EP0394404A1 - An automated "in vivo" micro-nucleus test method and a device for implementing it - Google Patents

An automated "in vivo" micro-nucleus test method and a device for implementing it

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EP0394404A1
EP0394404A1 EP19890911362 EP89911362A EP0394404A1 EP 0394404 A1 EP0394404 A1 EP 0394404A1 EP 19890911362 EP19890911362 EP 19890911362 EP 89911362 A EP89911362 A EP 89911362A EP 0394404 A1 EP0394404 A1 EP 0394404A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cellulose
mixture
filter
cell
Prior art date
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Ceased
Application number
EP19890911362
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Felix Romagna
Gerhard Johannsen
Wilfried Frieauff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems Holdings GmbH
Original Assignee
Wild Leitz GmbH
Leica Industrieverwaltung GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wild Leitz GmbH, Leica Industrieverwaltung GmbH filed Critical Wild Leitz GmbH
Publication of EP0394404A1 publication Critical patent/EP0394404A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • G01N2001/2846—Cytocentrifuge method

Definitions

  • the invention relates to an automated "in vivo" microkernel test method in mammals, in particular in humans, and in rats and mice, and a corresponding preparation device for carrying out the same.
  • the micronucleus test is an "in vivo" test for the detection of agent-induced chromosome damage and damage to the spindle apparatus. For this purpose, erythrocyte-like cells of the bone marrow or peripheral blood of mammals are examined for cells containing micronuclei. The micronucleus test in the bone marrow of the mouse is most frequently used according to W. Schmid's modified method, cf. Mutation Res., 31 (1975), 9-15.
  • the main advantages of the present invention are that an increase in the sensitivity of the classic micronucleus test in the mouse bone marrow could be achieved and that above all the adaptability of the new method for examining the bone marrow is also given to the rat.
  • 1 shows, in a purely schematic representation in cross section, a first device according to the invention for the separation of cells to be examined from the bone marrow or peripheral blood of mammals (human; mouse, rat, etc.).
  • a vertical column made of glass or plastic can be fastened to a stand 12, for example a disposable syringe 7 with a centrally positioned cannula 9 pointing downwards.
  • the filling of the syringe 7 consists of a cellulose mixture 2 with a defined column height. Above this mixture there is a free space 1 for receiving the sample suspension 13 to be separated, which contains a carrier liquid, for example an isotonic solution or a fetal calf serum.
  • a lid 11 closes the free space 1 towards the top.
  • the syringe 7 has a filter reservoir 4a in which one or more filters 4 with a mesh size between 5 and 20 ⁇ m, preferably between 10 and 12 ⁇ m , are provided.
  • the filter reservoir 4a is preferably formed as an individual component and can accordingly be pushed onto the cannula 9 of the syringe 7 with a precise fit. However, it is also possible to form the syringe 7 in one piece together with the filter reservoir.
  • a collecting container 5 is provided for the eluate ⁇ , which consists of a suspension of mature and immature erythrocytes.
  • the collecting container 5 can be dimensioned such that it can be detachably connected to the disposable syringe 7, for example by being pushed on. It can have air passage openings 10. This ensures that with the container 5 attached, after filling a sample suspension 13 into the free space 1, a slow leakage of this substance through the individual filter regions 2 - 8 - 4 with normal pressure compensation is possible.
  • the procedure is as follows: after filling in the sample suspension 13 - in the present case rat bone marrow is entered - the sample penetrates into the cellulose mixture 2.
  • the cellulose mixture consists of microcrystalline cellulose and ⁇ -cellulose in a weight ratio of preferably 1: 1. For certain applications, this weight ratio can also vary between 1.5: 1 and 1: 1.5.
  • a similar method has already been developed by Beutler et al; however, this was limited only to peripheral blood and, moreover, was never used in connection with a micronucleus test, cf. J. Lab. Clin. Med. 88 (2), 1976, 328-333.
  • Standard cell type 50 from SIGMA, St. Louis, USA, for example, can be used as the microcrystalline cellulose; a product of the company mentioned can also be used as ⁇ -cellulose in fiber form.
  • Bei.de cellulose modifications are shaken vigorously for several minutes before being placed in the vertical column. The "column height" of the cellulose mixture 2 and its packing density in the syringe 7 is of great importance for the success of the preparation process.
  • the eluate 6 collected in the container 5 contains only the two desired cell types, namely the immature (polychromatophilic) and the mature erythrocytes. A total elimination of the nucleated hematopoietic cells was thus achieved.
  • rat bone marrow the cells are now cleaned using a Percoll step gradient method. This process step is essential for the micronucleus test in the rat bone marrow (removal of the remaining leukocytic granules).
  • the solutions described by Rennie et al in Klin. Chem. Acta, 98 (1979), pages 119-125 are used for the cleaning process mentioned.
  • a centrifuge tube for example with a volume of 5 ml, 1.5 ml of an 80% Percoll solution are first introduced. 1.5 ml of a 30% Percoll solution are layered on top.
  • the cells to be examined accumulate in the boundary layer area between the 80% and the 30% Percoll solution.
  • the cells to be examined must be arranged very flat on the slide. The cells are therefore placed on slides treated with polylysine by cytocentrifugation. The flattened and homogeneously distributed cells in this way can then be colored using the known May-Grünwald / Giemsa standard staining. However, coloring with fluorescent dyes, preferably with acridine orange, is also possible.
  • the cells which have been separated, prepared and labeled in this way are then available for subsequent automatic quantitative microscopic image analysis.
  • an enrichment process of the polychromatophilic erythrocytes occurs in samples from peripheral blood by means of a modified Percoll step gradient method.
  • the device for carrying out this enrichment method differs from that for cleaning rat bone marrow samples only in that instead of the 80% Percoll solution to be entered first, 1.5 ml of a 55-65% Percoll solution. Solution can be entered.
  • the MIAMED image analysis system developed by WILD-LEITZ The most important prerequisite for this is the previous elimination of the nucleated cells of hematopoiesis described above with the help of the mentioned preparation or separation method in the manner of a "column chromatography".
  • the MIAMED consists on the one hand of the automated WILD-LEITZ microscope MEDILUX and on the other hand of the image processing system MIAC (Modular Image Analysis Computer).
  • the microscope has a scanning table that can hold up to sixteen slides, a focus drive, lamp control and a nosepiece.
  • the table, focus and objective revolver are motor-driven and are controlled by software via the MIAC.
  • a video camera adapted to the microscope and MIAC enables the microscope images to be recorded electronically and transferred to the image processing system.
  • the MIAC is a modular bus-oriented system of great flexibility.
  • a new type of bus system enables fast and flexible communication between the various MIAC modules.
  • the modules include image memories and special image processors for fast processing of gray and binary images.
  • the architecture of the system is designed for so-called pipeline processing, that is to say for continuous and parallel processing of the images delivered by the camera.
  • the modularity also enables the system to be configured to suit the problem in order to achieve an optimal price / performance ratio.
  • the program package for the automatic detection of micronuclei is embedded in a software architecture that is specially designed for so-called "rare evenf” strategies and is adapted to the fast MIAMED pipeline structure. According to this strategy, the user with the three Programmte len data entry, automatic detection and do resulting ⁇ nis analyses. There may also be a so-called "superuser” program, which is not accessible to the routine user. It is used to set special system parameters.
  • the interactive actions of the user are limited to the setting of general search parameters to the entry of some special problem-dependent parameters that control the automatic search process of the system.
  • Essential input data are, for example, default values for the search areas on the slides, the setting of the focus level of the start field and the specification of the number of cells to be evaluated.
  • Automatic detection is a program that, without supervision, uses the input data to automatically and fully scan the slides spirally field by field for cells containing micronuclei. It is composed of a problem-independent "detection frame", which is responsible for the exact control and adjustment of the image fields, and a problem-specific "detection core”, which guarantees the extraction of the desired image information by appropriate algorithms. All data obtained in the automatic search run, in particular the positions of the detected micronucleus-containing cells, are stored in a special database, as was the input data previously. The search can be interrupted at any time by the user to output current interim results. In addition, the user has the option of Interruption turn on the display for the graphical representation of the single ⁇ NEN detection steps, so as to verify the selection of parameters and to modify, if necessary.
  • a program part for the evaluation and analysis of the automatically detected micronucleus-containing cells completes the program package.
  • the analysis program the general part of which enables the detected cells to be quickly demonstrated again, also contains a special part for problem-specific analysis of the generated data. This makes it possible to prepare and format all statistically relevant data in such a way that they can also be processed further by commercially available PC programs.
  • the present method it is possible for the first time to reliably carry out the micronucleus test in the bone marrow of the rat. This is possible because the new column method and the subsequent cleaning of the cells using the Percoll step gradient method can remove all artifact-producing leukocytic granules, so that a high-quality cell preparation results. This can then be examined - either manually or fully automatically with the aid of a special image analysis method - for erythrocytes containing micronuclei.
  • the polychro atophilic erythrocytes can be enriched using a Percoll step gradient method; in the "rat" species, for example, from originally 2 to 5% to over 80%.
  • Another advantage of the method according to the invention is that good adaptability to other mammalian species, including humans. The genotoxicity test in vivo has thus become considerably more flexible.
  • the column arrangement shown schematically in FIG. 1 is designed here as a laboratory device. It is of course also possible to provide this arrangement in one piece as a "disposable set" 11-7-4-6. This gives greater flexibility in handling at any location.
  • the lid of the disposable set device has a different interior shape than that of the laboratory arrangement shown in FIG. 1, since it is designed as a cylindrical inner plug which takes up the entire free space 1 including the partial volume 13. This ensures that the preparation set has a constant, reproducible, defined adjustable column filling height of the cellulose mixture 2 before it is used.
  • the amount of the cellulose mixture 2 to be used depends on the species. It is within the scope of the present invention to optimize the loading of the disposable syringe 7 with cellulose mixture fillings and / or with filter paper (s) 8 and / or with filter material (4) for the species to be examined in each case.
  • FIG. 2 shows a simplified cross-sectional view of a simplified variant, which is also designed as a disposable set and represents a compact cell separation device 22.
  • the preferably rotationally symmetrical device has an inlet opening 14, into which the cannula, for example of a disposable syringe, can be inserted.
  • the cellulose mixture 2 which has already been described in more detail in FIG. 1, is located in its central region. This mixture is by means of a upper seal 15 and a lower seal 16 held in the central region of the device 22.
  • the upper seal 15 prevents the cellulose mixture 2 from escaping and at the same time allows the sample suspension to be separated to pass through. Two embodiments are possible.
  • the seal 15 can be made of plastic and can be designed as a removable cover or as a cell-permeable grid.
  • the lower seal 16 likewise prevents the cellulose mixture 2 from passing through and allows the cell suspension to pass through and is advantageously designed as a cell-permeable plastic grid.
  • the special filter or filters 18 serve, in analogy to the function of the filter 4 in FIG. 1, for post-filtration. They can be designed as a cellulose or polycarbonate membrane with mesh sizes between 3 and 8 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m, or as a cellulose ester mixture, MF from Nuclepore, USA.
  • the filter pad 20 is also expediently a cell-permeable plastic grid.
  • the reference number 19 denotes a conically tapered sealing wall which deliberately narrows the filter space downwards and ensures a firm fit and a solid peripheral seal of the special filter (s) 18.
  • the exit opening 21 adjoining at the bottom is the exit point for the fraction of the pure mature and immature erythrocyte suspension. It is preferably closable.
  • the preferred size standard of the Connection is: Luer or Record.
  • the cell separation device 22 is made of plastic or glass. In a preferred embodiment, the outer diameter ⁇ is between 10 and 12 mm; the height b (without taking into account the inlet opening 14 designed as a socket) between 13 and 15 mm. In this simple variant of a cell separation device, shown in FIG.
  • a syringe containing the sample suspension for example a disposable syringe with a volume of 2 or 5 ml
  • a syringe containing the sample suspension for example a disposable syringe with a volume of 2 or 5 ml
  • the cell suspension is slowly and carefully pressed through the device 22 and the separated cells are collected in a collecting vessel (not shown in FIG. 2).
  • the cell separation device 22 shown in FIG. 2 represents an optimized design variant as a spatial form. Only structural changes to what is shown are within the scope of the present invention, insofar as the sequence in the process sequence is maintained while maintaining the essential features: cellulose mixture cell separation and post-filtering using a special filter (n) is observed.

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Abstract

Procédé automatisé d'essais ''in vivo'' sur des micronoyaux pour l'analyse de la moelle osseuse et du sang périphérique chez toutes les espèces concernées. On sépare les cellules hématopoïétiques contenant des noyaux par filtration en colonne, la suspension passant comme dans une chromatographie en colonne. Les érythrocytes jeunes ou mûrs ainsi séparés sont soumis à un processus du type "percoll" pour purifier ou enrichir les érythrocytes jeunes (réticulocytes), ensuite ils sont filtrés, puis applatis et positionnés de manière homogène sur des supports traités à la polylysine par cytocentrifugation, puis teints et enfin soumis à un processus entièrement automatisé d'analyse d'image microscopique.Automated process of "in vivo" tests on micronuclei for the analysis of bone marrow and peripheral blood in all the species concerned. The hematopoietic cells containing nuclei are separated by column filtration, the suspension passing as in column chromatography. The young or mature erythrocytes thus separated are subjected to a "percoll" type process to purify or enrich the young erythrocytes (reticulocytes), then they are filtered, then flattened and positioned homogeneously on supports treated with polylysine by cytocentrifugation, then dyed and finally subjected to a fully automated microscopic image analysis process.

Description

Automatisiertes "in vivo"-Mikrokerntest-Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung desselbenAutomated "in vivo" micronucleus test method and device for carrying it out
Die Erfindung betrifft ein automatisiertes "in vivo"-Mikrokern- testverfahren bei Säugern, insbesondere beim Menschen sowie bei Ratten und Mäusen, sowie eine entsprechende Präparationsvorrich¬ tung zur Durchführung desselben. Der Mikrokerntest ist ein "in vivo"-Test zur Detektion von agenz-induzierten Chromosomenschäden und Schäden des Spindelapparates. Hierfür werden erythrozyten- artige Zellen des Knochenmarks oder des peripheren Blutes von Säugern auf mikrokernhaltige Zellen untersucht. Am häufigsten wird der Mikrokerntest im Knochenmark der Maus nach der modifizierten Methode von W. Schmid angewendet, vgl. Mutation Res., 31 (1975), 9-15. Dabei untersucht man mit Hilfe eines Mikroskops die von Hand hergestellten Knochenmark-Ausstriche auf mikrokernhaltige poly- chromatophile Erythrozyten. Dieser Standardtest spielt eine große Rolle in der industriellen Toxikologie, um das genotoxische Potential von neuen chemischen Verbindungen, z.B. Phar aka, abzu¬ schätzen. Der Mikrokerntest im Maus-Knochenmark ist heute als wichtiger Genotoxizitätstest weltweit akzeptiert, und zwar sowohl seitens der Fachwelt als auch von seiten der Registrierungsbehör¬ den. Da die Knochenmark-Ausstriche alle Zeiltypen der Hämatopoese ent¬ halten, ist für die Mikrokernanalyse speziell ausgebildetes Fach¬ personal erforderlich. Hierin zeigt sich bereits die Problematik dieses Standardtests. Diese anspruchsvollen Untersuchungen sind zudem sehr zeitaufwendig und ermüdend, weil mikrokernhaltige Zel¬ len ein sehr seltenes Ereignis sind. Dies bedeutet, daß nur 1 bis 2 mikrokernhaltige Zellen pro 1000 polychromatophile Erythrozyten bei Testkontrollen auftreten. Um statistisch eine Verdopplung ge¬ genüber einem Kontrollwert nachweisen zu können, müßten minde¬ stens 4000 Zellen pro Spezies untersucht werden. Dies ist aber in der Praxis aus ökonomischen Gründen serienmäßig nicht durchführ¬ bar. Deshalb ist man dazu übergegangen - und zwar auf Kosten der Sensitivität dieses Tests -, sich auf die Analyse einer Stichpro¬ bengröße von etwa 1000 Zellen pro Spezies zu beschränken. Dieses Vorgehen ist in jüngster Zeit von der internationalen Fachwelt mehrfach scharf kritisiert worden, wobei eine drastische Erhöhung der zu analysierenden Zellzahl gefordert wurde, um damit eine höhere Sensitivität des Tests zu erreichen. Diese Forderung ist jedoch aus ökonomischen Gründen nur dann realisierbar, wenn die Mikrokernanalyse automatisiert werden kann.The invention relates to an automated "in vivo" microkernel test method in mammals, in particular in humans, and in rats and mice, and a corresponding preparation device for carrying out the same. The micronucleus test is an "in vivo" test for the detection of agent-induced chromosome damage and damage to the spindle apparatus. For this purpose, erythrocyte-like cells of the bone marrow or peripheral blood of mammals are examined for cells containing micronuclei. The micronucleus test in the bone marrow of the mouse is most frequently used according to W. Schmid's modified method, cf. Mutation Res., 31 (1975), 9-15. With the help of a microscope, the hand-made bone marrow smears are examined for micronucleated polychromatophilic erythrocytes. This standard test plays a major role in industrial toxicology in order to estimate the genotoxic potential of new chemical compounds, for example Phar aka. The micronucleus test in the mouse bone marrow is now accepted worldwide as an important genotoxicity test, both by the professional community and by the registration authorities. Since the bone marrow smears contain all cell types of hematopoiesis, specially trained specialist personnel are required for microkernel analysis. This already shows the problems with this standard test. These demanding examinations are also very time-consuming and tiring because cells containing micro-nuclei are a very rare event. This means that only 1 to 2 cells containing micronuclei per 1000 polychromatophilic erythrocytes appear in test controls. In order to be able to statistically demonstrate a doubling compared to a control value, at least 4,000 cells per species would have to be examined. In practice, however, this cannot be carried out in series for economic reasons. For this reason, the move has been made - at the expense of the sensitivity of this test - to limit the analysis to a sample size of approximately 1000 cells per species. This procedure has recently been sharply criticized by international experts, requiring a drastic increase in the number of cells to be analyzed in order to achieve a higher sensitivity of the test. For economic reasons, however, this requirement can only be met if the microkernel analysis can be automated.
Obwohl verschiedentlich intensive Anstrengungen unternommen wur¬ den, konnte bis dato keine zuverlässige vollautomatische Mikro¬ kernanalyse für klassische Knochenmark-Ausstriche entwickelt wer¬ den, die auch den Ansprüchen der industriellen Toxikologie genügen würde. Die Hauptschwierigkeiten bei der Automatisierung liegen einerseits in der schwierigen Differenzierung der vielen hämato- poetischen Zellvorstadien und andererseits im Vorkommen von artefakt-produzierendem Zelldebris im Gesamtknochenmark. Ein wei¬ terer Nachteil der "klassischen" Methode ist ihre beschränkte An- wendungsmöglichkeit. Es können nämlich nur diejenigen Säuger- Spezies verwendet werden, deren Knochenmark keine artefakt¬ produzierenden leukozytären Granula aufweisen. Aus diesem Grunde läßt sich das Standardverfahren beispielsweise für Ratten nicht anwenden. Dies ist ein großer Nachteil, weil gerade die Ratte das Hauptmodell der industriellen Toxikologie schlechthin darstellt. Auch hieraus ergibt sich die große Forderung der Fachwelt, daß ein "routinefähiger" Mikrokerntest für Ratten-Knochenmark eingeführt werden kann. Ein solcher Test könnte sogar parallel zu den anderen Toxizitätsprüfungen an denselben Tieren durchgeführt werden, was auch unter dem Aspekt des Tierschutzes von eminenter Bedeutung wäre.Although intensive efforts have been made on various occasions, it has not been possible to date to develop a reliable, fully automatic micronucleus analysis for classic bone marrow smears which would also meet the requirements of industrial toxicology. The main difficulties with automation lie on the one hand in the difficult differentiation of the many hematopoietic cell pre-stages and on the other hand in the occurrence of artifact-producing cell debris in the total bone marrow. Another disadvantage of the "classic" method is its limited use possibility of application. Namely, only those mammal species can be used whose bone marrow have no artifact-producing leukocytic granules. For this reason, the standard method cannot be used for rats, for example. This is a major disadvantage because the rat is the main model of industrial toxicology. This also gives rise to the great demand among experts that a "routine" micronucleus test for rat bone marrow can be introduced. Such a test could even be carried out in parallel to the other toxicity tests on the same animals, which would also be of eminent importance in terms of animal welfare.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikro- kerntest-Verfahren zu entwickeln, das für alle relevanten Spezies kompatibel ist und das die Nachteile der bisher bekannten rein manuellen Verfahren nicht mehr aufweist.It is therefore the object of the present invention to develop a micronucleus test method which is compatible for all relevant species and which no longer has the disadvantages of the previously known purely manual methods.
Diese Aufgabe wird bei einem Mikrokerntest-Verfahren der im Ober¬ begriff des Hauptanspruchs angegebenen Art durch die im Kenn¬ zeichen desselben stehenden Merkmale gelöst. Weitere Ausgestaltun¬ gen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie Präparationsvorrich¬ tungen zur Durchführung dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 23 beschrieben.In a micronucleus test method of the type specified in the preamble of the main claim, this object is achieved by the features in the characterizing part of the same. Further refinements of the method according to the invention and preparation devices for carrying out this method are described in claims 2 to 23.
Die wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung bestehen darin, daß eine Erhöhung der Sensitivität des klassischen Mikro- kerntests im Maus-Knochenmark erzielt werden konnte und daß vor allem die Adaptierbarkeit des neuen Verfahrens für Untersuchungen des Knochenmarks auch der Ratte gegeben ist. In der Fig. 1 ist in rein schematischer Darstellung im Querschnitt eine erste erfindungsgemäße Vorrichtung für die Separation von zu untersuchenden Zellen aus dem Knochenmark bzw. dem peripheren Blut von Säugern (Mensch; Maus, Ratte, etc.) dargestellt.The main advantages of the present invention are that an increase in the sensitivity of the classic micronucleus test in the mouse bone marrow could be achieved and that above all the adaptability of the new method for examining the bone marrow is also given to the rat. 1 shows, in a purely schematic representation in cross section, a first device according to the invention for the separation of cells to be examined from the bone marrow or peripheral blood of mammals (human; mouse, rat, etc.).
An einem Stativ 12 ist eine vertikale Säule aus Glas oder Kunststoff befestigbar, beispielsweise eine Einweg-Spritze 7 mit nach unten weisender, zentral angesetzter Kanüle 9. Die Füllung der Spritze 7 besteht aus einem Zellulose-Gemisch 2 mit definier¬ ter Säulenhöhe. Oberhalb dieses Gemisches befindet sich ein Frei¬ raum 1 für die Aufnahme der zu separierenden Probensuspension 13, die eine Trägerflüssigkeit, beispielsweise eine isotonische Lösung oder ein fötales Kälberserum, enthält. Ein Deckel 11 schließt den Freiräum 1 nach oben hin ab. Unterhalb des Zellulose-Gemisches 2 befindet sich mindestens eine Schicht von Filterpapier 8. Die Spritze 7 weist im Bereich ihrer Kanüle 9 ein Filterreservoir 4a auf, in dem ein oder mehrere Filter 4 der Mascheπweite zwischen 5 und 20 μm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 μm, vorgesehen sind. Das Filterreservoir 4a ist vorzugsweise als Einzelbauteil ausge¬ bildet und kann dementsprechend auf die Kanüle 9 der Spritze 7 paßgenau aufgeschoben werden. Es ist aber auch möglich, die Spritze 7 zusammen mit dem Filterreservoir einstückig auszubilden. Schließlich ist ein Auffangbehälter 5 für das Eluat δ vorgesehen, das aus einer Suspension reifer und unreifer Erythrozyten besteht. Der Auffangbehälter 5 kann so dimensioniert sein, daß er mit der Einweg-Spritze 7 - beispielsweise durch Aufschieben - lösbar verbunden werden kann. Er kann Luftdurchtrittsöffnungen 10 aufwei¬ sen. Dadurch wird sichergestellt, daß bei angesetztem Behälter 5 nach dem Einfüllen einer Probensuspension 13 in den Freiraum 1 ein langsames Durchsickern dieser Substanz durch die einzelnen Filter¬ regionen 2 - 8 - 4 mit normalem Druckausgleich möglich ist.A vertical column made of glass or plastic can be fastened to a stand 12, for example a disposable syringe 7 with a centrally positioned cannula 9 pointing downwards. The filling of the syringe 7 consists of a cellulose mixture 2 with a defined column height. Above this mixture there is a free space 1 for receiving the sample suspension 13 to be separated, which contains a carrier liquid, for example an isotonic solution or a fetal calf serum. A lid 11 closes the free space 1 towards the top. Below the cellulose mixture 2 there is at least one layer of filter paper 8. In the area of its cannula 9, the syringe 7 has a filter reservoir 4a in which one or more filters 4 with a mesh size between 5 and 20 μm, preferably between 10 and 12 μm , are provided. The filter reservoir 4a is preferably formed as an individual component and can accordingly be pushed onto the cannula 9 of the syringe 7 with a precise fit. However, it is also possible to form the syringe 7 in one piece together with the filter reservoir. Finally, a collecting container 5 is provided for the eluate δ, which consists of a suspension of mature and immature erythrocytes. The collecting container 5 can be dimensioned such that it can be detachably connected to the disposable syringe 7, for example by being pushed on. It can have air passage openings 10. This ensures that with the container 5 attached, after filling a sample suspension 13 into the free space 1, a slow leakage of this substance through the individual filter regions 2 - 8 - 4 with normal pressure compensation is possible.
Der Verfahrensablauf ist folgender: Nach Einfüllen der Proben¬ suspension 13 - im vorliegenden Fall sei Ratten-Knochenmark einge¬ geben - dringt die Probe in das Zellulose-Gemisch 2 ein. Das Zellulose-Gemisch besteht aus mikrokristalliner Zellulose und α-Zellulose im Gewichtsverhältnis von vorzugsweise 1 : 1. Für be¬ stimmte Anwendungsfälle kann sich dieses Gewichtsverhältnis auch zwischen 1,5 : 1 und 1 : 1,5 bewegen. Zwar wurde von Beutler et al bereits eine ähnliche Methode entwickelt; diese beschränkte sich aber lediglich auf peripheres Blut und wurde zudem nie im Zusam¬ menhang mit einem Mikrokerntest verwendet, vgl. J. Lab. Clin. Med. 88 (2), 1976, 328-333.The procedure is as follows: after filling in the sample suspension 13 - in the present case rat bone marrow is entered - the sample penetrates into the cellulose mixture 2. The cellulose mixture consists of microcrystalline cellulose and α-cellulose in a weight ratio of preferably 1: 1. For certain applications, this weight ratio can also vary between 1.5: 1 and 1: 1.5. A similar method has already been developed by Beutler et al; however, this was limited only to peripheral blood and, moreover, was never used in connection with a micronucleus test, cf. J. Lab. Clin. Med. 88 (2), 1976, 328-333.
Als mikrokristalline Zellulose kann beispielsweise "Sigmacell type 50" der Firma SIGMA, St. Louis, USA, eingesetzt werden; als α-Zellulose in Faserform ist ebenfalls ein Produkt der genannten Firma verwendbar. Bei.de Zellulose-Modifi ationen werden vor dem Einlegen in die vertikale Säule mehrere Minuten lang kräftig durch Schütteln gemischt. Die "Säulen-Höhe" des Zellulose-Gemisches 2 und ihre Packungsdichte in der Spritze 7 ist für den Erfolg des Präparationsverfahrens von großer Bedeutung."Sigmacell type 50" from SIGMA, St. Louis, USA, for example, can be used as the microcrystalline cellulose; a product of the company mentioned can also be used as α-cellulose in fiber form. Bei.de cellulose modifications are shaken vigorously for several minutes before being placed in the vertical column. The "column height" of the cellulose mixture 2 and its packing density in the syringe 7 is of great importance for the success of the preparation process.
Das im Behälter 5 aufgefangene Eluat 6 enthält ausschließlich die zwei gewünschten Zelltypen, nämlich die unreifen (polychromato- philen) und die reifen Erythrozyten. Es wurde also eine totale Elimination der kernhaltigen hämatopoetisehen Zellen erreicht.The eluate 6 collected in the container 5 contains only the two desired cell types, namely the immature (polychromatophilic) and the mature erythrocytes. A total elimination of the nucleated hematopoietic cells was thus achieved.
Die Zellen werden - im Falle des Knochenmarks von Ratten - nunmehr mittels eines Percoll-Schrittgradientenverfahrens gereinigt. Die¬ ser Verfahrensschritt ist für den Mikrokerntest im Ratten-Knochen¬ mark essentiell (Entfernung der restlichen leukozytären Granula). Für das genannte Reinigungsverfahren werden die von Rennie et al in Klin. Chem. Acta, 98 (1979), Seiten 119-125, beschriebenen Lösungen verwendet. In ein Zentrifugierröhrchen, beispielsweise mit einem Volumen von 5 ml, werden zunächst 1,5 ml einer 80 %igen Percoll-Lösung eingegeben. Darüber werden 1,5 ml einer 30 %igen Percoll-Lösung geschichtet. Schließlich werden darüber 0,5 ml der in dem Eluat 6 befindlichen unreifen und reifen Erythrozyten ge¬ geben und das Ganze sodann zentrifugiert. Im Grenzschicht-Bereich zwischen der 80 %igen und der 30 %igen Percoll-Lösung sammeln sich die zu untersuchenden Zellen an. Um für die nachfolgende mikroskopische Auswertung verwendbare "Mi roobjekte" zu haben, müssen die zu untersuchenden Zellen sehr flach auf dem Objekt¬ träger angeordnet sein. Daher werden die Zellen mittels Zyto- zentrifugation auf mit Polylysin behandelte Objektträger gebracht. Die derart abgeflachten und homogen verteilten Zellen können so¬ dann mittels der bekannten Standardfärbung nach May- Grünwald/Giemsa eingefärbt werden. Es ist indes auch eine Einfär- bung mit Fluoreszenzfarbstoffen, vorzugsweise mit Acridin-Orange, möglich. Danach sind die so separierten, präparierten und markier¬ ten Zellen einer sich anschließenden automatischen quantitiv- mikroskopisehen Bildanalyse zugänglich.In the case of rat bone marrow, the cells are now cleaned using a Percoll step gradient method. This process step is essential for the micronucleus test in the rat bone marrow (removal of the remaining leukocytic granules). The solutions described by Rennie et al in Klin. Chem. Acta, 98 (1979), pages 119-125 are used for the cleaning process mentioned. In a centrifuge tube, for example with a volume of 5 ml, 1.5 ml of an 80% Percoll solution are first introduced. 1.5 ml of a 30% Percoll solution are layered on top. Finally, 0.5 ml of the immature and mature erythrocytes in the eluate 6 are added and the whole is then centrifuged. The cells to be examined accumulate in the boundary layer area between the 80% and the 30% Percoll solution. To for the following To have microscopic evaluation usable "micro objects", the cells to be examined must be arranged very flat on the slide. The cells are therefore placed on slides treated with polylysine by cytocentrifugation. The flattened and homogeneously distributed cells in this way can then be colored using the known May-Grünwald / Giemsa standard staining. However, coloring with fluorescent dyes, preferably with acridine orange, is also possible. The cells which have been separated, prepared and labeled in this way are then available for subsequent automatic quantitative microscopic image analysis.
Anstelle des Percoll-Reinigungs-Prozesses, wie er für Proben von Ratten-Knochenmark vorgesehen ist, tritt bei Proben aus peri- pherem Blut ein Anreicherungs-Prozess der polychromatophilen Erythrozyten mittels eines modifizierten Percoll-Schrittgradien¬ tenverfahrens. Die Vorrichtung zur Durchführung dieses Anreiche¬ rungs-Verfahrens unterscheidet sich von derjenigen zur Reinigung von Ratten-Knochenmark-Proben nur dadurch, daß anstelle der zu¬ erst einzugebenden 80 %igen Percoll-Lösung 1,5 ml einer 55-65 %igen Percoll-Lösung eingegeben werden.Instead of the Percoll purification process, as is provided for samples of rat bone marrow, an enrichment process of the polychromatophilic erythrocytes occurs in samples from peripheral blood by means of a modified Percoll step gradient method. The device for carrying out this enrichment method differs from that for cleaning rat bone marrow samples only in that instead of the 80% Percoll solution to be entered first, 1.5 ml of a 55-65% Percoll solution. Solution can be entered.
Die abschließende vollautomatische Mikrokernanalyse von großen Zeilzahlen ist mit Hilfe des bei WILD-LEITZ entwickelten Bild¬ analysesystems MIAMED möglich. Wichtigste Voraussetzung hierzu ist die vorausgehende und weiter oben bereits beschriebene Eliminie¬ rung der kernhaltigen Zellen der Hämatopoese mit Hilfe der er- wähnten Präparations- bzw. Separations-Methode nach Art einer "Säulenchromatographie".Das MIAMED besteht einerseits aus dem automatisierten WILD-LEITZ-Mikroskop MEDILUX und andererseits aus dem Bildverarbeitungssystem MIAC (Modular Image Analysis Computer) .The final fully automatic micro-core analysis of large numbers of lines is possible with the help of the MIAMED image analysis system developed by WILD-LEITZ. The most important prerequisite for this is the previous elimination of the nucleated cells of hematopoiesis described above with the help of the mentioned preparation or separation method in the manner of a "column chromatography". The MIAMED consists on the one hand of the automated WILD-LEITZ microscope MEDILUX and on the other hand of the image processing system MIAC (Modular Image Analysis Computer).
Das Mikroskop verfügt über einen Scanning-Tisch, der bis zu sechzehn Objektträger aufnehmen kann, einen Fokustrieb, eine Lampenregelung und einen Objektivrevolver. Tisch, Fokus und Objek¬ tivrevolver sind motorgetrieben und werden per Software über den MIAC gesteuert. Eine an Mikroskop und MIAC adaptierte Videokamera ermöglicht die elektronische Aufnahme der Mikroskop-Bilder und deren Übergabe an das Bildverarbeitungs-System.The microscope has a scanning table that can hold up to sixteen slides, a focus drive, lamp control and a nosepiece. The table, focus and objective revolver are motor-driven and are controlled by software via the MIAC. A video camera adapted to the microscope and MIAC enables the microscope images to be recorded electronically and transferred to the image processing system.
Der MIAC ist ein modulares bus-orientiertes System von großer Flexibilität. Ein neuartiges Bus-System gestattet eine schnelle und flexible Kommunikation zwischen den diversen Modulen des MIAC. Bei den Modulen handelt es sich unter anderem um Bildspeicher und spezielle Bildprozessoren zur schnellen Verarbeitung von Grau- und Binärbildern. Die Architektur des Systems ist für sogenanntes Pipeline-Processing ausgelegt, das heißt für eine kontinuierliche und parallele Verarbeitung der von der Kamera angelieferten Bil¬ der. Die Modularität ermöglicht darüber hinaus eine problemange¬ paßte Konfigurierung des Systems im Sinne der Erzielung eines optimalen Preis-/Leistungs-Verhältnisses.The MIAC is a modular bus-oriented system of great flexibility. A new type of bus system enables fast and flexible communication between the various MIAC modules. The modules include image memories and special image processors for fast processing of gray and binary images. The architecture of the system is designed for so-called pipeline processing, that is to say for continuous and parallel processing of the images delivered by the camera. The modularity also enables the system to be configured to suit the problem in order to achieve an optimal price / performance ratio.
Das Programmpaket zur automatischen Detektion von Mikrokernen ist in eine Software-Architektur eingebettet, die speziell für sogenannte "rare evenf'-Strategien ausgelegt ist und an die schnelle MIAMED-Pipeline-Struktur angepaßt ist. Entsprechend dieser Strategie hat es der Benutzer mit den drei Programmte len Dateneingabe, automatische Detektion und Ergeb¬ nisanalyse zu tun. Hinzu kann noch ein sogenanntes "superuser"- Programm kommen, das dem Routineanwender nicht zugänglich ist. Es dient der Einstellung spezieller Systemparameter.The program package for the automatic detection of micronuclei is embedded in a software architecture that is specially designed for so-called "rare evenf" strategies and is adapted to the fast MIAMED pipeline structure. According to this strategy, the user with the three Programmte len data entry, automatic detection and do resulting ¬ nisanalyse. There may also be a so-called "superuser" program, which is not accessible to the routine user. It is used to set special system parameters.
Im Dateneingabeteil sind die interaktiven Aktionen des Benutzers neben der Einstellung allgemeiner Suchparameter auf die Eingabe einiger spezieller problemabhängiger Parameter beschränkt, die den automatischen Suchablauf des Systems steuern. Wesentliche Eingabe¬ daten sind beispielsweise Vorgabewerte für die Suchbereiche auf den Objektträgern, die Einstellung der Fokusebene des Startfeldes und die Angabe der Anzahl auszuwertender Zellen.In the data entry section, the interactive actions of the user are limited to the setting of general search parameters to the entry of some special problem-dependent parameters that control the automatic search process of the system. Essential input data are, for example, default values for the search areas on the slides, the setting of the focus level of the start field and the specification of the number of cells to be evaluated.
Bei der automatischen Detektion handelt es sich um ein Programm, das unüberwacht unter Benutzung der Eingabedaten vollautomatisch die Objektträger spiralartig Bildfeld für Bildfeld nach mikrokern- haltigen Zellen durchmustert. Es setzt sich zusammen aus einem problemunabhängigen "Detektionsrahmen", der für die exakte An- steuerung und Justierung der Bildfelder zuständig ist, und einem problemspezifischen "Detektionskern", der durch entsprechende Algorithmen die Extraktion der gewünschten Bildinformation garan¬ tiert. Alle im automatischen Suchlauf gewonnenen Daten, insbeson¬ dere die Positionen der detektierten mikrokernhaltigen Zellen, werden - wie zuvor schon die Eingabedaten - in einer speziellen Datenbank abgelegt. Zur Ausgabe aktueller Zwischenergebnisse kann der Suchlauf jederzeit seitens des Anwenders unterbrochen werden. Darüber hinaus hat der Anwender die Möglichkeit, während der Unterbrechung die Anzeige zur graphischen Darstellung der einzel¬ nen Detektionsschritte einzuschalten, um so die Parameterwahl zu überprüfen und gegebenenfalls zu modifizieren.Automatic detection is a program that, without supervision, uses the input data to automatically and fully scan the slides spirally field by field for cells containing micronuclei. It is composed of a problem-independent "detection frame", which is responsible for the exact control and adjustment of the image fields, and a problem-specific "detection core", which guarantees the extraction of the desired image information by appropriate algorithms. All data obtained in the automatic search run, in particular the positions of the detected micronucleus-containing cells, are stored in a special database, as was the input data previously. The search can be interrupted at any time by the user to output current interim results. In addition, the user has the option of Interruption turn on the display for the graphical representation of the single ¬ NEN detection steps, so as to verify the selection of parameters and to modify, if necessary.
Ein Programmteil für die Auswertung und Analyse der automatisch detektierten mikrokernhaltigen Zellen vervollständigt das Pro¬ grammpaket. Das Analyseprogramm, dessen allgemeiner Teil die schnelle Wiedervorführung der detektierten Zellen erlaubt, enthält darüber hinaus einen speziellen Teil zur problemspezifischen Ana¬ lyse der erzeugten Daten. Dadurch wird es möglich, alle stati¬ stisch relevanten Daten so aufzubereiten und zu formatieren, daß sie auch von kommerziell verfügbaren PC-Programmen weiterbearbei¬ tet werden können.A program part for the evaluation and analysis of the automatically detected micronucleus-containing cells completes the program package. The analysis program, the general part of which enables the detected cells to be quickly demonstrated again, also contains a special part for problem-specific analysis of the generated data. This makes it possible to prepare and format all statistically relevant data in such a way that they can also be processed further by commercially available PC programs.
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es erstmals möglich, den Mikro¬ kerntest im Knochenmark der Ratte zuverlässig durchzuführen. Dies ist deswegen möglich, weil durch die neue Säulenmethode und die anschließende Reinigung der Zellen mittels des Percoll-Schritt- gradientenverfahrens alle artefakt-produzierenden leukozytären Granula entfernt werden können, so daß eine hochwertige Zellprä- paration resultiert. Diese kann dann nach Wahl - entweder manuell oder vollautomatisch mit Hilfe eines speziellen Bildanalysever¬ fahrens - auf mikrokernhaltige Erythrozyten untersucht werden.With the present method it is possible for the first time to reliably carry out the micronucleus test in the bone marrow of the rat. This is possible because the new column method and the subsequent cleaning of the cells using the Percoll step gradient method can remove all artifact-producing leukocytic granules, so that a high-quality cell preparation results. This can then be examined - either manually or fully automatically with the aid of a special image analysis method - for erythrocytes containing micronuclei.
Alle hier beschriebenen neuen Techniken sind nicht nur für das Knochenmark anwendbar, sondern auch für Untersuchungen des peri¬ pheren Bluts von Säugern. Als Besonderheit können hier die poly- chro atophilen Erythrozyten (Retikulozyten) mit Hilfe eines Percoll-Schrittgradientenverfahrens angereichert werden; bei der Spezies "Ratte" z.B. von ursprünglich 2 bis 5 % auf über 80 %. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der guten Adaptierbarkeit für andere Säuger-Spezies, einschließlich des Menschen. Die Genotoxizitäts-Prüfung in vivo ist damit wesent¬ l ch flexibler geworden.All of the new techniques described here can be used not only for the bone marrow, but also for examinations of the peripheral blood of mammals. As a special feature, the polychro atophilic erythrocytes (reticulocytes) can be enriched using a Percoll step gradient method; in the "rat" species, for example, from originally 2 to 5% to over 80%. Another advantage of the method according to the invention is that good adaptability to other mammalian species, including humans. The genotoxicity test in vivo has thus become considerably more flexible.
Die in der Fig. 1 schematisch dargestellte Säulenanordnung ist hier als Laborgerät konzipiert. Es ist selbstverständlich auch mögl ch, diese Anordnung in einstückiger Form als "Einweg-Set" 11-7-4-6 vorzusehen. Damit ist eine größere Flexibilität in der Handhabung an jedwedem Einsatzort gegeben. Der Deckel der Einweg- Set-Vorrichtung hat jedoch eine andere Innen-Raumform als bei der in der Figur 1 dargestellten Laboranordnung, da er als zylin¬ drischer Innenstopfen ausgebildet ist, der den gesamten Freiraum 1 einschließlich des Teilvolumens 13 einnimmt. Auf diese Weise ist sichergestellt, daß das Präparations-Set vor dessen Einsatz eine konstante, reproduzierbare, definiert einstellbare Säulen-Füllhöhe des Zellulose-Gemisches 2 aufweist. Die Menge des einzusetzenden Zellulose-Gemisches 2 ist speziesabhängig. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die Beschickung der Einweg-Spritze 7 mit Zellulose-Gemisch-Füllungen und/oder mit Filterpapier(en) 8 und/oder mit Filtermaterial (4) für die jeweils zu untersuchende Spezies zu optimieren.The column arrangement shown schematically in FIG. 1 is designed here as a laboratory device. It is of course also possible to provide this arrangement in one piece as a "disposable set" 11-7-4-6. This gives greater flexibility in handling at any location. However, the lid of the disposable set device has a different interior shape than that of the laboratory arrangement shown in FIG. 1, since it is designed as a cylindrical inner plug which takes up the entire free space 1 including the partial volume 13. This ensures that the preparation set has a constant, reproducible, defined adjustable column filling height of the cellulose mixture 2 before it is used. The amount of the cellulose mixture 2 to be used depends on the species. It is within the scope of the present invention to optimize the loading of the disposable syringe 7 with cellulose mixture fillings and / or with filter paper (s) 8 and / or with filter material (4) for the species to be examined in each case.
In Fig. 2 wird in schematischer Darstellung im Querschnitt eine vereinfachte Variante gezeigt, die ebenfalls als Einweg-Set ausge¬ bildet ist und eine kompakte Zellseparationsvorrichtung 22 dar¬ stellt. Die vorzugsweise rotationssymmetrische Vorrichtung weist eine Eingangsöffnung 14 auf, in die die Kanüle beispielsweise einer Einweg-Spritze eingeführt werden kann. In ihrem mittleren Bereich befindet sich das Zellulose-Gemisch 2, das bereits in Fig. 1 näher beschrieben wurde. Dieses Gemisch wird mittels einer oberen Abdichtung 15 sowie einer unteren Abdichtung 16 in dem mittleren Bereich der Vorrichtung 22 gehalten. Die obere Abdich¬ tung 15 verhindert das Austreten des Zellulose-Gemisches 2 und erlaubt gleichzeitig den Durchtritt der zu separierenden Proben¬ suspension. Dabei sind zwei Ausführungsformen möglich. Die Ab¬ dichtung 15 kann aus Kunststoff bestehen und als entfernbarer Deckel oder als zelldurchlässiges Gitter ausgebildet sein. Die un¬ tere Abdichtung 16 verhindert ebenfalls den Durchtritt des Zellu¬ lose-Gemisches 2 und erlaubt den Durchtritt der Zellsuspension und ist vorteilhafterweise als zelldurchlässiges Kunststoffgitter aus¬ gebildet. Der Verbindungsteil 17 grenzt als Einschnürungsbereich die das Zellulose-Gemisch 2 enthaltene Kammer von der darunter befindlichen Filterkammer peripher ab und dient gleichzeitig zur Befestigung und peripheren Abdichtung eines oder mehrerer Spezial¬ filter 18, die auf einer Filterauflage 20 aufliegen. Der oder die Spezialfilter 18 dienen in Analogie zu der Funktion des Filters 4 in Fig. 1 der Nachfiltrierung. Sie können als Zellulose- oder Polycarbonatmembran mit Maschenweiten zwischen 3 und 8 μm, vor¬ zugsweise 5 μm, oder als Zelluloseestergemisch, MF von Nuclepore, USA, ausgebildet sein. Auch die Filterauflage 20 ist zweckmäßiger¬ weise ein zelldurchlässiges Kunststoffgitter. Mit der Bezugsziffer 19 ist eine sich konisch verjüngende Abdichtungswand bezeichnet, die den Filterraum nach unten hin gezielt einengt und für einen festen Sitz sowie für eine solide periphere Abdichtung der/des Spezialfilter(s) 18 sorgt. Die sich nach unten hin anschließende Ausgangsöffnung 21 ist der Austrittsort für die Fraktion der reinen reifen und unreifen Erythrozyten-Suspension. Sie ist vor¬ zugsweise verschließbar.Die bevorzugte Größennorm des Anschlusses ist: Luer oder Record. Die Zellseparationsvorrichtung 22 besteht aus Kunststoff oder aus Glas. Der Außendurchmesser α beträgt bei einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 10 und 12 mm; die Höhe b (ohne Berücksichtigung der als Stutzen ausgebil¬ deten Eingangsöffnung 14) zwischen 13 und 15 mm. Bei dieser in Fig. 2 dargestellten, als Einweg-Set konzipierten Einfach-Variante einer Zellseparationsvorrichtung wird zunächst eine die Proben¬ suspension enthaltende Spritze, beispielsweise eine Einwegspritze mit 2 oder 5 ml Volumen, in die Eingangsöffnung 14 eingeführt. Dann wird die Zellsuspension durch manuelles Drücken des Spritzen¬ kolbens langsam und vorsichtig durch die Vorrichtung 22 gepreßt und die separierten Zellen in einem in Fig. 2 nicht dargestellten Auffanggefäß aufgefangen. Dieses vereinfachte Verfahren ist zeit¬ sparend und braucht im Gegensatz zu dem Verfahrensablauf, wie er im Zusammenhang mit der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung be¬ schrieben ist, kein zusätzliches Elutionsmittel . Die in Fig. 2 dargestellte Zellseparationsvorrichtung 22 stellt als Raumform eine optimierte Ausführungs-Variante dar. Lediglich konstruktive Abänderungen des Dargestellten liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung, soweit die Reihenfolge im Verfahrensablauf unter Beibe¬ haltung der essentiellen Merkmale: Zellulosegemisch-Zellseparation und Nachfiltrierung mittels Spezialfilter(n) eingehalten wird. 2 shows a simplified cross-sectional view of a simplified variant, which is also designed as a disposable set and represents a compact cell separation device 22. The preferably rotationally symmetrical device has an inlet opening 14, into which the cannula, for example of a disposable syringe, can be inserted. The cellulose mixture 2, which has already been described in more detail in FIG. 1, is located in its central region. This mixture is by means of a upper seal 15 and a lower seal 16 held in the central region of the device 22. The upper seal 15 prevents the cellulose mixture 2 from escaping and at the same time allows the sample suspension to be separated to pass through. Two embodiments are possible. The seal 15 can be made of plastic and can be designed as a removable cover or as a cell-permeable grid. The lower seal 16 likewise prevents the cellulose mixture 2 from passing through and allows the cell suspension to pass through and is advantageously designed as a cell-permeable plastic grid. The connecting part 17, as a constriction region, peripherally delimits the chamber containing the cellulose mixture 2 from the filter chamber located underneath it, and at the same time serves for fastening and peripheral sealing of one or more special filters 18 which rest on a filter support 20. The special filter or filters 18 serve, in analogy to the function of the filter 4 in FIG. 1, for post-filtration. They can be designed as a cellulose or polycarbonate membrane with mesh sizes between 3 and 8 μm, preferably 5 μm, or as a cellulose ester mixture, MF from Nuclepore, USA. The filter pad 20 is also expediently a cell-permeable plastic grid. The reference number 19 denotes a conically tapered sealing wall which deliberately narrows the filter space downwards and ensures a firm fit and a solid peripheral seal of the special filter (s) 18. The exit opening 21 adjoining at the bottom is the exit point for the fraction of the pure mature and immature erythrocyte suspension. It is preferably closable. The preferred size standard of the Connection is: Luer or Record. The cell separation device 22 is made of plastic or glass. In a preferred embodiment, the outer diameter α is between 10 and 12 mm; the height b (without taking into account the inlet opening 14 designed as a socket) between 13 and 15 mm. In this simple variant of a cell separation device, shown in FIG. 2 and designed as a disposable set, a syringe containing the sample suspension, for example a disposable syringe with a volume of 2 or 5 ml, is first introduced into the inlet opening 14. Then, by manually pressing the syringe plunger, the cell suspension is slowly and carefully pressed through the device 22 and the separated cells are collected in a collecting vessel (not shown in FIG. 2). This simplified process is time-saving and, in contrast to the process sequence as described in connection with the device shown in FIG. 1, does not require any additional eluent. The cell separation device 22 shown in FIG. 2 represents an optimized design variant as a spatial form. Only structural changes to what is shown are within the scope of the present invention, insofar as the sequence in the process sequence is maintained while maintaining the essential features: cellulose mixture cell separation and post-filtering using a special filter (n) is observed.

Claims

A n s p r ü c h e Expectations
1. Automatisiertes "in vivo"-Mikrokerntest-Verfahren bei Säugern, insbesondere beim Menschen sowie bei Ratten und Mäusen, g e k e n n z e i c h n e t durch die folgenden Verfahrens¬ schritte:1. Automated "in vivo" micronucleus test method in mammals, in particular in humans, and in rats and mice, by the following method steps:
(a) Abtrennung der zellkernhaltigen hämatopoetisehen Zellen aus Proben des Knochenmarks bzw. des peripheren Bluts durch Säulenfiltration, wobei(a) Separation of the cell nucleus-containing hematopoietic cells from samples of the bone marrow or peripheral blood by column filtration, wherein
(a^) eine Suspension der jeweiligen Probe, enthaltend eine Trägerflüssigkeit, beispielsweise eine isotonische Lösung oder ein fötales Kälberserum, auf ein in einer Säule befindliches Zellulose-Gemisch, bestehend aus α- Zellulose und mikrokristalliner Zellulose, gegeben wird, (a ) die Suspension das Zellulose-Gemisch durchtränkt und an¬ schließend mit einer isotonischen Lösung eluiert wird, (a3) der durchtretende Teil der Probensuspension sodann auf eine in der Säule befindliche Schicht aus Filterpapier auftrifft und von dort (3 ) einer gezielten Endfilterung mit einer Filtermaschen¬ weite zwischen 5 und 20 μm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 μm, unterzogen wird und(a ^) a suspension of the respective sample containing a carrier liquid, for example an isotonic solution or a fetal calf serum, is added to a cellulose mixture in a column consisting of α-cellulose and microcrystalline cellulose, (a) the suspension the cellulose mixture is impregnated and then eluted with an isotonic solution, (a3) the part of the sample suspension which passes through then hits a layer of filter paper located in the column and from there (3) is subjected to a targeted final filtering with a filter mesh width between 5 and 20 μm, preferably between 10 and 12 μm, and
(as) die derart separierten Zellen, die aus den zu unter¬ suchenden unreifen und reifen Erythrozyten bestehen, in einem Auffanggefäß angesammelt werden;(as) the cells separated in this way, which consist of the immature and mature erythrocytes to be examined, are collected in a collecting vessel;
(b) Anwendung von Schrittgradientenverfahren zur Reinigung bzw. Anreicherung der nach dem Teilschritt (35) erhaltenen Zellmenge, wobei(b) application of step gradient methods for the purification or enrichment of the cell quantity obtained after the partial step (35), wherein
(bi) die Verfahrensstufe der Reinigung im Falle der Separie¬ rung von Knochenmark-Zellen von Ratten und(bi) the process step of cleaning in the case of separation of bone marrow cells from rats and
(b ) die Verfahrensstufe der Anreicherung im Falle der(b) the enrichment process stage in the case of
Separierung von Retikulozyten aus peripherem Blut von Säugern durchzuführen ist;Separation of reticulocytes from peripheral blood of mammals is to be performed;
(c) Filtration der nach den vorhergehenden Verfahrensstufen erhaltenen Zellmengen unter Verwendung von Filtermembranen mit Maschenweiten zwischen 5 und 20 μm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 μm;(c) Filtration of the cell quantities obtained according to the preceding process steps using filter membranes with mesh sizes between 5 and 20 μm, preferably between 10 and 12 μm;
(d) Präparation der zu untersuchenden Zellen auf Objektträgern mittels Zytozentrifugation zur Abflachung der Zellen;(d) preparation of the cells to be examined on slides by means of cytocentrifugation to flatten the cells;
(e) Standard-Färbung der Präparate nach May-Grünwald/Giemsa bzw. mit Fluoreszenzfarbstoffen, vorzugsweise mit Acridin- Orange;(e) standard staining of the preparations according to May-Grünwald / Giemsa or with fluorescent dyes, preferably with acridine orange;
(f) automatische, quantitativ-mikroskopische Bildanalyse der separierten, mikroskopiergerecht präparierten und farblich gekennzeichneten Blutzellen.(f) automatic, quantitative-microscopic image analysis of the separated, microscopically prepared and color-coded blood cells.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß das Gemisch aus α-Zellulose und mikrokri¬ stalliner Zellulose im Gewichts-Verhältnis zwischen 1,5 : 1 und2. The method of claim 1, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t that the mixture of α-cellulose and microcrystalline cellulose in a weight ratio between 1.5: 1 and
1 : 1,5, vorzugsweise jedoch im Verhältnis 1 : 1, vorliegt.1: 1.5, but preferably in a ratio of 1: 1.
3. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Gemisch aus mikrokristallinen Zellulose-Partikeln und ct-Zellulose-Fasern besteht und innig durchmischt und sodann in eine Säule, beispiels¬ weise eine 20 ml-Einweg-Spritze, gegeben wird. 3. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the mixture of microcrystalline cellulose particles and ct-cellulose fibers and thoroughly mixed and then in a column, for example, a 20 ml disposable syringe is given.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Masse des in die Säule eingegebenen Zellulose-Gemisches bei Verwendung einer 20 ml-Spritze mit einem Durchmesser von ca. 18 mm in Abhängigkeit von den jeweils zu präparierenden Säugerspezies-Blutzellen zwi¬ schen 1,0 - 2,0 g beträgt, so daß ein vertikaler Durchdringungsweg zwischen 1 und 2 cm resultiert.4. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the mass of the cellulose mixture entered into the column when using a 20 ml syringe with a diameter of approximately 18 mm depending on the mammalian species blood cells to be prepared in each case is 1.0 - 2.0 g, so that a vertical penetration path between 1 and 2 cm results.
5. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Verfahrensstufe der Reinigung (bj) nach einem "Percoll "-Schrittgradientenverfahren abläuft, wobei in ein Röhrchen, beispielsweise in ein 5 ml-Einweg-Zentrifugier- röhrchen, 1,5 ml einer 80 %igen Percoll-Lösung eingegeben werden, sodann 1,5 ml einer 30 %igen Percoll-Lösung aufgeschichtet und zu¬ oberst 0,5 ml des nach dem Teilschritt {a$) erhaltenen Zellge¬ misches, das die unreife und die reife Erythrozyten-Population enthält, zugegeben werden und das Ganze sodann mit 700 bis 900 g (g = Erdbeschleunigung), vorzugsweise mit 800 g, zentrifugiert wird.5. The method according to claim 1, dadurchgekenn ¬ characterized in that the process step of cleaning (bj) takes place according to a "Percoll" step gradient method, being in a tube, for example in a 5 ml disposable centrifuge tube, 1.5 ml of a 80% Percoll solution are then added, then 1.5 ml of a 30% Percoll solution are layered and 0.5 ml of the cell mixture obtained after the sub-step {a $) containing the immature and the mature erythrocytes -Population contains, are added and the whole is then centrifuged with 700 to 900 g (g = gravitational acceleration), preferably with 800 g.
6. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Verfahrensstufe der Anreicherung der polychromatophilen Erythrozyten nach einem "Percoll"-Schrittgra¬ dientenverfahren abläuft, wobei in ein Röhrchen, beispielsweise in ein 5 ml-Einweg-Zentrifugierröhrchen, eine 55-65 %ige Percoll- Lösung eingegeben wird, sodann 1,5 ml einer 30 %igen Percoll- Lösung aufgeschichtet und zuoberst 0,5 ml des nach dem Teilschritt (as) erhaltenen Zellgemisches, das die unreifen und die reifen Erythrozyten-Populationen enthält, zugegeben werden und das Ganze sodann mit 700 bis 900 g (g = Erdbeschleunigung), vorzugsweise während 10 Minuten mit 800 g, zentrifugiert wird. 6. The method according to claim 1, dadurchgekenn ¬ characterized in that the process step of the enrichment of the polychromatophilic erythrocytes according to a "Percoll" -Schrittgra¬ serving method, wherein in a tube, for example in a 5 ml disposable centrifuge tube, a 55-65% Percoll solution is entered, then 1.5 ml of a 30% Percoll solution are layered and at the top 0.5 ml of the cell mixture obtained after the sub-step (as), which contains the immature and the mature erythrocyte populations, are added and the whole is then centrifuged at 700 to 900 g (g = gravitational acceleration), preferably at 800 g for 10 minutes.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es bei Anwen¬ dung einer kompakten Zellseparationsvorrichtung (22) ohne den im Teilmerkmal (a2) des Hauptanspruchs angegebenen Verfahrens-Teil¬ schritt des Eluierens mittels einer isotonischen Lösung abläuft.7. The method according to at least one of the preceding claims, d a d u r c h g e k e n e z e i c h n e t that when using a compact cell separation device (22) without the partial process step (a2) of the main claim of the main claim of eluting by means of an isotonic solution.
8. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die auf Objektträgern präparierten Blut- zellen auf dem Objekttisch eines automatisierten Mikroskops abge¬ scannt und sodann über eine adaptierte Videokamera an ein Bildver- arbeitungs-System übergeben werden, das eine kontinuierliche und parallele Verarbeitung der von der Kamera gelieferten Bilder durchführt, wobei die drei Programmteile: Dateneingabe, automa¬ tische Detektion und Ergebnisanalyse durchlaufen werden.8. The method according to claim 1, characterized in that the blood cells prepared on specimen slides are scanned on the object table of an automated microscope and then transferred via an adapted video camera to an image processing system which provides continuous and parallel processing of the images supplied by the camera, the three program parts: data input, automatic detection and result analysis being run through.
9. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß mittels der Dateneingabe die Einstellung allgemeiner Suchparameter sowie problemabhängiger Parameter er¬ folgt, wie zum Beispiel die Eingabe von Vorgabewerten für die Suchbereiche auf den Objektträgern, die Einstellung der Fokusebene des Startfeldes und die Angabe der Anzahl der auszuwertenden Zellen.9. The method according to claim 8, characterized in that the setting of general search parameters and problem-dependent parameters is carried out by means of the data input, such as, for example, the input of default values for the search areas on the slides, the setting of the focus level of the start field and the specification of the Number of cells to be evaluated.
10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, d a d u r c h g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß der Objektträger während der auto¬ matischen Detektion unter Benutzung der Eingabedaten vollautoma¬ tisch Bildfeld für Bildfeld nach mikrokernhaltigen Zellen durch¬ mustert wird, wobei einerseits ein problemunabhängiger Detektions- rahmen für die exakte Ansteuerung und Justierung der Bildfelder zuständig ist und andererseits ein problemspezifischer Detektions- kern die Extraktion der gewünschten Bildinformationen sicher¬ stellt. 10. The method according to claim 8 and 9, dadurchge ¬ indicates that the slide during the automatic detection using the input data is fully screened frame by frame for cells containing micronuclei, on the one hand a problem-independent detection frame for the exact Control and adjustment of the image fields is responsible and, on the other hand, a problem-specific detection core ensures the extraction of the desired image information.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß alle im auto¬ matischen Suchlauf gewonnenen Daten, insbesondere die Positionen der detektierten mikrokernhaltigen Zellen - wie auch zuvor die Eingabedaten - in einer speziellen Datenbank abgelegt werden.11. The method according to at least one of claims 8 to 10, so that all data obtained in the automatic search, in particular the positions of the detected micronucleated cells - as well as the input data beforehand - are stored in a special database.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der die Er¬ gebnisanalyse betreffende Programmteil die Auswertung und Analyse der automatisch detektierten mikrokernhaltigen Zellen umfaßt, wo¬ bei dessen allgemeiner Teil eine schnelle Wiedervorführung der detektierten Zellen erlaubt und dessen spezieller Teil der pro¬ blemspezifischen Analyse der erzeugten Daten dient, also alle Daten derart aufbereitet und formatiert, daß sie auch von kommerziell verfügbaren PC-Programmen weiterbearbeitet werden können.12. The method according to at least one of claims 8 to 11, characterized in that the program part relating to the result analysis comprises the evaluation and analysis of the automatically detected micronucleus-containing cells, the general part of which allows rapid re-presentation of the detected cells and the special part thereof The problem-specific analysis of the generated data is used, that is, all the data are prepared and formatted in such a way that they can also be processed further by commercially available PC programs.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß als Säulenfiltrations-Gehäuse ein in Wirkstellung vertikales Glas- oder Kunststoffröhr, vorzugsweise eine 20 ml-Einwegspritze (7) mit zentraler Ausgangsöffnung (9), vorgesehen ist, die in ihrem inneren Basisbereich mindestens eine Lage Filterpapier (8), beispielsweise Linsenreinigungspapier, auf¬ weist; darüber befindet sich das Zellulose-Gemisch (2); oberhalb des Zellulose-Gemisches (2) befindet sich ein Freiraum (1) zur Eingabe der zu separierenden Blutzellensuspension (13); unterhalb des sich verjüngenden Röhrchenteils (3) befindet sich im Bereich der Kanüle (9) ein Filterreservoir (4a) mit einem oder mehreren Filtern (4) der Maschenweiten zwischen 5 und 20 μm, vorzugsweise zwischen 10 und 12 m.13. The apparatus for performing the method according to at least one of claims 1 to 12, characterized in that the column filtration housing is a vertical glass or plastic tube in the operative position, preferably a 20 ml disposable syringe (7) with a central outlet opening (9), is provided which has at least one layer of filter paper (8), for example lens cleaning paper, in its inner base region; above is the cellulose mixture (2); Above the cellulose mixture (2) there is a free space (1) for entering the blood cell suspension (13) to be separated; below of the tapering tube part (3) there is a filter reservoir (4a) with one or more filters (4) with mesh sizes between 5 and 20 μm, preferably between 10 and 12 m, in the area of the cannula (9).
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß das in die Spritze (7) eingepreßte Zellu¬ lose-Gemisch (2) mittels eines bei Gebrauch der Vorrichtung ent¬ fernbaren Deckels (11) nach oben hin abgegrenzt und als Einweg-Set ausgebildet ist.14. The apparatus according to claim 13, characterized in that the cellulosic mixture (2) pressed into the syringe (7) is delimited at the top by means of a cover (11) which can be removed when the device is used and as a disposable set is trained.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 und 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß ein vorzugs¬ weise auf die Einweg-Spritze (7) aufschiebbarer und mit Luft- durchtrittsöffnungen (10) versehener Auffangbehälter (5) für das Eluat (6) vorgesehen ist.15. Device according to one of claims 13 and 14, so that a collection container (5) for the eluate (6), which can be pushed onto the disposable syringe (7) and is provided with air passage openings (10), is provided.
16. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als Säulenfiltrations-Gehäuse eine kompakte Zellseparationsvorrichtung (22) aus Glas oder Kunststoff vorgesehen ist, welche die folgenden Konstruktions- und Funktionsmerkmale aufweist:16. Apparatus for carrying out the method according to claim 7, so that a compact cell separation device (22) made of glass or plastic is provided as the column filtration housing, which has the following construction and functional features:
(a) die vorzugsweise rotationssymmetrische Vorrichtung weist unterhalb ihrer als Stutzen ausgebildeten Eingangsöff¬ nung (14) einen Hauptraum auf, der das Zellulose- Gemisch (2) enthält, wobei das Gemisch aus α- und mikrokristalliner Zellulose mit einem bevorzugten Mischungsverhältnis 1:1 und einem Gewicht von ca. 0,1 - 0,5 g besteht; (b) der Hauptraum wird von einer oberen Abdichtung (15) und einer unteren Abdichtung (16) derart umgrenzt, daß ein Austreten des Zellulose-Gemisches (2) in benachbarte Räume ausgeschlossen ist, daß aber gleichzeitig ein Durchtritt der Probensuspension ermöglicht wird;(a) the preferably rotationally symmetrical device has a main space below its inlet opening (14), which contains the cellulose mixture (2), the mixture of α- and microcrystalline cellulose having a preferred mixing ratio of 1: 1 and a weight of approx. 0.1 - 0.5 g; (b) the main space is delimited by an upper seal (15) and a lower seal (16) in such a way that the cellulose mixture (2) cannot escape into adjacent rooms, but at the same time allows the sample suspension to pass through;
(c) unter einem als Einschnürungsbereich ausgebildeten Ver¬ bindungsteil (17), der in seinem zentralen Öffnungsbe¬ reich die untere Abdichtung (16) aufnimmt, befindet sich eine Kammer, die eine Filterauflage (20) sowie mindestens ein darauf liegendes Spezialfilter (18) auf¬ weist;(c) under a constriction area (17), which receives the lower seal (16) in its central opening area, there is a chamber containing a filter pad (20) and at least one special filter (18) on it exhibits;
.(d) der konisch verlaufende Unterteil der Vorrichtung (22) mündet in eine Ausgangsöffnung (21), die beispielsweise mit einem Auffanggefäß funktionell verbunden werden kann.(d) the tapered lower part of the device (22) opens into an outlet opening (21) which can be functionally connected, for example, to a collecting vessel.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die obere Abdichtung (15) als entfernbarer Deckel ausgebildet ist.17. The apparatus of claim 16, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t that the upper seal (15) is designed as a removable cover.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Abdichtungen (15,16) sowie die Filter¬ auflage (20) jeweils als zelldurchlässiges Kunststoffgitter ausge¬ bildet sind.18. The apparatus according to claim 16, so that the seals (15, 16) and the filter pad (20) are each formed as a cell-permeable plastic grid.
19. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Eingangsöffnung (14) und die Ausgangs¬ öffnung (21) hinsichtlich ihrer Dimensionierungen derart ausgebil¬ det sind, daß sie den genormten Luer- oder Record-Maßen entsprechen. 19. The apparatus according to claim 16, characterized in that the inlet opening (14) and the outlet opening (21) are designed with regard to their dimensions such that they correspond to the standardized Luer or record dimensions.
20. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß der das Zellulose-Gemisch (2) aufnehmende Innenraum und die die Filterauflage (20) sowie den bzw. die Spezialfilter (18) umschließende Filterkammer jeweils doppel¬ konisch zulaufende Ober- und Unterbegrenzungen aufweisen.20. The apparatus according to claim 16, characterized ¬ characterized in that the cellulose mixture (2) receiving the interior and the filter pad (20) and the special filter or filters (18) enclosing filter chamber each have double conical upper and lower limits .
21. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie einen Außendurchmesser a zwischen 10 und 12 mm und eine Höhe b21. The device according to at least one of claims 16 to 20, that it has an outer diameter a between 10 and 12 mm and a height b
- unter Ausschluß der Eingangsöffnung (14) - zwischen 13 und 15 mm aufweist und als Einweg-Set ausgebildet ist.- Excluding the entrance opening (14) - between 13 and 15 mm and is designed as a disposable set.
22. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 8 bis 12, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Bildanalyse gemäß Teilmerkmal (f) des Hauptanspruchs unter Verwendung eines Mikroskops und unter Einsatz eines Bildverarbeitungssystems erfolgt, wobei das Mikroskop einen motorisch verstellbaren Scanning-Tisch, der bis zu sechzehn Ob¬ jektträger aufnehmen kann, einen motorisch angetriebenen Fokustrieb, eine Lampenregelung und einen motorisch einstellbaren Objektivrevolver enthält und das Bildverarbeitungssystem als modulares, bus-orientiertes System großer Flexibilität ausgebildet ist, wobei die Module Bildspeicher und spezielle Bildprozessoren zur schnellen Verarbeitung von Grau- und Binärbildern umfassen.22. Device for performing the method according to claims 1 and 8 to 12, characterized in that the image analysis according to partial feature (f) of the main claim takes place using a microscope and using an image processing system, the microscope being a motor-adjustable scanning table , which can hold up to sixteen slides, contains a motor-driven focus drive, a lamp control and a motor-adjustable nosepiece, and the image processing system is designed as a modular, bus-oriented system of great flexibility, the modules image memory and special image processors for fast processing of Include gray and binary images.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß als Mikroskop das automatisierte Mikroskop MEDILUX und als Bildverarbeitungssystem das MIAMED eingesetzt werden. 23. The apparatus of claim 22, d a d u r c h g e k e n n ¬ z e i c h n e t that the automated microscope MEDILUX are used as the microscope and MIAMED as the image processing system.
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