JP6456015B2 - Non-human mammal as a model animal for obstructive arteriosclerosis, a model animal for studying sputum, and a model animal for systemic amyloidosis - Google Patents
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Description
本発明は、閉塞性動脈硬化症モデル動物、抗肥満薬およびるい痩研究用モデル動物、及び全身性アミロイドーシスモデル動物として用いる非ヒト哺乳動物等に関する。 The present invention relates to a model animal for obstructive arteriosclerosis, a model animal for studying anti-obesity drugs and leprosy, a non-human mammal used as a systemic amyloidosis model animal, and the like.
心筋梗塞や脳梗塞といった動脈硬化を基盤として起こる血管疾患は、世界の死因のおよそ3割を占め、日本においてもほぼ同様の傾向を示している。動脈硬化の予防と治療は、日本の健康福祉における大きな課題の1つである。動脈が肥厚し硬化した状態を動脈硬化といい、これによって引き起こされる様々な病態を動脈硬化症という。動脈硬化には、アテローム性動脈硬化、細動脈硬化、中膜硬化などのタイプがあるが、注記のない場合はアテローム性動脈硬化を指すことが多い。アテローム性動脈硬化は、動脈の内側に粥状（アテローム性）の隆起（プラーク）が発生する状態である。アテローム性動脈硬化は、脂質異常症（従来の高脂血症）や糖尿病、高血圧、喫煙などの危険因子により生じると考えられ、最終的には動脈の血流が遮断されて、酸素や栄養が重要組織に到達できなくなる結果、脳梗塞や心筋梗塞などの原因となる。 Vascular diseases that occur based on arteriosclerosis such as myocardial infarction and cerebral infarction account for about 30% of the world's causes of death, and the trend is similar in Japan. Prevention and treatment of arteriosclerosis is one of the major challenges in Japanese health and welfare. A state in which the artery is thickened and hardened is called arteriosclerosis, and various pathologies caused by this are called arteriosclerosis. Atherosclerosis includes types such as atherosclerosis, arteriosclerosis, and medial sclerosis, but often refers to atherosclerosis unless otherwise noted. Atherosclerosis is a condition in which an atheromatous (atherosclerotic) bulge (plaque) occurs inside an artery. Atherosclerosis is thought to be caused by risk factors such as dyslipidemia (conventional hyperlipidemia), diabetes, hypertension, and smoking. Eventually, arterial blood flow is blocked, and oxygen and nutrition As a result of the inability to reach important tissues, it may cause cerebral infarction or myocardial infarction.
閉塞性動脈硬化症は、主に下肢の大血管が慢性に閉塞することによって、軽い場合には冷感、重症の場合には下肢の壊死にまで至ることがある病気であり、特に50歳以降の男性に多い。動脈硬化を発症するモデル動物としては、（１）Apo E*3 Leidenトランスジェニックマウス（TNO(The Netherlands Organization for Applied Scientific Research)社製。アテローム性動脈硬化症を発症する）、（２）Apo Eノックアウトマウス（MMRRC(Mutant Mouse Regional Resources Centers supported by NIH)社製）、（３）Ldlrノックアウトマウス（MMRRC社製）等があるが，高脂質血症を伴わず閉塞性動脈硬化症を発症するモデル動物は知られていなかった。
一方、慢性炎症は、動脈硬化症、アトピー性皮膚炎（Atopic dermatitis：AD）及び肥満など先進国で増加しつつある疾患に於いて潜在し治療の標的となり得る。基礎となる炎症は、異常な脂肪組織のリモデリングに関与することで、肥満と脂肪異栄養症（非特許文献３：先行技術文献については、末尾に纏めて示す。）の両方の病因に寄与する。炎症性サイトカインのIL-1を阻害する治療法に関する臨床試験が、アテローム性動脈硬化症（非特許文献４）とADに関する臨床試験で検討中である（http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01122914）。
Obstructive arteriosclerosis is a disease that can lead to cold sensation in mild cases and necrosis of the lower limbs in severe cases, mainly due to chronic occlusion of large blood vessels in the lower limbs, especially after the age of 50 Often found in men. As model animals that develop arteriosclerosis, (1) Apo E * 3 Leiden transgenic mice (manufactured by TNO (The Netherlands Organization for Applied Scientific Research), which develops atherosclerosis), (2) Apo E There are knockout mice (MMRRC (manufactured by Mutant Mouse Regional Resources Centers supported by NIH)), (3) Ldlr knockout mice (manufactured by MMRRC), etc., but models that develop obstructive arteriosclerosis without hyperlipidemia The animal was not known.
Chronic inflammation, on the other hand, is potentially a potential therapeutic target in diseases that are increasing in developed countries such as arteriosclerosis, Atopic dermatitis (AD) and obesity. The underlying inflammation contributes to the pathogenesis of both obesity and lipodystrophy (non-patent document 3: the prior art document is summarized at the end) by being involved in abnormal adipose tissue remodeling. To do. Clinical trials on treatments that inhibit the inflammatory cytokine IL-1 are under investigation in clinical trials related to atherosclerosis (Non-patent Document 4) and AD (http://clinicaltrials.gov/ct2/show / NCT01122914).
皮膚は、外部刺激に応答してケラチノサイト自身や皮膚に存在するランゲルハンス細胞などがサイトカインを産生しシグナル・カスケードを引き起こす免疫器官である。皮膚炎（アトピー性皮膚炎）を自然発症するモデル動物として、（１）外来性のヒト前駆型カスパーゼ1遺伝子とケラチン14プロモータとを含む組換えDNAを有し、持続的にIL-1とIL-18を放出しアトピー性皮膚炎を生じるトランスジェニックマウス（特許文献１、非特許文献１）、（２）ケラチン14プロモータの下流に副甲状腺ホルモン遺伝子リーダーシークエンス及び外来性のIL-18遺伝子を結合した組換えDNAを有し、生後1年以降に持続的にアトピー性皮膚炎を生じるマウス（特許文献２、非特許文献２）が知られている。
表皮角化細胞は、サイトカインカスケードを活性化し、炎症反応の引き金となるマスターサイトカインであるIL-1α、及びIL-1βの前駆体を提供する貯蔵槽となっている。IL-1αは皮膚炎と引っ掻きによって生産・分泌され、傷害を受けた表皮角化細胞に対して、CTL／NKプロテアーゼ・グランチームB（非特許文献５）及びカルシウム活性化プロテアーゼ・カルパイン（非特許文献６）を生じさせる。IL-1βは不活性な前駆体として貯蔵されており、カスパーゼ1／IL-1β変換酵素などの特異的な酵素によって活性化され、放出される。表皮角化細胞から放出されたIL-1は、局所的なメディエータとして作用する。しかし、重症型ADでは、ケラチノサイト由来のIL-1は血流によって循環され、潜在的に遠隔器官に影響を及ぼす高IL-1血症を誘導すると考えられている。このような全身性病態は、臨床的に大きな関連があるが、今のところ未解明のままである。
また、アミロイドーシスは、アミロイド蛋白が全身の臓器の細胞外に沈着する疾患であり、日本では特定疾患（難病）に指定されている。アミロイドーシスの病態については、不明な点が多く、モデル動物が望まれていた。
Skin is an immune organ that causes a signal cascade by producing cytokines in response to external stimuli such as keratinocytes themselves or Langerhans cells present in the skin. As a model animal that spontaneously develops dermatitis (atopic dermatitis), (1) It has recombinant DNA containing exogenous human precursor caspase 1 gene and keratin 14 promoter, and it is continuously IL-1 and IL Mice that release -18 and cause atopic dermatitis (Patent Document 1, Non-Patent Document 1), (2) A parathyroid hormone gene leader sequence and an exogenous IL-18 gene are linked downstream of the keratin 14 promoter A mouse (patent document 2, non-patent document 2) that has a recombinant DNA and causes atopic dermatitis continuously after the first year of life is known.
Epidermal keratinocytes act as reservoirs that activate the cytokine cascade and provide IL-1α, a master cytokine that triggers the inflammatory response, and precursors of IL-1β. IL-1α is produced and secreted by dermatitis and scratching, and against damaged keratinocytes, CTL / NK protease granteam B (Non-patent document 5) and calcium-activated protease calpain (non-patent document) Document 6). IL-1β is stored as an inactive precursor and is activated and released by specific enzymes such as caspase 1 / IL-1β converting enzyme. IL-1 released from epidermal keratinocytes acts as a local mediator. However, in severe AD, keratinocyte-derived IL-1 is circulated by the bloodstream and is thought to induce hyperIL-1emia, potentially affecting distant organs. Such systemic pathologies have significant clinical relevance, but remain unclear for now.
Amyloidosis is a disease in which amyloid protein is deposited extracellularly in organs throughout the body, and is designated as a specific disease (intractable disease) in Japan. Regarding the pathology of amyloidosis, there are many unclear points, and a model animal has been desired.
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、閉塞性動脈硬化症モデル動物、抗肥満モデル動物、及び全身性アミロイドーシスモデル動物などを提供することである。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide an obstructive arteriosclerosis model animal, an anti-obesity model animal, a systemic amyloidosis model animal, and the like.
本発明者は、鋭意検討の結果、炎症性サイトカインの一つであるIL-1が持続的に体内（特に、皮膚内）に存在することにより、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を生じさせることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記課題を解決するための第一の発明に係る非ヒト哺乳動物は、内因性IL-1α及び／又はIL-1βを誘導することにより、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を生じさせることを特徴とする。
本発明者は、皮膚炎等により皮膚が損傷すると発生する現象であって、IL-1α、IL-1βが浸み出す形態で誘発され、これらが白血球を活性化させることで、皮膚炎が増悪する。これにより高用量IL-1投与等と異なり、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）を短期間で衰弱させることなく、長期間の過剰IL-1α、IL-1βを原因とする疾患、例えば動脈硬化症、るい痩、全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を生じさせ、疾患予防、治療用物質の検証に耐える実験用動物を効率よく育成できる結果となった。
As a result of intensive studies, the present inventor has confirmed that IL-1 which is one of inflammatory cytokines is continuously present in the body (particularly in the skin), thereby causing obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic The inventors have found that at least one disease in a group of diseases consisting of amyloidosis is caused, and basically completed the present invention.
Thus, the non-human mammal according to the first invention for solving the above-mentioned problems induces endogenous IL-1α and / or IL-1β, thereby causing obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic It is characterized by causing at least one disease of a disease group consisting of amyloidosis.
The present inventor is a phenomenon that occurs when skin is damaged by dermatitis or the like, and is induced in a form in which IL-1α and IL-1β ooze out, and these activate white blood cells, thereby exacerbating dermatitis. To do. As a result, unlike high-dose IL-1 administration, diseases caused by long-term excess IL-1α and IL-1β without degrading non-human mammals (eg, mice) in a short period of time, such as arteriosclerosis As a result, at least one disease of the disease group consisting of symptom, leprosy, and systemic amyloidosis was produced, and experimental animals that can withstand disease prevention and verification of therapeutic substances could be efficiently bred.
非ヒト哺乳動物の育成期間は皮膚炎を発症するのに生後約２カ月、動脈硬化を発症するのに３カ月程度は要する。すなわち対象疾患の予防、治療用物質の検証に耐える実験用動物を育成する期間は、マウスの場合で少なくとも２カ月、好ましくは３カ月の期間、ＣＴスキャンや体重測定等の予め定めた状態観察と、温度湿度、食餌など一定の環境で育成することが望ましい。マウス以外の場合では、皮膚炎を観察することにより、その育成期間を決定し、少なくとも、IL-1α、IL-1βが浸み出す形態で誘発される期間を観察して、育成期間を決めることが望ましい。
本発明の要旨の一つは、皮膚炎と動脈硬化他の疾患の関係、すなわち皮膚炎という形でIL-１が長期間誘発されることで、長期間に渡ってIL-1α、IL-1βが血管を含む内臓に影響を与え、種々の疾患を発症させる実験動物を育成することを可能にしたことである。
The growing period of a non-human mammal takes about 2 months to develop dermatitis and about 3 months to develop arteriosclerosis. In other words, the period for breeding laboratory animals that can withstand the prevention of target diseases and the verification of therapeutic substances is at least 2 months, preferably 3 months, in the case of mice, with predetermined state observations such as CT scans and body weight measurements. It is desirable to grow in a certain environment such as temperature, humidity and food. In cases other than mice, determine the growth period by observing dermatitis, and at least observe the period induced by IL-1α and IL-1β leaching, and determine the growth period Is desirable.
One of the gist of the present invention is that IL-1 is induced for a long period of time in the form of dermatitis and arteriosclerosis and other diseases, that is, dermatitis. Has made it possible to nurture experimental animals that affect internal organs including blood vessels and cause various diseases.
このように、皮膚はIL-1前駆体を多く貯蔵するリザーバであり、通常の状態ではIL-1前駆体は生物的活性を持たない。しかし、皮膚損傷が起こることによって、IL-1αにおいては表皮角化細胞中のIL-1αが放出され、IL-1βにおいては前駆体として表皮角化細胞の貯蔵されていたものが、浸潤した白血球、あるいは導入されたカスパーゼ１遺伝子などにより活性型IL-1βに誘導され皮膚より放出され、結果、血中IL-1α、IL-1βの増加に至り閉塞性動脈硬化等の疾患を生じさせる。
上記発明において、非ヒト哺乳動物は、（１）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に前駆型カスパーゼ１遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、又は（２）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に副甲状腺ホルモン遺伝子リーダーシークエンス及びIL-18遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、血中に持続的に成熟型IL-18を分泌し、持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物であることが好ましい。
Thus, the skin is a reservoir that stores a large amount of IL-1 precursor, and under normal conditions, the IL-1 precursor has no biological activity. However, when skin damage occurs, IL-1α is released in the keratinocytes in IL-1α, and the stored keratinocytes as precursors in IL-1β are infiltrated leukocytes. Alternatively, activated IL-1β is induced by the introduced caspase 1 gene and released from the skin, resulting in an increase in blood IL-1α and IL-1β, resulting in diseases such as obstructive arteriosclerosis.
In the above invention, the non-human mammal has (1) a transgenic non-human mammal that has a recombinant DNA linked with a precursor caspase 1 gene downstream of a gene promoter that is specifically expressed in the skin, and continuously causes dermatitis. Animal, or (2) Recombinant DNA linked to the parathyroid hormone gene leader sequence and IL-18 gene downstream of the gene promoter that is specifically expressed in the skin, and secreted mature IL-18 continuously in the blood However, it is preferably a transgenic non-human mammal that causes dermatitis continuously.
また、第二の発明に係る実験用非ヒト哺乳動物の作製方法は、非ヒト哺乳動物に対して、IL-1α及び／又はIL-1βを投与することにより、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を生じさせることを特徴とする。
第三の発明に係る閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患の予防又は治療用物質のスクリーニング方法は、上記いずれかに記載の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患の改善効果を検定することを特徴とする。
第四の発明に係る抗IL-1抗体は、閉塞性動脈硬化、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患の予防又は治療用であることを特徴とする。
また、別の発明に係る実験用非ヒト哺乳動物は、内因性IL-1α及び／又はIL-1βを誘導する非ヒト哺乳動物を、生後一定期間育成し、皮膚炎発症を観察し、皮膚炎発症後にCTスキャン観察、体重観察、血圧観察、体外における体脂肪培養観察、血中アミロイドAタンパク質濃度観察の少なくともいずれか一つの観察結果を用いて、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患の実験用として選別されたことを特徴とする。このとき、実験用非ヒト哺乳動物の育成期間中、定期的に外的刺激を与えて育成された事が好ましい。また、外的刺激がテープストリーピングまたは、薬品塗布のうちの少なくともいずれか一つであることが好ましい。
In addition, the method for producing an experimental non-human mammal according to the second invention comprises administering IL-1α and / or IL-1β to a non-human mammal, thereby causing obstructive arteriosclerosis, ulcers. Or at least one disease of a disease group consisting of systemic amyloidosis.
The method for screening a substance for prevention or treatment of at least one disease of the disease group consisting of obstructive arteriosclerosis, leprosy, or systemic amyloidosis according to the third invention is any of the above non-human mammals A test substance is administered to an animal, and an improvement effect of at least one disease selected from a disease group consisting of obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis is assayed.
The anti-IL-1 antibody according to the fourth invention is characterized in that it is used for the prevention or treatment of at least one disease selected from the group consisting of obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis.
Further, a non-human mammal for experiment according to another invention is a non-human mammal that induces endogenous IL-1α and / or IL-1β, which is bred for a certain period after birth, observed for onset of dermatitis, and dermatitis At least one of CT scan observation, body weight observation, blood pressure observation, in vitro body fat culture observation, blood amyloid A protein concentration observation after onset, obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic It is characterized by being selected for experimentation of at least one disease in the disease group consisting of amyloidosis. At this time, it is preferable that the non-human mammal for experimentation was nurtured by applying external stimulus periodically. The external stimulus is preferably at least one of tape striping and chemical application.
また、別の発明に係る実験用非ヒト哺乳動物の育成方法は、内因性IL-1α及び／又はIL-1βを誘導する非ヒト哺乳動物を、生後一定期間育成し、皮膚炎発症を観察し、皮膚炎発症後にCTスキャン観察、体重観察、血圧観察、体外における体脂肪培養観察、又は血中アミロイドAタンパク質濃度観察からなる群から選択される少なくともいずれか一つの観察結果により、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を発症した被検動物を選別することが好ましい。このとき、実験用非ヒト哺乳動物の育成期間中、定期的に外的刺激を与えて育成する事が好ましい。また、外的刺激がテープストリーピングまたは、薬品塗布のうちの少なくともいずれか一つであることが好ましい。
「IL-1」（インターロイキン-1：Interleukin-1)は、サイトカインと称される生理活性物質の一種であり、最初に同定されたインターロイキン分子である。IL-1は、炎症反応に深く関与することから、炎症性サイトカインに含まれる。現在のところ、IL-1には、IL-1αとIL-1βの2種類が同定されており、これら2種類の分子が同一のインターロイキン-1受容体に結合して生理作用を発現することが分かっている。本発明において、IL-1と言うときは、IL-1α若しくはIL-1βのいずれか、又は両方を意味する。
In addition, the method for nurturing a laboratory non-human mammal according to another invention is a method of cultivating a non-human mammal that induces endogenous IL-1α and / or IL-1β for a certain period after birth and observes the onset of dermatitis. Occlusive arteriosclerosis according to at least one observation result selected from the group consisting of CT scan observation, body weight observation, blood pressure observation, in vitro body fat culture observation, or blood amyloid A protein concentration observation after the onset of dermatitis It is preferable to select a test animal that has developed at least one disease out of a disease group consisting of symptom, leprosy, or systemic amyloidosis. At this time, it is preferable to periodically give an external stimulus to the animal during the period of raising the experimental non-human mammal. The external stimulus is preferably at least one of tape striping and chemical application.
“IL-1” (Interleukin-1) is a type of physiologically active substance called a cytokine and is the first identified interleukin molecule. IL-1 is included in inflammatory cytokines because it is deeply involved in inflammatory responses. At present, two types of IL-1α and IL-1β have been identified for IL-1, and these two types of molecules bind to the same interleukin-1 receptor and express physiological effects. I know. In the present invention, IL-1 means either IL-1α or IL-1β, or both.
「内因性IL-1α及び／又はIL-1βを誘導する」とは、IL-1を誘導する化学物質を投与する他に、IL-1そのものを発現させる遺伝子を導入したトランスジェニック動物、IL-1の分解を阻害することで結果的にIL-1を誘導する分子を発現させる遺伝子を導入したトランスジェニック動物、IL-1前駆体を分解して成熟体を誘導することでIL-1を誘導させる分子を導入したトランスジェニック動物、IL-1とは異なる炎症性インターロイキン（例えば、IL-18）を長期間に渡って発現することでIL-1を誘導する遺伝子を導入したトランスジェニック動物などが含まれる。
「閉塞性動脈硬化症」とは、主に下肢の大血管が慢性に閉塞することによって、軽い場合には冷感、重症の場合には下肢の壊死にまで至ることがある病気を意味し、特に50歳以降の男性に多いことが知られている。
「るい痩」とは、脂肪組織が病的に減少した症候を意味し、痩せの程度が著しい状態をいう。病的であることを強調するために、るい痩症、症候性やせということがある。脂肪組織が過剰に蓄積した肥満症、又は症候性肥満と反対にある概念である。
“Inducing endogenous IL-1α and / or IL-1β” refers to a transgenic animal into which a gene that expresses IL-1 itself is introduced in addition to administering a chemical substance that induces IL-1, IL- Transgenic animals introduced with a gene that expresses a molecule that induces IL-1 as a result of inhibiting degradation of 1, IL-1 is induced by degrading IL-1 precursor and inducing mature body Transgenic animals into which molecules to be introduced are introduced, transgenic animals into which genes that induce IL-1 by expressing inflammatory interleukins different from IL-1 (eg IL-18) over a long period of time, etc. Is included.
`` Occlusive arteriosclerosis '' means a disease that can lead to cold sensation in mild cases and necrosis of lower limbs in severe cases, mainly due to chronic occlusion of large blood vessels in the lower limbs, In particular, it is known to be more common among men after the age of 50.
“Ruikan” means a symptom in which adipose tissue is pathologically reduced, and refers to a state in which the degree of leanness is significant. To emphasize morbidity, there are cases of leprosy and symptomatic skinny. It is a concept opposite to obesity with excessive accumulation of adipose tissue or symptomatic obesity.
「全身性アミロイドーシス」とは、難溶性のアミロイド蛋白が全身に沈着する予後不良の疾患を意味する。アミロイドは、マクロファージの食作用にも抵抗性を示すため、沈着が減少することなく増加していき、最終的に組織を破壊することで症状が出る。
「皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータ」としては、ケラチン1、ケラチン5、ケラチン10、ケラチン14などの遺伝子プロモータを利用できる。このうち、ケラチン14プロモータを用いることが好ましい。
上記「（１）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に前駆型カスパーゼ１遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物」としては、例えば、外来性のヒト前駆型カスパーゼ1遺伝子とケラチン14プロモータとを含む組み換えDNAを有し、持続的にアトピー性皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物であるトランスジェニックマウス（特許文献１に開示のもの）を用いることができる。このトランスジェニックマウスでは、少なくとも３ヶ月の飼育により、皮膚炎を起こし、閉塞性動脈硬化等の疾患を生じる。
また、「（２）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に副甲状腺ホルモン遺伝子リーダーシークエンス及びIL-18遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、血中に持続的に成熟型IL-18を分泌し、生後1年以降に持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物」としては、例えば、ケラチン14プロモータの下流に副甲状腺ホルモン遺伝子リーダーシークエンス及び外来性のIL-18遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、血中に持続的に成熟型IL-18を分泌し、生後1年以降に持続的にアトピー性皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物であるトランスジェニックマウス（特許文献２に開示のもの）を用いることができる。
「テープストリーピング」とは、皮膚にテープを貼り、はがす行為を一定回数定期的に実施する刺激を意味する。また、「薬品塗布」に用いられる薬品としては、直接に実験用動物の生命を脅かすことなく、皮膚炎症を起こすものであればよい。このような薬品としては、特に限定されないが、例えば、界面活性剤（SDSなど）、クロトンオイル、漆、生体毒（昆虫、海洋生物などから得られるものなど）などが例示される。
“Systemic amyloidosis” means a disease with poor prognosis in which poorly soluble amyloid protein is deposited throughout the body. Since amyloid is resistant to macrophage phagocytosis, deposition increases without a decrease, and symptoms are eventually caused by tissue destruction.
As the “skin-specific gene promoter”, gene promoters such as keratin 1, keratin 5, keratin 10, and keratin 14 can be used. Of these, the keratin 14 promoter is preferably used.
Examples of the “(1) transgenic non-human mammal having a recombinant DNA having a precursor caspase 1 gene linked downstream of a gene promoter that is specifically expressed in the skin and continuously producing dermatitis” include, for example, foreign Transgenic mouse, which is a transgenic non-human mammal that has a recombinant DNA containing a sexual human precursor caspase 1 gene and a keratin 14 promoter and that continuously causes atopic dermatitis (disclosed in Patent Document 1) Can be used. In this transgenic mouse, breeding for at least 3 months causes dermatitis and causes diseases such as obstructive arteriosclerosis.
In addition, “(2) Has a recombinant DNA linked to the parathyroid hormone gene leader sequence and IL-18 gene downstream of the gene promoter that is expressed specifically in the skin, and secretes mature IL-18 continuously in the blood. As a `` transgenic non-human mammal that causes dermatitis continuously after the first year of life '', for example, a recombinant in which a parathyroid hormone gene leader sequence and an exogenous IL-18 gene are linked downstream of the keratin 14 promoter. Transgenic mice that have DNA, secrete mature IL-18 continuously in the blood, and produce atopic dermatitis continuously after the first year of life (Patent Document 2 describes Disclosed) can be used.
“Tape striping” means a stimulus in which a tape is applied to the skin and peeled off periodically. In addition, the chemicals used for “chemical application” may be those that cause skin inflammation without directly threatening the life of the experimental animal. Examples of such chemicals include, but are not limited to, surfactants (such as SDS), croton oil, lacquer, biotoxins (such as those obtained from insects and marine organisms), and the like.
本発明によれば、閉塞性動脈硬化症モデル動物、抗肥満モデル動物、及び全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患モデル動物などを提供できる。これらの動物は、IL-1の増加によって特異的な症状を発症することが分かったので、この作用に対抗する作用を示す物質を検索することで、上記疾患の予防又は治療用物質をスクリーニングできる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, at least 1 disease model animal etc. of the disease group which consists of an obstructive arteriosclerosis model animal, an anti-obesity model animal, and systemic amyloidosis can be provided. Since these animals were found to develop specific symptoms due to an increase in IL-1, it is possible to screen for substances for the prevention or treatment of the above diseases by searching for substances that show an action against this action. .
次に、本発明の実施形態について、マウスを用いて実験、観察した図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなくマウス以外の非ヒト哺乳動物を含む様々な形態で実施できる。
図１から図２１は、本願発明実施およびその検証に用いたものであり、下記にまとめて、その構成、効果を説明する。
本出願中の各図において、正常な比較対照群をNormal（またはNorと表記）、ケラチノサイトIL-1α、IL-1β及びIL-18を全身に大量に供給することで皮膚炎のADを発症する二種類のモデルマウス、すなわちケラチン14プロモーターにより発現制御されるカスパーゼ1トランスジェニックマウスをKCASP1Tg（またはKCASPと表記）と称する。さらにケラチン14プロモーターにより発現制御されるマウスIL-18のトランスジェニック・マウスをKIL-18Tgとし、その中でも皮膚炎を伴うKIL-18TgをKIL-18Tg(+)（またはIL-18Tg(+)と表記）と、皮膚炎を伴わないKIL-18TgをKIL-18Tg(-)（またはIL-18Tg(-)と表記）」と示した。
図１は対照群(Normal)と、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)及びKIL-18Tg(+)の各群における体重（BW)と皮膚炎の状態（dermatitis）を示すグラフである。(A)は、対照群、KCASP1Tg及びKIL-18Tg(-)の三群についてのグラフ、(B)は、対照群とKIL-18Tg(+)の二群についてのグラフである。
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to charts that have been experimented and observed using a mouse. However, the technical scope of the present invention is not limited to these embodiments, and the gist of the invention is described below. It can be implemented in various forms including non-human mammals other than mice without changing the above.
FIG. 1 to FIG. 21 are used for carrying out the invention of the present application and its verification, and the configuration and effects thereof will be described collectively below.
In each figure in this application, normal control group is expressed as Normal (or Nor), and keratinocytes IL-1α, IL-1β and IL-18 are supplied in large quantities throughout the body to develop AD of dermatitis Two types of model mice, namely caspase 1 transgenic mice whose expression is controlled by the keratin 14 promoter, are referred to as KCASP1Tg (or KCASP). Furthermore, the transgenic mouse of mouse IL-18 whose expression is controlled by the keratin 14 promoter is called KIL-18Tg, and KIL-18Tg with dermatitis is expressed as KIL-18Tg (+) (or IL-18Tg (+)) ) And KIL-18Tg without dermatitis was expressed as KIL-18Tg (-) (or expressed as IL-18Tg (-)).
FIG. 1 is a graph showing body weight (BW) and dermatitis state in a control group (Normal), and each group of KCASP1Tg, KIL-18Tg (−) and KIL-18Tg (+). (A) is a graph for the three groups of the control group, KCASP1Tg and KIL-18Tg (−), and (B) is a graph for the two groups of the control group and KIL-18Tg (+).
体重測定は、2週間毎に行った。KCASP1Tgでは、びらん性皮膚炎は8週齢において眼窩周囲病変から始まり、徐々に顔全体と胴部に広がり、5ヶ月齢程度でプラトーに達した。KIL-18Tgでは、生後6月齢までの観察期間内では、びらん性皮膚炎を発症しなかった。体重減少は、KCASP1Tgでは10週齢で始まったが、KIL-18Tgでは認められなかった。生後1年を経過するとKIL-18Tgでも、びらん性皮膚炎が発症し、体重減少が認められた。図中、「*」はp＜0.05で５％未満の危険率を示す。同様に「**」はp＜0.001、「***」はp＜0.0001にて、それぞれ正常群に比べて有意差が認められたことを示す。このように、１週毎等の定期的な体重測定による観察は、実験動物の選別に有用なファクターとなる。
図２は、CTスキャンによって、内臓脂肪の様子を調べた写真図である。左より、対照群(Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)及びKIL-18Tg(+)の様子を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、正常対照マウス又はKIL-18Tg(-)に比べ、内臓脂肪が劇的に減少することが分かった。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、皮下脂肪も減少した。このように、１週毎等の定期的なCTスキャンによって、内臓脂肪の様子を調べることによる観察は、実験動物の選別に有用なファクターとなる。
図３は、対照群(Normal)、KIL-18Tg(-)及びKCASP1Tgにおける体脂肪率を測定した結果を示すグラフである。6ヶ月齢の3群について、体脂肪率を比較したところ、他の2群に比べると、KCASP1Tgでは、有意に減少することがわかった。
Body weight was measured every 2 weeks. In KCASP1Tg, erosive dermatitis started from a periorbital lesion at 8 weeks of age and gradually spread to the entire face and torso, reaching a plateau at about 5 months of age. KIL-18Tg did not develop erosive dermatitis within the observation period up to 6 months of age. Weight loss began at 10 weeks of age with KCASP1Tg but not with KIL-18Tg. One year after birth, KIL-18Tg also developed erosive dermatitis and weight loss. In the figure, “*” indicates a risk rate of less than 5% at p <0.05. Similarly, “**” indicates p <0.001 and “***” indicates p <0.0001, indicating that a significant difference was observed compared to the normal group. As described above, observation by periodic weight measurement such as weekly becomes a useful factor for selection of experimental animals.
FIG. 2 is a photograph showing the state of visceral fat examined by CT scan. From the left, the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) and KIL-18Tg (+) are shown. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), it was found that visceral fat was dramatically reduced compared to normal control mice or KIL-18Tg (-). KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) also reduced subcutaneous fat. Thus, observation by examining the state of visceral fat by a regular CT scan every week or the like is a useful factor for selecting experimental animals.
FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of body fat percentage in the control group (Normal), KIL-18Tg (−), and KCASP1Tg. A comparison of body fat percentage in 3 groups at 6 months of age revealed that KCASP1Tg significantly decreased compared to the other 2 groups.
図４は、対照群（Nor）、KCASP1Tg（KCASP）、KIL-18Tg(-)（IL18(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL18(+)）の各群において、IL-1α、IL-1β及びIL-18濃度を測定した結果を示すグラフである。KCASP1Tg及びKIL-18Tg(+)では、血中IL-1α及びIL-1β濃度は増加した。血中IL-18濃度は、KCASP1Tgでは増加し、KIL-18Tgでは、若年齢に比べると高齢では増加した。
図５は、対照群(Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL18(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL18(+)）の各群において、腹部脂肪細胞をH＆E染色したときの顕微鏡写真図である。対照群とKIL-18Tg(-)では、腹部脂肪細胞は大きく、ふっくらした形状であった。一方、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、対照群とKIL-18Tg(-)との比較において、脂肪細胞は小さく、丸かった。単核細胞の浸潤数は4群間で同様であった。
このように、定期的な体脂肪率を測定、腹部脂肪細胞をH＆E染色したときの顕微鏡写真観察によっても、実験用に適するかどうかのマウスの育成選別を有効に行うことができる。これらは、るい痩は外観で判断できるが、閉塞性動脈硬化症、又は全身性アミロイドーシスを直接観察することなく、実験用動物を効率的に育成、精度よく対象疾病の予防又は治療用物質の研究に使える動物を提供できることとなる。
図６は、KCASP1Tgに対して、無処置（KCASP1Tg）、抗IL-1α中和抗体（anti-IL-1α）、抗IL-1β中和抗体（anti-IL-1β）、及び抗IL-1α中和抗体と抗IL-1β中和抗体（anti-IL-1α+β）を4週齢から24週齢に渡って腹腔内投与したときの体重変化を示すグラフである。体重減少は、抗IL-1α中和抗体又は抗IL-1β中和抗体の投与によって改善され、両抗体を投与することによって、相加的な効果が認められた。
FIG. 4 shows IL-1α, IL in the control group (Nor), KCASP1Tg (KCASP), KIL-18Tg (−) (IL18 (−)) and KIL-18Tg (+) (IL18 (+)). It is a graph which shows the result of having measured -1 (beta) and IL-18 density | concentration. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), blood IL-1α and IL-1β concentrations increased. Blood IL-18 levels increased with KCASP1Tg, and with KIL-18Tg increased with age compared to younger age.
FIG. 5 shows abdominal fat cells stained with H & E in each of the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (−) (IL18 (−)) and KIL-18Tg (+) (IL18 (+)). FIG. In the control group and KIL-18Tg (-), abdominal fat cells were large and plump. On the other hand, in KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), adipocytes were small and round in comparison with the control group and KIL-18Tg (-). The number of mononuclear cells infiltrated was similar among the 4 groups.
As described above, it is possible to effectively perform the breeding selection of the mouse to determine whether it is suitable for the experiment also by periodically measuring the body fat percentage and observing the microphotograph when the abdominal fat cells are stained with H & E. Although these can be judged by visual appearance, the laboratory animals can be efficiently cultivated without directly observing obstructive arteriosclerosis or systemic amyloidosis, and research on substances for the prevention or treatment of target diseases can be performed with high accuracy. It will be possible to provide animals that can be used.
FIG. 6 shows no treatment (KCASP1Tg), anti-IL-1α neutralizing antibody (anti-IL-1α), anti-IL-1β neutralizing antibody (anti-IL-1β), and anti-IL-1α against KCASP1Tg. It is a graph which shows a body weight change when a neutralizing antibody and an anti- IL-1β neutralizing antibody (anti-IL-1α + β) are intraperitoneally administered from 4 weeks to 24 weeks of age. Weight loss was improved by administration of anti-IL-1α neutralizing antibody or anti-IL-1β neutralizing antibody, and an additive effect was observed by administering both antibodies.
図７は、野生型マウスに対して、対照群（PBS：Normal）、組換えIL-1α（rIL-1α）、又は組換えIL-1β（rIL-1β）を投与したときの体重変化を示すグラフである。組換えIL-1α又は組換えIL-1βを10週間に渡って、野生型マウスに腹腔内投与したところ、PBSを投与した対照群に比べて、体重減少を引き起こした。さらに、飼育中のKCASP1Tg及びKIL-18Tg(+)に、外的刺激を与えることにより、対象疾病発生時期を早めるなどの制御をすることが可能である。外的刺激としては、実験用マウスの皮膚にテープを貼る、はがす行為を一定回数定期的に実施するテープストリーピングで刺激を与えることや、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と言った界面活性剤などの化学物質を週に一、二度程度、実験用マウスの皮膚に塗布するなどの行為を繰り返し、皮膚の組織をある程度破壊することで皮膚病の発症を早める事が出来る。塗布する薬剤としては、実験用動物の生命を脅かすことなく、皮膚炎症を起こすものであれば良く、化学物質以外でも一次刺激物質であるクロトンオイル、接触性皮膚炎を生じさせる漆などの植物由来の物質や、昆虫、海洋生物の生体毒などを薄めて使用することも可能である。その外的刺激の結果、内因性IL-1α及び／又はIL-1βの分泌の時期が早まり、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスを発症する迄の期間も早まる事になる。
図８は、培養脂肪細胞に各種の皮膚上清を添加して培養し、14日目にオイルレッドOで染色したときの様子を示す顕微鏡写真図である。図中の記号は、それぞれ、添加なし（Medium）、正常マウス皮膚上清（Normal skin）、KCASP1Tg皮膚上清（KCASP1Tg）、KCASP1Tg皮膚上清を抗IL-1α中和抗体で前処理（KCASP1+anti-IL-1α）、KCASP1Tg皮膚上清を抗IL-1β中和抗体で前処理（KCASP1+anti-IL-1β）、KCASP1Tg皮膚上清を抗IL-1α中和抗体及び抗IL-1β中和抗体で前処理（KCASP1+anti-IL-1α+β）を意味する。
通常の培地で培養したマウス脂肪細胞は、培養14日目には、豊富な脂肪滴が含まれていた。正常皮膚の培養上清を補充すると、オイルレッドOで染色された脂質を含むふっくらした脂肪細胞が減少を示した。この脂肪細胞は、KCASP1Tg 皮膚培養上清によって消滅した。抗IL-1α中和抗体又は抗IL-1β中和抗体でKCASP1Tg皮膚上清を前処理すると、脂肪細胞の抑制効果が改善され、両中和抗体で前処理すると、抑制効果は殆ど見られなかった。
FIG. 7 shows changes in body weight when a control group (PBS: Normal), recombinant IL-1α (rIL-1α), or recombinant IL-1β (rIL-1β) is administered to wild-type mice. It is a graph. When recombinant IL-1α or recombinant IL-1β was administered intraperitoneally to wild-type mice for 10 weeks, it caused weight loss compared to the control group administered with PBS. Furthermore, by giving an external stimulus to KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) during breeding, it is possible to control the target disease onset time. As external stimuli, a tape is applied to the skin of a laboratory mouse, the tape striping is performed regularly for a certain number of times, and a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) is used. By repeatedly applying chemical substances to the skin of experimental mice once or twice a week, the onset of skin diseases can be accelerated by destroying the skin tissue to some extent. The drug to be applied may be anything that causes skin irritation without threatening the life of experimental animals. Other than chemical substances, croton oil, which is a primary irritant, and lacquer that produces contact dermatitis It is also possible to dilute these substances, insects, marine organisms, etc. As a result of the external stimulation, the timing of secretion of endogenous IL-1α and / or IL-1β is advanced, and the period until the onset of obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis is also accelerated.
FIG. 8 is a photomicrograph showing the appearance when various skin supernatants are added to cultured adipocytes and cultured, and stained with oil red O on the 14th day. Symbols in the figure are: No addition (Medium), Normal mouse skin supernatant (Normal skin), KCASP1Tg skin supernatant (KCASP1Tg), KCASP1Tg skin supernatant with anti-IL-1α neutralizing antibody (KCASP1 + anti-IL-1α), KCASP1Tg skin supernatant pretreated with anti-IL-1β neutralizing antibody (KCASP1 + anti-IL-1β), KCASP1Tg skin supernatant in anti-IL-1α neutralizing antibody and anti-IL-1β It means pretreatment with Japanese antibody (KCASP1 + anti-IL-1α + β).
Mouse adipocytes cultured in a normal medium contained abundant fat droplets on the 14th day of culture. When supplemented with normal skin culture supernatant, plump adipocytes containing lipids stained with oil red O showed a decrease. The adipocytes disappeared by the KCASP1Tg skin culture supernatant. Pretreatment of KCASP1Tg skin supernatant with anti-IL-1α neutralizing antibody or anti-IL-1β neutralizing antibody improves the adipocyte inhibitory effect. When pretreated with both neutralizing antibodies, almost no inhibitory effect is seen. It was.
図９は、大動脈切片をヘマトキシリン・エオシン（HE）染色（上段）、又はエラスチカ・ワンギーソン（Elastica van Gieson stain：EVG）染色（中段及び下段）したときの結果を示す顕微鏡写真図である。左列より、対照群(Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）の様子をそれぞれ示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、それぞれ6ヶ月齢及び18ヶ月齢のいずれにおいても、狭窄が確認された。EVG染色による大動脈周囲病変と弾性繊維については、4群間において有意差は見られなかった。
図１０は、造影CTスキャンによる結果を示す写真図である。左より、対照群(Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、正常対照群とKIL-18Tg(-)に比べ、大動脈狭窄が認められた。
図１１は、大動脈径を比較するグラフである。左より、対照群（Nor)、KCASP1Tg（KCASP）、KIL-18Tg(-)（IL-18(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18(+)）のデータを示す（各群n=6）。大動脈径は、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)で有意に減少した。
図１２は、CTイメージを三次元グラフ化したときの写真図である。左より、対照群(Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、明らかな大動脈狭窄が認められた。
図１３は、心臓重量を比較するグラフである。左より、対照群（Nor)、KCASP1Tg（KCASP）、KIL-18Tg(-)（IL-18(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18(+)）のデータを示す（各群n=6）。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、有意な心臓重量の増加が認められた。
FIG. 9 is a photomicrograph showing the results when aortic sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) (upper) or elastica van Gieson stain (EVG) (middle and lower). From the left column, the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), stenosis was confirmed at 6 months and 18 months, respectively. There were no significant differences between the four groups in the peri-aortic lesions and elastic fibers by EVG staining.
FIG. 10 is a photograph showing the result of contrast CT scan. From the left, the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), aortic stenosis was observed compared to the normal control group and KIL-18Tg (-).
FIG. 11 is a graph comparing aortic diameters. From left, control group (Nor), KCASP1Tg (KCASP), KIL-18Tg (-) (IL-18 (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18 (+)) data are shown (each group) n = 6). Aortic diameter was significantly decreased with KCASP1Tg and KIL-18Tg (+).
FIG. 12 is a photograph when a CT image is converted into a three-dimensional graph. From the left, the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. Clear aortic stenosis was observed with KCASP1Tg and KIL-18Tg (+).
FIG. 13 is a graph comparing heart weight. From left, control group (Nor), KCASP1Tg (KCASP), KIL-18Tg (-) (IL-18 (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18 (+)) data are shown (each group) n = 6). KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) showed a significant increase in heart weight.
図１４は、大動脈リングの張力を比較するグラフである。対照群（Normal）及びKCASP1Tgから得られた1mmリングにおいて、最大張力が確認された。大動脈リングのスナップポイント強度は、対照群に比べ、KCASP1Tgでは有意に低かった。
図１５は、マウス尾部で拡張期血圧（un）及び収縮期血圧（sys）を測定した結果を示すグラフである。左より、対照群（Nor)、KCASP1Tg（KCASP）、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）のデータを示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、尾部で測定した拡張期及び収縮期血圧は、いずれも低下した。
図１６は、サーモグラフィによる測定結果を示す写真図である。左より、対照群（Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、下肢との尾部において、末梢循環の悪化を示した。
図１７は、肝臓（Liver）、腎臓（Kidney）及び脾臓（Spleen）を比較する写真図である。左より、対照群（Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）から採取した臓器を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、臓器は大きくなっており、肉眼観察では”異常”な色を示した。
図１８は、肝臓（Liver）、腎臓（Kidney）及び脾臓（Spleen）の重量を比較するグラフである。各グラフについて、左より、対照群（Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）から採取した臓器の平均値を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、対照群に比べると、各臓器の重量は大きくなった。
FIG. 14 is a graph comparing the tension of the aortic ring. Maximum tension was confirmed in the 1 mm ring obtained from the control group (Normal) and KCASP1Tg. The snap point intensity of the aortic ring was significantly lower with KCASP1Tg than the control group.
FIG. 15 is a graph showing the results of measuring diastolic blood pressure (un) and systolic blood pressure (sys) with the mouse tail. From the left, the data of the control group (Nor), KCASP1Tg (KCASP), KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), both the diastolic and systolic blood pressure measured at the tail decreased.
FIG. 16 is a photograph showing the measurement results by thermography. From the left, the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) showed deterioration of peripheral circulation in the tail with the lower limbs.
FIG. 17 is a photograph comparing the liver (Liver), kidney (Kidney) and spleen (Spleen). From left, organs collected from the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), the organs were large and showed an "abnormal" color on visual observation.
FIG. 18 is a graph comparing the weights of the liver (Liver), kidney (Kidney) and spleen (Spleen). For each graph, from the left, the average of organs collected from the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) Indicates the value. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), the weight of each organ increased compared to the control group.
図１９は、血中アミロイドAタンパク質（SAA）濃度を示すグラフである。左より、対照群（Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）のSAA濃度の平均値を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、有意に高値であった。
図２０は、肝臓（Liver）、腎臓（Kidney）及び膵臓（Spleen）の組織学的所見を示す顕微鏡写真図である。各臓器について、HE染色（HE）又はコンゴレッド染色（Congo Red）の結果を示す。また、左より、対照群（Normal)、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）から採取した臓器のものを示す。組織学的所見では、組織構造が崩壊しており、肝細胞では肝臓は単調非構造性沈着によって置き換えられ、腎臓では糸球体と尿細管が壊滅的な損傷を受け、脾臓ではリンパ濾胞は明確でなかった。KCASP1Tg とKIL-18Tg(+)では、コンゴレッド染色によって、濃いアミロイド沈着が認められた。
図２１は、血中GOT、GPT、BUN及びCreatinine濃度を纏めたグラフである。各グラフにおいて、左より、対照群（Normal）、KCASP1Tg、KIL-18Tg(-)（IL-18Tg(-)）及びKIL-18Tg(+)（IL-18Tg(+)）の平均値を示す。KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、若干の肝障害を示し、また腎機能障害が認められた。
FIG. 19 is a graph showing blood amyloid A protein (SAA) concentration. From the left, the average values of the SAA concentrations of the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (−) (IL-18Tg (−)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) were significantly higher.
FIG. 20 is a photomicrograph showing the histological findings of the liver (Liver), kidney (Kidney) and pancreas (Spleen). The results of HE staining (HE) or Congo Red staining (Congo Red) are shown for each organ. From left, organs taken from the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (-) (IL-18Tg (-)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown. . Histological findings indicate that the tissue structure is disrupted, in liver cells the liver is replaced by monotonic unstructured deposits, in the kidney the glomeruli and tubules are devastatingly damaged, and in the spleen the lymphoid follicle is clear. There wasn't. In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), dark amyloid deposits were observed by Congo red staining.
FIG. 21 is a graph summarizing blood GOT, GPT, BUN and Creatinine concentrations. In each graph, the average values of the control group (Normal), KCASP1Tg, KIL-18Tg (−) (IL-18Tg (−)) and KIL-18Tg (+) (IL-18Tg (+)) are shown from the left. KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) showed some liver damage and renal dysfunction.
＜試験方法＞
上記の各図説明と重複する部分もあるが、以下に本発明の実施及び検証する実験について説明する。
１．トランスジェニックマウス
K14プロモーターを含有し、ケラチノサイト特異的にヒトカスパーゼ1遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックマウス（KCASP1Tg）を本研究に使用した（非特許文献１）。また、ケラチノサイト特異的にマウスIL-18を発現するトランスジェニックマウス（KIL-18Tg）を使用した（非特許文献２）。C57BL/6同腹子を対照マウスとした。KIL-18Tgを除く動物については、6ヶ月齢まで観察した。KIL-18Tgについては、慢性皮膚炎は1年齢以降に発症するため、長期間に渡って観察した。動物は、倫理ガイドラインに沿って飼育され、発明者の属する組織における動物飼育と使用のための審査委員会によって承認された。
<Test method>
Although there is a part that overlaps with the above description of each figure, an experiment for implementing and verifying the present invention will be described below.
1. Transgenic mouse
A transgenic mouse (KCASP1Tg) containing the K14 promoter and overexpressing the human caspase 1 gene specifically in keratinocytes was used in this study (Non-patent Document 1). Moreover, the transgenic mouse (KIL-18Tg) which expresses mouse IL-18 specifically to a keratinocyte was used (nonpatent literature 2). C57BL / 6 littermates were used as control mice. Animals other than KIL-18Tg were observed up to 6 months of age. Regarding KIL-18Tg, since chronic dermatitis develops after the first age, it was observed over a long period of time. The animals were bred according to ethical guidelines and approved by a review board for animal bred and use in the institution to which the inventor belongs.
２．皮膚変化の計量と体重測定
皮膚変化と体重測定は、2週間毎に実施した。皮膚病変及び全身表面積は、ルーセント・プラスチックフィルム上にマークすることによって評価し、全身面積に対する百分率として示した（各群についてn=10）。皮膚変化と体重測定は図１に示す。
３．CT及び3D解析
イソフルレン（アボット社製）吸入による全身麻酔下にて、マイクロX線CT（理学社製）を用いてCT撮影を行った。データはi-VIEW-Rソフトウエア（理学社製）にて解析した。体脂肪率を計算し、3Dグラフを得た。CT撮影結果は図２、図１０に、３Dグラフは図１２に示す。
４．血中サイトカイン濃度
KIL-18Tgの長期間観察については、18ヶ月齢の血液サンプルを採取し、その他のマウスについては、6ヶ月齢の血液サンプルを採取した（各群についてn=10）。血中サイトカイン濃度は、特異的ELISAキット（IL-1α、IL-1βについてはR＆Dシステムズ社製、IL-18についてはMBL社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って測定した。
５．組織学的解析
2. Skin change measurement and body weight measurement Skin change and body weight measurement were performed every 2 weeks. Skin lesions and whole body surface area were assessed by marking on Lucent plastic film and presented as a percentage of total body area (n = 10 for each group). Skin changes and body weight measurements are shown in FIG.
3. CT and 3D analysis Under general anesthesia by inhalation of isoflurane (Abbott), CT imaging was performed using micro X-ray CT (Rigaku). The data was analyzed with i-VIEW-R software (manufactured by Rigaku Corporation). The body fat percentage was calculated and a 3D graph was obtained. The CT imaging results are shown in FIGS. 2 and 10, and the 3D graph is shown in FIG.
4). Blood cytokine levels
For long-term observation of KIL-18Tg, 18-month-old blood samples were collected, and for other mice, 6-month-old blood samples were collected (n = 10 for each group). The blood cytokine concentration was measured according to the attached manual using a specific ELISA kit (IL-1α, IL-1β manufactured by R & D Systems, IL-18 manufactured by MBL).
5. Histological analysis
腹部脂肪組織及び大動脈標本を10%中性ホルマリン緩衝液に固定し、パラフィンに包埋した。6μmの厚さで組織学的標本を切り出し、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色を行った。大動脈切片については、エラスチカ・ワンギーソン（Elastica van Gieson stain：EVG）染色を行った。肝臓、腎臓、脾臓の切片は、HE染色とコンゴレッド染色を行った。（図２０）
６．中和抗体による処理
1ヶ月齢のKCASP1Tgに対して1週間毎に10μgの抗IL-1α中和抗体及び／又は抗IL-1β中和抗体（バイオレジェンド社製）を腹腔内投与し、6週齢から2週間毎に身体的変化を観察した。PBSにて処理したCASP1Tg同腹子を対照群（各群についてn=7）として用いた。
７．組換えタンパク質の腹腔内投与
正常マウスには、6週齢から10週間に渡って毎週3回ずつ、1μgの組換えIL-1α又は組換えIL-1β（バイオレジェンド社製）のいずれかを腹腔内投与し、身体的変化を正常PBS処理マウスと比較した（各群についてn=6）。
Abdominal adipose tissue and aortic specimens were fixed in 10% neutral formalin buffer and embedded in paraffin. A histological specimen with a thickness of 6 μm was cut out and stained with hematoxylin and eosin (HE). The aortic section was stained with Elastica van Gieson stain (EVG). Liver, kidney and spleen sections were HE stained and Congo red stained. (Fig. 20)
6). Treatment with neutralizing antibody
Every month, 10 μg of anti-IL-1α neutralizing antibody and / or anti-IL-1β neutralizing antibody (manufactured by Biolegend) is intraperitoneally administered to 1 month old KCASP1Tg every 6 weeks Observed physical changes. CASP1Tg littermates treated with PBS were used as a control group (n = 7 for each group).
7). Intraperitoneal administration of recombinant protein Normal mice receive either 1 μg of recombinant IL-1α or recombinant IL-1β (manufactured by Biolegend) abdominally 3 times weekly for 6 weeks to 10 weeks. The physical changes were compared with normal PBS-treated mice (n = 6 for each group).
８．皮膚上清と脂肪細胞の培養
マウス胚線維芽脂肪細胞様の3T3-L1細胞株（ATCCより入手）を既報（非特許文献１６）に従って10日間培養し、成熟脂肪細胞に分化させた。培地には、通常マウスの皮膚上清、KCASP1Tgの皮膚上清、抗IL-1α中和抗体及び／又は抗IL-1β中和抗体で処理したKCASP1Tgの皮膚上清を添加した。皮膚上清の作成は6ヶ月齢の正常マウス又はKCASP1Tgマウスから1cm2の皮膚を採取し、ハサミで細分化した後、10% FCS、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地（2mL）を注いだ24穴培養プレート（コスター社製）にて皮膚を培養した。皮膚培養上清に1μgの抗IL-1α中和抗体及び／又は抗IL-1β中和抗体（バイオレジェンド社製）を添加し、2時間培養し前処置をした。培養14日目にPBSで培養細胞を洗浄し、オイルレッドO（シグマ・アルドリッチ社製）とヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で観察した（各群についてn=6）（図８）。
8). Culture of skin supernatant and adipocytes A mouse embryo fibroblast adipocyte-like 3T3-L1 cell line (obtained from ATCC) was cultured for 10 days according to a previous report (Non-Patent Document 16) and differentiated into mature adipocytes. To the medium, normal mouse skin supernatant, KCASP1Tg skin supernatant, anti-IL-1α neutralizing antibody and / or KCASP1Tg skin supernatant treated with anti-IL-1β neutralizing antibody were added. The skin supernatant was prepared by collecting 1 cm 2 of skin from 6 month old normal mice or KCASP1Tg mice, subdividing with scissors, and then adding 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. The skin was cultured in a 24-well culture plate (manufactured by Coster) into which the RPMI1640 medium (2 mL) contained was poured. 1 μg of anti-IL-1α neutralizing antibody and / or anti-IL-1β neutralizing antibody (manufactured by Biolegend) was added to the skin culture supernatant and cultured for 2 hours for pretreatment. On the 14th day of culture, the cultured cells were washed with PBS, stained with Oil Red O (manufactured by Sigma-Aldrich) and hematoxylin, and then observed under a microscope (n = 6 for each group) (FIG. 8).
９．腹部大動脈のスナッピング張力試験
既報（非特許文献１７）に示すように、ペントバルビタール（50mg/kg体重、腹腔内投与）にてマウスを麻酔し、腹部動脈を採取後、脂肪と結合組織を取り除き、1mm長さのリング状に切断した。20mL容の容器に115mM NaCl、4.7mM KCl、2.5mM塩化カルシウム、1.2mM MgCl2、25mM炭酸水素ナトリウム、1.2mM KH2PO4及び10mMデキストロースを含む改良クレブス・ヘンゼライト溶液（室温）を注ぎ、リングを2個のステンレス製フックによって容器内に垂直に支持し、アイソメトリック・フォース・トランスデューサ（TB-651T；日本光電社製）によって張力を測定した。等尺性張力の変化を張力・変位トランスデューサ（TB-651T；日本光電社製）とキャリア増幅器（EF601G；日本光電社製）で測定し、ペンレコーダ（WT-645G；日本光電社製）で記録した。容器中の溶液は37℃に維持し、5%二酸化炭素を含む空気を連続的に供給した。大動脈リングは洗浄後に30分間平衡化した。張力を測定するため、大動脈リングをスナップし、等尺性張力を徐々に増加した（n=12）（図１４）。
9. Abdominal aorta snapping tension test As shown in the previous report (Non-Patent Document 17), the mouse was anesthetized with pentobarbital (50 mg / kg body weight, intraperitoneal administration), and after collecting the abdominal artery, fat and connective tissue were removed, It was cut into a 1 mm long ring. Pour a modified Krebs-Henseleit solution (room temperature) containing 115 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM calcium chloride, 1.2 mM MgCl 2 , 25 mM sodium bicarbonate, 1.2 mM KH 2 PO 4 and 10 mM dextrose into a 20 mL container Was vertically supported in a container by two stainless steel hooks, and the tension was measured by an isometric force transducer (TB-651T; manufactured by Nihon Kohden Co., Ltd.). Changes in isometric tension were measured with a tension / displacement transducer (TB-651T; manufactured by Nihon Kohden) and a carrier amplifier (EF601G; manufactured by Nihon Kohden) and recorded with a pen recorder (WT-645G; manufactured by Nihon Kohden) did. The solution in the container was maintained at 37 ° C., and air containing 5% carbon dioxide was continuously supplied. The aortic ring was equilibrated for 30 minutes after lavage. To measure the tension, the aortic ring was snapped and the isometric tension was gradually increased (n = 12) (FIG. 14).
１０．末梢血圧とサーモグラフィ
既報に示すように（非特許文献１８）、意識下の6ヶ月齢マウスの血圧をBP-98A尾部カフ・システム（ソフトロン社製）にて測定し、末梢循環をサーモグラフィ（FLIRシステムズ社製）にて測定した。血圧と末梢循環は、18ヶ月齢のKIL-18Tg(+)でも測定した（各群について、n=8）血圧は図１５、サーモグラフィ結果は図１６に示す。
１１．統計解析
統計解析は、フリードマン検定を用いて行った。KIL-18Tg(+)の長期的な観測の解析と張力試験スナップの解析には、t検定を用いた。5%未満の危険率（p＜0.05）を有意とした。グラフの作成、及び統計的解析については、Graphpad prism 6.0を用いた。
10. Peripheral blood pressure and thermography As shown in the previous report (Non-patent Document 18), blood pressure of 6-month-old mice under consciousness was measured with the BP-98A tail cuff system (manufactured by Softron), and peripheral circulation was thermographic (FLIR (Made by Systems). Blood pressure and peripheral circulation were also measured with 18-month-old KIL-18Tg (+) (n = 8 for each group). FIG. 15 shows blood pressure, and FIG. 16 shows the results of thermography.
11. Statistical analysis Statistical analysis was performed using the Friedman test. A t-test was used for the analysis of long-term observation of KIL-18Tg (+) and the analysis of the tension test snap. A risk rate of less than 5% (p <0.05) was considered significant. Graphpad prism 6.0 was used for graph creation and statistical analysis.
＜試験結果、及び考察＞
本発明者は、ケラチノサイトIL-1α、IL-1β及びIL-18を全身に大量に供給することで皮膚炎のADを発症する二種類のモデルマウス（すなわち、ケラチン14ドリブン・カスパーゼ1（KCASP1Tg）（非特許文献１）及びマウスIL-18トランスジェニック・マウス（KIL-18Tg）（非特許文献２））を用いた。KCASP1Tgは、遺伝子導入されたカスパーゼ1、あるいはカスパーゼ1様酵素によって、表皮角化細胞IL-1βを分泌する（非特許文献７−９）。また皮膚炎が生じ表皮角化細胞が損傷することにより、角化細胞中のIL-1αが放出される。KCASP1Tg は、生後8週目より眼窩周囲病変から、びらん性皮膚炎を発症する。皮膚炎は、徐々に顔全体及び胴体に広がり、5ヶ月で体表面の約15％にまで及ぶ。KCASP1Tg では、10週齢から皮膚炎の進展に伴って、体重減少が始まるのに対し、同時期のKIL-18Tg では皮膚炎を伴わず体重減少は見られなかった（図１）。生後1年目には、KIL-18Tgは皮膚炎を発症し、その後に体重減少を起こした。CTスキャンによれば、KCASP1Tg と皮膚炎を伴うKIL-18Tg （KIL-18Tg(+)）では、皮膚炎と共に体細胞が劇的に減少していたが、皮膚炎を伴わないKIL-18Tg （KIL-18Tg(-)）では、そのような減少は見られなかった（図２，図３）。血中IL-1α濃度及び血中IL-1β濃度は、KCASP1Tg とKIL-18Tg(+)では、対照群及びKIL-18Tg(-)に比べて有意に増加した。血中IL-18濃度は、KCASP1Tg では増加し、若齢のKIL-18Tg においても既に増加していた（図４）。腹部脂肪組織の病理組織学的研究によれば、単核細胞の浸潤数は4群間で差違が認められなかったものの、正常コントロールマウスとKIL-18Tg（-）では、脂肪細胞が大きくかつ膨らんでおり、KCASP1TgとKIL-18Tg（+）では、脂肪細胞は小さく丸かった、（図５）。
<Test results and discussion>
The present inventor has developed two types of model mice (ie, keratin 14 driven caspase 1 (KCASP1Tg)) that develop AD of dermatitis by supplying a large amount of keratinocytes IL-1α, IL-1β and IL-18 throughout the body. (Non-patent document 1) and mouse IL-18 transgenic mouse (KIL-18Tg) (non-patent document 2)) were used. KCASP1Tg secretes epidermal keratinocytes IL-1β by caspase 1 or a caspase 1-like enzyme introduced with a gene (Non-patent Documents 7-9). In addition, when dermatitis occurs and epidermal keratinocytes are damaged, IL-1α in the keratinocytes is released. KCASP1Tg develops erosive dermatitis from the periorbital lesion from the 8th week of life. Dermatitis gradually spreads to the entire face and torso, reaching about 15% of the body surface in 5 months. KCASP1Tg began to lose weight with the development of dermatitis from the age of 10 weeks, whereas KIL-18Tg at the same time showed no weight loss without dermatitis (Fig. 1). In the first year of life, KIL-18Tg developed dermatitis, followed by weight loss. According to CT scans, KCASP1Tg and KIL-18Tg with dermatitis (KIL-18Tg (+)) showed a dramatic decrease in somatic cells with dermatitis, but KIL-18Tg without dermatitis (KIL -18Tg (-)), no such decrease was observed (Figs. 2 and 3). The blood IL-1α and blood IL-1β concentrations were significantly increased in KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) compared to the control group and KIL-18Tg (−). The blood IL-18 concentration increased with KCASP1Tg and also increased with younger KIL-18Tg (FIG. 4). According to the histopathological study of abdominal adipose tissue, the number of mononuclear cells infiltrated was not different between the 4 groups, but in normal control mice and KIL-18Tg (-), adipocytes were large and swollen In KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), the fat cells were small and round (FIG. 5).
これらの結果より、IL-18ではなくIL-1αとIL-1βが、るい痩を誘導したことが推測された。この仮説を検証するため、4週齢から24週齢までに渡り、KCASP1Tg に対して、抗IL-1α中和抗体及び／又は抗IL-1β中和抗体を腹腔内投与した。抗IL-1α抗体又は抗IL-1β抗体の投与によって、体重減少は改善され、両抗体の投与による相加効果が認められた（図６）。図には示さないが、CTスキャンによれば、IL-1α抗体とIL-1β抗体の投与によって、貯蔵された体脂肪の減少が明らかとなった。IL-1抗体は、皮膚炎の発症と進展も抑制したことから、皮膚炎症状はIL-1によって増悪することが支持された（非特許文献２）。更に、皮膚炎とるい痩におけるIL-1の病原性を立証するために、組換えIL-1α又は組換えIL-1βによって、通常の健康マウスを処理した。野生型マウスに対して、組換えIL-1α又は組換えIL-1βを腹腔内投与すると、10週間で体重減少が認められた（図７）。データには示さないが、CTスキャンによれば、体脂肪減少が認められた。 From these results, it was inferred that IL-1α and IL-1β, instead of IL-18, induced lupus. In order to test this hypothesis, anti-IL-1α neutralizing antibody and / or anti-IL-1β neutralizing antibody was administered intraperitoneally to KCASP1Tg from 4 to 24 weeks of age. Weight loss was improved by administration of anti-IL-1α antibody or anti-IL-1β antibody, and an additive effect was observed by administration of both antibodies (FIG. 6). Although not shown in the figure, CT scan revealed a decrease in stored body fat by administration of IL-1α and IL-1β antibodies. Since IL-1 antibody also suppressed the onset and progress of dermatitis, it was supported that skin inflammation was exacerbated by IL-1 (Non-patent Document 2). In addition, normal healthy mice were treated with recombinant IL-1α or recombinant IL-1β to establish the pathogenicity of IL-1 in dermatitis. When recombinant IL-1α or recombinant IL-1β was administered intraperitoneally to wild-type mice, weight loss was observed in 10 weeks (FIG. 7). Although not shown in the data, body fat loss was found by CT scan.
肥満における脂肪組織リモデリングについて研究が行われてきたが（非特許文献１０）、どのような免疫応答が、るい痩のプロセスと原因に影響を与えているのか不明である。病理組織学的分析によれば、KCASP1Tg の脂肪細胞は小さく、丸かった（図５）、これは”ふっくらした栄養のある脂肪細胞”と比べてかなり異なる表現型を示した。本発明者は、マウス胚線維芽細胞様の脂肪細胞を用いて、この萎縮した脂肪細胞が、皮膚由来サイトカインの直接的な影響によるものであったかどうかを検討した。脂肪細胞は、通常の培地で培養された状態では（図８）、豊富な脂質粒子（オイルレッドOで染色した）を含んでおり、それによって、ふっくらした形状を示した。正常皮膚からの培養上清の存在下で培養すると、脂肪細胞は細胞質の脂質粒子の減少を示し、培養された正常皮膚から自然に放出されるサイトカインの減少によって、ふっくらした形状が弱まった。一方、KCASP1Tgの皮膚培養上清の存在下で培養すると、それらの脂肪細胞はさらに脂質粒子の著しい減少を示した。KCASP1Tgの皮膚培養上清の脂質粒子増殖に対する抑制効果は、抗IL-1α抗体又は抗IL-1β抗体によって中和された。この抑制効果は、両抗体の同時処理によって、ほとんど全く抑制された（図８）。 Although research has been conducted on adipose tissue remodeling in obesity (Non-patent Document 10), it is unclear what immune response affects the process and cause of sputum. According to histopathological analysis, the adipocytes of KCASP1Tg were small and round (FIG. 5), which showed a considerably different phenotype compared to “fluffy and nourishing adipocytes”. The present inventor used mouse embryonic fibroblast-like adipocytes to examine whether or not the atrophic adipocytes were due to direct effects of skin-derived cytokines. Adipocytes contained abundant lipid particles (stained with Oil Red O) when cultured in a normal medium (FIG. 8), thereby showing a plump shape. When cultured in the presence of culture supernatant from normal skin, adipocytes showed a decrease in cytoplasmic lipid particles, and the plump shape was weakened by a decrease in cytokines naturally released from cultured normal skin. On the other hand, when cultured in the presence of KCASP1Tg skin culture supernatant, these adipocytes further showed a marked decrease in lipid particles. The inhibitory effect of KCASP1Tg on the lipid particle proliferation of the skin culture supernatant was neutralized by anti-IL-1α antibody or anti-IL-1β antibody. This inhibitory effect was almost completely suppressed by the simultaneous treatment of both antibodies (FIG. 8).
次に、心血管系に関する評価を行った。注目すべきことには、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)マウスは、それぞれ6ヶ月齢と18ヶ月齢において、大動脈狭窄を起こした（図９）。狭窄大動脈の血管壁では、弾性繊維は正常であり、データには示さないが平滑筋にも異常を認めなかった。データには示さないが、対照群とKCASP1Tgの大動脈における前線維性サイトカインTGF-βと抗線維サイトカインIFN-γ及びTNF-αのmRNA発現については、有意な変化は見られなかった。アテローム硬化性変化によるプラークは、検出されなかった。造影CTスキャンによれば、KCASP1Tg及びKIL-18Tg(+)の大動脈径は、対照群に比べると、有意に減少した（図１０、図１１）。CTイメージを3Dグラフ化したところ、KCASP1Tg 及びKIL-18Tg(+)では、狭窄が認められた（図１２）。更に、KCASP1Tg とKIL-18Tg(+)では、左心室肥大を伴う心臓肥大を示した（図１３）。
データには示さないが、生後6ヶ月齢の動物についての超音波エコー検査によれば、明らかな左心室機能不全は検出されなかった。左心室機能不全は、大動脈狭窄症と大動脈壁の硬さとしなやかさの減少に起因する変化である可能性が高い（図１４）。大動脈狭窄症は、末梢灌流にも影響し、尾部での血圧を測定したところ、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、収縮期及び拡張期の両方で低かった（図１５）。
Next, the cardiovascular system was evaluated. Of note, KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) mice developed aortic stenosis at 6 months and 18 months of age, respectively (FIG. 9). In the vascular wall of the stenotic aorta, the elastic fibers were normal, and although not shown in the data, no abnormality was observed in the smooth muscle. Although not shown in the data, there was no significant change in mRNA expression of profibrotic cytokines TGF-β and anti-fibrous cytokines IFN-γ and TNF-α in the control group and KCASP1Tg aorta. Plaques due to atherosclerotic changes were not detected. According to contrast CT scan, the aortic diameters of KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) were significantly decreased compared to the control group (FIGS. 10 and 11). When the CT image was converted into a 3D graph, stenosis was observed in KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) (FIG. 12). Furthermore, KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) showed cardiac hypertrophy with left ventricular hypertrophy (FIG. 13).
Although not shown in the data, no apparent left ventricular dysfunction was detected by ultrasonography on 6 month old animals. Left ventricular dysfunction is likely a change due to aortic stenosis and a decrease in aortic wall stiffness and suppleness (FIG. 14). Aortic stenosis also affected peripheral perfusion, and when blood pressure in the tail was measured, KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) were low in both systole and diastole (FIG. 15).
サーモグラフィの測定によれば、KCASP1Tg 及びKIL-18Tg(+)の2つのグループでは、下肢と尾部において循環が阻害されていた（図１６）。データには示さないが、循環は冷刺激によって悪化した。これはヒトの動脈硬化における四肢の壊死モデルに関与している。他の臓器について調べたところ、対照群に比べ、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、肝臓、腎臓、及び膵臓の大きさと重量が有意に増加していることが分かった（図１７、図１８）。肉眼的には、これらの臓器は、”異常”であった。慢性炎症性疾患では、アミロイドーシスが認められることがある。実際、血清アミロイド蛋白A（SAA）濃度は、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、有意に高かった（図１９）。組織学的所見では臓器構造が崩壊しており、具体的には、肝臓では肝細胞は無構造性沈着物によって置き換えられ、腎臓では糸球体と尿細管が損傷を受け、脾臓ではリンパ濾胞が明らかではなく、コンゴレッド染色によって濃いアミロイド沈着が認められた（図２０）。検査所見では、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)では、若干の肝機能異常を認め、腎機能障害が検出された（図２１）。SAAの増加によって、脂肪細胞の分化及び脂質合成が抑制されるとの報告がある（非特許文献１１）。図８に示すように、KCASP1TgとKIL-18Tg(+)のるい痩は、高濃度の循環SAAとIL-1α及びIL-1βの直接障害の組み合わせによって誘発されている可能性がある。KCASP1Tgでは、脂肪細胞は動脈硬化症の発症前の若年期に、既に減少していた。 According to the thermography measurement, in the two groups of KCASP1Tg and KIL-18Tg (+), circulation was inhibited in the lower limbs and tail (FIG. 16). Although not shown in the data, circulation was exacerbated by cold stimulation. This has been implicated in a limb necrosis model in human atherosclerosis. When other organs were examined, it was found that the size and weight of the liver, kidney, and pancreas were significantly increased in KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) compared to the control group (FIGS. 17 and 18). ). Grossly, these organs were “abnormal”. In chronic inflammatory diseases, amyloidosis may be observed. In fact, serum amyloid protein A (SAA) concentrations were significantly higher in KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) (FIG. 19). Histological findings show that the organ structure is disrupted, specifically, hepatocytes are replaced by unstructured deposits in the liver, glomeruli and tubules are damaged in the kidney, and lymphoid follicles are evident in the spleen Instead, dark amyloid deposits were observed by Congo red staining (FIG. 20). Laboratory findings showed that KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) showed some liver function abnormalities and detected renal dysfunction (FIG. 21). There is a report that the increase in SAA suppresses adipocyte differentiation and lipid synthesis (Non-patent Document 11). As shown in FIG. 8, KCASP1Tg and KIL-18Tg (+) sputum may be induced by a combination of high concentrations of circulating SAA and direct impairment of IL-1α and IL-1β. In KCASP1Tg, adipocytes had already decreased in the early years before the onset of arteriosclerosis.
脂肪細胞は、エネルギー貯蔵について急速に反応するという役割を持つために、IL-1α及びIL-1βに対して非常に敏感である。一週間のIL-1投与によって、ラット拒食症モデルで体重が僅かに低減したとの報告がある（非特許文献１２）。但し、IL-1の投与量が少量であり、投与期間も短いことから、体重減少がIL-1による効果か否かの検討が不十分である。これに対し、今回の知見では、特に図６〜図８に示すように、IL-1によって体重が大幅に減少することがわかった。これは、IL-1を大量かつ長期間に渡って誘導することにより、初めて認められたものである。この知見によれば、ヒト肥満に対してIL-1療法が効果的であることを強く示唆している。なお、この現象は、サイトカインの投与によって、動物のエネルギー消費機構が誘発されたものと考えられる。
閉塞性動脈硬化、特にアテローム性動脈硬化症におけるIL-1及びIL-18の寄与については、既報がある（非特許文献１３）。アテローム性動脈硬化におけるIL-1αとIL-1βの起源として、アテローム病変における単球が疑われている。一般的には、アテローム性動脈硬化症には、アテローム変化と動脈壁の硬化性変化の両方が認められる。また、アテローム性動脈硬化症の殆どの動物モデルは、高脂血症誘発血管アテローム変性に基づいている。興味深いことに、我々のモデルでは、アテローム・プラークは認められなかった。本研究によって、アテローム変性を伴わない動脈硬化症の発症について、IL-1αとIL-1βの直接的な効果が確認された。自己免疫疾患の一つで断続的にIL-1に曝される家族性地中海熱（FMF）において、動脈硬化血管の変化が報告されているが（非特許文献１４）、FMFにおける血管変化では、アテローム斑は殆ど認められていない。本研究では、血中IL-18濃度は、KIL-18Tgの表現型の発症前には既に高値となったため、KIL-18Tgの硬化症の発症はIL-18ではなくIL-1αとIL-1βの影響によることが強く推測される。自己免疫疾患における血管変化に関する更なる研究が望まれる。
Adipocytes are very sensitive to IL-1α and IL-1β because they have a role of responding rapidly to energy storage. There has been a report that the body weight slightly decreased in the rat anorexia model by one week of IL-1 administration (Non-patent Document 12). However, since the dose of IL-1 is small and the administration period is short, it is insufficient to examine whether weight loss is an effect of IL-1. On the other hand, in this knowledge, as shown in FIGS. 6 to 8 in particular, it was found that IL-1 significantly reduced body weight. This was recognized for the first time by inducing a large amount of IL-1 over a long period of time. This finding strongly suggests that IL-1 therapy is effective against human obesity. In addition, it is thought that this phenomenon induced the energy consumption mechanism of animals by administration of cytokine.
There has been a report on the contribution of IL-1 and IL-18 in obstructive arteriosclerosis, particularly atherosclerosis (Non-patent Document 13). Monocytes in atherosclerotic lesions are suspected as the origin of IL-1α and IL-1β in atherosclerosis. In general, atherosclerosis has both atherosclerosis and sclerotic changes in the arterial wall. Also, most animal models of atherosclerosis are based on hyperlipidemia-induced vascular atheropathy. Interestingly, atheroma plaques were not observed in our model. This study confirmed the direct effects of IL-1α and IL-1β on the development of arteriosclerosis without atherosclerosis. In familial Mediterranean fever (FMF) that is intermittently exposed to IL-1 as one of the autoimmune diseases, changes in arteriosclerotic blood vessels have been reported (Non-patent Document 14). There are few atheroma plaques. In this study, blood IL-18 levels were already high prior to the onset of the KIL-18Tg phenotype, so the development of KIL-18Tg sclerosis was not IL-18 but IL-1α and IL-1β It is strongly speculated that this is due to the influence of Further research on vascular changes in autoimmune diseases is desired.
モデルマウスによる知見では、内因性IL-1によって誘発される全身のるい痩、ADの皮膚や動脈の血管変化については、驚くべきものがある。最終的には、重篤なアミロイドーシスを伴った。遺伝子導入されたカスパーゼ1はIL-1β前駆体を成熟形態にするので、KCASP1Tgにおいて皮膚から供給される大量のIL-1は妥当なものである。しかし、KIL-18Tgにおける全身変化は驚くべき発見である。皮膚から放出される内因性IL-1αとIL-1βによって誘発される皮膚炎は、全身衰弱、動脈硬化症、及びアミロイドーシスを起こした。本実施形態によれば、引っ掻き行動の抑制や炎症性皮膚疾患（ADを含む）の制御の重要性を明らかに示唆している。高濃度のIL-1及び炎症性サイトカインを伴う慢性炎症性角化性疾患の一つである乾癬は、心臓血管障害のリスクとなっている。TNF-α又はIL-12/23p40を標的とした近年の生物学的治療法によれば、皮膚病変を抑制し、心臓血管障害のリスクを減少させたとの報告がある（非特許文献１５）。皮膚病変の制御によって、IL-1とサイトカインの抑制を行えば、本実施形態の結果を利用できる可能性が非常に高い。 The findings from the model mice are surprising regarding systemic sputum induced by endogenous IL-1, and vascular changes in AD skin and arteries. Eventually, it was accompanied by severe amyloidosis. Since the transduced caspase 1 brings the IL-1β precursor to the mature form, the large amount of IL-1 supplied from the skin in KCASP1Tg is reasonable. However, systemic changes in KIL-18Tg are a surprising finding. Dermatitis induced by endogenous IL-1α and IL-1β released from the skin caused systemic weakness, arteriosclerosis, and amyloidosis. According to this embodiment, the importance of suppression of scratching behavior and control of inflammatory skin diseases (including AD) is clearly suggested. Psoriasis, one of the chronic inflammatory keratotic diseases with high levels of IL-1 and inflammatory cytokines, is at risk for cardiovascular disorders. According to a recent biological therapy targeting TNF-α or IL-12 / 23p40, it has been reported that skin lesions were suppressed and the risk of cardiovascular disorder was reduced (Non-patent Document 15). If IL-1 and cytokines are suppressed by controlling skin lesions, it is very likely that the results of this embodiment can be used.
上記したように、本願発明によれば、内因性IL-1α及び／又はIL-1βを誘導する非ヒト哺乳動物は、または（１）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に前駆型カスパーゼ１遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、又は（２）皮膚特異的に発現する遺伝子プロモータの下流に副甲状腺ホルモン遺伝子リーダーシークエンス及びIL-18遺伝子を結合した組み換えDNAを有し、血中に持続的に成熟型IL-18を分泌し、持続的に皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、注意深く育成し皮膚炎観察などで判断することにより、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスを精度よく生じさせる実験用動物を効率よく提供できようになる。また、実施の形態の説明中で、図１３の心臓重量を比較や、図１４大動脈リングの張力比較、図１７、図１８、図２０の肝臓、腎臓及び脾臓を比較による殺傷観察することや、実験用動物を時間をかけて診断することなく、育成と一定の観察により効率よく必要とされる実験用動物を確実に提供することができる。
このことにより、上記した非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスの改善効果を検定することを特徴とする閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスの予防又は治療用物質のスクリーニングを効率よく実施することを可能とし、一例として、閉塞性動脈硬化、るい痩、又は全身性アミロイドーシスの予防又は治療用に抗IL-1抗体が有効であることも開示した。
As described above, according to the present invention, a non-human mammal that induces endogenous IL-1α and / or IL-1β is: (1) a precursor caspase 1 downstream of a gene promoter that is specifically expressed in skin. A transgenic non-human mammal having a recombinant DNA linked with the gene and causing dermatitis continuously, or (2) a parathyroid hormone gene leader sequence and IL-18 gene downstream of a gene promoter expressed specifically in the skin Transgenic non-human mammals that have recombinant DNA bound to and secrete mature IL-18 continuously in the blood and cause persistent dermatitis should be carefully nurtured and determined by observation of dermatitis, etc. Thus, it becomes possible to efficiently provide a laboratory animal that can accurately cause obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis. Further, in the description of the embodiment, the heart weight of FIG. 13 is compared, the tension of the aortic ring is compared, the liver, kidney and spleen of FIG. 17, FIG. 18, FIG. Without diagnosing laboratory animals over time, it is possible to reliably provide laboratory animals that are efficiently required by breeding and constant observation.
Thus, the test substance is administered to the non-human mammal described above, and the effect of improving obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis is assayed. It is also possible to efficiently screen for substances for preventing or treating systemic amyloidosis. For example, anti-IL-1 antibodies are effective for preventing or treating obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis. It was also disclosed.
また、一定の遺伝子組み換えを行った非ヒト哺乳動物を、生後一定期間育成し、皮膚炎発症を観察し、皮膚炎発症後にCTスキャン観察、体重観察、血圧観察、血中アミロイドAタンパク質濃度観察の結果により、閉塞性動脈硬化症、るい痩、又は全身性アミロイドーシスの実験用として、極めて効率よく選別できるようになった。さらに、上記実験用動物の皮膚に、テープストリーピングや界面活性剤、クロトンオイル、漆等の化学物質塗布等の外的刺激を定期的に繰り返すことで、その実験用動物の提供期間を短縮する等の制御を行うことも可能とした。
要約すると、持続炎症を起こしている皮膚から供給されるIL-1が、硬化血管の変化とアディポサイトカインのシステムを変更し、全身性アミロイドーシスと全身るい痩を引き起こす。今回の研究では、AD、メタボリックシンドローム、及び自己炎症性疾患におけるIL-1の生物学的役割に新たな知見を提供している。また、本研究のデータは、抗IL-1療法の有効性を強く支持している。
このように本実施形態によれば、閉塞性動脈硬化症モデル動物、抗肥満モデル動物、及び全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患モデル動物などを提供できた。これらの動物は、IL-1の増加によって特異的な症状を発症することが分かったので、この作用に対抗する作用を示す物質を検索することで、上記疾患の予防又は治療用物質をスクリーニングできる。
In addition, non-human mammals that have undergone certain genetic recombination are bred for a certain period of time after birth and observed for onset of dermatitis. After onset of dermatitis, CT scan observation, weight observation, blood pressure observation, blood amyloid A protein concentration observation As a result, it has become possible to select extremely efficiently for the experiment of obstructive arteriosclerosis, sputum, or systemic amyloidosis. Furthermore, by periodically repeating external stimuli such as tape striping, application of chemicals such as surfactant, croton oil, and lacquer on the skin of the experimental animal, the period for providing the experimental animal is shortened. It is also possible to perform such control.
In summary, IL-1 supplied from persistently inflamed skin alters sclerotic vascular changes and the adipocytokine system, causing systemic amyloidosis and systemic sputum. This study provides new insights into the biological role of IL-1 in AD, metabolic syndrome, and autoinflammatory diseases. In addition, the data in this study strongly supports the effectiveness of anti-IL-1 therapy.
As described above, according to the present embodiment, it is possible to provide an obstructive arteriosclerosis model animal, an anti-obesity model animal, and at least one disease model animal in a disease group consisting of systemic amyloidosis. Since these animals were found to develop specific symptoms due to an increase in IL-1, it is possible to screen for substances for the prevention or treatment of the above diseases by searching for substances that show an action against this action. .
Claims (5)
CTスキャン観察、体重観察、血圧観察、体外における体脂肪培養観察、又は血中アミロイドAタンパク質濃度観察からなる群から選択される少なくともいずれか一つの観察結果により、閉塞性動脈硬化症又は全身性アミロイドーシスからなる疾患群のうちの少なくとも一つの疾患を発症した被検動物を選別する、実験用マウスの育成方法。 Caspase-1 transgenic mice (KCASP1Tg mice) whose expression is controlled by the keratin 14 promoter, a non-human mammal that induces endogenous IL-1α and / or IL-1β, are bred for a certain period after birth and observed for onset of dermatitis And after the onset of dermatitis
Obstructive arteriosclerosis or systemic amyloidosis based on at least one observation result selected from the group consisting of CT scan observation, weight observation, blood pressure observation, in vitro body fat culture observation, or blood amyloid A protein concentration observation A method for breeding experimental mice , which comprises selecting a test animal that has developed at least one disease from a disease group consisting of:
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