EP0261552A1 - Gentechnisches Verfahren zur Herstellung von Salm-Calcitonin sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens - Google Patents

Gentechnisches Verfahren zur Herstellung von Salm-Calcitonin sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens Download PDF

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EP0261552A1
EP0261552A1 EP87113445A EP87113445A EP0261552A1 EP 0261552 A1 EP0261552 A1 EP 0261552A1 EP 87113445 A EP87113445 A EP 87113445A EP 87113445 A EP87113445 A EP 87113445A EP 0261552 A1 EP0261552 A1 EP 0261552A1
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EP
European Patent Office
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dna sequence
calcitonin
salm
plasmid
gene
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Withdrawn
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EP87113445A
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Friedrich Dr. Hein
Hans Willi Dr. Jansen
Hubert Dr. Müller
Eugen Dr. Uhlmann
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Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/585—Calcitonins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • calcitonin As a hypocalcaemic and hypophosphateemic peptide hormone, calcitonin is involved in the regulation of serum calcium levels. Common structural features of calcitonins from different species are 32 amino acids in length, a disulfide bridge between cysteine residues 1 and 7 and a C-terminal prolinamide function. Of the commercially available calcitonins (human, pig, eel, salm), salm calcitonin is the most effective. Calcitonin is used to treat calcium metabolism disorders. These include hypercalcemia, Paget's disease, various forms of osteoporosis and Sudeck syndrome. The analgesic effect of calcitonin represents another current aspect of this hormone. Furthermore, calcitonin has a therapeutic effect in acute pancreatitis by inhibiting pancreatic enzyme secretion and thus accelerating the normalization of numerous disease parameters.
  • EP-A 191 869 describes a process for the preparation of Salm-Calcitonin I with additional N-terminal methionine, C-terminal glycine (Salm-Calcitonin I-Gly33) and of Salm-Calcitonin I-carboxamide, in which a Expression plasmid incorporates a gene, expresses it and, if necessary, enzymatically converts the glycyl peptide into the carboxamide.
  • the present invention is defined in the claims. In particular, it relates to a special gene for the production of Salm-Calcitonin I-Gly33.
  • the first step of the genetic engineering process is the chemical synthesis of the special gene.
  • the coding strand and the non-coding strand are each chemically synthesized and thus for the enzymatic ligation reaction, as is used according to EP-A 0 191 869 and also otherwise normally for constructing a gene from overlapping fragments (cf. EP-A 0 133 282, 0 136 472, 0 155 590, 0 161 504, 0 163 249, 0 171 024, 0 173 149 or 0 177 827), deliberately omitted.
  • the genetic code is "degenerate”, i.e. that only a single nucleotide sequence codes for two amino acids, while the remaining 18 genetically encodable amino acids are assigned two to six triplets. A large variety of codon combinations are thus available for the synthesis of the gene. It has now been found that DNA sequence I (Appendix, reproduced there with ATG start codon, two translation stop codons and overhanging ends for different restriction enzymes) is particularly advantageous.
  • DNA sequence I it was also taken into account that those amino acids to which several codons can be assigned are not equivalent, but rather show different preferences in the respective host cell like E. coli. Furthermore, palindromic sequences were reduced to a minimum.
  • DNA sequence I can be constructed from two chemically synthesized oligonucleotides with lengths of 109 and 117 nucleotides.
  • DNA sequence I can be resumed from the re-isolated plasmid by digestion with SphI and EcoRI.
  • Salm-Calcitonin I-Gly33 is in the form of a fusion protein with a bacterial protein such as ⁇ -galactosidase or partial sequences of the same. Such fusion proteins can then be cleaved chemically in a known manner.
  • the methionine at the amino terminus can be separated by bromine cyanide cleavage, so that the undesired portion of the bacterial protein in the fusion protein is also removed.
  • the synthetic gene is incorporated into the plasmid in a manner known per se.
  • the transformation of the hybrid plasmid obtained in this way into suitable host organisms, advantageously E. coli, is also known per se and is described in detail in the textbook mentioned above.
  • the expressed protein can be obtained and purified by the processes mentioned in EP-A 0 191 869 and 0 133 282.
  • the DNA sequence I according to the invention, the hybrid plasmids obtained therewith and the transformed host organisms are also the subject of the invention.
  • the synthesis of the two gene building blocks is explained using the example of the coding strand of DNA sequence I.
  • the nucleoside at the 3 ⁇ end in the present case thus guanosine (nucleotide no. 113), is covalently bound to a support via the 3 ⁇ -hydroxy function.
  • the carrier material is CPG ("Controlled Pore Glass") functionalized with long-chain aminoalkyl residues.
  • the base component is used as 5 ⁇ -O-dimethoxytrityl nucleoside-3 ⁇ -phosphorous acid- ⁇ -cyanoethyl er-dialkylamide, with the adenine as N6-benzoyl compound, the cytosine as N4-benzoyl compound, the guanine as N2- Isobutyryl compound and the thymine are present without a protective group.
  • Phosphite here means deoxyribose-3 ⁇ -monophosphoric acid mono- ⁇ -cyanoethyl ester, the third valence being saturated by a diisopropylamino radical.
  • the yields of the individual synthesis steps can each be determined spectrophotometrically after the detritylation reaction B) by measuring the absorption of the dimethoxytrityl cation at the wavelength of 496 nm.
  • the dimethoxytrityl group is split off as described in A) to C).
  • Treatment with ammonia cleaves the oligonucleotide from the support and at the same time eliminates the ⁇ -cyanoethyl groups.
  • a two to three day treatment of the oligomer with concentrated ammonia removes the amino protective groups of the bases quantitatively.
  • the crude product thus obtained is purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Each 100 pmol of the 109-mer oligonucleotide (coding strand) and 117-mer oligonucleotide (non-coding strand) are dissolved together in 50 ul 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 10 mM magnesium chloride and 10 mM dithiothreitol Solution heated to 95 ° C for 5 minutes and cooled to room temperature within two hours.
  • the hybridized DNA double strand corresponding to DNA sequence I is purified by gel chromatography.
  • the commercial plasmid pUC19 is opened in a known manner with the restriction endonucleases SphI and EcoRI according to the manufacturer's instructions.
  • the digestion mixture is separated on a 1% agarose gel by electrophoresis in a known manner and the fragments made visible by staining with ethidium bromide.
  • the plasmid band is then cut out of the agarose gel and separated from the agarose by electroelution.
  • the expression plasmid pWH1 consists of a pBR322 portion and the gene for ⁇ -galactosidase with its regulatory region.
  • the preparation of pWH1 was described in detail in EP-A 0 133 282.
  • This amino acid 1005 of the ⁇ -galactosidase contains a unique EcoRI site that can be used as a cloning site for eukaryotic genes.
  • DNA sequence I can be obtained from the plasmid according to FIG. 1 by restriction enzyme digestion with SphI and EcoRI.
  • a chemically synthetic linker is ligated to the DNA sequence I, which contains the recognition sequences for the restriction enzymes SphI and EcoRI: After restriction enzyme digestion with EcoRI, a DNA fragment is obtained, flanked by EcoRI recognition sequences. Such a fragment can then be integrated into the plasmid pWH1 opened with EcoRI, the plasmid according to FIG. 2 being obtained.
  • 0.1-1 ⁇ g pWH1 is opened with EcoRI and with bacterial alkaline phosphatase at the 5 ⁇ ends of the EcoRI interface dephosphorylated. This prevents ligation of the plasmid with itself. Only those plasmids that have integrated a gene fragment with flanking EcoRI recognition sequences can be closed in a ring. For this, 10 ⁇ g calcitonin gene are added and the ligation is carried out.
  • Competent E. coli cells are transformed with 0.1-1 ⁇ g plasmid according to FIG. 2 and plated on ampicillin agar plates. The integration of the calcitonin gene and its direction of integration in the plasmid can then be determined by rapid DNA processing (Maniatis, op. Cit.).
  • a fusion protein is expressed which carries three amino acids from the linker at the amino end of the Met (Salm-Calcitonin-Gly) sequence and the sequence of the 1005 amino acids of the ⁇ -galactosidase. After cyanogen bromide cleavage, the salm-calcitonin-Gly33 is obtained.
  • the bacterial strains cultured to the desired optical density are induced with a suitable inductor, for example IPTG, for a sufficiently long time, for example 2 hours.
  • a suitable inductor for example IPTG
  • the cells are then killed with 0.1% cresol and 0.1 mM phenyl-methyl-sulfonyl fluoride (benzyl sulfonyl fluoride).
  • the cell mass is disrupted in an aqueous acidic solution at pH 3.0 in a suitable device (French press or (R) Dyno-Mühle), whereupon the insoluble components are centrifuged off.
  • the proteins are isolated from the supernatant using standard methods (Grau, Müllner, Seipke, Angew. Chem. 98 (1986) 530). The enrichment and the purity of the products are checked by HPLC analysis.
  • the methionine including the proportion of the bacterial protein ⁇ -galactosidase bound to the methionine, is separated off by cyanogen bromide and the calcitonin derivative is extracted and purified.
  • Fusion proteins with a ⁇ -galactosidase component can already be detected in the crude extract of the lysed bacteria on the basis of their running behavior in gel electrophoresis, which differs from that of the authentic ⁇ -galactosidase.
  • the degree of purity and enrichment of Salm-Calcitonin-Gly are determined by HPLC.
  • the radioimmunoassay is expediently designed as an indirect immunoprecipitation assay with anti-calcitonin antibody and anti-IgC-anti-calcitonin antibody.
  • the sensitivity of the RIA is 10 ng Salm-Calcitonin I.
  • Salm-Calcitonin I-Gly33 or Salm-Calcitonin I can be determined by measuring the calcium ion concentration in the serum.

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Abstract

Mit Hilfe einer speziellen DNA-Sequenz kann in einem gentechnischen Verfahren Salm-Calcitonin I mit zusätzlichem C-terminalem Glycin gewonnen werden. Das Gen wird vorteilhaft aus zwei Oligonukleotiden synthetisiert, in ein Hybridplasmid eingebaut und dieses in einem Wirtsorganismus zur Expression gebracht. Salm-Calcitonin I-Gly³³ ist enzymatisch in Salm-Calcitonin I umwandelbar.

Description

  • Calcitonin ist als hypokalzämisches und hypophosphatämisches Peptidhormon an der Regulation des Serum-Kalziumspiegels beteiligt. Gemeinsame Strukturmerkmale von Calcitoninen aus verschiedenen Spezies sind eine Länge von 32 Aminosäuren, eine Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten 1 und 7 und eine C-terminale Prolinamidfunktion. Von den kommerziell erhältlichen Calcitoninen (Mensch, Schwein, Aal, Salm) ist Salm-Calcitonin das wirksamste. Calcitonin wird zur Behandlung von Störungen des Kalziumstoffwechsels eingesetzt. Dazu gehören Hyperkalzämie, Morbus Paget, verschiedene Formen der Osteoporose sowie das Sudeck-Syndrom. Die analgetische Wirkung des Calcitonins stellt einen weiteren aktuellen Aspekt dieses Hormons dar. Ferner ist Calcitonin bei der akuten Pankreatitis therapeutisch wirksam, indem es die Pankreasenzym-Sekretion hemmt und so die Normalisierung zahlreicher Krankheitsparameter beschleunigt.
  • Die gentechnische Herstellung von Polypeptiden mit einem Carbonsäureamid-Carboxyterminus wie Calcitonin über das entsprechende Peptid mit einem Glycyl-C-Terminus und dessen enzymatische Umwandlung ist bereits bekannt (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer - im folgenden "EP-A" - 0 133 282).
  • In der EP-A 191 869 ist ein Verfahren zur Herstellung von Salm-Calcitonin I mit zusätzlichem N-terminalen Methionin, C-terminalen Glycin (Salm-Calcitonin I-Gly³³) und von Salm-Calcitonin I-Carboxamid beschrieben, wobei man in ein Expressionsplasmid ein Gen einbaut, dieses exprimiert und gegebenenfalls das Glycyl-Peptid enzymatisch in das Carboxamid umwandelt.
  • Die vorliegende Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Sie betrifft insbesondere ein spezielles Gen zur Herstellung von Salm-Calcitonin I-Gly³³.
  • Der erste Schritt des gentechnologischen Verfahrens ist die chemische Synthese des speziellen Gens. Dabei werden der codierende Strang sowie der nichtcodierende Strang jeweils chemisch durchsynthetisiert und somit auf die enzymatische Ligationsreaktion, wie sie gemäß EP-A 0 191 869 und auch sonst normalerweise zum Aufbau eines Gens aus sich überlappenden Fragmenten verwendet wird (vgl. EP-A 0 133 282, 0 136 472, 0 155 590, 0 161 504, 0 163 249, 0 171 024, 0 173 149 oder 0 177 827), bewußt verzichtet.
  • Der genetische Code ist bekanntlich "entartet", d.h. daß nur für zwei Aminosäuren eine einzige Nukleotidsequenz codiert, während den restlichen 18 genetisch codierbaren Aminosäuren zwei bis sechs Tripletts zuzuordnen sind. Für die Synthese des Gens steht somit eine große Vielfalt von Codon-Kombinationen zur Auswahl. Es wurde nun gefunden, daß die DNA-Sequenz I (Anhang, dort wiedergegeben mit ATG-Startcodon, zwei Translations-Stopcodons und überhängenden Enden für unterschiedliche Restriktionsenzyme) besonders vorteilhaft ist.
  • Am 5ʹ-Ende des codierenden Stranges befindet sich eine überhängende DNA-Sequenz entsprechend der Restriktionsendonuklease SphI, am 3ʹ-Ende des codierenden Strangs dagegen die einzelsträngige überhängende Sequenz entsprechend dem Restriktionsenzym EcoRI. Diese beiden unterschiedlichen Erkennungssequenzen gewährleisten die Inserierung der DNA in Plasmide in der gewünschten Orientierung.
  • Zwischen diesen Erkennungssequenzen und den Codons für die Aminosäurefolge befindet sich am 5ʹ-Ende des codierenden Stranges das Codon für die Aminosäure Methionin (das in der DNA-Sequenz I mit 0 beziffert ist). Am Ende dieses Stranges folgt auf das für Prolin codierende Triplett das Codon 33 für Glycin, gefolgt von zwei Translationsterminations-Tripletts (Stop-Codons).
  • Innerhalb des Strukturgens wurden eine Reihe von singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen eingebaut, die Zugang zu Teilsequenzen des Salm-Calcitonins I schaffen sowi e die Durchführung von Mutationen erlauben:
    Figure imgb0001
  • Bei der DNA-Sequenz I wurde weiterhin berücksichtigt, daß bei denjenigen Aminosäuren, denen mehrere Codons zuzuordnen sind, diese nicht gleichwertig sind, sondern in der jeweiligen Wirtszelle wie E. coli unterschiedliche Präferenzen zeigen. Weiterhin wurden palindromische Sequenzen auf ein Mindestmaß reduziert. Die DNA-Sequenz I läßt sich aus zwei chemisch synthetisierten Oligonukleotiden mit Längen von 109 und 117 Nukleotiden aufbauen.
  • Das synthetische Gen wird nach Inserierung in das handelsübliche Plasmid pUC19 (Figur 1) in E. coli kloniert. Aus dem reisolierten Plasmid kann die DNA-Sequenz I durch Verdauung mit SphI und EcoRI wiedergenommen werden.
  • Nach Umklonieren des Gens in einen Expressionsvektor wie pWH1 (EP-A 0 133 282) wird Salm-Calcitonin I-Gly³³ in Form eines Fusionsproteins mit einem bakteriellen Protein wie β-Galaktosidase oder Partialsequenzen desselben exprimiert Solche Fusionsproteine können dann in bekannter Weise chemisch gespalten werden.
  • Das Methionin am Aminoterminus kann durch Bromcyanspaltung abgetrennt werden, so daß der unerwünschte Anteil des Bakterienproteins im Fusionsprotein mit entfernt wird.
  • Die enzymatische Umwandlung des Glycylrestes 33 in die Aminogruppe der Prolinamid-Funktion im Salm-Calcitonin I ist an sich bekannt (EP-A 0 191 869 und 0 133 282; A.F. Bradbury et al., Nature 298 (1982) 686-688).
  • Der Einbau des synthetischen Gens in das Plasmid erfolgt in an sich bekannter Weise. Hierzu kann auf das Lehrbuch von Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982) verwiesen werden. Die Transformation des so erhaltenen Hybridplasmids in geeignete Wirtsorganismen, vorteilhaft E. coli, ist ebenfalls an sich bekannt und in dem vorstehend genannten Lehrbuch eingehend beschrieben. Die Gewinnung des exprimierten Proteins und dessen Reinigung können nach den in der EP-A 0 191 869 und 0 133 282 genannten Verfahren erfolgen.
  • Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz I, die damit erhaltenen Hybridplasmide und die transformierten Wirtsorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • In den folgenden Beispielen werden einige Ausgestaltungen der Erfindung im einzelnen erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist.
    • Beispiele 1. Chemische Synthese eines einzelsträngigen Oligonukleotids
  • Am Beispiel des codierenden Stranges der DNA-Sequenz I wird die Synthese der beiden Genbausteine erläutert. Für die Festphasensynthese wird das am 3ʹ-Ende stehende Nukleosid, im vorliegenden Fall also Guanosin (Nukleotid Nr. 113), über die 3ʹ-Hydroxyfunktion kovalent an einen Träger gebunden verwendet. Trägermaterial ist mit langkettigen Aminoalkylresten funktionalisiertes CPG ("Controlled Pore Glass").
  • In den folgenden Syntheseschritten wird die Basenkomponente als 5ʹ-O-Dimethoxytritylnukleosid-3ʹ-phosphorigsäure-β-cyanoethyles er-dialkylamid eingesetzt, wobei das Adenin als N⁶-Benzoyl-Verbindung, das Cytosin als N⁴-Benzoyl-Verbindung, das Guanin als N²-Isobutyryl-Verbindung und das Thymin ohne Schutzgruppe vorliegen.
  • 25 mg des polymeren Trägers, der 0,2 µmol N²-Isobutyrylguanosin gebunden enthält, werden nacheinander mit folgenden Agentien behandelt:
    • A) Acetonitril
    • B) 3 % Trichloressigsäure in Dichlormethan
    • C) Acetonitril
    • D) 5 µmol des entsprechenden Nukleosid-phosphits und 25 µmol Tetrazol in 0,15 ml wasserfreiem Acetonitril
    • E) Acetonitril
    • F) 20 % Acetanhydrid in Tetrahydrofuran mit 40 % Lutidin und 10 % Dimethylaminopyridin
    • G) Acetonitril
    • H) 3 % Jod in Lutidin/Wasser/Tetrahydrofuran im Volumenverhältnis 5:4:1.
  • Unter "Phosphit" wird hierbei der Desoxyribose-3ʹ-monophosphorigsäure-m ono-β-cyanoethylester verstanden, wobei die dritte Valenz durch einen Diisopropylaminorest abgesättigt ist. Die Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte können jeweils nach der Detritylierungsreaktion B) spektrophotometrisch durch Messung der Absorption des Dimethoxytritylkations bei der Wellenlänge von 496 nm bestimmt werden.
  • Nach abgeschlossener Synthese erfolgt die Abspaltung der Dimethoxytritylgruppe wie in A) bis C) beschrieben. Durch die Behandlung mit Ammoniak wird das Oligonukleotid vom Träger gespalten und zugleich werden die β-Cyanoethylgruppen eliminiert. Eine zwei- bis dreitägige Behandlung des Oligomeren mit konzentriertem Ammoniak spaltet die Aminoschutzgruppen der Basen quantitativ ab. Das so erhaltene Rohprodukt wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
    • 2. Herstellung eines Hybridplasmids, das die DNA-Sequenz I enthält
  • Je 100 pmol des 109-mer Oligonukleotids (codierender Strang) und 117-mer Oligonukleotids (nichtcodierender Strang) werden zusammen in 50 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Dithiothreitol gelöst, diese Lösung 5 Minuten auf 95°C erhitzt und binnen zwei Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt. Der hybridisierte DNA-Doppelstrang entsprechend der DNA-Sequenz I wird durch Gelchromatographie gereinigt.
  • Das handelsübliche Plasmid pUC19 wird in bekannter Weise mit den Restriktionsendonukleasen SphI und EcoRI nach den Angaben der Hersteller geöffnet. Der Verdauungsansatz wird auf einem 1 %-igen Agarosegel durch Elektrophorese in bekannter Weise aufgetrennt und die Bruchstücke durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Plasmidbande wird anschließend aus dem Agarosegel herausgeschnitten und durch Elektroelution von der Agarose abgetrennt.
  • 1 µg Plasmid wird dann mit 10 ng des DNA-Fragments entsprechend der DNA-Sequenz I über Nacht bei 16°C ligiert. Man erhält das Hybridplasmid gemäß Figur 1.
    • 3. Konstruktion eines Expressionsplasmids, das die DNA-Sequenz I enthält.
  • Das Expressionsplasmid pWH1 besteht aus einem pBR322-Anteil und dem Gen für β-Galaktosidase mit dessen Regulationsregion. Die Herstellung von pWH1 wurde in der EP-A 0 133 282 ausführlich beschrieben. Dieses Plasmid enthält bei der Aminosäure 1005 der β-Galaktosidase eine singuläre EcoRI-Schnittstelle, die als Klonierungsstelle für eukaryotische Gene benutzt werden kann. Aus dem Plasmid gemäß Figur 1 kann die DNA-Sequenz I durch Restriktionsenzymverdauung mit SphI und EcoRI gewonnen werden. An die DNA-Sequenz I wird ein chemisch synthetischer Linker anligiert, der die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme SphI und EcoRI enthält:
    Figure imgb0002
    Nach einer Restriktionsenzymverdauung mit EcoRI erhält man ein DNA-Fragment, flankiert von EcoRI Erkennungssequenzen. Ein solches Fragment kann anschließend in das mit EcoRI geöffnete Plasmid pWH1 integriert werden, wobei das Plasmid gemäß Figur 2 erhalten wird.
  • Hierzu wird 0,1-1 µg pWH1 mit EcoRI geöffnet und mit bakterieller alkalischer Phosphatase an den 5ʹ-Enden der EcoRI-Schnittstelle dephosphoryliert. Hierdurch wird eine Ligation des Plasmids mit sich selber verhindert. Nur diejenigen Plasmide können ringförmig geschlossen werden, welche ein Genfragment mit flankierenden EcoRI-Erkennungssequenzen integriert haben. Hierzu werden 10 µg Calcitonin-Gen zugegeben und die Ligation durchgeführt.
    • 4. Transformation der Hybridplasmide
  • Kompetente E. coli-Zellen werden mit 0,1 - 1 µg Plasmid gemäß Figur 2 transformiert und auf Ampicillin-Agarplatten plattiert. Anschließend läßt sich die Integration des Calcitonin-Gens und seine Integrationsrichtung im Plasmid durch DNA-Schnellaufarbeitung bestimmen (Maniatis, a.a.O.).
    • 5. Expression
  • Nach Transformation dieser Hybridplasmide in E. coli wird ein Fusionsprotein exprimiert, das am Aminoende der Met-(Salm-Calcitonin-Gly)-Sequenz drei Aminosäuren aus dem Linker sowie die Seq uenz der 1005 Aminosäuren der β-Galaktosidase trägt. Nach Bromcyan-Spaltung wird das Salm-Calcitonin-Gly³³ erhalten.
    • 6. Aufarbeitung und Reinigung
  • Die zur gewünschten optischen Dichte kultivierten Bakterienstämme werden mit einem geeigneten Induktor, beispielsweise IPTG, hinreichend lange, beispielsweise 2 Stunden, induziert. Anschließend werden die Zellen mit 0,1 % Kresol und 0,1 mM Phenyl-methyl-sulfonylfluorid (Benzylsulfonylfluorid) abgetötet. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren wird die Zellmasse in einer wäßrigsauren Lösung bei pH 3,0 in einer geeigneten Vorrichtung (French-Presse bzw. (R)Dyno-Mühle) aufgeschlossen, worauf die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert werden. Aus dem Überstand werden die Proteine nach Standard-Methoden (Grau, Müllner, Seipke, Angew. Chem. 98 (1986) 530) isoliert. Durch HPLC-Analytik werden die Anreicherung und die Reinheit der Produkte kontrolliert.
  • Das Methionin einschließlich des Anteils des am Methionin gebundenen Bakterienproteins β-Galaktosidase wird durch Bromcyan-Spaltung abgetrennt und das Calcitonin-Derivat extrahiert und gereinigt.
  • Fusionsproteine mit einem β-Galaktosidase-Anteil lassen sich bereits im Rohextrakt der lysierten Bakterien anhand ihres von der authentischen β-Galaktosidase unterschiedlichen Laufverhaltens in der Gelelektrophorese nachweisen. Nach der Bromcyan-Spaltung werden Reinheitsgrad und Anreicherung von Salm-Calcitonin-Gly über HPLC bestimmt.
  • Die Charakterisierung der Produkte auf Calcitonin-Aktivität kann immunologisch und biologisch erfolgen:
  • In einem Radioimmunoassay reagiert das bakteriologisch hergestellte Salm-Calcitonin I und seine Variante Salm-Calcitonin I-Gly mit einem Antikörper gegen synthetisches Salm-Calcitonin I.
    Der Radioimmunoassay wird zweckmäßig als indirekter Immunpräzipitationsassay mit Anti-Calcitonin-Antikörper und Anti-IgC-Anti-Calcitonin-Antikörper ausgestaltet. Die Empfindlichkeit des RIA beträgt 10 ng Salm-Calcitonin I.
  • Die biologische Aktivität von Salm-Calcitonin I-Gly³³ bzw. von Salm-Calcitonin I kann durch Messung der Kalziumionenkonzentration im Serum bestimmt werden. Hierbei kann man auf kommerziell erhältliche Kalzium-"Assay Kits" zurückgreifen.
    Figure imgb0003

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Salm-Calcitonin I mit zusätzlichem C-terminalen Glycin und von Salm-Calcitonin I-Carboxamid, wobei man in ein Expressionsplasmid ein Gen einbaut, das für das Glycyl-Peptid codiert, dieses exprimiert und gegebenenfalls das Glycyl-Peptid enzymatisch in das Carboxamid umwandelt, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen für das Glycyl-Peptid die DNA-Sequenz II
TGC TCT AAC CTG TCG ACT TGC GTT CTT GGT AAG
ACG AGA TTG GAC AGC TGA ACG CAA GAA CCA TCC
CTT TCT CAG GAA CTT CAT AAA CTG CAG ACC TAT
GAA AGA GTC CTT GAA GTA TTT GAC GTC TGG ATA
CCG CGC ACT AAT ACC GGC TCT GGT ACC CCT GGT
GGC GCG TGA TTA TGG CCG AGA CCA TGG GGA CCA
aufweist.
2. DNA-Sequenz II gemäß Anspruch 1.
3. DNA-Sequenz I (Anhang).
4. Verfahren zur Herstellung der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den codierenden und den nicht-codierenden Strang nach dem Phosphitverfahren synthetisiert.
5. Hybridplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Sequenz I oder II enthält.
6. Hybridplasmid, das zwischen einer SphI- und einer EcoRI-Schnittstelle die DNA-Sequenz I enthält.
7. Wirtsorganismus, der ein Hybridplasmid nach Anspruch 5 oder 6 enthält.
8. E. coli, enthaltend ein Hybridplasmid nach Anspruch 5 oder 6.
EP87113445A 1986-09-20 1987-09-15 Gentechnisches Verfahren zur Herstellung von Salm-Calcitonin sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens Withdrawn EP0261552A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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DE3632037 1986-09-20
DE19863632037 DE3632037A1 (de) 1986-09-20 1986-09-20 Gentechnisches verfahren zur herstellung von salm-calcitonin sowie mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens

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EP0261552A1 true EP0261552A1 (de) 1988-03-30

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BIOLOGICAL ABSTRACTS,RRM, Band 33, 1987, Nr. 84491, Philadelphia, US; F. HEIN et al.: "Use of long oligonucleotides in gene synthesis chemical synthesis and cloning of a gene for salmon calcitonin" & Nucleosides nucleotid7, Band 6, Nr. 1-2, Seite 489-490 *
BIOLOGICAL ABSTRACTS,RRM, Band 33, 1987, Nr. 84491, Philadelphia, US; F. HEIN et al.: "Use of long oligonucleotides in gene synthesis chemical synthesis and cloning of a gene for salmon calcitonin" & Nucleosides nucleotides, Band 6, Nr. 1-2, Seite 489-490 *

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IE872531L (en) 1988-03-29
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JPS6398391A (ja) 1988-04-28
PT85753A (de) 1987-10-01
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DE3632037A1 (de) 1988-04-07

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