter). The quantity of rabbit anti-idiotypic antibodies bound to the IgG antiserum is then measured by means of labeled antibodies directed against the anti-idiotypic rabbit IgG antibodies. Doors
<EMI ID = 18.1>
pipetted in wells incubated for 16 hours
at 21 [deg.] C and, after washing, the radioactivity is counted in a gamma radiation counter. As can be seen in FIG. 7, the inhibition of the binding of rabbit anti-idiotypic antibodies is proportional to the concentration of allergen. The results are calculated by the following formula:
_ sample cpm - control A cpm
<EMI ID = 19.1>
control A representing radioactivity
of a well without anti-idiotypic antibodies, that is to say the non-specific radioactivity originating from the binding of goat antibodies to the support, the control of the radioactivity of a well without
the allergen (DPT), that is to say in fact the maximum radioactivity and cpm signifying the number of shots
per minute.
Example 3.
Dose of thyroxine (T4) by particle counting (PACIA).
A rabbit antiserum is prepared against the idiotype of monoclonal anti-T4 antibodies
(Hybritec, Liège, Belgium), as described above
for anti-idiotypic antiserum directed against monoclonal anti-IgE antibodies. Then use the anti-idiotypic antiserum for the T4 assay
using either latex coated with anti-idiotypic antibodies, or latex coated with monoclonal antibodies.
In the first method (which scrupulously follows the details given for the specific determination of IgE; see example 1), the
latex of fragments F (ab ') 2 of the anti-idiotypic IgG, as described in the assay of IgE of Example 1. The agglutinating activity of the monoclonal antibodies is then measured. It can be seen that a concentration of
10 µg / liter of monoclonal antibodies, causing agglutination of 80%, gives the highest sensitivity in the inhibition test. The inhibition exerted by the solubilized T4 in saline solution
(9 gr / liter) on the agglutinating activity of the anti-T4 monoclonal antibodies is tested after different periods of incubation between T4 and the anti-T4 monoclonal antibodies. The sensibility
increases from 40 to 20 ng / liter by increasing the incubation period from 0 to 30 minutes, the sensitivity being defined by 3 peak height units. Incubation periods longer than 30
minutes do not improve sensitivity. The dynamic range extends from 20 to 320 ng / ml.
In the second method, the latex is coated with monoclonal anti-T4 antibodies and the anti-idiotypic antiserum is used as the agglutinating substance. The agglutinative activity of this antiserum diluted to 1/4000 is increased by the addition of a rheumatoid serum diluted to 1/50, as described in the patent of the United States of America n [deg.] 4,427,781. We have
chose this rheumatoid serum on the basis of its strong agglutinating activity vis-à-vis the latex coated with rabbit IgG and its lack of agglutinating activity vis-à-vis the latex coated with mouse IgG. The inhibition exerted by T4 solubilized in saline solution
(9 gr / liter) on the agglutination is tested after different incubation times between T4 and the anti-T4 latex before the addition of the rabbit anti-idiotype added with rheumatoid factor. The sensitivity increases from 25 ng / ml to 1 ng / ml when the pre-incubation times are increased from 0 to 30 minutes. Longer incubations do not improve sensitivity beyond 1 ng / ml. The dynamic range extends from 1 ng / ml to 100 ng / ml.
It should be understood that the present invention is in no way limited to the above embodiments and that many modifications can be made thereto without departing from the scope of this patent.
CLAIMS.
1. Method for immunoassay of a substance in a liquid sample, such as a
biological fluid, said substance comprising at
least an important determinant for identification
thereof, characterized in that it comprises reacting said liquid sample containing the substance to be assayed, antibodies directed against said substance, specific to said determinant and anti-idiotypic antibodies directed against specific antibodies and the determination of the quantity of the substance in the liquid sample by measuring the degree of inhibition which this substance causes on the binding reaction between the aforementioned specific and anti-idiotypic antibodies, the quantity of this substance being proportional to the degree of inhibition obtained on this binding reaction.