EA047395B1 - Модуляторы экспрессии pnpla3 - Google Patents

Модуляторы экспрессии pnpla3 Download PDF

Info

Publication number
EA047395B1
EA047395B1 EA202190708 EA047395B1 EA 047395 B1 EA047395 B1 EA 047395B1 EA 202190708 EA202190708 EA 202190708 EA 047395 B1 EA047395 B1 EA 047395B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
certain embodiments
compound
modified
oligonucleotide
compounds
Prior art date
Application number
EA202190708
Other languages
English (en)
Inventor
Сьюзан М. Фрейер
Хюнх-Хоа Бый
Original Assignee
Айонис Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Айонис Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Айонис Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA047395B1 publication Critical patent/EA047395B1/ru

Links

Description

Перечень последовательностей
Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронной форме. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0317USLSEQ_ST25.txt, созданного 13 сентября 2018 г., размер которого составляет 480 кБ. Информация из перечня в электронной форме включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники
В вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваются способы, соединения и композиции, применимые для подавления экспрессии PNPLA3 (содержащий домен пататин-подобной фосфолипазы белок 3; гипотетический белок dJ796I17.1; адипонутрин; DJ796I17.1) и в некоторых случаях снижения количества белка PNPLA3 в клетке или у животного, что может быть применимо для лечения, предупреждения или уменьшения выраженности заболевания, ассоциированного с PNPLA3.
Предпосылки изобретения
Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) охватывает целый спектр заболеваний печени от стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (NASH) и цирроза. NAFLD определяется как накопление жира в печени, превышающее 5% по весу, при отсутствии значительного употребления алкоголя, приема стеатогенного лекарственного препарата или наследственного заболевания (Kotronen et al., Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28:27-38).
Неалкогольный стеатогепатит (NASH) представляет собой NAFLD с наличием признаков воспаления и повреждения печени. Гистологически NASH определяется по наличию макровезикулярного стеатоза, гепатоцеллюлярного баллонирования и лобулярных воспалительных инфильтратов (Sanyal, Hepatol. Res. 2011. 41:670-4). По оценкам NASH затрагивает 2-3% общей численности населения. При наличии других патологий, таких как ожирение или диабет, прогнозируемая частота встречаемости возрастает до 7 и 62% соответственно (Hashimoto et al., J. Gastroenterol. 2011. 46(1):63-69).
PNPLA3 является составляющим 481 аминокислот представителем семейства содержащих домен пататин-подобной фосфолипазы белков, который экспрессируется в ER и на липидных каплях. У людей PNPLA3 экспрессируется на высоком уровне в печени, тогда как уровень экспрессии в жировой ткани в пять раз ниже (Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010. 107:7892-7).
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложено соединение, анионная форма которого характеризуется следующей формулой (SEQ ID NO: 1089):
ноон о
в виде его фармацевтически приемлемой соли.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и состоит из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланго
- 1 047395 вым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа расположена на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида и представляет собой:
HO-^-pV°\>yNY^\o/ AcHN О .
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено соединение, анионная форма которого характеризуется следующей формулой (SEQ ID NO: 1089): о о
в виде его фармацевтически приемлемой соли.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и состоит из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа содержит кластер GalNAc, содержащий 1-3 GalNAc-лиганда.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, где модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом; при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин
- 2 047395 представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа содержит кластер GalNAc, содержащий 1-3 GalNAc-лиганда.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В одном предпочтительном воплощении указанная фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль.
В другом предпочтительном воплощении указанная фармацевтически приемлемая соль представляет собой калиевую соль.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение или модифицированный олигонуклеотид по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Предложенные в данном документе эффективные и переносимые соединения и композиции применимы для подавления экспрессии PNPLA3 и могут быть применимы для лечения, предупреждения, уменьшения выраженности или замедления прогрессирования заболеваний печени. Определенные варианты осуществления, предусматриваемые в данном документе, направлены на соединения и композиции, которые являются более эффективными или имеют большее терапевтическое значение, чем публично раскрытые соединения.
Подробное описание
Следует понимать, что как вышеприведенное общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются лишь иллюстративными и пояснительными и не ограничивают заявляемые варианты осуществления. В данном документе применение формы единственного числа включает форму множественного числа, если специально не указано иное. В данном документе применение или означает и/или, если не указано иное. Более того, применение термина включающий, а также других форм, таких как включает и включен, не является ограничивающим.
Применяемые в данном документе заголовки разделов служат только в организационных целях и не должны пониматься как ограничивающие описываемый объект. Все документы или части документов, процитированные в настоящем документе, включая без ограничения патенты, патентные заявки, статьи, книги, научные труды и записи эталонных последовательностей в GenBank и NCBI, настоящим явно включены посредством ссылки на части документа, обсуждаемые в данном документе, а также во всей их полноте.
Понятно, что последовательность, приведенная под каждым из SEQ ID NO в примерах, содержащихся в данном документе, не зависит от какой-либо модификации сахарного компонента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. В силу этого соединения, определенные под SEQ ID NO, могут независимо содержать одну или несколько модификаций сахарного компонента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Номер ION у описанных под ним соединений указывает на комбинацию последовательности нуклеиновых оснований, химической модификации и мотива.
Определения
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения.
2'-дезоксинуклеозид означает нуклеозид, содержащий 2'-Н(Н)-фуранозильный сахарный компонент, обнаруживаемый во встречающихся в природе дезоксирибонуклеиновых кислотах (ДНК). В определенных вариантах осуществления 2'-дезоксинуклеозид может содержать модифицированное нуклеиновое основание или может содержать нуклеиновое основание РНК (урацил).
2'-О-метоксиэтил (также 2'-MOE) относится к 2'-O(CH2)2-OCH3) вместо группы 2'-OH рибозильного кольца. 2'-О-метоксиэтил-модифицированный сахар является модифицированным сахаром.
2'-МОЕ-нуклеозид (также 2'-О-метоксиэтилнуклеозид) означает нуклеозид, содержащий 2'-МОЕ-модифицированный сахарный компонент.
2'-замещенный нуклеозид или 2-модифицированный нуклеозид означает нуклеозид, содержащий 2'-замещенный или 2'-модифицированный сахарный компонент. Как используется в данном документе, 2'-замещенный или 2-модифицированный применительно к сахарному компоненту означает, что сахарный компонент содержит по меньшей мере одну 2'-замещающую группу, отличную от H или OH.
З'-концевой сайт-мишень относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который является комплементарным самому крайнему З'-концевому нуклеотиду конкретного соединения.
5'-концевой сайт-мишень относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который явля
- З 047395 ется комплементарным самому крайнему 5'-концевому нуклеотиду конкретного соединения.
5'-метилцитозин означает цитозин с присоединенной в 5'-положении метильной группой.
Приблизительно означает в пределах ±10% от значения. Например, если указано, что соединения осуществляли подавление PNPLA3 по меньшей мере приблизительно на 70%, подразумевается, что уровни PNPLA3 подавляются на величину в диапазоне от 60 до 80%.
Введение или осуществление введения относится к путям введения индивидууму соединения или композиции, предусматриваемых в данном документе, для выполнения их предполагаемой функции. Пример пути введения, который можно применять, включает без ограничения парентеральное введение, такое как подкожная, внутривенная или внутримышечная инъекция или инфузия.
Вводимые одновременно или совместное введение означает введение двух или более соединений любым способом, при котором у пациента проявляются фармакологические эффекты их обоих. Для одновременного введения не требуется, чтобы оба соединения вводились в одной и той же фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме, посредством одного и того же пути введения или в одно и то же время. Эффекты обоих соединений необязательно должны проявляться в одно и то же время. Эффекты должны перекрываться только в течение определенного периода времени и необязательно должны иметь одинаковую длительность. Одновременное введение или совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение.
Уменьшение интенсивности относится к улучшению или ослаблению по меньшей мере одного проявления, признака или симптома ассоциированного заболевания, нарушения или состояния. В определенных вариантах осуществления уменьшение интенсивности включает задержку или замедление прогрессирования или снижение степени тяжести одного или нескольких проявлений состояния или заболевания. Прогрессирование или степень тяжести проявлений может определяться с помощью субъективных или объективных показателей, которые известны специалистам в данной области.
Животное относится к человеку или отличному от человека животному, в том числе без ограничения мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, свиньям и отличным от человека приматам, в том числе без ограничения нечеловекообразным обезьянам и шимпанзе.
Антисмысловая активность означает любую поддающуюся обнаружению и/или измерению активность, связанную с гибридизацией антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотоймишенью. В определенных вариантах осуществления антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствие антисмыслового соединения для мишени.
Антисмысловое соединение означает соединение, содержащее олигонуклеотид и необязательно один или несколько дополнительных компонентов, таких как конъюгированная группа или концевая группа. Примеры антисмысловых соединений включают однонитевые и двухнитевые соединения, такие как олигонуклеотиды, рибозимы, siRNA, shRNA, ssRNA, и соединения, активность которых зависит от степени занятости активных центров.
Антисмысловое подавление означает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного нуклеиновой кислоте-мишени, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени в отсутствие антисмыслового соединения.
Антисмысловые механизмы представляют собой все такие механизмы, предполагающие гибридизацию соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью, где результатом или эффектом гибридизации является либо разрушение мишени, либо занятие мишени с сопутствующей блокировкой клеточного механизма, предполагающего, например, транскрипцию или сплайсинг.
Антисмысловой олигонуклеотид означает олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени или ее области или сегменту. В определенных вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид способен к специфической гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью или ее областью или сегментом.
Бициклический нуклеозид или BNA означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный компонент. Бициклический сахар или бициклический сахарный компонент означает модифицированный сахарный компонент, содержащий два кольца, где второе кольцо образовано с помощью мостика, соединяющего два атома в первом кольце, за счет чего обеспечивается образование бициклической структуры. В определенных вариантах осуществления первое кольцо бициклического сахарного компонента представляет собой фуранозильный компонент. В определенных вариантах осуществления бициклический сахарный компонент не содержит фуранозильный компонент.
Разветвляющая группа означает группу атомов по меньшей мере с 3 положениями, которые могут образовывать ковалентные связи по меньшей мере с 3 группами. В определенных вариантах осуществления разветвляющаяся группа обеспечивает несколько реакционноспособных сайтов для присоединения связанных лигандов к олигонуклеотиду с помощью конъюгирующего линкера и/или расщепляемого компонента.
Нацеливающий на клетку компонент означает конъюгированную группу или фрагмент конъюгированной группы, которые способны связываться с клеткой конкретного типа или с клетками конкрет
- 4 047395 ных типов.
cEt или конформационно ограниченный этилом означает бициклический рибозильный сахарный компонент, где второе кольцо бициклического сахара образовано посредством мостика, соединяющего 4'-атом углерода и 2'-атом углерода, при этом мостик имеет формулу: 4'-CH(CH3)-O-2', и при этом метильная группа мостика находится в S-конфигурации.
cEt-нуклеозид означает нуклеозид, содержащий cEt-модифицированный сахарный компонент.
Химическая модификация в соединении описывает замещения или изменения в результате химической реакции любой из структурных единиц в соединении по сравнению с исходным состоянием такой структурной единицы. Модифицированный нуклеозид означает нуклеозид, независимо имеющий модифицированный сахарный компонент и/или модифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеиновое основание.
Химически отличная область относится к области соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области того же самого соединения. Например, область с 2'-О-метоксиэтилнуклеотидами химически отличается от области с нуклеотидами без 2'-О-метоксиэтильных модификаций.
Химерные антисмысловые соединения означают антисмысловые соединения, которые имеют по меньшей мере две химически отличные области, при этом на каждое положение приходится несколько субъединиц.
Расщепляемая связь означает любую химическую связь, которая может быть разорвана. В определенных вариантах осуществления расщепляемая связь выбрана из амидной, полиамидной, сложноэфирной, эфирной, одной или обеих сложноэфирных в фосфодиэфирной связи, фосфоэфирной, карбаматной, дисульфидной или пептидной.
Расщепляемый компонент означает связь или группу атомов, которые расщепляются в физиологических условиях, например внутри клетки, животного или человека.
Комплементарный применительно к олигонуклеотиду означает, что последовательность нуклеиновых оснований такого олигонуклеотида или одной или нескольких его областей соответствует последовательности нуклеиновых оснований другого олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты или одной или нескольких их областей при выравнивании двух последовательностей нуклеиновых оснований в противоположных направлениях. Описанные в данном документе совпадения нуклеиновых оснований или комплементарные нуклеиновые основания ограничены следующими парами: аденин (А) и тимин (Т), аденин (А) и урацил (U), цитозин (С) и гуанин (G) и 5-метилцитозин (mC) и гуанин (G), если не указано иное. Комплементарные олигонуклеотиды и/или нуклеиновые кислоты не должны характеризоваться комплементарностью нуклеиновых оснований по каждому нуклеозиду и могут содержать одно или несколько несовпадений нуклеиновых оснований. В отличие от этого, полностью комплементарные или на 100% комплементарные применительно к олигонуклеотидам означает, что такие олигонуклеотиды характеризуются совпадениями нуклеиновых оснований по каждому нуклеозиду без каких-либо несовпадений нуклеиновых оснований.
Конъюгированная группа означает группу атомов, которая присоединена к олигонуклеотиду. Конъюгированные группы содержат конъюгированный компонент и конъюгирующий линкер, который присоединяет конъюгированный компонент к олигонуклеотиду.
Конъюгирующий линкер означает группу атомов, содержащую по меньшей мере одну связь, которая соединяет конъюгированный компонент с олигонуклеотидом.
Конъюгированный компонент означает группу атомов, которая присоединена к олигонуклеотиду посредством конъюгирующего линкера.
Смежный применительно к олигонуклеотиду относится к нуклеозидам, нуклеиновым основаниям, сахарным компонентам или межнуклеозидным связям, которые непосредственно примыкают друг к другу. Например, смежные нуклеиновые основания означают нуклеиновые основания, которые непосредственно примыкают друг к другу в последовательности.
Конструирование или сконструированный для относится к способу конструирования соединения, которое специфически гибридизируется с выбранной молекулой нуклеиновой кислоты.
Разбавитель означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекции может быть жидкостью, например физиологическим раствором.
Модифицированные разными способами означает химические модификации или химические заместители, которые отличаются друг от друга, включая отсутствие модификаций. Так, например, МОЕ-нуклеозид и немодифицированный нуклеозид ДНК являются модифицированными разными способами, даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Аналогичным образом, ДНК и РНК являются модифицированными разными способами, даже несмотря на то, что оба они представляют собой встречающиеся в природе немодифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды, которые являются одинаковыми, но содержат различные нуклеиновые основания, не являются модифицирован
- 5 047395 ными разными способами. Например, нуклеозид, содержащий 2'-ОМе-модифицированный сахар и немодифицированное адениновое нуклеиновое основание, и нуклеозид, содержащий 2'-ОМе-модифицированный сахар и немодифицированное тиминовое нуклеиновое основание, не являются модифицированными разными способами.
Доза означает определенное количество соединения или фармацевтического средства, предоставляемое за одно введение или за определенный период времени. В определенных вариантах осуществления доза может быть введена в виде двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в определенных вариантах осуществления, если необходимо подкожное введение, для необходимой дозы может потребоваться объем, который трудно вместить в одну инъекцию. В таких вариантах осуществления для достижения необходимой дозы можно применять две или более инъекции. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить двумя или более инъекциями для уменьшения реакции в месте инъекции у индивидуума. В других вариантах осуществления соединение или фармацевтическое средство вводят путем инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны в виде количества фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц.
Схема введения доз представляет собой комбинацию доз, разработанную для достижения одного или нескольких необходимых эффектов.
Двухнитевое антисмысловое соединение означает антисмысловое соединение, содержащее два олигомерных соединения, которые являются комплементарными друг другу и формируют дуплекс, и где одно из двух указанных олигомерных соединений содержит олигонуклеотид.
Эффективное количество означает количество соединения, достаточное для достижения необходимого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в соединении. Эффективное количество может варьироваться для индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуумов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки медицинского состояния индивидуума, а также других учитываемых факторов.
Эффективность означает способность обеспечивать желаемый эффект.
Экспрессия включает все функции, посредством которых закодированная в гене информация преобразуется в присутствующие и функционирующие в клетке структуры. Такие структуры включают без ограничения продукты транскрипции и трансляции.
Гэпмер означает олигонуклеотид, содержащий внутреннюю область, имеющую несколько нуклеозидов, которые способствуют расщеплению под действием РНКазы Н, расположенную между внешними областями, имеющими один или несколько нуклеозидов, где нуклеозиды, образующие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, образующих внешние области. Внутренняя область может называться гэпом, а внешние области могут называться флангами.
Гибридизация означает отжиг олигонуклеотидов и/или нуклеиновых кислот. Без ограничения конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм гибридизации предполагает образование водородных связей, которое может представлять собой образование водородных связей по типу уотсон-криковского, хугстиновского или обратного хугстиновского взаимодействия между комплементарными нуклеиновыми основаниями. В определенных вариантах осуществления комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты включают без ограничения антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень. В определенных вариантах осуществления комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты включают без ограничения олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.
Непосредственно примыкающий означает, что между непосредственно примыкающими элементами одного типа отсутствуют промежуточные элементы (например, между непосредственно примыкающими нуклеиновыми основаниями отсутствуют промежуточные нуклеиновые основания).
Индивидуум означает человека или отличного от человека животного, выбранного для лечения или терапии.
Подавление экспрессии или активности относится к снижению или блокированию экспрессии или активности по сравнению с экспрессией или активностью в необработанном или контрольном образце и не обязательно указывает на полное устранение экспрессии или активности.
Межнуклеозидная связь означает группу или связь, которые образуют ковалентную связь между примыкающими друг к другу нуклеозидами в олигонуклеотиде. Модифицированная межнуклеозидная связь означает любую межнуклеозидную связь, отличную от встречающейся в природе фосфатной межнуклеозидной связи. Нефосфатные связи называются в данном документе модифицированными межнуклеозидными связями.
Удлиненные олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат один или несколько дополнительных нуклеозидов по сравнению с олигонуклеотидом, раскрытым в данном документе, например, исходным олигонуклеотидом.
Связанные нуклеозиды означают примыкающие друг к другу нуклеозиды, связанные между собой межнуклеозидной связью.
Линкерный нуклеозид означает нуклеозид, который связывает олигонуклеотид с конъюгированным компонентом. Линкерные нуклеозиды расположены в конъюгирующем линкере соединения. Лин
- 6 047395 керные нуклеозиды не считаются частью олигонуклеотидной части соединения, даже если они являются смежными с олигонуклеотидом.
Несовпадающее или некомплементарное означает нуклеиновое основание первого олигонуклеотида, которое не является комплементарным соответствующему нуклеотидному основанию второго олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты-мишени при выравнивании первого и второго олигонуклеотидов. Например, нуклеиновые основания, в том числе без ограничения универсальные нуклеиновые основания инозин и гипоксантин, способны гибридизироваться по меньшей мере с одним нуклеиновым основанием, но тем не менее являются несовпадающими или некомплементарными относительно нуклеинового основания, с которым они гибридизируются. В качестве другого примера, нуклеиновое основание первого олигонуклеотида, которое не способно гибридизироваться с соответствующим нуклеиновым основанием второго олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты-мишени, при выравнивании первого и второго олигонуклеотидов является несовпадающим или некомплементарным нуклеиновым основанием.
Модулирование относится к изменению или корректировке признака в клетке, ткани, органе или организме. Например, модулирование РНК PNPLA3 может означать увеличение или уменьшение уровня РНК PNPLA3 и/или белка PNPLA3 в клетке, ткани, органе или организме. Модулятор осуществляет изменение в клетке, ткани, органе или организме. Например, оказывающее воздействие на PNPLA3 соединение может представлять собой модулятор, который обеспечивает уменьшение количества РНК PNPLA3 и/или белка PNPLA3 в клетке, ткани, органе или организме.
МОЕ означает метоксиэтил.
Мономер относится к одной структурной единице олигомера. Мономеры включают без ограничения нуклеозиды и нуклеотиды.
Мотив означает характерный участок из немодифицированных и/или модифицированных сахарных компонентов, нуклеиновых оснований и/или межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде.
Природные или встречающиеся в природе средства обнаруживаются в природе.
Небициклический модифицированный сахар или небициклический модифицированный сахарный компонент означает модифицированный сахарный компонент, который содержит модификацию, такую как заместитель, который не образует мостик между двумя атомами сахара с образованием второго кольца.
Нуклеиновая кислота относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает без ограничения рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), однонитевые нуклеиновые кислоты и двухнитевые нуклеиновые кислоты.
Нуклеиновое основание означает гетероциклический компонент, способный к спариванию с основанием другой нуклеиновой кислоты. Как используется в данном документе, встречающееся в природе нуклеиновое основание представляет собой аденин (А), тимин (Т), цитозин (С), урацил (U) и гуанин (G). Модифицированное нуклеиновое основание представляет собой встречающееся в природе нуклеиновое основание, которое является химически модифицированным. Универсальное основание или универсальное нуклеиновое основание представляет собой нуклеиновое основание, отличное от встречающегося в природе нуклеинового основания и модифицированного нуклеинового основания и способное к спариванию с любым нуклеиновым основанием.
Последовательность нуклеиновых оснований означает порядок расположения смежных нуклеиновых оснований в нуклеиновой кислоте или олигонуклеотиде независимо от какого-либо сахара или межнуклеозидной связи.
Нуклеозид означает соединение, содержащее нуклеиновое основание и сахарный компонент. Нуклеиновое основание и сахарный компонент независимо друг от друга являются немодифицированными или модифицированными. Модифицированный нуклеозид означает нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеиновое основание и/или модифицированный сахарный компонент. Модифицированные нуклеозиды включают в себя нуклеозиды с удаленными азотистыми основаниями, у которых отсутствует нуклеиновое основание.
Олигомерное соединение означает соединение, содержащее один олигонуклеотид и необязательно один или несколько дополнительных компонентов, таких как конъюгированная группа или концевая группа.
Олигонуклеотид означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга. Если не указано иное, олигонуклеотиды состоят из 8-80 связанных нуклеозидов. Модифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, где по меньшей мере один сахар, нуклеиновое основание или межнуклеозидная связь являются модифицированными. Немодифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, который не содержит какую-либо модификацию сахара, нуклеинового основания или межнуклеозидной связи.
Исходный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, последовательность которого применяют в качестве основы для конструирования большего количества олигонуклеотидов со сходной последовательностью, но с различной длиной, мотивами и/или химическими структурами. Новые сконструирован
- 7 047395 ные олигонуклеотиды могут иметь такую же или перекрывающуюся последовательность в сравнении с исходным олигонуклеотидом.
Парентеральное введение означает введение путем инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
Фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель означает любое вещество, подходящее для применения при введении индивидууму. Например, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой стерильный водный раствор, такой как PBS или вода для инъекций.
Фармацевтически приемлемые соли означают физиологически и фармацевтически приемлемые соли соединений, таких как олигомерные соединения или олигонуклеотиды, т.е. соли, которые сохраняют необходимую биологическую активность исходного соединения и не придают ему нежелательных токсикологических свойств.
Фармацевтическое средство означает соединение, которое оказывает терапевтически благоприятный эффект при введении индивидууму.
Фармацевтическая композиция означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько соединений или их соль и стерильный водный раствор.
Фосфотиоатная связь означает модифицированную фосфатную связь, в которой один из немостиковых атомов кислорода замещен атомом серы. Фосфотиоатная межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
Фосфорный компонент означает группу атомов, содержащую атом фосфора. В определенных вариантах осуществления фосфорный компонент включает в себя моно-, ди- или трифосфат или фосфотиоат.
Фрагмент означает определенное количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований олигомерного соединения.
Предупреждение относится к задержке или предотвращению начала проявления, развития или прогрессирования заболевания, нарушения или состояния в течение периода времени от нескольких минут до неопределенного срока.
Пролекарство означает соединение в форме вне организма, которое при введении индивидууму метаболизируется до другой формы внутри его организма или клеток. В определенных вариантах осуществления метаболизированная форма является активной или более активной формой соединения (например, лекарственного средства). Как правило, превращение пролекарства внутри организма облегчается благодаря действию фермента(ферментов) (например, эндогенного или вирусного фермента) или химического(химических) вещества(веществ), присутствующих в клетках или тканях, и/или физиологическим условиям.
Снижение означает доведение до меньших степени, размера, количества или числа.
№ в RefSeq представляет собой уникальную комбинацию букв и цифр, присвоенных последовательности, которые указывают на то, что последовательность соответствует конкретному транскриптумишени (например, гену-мишени). Такая последовательность и информация о гене-мишени (в совокупности, запись о гене) могут быть найдены в базе данных генетических последовательностей. Базы данных генетических последовательностей включают базу данных эталонных последовательностей NCBI, GenBank, Европейский архив нуклеотидов и Японский банк данных о ДНК (последние три образуют Международное сотрудничество баз данных по нуклеотидным последовательностям или INSDC).
Область определяется как фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, имеющий по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
Соединение для RNAi означает антисмысловое соединение, которое действует, по меньшей мере частично, посредством RISC или Ago2, но не посредством РНКазы Н, модулируя нуклеиновую кислотумишень и/или белок, кодируемый нуклеиновой кислотой-мишенью. Соединения для RNAi включают без ограничения двухнитевую siRNA, однонитевую РНК (ssRNA) и microRNA, в том числе миметики microRNA.
Сегменты определяются как более мелкие фрагменты или субфрагменты областей в пределах нуклеиновой кислоты.
Побочные эффекты означают физиологическое заболевание и/или состояния, связанные с лечением, которые отличаются от желаемых эффектов. В определенных вариантах осуществления побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномалии функциональных печеночных проб, аномалии функционирования почек, гепатотоксичность, почечную токсичность, аномалии функционирования центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке крови могут указывать на гепатотоксичность или аномалию функционирования печени. На
- 8 047395 пример, повышенные уровни билирубина могут указывать на гепатотоксичность или аномалию функционирования печени.
Однонитевое применительно к соединению означает, что соединение имеет только один олигонуклеотид. Самокомплементарный означает олигонуклеотид, который по меньшей мере частично гибридизируется сам с собой. Соединение, состоящее из одного олигонуклеотида, где олигонуклеотид соединения является самокомплементарным, является однонитевым соединением. Однонитевое соединение может быть способно связываться с комплементарным соединением с образованием дуплекса.
Сайты определяются как уникальные положения нуклеиновых оснований в пределах нуклеиновой кислоты-мишени.
Специфически гибридизирующийся относится к олигонуклеотиду, характеризующемуся достаточной степенью комплементарности между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью для индуцирования желаемого эффекта, проявляющему в то же время минимальные эффекты или не проявляющему такие эффекты в отношении нуклеиновых кислот, не являющихся мишенями. В определенных вариантах осуществления специфическая гибридизация происходит в физиологических условиях.
Специфическое подавление применительно к нуклеиновой кислоте-мишени означает снижение или блокирование экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени при проявлении в то же время меньших, минимальных эффектов или без проявления таких эффектов в отношении нуклеиновых кислот, не являющихся мишенями. Снижение не обязательно указывает на полное устранение экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени.
Стандартный клеточный анализ означает анализ(анализы), описанные в примерах, и их приемлемые варианты.
Стандартный эксперимент in vivo означает процедуру(процедуры), описанные в примере(примерах), и их приемлемые варианты.
Стереослучайный хиральный центр в контексте совокупности молекул с идентичной молекулярной формулой означает хиральный центр, имеющий случайную стереохимическую конфигурацию. Например, в совокупности молекул, содержащих стереослучайный хиральный центр, количество молекул, имеющих ^-конфигурацию стереослучайного хирального центра, может необязательно являться таким же, как количество молекул, имеющих ^-конфигурацию стереослучайного хирального центра. Стереохимическая конфигурация хирального центра считается случайной, если она является результатом способа синтеза, который не предназначен для контроля стереохимической конфигурации. В определенных вариантах осуществления стереослучайный хиральный центр представляет собой стереослучайную фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
Сахарный компонент означает немодифицированный сахарный компонент или модифицированный сахарный компонент. Немодифицированный сахарный компонент или немодифицированный сахар означает 2'-ОН(Н)-ри6озильный компонент, обнаруживаемый в РНК (немодифицированный сахарный компонент РНК), или 2'-Н(Н)-компонент, обнаруживаемый в ДНК (немодифицированный сахарный компонент ДНК). Модифицированный сахарный компонент или модифицированный сахар означает модифицированный фуранозильный сахарный компонент или имитатор сахара. Модифицированный фуранозильный сахарный компонент означает фуранозильный сахар, содержащий отличный от атома водорода заместитель вместо по меньшей мере одного атома водорода или гидроксила немодифицированного сахарного компонента. В определенных вариантах осуществления модифицированный фуранозильный сахарный компонент представляет собой 2'-замещенный сахарный компонент. Такие модифицированные фуранозильные сахарные компоненты включают в себя бициклические сахара и небициклические сахара.
Имитатор сахара означает модифицированный сахарный компонент, отличный от фуранозильного компонента, который может связывать нуклеиновое основание с другой группой, такой как межнуклеозидная связь, конъюгированная группа или концевая группа, в олигонуклеотиде. Модифицированные нуклеозиды, содержащие имитаторы сахаров, могут быть включены в состав олигонуклеотида в одном или нескольких положениях, и такие олигонуклеотиды способны к гибридизации с комплементарными соединениями или нуклеиновыми кислотами.
Синергизм или действовать синергетическим образом относится к эффекту комбинации, который превышает совокупный эффект каждого компонента по отдельности в тех же дозах.
PNPLA3 означает любую нуклеиновую кислоту или белок PNPLA3. Нуклеиновая кислота PNPLA3 означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую PNPLA3. Например, в определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота PNPLA3 включает последовательность ДНК, кодирующую PNPLA3, последовательность РНК, транскрибируемую из ДНК, кодирующей PNPLA3 (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и последовательность mRNA, кодирующую PNPLA3. mRNA PNPLA3 означает mRNA, кодирующую белок PNPLA3. Мишень может быть указана в верхнем или нижнем регистре.
Специфический ингибитор PNPLA3 относится к любому средству, способному к специфическому подавлению экспрессии или активности РНК PNPLA3 и/или белка PNPLA3 на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы PNPLA3 включают нуклеиновые кислоты (в том числе антисмы
- 9 047395 еловые соединения), пептиды, антитела, малые молекулы и другие средства, способные к подавлению экспрессии РНК PNPLA3 и/или белка PNPLA3.
Ген-мишень относится к гену, кодирующему мишень.
Нацеливание означает специфическую гибридизацию соединения с нуклеиновой кислотоймишенью с целью индуцирования желаемого эффекта.
Все из нуклеиновой кислоты-мишени, РНК-мишени, РНК-транскрипта-мишени и нуклеиновой кислоты-мишени означают нуклеиновую кислоту, на которую способны нацеливаться соединения, описанные в данном документе.
Область-мишень означает фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, на который нацеливается одно или несколько соединений.
Сегмент-мишень означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацеливается соединение. 5'-концевой сайт-мишень относится к самому крайнему 5'-концевому нуклеотиду сегмента-мишени. З'-концевой сайт-мишень относится к самому крайнему З'-концевому нуклеотиду сегмента-мишени.
Концевая группа означает химическую группу или группу атомов, которая ковалентно связана с концом олигонуклеотида.
Терапевтически эффективное количество означает количество соединения, фармацевтического средства или композиции, которое оказывает терапевтически благоприятный эффект в отношении индивидуума.
Лечение относится к введению соединения или фармацевтической композиции животному с целью осуществления изменения или улучшения в отношении заболевания, нарушения или состояния у животного.
Определенные варианты осуществления
В определенных вариантах осуществления предусмотрены способы, соединения и композиции для подавления экспрессии PNPLA3 (PNPLA3).
В определенных вариантах осуществления предусмотрены соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту PNPLA3. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота PNPLA3 имеет последовательность, приведенную в RefSeq или GENBANK под номером доступа NM_025225.2 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 1); NC_000022.11 с усечением нуклеотидов от 43921001 до 43954500 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 2); AK123806.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под
SEQ ID NO: 3); BQ686328.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под
SEQ ID NO: 4); BF762711.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под
SEQ ID NO: 5); DA290491.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под
SEQ ID NO: 6); и последовательности, перечисленные под SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение является однонитевым. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
В определенных вариантах осуществления предусмотрено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение является однонитевым. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым.
В определенных вариантах осуществления предусматривается соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение является однонитевым. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым.
В определенных вариантах осуществления предусмотрено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов и в пределах нуклеотидных оснований 5567-5642, 5644-5731, 5567-5731, 5567-5620, 13697-13733, 20553-20676, 20664-20824, 20553-20824 и 25844-25912 и являющийся комплементарным по отношению к SEQ ID NO: 2, где указанный модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95 или 100% комплементарным по отношению к SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение является однонитевым. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым.
В определенных вариантах осуществления соединения нацеливаются на нуклеотиды 5567-5620
- 10 047395 нуклеиновой кислоты PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединения нацеливаются на участок в пределах нуклеотидов 5567-5642, 5644-5731, 5567-5731, 5567-5620 нуклеиновой кислоты PNPLA3, имеющей последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления соединения содержат фрагмент по меньшей мере из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований, комплементарный фрагменту равной длины в пределах нуклеотидов 5567-5642, 5644-5731, 5567-5731, 5567-5620 нуклеиновой кислоты PNPLA3, имеющей последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления такие соединения представляют собой антисмысловые соединения, олигомерные соединения или олигонуклеотиды.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую фрагмент по меньшей мере из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 1089.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую SEQ ID NO: 1089.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, который имеет последовательность нуклеиновых оснований, состоящую из SEQ ID NO: 1089.
В определенных вариантах осуществления соединения, нацеленные на PNPLA3, представляют собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. Из более чем 2384 соединений, которые были подвергнуты скринингу, как описано в разделе Примеры ниже, ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 и 975612 оказались наилучшими лидерными соединениями.
В определенных вариантах осуществления любой из вышеперечисленных модифицированных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, по меньшей мере один модифицированный сахар и/или по меньшей мере одно модифицированное нуклеиновое основание.
В определенных вариантах осуществления любой из вышеперечисленных модифицированных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-О-метоксиэтильную группу. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар, такой как содержащий группу 4'-СН(СНз)-О-2', группу 4'-CH2-O-2' или группу 4'-(CH2)2-O-2'.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, такую как фосфотиоатная межнуклеозидная связь.
В определенных вариантах осуществления любой из вышеперечисленных модифицированных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере одно модифицированное нуклеиновое основание, такое как 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления любой из вышеперечисленных модифицированных олигонуклеотидов содержит:
гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов;
где гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и З'-концевым фланговым сегментом, и где каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит модифицированный сахар.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов, при этом он имеет последовательность нуклеиновых оснований, предусматривающую последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов, при этом он имеет последовательность нуклеиновых оснований, состоящую из последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 1089.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит или состоит из модифицированного олигонуклеотида, имеющего длину 16 связанных нуклеиновых оснований, при этом он имеет последовательность нуклеиновых оснований, предусматривающую последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1089, где модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и З'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом
- 11 047395 каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов.
В определенных вариантах осуществления соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида и конъюгированной группы, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и состоит из последовательности под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа расположена на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида и представляет собой:
НО ОН
НО он
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916333 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975616 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 12 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975616 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975613 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 13 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975613 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975612 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 14 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975612 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916789 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 15 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 916789 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916602 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 16 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 916602 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
- 17 047395
В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение или олигонуклеотид могут быть по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99 или 100% комплементарными нуклеиновой кислоте, кодирующей PNPLA3.
В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым. В определенных вариантах осуществления соединение содержит дезоксирибонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым. В определенных вариантах осуществления соединение является двухнитевым и содержит рибонуклеотиды. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, описанный в данном документе, и конъюгированную группу. В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа содержит по меньшей мере один N-ацетилгалактозамин (GalNAc), по меньшей мере два N-ацетилгалактозамина (GalNAc) или по меньшей мере три N-ацетилгалактозамина (GalNAc).
В определенных вариантах осуществления соединения или композиции, предусмотренные в данном документе, содержат фармацевтически приемлемую соль модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления соль представляет собой натриевую соль. В определенных вариантах осуществления соль представляет собой калиевую соль.
В определенных вариантах осуществления соединения или композиции, описанные в данном документе, являются активными в силу того, что они характеризуются по меньшей мере одной из IC50 in vitro, составляющей менее 2 мкМ, менее 1,5 мкМ, менее 1 мкМ, менее 0,9 мкМ, менее 0,8 мкМ, менее 0,7 мкМ, менее 0,6 мкМ, менее 0,5 мкМ, менее 0,4 мкМ, менее 0,3 мкМ, менее 0,2 мкМ, менее 0,1 мкМ, менее 0,05 мкМ, менее 0,04 мкМ, менее 0,03 мкМ, менее 0,02 мкМ или менее 0,01 мкМ.
В определенных вариантах осуществления соединения или композиции, описываемые в данном документе, хорошо переносятся, что показано с помощью того, что они характеризуются по меньшей мере одним из значений повышения уровня аланинаминотрансферазы (ALT) или аспартаттрансаминазы (AST), составляющим не более чем в 4 раза, в 3 раза или в 2 раза, по сравнению с контрольными животными или повышением массы печени, селезенки или почки, составляющим не более чем на 30, 20, 15, 12, 10, 5 или 2%, по сравнению с контрольными животными. В определенных вариантах осуществления соединения или композиции, описанные в данном документе, хорошо переносятся, что демонстрируется отсутствием повышения уровней ALT или AST по сравнению с контрольными животными. В определенных вариантах осуществления соединения или композиции, описанные в данном документе, хорошо переносятся, что демонстрируется отсутствием повышения массы печени, селезенки или почки по сравнению с контрольными животными.
В определенных вариантах осуществления предусматривается композиция, содержащая соединение согласно любому из вышеуказанных вариантов осуществления или любую его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один из фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя. В определенных вариантах осуществления композиция имеет вязкость, составляющую менее чем приблизительно 40 сП (сантипуаз), менее чем приблизительно 30 сП, менее чем приблизительно 20 сП, менее чем приблизительно 15 сП или менее чем приблизительно 10 сП. В определенных вариантах осуществления композиция, имеющая любое из вышеуказанных значений вязкости, содержит соединение, предусмотренное в данном документе, в концентрации приблизительно 100 мг/мл, приблизительно 125 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 175 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл, приблизительно 225 мг/мл, приблизительно 250 мг/мл, приблизительно 275 мг/мл или приблизительно 300 мг/мл. В определенных вариантах осуществления композиция, имеющая любое из вышеуказанных значений вязкости и/или концентрации соединения, имеет температуру, соответствующую комнатной температуре или составляющую приблизительно 20°С, приблизительно 21°С, приблизительно 22°С, приблизительно 23°С, приблизительно 24°С, приблизительно 25°С, приблизительно 26°С, приблизительно 27°С, приблизительно 28°С, приблизительно 29°С или приблизительно 30°С.
Некоторые показания.
Определенные варианты осуществления, предусмотренные в данном документе, относятся к способам подавления экспрессии PNPLA3, которые могут быть применимыми для лечения, предупреждения или уменьшения выраженности заболевания, ассоциированного с PNPLA3, у индивидуума путем введения соединения, которое нацеливается на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение может представлять собой специфический ингибитор PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение, олигомерное соединение или олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3.
Примеры заболеваний, ассоциированных с PNPLA3, поддающихся лечению, предупреждению и/или уменьшению их выраженности с помощью способов, предусмотренных в данном документе,
- 18 047395 включают заболевание печени, NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярную карциному, алкогольную болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит. Определенные соединения, представленные в данном документе, направлены на соединения и композиции, которые обеспечивают снижение повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у животного.
В определенных вариантах осуществления способ лечения, предупреждения или уменьшения выраженности заболевания, ассоциированного с PNPLA3, у индивидуума включает введение индивидууму соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, за счет чего осуществляется лечение, предупреждение или уменьшение выраженности заболевания. В определенных вариантах осуществления индивидуум идентифицирован как имеющий заболевание, ассоциированное с PNPLA3, или подверженный риску его развития. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание печени. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение вводят индивидууму парентерально. В определенных вариантах осуществления введение соединения обеспечивает улучшение в отношении повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, цирроза, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени, профилактику или предупреждение таковых у животного.
В определенных вариантах осуществления способ лечения, предупреждения или уменьшения выраженности повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у животного включает введение индивидууму соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, за счет чего осуществляется лечение, предупреждение или уменьшение выраженности повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение вводят индивидууму парентерально. В определенных вариантах осуществления введение соединения обеспечивает улучшение в отношении повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени, профилактику или предупреждение таковых. В определенных вариантах осуществления индивидуум идентифицирован как имеющий заболевание, ассоциированное с PNPLA3, или подверженный риску его развития.
В определенных вариантах осуществления способ подавления экспрессии PNPLA3 у индивидуума, у которого имеется заболевание, ассоциированное с PNPLA3, или который подвержен риску его разви
- 19 047395 тия, включает введение индивидууму соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, за счет чего осуществляется подавление экспрессии PNPLA3 у индивидуума. В определенных вариантах осуществления введение соединения обеспечивает подавление экспрессии PNPLA3 в печени. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание печени. В определенных вариантах осуществления у индивидуума имеется NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома, алкогольная болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит, или он подвержен риску их развития. В определенных вариантах осуществления у индивидуума имеется повреждение печени, стеатоз, фиброз печени, воспаление печени, рубцевание печени или цирроз, печеночная недостаточность, увеличение печени, повышенные уровни трансаминаз или накопление жира в печени или, он подвержен риску их развития. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение вводят индивидууму парентерально. В определенных вариантах осуществления введение соединения обеспечивает улучшение в отношении повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени, профилактику или предупреждение таковых.
В определенных вариантах осуществления способ подавления экспрессии PNPLA3 в клетке включает приведение клетки в контакт с соединением, содержащим специфический ингибитор PNPLA3, за счет чего осуществляется подавление экспрессии PNPLA3 в клетке. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой гепатоцит. В определенных вариантах осуществления клетка находится в печени. В определенных вариантах осуществления клетка находится в печени индивидуума, у которого имеется повреждение печени, стеатоз, фиброз печени, воспаление печени, рубцевание печени или цирроз, печеночная недостаточность, увеличение печени, повышенные уровни трансаминаз или накопление жира в печени или который подвержен риску их развития. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
В определенных вариантах осуществления способ снижения или подавления повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у индивидуума, у которого имеется заболевание, ассоциированное с PNPLA3, или который подвержен риску его развития, включает введение индивидууму соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, за счет чего осуществляется снижение или подавление повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у индивидуума. В определенных вариантах осуществления у индивидуума имеется NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатоге
- 20 047395 патит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома, алкогольная болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит, или он подвержен риску их развития. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение вводят индивидууму парентерально. В определенных вариантах осуществления индивидуум идентифицирован как имеющий заболевание, ассоциированное с PNPLA3, или подверженный риску его развития.
Определенные варианты осуществления охватывают соединение, содержащее специфический ингибитор PNPLA3, для применения в лечении заболевания, ассоциированного с PNPLA3. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярную карциному, алкогольную болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления соединение вводят индивидууму парентерально.
Определенные варианты осуществления охватывают соединение, содержащее специфический ингибитор PNPLA3, для применения для снижения или подавления повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у индивидуума, у которого имеется NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома, алкогольная болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит или который подвержен риску их развития. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления
- 21 047395 соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
Определенные варианты осуществления охватывают применение соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, для изготовления или получения лекарственного препарата для лечения заболевания, ассоциированного с PNPLA3.
Определенные варианты осуществления охватывают применение соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, для получения лекарственного препарата, предназначенного для лечения заболевания, ассоциированного с PNPLA3. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание печени. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярную карциному, алкогольную болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
Определенные варианты осуществления охватывают применение соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, для изготовления или получения лекарственного препарата для снижения или подавления повреждения печени, стеатоза, фиброза печени, воспаления печени, рубцевания печени или цирроза, печеночной недостаточности, увеличения печени, повышенных уровней трансаминаз или накопления жира в печени у индивидуума, у которого имеется заболевание печени, ассоциированное с PNPLA3, или который подвержен риску его развития. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярную карциному, алкогольную болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит. Определенные варианты осуществления охватывают применение соединения, содержащего специфический ингибитор PNPLA3, для получения лекарственного препарата для лечения заболевания, ассоциированного с PNPLA3. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой NAFLD, стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, гепатоцеллюлярную карциному, алкогольную болезнь печени, алкогольный стеатогепатит (ASH), гепатит, вызванный HCV, хронический гепатит, наследственный гемохроматоз или первичный склерозирующий холангит. В определенных вариантах осуществления соединение содержит антисмысловое соединение, нацеленное на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид, нацеленный на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательностей нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой ION 975616, 994284, 975605, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 или 975612. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может быть однонитевым или двухнитевым. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления соединение может представлять собой антисмысловое соединение или олигомерное соединение.
В любом из вышеперечисленных способов или вариантов применения соединение может быть нацеленным на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение содержит или состоит из модифицированного олигонуклеотида, например модифицированного олигонуклеотида длиной 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95 или 100% комплементарным любой из последовательностей нуклеиновых оснований, приведенных
- 22 047395 под SEQ ID NO: 1-10. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, по меньшей мере один модифицированный сахар и/или по меньшей мере одно модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар или 2'-О-метоксиэтил-модифицированный сахар, а модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; 5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов; и 3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов, где гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, непосредственно примыкая к ним, и где каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит модифицированный сахар.
В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95 или 100% комплементарным любой из последовательностей нуклеиновых оснований, приведенных под SEQ ID NO: 1-10.
В любом из вышеперечисленных способов или вариантов применения соединение содержит или состоит из модифицированного олигонуклеотида, имеющего длину 16 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеиновых оснований, содержащую SEQ ID NO: 1089, где модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из связанных 2'-дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, и при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит модифицированный сахар.
В любом из вышеперечисленных способов или вариантов применения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных нуклеозидов, или состоит из него, который имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1089, где модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916333 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 23 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975616 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975616 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
- 24 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975613 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975613 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
- 25 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 975612 или его соль или со стоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую соль 975612 или состо ит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
- 26 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916789 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую солью 916789 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В определенных вариантах осуществления соединение содержит ION 916602 или его соль или состоит из них, при этом они имеют следующую химическую структуру:
- 27 047395
В определенных вариантах осуществления соединение содержит натриевую солью 916602 или состоит из нее, при этом она имеет следующую химическую структуру:
В любом из вышеперечисленных способов или вариантов применения соединение можно вводить парентерально. Например, в определенных вариантах осуществления соединение можно вводить посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
Некоторые соединения.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, могут представлять собой антисмысловые соединения. В определенных вариантах осуществления антисмысловое соединение содержит олигомерное соединение или состоит из него. В определенных вариантах осуществления олигомерное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых
- 28 047395 оснований, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, содержит модифицированный олигонуклеотид или состоит из него. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
В определенных вариантах осуществления соединение или антисмысловое соединение является однонитевым. Такое однонитевое соединение или антисмысловое соединение содержит олигомерное соединение или состоит из него. В определенных вариантах осуществления такое олигомерное соединение содержит олигонуклеотид и необязательно конъюгированную группу или состоит из них. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид является модифицированным. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид однонитевого антисмыслового соединения или олигомерного соединения содержит самокомплементарную последовательность нуклеиновых оснований.
В определенных вариантах осуществления соединения являются двухнитевыми. Такие двухнитевые соединения содержат первый модифицированный олигонуклеотид, имеющий область, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени, и второй модифицированный олигонуклеотид, имеющий область, комплементарную первому модифицированному олигонуклеотиду. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид представляет собой РНК-олигонуклеотид. В таких вариантах осуществления тиминовое нуклеиновое основание в модифицированном олигонуклеотиде замещено урациловым нуклеиновым основанием. В определенных вариантах осуществления соединение содержит конъюгированную группу. В определенных вариантах осуществления один из модифицированных олигонуклеотидов является конъюгированным. В определенных вариантах осуществления оба модифицированных олигонуклеотида являются конъюгированными. В определенных вариантах осуществления первый модифицированный олигонуклеотид является конъюгированным. В определенных вариантах осуществления второй модифицированный олигонуклеотид является конъюгированным. В определенных вариантах осуществления первый модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов, и второй модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления один из модифицированных олигонуклеотидов имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 1089.
В определенных вариантах осуществления антисмысловые соединения являются двухнитевыми. Такие двухнитевые антисмысловые соединения содержат первое олигомерное соединение, имеющее область, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени, и второе олигомерное соединение, имеющее область, комплементарную первому олигомерному соединению. Первое олигомерное соединение таких двухнитевых антисмысловых соединений, как правило, содержит модифицированный олигонуклеотид и необязательно конъюгированную группу или состоит из них. Олигонуклеотид второго олигомерного соединения такого двухнитевого антисмыслового соединения может быть модифицированным или немодифицированным. Любое из олигомерных соединений двухнитевого антисмыслового соединения или оба из них могут содержать конъюгированную группу. Олигомерные соединения двухнитевых антисмысловых соединений могут содержать некомплементарные нуклеозиды выступающих концов.
Примеры однонитевых и двухнитевых соединений включают без ограничения олигонуклеотиды, siRNA, олигонуклеотиды, нацеливающиеся на микроРНК, и однонитевые соединения для RNAi, такие как малые шпилечные РНК (shRNA), однонитевые siRNA (ssRNA) и миметики микроРНК.
В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая, будучи записанной в направлении 5'-3', содержит последовательность, обратно комплементарную сегменту-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую оно нацеливается.
В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, содержит олигонуклеотид, имеющий длину 16 связанных субъединиц. В определенных вариантах осуществления связанные субъединицы представляют собой нуклеотиды, нуклеозиды или нуклеиновые основания.
В определенных вариантах осуществления соединение может дополнительно содержать дополнительные компоненты или элементы, такие как конъюгированная группа, которые присоединены к олигонуклеотиду. В определенных вариантах осуществления такие соединения представляют собой антисмысловые соединения. В определенных вариантах осуществления такие соединения представляют собой олигомерные соединения. В вариантах осуществления, в которых конъюгированная группа содержит нуклеозид (т.е. нуклеозид, который связывает конъюгированную группу с олигонуклеотидом), нуклеозид конъюгированной группы не учитывается в длине олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления соединения могут быть укороченными или усеченными. Например, одна субъединица может быть удалена с 5'-конца (5'-концевое усечение) или, в качестве альтернативы, с 3'-конца (3'-концевое усечение). В укороченном или усеченном соединении, нацеленном на нуклеиновую кислоту PNPLA3, могут быть удалены две субъединицы на 5'-конце или в качестве альтернативы могут быть удалены две субъединицы на 3'-конце соединения. В качестве альтернативы, удален
- 29 047395 ные нуклеозиды могут быть распределены по всему соединению.
При наличии в удлиненном соединении одной дополнительной субъединицы дополнительная субъединица может быть расположена на 5'- или 3'-конце соединения. При наличии двух или более дополнительных субъединиц добавленные субъединицы могут примыкать друг к другу, например, в соединении, имеющем две субъединицы, добавленные на 5'-конце (5'-концевое добавление) или, в качестве альтернативы, на 3'-конце (3'-концевое добавление) соединения. В качестве альтернативы, добавленные субъединицы могут быть распределены по всему соединению.
Существует возможность увеличения или уменьшения длины соединения, такого как олигонуклеотид, и/или введения несовпадающих оснований без устранения активности (Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:7305-7309; Gautschi et al., J., Natl. Cancer Inst. March 2001, 93:463-471; Maher and Dolnick Nuc. Acid. Res. 1998, 16:3341-3358). Однако, казалось бы, небольшие изменения в последовательности, химических структурах и мотивах олигонуклеотида могут сильно повлиять на одно или несколько из множества свойств, необходимых для клинического исследования (Seth et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 10; Egli et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16642).
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, представляют собой соединения на основе интерферирующей РНК (для RNAi), которые включают в себя соединения на основе двухнитевой РНК (также называемые короткими интерферирующими РНК или siRNA) и соединения на основе однонитевой RNAi (или ssRNA). Такие соединения осуществляют свою функцию по меньшей мере частично посредством сигнального пути RISC с разрушением и/или секвестрацией нуклеиновой кислоты-мишени (следовательно, включают в себя соединения на основе microRNA/миметиков microRNA). Подразумевается, что используемый в данном документе термин siRNA эквивалентен другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны опосредовать RNAi, специфическую в отношении последовательности, например, короткой интерферирующей РНК (siRNA), двухнитевой РНК (dsRNA), микроРНК (miRNA), короткой шпилечной РНК (shRNA), короткому интерферирующему олигонуклеотиду, короткой интерферирующей нуклеиновой кислоте, короткому интерферирующему модифицированному олигонуклеотиду, химически модифицированной siRNA, РНК для посттранскрипционного сайленсинга генов (ptgsRNA) и другим. Кроме того, подразумевается, что используемый в данном документе термин RNAi эквивалентен другим терминам, используемым для описания РНК-интерференции, специфической в отношении последовательности, таким как посттранскрипционный сайленсинг генов, подавление трансляции или эпигенетические механизмы.
В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, может содержать любую из описанных в данном документе олигонуклеотидных последовательностей, нацеливающихся на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение может быть двухнитевым. В определенных вариантах осуществления соединение содержит первую нить, содержащую фрагмент по меньшей мере из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 1089, и вторую нить. В определенных вариантах осуществления соединение содержит первую нить, содержащую последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, и вторую нить. В определенных вариантах осуществления соединение содержит рибонуклеотиды, при этом первая нить содержит урацил (U) вместо тимина (Т) в SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит (i) первую нить, содержащую последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную сайту в PNPLA3, на который нацеливается SEQ ID NO: 1089, и (ii) вторую нить. В определенных вариантах осуществления соединение содержит один или несколько модифицированных нуклеотидов, у которых в 2'-положении сахара содержится галоген (такой как группа фтора; 2'-F) или содержится алкоксигруппа (такая как метоксигруппа; 2'-ОМе). В определенных вариантах осуществления соединение содержит по меньшей мере одну 2'-Е-модификацию сахара и по меньшей мере одну 2'-ОМе-модификацию сахара. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна 2'-Е-модификация сахара и по меньшей мере одна 2'-ОМе-модификация сахара расположены в чередующемся порядке на протяжении по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований вдоль нити соединения на основе dsRNA. В определенных вариантах осуществления соединение содержит между прилегающими нуклеотидами одну или несколько связей, отличных от встречающейся в природе фосфодиэфирной связи. Примеры таких связей включают фосфорамидные, фосфотиоатные и фосфодитиоатные связи. Соединения также могут представлять собой химически модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, как раскрыто в патенте США № 6673661. В других вариантах осуществления соединение содержит одну или две кэпированные нити, как раскрыто, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 г.
В определенных вариантах осуществления первая нить соединения представляет собой направляющую нить siRNA, а вторая нить соединения представляет собой сопровождающую нить siRNA. В определенных вариантах осуществления вторая нить соединения комплементарна первой нити. В определенных вариантах осуществления каждая нить соединения имеет длину 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления первая или вторая нить соединения может содержать конъюгированную группу.
- 30 047395
В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, может содержать любую из описанных в данном документе олигонуклеотидных последовательностей, нацеливающихся на PNPLA3. В определенных вариантах осуществления соединение является однонитевым. В определенных вариантах осуществления такое соединение представляет собой однонитевое соединение для RNAi (ssRNAi). В определенных вариантах осуществления соединение содержит фрагмент по меньшей мере из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит рибонуклеотиды, при этом урацил (U) располагается на месте тимина (Т) в SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную сайту в PNPLA3, на который нацелена SEQ ID NO: 1089. В определенных вариантах осуществления соединение содержит один или несколько модифицированных нуклеотидов, у которых в 2'-положении в сахаре содержится галоген (такой как группа фтора; 2'-F) или содержится алкоксигруппа (такая как метоксигруппа; 2'-ОМе). В определенных вариантах осуществления соединение содержит по меньшей мере одну 2'-Е-модификацию сахара и по меньшей мере одну 2'-ОМе-модификацию сахара. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна 2'-Е-модификация сахара и по меньшей мере одна 2'-ОМе-модификация сахара расположены в чередующемся порядке на протяжении по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеиновых оснований вдоль нити соединения. В определенных вариантах осуществления соединение содержит между прилегающими нуклеотидами одну или несколько связей, отличных от встречающейся в природе фосфодиэфирной связи. Примеры таких связей включают фосфорамидные, фосфотиоатные и фосфодитиоатные связи. Соединения также могут представлять собой химически модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, как раскрыто в патенте США № 6673661. В других вариантах осуществления соединение содержит кэпированную нить, как раскрыто, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 г. В определенных вариантах осуществления соединение состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления соединение может содержать конъюгированную группу.
Некоторые механизмы.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат модифицированные олигонуклеотиды или состоят из них. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, представляют собой антисмысловые соединения. В определенных вариантах осуществления соединения содержат олигомерные соединения. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, способны гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, что приводит к по меньшей мере одной форме антисмысловой активности. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, избирательно воздействуют на одну или несколько нуклеиновых кислот-мишеней. Такие соединения содержат последовательность нуклеиновых оснований, которая гибридизируется с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами-мишенями, что приводит к одной или нескольким формам желаемой антисмысловой активности, и не гибридизируется с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, не являющимися мишенями, или не гибридизируется с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, не являющимися мишенями, таким образом, что это приводит к значительной нежелательной антисмысловой активности.
При определенных формах антисмысловой активности гибридизация соединения, описанного в данном документе, с нуклеиновой кислотой-мишенью приводит к привлечению белка, который расщепляет нуклеиновую кислоту-мишень. Например, определенные соединения, описанные в данном документе, приводят к опосредованному РНКазой H расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени. РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет нить РНК в дуплексе РНК:ДНК. ДНК в таком дуплексе РНК:ДНК необязательно должна быть немодифицированной ДНК. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, являются достаточно ДНК-подобными, чтобы вызывать активность РНКазы H. Кроме того, в определенных вариантах осуществления допускаются один или несколько нуклеозидов, не являющихся ДНК-подобными, в гэп-сегменте гэпмера.
При определенных формах антисмысловой активности соединения, описанные в данном документе, или фрагмент соединения включается в состав РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC), что, в конечном счете, приводит к расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени. Например, определенные соединения, описанные в данном документе, приводят к расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени с помощью белка Argonaute. Соединения, которые включаются в состав RISC, являются соединениями для RNAi. Соединения для RNAi могут быть двухнитевыми (siRNA) или однонитевыми (ssRNA).
В определенных вариантах осуществления гибридизация соединений, описанных в данном документе, с нуклеиновой кислотой-мишенью не приводит к привлечению белка, который расщепляет нуклеиновую кислоту-мишень. В определенных подобных вариантах осуществления гибридизация соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью приводит к изменению сплайсинга нуклеиновой кислотымишени. В определенных вариантах осуществления гибридизация соединения с нуклеиновой кислотой
- 31 047395 мишенью приводит к подавлению связывающего взаимодействия между нуклеиновой кислотоймишенью и белком или другой нуклеиновой кислотой. В определенных подобных вариантах осуществления гибридизация соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью приводит к изменению трансляции нуклеиновой кислоты-мишени.
Формы антисмысловой активности можно наблюдать непосредственно или опосредованно. В определенных вариантах осуществления наблюдение или выявление антисмысловой активности предусматривает наблюдение или выявление изменения количества нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью, изменения соотношения сплайс-вариантов нуклеиновой кислоты или белка и/или фенотипического изменения в клетке или у животного.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотид, содержащий область, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени, или состоят из него. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень представляет собой молекулу эндогенной РНК. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок. В определенных подобных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень выбрана из mRNA и пре-mRNA, содержащей интронные, экзонные и нетранслируемые области. В определенных вариантах осуществления РНК-мишень представляет собой mRNA. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень представляет собой пре-mRNA. В определенных подобных вариантах осуществления область-мишень полностью находится в пределах интрона. В определенных вариантах осуществления область-мишень охватывает экзон-интронное сочленение. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 50% области-мишени находится в пределах интрона.
Нуклеотидные последовательности, которые кодируют PNPLA3, включают без ограничения следующие: приведенную в RefSeq или GENBANK под номерами доступа NM_025225.2 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 1); приведенную в GENBANK под номером доступа NC_000022.11 с усечением нуклеотидов от 43921001 до 43954500 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 2); AK123806.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 3); BQ686328.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 4); BF762711.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 5); DA290491.1 (включена посредством ссылки, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 6) и последовательности, перечисленные под SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.
Гибридизация.
В некоторых вариантах осуществления между соединением, раскрытым в данном документе, и нуклеиновой кислотой PNPLA3 происходит гибридизация. Наиболее распространенный механизм гибридизации предполагает образование водородных связей (например, образование водородных связей по типу уотсон-криковского, хугстиновского или обратного хугстиновского взаимодействия) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Условия гибридизации зависят от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновой кислоты, подлежащих гибридизации.
Способы определения того, может ли последовательность специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известны из уровня техники. В определенных вариантах осуществления соединения, предусмотренные в данном документе, могут специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой PNPLA3.
Комплементарностъ.
Говорят, что олигонуклеотид является комплементарным другой нуклеиновой кислоте, если последовательность нуклеиновых оснований такого олигонуклеотида или одной или нескольких его областей соответствует последовательности нуклеиновых оснований другого олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты или одной или нескольких их областей при выравнивании двух последовательностей нуклеиновых оснований в противоположных направлениях. Описанные в данном документе совпадения нуклеиновых оснований или комплементарные нуклеиновые основания ограничены следующими парами: аденин (А) и тимин (Т), аденин (А) и урацил (U), цитозин (С) и гуанин (G) и 5-метилцитозин (mC) и гуанин (G), если не указано иное. Комплементарные олигонуклеотиды и/или нуклеиновые кислоты не должны характеризоваться комплементарностью нуклеиновых оснований по каждому нуклеозиду и могут содержать одно или несколько несовпадений нуклеиновых оснований. Олигонуклеотид является полностью комплементарным или на 100% комплементарным, если такие олигонуклеотиды характеризуются совпадениями нуклеиновых оснований по каждому нуклеозиду без каких-либо несовпадений нуклеиновых оснований.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат модифицированные олигонуклеотиды или состоят из них. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, представляют собой антисмысловые соединения. В определенных вариантах осуществления соединения содержат олигомерные соединения. Некомплементарные нуклеиновые основания между соединением и нуклеиновой кислотой PNPLA3 могут допускаться при
- 32 047395 условии, что соединение сохраняет способность специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Более того, соединение может гибридизироваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты PNPLA3 таким образом, что промежуточные или примыкающие сегменты не участвуют в событии гибридизации (например, с образованием петлевой структуры, несовпадения или шпилечной структуры).
В определенных вариантах осуществления соединения, предусмотренные в данном документе, или их определенный фрагмент являются комплементарными нуклеиновой кислоте PNPLA3, ее областимишени, сегменту-мишени или определенному фрагменту на величину, составляющую по меньшей мере или составляющую до 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В определенных вариантах осуществления соединения, предусмотренные в данном документе, или их определенный фрагмент являются комплементарными нуклеиновой кислоте PNPLA3, ее области-мишени, сегменту-мишени или определенному фрагменту на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-100% или любую величину в пределах этих диапазонов. Процент комплементарности соединения по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени можно определить с помощью стандартных способов.
Например, соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований соединения являются комплементарными области-мишени и, следовательно, будут специфически гибридизироваться, будет комплементарным на 90%. В этом примере остальные некомплементарные нуклеиновые основания могут образовывать кластеры или чередоваться с комплементарными нуклеиновыми основаниями и не должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеиновыми основаниями. Соответственно, соединение, длина которого составляет 18 нуклеиновых оснований, имеющее четыре некомплементарных нуклеиновых основания, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, будет характеризоваться общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью, составляющей 77,8%. Процент комплементарности соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени можно определить обычным образом с помощью программ BLAST (средства поиска основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных из уровня техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Процент гомологии, идентичности или комплементарности последовательностей можно определить, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Мэдисон, Висконсин), используя настройки по умолчанию, в которой используется алгоритм Смита-Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, или их определенные фрагменты являются полностью комплементарными (т.е. на 100% комплементарными) нуклеиновой кислоте-мишени или ее определенному фрагменту. Например, соединение может быть полностью комплементарным нуклеиновой кислоте PNPLA3, или ее области-мишени, или сегменту-мишени, или последовательности-мишени. Как используется в данном документе, полностью комплементарное означает, что каждое нуклеиновое основание соединения является комплементарным соответствующему нуклеиновому основанию нуклеиновой кислоты-мишени. Например, соединение из 20 нуклеиновых оснований является полностью комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований при условии, что в нуклеиновой кислоте-мишени имеется соответствующий фрагмент из 20 нуклеиновых оснований, который является полностью комплементарным соединению. Полностью комплементарный также можно использовать применительно к определенному фрагменту первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, фрагмент из 20 нуклеиновых оснований в соединении из 30 нуклеиновых оснований может быть полностью комплементарным нуклеиновой кислотемишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Фрагмент из 20 нуклеиновых оснований в соединении из 30 нуклеиновых оснований является полностью комплементарным последовательности-мишени, если в последовательности-мишени имеется соответствующий фрагмент из 20 нуклеиновых оснований, в котором каждое нуклеиновое основание является комплементарным нуклеиновому основанию во фрагменте из 20 нуклеиновых оснований в соединении. В то же самое время все соединение из 30 нуклеиновых оснований может быть или может не быть полностью комплементарным последовательности-мишени в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеиновых оснований в соединении также комплементарными последовательности-мишени.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат одно или несколько несовпадающих нуклеиновых оснований относительно нуклеиновой кислотымишени. В определенных подобных вариантах осуществления антисмысловая активность в отношении мишени снижается за счет такого несовпадения, но активность в отношении молекулы, не являющейся мишенью, снижается на еще большую величину. Таким образом, в определенных подобных вариантах осуществления улучшается избирательность соединения. В определенных вариантах осуществления несовпадение имеет конкретное местоположение в пределах олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 от 5'-конца области гэпа. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 от 3'-конца области гэпа. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 1, 2, 3 или 4 от 5'-конца фланговой области. В
- 33 047395 определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 4, 3, 2 или 1 от З'-конца фланговой области. В определенных вариантах осуществления несовпадение имеет конкретное местоположение в пределах олигонуклеотида, не имеющего гэпмерный мотив. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 от 5'-конца олигонуклеотида. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 от 3'-конца олигонуклеотида.
Местоположение некомплементарного нуклеинового основания может находиться на 5'-конце или на 3'-конце соединения. В качестве альтернативы, некомплементарные нуклеиновое основание или нуклеиновые основания могут находиться во внутреннем положении-соединения. При наличии двух или более некомплементарных нуклеиновых оснований они могут быть смежными (т.е. связанными) или несмежными. В одном варианте осуществления некомплементарное нуклеиновое основание расположено во фланговом сегменте гэпмерного олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, длина которых составляет или составляет до 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеиновых оснований, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота PNPLA3, или ее определенного фрагмента.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, длина которых составляет или составляет до 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеиновых оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота PNPLA3, или ее определенного фрагмента.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, также включают в себя те соединения, которые являются комплементарными фрагменту нуклеиновой кислотымишени. Как используется в данном документе, фрагмент относится к определенному количеству смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. Фрагмент также может относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований в соединении. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 8 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 9 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 10 нуклеиновых оснований в сегментемишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 11 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 12 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 13 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 14 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 15 нуклеиновых оснований в сегментемишени. В определенных вариантах осуществления соединения являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 16 нуклеиновых оснований в сегменте-мишени. Также предусматриваются соединения, которые являются комплементарными фрагменту по меньшей мере из 9, 10, 17, 18, 19, 20 или большего числа нуклеиновых оснований в сегменте-мишени или фрагменту в диапазоне, ограниченном любыми двумя из этих значений.
Идентичность.
Соединения, предусмотренные в данном документе, также могут характеризоваться определенным процентом идентичности с конкретной нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO или соединением, представленным под конкретным номером ION, или их фрагментом. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, представляют собой антисмысловые соединения или олигомерные соединения. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, представляют собой модифицированные олигонуклеотиды. Как используется в данном документе, соединение является идентичным последовательности, раскрытой в данном документе, если оно обладает такой же способностью образовывать пары нуклеиновых оснований. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в раскрытой последовательности ДНК, будет считаться идентичной последовательности ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин образуют пару с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные варианты соединений, описанных в данном документе, а также соединения, имеющие неидентичные основания относительно соединений, предусмотренных в данном документе. Неидентичные основания могут примыкать друг к другу или быть распределены по всему соединению. Процент идентичности соединения рассчитывают по количеству оснований, которые обладают идентичными свойствами образования пар оснований по сравнению с последовательностью, с которой его сравнивают.
- 34 047395
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, или их фрагменты являются идентичными одному или нескольким соединениям или SEQ ID NO или их фрагменту, раскрытым в данном документе, на величину, составляющую или составляющую по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, являются идентичными приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% или любую процентную величину между такими значениями по отношению к конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO или соединению, представленному под конкретным номером ION, или их фрагменту, при этом соединения содержат олигонуклеотид, имеющий одно или несколько несовпадающих нуклеиновых оснований. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 от 5'-конца олигонуклеотида. В определенных подобных вариантах осуществления несовпадение находится в положении, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 от 3'-конца олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат антисмысловые соединения или состоят из них. В определенных вариантах осуществления фрагмент антисмыслового соединения сравнивают с фрагментом равной длины в нуклеиновой кислоте-мишени. В определенных вариантах осуществления фрагмент из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований сравнивают с фрагментом равной длины в нуклеиновой кислотемишени.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды или состоят из них. В определенных вариантах осуществления фрагмент олигонуклеотида сравнивают с фрагментом равной длины в нуклеиновой кислоте-мишени. В определенных вариантах осуществления фрагмент из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований сравнивают с фрагментом равной длины в нуклеиновой кислоте-мишени.
Некоторые модифицированные соединения.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды, состоящие из связанных нуклеозидов, или состоят из них. Олигонуклеотиды могут представлять собой немодифицированные олигонуклеотиды (РНК или ДНК) или могут представлять собой модифицированные олигонуклеотиды. Модифицированные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере одну модификацию по сравнению с немодифицированной РНК или ДНК (т.е. содержат по меньшей мере один модифицированный нуклеозид (содержащий модифицированный сахарный компонент и/или модифицированное нуклеиновое основание) и/или по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь).
А. Модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный компонент или модифицированное нуклеиновое основание или как модифицированный сахарный компонент, так и модифицированное нуклеиновое основание.
1. Модифицированные сахарные компоненты.
В определенных вариантах осуществления сахарные компоненты представляют собой небициклические модифицированные сахарные компоненты. В определенных вариантах осуществления модифицированные сахарные компоненты представляют собой бициклические или трициклические сахарные компоненты. В определенных вариантах осуществления модифицированные сахарные компоненты представляют собой имитаторы сахаров. Такие имитаторы сахаров могут содержать одно или несколько замещений, соответствующих замещениям в других типах модифицированных сахарных компонентов.
В определенных вариантах осуществления модифицированные сахарные компоненты представляют собой небициклические модифицированные фуранозильные сахарные компоненты, содержащие один или несколько ациклических заместителей, в том числе без ограничения заместителей в 2'-, 4'- и/или 5'положениях. В определенных вариантах осуществления фуранозильный сахарный компонент представляет собой рибозильный сахарный компонент. В определенных вариантах осуществления один или несколько ациклических заместителей в небициклических модифицированных сахарных компонентах являются разветвленными. Примеры 2'-замещающих групп, подходящих для небициклических модифицированных сахарных компонентов, включают без ограничения: 2'-F, 2'-OCH3 (ОМе или О-метил) и 2'-О(СН2)2ОСНз-(МОЕ). В определенных вариантах осуществления 2'-замещающие группы выбраны из галогена, аллила, амино, азидо, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O-Cl-Cl0-алкокси, замещенного O-C.'i-C.'10-алкокси. O-C1-C10-алкила, замещенного O-Ci-Ci0^km, S-алкила, N(Rm)-алкила, О-алкенила, S-алкенила, N(Rm)-алкенила, О-алкинила, S-алкинила, N(Rm)-алкинила, О-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила, О-аралкила, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn) или OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н, защитную группу для аминогруппы или замещенный или незамещенный С1-С10-алкил, и 2'-замещающих групп, описанных в Cook et al., U.S. 6531584; Cook et al., U.S. 5859221; и Cook et al., U.S. 6005087. В определенных вариантах осуществления такие 2'-замещающие группы могут быть дополнительно замещены одной или несколькими замещающими группами, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенил, нитро (NO2), тиола, тиоалкокси, тиоалкила, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
- 35 047395
Примеры 4'-замещающих групп, подходящих для линейных небициклических модифицированных сахарных компонентов, включают без ограничения алкокси (например, метокси), алкил и группы, описанные в Manoharan et al., WO 2015/106128. Примеры 5'-замещающих групп, подходящих для небициклических модифицированных сахарных компонентов, включают без ограничения 5'-метил (R или S), 5'-винил и 5'-метокси. В определенных вариантах осуществления небициклические модифицированные сахара содержат более одного немостикового заместителя в сахаре, например, в случае с 2'-Е-5'-метилмодифицированными сахарными компонентами, а также модифицированными сахарными компонентами и модифицированными нуклеозидами, описанными в Migawa et al., WO 2008/101157 и Rajeev et al., US 2013/0203836.
В определенных вариантах осуществления 2'-замещенный нуклеозид или небициклический 2'-модифицированный нуклеозид содержит сахарный компонент, содержащий линейную 2'-замещающую группу, выбранную из F, NH2, N3, OCF3, OCH3, O(CH2)3NH2, CH2CH=CH2, OCH2CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn), OCCHhOCCHENCCHsh и N-замещенного ацетамида (OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn)), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н, защитную группу для аминогруппы или замещенный или незамещенный С^о-алкил.
В определенных вариантах осуществления 2'-замещенный нуклеозид или небициклический 2'-модифицированный нуклеозид содержит сахарный компонент, содержащий линейную 2'-замещающую группу, выбранную из F, OCF3, OCH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 и OCH2C(=O)-N(H)CH3 (NMA).
В определенных вариантах осуществления 2'-замещенный нуклеозид или небициклический 2'-модифицированный нуклеозид содержит сахарный компонент, содержащий линейную 2'-замещающую группу, выбранную из F, OCH3 и OCH2CH2OCH3.
Нуклеозиды, содержащие модифицированные сахарные компоненты, такие как небициклические модифицированные сахарные компоненты, обозначают по положению (положениям) замещения(замещений) в сахарном компоненте нуклеозида. Например, нуклеозиды, содержащие 2'-замещенные или 2'-модифицированные сахарные компоненты, называют 2'-замещенными нуклеозидами или 2'-модифицированными нуклеозидами.
Определенные модифицированные сахарные компоненты содержат мостиковый заместитель в сахаре, который образует второе кольцо, в результате чего образуется бициклический сахарный компонент. В определенных подобных вариантах осуществления бициклический сахарный компонент содержит мостик между 4'- и 2'-атомами фуранозного кольца. В некоторых таких вариантах осуществления фуранозное кольцо представляет собой рибозное кольцо. Примеры таких 4'-2'-мостиковых заместителей в сахаре включают без ограничения 4'-Ch2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2' (LNA), 4'-CH2-S-2', 4'-(CH2)2-O-2' (ENA), 4'-CH(CH3)-O-2' (называемый конформационно ограничивающим этилом или cEt в S-конфигурации), 4'-CH2-O-CH2-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH(CH2OCH3)-0-2' (конформационно ограничивающий МОЕ или сМОЕ) и его аналоги (см., например, Seth et al., U.S. 7399845, Bhat et al., U.S. 7569686, Swayze et al., U.S. 7741457, и Swayze et al., U.S. 8022193), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' и его аналоги (см., например, Seth et al., U.S. 8278283), 4'-CH2-N(OCH3)-2' и его аналоги (см., например, Prakash et al., U.S. 8278425), 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (см., например, Allerson et al., U.S. 7696345 и Allerson et al., U.S. 8124745), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2‘ (см., например, Zhou, et al., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134), 4'-CH2-C(=CH2)-2' и его аналоги (см., например, Seth et al., U.S. 8278426), 4'-C(RaRb)-N(R)-O-2', 4'-C(RaRb)-O-N(R)-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' и 4'-CH2-N(R)-O-2', где каждый R, Ra и Rb независимо представляет собой H, защитную группу или О-С^-алкил (см., например, Imanishi et al., U.S. 7427672).
В определенных вариантах осуществления такие 4'-2'-мостики независимо содержат от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)2-, -S(=O)X- и -N(Ra)-; где:
x равняется 0, 1 или 2;
n равняется 1, 2, 3 или 4;
каждый Ra и Rb независимо представляет собой H, защитную группу, гидроксил, ^-^-алкил, замещенный С-С^алкил, C2-Cl2-алкенил, замещенный C2-C12-алкенил, ^-^-алкинил, замещенный ^-^-алкинил, C5-С20-арил, замещенный C5-С20-арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, алициклический С5-С7-радикал, замещенный алициклический С5-С7-радикал, галоген, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)2-Ji) или сульфоксил (S(=O)-Ji); и каждый J1 и J2 независимо представляет собой H, Ci-Ci2^km, замещенный C1-C12^KM, С2-С12-алкенил, замещенный C2-C12-алкенил, C2-C12-алкинил, замещенный С2-С12-алкинил, C5-С20-арил, замещенный C5-С20-арил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C1-C12-аминоалкил, замещенный C1-C12-аминоалкил или защитную группу.
- 36 047395
Дополнительные бициклические сахарные компоненты известны из уровня техники, см., например: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J.
Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org.
Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8362-8379;
Elayadi etal., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch etal., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wengel et al., U.S. 7053207, Imanishi et al., U.S. 6268490, Imanishi et al. U.S. 6770748, Imanishi et al., U.S. RE44779;
Wengel et al., U.S. 6794499, Wengel et al., U.S. 6670461; Wengel et al., U.S. 7034133, Wengel et al., U.S. 8080644; Wengel et al., U.S. 8034909; Wengel et al., U.S. 8153365; Wengel et al., U.S. 7572582; и Ramasamy et al., U.S. 6525191, Torsten et al., WO 2004/106356, Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al., WO 2007/134181; Seth et al., U.S. 7547684; Seth et al., U.S. 7666854;
Seth et al., U.S. 8088746; Seth et al., U.S. 7750131; Seth et al., U.S. 8030467; Seth et al., U.S. 8268980; Seth et al., U.S. 8546556; Seth et al., U.S. 8530640; Migawa et al., U.S. 9012421; Seth et al., U.S. 8501805; Allerson et al., US2008/0039618; и Migawa et al., US2015/0191727.
В определенных вариантах осуществления бициклические сахарные компоненты и нуклеозиды, в состав которых включены такие бициклические сахарные компоненты, дополнительно определяются изомерной конфигурацией. Например, нуклеозид LNA (описанный в данном документе) может находиться в конфигурации α-L или в конфигурации β-D.
Вх
Bx
LNA ф-О-конфигурация) мостик = 4'-CH2-O-2' α-L-LNA (α-L -конфигурация) мостик = 4'-СН2-О-2' a-L-метиленокси-модифицированные (4'-CH2-O-2') или имеющие конфигурацию α-L-LNA бициклические нуклеозиды были включены в состав олигонуклеотидов, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 27, 6365-6372). В данном документе общее описание бициклических нуклеозидов включает обе изомерные конфигурации. Если положения конкретных бициклических нуклеозидов (например, LNA или cEt) идентифицированы в проиллюстрированных в данном документе на примерах вариантах осуществления, то они находятся в конфигурации β-D, если не указано иное.
В определенных вариантах осуществления модифицированные сахарные компоненты содержат один или несколько немостиковых заместителей в сахаре и один или несколько мостиковых заместителей в сахаре (например, в случае с 5'-замещенными и содержащими 4'-2'-мостик сахарами).
В определенных вариантах осуществления модифицированные сахарные компоненты представляют собой имитаторы сахаров. В определенных подобных вариантах осуществления атом кислорода в сахарном компоненте заменен, например, атомом серы, углерода или азота. В определенных подобных вариантах осуществления такие модифицированные сахарные компоненты также содержат мостиковые и/или немостиковые заместители, описанные в данном документе. Например, определенные имитаторы сахаров содержат 4'-атом серы и замещение в 2'-положении (см., например, Bhat et al., U.S. 7875733, и Bhat et al., U.S. 7939677) и/или в 5'-положении.
В определенных вариантах осуществления имитаторы сахаров содержат кольца с числом атомов, отличным от 5. Например, в определенных вариантах осуществления имитатор сахара содержит шестичленный тетрагидропиран (ТНР). Такие тетрагидропираны могут быть дополнительно модифицированными или замещенными. Нуклеозиды, содержащие такие модифицированные тетрагидропираны, включают без ограничения гексит-нуклеиновую кислоту (HNA), аннит-нуклеиновую кислоту (ANA), маннит-нуклеиновую кислоту (MNA) (см., например, Leumann, C/J. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854), фтор-HNA:
(F-HNA, см., например, Swayze et al., U.S. 8088904; Swayze et al., U.S. 8440803; и Swayze et al.,
- 37 047395
U.S. 9005906, F-HNA также может обозначаться как F-THP или З'-фтортетрагидропиран) и нуклеозиды, содержащие дополнительные модифицированные соединения ТНР следующей формулы:
где независимо для каждого указанного модифицированного THP-нуклеозида:
Вх представляет собой компонент, являющийся нуклеиновым основанием;
каждый из Т3 и Т4 независимо представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую модифицированный THP-нуклеозид с остальной частью олигонуклеотида, или один из Т3 и Т4 представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую модифицированный THPнуклеозид с остальной частью олигонуклеотида, а другой из Т3 и Т4 представляет собой H, защитную группу для гидроксильной группы, связанную конъюгированную группу или 5'- или 3'-концевую группу;
каждый из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 независимо представляет собой H, СгСб-алкил, замещенный С^Сб-алкил, С2-С6-алкенил, замещенный С2-С6-алкенил, С2-С6-алкинил или замещенный С2-С6-алкинил;
каждый из R1 и R2 независимо выбран из водорода, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ1J2, SJi, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJiJ2 и CN, где X представляет собой О, S или NJ1, а каждый из J1, J2, и J3 независимо представляет собой H или С1-С6-алкил.
В определенных вариантах осуществления предусматрены модифицированные THP-нуклеозиды, где каждый из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой H. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 является отличным от H. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой метил. В определенных вариантах осуществления предусмотрены модифицированные ТНР-нуклеозиды, где один из R1 и R2 представляет собой F. В определенных вариантах осуществления R1 представляет собой F, a R2 представляет собой H, в определенных вариантах осуществления R1 представляет собой метокси, a R2 представляет собой H, и в определенных вариантах осуществления R1 представляет собой метоксиэтокси, a R2 представляет собой H.
В определенных вариантах осуществления имитаторы сахаров содержат кольца, содержащие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, сообщалось о нуклеозидах, содержащих морфолиновые сахарные компоненты, и об их применении в олигонуклеотидах (см., например, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 и Summerton et al., U.S. 5698685; Summerton et al., U.S. 5166315; Summerton et al., U.S. 5185444; and Summerton et al., U.S. 5034506). Используемый в данном документе термин морфолиновый компонент означает имитатор сахара со следующей структурой:
В определенных вариантах осуществления морфолиновые компоненты могут быть модифицированы, например, путем добавления или изменения различных замещающих групп в приведенной выше структуре морфолинового компонента. Такие имитаторы сахаров в данном документе называются модифицированными морфолиновыми компонентами.
В определенных вариантах осуществления имитаторы сахаров содержат ациклические компоненты. Примеры нуклеозидов и олигонуклеотидов, содержащих такие ациклические имитаторы сахаров, включают без ограничения пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), ациклическую бутил-нуклеиновую кислоту (см., например, Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 77, 5853-5865), а также нуклеозиды и олигонуклеотиды, описанные в Manoharan et al., US 2013/130378.
Из уровня техники известны многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы сахаров и имитаторов сахаров, которые могут применяться в модифицированных нуклеозидах.
2. Модифицированные нуклеиновые основания.
Нуклеиновые основания (или основания) с модификациями или замещениями структурно отличаются от встречающихся в природе или синтетических немодифицированных нуклеиновых оснований, но являются функционально взаимозаменяемыми с ними. В образовании водородных связей могут принимать участие как природные, так и модифицированные нуклеиновые основания. Такие модификации нуклеиновых оснований могут придавать антисмысловым соединениям стабильность к действию нуклеаз, сродство связывания или некоторое другое благоприятное биологическое свойство.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат модифицированные олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат один или несколько нуклеозидов, содержащих немодифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат один или несколько нуклеозидов, содержащих модифицированное нуклеиновое основание. В
- 38 047395 определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат один или несколько нуклеозидов, которые не содержат нуклеиновое основание, называемых нуклеозидами с удаленными азотистыми основаниями.
В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеиновые основания выбраны из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов, алкил- или алкинилзамещенных пиримидинов, алкилзамещенных пуринов и N-2-, N-6- и О-6-замещенных пуринов. В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеиновые основания выбраны из 2-аминопропиладенина, 5-гидротксиметилциозина, 5-метилцитозина, ксантина, гипоксантина, 2-аминоаденина, 6-Ы-метилгуанина, 6-Ы-метиладенина, 2-пропиладенина, 2-тиоурацила, 2-тиотимина и 2-тиоцитозина, 5-пропинил(С=СCH3)-урацила, 5-пропинилцитозина, 6-азоурацила, 6-азоцитозина, 6-азотимина, 5-рибозилурацила (псевдоурацила), 4-тиоурацила, 8-галогена, 8-амино, 8-тиола, 8-тиоалкила, 8-гидроксила, 8-аза и других 8-замещенных пуринов, 5-галогена, в частности 5-брома, 5-трифторметила, 5-галогенурацила и 5-галогенцитозина, 7-метилгуанина, 7-метиладенина, 2-1;-аденина, 2-аминоаденина, 7-дезазагуанина, 7-дезазааденина, 3-дезазагуанина, 3-дезазааденина, 6-Хбензоиладенина, 2-Хизобутирилгуанина, 4-Ы-бензоилцитозина, 4-Ы-бензоилурацила, 5-метил-4-Ы-бензоилцитозина, 5-метил-4-Ы-бензоилурацила, универсальных оснований, гидрофобных оснований, оснований, обладающих способностью к неспецифическому спариванию, оснований с увеличенным размером и фторированных оснований. Дополнительные модифицированные нуклеиновые основания включают трициклические пиримидины, такие как 1,3-диазафеноксазин-2-он, 1,3-диазафенотиазин-2-он и 9-(2-аминоэтокси)-1,3-диазафеноксазин-2-он (G-образный зажим). Модифицированные нуклеиновые основания также могут включать нуклеиновые основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-дезазааденином, 7-дезазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Дополнительные нуклеиновые основания включают в себя нуклеиновые основания, раскрытые в Merigan et al., U.S. 3687808, нуклеиновые основания, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. and Lebleu, В., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; и нуклеиновые основания, раскрытые в главах 6 и 15 Antisense Drug Technology, Crooke S.T., Ed., CRC Press, 2008, на страницах 163-166 и 442-443.
Публикации, в которых изложено получение некоторых из вышеупомянутых модифицированных нуклеиновых оснований, а также других модифицированных нуклеиновых оснований, включают без ограничения
Manoharan et al., US2003/0158403,
Manoharan et al., US2003/0175906; Dinh et al., U.S. 4845205; Spielvogel et al., U.S. 5130302;
Rogers et al., U.S. 5134066; Bischofberger et al., U.S. 5175273; Urdea et al., U.S. 5367066;
Benner et al., U.S. 5432272; Matteucci et al., U.S. 5434257; Gmeiner et al., U.S. 5457187; Cook et al., U.S. 5459255; Froehler et al., U.S. 5484908; Matteucci et al., U.S. 5502177; Hawkins et al., U.S. 5525711; Haralambidiset al., U.S. 5552540; Cook etal.,U.S. 5587469; Froehler et al., U.S. 5594121; Switzer et al., U.S. 5596091; Cook et al., U.S. 5614617; Froehler et al., U.S. 5645985; Cook et al., U.S. 5681941; Cook et al., U.S. 5811534; Cook et al., U.S. 5750692; Cook et al., U.S. 5948903; Cook et al., U.S. 5587470; Cook et al., U.S. 5457191; Matteucci et al., U.S. 5763588;
Froehler et al., U.S. 5830653; Cook et al., U.S. 5808027; Cook et al., U.S. 6166199; и Matteucci et al., U.S. 6005096.
В определенных вариантах осуществления соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту PNPLA3, содержат одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5'-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
Модифицированные межнуклеозидные связи.
Естественная межнуклеозидная связь в РНК и ДНК представляет собой 3'-5'-фосфодиэфирную связь. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, имеющие одну или несколько модифицированных, т.е. не встречающихся в природе, межнуклеозидных связей, зачастую предпочтительнее соединений со встречающимися в природе межнуклеозидными связями ввиду наличия у их требуемых свойств, таких как, например, повышенное поглощение клетками, повышенное сродство с нуклеиновыми кислотами-мишенями и увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Иллюстративные межнуклеозидные связи, имеющие хиральный центр, включают без ограничения алкилфосфонатные и фосфотиоатные связи. Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие межнуклеозидные связи, имеющие хиральный центр, можно получить в виде совокупностей модифицированных олигонуклеотидов, содержащих стереослучайные межнуклеозидные связи, или в виде совокуп
- 39 047395 ностей модифицированных олигонуклеотидов, содержащих фосфотиоатные связи в конкретных стереохимических конфигурациях. В определенных вариантах осуществления совокупности модифицированных олигонуклеотидов содержат фосфотиоатные межнуклеозидные связи, где все из фосфотиоатных межнуклеозидных связей являются стереослучайными. Такие модифицированные олигонуклеотиды можно получать с применением таких способов синтеза, которые приводят к случайному выбору стереохимической конфигурации каждой фосфотиоатной связи. Тем не менее, как хорошо понятно специалистам в данной области техники, каждый отдельный фосфотиоат каждой отдельной молекулы олигонуклеотида характеризуется определенной стереоконфигурацией. В определенных вариантах осуществления совокупности модифицированных олигонуклеотидов обогащены модифицированными олигонуклеотидами, содержащими одну или несколько конкретных фосфотиоатных межнуклеозидных связей в конкретной, независимо выбранной стереохимической конфигурации. В определенных вариантах осуществления конкретная конфигурация конкретной фосфотиоатной связи присутствует по меньшей мере в 65% молекул в совокупности. В определенных вариантах осуществления конкретная конфигурация конкретной фосфотиоатной связи присутствует по меньшей мере в 70% молекул в совокупности. В определенных вариантах осуществления конкретная конфигурация конкретной фосфотиоатной связи присутствует по меньшей мере в 80% молекул в совокупности. В определенных вариантах осуществления конкретная конфигурация конкретной фосфотиоатной связи присутствует по меньшей мере в 90% молекул в совокупности. В определенных вариантах осуществления конкретная конфигурация конкретной фосфотиоатной связи присутствует по меньшей мере в 99% молекул в совокупности. Такие хирально обогащенные совокупности модифицированных олигонуклеотидов можно получить с применением способов синтеза, известных из уровня техники, например способов, описанных в Oka et al., JACS 125, 8307 (2003), Wan et al., Nuc. Acid. Res. 42, 13456 (2014) и WO 2017/015555. В определенных вариантах осуществления совокупность модифицированных олигонуклеотидов обогащена модифицированными олигонуклеотидами, имеющими по меньшей мере один указанный фосфотиоат в (Sp)-конфигурации. В определенных вариантах осуществления совокупность модифицированных олигонуклеотидов обогащена модифицированными олигонуклеотидами, имеющими по меньшей мере один фосфотиоат в (Rp)-конфигурации. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды, содержащие (Rp)- и/или (Sp)-фосфотиоаты, предусматривают одну или более из следующих формул соответственно, где В ука зывает на нуклеиновое основание:
Если не указано иное, хиральные межнуклеозидные связи модифицированных олигонуклеотидов, описанных в данном документе, могут быть стереослучайными или находиться в конкретной стереохимической конфигурации.
В определенных вариантах осуществления соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту PNPLA3, содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфотиоатные связи. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями содержат межнуклеозидные связи, в которых сохраняется атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают без ограничения фосфодиэфирные, фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные и фосфотиоатные связи. Хорошо известны способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей.
В определенных вариантах осуществления нуклеозиды модифицированных олигонуклеотидов могут быть связаны друг с другом с помощью любой межнуклеозидной связи. Два основных класса межнуклеозидных связывающих групп определяются наличием или отсутствием атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают в себя без ограничений фосфатные связи, которые охватывают фосфодиэфирную связь (Р=О) (также называемые ^модифицированными или встречающимися в природе связями), фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, а также фосфотиоатные (P=S) и дифосфотиоатные (HS-P=S) связи. Иллюстративные не содержащие фосфор межнуклеозидные связывающие группы включают без ограничения метиленметилиминогруппу (-CH2-N(CH3)-O-CH2), тиодиэфирную, тионокарбаматную (-O-C(=O)(NH)-S-); силоксановую (-O-SiH2-O-) и ^№-диметилгидразиновую (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-) группы. Модифицированные межнуклеозидные
- 40 047395 связи, в отличие от встречающихся в природе фосфатных связей, можно использовать для изменения, как правило, увеличения, устойчивости олигонуклеотида к действию нуклеаз. В определенных вариантах осуществления межнуклеозидные связи, имеющие хиральный атом, можно получать в виде рацемической смеси или в виде отдельных энантиомеров. Иллюстративные хиральные межнуклеозидные связи включают без ограничения алкилфосфонатные и фосфотиоатные связи. Специалистам в данной области хорошо известны способы получения фосфоросодержащих и не содержащих фосфор межнуклеозидных связей.
Нейтральные межнуклеозидные связи включают без ограничения фосфотриэфирные, метилфосфонатные связи, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), 3-амидную (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), 4-амидную (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), формацетальную (3'-О-СН2-О-5'), метоксипропильную и тиоформацетальную связи (3'-S-CH2-O-5'). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, включающие силоксановую (диалкилсилоксановую), карбоксилатную сложноэфирную, карбоксамидную, сульфидную, сульфонатную сложноэфирную и амидные связи (см., например, Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, содержащие комбинацию составляющих частей N, О, S и CH2.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области в виде определенного характерного участка или мотива из модифицированных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления межнуклеозидные связи расположены в виде мотива, содержащего гэп. В таких вариантах осуществления межнуклеозидные связи в каждой из двух фланговых областей отличаются от межнуклеозидных связей в области гэпа. В определенных вариантах осуществления межнуклеозидные связи во фланговых областях являются фосфодиэфирными, а межнуклеозидные связи в гэпе являются фосфотиоатными. Нуклеозидный мотив выбирают независимо, так что такие олигонуклеотиды, имеющие мотив из межнуклеозидных связей, содержащий гэп, могут иметь или не иметь нуклеозидный мотив, содержащий гэп, и если они действительно имеют нуклеозидный мотив, содержащий гэп, то длина фланговых областей и гэпа может быть или не быть одинаковой.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат область, имеющую чередующийся мотив из межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат область с однородно модифицированными межнуклеозидными связями. В определенных подобных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит область, имеющую однородные связи, представляющие собой фосфотиоатные межнуклеозидные связи. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет однородные фосфотиоатные связи. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной и фосфотиоатной. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной и фосфотиоатной, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является фосфотиоатной.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок, состоящий по меньшей мере из 6 последовательно расположенных фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок, состоящий по меньшей мере из 8 последовательно расположенных фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок, состоящий по меньшей мере из 10 последовательно расположенных фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок, состоящий по меньшей мере из 12 последовательно расположенных фосфотиоатных межнуклеозидных связей. В определенных подобных вариантах осуществления по меньшей мере один такой блок расположен на З'-конце олигонуклеотида. В определенных подобных вариантах осуществления по меньшей мере один такой блок расположен в пределах З нуклеозидов на З'-конце олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат одну или несколько метилфосфонатных связей. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, имеющие гэпмерный нуклеозидный мотив, предусматривают мотив связей, содержащий связи, все из которых являются фосфотиоатными, за исключением одной или двух метилфосфонатных связей. В определенных вариантах осуществления одна метилфосфонатная связь находится в центральном гэпе олигонуклеотида, имеющего гэпмерный нуклеозидный мотив.
В определенных вариантах осуществления желательно упорядочить количество фосфотиоатных межнуклеозидных связей и фосфодиэфирных межнуклеозидных связей для сохранения устойчивости к действию нуклеаз. В определенных вариантах осуществления желательно упорядочить количество и положение фосфотиоатных межнуклеозидных связей и количество и положение фосфодиэфирных межнук
- 41 047395 леозидных связей для сохранения устойчивости к действию нуклеаз. В определенных вариантах осуществления количество фосфотиоатных межнуклеозидных связей можно уменьшить, а количество фосфодиэфирных межнуклеозидных связей можно увеличить. В определенных вариантах осуществления количество фосфотиоатных межнуклеозидных связей можно уменьшить, а количество фосфодиэфирных межнуклеозидных связей можно увеличить, при этом по-прежнему сохраняя устойчивость к действию нуклеаз. В определенных вариантах осуществления желательно уменьшить количество фосфотиоатных межнуклеозидных связей, при этом по-прежнему поддерживая устойчивость к действию нуклеаз. В определенных вариантах осуществления желательно увеличить количество фосфодиэфирных межнуклеозидных связей, при этом по-прежнему поддерживая устойчивость к действию нуклеаз.
3. Некоторые мотивы.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды могут иметь мотив, например, характерный участок из немодифицированных и/или модифицированных сахарных компонентов, нуклеиновых оснований и/или межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат один или несколько модифицированных нуклеозидов, содержащих модифицированный сахар. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат один или несколько модифицированных нуклеозидов, содержащих модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В таких вариантах осуществления характерный участок или мотив определяют модифицированные, немодифицированные и модифицированные разными способами сахарные компоненты, нуклеиновые основания и/или межнуклеозидные связи модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления каждый характерный участок из сахарных компонентов, нуклеиновых оснований и межнуклеозидных связей является независимым от других. Таким образом, модифицированный олигонуклеотид можно описать с помощью его мотива из сахаров, мотива из нуклеиновых оснований и/или мотива из межнуклеозидных связей (как используется в данном документе, мотив из нуклеиновых оснований описывает модификации нуклеиновых оснований независимо от последовательности нуклеиновых оснований).
A. Некоторые мотивы из сахаров.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат один или несколько типов модифицированных сахарных и/или немодифицированных сахарных компонентов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области в виде определенного характерного участка или мотива из сахаров. В некоторых случаях такие мотивы из сахаров включают без ограничения любые обсуждаемые в данном документе модификации сахаров.
В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат область, имеющую гэпмерный мотив, которая содержит две внешние области, или фланги, и центральную или внутреннюю область, или гэп, или состоят из нее. Три области гэпмерного мотива (5'-фланг, гэп и 3'фланг) образуют непрерывную последовательность нуклеозидов, в которой по меньшей мере некоторые сахарные компоненты нуклеозидов каждого из флангов отличаются от по меньшей мере некоторых сахарных компонентов нуклеозидов гэпа. В частности, по меньшей мере сахарные компоненты нуклеозидов каждого фланга, которые располагаются ближе всего к гэпу (самого крайнего 3'-концевого нуклеозида 5'-фланга и самого крайнего 5'-концевого нуклеозида 3'-фланга), отличаются от сахарных компонентов соседних нуклеозидов гэпа, что таким образом определяет границу между флангами и гэпом (т.е. точку сочленения фланга и гэпа). В определенных вариантах осуществления все сахарные компоненты в гэпе являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления гэп содержит один или несколько нуклеозидов, имеющих сахарный компонент, который отличается от сахарного компонента одного или нескольких других нуклеозидов гэпа. В определенных вариантах осуществления все сахарные мотивы двух флангов являются одинаковыми (симметричный гэпмер). В определенных вариантах осуществления сахарный мотив 5'-фланга отличается от сахарного мотива 3'-фланга (асимметричный гэпмер).
В определенных вариантах осуществления фланги гэпмера содержат 1-5 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления фланги гэпмера содержат 2-5 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления фланги гэпмера содержат 3-5 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления все нуклеозиды гэпмера являются модифицированными нуклеозидами.
В определенных вариантах осуществления гэп гэпмера содержит 7-12 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления гэп гэпмера содержит 7-10 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления гэп гэпмера содержит 8-10 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления гэп гэпмера содержит 10 нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления каждый нуклеозид гэпа гэпмера является немодифицированным 2'-дезоксинуклеозидом.
В определенных вариантах осуществления гэпмер является дезоксигэпмером. В таких вариантах осуществления нуклеозиды со стороны гэпа от каждой точки сочленения фланга и гэпа являются немодифицированными 2'-дезоксинуклеозидами, а нуклеозиды со стороны фланга от каждой точки сочленения фланга и гэпа являются модифицированными нуклеозидами. В определенных подобных вариантах
- 42 047395 осуществления каждый нуклеозид гэпа является немодифицированным 2'-дезоксинуклеозидом. В определенных подобных вариантах осуществления каждый нуклеозид каждого фланга является модифицированным нуклеозидом.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет полностью модифицированный мотив из сахаров, при этом каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахарный компонент. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат область, имеющую полностью модифицированный мотив из сахаров, или состоят из нее, при этом каждый нуклеозид области содержит модифицированный сахарный компонент. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат область, имеющую полностью модифицированный мотив из сахаров, или состоят из нее, при этом каждый нуклеозид в полностью модифицированной области содержит одинаковый модифицированный сахарный компонент, и такой участок называется в данном документе однородно модифицированным мотивом из сахаров. В определенных вариантах осуществления полностью модифицированный олигонуклеотид является однородно модифицированным олигонуклеотидом. В определенных вариантах осуществления каждый нуклеозид однородно модифицированного олигонуклеотида содержит одинаковую 2'-модификацию.
B. Некоторые мотивы из нуклеиновых оснований.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат модифицированные и/или немодифицированные нуклеиновые основания, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области в виде определенного характерного участка или мотива. В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание является модифицированным. В определенных вариантах осуществления ни одно из нуклеиновых оснований не является модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый пурин или каждый пиримидин являются модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый аденин является модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый гуанин является модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый тимин является модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый урацил является модифицированным. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин является модифицированным. В определенных вариантах осуществления некоторые или все цитозиновые нуклеиновые основания в модифицированном олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды содержат блок из модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных подобных вариантах осуществления блок располагается на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления блок расположен в пределах 3 нуклеозидов на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления блок находится на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления блок расположен в пределах 3 нуклеозидов на 5'-конце олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, имеющие гэпмерный мотив, содержат нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеиновое основание. В определенных подобных вариантах осуществления один нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеиновое основание, находится в центральном гэпе олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив. В определенных подобных вариантах осуществления сахарный компонент указанного нуклеозида представляет собой 2'-дезоксирибозильный компонент. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 2-тиопиримидина и 5-пропинпиримидина.
C. Некоторые мотивы из межнуклеозидных связей.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат модифицированные и/или немодифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области в виде определенного характерного участка или мотива. В определенных вариантах осуществления фактически каждая межнуклеозидная связывающая группа представляет собой фосфатную межнуклеозидную связь (Р=О). В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связывающая группа модифицированного олигонуклеотида является фосфотиоатной (P=S). В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связывающая группа модифицированного олигонуклеотида независимо выбрана из фосфотиоатной и фосфатной межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления мотив из сахаров модифицированного олигонуклеотида представляет собой гэпмер, а все межнуклеозидные связи в гэпе являются модифицированными. В определенных подобных вариантах осуществления некоторые или все межнуклеозидные связи во флангах являются немодифицированными фосфатными связями. В определенных вариантах осуществления концевые межнуклеозидные связи являются модифицированными. В определенных вариантах осуществления сахарный мотив модифицированного олигонуклеотида представляет собой гэпмер, а мотив из межнуклеозидных связей содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь в по меньшей мере одном фланге, где по меньшей мере одна фосфодиэфирная связь не является концевой межнуклеозидной связью, а остальные межнуклеозидные связи представляют собой фосфотиоатные межнуклео
- 43 047395 зидные связи. В некоторых таких вариантах осуществления все из фосфотиоатных связей являются стереослучайными. В определенных вариантах осуществления все из фосфотиоатных связей во флангах представляют собой ^р)-фосфотиоаты, и гэп содержит по меньшей мере один мотив Sp, Sp, Rp. В определенных вариантах осуществления совокупности модифицированных олигонуклеотидов обогащены модифицированными олигонуклеотидами, содержащими такие мотивы из межнуклеозидных связей.
4. Некоторые модифицированные олигонуклеотиды.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат модифицированные олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления вышеприведенные модификации (сахаров, нуклеиновых оснований, межнуклеозидных связей) включены в состав модифицированного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды характеризуются по их модификации, мотивам и значениям общей длины. В определенных вариантах осуществления каждый из таких параметров является независимым от других. Таким образом, если не указано иное, каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив из сахаров, может быть модифицированной или немодифицированной и может соответствовать или не соответствовать гэпмерному характеру модификаций сахаров. Например, межнуклеозидные связи во фланговых областях гэпмера из сахаров могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга и могут быть такими же, как межнуклеозидные связи в области гэпа мотива из сахаров, или отличными от них. Аналогичным образом, такие гэпмерные олигонуклеотиды могут содержать одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований независимо от гэпмерного характера модификаций сахаров. Кроме того, в некоторых случаях олигонуклеотид описывается общей длиной, или диапазоном длин, или длинами или диапазонами длин двух или более областей (например, областей из нуклеозидов, имеющих указанные модификации сахаров). При таких обстоятельствах может быть возможным выбрать для каждого диапазона такие количества, которые в результате обеспечивают олигонуклеотид, имеющий общую длину, выходящую за пределы указанного диапазона. При таких обстоятельствах должны быть удовлетворены требования к обоим элементам. Например, в определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-20 связанных нуклеозидов и имеет мотив из сахаров, состоящий из трех областей, А, В и С, где область А состоит из 2-6 связанных нуклеозидов, имеющих указанный мотив из сахаров, область В состоит из 6-10 связанных нуклеозидов, имеющих указанный мотив из сахаров, и область С состоит из 2-6 связанных нуклеозидов, имеющих указанный мотив из сахаров. Такие варианты осуществления не включают модифицированные олигонуклеотиды, в которых каждая из А и С состоит из 6 связанных нуклеозидов, а В состоит из 10 связанных нуклеозидов (несмотря на то, что эти количества нуклеозидов являются допустимыми согласно требованиям к А, В и С), поскольку общая длина такого олигонуклеотида будет составлять 22, что превышает верхний предел общей длины модифицированного олигонуклеотида (20). В данном документе, если в описании олигонуклеотида ничего не говорится относительно одного или нескольких параметров, то такой параметр не ограничен. Таким образом, модифицированный олигонуклеотид, описываемый только как имеющий гэпмерный мотив из сахаров без дополнительного описания, может иметь любую длину, любой мотив из межнуклеозидных связей и любой мотив из нуклеиновых оснований. Если не указано иное, все модификации являются независимыми от последовательности нуклеиновых оснований.
Некоторые конъюгированные соединения.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат олигонуклеотид (модифицированный или немодифицированный) и необязательно одну или несколько конъюгированных групп и/или концевых групп или состоят из них. Конъюгированные группы состоят из одного или нескольких конъюгированных компонентов и конъюгирующего линкера, который связывает конъюгированный компонент с олигонуклеотидом. Конъюгированные группы могут быть присоединены к любому одному или обоим концам олигонуклеотида и/или в любом внутреннем положении. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы присоединены к нуклеозиду модифицированного олигонуклеотида в 2'-положении. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы, присоединенные к любому одному или обоим концам олигонуклеотида, являются концевыми группами. В определенных подобных вариантах осуществления конъюгированные группы или концевые группы присоединены на 3'- и/или 5'-конце олигонуклеотидов. В определенных подобных вариантах осуществления конъюгированные группы (или концевые группы) присоединены на З'-конце олигонуклеотидов. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы присоединены возле 3'конца олигонуклеотидов. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы (или концевые группы) присоединены на 5'-конце олигонуклеотидов. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы присоединены возле 5'-конца олигонуклеотидов.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид является модифицированным. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид соединения имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды являются комплементарными матричной РНК (mRNA). В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды являются комплементарными пре-mRNA. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды являются комплементарными смысловому транскрипту.
- 44 047395
Примеры концевых групп включают без ограничения конъюгированные группы, кэп-группы, фосфатные компоненты, защитные группы, модифицированные или немодифицированные нуклеозиды и два или более нуклеозидов, которые независимо являются модифицированными или немодифицированными.
А. Некоторые конъюгированные группы.
В определенных вариантах осуществления к олигонуклеотидам ковалентно присоединены одна или несколько конъюгированных групп. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы модифицируют одно или несколько свойств присоединенного олигонуклеотида, в том числе без ограничения фармакодинамику, фармакокинетику, стабильность, связывание, абсорбцию, распределение в тканях, распределение в клетках, поглощение клетками, заряд и клиренс. В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы придают новое свойство присоединенному олигонуклеотиду, например, флуорофоры или репортерные группы, которые делают возможной детекцию олигонуклеотида.
Некоторые конъюгированные группы и конъюгированные компоненты были описаны ранее, например холестериновый компонент (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), простой тиоэфир, например гексил^-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533538), алифатическая цепь, например додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фософлипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-рац-глицеро-З-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиамин или цепь полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусная кислота, пальмитиловый компонент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый компонент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, i, 923937), токоферольная группа (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; doi:10.1038/mtna.2014.72 и Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740) или кластер GalNAc (например, WO 2014/179620).
1. Конъюгированные компоненты/
Конъюгированные компоненты включают без ограничения интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, пептиды, углеводы (например, GalNAc), витаминные компоненты, полиэтиленгликоли, тиоэфиры, полиэфиры, холестерины, тиохолестерины, компоненты, представляющие собой холевую кислоту, фолат, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фенантридин, антрахинон, адамантан, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины, флуорофоры и красители.
В определенных вариантах осуществления конъюгированный компонент предусматривает действующее лекарственное вещество, например аспирин, варфарин, фенилбутазон, ибупрофен, супрофен, фенбуфен, кетопрофен, (Ь)-(+)-пранопрофен. карпрофен, дансилсаркозин, 2,3,5-трийодбензойную кислоту, финголимод, флуфенаминовую кислоту, фолиновую кислоту, бензотиадиазид, хлортиазид, диазепин, индометицин, барбитурат, цефалоспорин, сульфамидное лекарственное средство, антидиабетическое средство, антибактериальное средство или антибиотик.
2. Конъюгирующие линкеры.
Конъюгированные компоненты присоединены к олигонуклеотидам с помощью конъюгирующих линкеров. В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа предусматривает одинарную химическую связь (т.е. конъюгируемый компонент присоединен к олигонуклеотиду с помощью конъюгирующего линкера посредством одинарной связи). В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит цепочечную структуру, такую как гидрокарбильная цепь, или олигомер из повторяющихся звеньев, таких как этиленгликолевые, нуклеозидные или аминокислотные звенья.
В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит одну или несколько групп, выбранных из алкильной, амино, оксо, амидной, дисульфидной, полиэтиленгликолевой, эфирной, тиоэфирной и гидроксиламино. В определенных подобных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит группы, выбранные из алкильной, амино-, оксо-, амидной и эфирной групп. В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит группы, выбранные из алкильной и амидной групп. В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит группы, выбранные из алкильной и эфирной групп. В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере один фосфоросодержащий компонент. В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере одну фосфатную группу. В определенных вариантах осуществления конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере одну нейтральную связывающую группу.
В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры, в том числе описанные выше конъюгирующие линкеры, представляют собой бифункциональные связывающие компоненты, например, известные из уровня техники как применимые для присоединения конъюгированных групп к исход
- 45 047395 ным соединениям, таким как олигонуклеотиды, предусмотренные в данном документе. Как правило, бифункциональный связывающий компонент содержит по меньшей мере две функциональные группы. Одна из функциональных групп выбрана для связывания с конкретным сайтом в соединении, а другая выбрана для связывания с конъюгированной группой. Примеры функциональных групп, используемых в бифункциональном связывающем компоненте, включают без ограничения электрофилы для вступления в реакцию с нуклеофильными группами и нуклеофилы для вступления в реакцию с электрофильными группами. В определенных вариантах осуществления бифункциональные связывающие компоненты содержат одну или несколько групп, выбранных из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, алкила, алкенила и алкинила.
Примеры конъюгирующих линкеров включают без ограничения пирролидин, 8-амино-3,6диоксаоктановую кислоту (ADO), сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) и 6-аминогексановую кислоту (АНЕХ или AHA). Другие конъюгирующие линкеры включают без ограничения замещенный или незамещенный C1-C10-алкил, замещенный или незамещенный С2-С10-алкенил или замещенный или незамещенный С2-С10-алкинил, где неограничивающий перечень предпочтительных замещающих групп включает гидроксил, амино, алкокси, карбокси, бензил, фенил, нитро, тиол, тиоалкокси, галоген, алкил, арил, алкенил и алкинил.
В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры содержат 1-10 линкерных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления такие линкерные нуклеозиды являются модифицированными нуклеозидами. В определенных вариантах осуществления такие линкерные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный компонент. В определенных вариантах осуществления линкерные нуклеозиды являются немодифицированными. В определенных вариантах осуществления линкерные нуклеозиды содержат необязательно защищенное гетероциклическое основание, выбранное из пурина, замещенного пурина, пиримидина или замещенного пиримидина. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой нуклеозид, выбранный из урацила, тимина, цитозина, 4-Ы-бензоилцитозина, 5-метилцитозина, 4-Ы-бензоил-5-метилцитозина, аденина, 6-Ы-бензоиладенина, гуанина и 2-Ы-изобутирилгуанина. Как правило, желательно, чтобы линкерные нуклеозиды отщеплялись от соединения после того, как оно достигнет ткани-мишени. Соответственно, линкерные нуклеозиды, как правило, связаны друг с другом и с остальной частью соединения посредством расщепляемых связей. В определенных вариантах осуществления такие расщепляемые связи представляют собой фосфодиэфирные связи.
В данном документе линкерные нуклеозиды не считаются частью олигонуклеотида. Соответственно, в вариантах осуществления, в которых соединение содержит олигонуклеотид, состоящий из связанных нуклеозидов в указанном количестве или диапазоне количеств и/или характеризующийся указанным процентом комплементарности по отношению к эталонной нуклеиновой кислоте, и соединение также содержит конъюгированную группу, содержащую конъюгирующий линкер, содержащий линкерные нуклеозиды, эти линкерные нуклеозиды не учитываются при определении длины олигонуклеотида и не используются при определении процента комплементарности олигонуклеотида по отношению к эталонной нуклеиновой кислоте. Например, соединение может содержать (1) модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-30 нуклеозидов, и (2) конъюгированную группу, содержащую 1-10 линкерных нуклеозидов, смежных с нуклеозидами модифицированного олигонуклеотида. Общее количество смежных связанных нуклеозидов в таком соединении превышает 30. В качестве альтернативы, соединение может содержать модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-30 нуклеозидов, и не содержать конъюгированную группу. Общее количество смежных связанных нуклеозидов в таком соединении не превышает 30. Если не указано иное, конъюгирующие линкеры содержат не более 10 линкерных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры содержат не более 5 линкерных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры содержат не более 3 линкерных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры содержат не более 2 линкерных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления конъюгирующие линкеры содержат не более 1 линкерного нуклеозида.
В определенных вариантах осуществления желательно, чтобы конъюгированная группа отщеплялась от олигонуклеотида. Например, при определенных обстоятельствах соединения, содержащие конкретный конъюгируемый компонент, лучше поглощаются клетками конкретного типа, однако после поглощения соединения желательно, чтобы конъюгированная группа расщеплялась с высвобождением неконъюгированного или исходного олигонуклеотида. Таким образом, определенные конъюгаты могут содержать один или несколько расщепляемых компонентов, как правило, в составе конъюгирующего линкера. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой расщепляемую связь. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой группу атомов, содержащую по меньшей мере одну расщепляемую связь. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент содержит группу атомов, имеющую одну, две, три, четыре или более четырех расщепляемых связей. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент избирательно расщепляется внутри клеточного или субклеточного компартмента, такого как лизосома. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент избирательно расщепля
- 46 047395 ется эндогенными ферментами, такими как нуклеазы.
В определенных вариантах осуществления расщепляемая связь выбрана из амидной, сложноэфирной, эфирной, одной или обеих сложноэфирных в фосфодиэфирной связи, фосфоэфирной, карбаматной или дисульфидной. В определенных вариантах осуществления расщепляемая связь является одной или обеими из сложноэфирных в фосфодиэфирной связи. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент содержит фосфат или фосфодиэфир. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой фосфатную связь между олигонуклеотидом и конъюгированным компонентом или конъюгированной группой.
В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент содержит один или несколько линкерных нуклеозидов или состоит из них. В определенных подобных вариантах осуществления один или несколько линкерных нуклеозидов связаны друг с другом и/или с остальной частью соединения посредством расщепляемых связей. В определенных вариантах осуществления такие расщепляемые связи представляют собой немодифицированные фосфодиэфирные связи. В определенных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, который присоединен к 3'либо к 5'-концевому нуклеозиду олигонуклеотида посредством фосфатной межнуклеозидной связи и ковалентно присоединен к остальной части конъюгирующего линкера или конъюгированному компоненту посредством фосфатной или фосфотиоатной связи. В определенных подобных вариантах осуществления расщепляемый компонент представляет собой 2'-дезоксиаденозин.
3. Некоторые конъюгированные компоненты, нацеливающие на клетку В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа содержит конъюгированный компонент, нацеливающий на клетку. В определенных вариантах осуществления конъюгированная группа имеет общую формулу:
|Лиганд — |__I Разветвляющая .]__[Конъюгирующий,__ι Расщепляемый 1__| . эжмен П группа m I линкер 1 компонент б *
Нацеливающий на клетку компонент где n равняется от 1 до приблизительно 3, m равняется 0, если n равняется 1, m равняется 1, если n равняется 2 или более, j равняется 1 или 0, k равняется 1 или 0.
В определенных вариантах осуществления n равняется 1, j равняется 1, и k равняется 0. В определенных вариантах осуществления n равняется 1, j равняется 0 и k равняется 1. В определенных вариантах осуществления n равняется 1, j равняется 1 и k равняется 1. В определенных вариантах осуществления n равняется 2, j равняется 1 и k равняется 0. В определенных вариантах осуществления n равняется 2, j равняется 0 и k равняется 1. В определенных вариантах осуществления n равняется 2, j равняется 1 и k равняется 1. В определенных вариантах осуществления n равняется 3, j равняется 1 и k равняется 0. В определенных вариантах осуществления n равняется 3, j равняется 0 и k равняется 1. В определенных вариантах осуществления n равняется 3, j равняется 1 и k равняется 1.
В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы содержат компоненты, нацеливающие на клетку, которые имеют по меньшей мере один связанный лиганд. В определенных вариантах осуществления компоненты, нацеливающие на клетку, содержат два связанных лиганда, ковалентно присоединенных к разветвляющейся группе. В определенных вариантах осуществления компоненты, нацеливающие на клетку, содержат три связанных лиганда, ковалентно присоединенных к разветвляющейся группе.
В определенных вариантах осуществления компонент, нацеливающий на клетку, содержит разветвляющуюся группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной, амино, оксо, амидной, дисульфидной, полиэтиленгликолевой, эфирной, тиоэфирной и гидроксиламиногруппы. В определенных вариантах осуществления разветвляющаяся группа содержит разветвленную алифатическую группу, содержащую группы, выбранные из алкильной, амино, оксо, амидной, дисульфидной, полиэтиленгликолевой, эфирной, тиоэфирной и гидроксиламиногруппы. В определенных подобных вариантах осуществления разветвленная алифатическая группа содержит группы, выбранные из алкильной, амино, оксо, амидной и эфирной группы. В определенных подобных вариантах осуществления разветвленная алифатическая группа содержит группы, выбранные из алкильной, амино и эфирной группы. В определенных подобных вариантах осуществления разветвленная алифатическая группа содержит группы, выбранные из алкильной и эфирной группы. В определенных вариантах осуществления разветвляющаяся группа содержит моно- или полициклическую кольцевую систему.
В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент компонента, нацеливающего на клетку, содержит одну или несколько групп, выбранных из алкильной, замещенной алкильной, эфирной, тиоэфирной, дисульфидной, амино, оксо, амидной, фосфодиэфирной и полиэтиленгликолевой в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из
- 47 047395 алкильной, эфирной, тиоэфирной, дисульфидной, амино, оксо, амидной и полиэтиленгликолевой в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной, фосфодиэфирной, эфирной, амино, оксо и амидной в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной, эфирной, амино, оксо и амидной, в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной, амино и оксо в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной и оксо в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или несколько групп, выбранных из алкильной и фосфодиэфирной в любой комбинации. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент содержит по меньшей мере одну фосфорсодержащую связывающую группу или нейтральную связывающую группу. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент содержит цепь длиной от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент содержит цепь длиной от приблизительно 10 до приблизительно 18 атомов. В определенных вариантах осуществления каждый связывающий элемент содержит цепь длиной приблизительно 10 атомов.
В определенных вариантах осуществления каждый лиганд компонента, нацеливающего на клетку, характеризуется сродством к рецепторам по меньшей мере одного типа на клетке-мишени. В определенных вариантах осуществления каждый лиганд характеризуется сродством к рецепторам по меньшей мере одного типа на поверхности клетки печени млекопитающего. В определенных вариантах осуществления каждый лиганд характеризуется сродством к асиалогликопротеиновому рецептору печени (ASGP-R). В определенных вариантах осуществления каждый лиганд представляет собой углевод. В определенных вариантах осуществления каждый лиганд независимо выбран из галактозы, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), маннозы, глюкозы, глюкозамина и фукозы. В определенных вариантах осуществления каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин (GalNAc). В определенных вариантах осуществления компонент, нацеливающий на клетку, содержит 3 GalNAc-лиганда. В определенных вариантах осуществления компонент, нацеливающий на клетку, содержит 2 GalNAc-лиганда. В определенных вариантах осуществления компонент, нацеливающий на клетку, содержит 1 GalNAc-лиганд.
В определенных вариантах осуществления каждый лиганд компонента, нацеливающего на клетку, представляет собой углевод, производное углевода, модифицированный углевод, полисахарид, модифицированный полисахарид или производное полисахарида. В определенных подобных вариантах осуществления конъюгированная группа содержит углеводный кластер (см., например, Maier et al., Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting, Bioconjugate Chemistry, 2003, 14, 18-29, или Rensen et al., Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor, J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В определенных подобных вариантах осуществления каждый лиганд представляет собой аминосахар или тиосахар. Например, аминосахара могут быть выбраны из любого количества соединений, известных из уровня техники, таких как сиаловая кислота, a-D-галактозамин, β-мурамовая кислота, 2-дезокси-2-метиламино^-глюкопираноза, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-О-метил-Оманнопираноза, 2-дезокси-2-сульфоамино-О-глюкопираноза, и №сульфо-О-глюкозамин, и N-гликолоилα-нейраминовая кислота. Например, тиосахара могут быть выбраны из 5-тио-в^-глюкопиранозы, метил-2,3,4-три-О-ацетил-1 -тио-6-О-тритил-а^-глюкопиранозида, 4-тио-в^-галактопиранозы и этил3,4,6,7-тетра-О-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-а-О-глюкогептопиранозида.
В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы содержат компонент, нацеливающий на клетку, характеризующийся следующей формулой:
AcHN О .
В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы содержат компонент, нацеливающий на клетку, характеризующийся следующей формулой:
- 48 047395
В определенных вариантах осуществления конъюгированные группы содержат компонент, нацеливающий на клетку, характеризующийся следующей формулой:
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат конъюгированную группу, описанную в данном документе как LICA-1. LICA-1 показана ниже без необязательного расщепляемого компонента на конце конъюгирующего линкера:
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат LICA-1 и расщепляемый компонент в составе конъюгирующего линкера и имеют следующую формулу:
где олиго означает олигонуклеотид.
Иллюстративные публикации, в которых изложено получение некоторых из вышеупомянутых конъюгированных групп и соединений, содержащих конъюгированные группы, связывающие элементы, конъюгирующие линкеры, разветвляющиеся группы, лиганды, расщепляемые компоненты, а также другие модификации, включают без ограничения US 5994517, US 6300319, US 6660720, US 6906182, US 7262177, US 7491805, US 8106022, US 7723509, US 9127276, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 и WO 2012/037254, Biessen et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 1846-1852, Lee et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2011, 19, 2494-2500, Rensen et al., J. Biol Chem. 2001, 276, 37577-37584, Rensen et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808, Sliedregt et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 609-618, и Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат модифицированные олигонуклеотиды, содержащие гэпмерный или полностью модифицированный мотив, и конъюгированную группу, содержащую по меньшей мере один, два или три GalNAc-лиганда. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, содержат конъю
- 49 047395 гированную группу, которую можно найти в любом из следующих литературных источников: Lee,
Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., BioorgMedChem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., BioorgMed Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., BioorgMedChem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., BioorgMed Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., OrgLett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; международных публикациях WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; W02008/098788; W02004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131;
WO2011/163121; WO2012/177947; W02013/033230; W02013/075035; WO2012/083185;
W02012/083046; W02009/082607; WO2009/134487; W02010/144740; W02010/148013;
WO 1997/020563; W02010/088537; W02002/043771; W02010/129709; WO2012/068187;
WO2009/126933; W02004/024757; WO2010/054406; WO2012/089352; W02012/089602;
WO2013/166121; WO2013/165816; патентах США 4751219; 8552163; 6908903; 7262177; 5994517; 6300319; 8106022; 7491805; 7491805; 7582744; 8137695; 6383812; 6525031; 6660720; 7723509; 8541548; 8344125; 8313772; 8349308; 8450467; 8501930; 8158601; 7262177; 6906182; 6620916; 8435491; 8404862; 7851615; публикациях заявок на патент США US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740; US2008/0281044; US2010/0240730; US2003/0119724; US2006/0183886; US2008/0206869; US2011/0269814; US2009/0286973; US2011/0207799; US2012/0136042; US2012/0165393; US2008/0281041; US2009/0203135; US2012/0035115; US2012/0095075; US2012/0101148; US2012/0128760; US2012/0157509; US2012/0230938; US2013/0109817; US2013/0121954; US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801 и US2009/0203132;
каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций Соединения, описанные в данном документе, можно смешивать с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, в том числе без ограничения от пути введения, степени заболевания или подлежащей введению дозы.
В определенных вариантах осуществления предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько соединений или их соль. В определенных вариантах осуществления соединения представляют собой антисмысловые соединения или олигомерные соединения. В определенных вариантах осуществления соединения содержат модифицированный олигонуклеотид или состоят из него. В определенных подобных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит подходящий фармацевтически приемлемые разбавитель или носитель. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит стерильный солевой раствор и одно или несколько соединений. В определенных вариантах осуществления такая фармацевтическая композиция состоит из стерильного солевого раствора и одного или нескольких соединений. В определенных вариантах осуществления стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической степени чистоты. В
- 50 047395 определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько соединений и стерильную воду. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция состоит из одного соединения и стерильной воды. В определенных вариантах осуществления стерильная вода представляет собой воду фармацевтической степени чистоты. В определенных вариантах осуществления а фармацевтическая композиция содержит одно или несколько соединений и фосфатносолевой буферный раствор (PBS). В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция состоит из одного соединения и стерильного PBS. В определенных вариантах осуществления стерильный PBS представляет собой PBS фармацевтической степени чистоты. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, в том числе без ограничения от пути введения, степени заболевания или подлежащей введению дозы.
Соединение, описанное в данном документе, нацеленное на нуклеиновую кислоту PNPLA3, можно применять в фармацевтических композициях путем объединения соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой воду, такую как стерильная вода, подходящая для инъекций. Соответственно, в одном варианте осуществления в описанных в данном документе способах применяют фармацевтическую композицию, содержащую соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту PNPLA3, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой воду. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, предусмотренный в данном документе, или состоит из него.
Фармацевтические композиции, содержащие соединения, предусмотренные в данном документе, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, которые при введении животному, в том числе человеку, способны предоставить ему (непосредственно или опосредованно) их биологически активный метаболит или остаток. В определенных вариантах осуществления соединения представляют собой антисмысловые соединения или олигомерные соединения. В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид или состоит из него. Соответственно, например, настоящее изобретение также охватывает фармацевтически приемлемые соли соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения натриевые и калиевые соли.
Пролекарство может предусматривать включение дополнительных нуклеозидов на одном или обоих концах соединения, которые отщепляются под действием эндогенных нуклеаз в организме с образованием активного соединения.
В определенных вариантах осуществления соединения или композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Некоторые отобранные соединения.
Для примерно 2384 новых сконструированных соединений с различными длиной, химическими структурами и мотивами тестировали их эффект в отношении mRNA PNPLA3 человека in vitro в нескольких типах клеток (пример 1). Из 2384 соединений, тестируемых в отношении эффективности в однократной дозе in vitro, свыше 400 отобранных соединения тестировали в отношении дозозависимого подавления в клетках А431 (пример 2). Соединения из совокупности свыше 400 соединений, тестируемых в анализах зависимости ответа от дозы, дополнительно подвергали скринингу в отношении переносимости высокой дозы в модели на мышах BALB/c, и 87 олигонуклеотидов были отобраны для исследования эффективности in vivo в модели на мышах, трансгенных по PNPLA3.
Из 87 олигонуклеотидов, протестированных в модели на трансгенных мышах, 23 олигонуклеотида были отобраны для дополнительного тестирования в отношении переносимости в доклинических моделях на грызунах. В моделях переносимости in vivo на грызунах измеряли значения массы тела и массы органов, маркеры функции печени (такие как аланинтрансаминаза, аспартаттрансаминаза и билирубин) и маркеры функции почек (такие как BUN и креатинин). Было обнаружено, что в модели на мышах CD1 и в модели на крысах Спрег-Доули ION 975591, 975605, 975612, 975613, 975616, 975617, 975735, 975736, 994282 и 994284 являлись переносимыми (примеры 5 и 6).
Такие соединений дополнительно тестировали в отношении эффективности в модели на мышах, трансгенных по PNPLA3, в ходе многодозовых анализов (пример 7).
IONs 994284, 97605, 975616, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736, и 975612 тестировали на макаках-крабоедах в отношении переносимости (пример 8). Обработка соединениями хорошо переносилась обезьянами.
Соответственно, в данном документе предусмотрены соединения с любыми одним или несколькими улучшенными свойствами. В определенных вариантах осуществления соединения, описанные в данном документе, являются эффективными и переносимыми.
Примеры идентификаций соединений по изобретению и родственных соединений
В приведенных ниже примерах описан способ скрининга для выявления лидерных соединений, нацеленных на PNPLA3. ION 994284, 97605, 975616, 994282, 975613, 975617, 975735, 975736 и 975612 про
- 51 047395 демонстрировали высокую активность и переносимость.
Неограничивающее раскрытие и включение посредством ссылки.
Несмотря на то, что в перечне последовательностей, прилагаемом к данной подаваемой заявке, каждая последовательность в соответствии с установленными требованиями идентифицирована как РНК либо как ДНК, в действительности эти последовательности могут быть модифицированы с помощью любой комбинации химических модификаций. Специалист в данной области легко поймет, что такое обозначение, как РНК или ДНК, для описания модифицированных олигонуклеотидов, в некоторых случаях является произвольным. Например, олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий 2'OH-сахарный компонент и тиминовое основание, может быть описан как ДНК, имеющая модифицированный сахар (2'-OH вместо природного 2'-Н в ДНК), или как РНК, имеющая модифицированное основание (тимин (метилированный урацил) вместо природного урацила в РНК).
Соответственно, предложенные в данном документе последовательности нуклеиновых кислот, в том числе без ограничения приведенные в перечне последовательностей, охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие любую комбинацию из природных или модифицированных РНК и/или ДНК, включая без ограничения такие нуклеиновые кислоты с модифицированными нуклеиновыми основаниями. В качестве дополнительного примера и без ограничения, олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований ATCGATCG охватывает любые олигонуклеотиды, имеющие такую последовательность нуклеиновых оснований, независимо от того, являются ли они модифицированными или немодифицированными, в том числе без ограничения такие соединения, которые содержат основания РНК, такие как соединения, имеющие последовательность AUCGAUCG, и соединения, имеющие несколько оснований ДНК и несколько оснований РНК, такие как AUCGATCG, а также соединения, имеющие другие модифицированные нуклеиновые основания, такие как ATmC.'GAUC'G. где mC указывает на цитозиновое основание, содержащее метильную группу в 5-положении.
Некоторые соединения, описанные в данном документе (например, модифицированные олигонуклеотиды), имеют один или несколько асимметричных центров и, могут таким образом образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные конфигурации, которые могут быть определены с точки зрения абсолютной стереохимии как (R) или (S), как α или β, например, в случае аномеров сахаров или как (D) или (L), например, в случае аминокислот и т.д. Соединения, представленные в данном документе, которые изображены или описаны как имеющие определенные стереоизомерные конфигурации, включают только указанные соединения. Представленные в данном документе соединения, которые изображены или описаны как имеющие неопределенную стереохимию, включают все такие возможные изомеры, в том числе их стереослучайные и оптически чистые формы. Подобным образом включены все таутомерные формы соединений, представленных в данном документе, если не указано иное. Если не указано иное, подразумевается, что олигомерные соединения и модифицированные олигонуклеотиды, описанные в данном документе, включают соответствующие солевые формы.
Соединения, описанные в данном документе, включают вариации, в которых один или несколько атомов заменены нерадиоактивным изотопом или радиоактивным изотопом указанного элемента. Например, соединения согласно данному документу, которые содержат атомы водорода, охватывают все возможные замещения дейтерием каждого из атомов водорода 1Н. Изотопные замещения, охватываемые соединениями согласно данному документу, включают без ограничения: 2Н или 3Н вместо 1Н, 13С или 14С вместо 12С, 15N вместо 14N, 17О или 18О вместо 16О, а также 33S, 34S, 35S или 36S вместо 32S.
Хотя некоторые описанные в данном документе соединения, композиции и способы были конкретно описаны в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, нижеследующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных в данном документе, и не подразумевают их ограничение. Каждая из ссылок, упомянутая в настоящем документе, включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Пример 1. Антисмысловое подавление PNPLA3 человека в клетках А431/
Антисмысловые олигонуклеотиды разрабатывали для нацеливания на нуклеиновую кислоту PNPLA3 и тестировали их эффекты в отношении mRNA PNPLA3 in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов, в которых были сходные условия культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в показанных ниже отдельных таблицах.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в приведенных ниже таблицах обозначены как cEt-гэпмеры 3-10-3. Гэпмеры имеют длину 16 нуклеозидов, при этом центральный гэпсегмент содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов и фланкирован фланговыми сегментами в 5'-направлении и в 3'-направлении, каждый из которых содержит по три нуклеозида. Каждый нуклеозид в 5'-концевом фланговом сегменте и каждый нуклеозид в 3'-концевом фланговом сегменте имеет cEt-модификацию сахара. Все межнуклеозидные связи в каждом гэпмере являются фосфотиоатными (P=S) связями. Все цитозиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозин.
Стартовый сайт указывает на самый крайний 5'-концевой нуклеозид, на который нацеливается гэпмер, в последовательности гена человека. Стоп-сайт указывает на самый крайний 3'-концевой нуклеозид, на который нацеливается гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый из гэпмеров, перечисленных в приведенных ниже таблицах, нацелен либо на mRNA PNPLA3 человека, обозначенную в
- 52 047395 данном документе как SEQ ID NO: 1 (№ доступа в GENBANK NM_025225.2), либо на геномную последовательность PNPLA3 человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID NO: 2 (№ доступа в GENBANK NC_000022.11 с усечением нуклеотидов от 43921001 до 43954500). n/a указывает на то, что антисмысловой олигонуклеотид не нацеливается на такую конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Исследование 1.
Культивируемые клетки А431 при плотности 20000 клеток на лунку трансфицировали путем свободного поглощения с помощью 4000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составлявшего примерно 24 ч, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни mRNA PNPLA3 с помощью количественной ПНР в реальном времени. Набор праймеров и зондов для человека RTS36070 (прямая последовательность CCTTGGTATGTTCCTGCTTCA обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 11; обратная последовательность GTTGTCACTCACTCCTCCATC обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 12; последовательность зонда TGGCCTTATCCCTCCTTCCTTCFGA обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 13) применяли для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA PNPLA3 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента подавления PNPLA3 относительно необработанных контрольных клеток.
Таблица 1
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
912709 27 42 2765 2780 GGCATTCCCAGCGCGA 0 17
912710 95 ПО 2833 2848 TCCTGATCCGCAGCAG 15 18
912711 103 118 2841 2856 GGCTCGGGTCCTGATC 0 19
912712 131 146 2869 2884 GTTAGGATCTGGGTCG 91 20
912713 164 179 2902 2917 GTACATGGCGGCGGCG 0 21
912714 183 198 2921 2936 TCCAGCCGCGCTCTGC 23 22
912715 196 211 2934 2949 GCGAAGGACAAGCTCC 60 23
912716 197 212 2935 2950 CGCGAAGGACAAGCTC 0 24
912717 272 287 ЗОЮ 3025 GCGGAGGAGGTGCGGG 0 25
912718 273 288 ЗОН 3026 CGCGGAGGAGGTGCGG 0 26
912719 274 289 3012 3027 TCGCGGAGGAGGTGCG 19 27
912720 290 305 3028 3043 GAACAACATGCGCGCG 0 28
912721 291 306 3029 3044 CGAACAACATGCGCGC 7 29
912722 292 307 3030 3045 CCGAACAACATGCGCG 21 30
912723 293 308 3031 3046 GCCGAACAACATGCGC 0 31
912724 294 309 3032 3047 CGCCGAACAACATGCG 0 32
912725 323 338 3061 3076 GCCGACGCAGTGCAAC 0 33
912726 324 339 3062 3077 CGCCGACGCAGTGCAA 0 34
912727 340 355 3078 3093 GGGATACCGGAGAGGA 43 35
912728 370 385 5944 5959 TCTGAGAGGACCTGCA 53 36
912729 375 390 5949 5964 CAAGATCTGAGAGGAC 64 37
- 53 047395
912730 404 419 5978 5993 GCCAATGTTCCGACTC 71 38
912731 410 425 5984 5999 GAAGATGCCAATGTTC 51 39
912732 429 444 6003 6018 TTAAGTTGAAGGATGG 96 40
912733 432 447 6006 6021 TGCTTAAGTTGAAGGA 90 41
912734 478 493 6052 6067 TGGACATTGGCCGGGA 85 42
912735 479 494 6053 6068 GTGGACATTGGCCGGG 50 43
912736 484 499 6058 6073 AGCTGGTGGACATTGG 64 44
912737 528 543 6102 6117 CATCAGACACTCTGGT 5 45
912738 531 546 6105 6120 CCCCATCAGACACTCT 73 46
912739 552 567 6126 6141 AGTCAGACACCAGAAC 54 47
912755 693 708 11911 11926 TGGCATCAATGAAGGG 74 48
912756 698 713 11916 11931 TGTTTTGGCATCAATG 91 49
912757 746 761 11964 11979 TTTAGGGCAGATGTCG 89 50
912758 747 762 11965 11980 CTTTAGGGCAGATGTC 90 51
912759 795 810 12013 12028 GTAGACTGAGCTTGGT 98 52
912760 820 835 12038 12053 AGGTAGAGGTTCCCTG 0 53
912761 841 856 12059 12074 GGGACAAAAGCTCTCG 20 54
912762 873 888 13609 13624 GGCATATCTCTCCCAG 0 55
912763 874 889 13610 13625 AGGCATATCTCTCCCA 0 56
912764 886 901 13622 13637 AAATATCCTCGAAGGC 57 57
912765 888 903 13624 13639 CCAAATATCCTCGAAG 30 58
912766 889 904 13625 13640 TCCAAATATCCTCGAA 38 59
912767 894 909 13630 13645 ATGCATCCAAATATCC 58 60
912768 925 940 N/A N/A TTGCAGATGCCCTTCT 15 61
912769 968 983 16088 16103 ATCCATCCCTTCTGAG 34 62
912770 986 1001 16106 16121 GGGCATGGCGACCTCA 0 63
912771 1004 1019 16124 16139 ACTCATGTTTGCCCAG 67 64
912772 1068 1083 16188 16203 GGTCTAGCAGCTCATC 89 65
912773 1075 1090 16195 16210 CGCAGGTGGTCTAGCA 0 66
912774 1076 1091 16196 16211 ACGCAGGTGGTCTAGC 25 67
912775 1080 1095 16200 16215 TGAGACGCAGGTGGTC 50 68
912776 1086 1101 16206 16221 GGATGCTGAGACGCAG 67 69
912777 1172 1187 19012 19027 GTATCCACCTTTGTCT 78 70
912778 1178 1193 19018 19033 GCTCATGTATCCACCT 79 71
912779 1187 1202 19027 19042 GCAAATCTTGCTCATG 3 72
912780 1188 1203 19028 19043 TGCAAATCTTGCTCAT 13 73
912781 1189 1204 19029 19044 TTGCAAATCTTGCTCA 0 74
912782 1195 1210 19035 19050 AGCAAGTTGCAAATCT 77 75
912783 1199 1214 19039 19054 GGGTAGCAAGTTGCAA 74 76
912784 1205 1220 19045 19060 CCTAATGGGTAGCAAG 62 77
912785 1206 1221 19046 19061 TCCTAATGGGTAGCAA 79 78
- 54 047395
Таблица 2
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
912786 1207 1222 19047 19062 ATCCTAATGGGTAGCA 81 79
912787 1211 1226 19051 19066 CATTATCCTAATGGGT 46 80
912788 1212 1227 19052 19067 ACATTATCCTAATGGG 0 81
912789 1213 1228 19053 19068 GACATTATCCTAATGG 70 82
912790 1220 1235 19060 19075 TACATAAGACATTATC 34 83
912791 1224 1239 19064 19079 GCATTACATAAGACAT 86 84
912792 1245 1260 19085 19100 CCACAGGCAGGGTACA 76 85
912793 1246 1261 19086 19101 TCCACAGGCAGGGTAC 28 86
912794 1253 1268 19093 19108 GGCAGATTCCACAGGC 75 87
912795 1259 1274 19099 19114 CGCAATGGCAGATTCC 92 88
912796 1265 1280 19105 19120 GACAATCGCAATGGCA 64 89
912797 1266 1281 19106 19121 GGACAATCGCAATGGC 75 90
912798 1267 1282 19107 19122 TGGACAATCGCAATGG 73 91
912799 1285 1300 23690 23705 AGCCATGTCACCAGTC 67 92
912800 1289 1304 23694 23709 TGGAAGCCATGTCACC 24 93
912801 1290 1305 23695 23710 CTGGAAGCCATGTCAC 72 94
912802 1297 1312 23702 23717 GGCATATCTGGAAGCC 0 95
- 55 047395
912803 1298 1313 23703 23718 GGGCATATCTGGAAGC 0 96
912804 1351 1366 23756 23771 AGCACTCGAGTGAACA 0 97
912805 1386 1401 N/A N/A GCATTTGGGACCTGGA 77 98
912806 1387 1402 N/A N/A GGCATTTGGGACCTGG 60 99
912807 1388 1403 25151 25166 TGGCATTTGGGACCTG 41 100
912808 1394 1409 25157 25172 GCTCACTGGCATTTGG 44 101
912809 1523 1538 25286 25301 GTTCAGGCTGGACCTG 49 102
912810 1547 1562 25310 25325 AGGTACTTTATTGCCC 11 103
912811 1550 1565 25313 25328 AGCAGGTACTTTATTG 64 104
912812 1653 1668 25416 25431 AACTTTAGCACCTCTG 91 105
912813 1655 1670 25418 25433 GAAACTTTAGCACCTC 88 106
912814 1656 1671 25419 25434 GGAAACTTTAGCACCT 53 107
912815 1669 1684 25432 25447 CTGCACAAAGATGGGA 80 108
912816 1671 1686 25434 25449 AGCTGCACAAAGATGG 45 109
912817 1685 1700 25448 25463 AGCAATGCGGAGGTAG 15 110
912818 1740 1755 25503 25518 ACCAACTCAGCTCAGA 85 111
912819 1741 1756 25504 25519 AACCAACTCAGCTCAG 79 112
912820 1757 1772 25520 25535 TCCTAGCTTTTCATAA 23 113
912821 1788 1803 25551 25566 TGCTGGACCGCTGCAC 0 114
912822 1796 1811 25559 25574 GAGTTAAGTGCTGGAC 93 115
912823 1802 1817 25565 25580 GTATTAGAGTTAAGTG 92 116
912824 1803 1818 25566 25581 TGTATTAGAGTTAAGT 79 117
912825 1806 1821 25569 25584 TGATGTATTAGAGTTA 92 118
912826 1808 1823 25571 25586 GCTGATGTATTAGAGT 80 119
912827 1821 1836 25584 25599 TGAATTAACGCATGCT 83 120
912828 1822 1837 25585 25600 CTGAATTAACGCATGC 78 121
912829 1870 1885 25633 25648 AGTAAGGGACCCTCTG 17 122
912830 1871 1886 25634 25649 CAGTAAGGGACCCTCT 28 123
912831 1872 1887 25635 25650 TCAGTAAGGGACCCTC 77 124
912832 1874 1889 25637 25652 AGTCAGTAAGGGACCC 51 125
912833 1893 1908 25656 25671 ATTAATAGGGCCACGA 80 126
912834 1895 1910 25658 25673 CCATTAATAGGGCCAC 90 127
912835 1896 1911 25659 25674 ACCATTAATAGGGCCA 81 128
- 56 047395
912836 1906 1921 25669 25684 GAACAGTCTGACCATT 82 129
912837 1908 1923 25671 25686 TGGAACAGTCTGACCA 31 130
912838 1909 1924 25672 25687 CTGGAACAGTCTGACC 83 131
912839 1911 1926 25674 25689 TGCTGGAACAGTCTGA 72 132
912840 1916 1931 25679 25694 CCTCATGCTGGAACAG 83 133
912841 1928 1943 25691 25706 TCATTCTAAGAACCTC 96 134
912842 1945 1960 25708 25723 ACCCATCCAAACACCT 16 135
912843 1982 1997 25745 25760 ACACATGGGCCAGCCT 70 136
912844 1989 2004 25752 25767 CAAGATCACACATGGG 70 137
912845 2057 2072 25820 25835 GGGACGAACTGCACCC 0 138
912846 2098 2113 25861 25876 TATCATCTTTGCAGAC 81 139
912847 2116 2131 25879 25894 GTTTTTAGTAGTCAAG 91 140
912848 2117 2132 25880 25895 CGTTTTTAGTAGTCAA 91 141
912849 2145 2160 25908 25923 TATCATCTTGTTACCC 85 142
912850 2148 2163 25911 25926 GATTATCATCTTGTTA 70 143
912851 2150 2165 25913 25928 TAGATTATCATCTTGT 53 144
912852 2151 2166 25914 25929 GTAGATTATCATCTTG 80 145
912853 2152 2167 25915 25930 AGTAGATTATCATCTT 84 146
912854 2175 2190 25938 25953 GTGAAAAAGGTGTTCT 77 147
912855 2182 2197 25945 25960 TAGTTAGGTGAAAAAG 92 148
912856 2188 2203 25951 25966 TTATTTTAGTTAGGTG 88 149
912857 2190 2205 25953 25968 CATTATTTTAGTTAGG 86 150
912858 2273 2288 26036 26051 CTACTAACATCTCACT 55 151
912859 2274 2289 26037 26052 TCTACTAACATCTCAC 89 152
912860 2278 2293 26041 26056 TTATTCTACTAACATC 27 153
912861 2280 2295 26043 26058 GCTTATTCTACTAACA 79 154
912862 2281 2296 26044 26059 GGCTTATTCTACTAAC 81 155
912863 2632 2647 26395 26410 GGTGAATGCCCTGCAC 41 156
- 57 047395
Таблица 3
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
912864 2703 2718 26466 26481 TTCAAGTTGTGTGCTC 90 157
912865 2755 2770 26518 26533 GGGAGAAACTCACTGA 37 158
912866 N/A N/A 4416 4431 TGCTACTTGCCCCAGC 2 159
912867 N/A N/A 4421 4436 CACAATGCTACTTGCC 87 160
912868 N/A N/A 4584 4599 CCCAATGGCAGGGCTT 58 161
912869 N/A N/A 4592 4607 TGCTCCTACCCAATGG 46 162
912870 N/A N/A 4766 4781 GACTTTTATTGTTGCT 95 163
912871 N/A N/A 4883 4898 TTCTATACCAGAGTGA 89 164
912872 N/A N/A 4884 4899 TTTCTATACCAGAGTG 89 165
912873 N/A N/A 5405 5420 GTAGATGGCCTTAATG 83 166
912876 N/A N/A 6155 6170 TACATCCACGACTTCG 94 167
912877 N/A N/A 6156 6171 TTACATCCACGACTTC 76 168
912880 N/A N/A 6606 6621 GGAACATTCAGGGTTT 13 169
912881 N/A N/A 6834 6849 ATTACTTGGGTGCAGG 55 170
912884 N/A N/A 6838 6853 GCAGATTACTTGGGTG 45 171
912885 N/A N/A 6931 6946 TGCAGGACAGGTTCCT 30 172
912888 N/A N/A 7549 7564 CACACTGGGTCACCAC 55 173
912889 N/A N/A 7552 7567 AGTCACACTGGGTCAC 61 174
912928 N/A N/A 12273 12288 GGTATATGTTCCCAGG 87 175
912929 N/A N/A 12314 12329 TATAACCACAGCCTGG 29 176
912932 N/A N/A 12321 12336 CTGACTATATAACCAC 81 177
912933 N/A N/A 12666 12681 ATCTTAGTGGCTGGGT 91 178
912936 N/A N/A 12767 12782 CTTACTATGGTAGAGT 88 179
912937 N/A N/A 12768 12783 TCTTACTATGGTAGAG 74 180
912940 N/A N/A 12835 12850 TGCATTGCATAGCCTT 97 181
912941 N/A N/A 12836 12851 TTGCATTGCATAGCCT 96 182
912944 N/A N/A 12907 12922 TGCTTATAAAGCACAC 61 183
912945 N/A N/A 12988 13003 GGAATAAGCCTCCACC 14 184
912948 N/A N/A 14055 14070 GAAATCTGATTGCTTC 59 185
912949 N/A N/A 14393 14408 TACTTATCTGCTCACT 66 186
- 58 047395
912952 N/A N/A 14673 14688 TCTCTTAGTGTCCCCA 90 187
14707 14722
912953 N/A N/A 14674 14689 ATCTCTTAGTGTCCCC 92 188
14708 14723
912956 N/A N/A 15284 15299 TCACATTCATGCTTGC 82 189
912957 N/A N/A 15291 15306 GATAACCTCACATTCA 0 190
912960 N/A N/A 15712 15727 GAGCTAGGTGCTTCAC 6 191
912961 N/A N/A 15753 15768 ATAACAACTGAACCAC 85 192
912964 N/A N/A 15937 15952 GTTATTAGCCAAATGC 92 193
912965 N/A N/A 16468 16483 GGAGACTTGGCAAGGT 87 194
912968 N/A N/A 16960 16975 ATTCATGACAGCCCTT 46 195
912969 N/A N/A 17128 17143 ATCGATTTTTCAGAGT 9 196
912972 N/A N/A 17134 17149 ACAAACATCGATTTTT 52 197
912973 N/A N/A 17769 17784 CTCTTTAATGACCTCG 90 198
912976 N/A N/A 18865 18880 GTCAGAGGCACTCACA 25 199
912977 N/A N/A 18959 18974 AGCTATTATCTCCCAC 0 200
912980 N/A N/A 19315 19330 AGTTTCTGGGCTTGCA 90 201
912981 N/A N/A 19382 19397 GGCAATCACAAGAGAC 73 202
912984 N/A N/A 20286 20301 AGAGGAAGCCCAATCA 79 203
20316 20331
912985 N/A N/A 20287 20302 CAGAGGAAGCCCAATC 93 204
20317 20332
912988 N/A N/A 20658 20673 TAGAAATTGCAGTGCC 92 205
912989 N/A N/A 20731 20746 TCCTATCCATATATTG 55 206
912992 N/A N/A 21408 21423 GCAATTCTAGACATGG 88 207
912993 N/A N/A 21558 21573 AGGACTTACACCAAGA 86 208
912996 N/A N/A 21936 21951 TTCCTAATAAGAGCCC 24 209
912997 N/A N/A 21946 21961 GTCAAACATCTTCCTA 66 210
913000 N/A N/A 22077 22092 AAAACTGTAGGATAGG 47 211
913001 N/A N/A 22162 22177 GTTACATCCATAAAAC 0 212
913004 N/A N/A 22169 22184 AGAGAATGTTACATCC 62 213
913008 N/A N/A 23083 23098 AAAGATTAATCAGGGC 61 214
913012 N/A N/A 23788 23803 GTATTTACCTGGAGGC 0 215
913016 N/A N/A 24426 24441 GGCCTATGATTTTCAG 0 216
- 59 047395
Таблица 4
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
912874 N/A N/A 5869 5884 ATACTTTTGGCAAGGC 96 217
912875 N/A N/A 5870 5885 AATACTTTTGGCAAGG 91 218
912878 N/A N/A 6159 6174 TGCTTACATCCACGAC 12 219
912879 N/A N/A 6296 6311 CATCATGTTGGTCTCG 54 220
912882 N/A N/A 6835 6850 GATTACTTGGGTGCAG 39 221
912883 N/A N/A 6837 6852 CAGATTACTTGGGTGC 69 222
912886 N/A N/A 7083 7098 TTTAATGGTGTTTTGG 87 223
912887 N/A N/A 7478 7493 TCAAATGCCGGTATTC 52 224
912890 N/A N/A 7587 7602 GTGAACTTCAACTTCC 56 225
912930 N/A N/A 12317 12332 CTATATAACCACAGCC 77 226
912931 N/A N/A 12319 12334 GACTATATAACCACAG 92 227
912934 N/A N/A 12670 12685 AATCATCTTAGTGGCT 91 228
912935 N/A N/A 12765 12780 TACTATGGTAGAGTGG 80 229
912938 N/A N/A 12786 12801 GTACATGGTCTGCAAA 84 230
912939 N/A N/A 12787 12802 TGTACATGGTCTGCAA 57 231
912942 N/A N/A 12843 12858 GCATGCATTGCATTGC 16 232
912943 N/A N/A 12885 12900 ACCAATCCTGTTAGAC 93 233
912946 N/A N/A 13557 13572 GGAGACACCAAGCACC 42 234
912947 N/A N/A 13751 13766 GCACTAAGTGTTAGAA 79 235
912950 N/A N/A 14396 14411 GCTTACTTATCTGCTC 0 236
912951 N/A N/A 14501 14516 GGAGATCCATCCTGCA 0 237
912954 N/A N/A 14675 14690 CATCTCTTAGTGTCCC 92 238
14709 14724
912955 N/A N/A 15122 15137 TCCTAATGTCCTCAAC 9 239
- 60 047395
912958 N/A N/A 15293 15308 AAGATAACCTCACATT 33 240
912959 N/A N/A 15294 15309 CAAGATAACCTCACAT 22 241
912962 N/A N/A 15754 15769 TATAACAACTGAACCA 82 242
912963 N/A N/A 15856 15871 GCTTTAAAGCAGGACA 8 243
912966 N/A N/A 16774 16789 AAAATTGTGGGTTTAG 68 244
912967 N/A N/A 16850 16865 ATCATTTGGACCATAG 81 245
912970 N/A N/A 17130 17145 ACATCGATTTTTCAGA 83 246
912971 N/A N/A 17133 17148 CAAACATCGATTTTTC 62 247
912974 N/A N/A 17843 17858 GCTTTACAAGCTGGTC 0 248
912975 N/A N/A 17879 17894 ATCTATGTTCTCCTAG 0 249
912978 N/A N/A 19125 19140 ACCTAAAATGCTCACC 0 250
912979 N/A N/A 19198 19213 CCAGACTACATGCCAC 79 251
912982 N/A N/A 19446 19461 TCTACTAGGCATCTCT 63 252
912983 N/A N/A 19447 19462 TTCTACTAGGCATCTC 42 253
912986 N/A N/A 20288 20303 TCAGAGGAAGCCCAAT 92 254
20318 20333
912987 N/A N/A 20656 20671 GAAATTGCAGTGCCCT 92 255
912990 N/A N/A 21393 21408 GCCAACCTATCACTGA 60 256
912991 N/A N/A 21400 21415 AGACATGGCCAACCTA 32 257
912994 N/A N/A 21565 21580 TGAAATAAGGACTTAC 67 258
912995 N/A N/A 21934 21949 CCTAATAAGAGCCCCA 31 259
912998 N/A N/A 22041 22056 GAAATCTGTCAGAGCA 33 260
912999 N/A N/A 22072 22087 TGTAGGATAGGACTAG 0 261
913002 N/A N/A 22166 22181 GAATGTTACATCCATA 53 262
913003 N/A N/A 22168 22183 GAGAATGTTACATCCA 80 263
913005 N/A N/A 22605 22620 GTGATAAATCTGCAAG 70 264
913006 N/A N/A 23081 23096 AGATTAATCAGGGCCA 8 265
913007 N/A N/A 23082 23097 AAGATTAATCAGGGCC 30 266
913009 N/A N/A 23325 23340 GGTCACATGTGAGCCC 0 267
913010 N/A N/A 23496 23511 CACTTCTGGTTCAAGA 13 268
913011 N/A N/A 23580 23595 CCAATCTGATGACTTC 80 269
913013 N/A N/A 23790 23805 AAGTATTTACCTGGAG 0 270
913014 N/A N/A 24028 24043 CACTCAAAGAGACTCA 65 271
913015 N/A N/A 24425 24440 GCCTATGATTTTCAGG 0 272
913017 N/A N/A 24633 24648 CACTACTGCCCTCTTC 50 273
913018 N/A N/A 24983 24998 TGCTGGGCTGATGTCA 0 274
913019 N/A N/A 25150 25165 GGCATTTGGGACCTGA 67 275
- 61 047395
Таблица 5
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915343 1 16 2739 2754 GCCCCCCTCGGACCAT 0 276
915363 45 60 2783 2798 CCTCAGTGTCTCGGCC 0 277
915383 107 122 2845 2860 AATCGGCTCGGGTCCT 29 278
915403 190 205 2928 2943 GACAAGCTCCAGCCGC 64 279
915423 249 264 2987 3002 CGCTCAGGCAGCGGGT 0 280
915443 347 362 N/A N/A CTCCAGCGGGATACCG 6 281
915463 386 401 5960 5975 GGCCTTCCGCACAAGA 0 282
915483 416 431 5990 6005 TGGATGGAAGATGCCA 28 283
915503 452 467 6026 6041 GAGACCCTGTCGGAGG 45 284
915523 488 503 6062 6077 GATGAGCTGGTGGACA 70 285
915543 510 525 6084 6099 GAGAGATGCCTATTTT 92 286
915563 559 574 6133 6148 GACCGAAAGTCAGACA 7 287
915603 697 712 11915 11930 GTTTTGGCATCAATGA 94 288
915623 754 769 11972 11987 GACTTGACTTTAGGGC 98 289
915643 827 842 12045 12060 CGAGAGAAGGTAGAGG 97 290
915663 879 894 13615 13630 CTCGAAGGCATATCTC 66 291
915683 932 947 16052 16067 GGGCCTGTTGCAGATG 0 292
915703 985 1000 16105 16120 GGCATGGCGACCTCAG 6 293
915723 1037 1052 16157 16172 AGCCAAGGCAGCCGAC 0 294
915743 1132 1147 16252 16267 GCGAGCCTGGGCGAGA 0 295
915763 1177 1192 19017 19032 CTCATGTATCCACCTT 88 296
- 62 047395
915783 1229 1244 19069 19084 GGGCAGCATTACATAA 73 297
915803 1286 1301 23691 23706 AAGCCATGTCACCAGT 34 298
915823 1348 1363 23753 23768 ACTCGAGTGAACACCT 12 299
915843 1405 1420 25168 25183 GCCTGTTGGCTGCTCA 1 300
915863 1473 1488 25236 25251 CTGCTGGACAGCCCTT 0 301
915883 1542 1557 25305 25320 CTTTATTGCCCAAGAA 72 302
915903 1601 1616 25364 25379 CAGACTCTTCTCTAGT 49 303
915923 1633 1648 25396 25411 AATCTGCTAGACTCGC 88 304
915943 1686 1701 25449 25464 CAGCAATGCGGAGGTA 80 305
915963 1768 1783 25531 25546 GAAAGGTTGCTTCCTA 84 306
915983 1789 1804 25552 25567 GTGCTGGACCGCTGCA 11 307
916003 1815 1830 25578 25593 AACGCATGCTGATGTA 69 308
916023 1848 1863 25611 25626 GCTTCCTGGTGTCATT 81 309
916043 1884 1899 25647 25662 GCCACGAAACAGTCAG 67 310
916063 1913 1928 25676 25691 CATGCTGGAACAGTCT 20 311
916083 1954 1969 25717 25732 AAGGCCCCCACCCATC 0 312
916103 1977 1992 25740 25755 TGGGCCAGCCTACCCC 0 313
916123 2026 2041 25789 25804 GGAAGTGGGATCATGC 55 314
916142 2100 2115 25863 25878 GTTATCATCTTTGCAG 57 315
916162 2139 2154 25902 25917 CTTGTTACCCCCGCCA 84 316
916182 2264 2279 26027 26042 TCTCACTGATTCACAT 83 317
916202 2624 2639 26387 26402 CCCTGCACACTAGATT 55 318
916222 2677 2692 26440 26455 GAGGCGGAAGCTCCTG 0 319
916242 2707 2722 26470 26485 CAGGTTCAAGTTGTGT 83 320
916282 N/A N/A 4225 4240 AAATGTACGGAATCTC 79 321
916302 N/A N/A 4822 4837 GTGTAAACATTTGTCC 74 322
916322 N/A N/A 5414 5429 AGCTTTGGTGTAGATG 49 323
916342 N/A N/A 5801 5816 TACTATGGGAGCCACA 42 324
916362 N/A N/A 6866 6881 TGAAATTGTAACTGCC 70 325
916382 N/A N/A 7492 7507 TAGATCGGTGCTGTTC 27 326
916402 N/A N/A 7785 7800 GTTATAGGCGAGAGCA 0 327
916562 N/A N/A 12316 12331 TATATAACCACAGCCT 58 328
916582 N/A N/A 12932 12947 ATAAGAGCTGTCTCCT 94 329
916602 N/A N/A 13703 13718 CTAGTAAATGCTTGTC 96 330
916622 N/A N/A 14177 14192 CTAATATTTCTACAGC 0 331
916642 N/A N/A 14672 14687 CTCTTAGTGTCCCCAT 95 332
916662 N/A N/A 15542 15557 TTCCATCACAAGGCCT 50 333
916682 N/A N/A 16317 16332 TCCATAATGCACAAGA 71 334
916702 N/A N/A 17223 17238 TGTAGCTGGTTTGTGG 88 335
916722 N/A N/A 18223 18238 AACAGCTACATCAGGC 44 336
916742 N/A N/A 19249 19264 GGCATTGCACATAGAC 74 337
916761 N/A N/A 20410 20425 GTAAGCAATGCAGCCA 88 338
916781 N/A N/A 20659 20674 TTAGAAATTGCAGTGC 91 339
916801 N/A N/A 20989 21004 AGGTATTAAACTGCCA 25 340
916821 N/A N/A 21506 21521 GTCCTAAGAGCACTCA 57 341
916841 N/A N/A 22603 22618 GATAAATCTGCAAGAG 49 342
916861 N/A N/A 23472 23487 GGGACTTACACTGAAA 66 343
916881 N/A N/A 24314 24329 GTCAACGCAGACTGCT 33 344
- 63 047395
Таблица 6
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915344 2 17 2740 2755 CGCCCCCCTCGGACCA 0 345
915364 46 61 2784 2799 GCCTCAGTGTCTCGGC 0 346
915384 108 123 2846 2861 GAATCGGCTCGGGTCC 49 347
915404 191 206 2929 2944 GGACAAGCTCCAGCCG 9 348
915424 250 265 2988 3003 TCGCTCAGGCAGCGGG 0 349
915444 348 363 N/A N/A GCTCCAGCGGGATACC 0 350
915464 387 402 5961 5976 TGGCCTTCCGCACAAG 0 351
915484 428 443 6002 6017 TAAGTTGAAGGATGGA 96 352
915504 453 468 6027 6042 AGAGACCCTGTCGGAG 80 353
915524 489 504 6063 6078 AGATGAGCTGGTGGAC 81 354
915544 512 527 6086 6101 AAGAGAGATGCCTATT 77 355
915564 560 575 6134 6149 GGACCGAAAGTCAGAC 0 356
915604 700 715 11918 11933 GTTGTTTTGGCATCAA 91 357
915624 755 770 11973 11988 GGACTTGACTTTAGGG 81 358
915644 828 843 12046 12061 TCGAGAGAAGGTAGAG 24 359
915664 880 895 13616 13631 CCTCGAAGGCATATCT 41 360
915684 952 967 16072 16087 GATGACTTCAGGCCTG 0 361
915704 987 1002 16107 16122 TGGGCATGGCGACCTC 0 362
915724 1038 1053 16158 16173 CAGCCAAGGCAGCCGA 0 363
915744 1133 1148 16253 16268 AGCGAGCCTGGGCGAG 0 364
915764 1179 1194 19019 19034 TGCTCATGTATCCACC 56 365
915784 1230 1245 19070 19085 AGGGCAGCATTACATA 69 366
915804 1293 1308 23698 23713 TATCTGGAAGCCATGT 6 367
915824 1349 1364 23754 23769 CACTCGAGTGAACACC 0 368
915844 1406 1421 25169 25184 GGCCTGTTGGCTGCTC 0 369
915864 1477 1492 25240 25255 GTCTCTGCTGGACAGC 0 370
915884 1545 1560 25308 25323 GTACTTTATTGCCCAA 73 371
915904 1607 1622 25370 25385 GACTCACAGACTCTTC 92 372
915924 1634 1649 25397 25412 GAATCTGCTAGACTCG 65 373
915944 1687 1702 25450 25465 ACAGCAATGCGGAGGT 83 374
915964 1769 1784 25532 25547 CGAAAGGTTGCTTCCT 79 375
915984 1790 1805 25553 25568 AGTGCTGGACCGCTGC 38 376
916004 1816 1831 25579 25594 TAACGCATGCTGATGT 79 377
916024 1849 1864 25612 25627 GGCTTCCTGGTGTCAT 73 378
916044 1885 1900 25648 25663 GGCCACGAAACAGTCA 40 379
916064 1914 1929 25677 25692 TCATGCTGGAACAGTC 80 380
916084 1958 1973 25721 25736 TCACAAGGCCCCCACC 35 381
916104 1978 1993 25741 25756 ATGGGCCAGCCTACCC 0 382
916124 2053 2068 25816 25831 CGAACTGCACCCCTTC 38 383
916143 2101 2116 25864 25879 GGTTATCATCTTTGCA 81 384
916163 2140 2155 25903 25918 TCTTGTTACCCCCGCC 84 385
916183 2265 2280 26028 26043 ATCTCACTGATTCACA 86 386
916203 2625 2640 26388 26403 GCCCTGCACACTAGAT 65 387
- 64 047395
916223 2678 2693 26441 26456 GGAGGCGGAAGCTCCT 0 388
916243 2709 2724 26472 26487 GCCAGGTTCAAGTTGT 62 389
916283 N/A N/A 4226 4241 CAAATGTACGGAATCT 52 390
916303 N/A N/A 4864 4879 TACTTTAGGCTCCTGG 90 391
916323 N/A N/A 5422 5437 AGCATTAGAGCTTTGG 75 392
916343 N/A N/A 5803 5818 TCTACTATGGGAGCCA 89 393
916363 N/A N/A 6927 6942 GGACAGGTTCCTTGGA 0 394
916383 N/A N/A 7493 7508 CTAGATCGGTGCTGTT 14 395
916403 N/A N/A 7786 7801 AGTTATAGGCGAGAGC 0 396
916563 N/A N/A 12318 12333 ACTATATAACCACAGC 90 397
916583 N/A N/A 12936 12951 GACAATAAGAGCTGTC 0 398
916603 N/A N/A 13704 13719 GCTAGTAAATGCTTGT 73 399
916623 N/A N/A 14231 14246 CCAACTTTTAGTATTA 92 400
916643 N/A N/A 14678 14693 AGCCATCTCTTAGTGT 50 401
916663 N/A N/A 15566 15581 TCTGATGTCGAAGAGG 68 402
916683 N/A N/A 16341 16356 TCCCATGTGGCAGTAC 0 403
916703 N/A N/A 17239 17254 TCCAAATGCCCAACTC 37 404
916723 N/A N/A 18241 18256 GCAAATAATGTGCACA 22 405
916743 N/A N/A 19250 19265 GGGCATTGCACATAGA 59 406
916762 N/A N/A 20413 20428 GTAGTAAGCAATGCAG 69 407
916782 N/A N/A 20660 20675 CTTAGAAATTGCAGTG 91 408
916802 N/A N/A 21002 21017 ATTTTAACAGCTCAGG 95 409
916822 N/A N/A 21540 21555 TATGACATTTCAGAGT 88 410
916842 N/A N/A 22629 22644 AGTACAAGCGCAGCCT 14 411
916862 N/A N/A 23538 23553 ACAAGGACAAGCCCAC 37 412
916882 N/A N/A 24339 24354 GAAGTAGCGGCATCCC 68 413
Таблица 7
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID % SEQ
соеди- NO: 1, NO: 1, NO: 2, NO: 2, Последовательность (5'-3') подавле- ID
нения старто- стоп- старто- стоп- ния NO
- 65 047395
вый сайт сайт вый сайт сайт PNPLA3
915345 3 18 2741 2756 CCGCCCCCCTCGGACC 0 414
915365 47 62 2785 2800 TGCCTCAGTGTCTCGG 0 415
915385 109 124 2847 2862 GGAATCGGCTCGGGTC 72 416
915405 193 208 2931 2946 AAGGACAAGCTCCAGC 41 417
915425 251 266 2989 3004 CTCGCTCAGGCAGCGG 0 418
915445 349 364 N/A N/A TGCTCCAGCGGGATAC 0 419
915465 388 403 5962 5977 CTGGCCTTCCGCACAA 16 420
915485 430 445 6004 6019 CTTAAGTTGAAGGATG 27 421
915505 454 469 6028 6043 CAGAGACCCTGTCGGA 72 422
915525 492 507 6066 6081 CGGAGATGAGCTGGTG 92 423
915545 513 528 6087 6102 TAAGAGAGATGCCTAT 57 424
915565 561 576 6135 6150 TGGACCGAAAGTCAGA 0 425
915605 701 716 11919 11934 GGTTGTTTTGGCATCA 97 426
915625 756 771 11974 11989 TGGACTTGACTTTAGG 93 427
915645 829 844 12047 12062 CTCGAGAGAAGGTAGA 0 428
915665 881 896 13617 13632 TCCTCGAAGGCATATC 0 429
915685 953 968 16073 16088 GGATGACTTCAGGCCT 0 430
915705 988 1003 16108 16123 CTGGGCATGGCGACCT 0 431
915725 1039 1054 16159 16174 ACAGCCAAGGCAGCCG 0 432
915745 1134 1149 16254 16269 TAGCGAGCCTGGGCGA 0 433
915765 1193 1208 19033 19048 CAAGTTGCAAATCTTG 0 434
915785 1231 1246 19071 19086 CAGGGCAGCATTACAT 74 435
915805 1300 1315 23705 23720 TCGGGCATATCTGGAA 21 436
915825 1350 1365 23755 23770 GCACTCGAGTGAACAC 0 437
915845 1407 1422 25170 25185 AGGCCTGTTGGCTGCT 0 438
915865 1480 1495 25243 25258 TTGGTCTCTGCTGGAC 21 439
915885 1546 1561 25309 25324 GGTACTTTATTGCCCA 62 440
915905 1609 1624 25372 25387 GTGACTCACAGACTCT 81 441
915925 1635 1650 25398 25413 AGAATCTGCTAGACTC 74 442
915945 1688 1703 25451 25466 CACAGCAATGCGGAGG 56 443
915965 1770 1785 25533 25548 GCGAAAGGTTGCTTCC 66 444
915985 1791 1806 25554 25569 AAGTGCTGGACCGCTG 71 445
- 66 047395
916005 1817 1832 25580 25595 TTAACGCATGCTGATG 69 446
916025 1850 1865 25613 25628 GGGCTTCCTGGTGTCA 58 447
916045 1886 1901 25649 25664 GGGCCACGAAACAGTC 9 448
916065 1915 1930 25678 25693 CTCATGCTGGAACAGT 86 449
916085 1959 1974 25722 25737 ATCACAAGGCCCCCAC 82 450
916105 1979 1994 25742 25757 CATGGGCCAGCCTACC 0 451
916125 2054 2069 25817 25832 ACGAACTGCACCCCTT 84 452
916144 2102 2117 25865 25880 AGGTTATCATCTTTGC 90 453
916164 2141 2156 25904 25919 ATCTTGTTACCCCCGC 88 454
916184 2266 2281 26029 26044 CATCTCACTGATTCAC 91 455
916204 2626 2641 26389 26404 TGCCCTGCACACTAGA 47 456
916224 2680 2695 26443 26458 GAGGAGGCGGAAGCTC 0 457
916244 2710 2725 26473 26488 AGCCAGGTTCAAGTTG 71 458
916284 N/A N/A 4227 4242 TCAAATGTACGGAATC 40 459
916304 N/A N/A 4865 4880 GTACTTTAGGCTCCTG 89 460
916324 N/A N/A 5429 5444 ACATATCAGCATTAGA 87 461
916344 N/A N/A 5804 5819 GTCTACTATGGGAGCC 90 462
916364 N/A N/A 6966 6981 GAAGATGCATAGAGGA 0 463
916384 N/A N/A 7550 7565 TCACACTGGGTCACCA 43 464
916544 N/A N/A 12135 12150 GGCAATCAGGGAGGCA 32 465
916564 N/A N/A 12320 12335 TGACTATATAACCACA 92 466
916584 N/A N/A 12951 12966 CCCAATTGCCACTAGG 83 467
916604 N/A N/A 13718 13733 TCTTTACCAAGACCGC 92 468
916624 N/A N/A 14245 14260 GACAAATTCATCAACC 87 469
916644 N/A N/A 14778 14793 CTGTATCCAAAAGGCC 0 470
916664 N/A N/A 15597 15612 ATACATAGCAGAGCCA 44 471
916684 N/A N/A 16352 16367 CACCCTATCGCTCCCA 43 472
916704 N/A N/A 17267 17282 AGTTATGTCTGACTCA 72 473
916724 N/A N/A 18254 18269 AATATACCCCACAGCA 40 474
916744 N/A N/A 19288 19303 GTGCATGTGTGGCTTG 82 475
916763 N/A N/A 20414 20429 TGTAGTAAGCAATGCA 85 476
916783 N/A N/A 20724 20739 CATATATTGCGGATGA 24 477
916803 N/A N/A 21005 21020 GTTATTTTAACAGCTC 95 478
916823 N/A N/A 21561 21576 ATAAGGACTTACACCA 83 479
916843 N/A N/A 22679 22694 CAGCATGCAACCACCC 8 480
916863 N/A N/A 23550 23565 TGGGATGCTAGGACAA 72 481
916883 N/A N/A 24340 24355 GGAAGTAGCGGCATCC 0 482
- 67 047395
Таблица 8
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915346 25 40 2763 2778 CATTCCCAGCGCGACG 0 483
915366 52 67 2790 2805 TACCCTGCCTCAGTGT 0 484
915386 112 127 2850 2865 TCGGGAATCGGCTCGG 26 485
915406 195 210 2933 2948 CGAAGGACAAGCTCCA 69 486
915426 252 267 2990 3005 GCTCGCTCAGGCAGCG 0 487
915446 350 365 N/A N/A CTGCTCCAGCGGGATA 0 488
915466 389 404 5963 5978 CCTGGCCTTCCGCACA 40 489
915486 431 446 6005 6020 GCTTAAGTTGAAGGAT 88 490
915506 455 470 6029 6044 GCAGAGACCCTGTCGG 32 491
915526 493 508 6067 6082 CCGGAGATGAGCTGGT 4 492
915546 514 529 6088 6103 GTAAGAGAGATGCCTA 94 493
915566 562 577 6136 6151 TTGGACCGAAAGTCAG 56 494
915606 702 717 11920 11935 TGGTTGTTTTGGCATC 99 495
915626 757 772 11975 11990 GTGGACTTGACTTTAG 89 496
915646 830 845 12048 12063 TCTCGAGAGAAGGTAG 0 497
915666 882 897 13618 13633 ATCCTCGAAGGCATAT 0 498
915686 956 971 16076 16091 TGAGGATGACTTCAGG 10 499
915706 989 1004 16109 16124 GCTGGGCATGGCGACC 10 500
915726 1064 1079 16184 16199 TAGCAGCTCATCTCCC 67 501
915746 1135 1150 16255 16270 GTAGCGAGCCTGGGCG 0 502
915766 1196 1211 19036 19051 TAGCAAGTTGCAAATC 78 503
- 68 047395
915786 1232 1247 19072 19087 ACAGGGCAGCATTACA 87 504
915806 1302 1317 23707 23722 CGTCGGGCATATCTGG 53 505
915826 1352 1367 23757 23772 CAGCACTCGAGTGAAC 24 506
915846 1408 1423 25171 25186 GAGGCCTGTTGGCTGC 0 507
915866 1508 1523 25271 25286 GAGGATGGACCGCGGG 0 508
915886 1549 1564 25312 25327 GCAGGTACTTTATTGC 0 509
915906 1610 1625 25373 25388 AGTGACTCACAGACTC 35 510
915926 1636 1651 25399 25414 AAGAATCTGCTAGACT 69 511
915946 1689 1704 25452 25467 ACACAGCAATGCGGAG 69 512
915966 1771 1786 25534 25549 GGCGAAAGGTTGCTTC 58 513
915986 1792 1807 25555 25570 TAAGTGCTGGACCGCT 70 514
916006 1818 1833 25581 25596 ATTAACGCATGCTGAT 73 515
916026 1851 1866 25614 25629 TGGGCTTCCTGGTGTC 71 516
916046 1887 1902 25650 25665 AGGGCCACGAAACAGT 61 517
916066 1917 1932 25680 25695 ACCTCATGCTGGAACA 81 518
916086 1960 1975 25723 25738 CATCACAAGGCCCCCA 48 519
916106 1980 1995 25743 25758 ACATGGGCCAGCCTAC 54 520
916126 2055 2070 25818 25833 GACGAACTGCACCCCT 77 521
916145 2105 2120 25868 25883 TCAAGGTTATCATCTT 89 522
916165 2142 2157 25905 25920 CATCTTGTTACCCCCG 89 523
916185 2270 2285 26033 26048 CTAACATCTCACTGAT 66 524
916205 2627 2642 26390 26405 ATGCCCTGCACACTAG 62 525
916225 2681 2696 26444 26459 AGAGGAGGCGGAAGCT 25 526
916245 2711 2726 26474 26489 AAGCCAGGTTCAAGTT 83 527
916285 N/A N/A 4240 4255 ATTAGGACAAGATTCA 75 528
916305 N/A N/A 4866 4881 TGTACTTTAGGCTCCT 93 529
916325 N/A N/A 5430 5445 AACATATCAGCATTAG 85 530
916345 N/A N/A 5839 5854 CAAGGATGCCACCAAC 84 531
916365 N/A N/A 6974 6989 TCATTATGGAAGATGC 0 532
916385 N/A N/A 7602 7617 TTAACAACCCTGTCAG 1 533
916545 N/A N/A 12151 12166 GTAACTGGTAGCTCCT 93 534
916565 N/A N/A 12338 12353 ACCCATACTGCACCCC 79 535
916585 N/A N/A 12957 12972 GCCTATCCCAATTGCC 70 536
916605 N/A N/A 13719 13734 GTCTTTACCAAGACCG 23 537
916625 N/A N/A 14248 14263 AACGACAAATTCATCA 84 538
916645 N/A N/A 14788 14803 TGCAATCCCCCTGTAT 17 539
916665 N/A N/A 15598 15613 AATACATAGCAGAGCC 68 540
916685 N/A N/A 16366 16381 TGTCATGGTTGCCTCA 70 541
916705 N/A N/A 17273 17288 ATAAGGAGTTATGTCT 80 542
916725 N/A N/A 18255 18270 GAATATACCCCACAGC 58 543
916745 N/A N/A 19295 19310 GTTACAGGTGCATGTG 75 544
916764 N/A N/A 20435 20450 AGTCATCTGGAGTCAC 69 545
916784 N/A N/A 20756 20771 TCAGACAACCCACTGA 24 546
916804 N/A N/A 21046 21061 AGGAATCTGAATCCTA 0 547
916824 N/A N/A 21640 21655 GATAATTTCCTAGAGC 29 548
916844 N/A N/A 22699 22714 GAAATAAGTGCTCAGG 73 549
916864 N/A N/A 23582 23597 CTCCAATCTGATGACT 53 550
916884 N/A N/A 24347 24362 GAATTCAGGAAGTAGC 50 551
- 69 047395
Таблица 9
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915347 26 41 2764 2779 GCATTCCCAGCGCGAC 0 552
915367 58 73 2796 2811 GCTCTCTACCCTGCCT 9 553
915387 113 128 2851 2866 ATCGGGAATCGGCTCG 28 554
915407 198 213 2936 2951 CCGCGAAGGACAAGCT 0 555
915427 253 268 2991 3006 TGCTCGCTCAGGCAGC 0 556
915447 351 366 N/A N/A TCTGCTCCAGCGGGAT 1 557
915467 391 406 5965 5980 CTCCTGGCCTTCCGCA 29 558
915487 433 448 6007 6022 TTGCTTAAGTTGAAGG 94 559
915507 456 471 6030 6045 TGCAGAGACCCTGTCG 31 560
915527 494 509 6068 6083 GCCGGAGATGAGCTGG 0 561
915547 515 530 6089 6104 GGTAAGAGAGATGCCT 0 562
915567 563 578 6137 6152 TTTGGACCGAAAGTCA 0 563
915607 703 718 11921 11936 ATGGTTGTTTTGGCAT 35 564
915627 758 773 11976 11991 CGTGGACTTGACTTTA 85 565
915647 831 846 12049 12064 CTCTCGAGAGAAGGTA 7 566
915667 883 898 13619 13634 TATCCTCGAAGGCATA 0 567
915687 959 974 16079 16094 TTCTGAGGATGACTTC 39 568
915707 996 1011 16116 16131 TTGCCCAGCTGGGCAT 0 569
915727 1065 1080 16185 16200 CTAGCAGCTCATCTCC 58 570
915747 1136 1151 16256 16271 TGTAGCGAGCCTGGGC 16 571
915767 1197 1212 19037 19052 GTAGCAAGTTGCAAAT 80 572
915787 1233 1248 19073 19088 TACAGGGCAGCATTAC 71 573
915807 1316 1331 23721 23736 CAACCACAGGACATCG 0 574
915827 1353 1368 23758 23773 TCAGCACTCGAGTGAA 0 575
915847 1409 1424 25172 25187 GGAGGCCTGTTGGCTG 0 576
915867 1509 1524 25272 25287 TGAGGATGGACCGCGG 14 577
915887 1553 1568 25316 25331 ACCAGCAGGTACTTTA 29 578
915907 1611 1626 25374 25389 AAGTGACTCACAGACT 29 579
915927 1637 1652 25400 25415 AAAGAATCTGCTAGAC 60 580
915947 1690 1705 25453 25468 TACACAGCAATGCGGA 69 581
915967 1772 1787 25535 25550 AGGCGAAAGGTTGCTT 0 582
915987 1793 1808 25556 25571 TTAAGTGCTGGACCGC 82 583
916007 1819 1834 25582 25597 AATTAACGCATGCTGA 61 584
916027 1864 1879 25627 25642 GGACCCTCTGCACTGG 43 585
916047 1888 1903 25651 25666 TAGGGCCACGAAACAG 80 586
916067 1918 1933 25681 25696 AACCTCATGCTGGAAC 72 587
916087 1961 1976 25724 25739 CCATCACAAGGCCCCC 63 588
916107 1981 1996 25744 25759 CACATGGGCCAGCCTA 74 589
916127 2056 2071 25819 25834 GGACGAACTGCACCCC 5 590
916146 2106 2121 25869 25884 GTCAAGGTTATCATCT 88 591
916166 2143 2158 25906 25921 TCATCTTGTTACCCCC 90 592
916186 2272 2287 26035 26050 TACTAACATCTCACTG 1 593
916206 2628 2643 26391 26406 AATGCCCTGCACACTA 56 594
- 70 047395
916226 2682 2697 26445 26460 GAGAGGAGGCGGAAGC 10 595
916246 2712 2727 26475 26490 TAAGCCAGGTTCAAGT 81 596
916286 N/A N/A 4244 4259 TTTCATTAGGACAAGA 61 597
916306 N/A N/A 4867 4882 GTGTACTTTAGGCTCC 97 598
916326 N/A N/A 5431 5446 GAACATATCAGCATTA 52 599
916346 N/A N/A 5872 5887 GTAATACTTTTGGCAA 75 600
916366 N/A N/A 7069 7084 GGTATTACAAATTATC 10 601
916386 N/A N/A 7603 7618 CTTAACAACCCTGTCA 0 602
916546 N/A N/A 12152 12167 AGTAACTGGTAGCTCC 88 603
916566 N/A N/A 12343 12358 CTAATACCCATACTGC 84 604
916586 N/A N/A 12966 12981 AACTTTGCAGCCTATC 85 605
916606 N/A N/A 13739 13754 AGAACTAAGGCAAATC 85 606
916626 N/A N/A 14257 14272 GTCTTGGCCAACGACA 0 607
916646 N/A N/A 14793 14808 CAGGATGCAATCCCCC 45 608
916666 N/A N/A 15601 15616 GCCAATACATAGCAGA 75 609
916686 N/A N/A 16630 16645 GTCCATGAAATCCAGG 0 610
916706 N/A N/A 17293 17308 TCTCTTAGGGCACCTC 87 611
916726 N/A N/A 18256 18271 TGAATATACCCCACAG 24 612
916746 N/A N/A 19337 19352 AGCTCTAGGAGTCCCC 63 613
916765 N/A N/A 20513 20528 CCAGATTGAGTCTCCT 91 614
916785 N/A N/A 20775 20790 AATCAAGTGCCCTCCA 73 615
916805 N/A N/A 21211 21226 TGTAGCTGTGTGGTGG 85 616
916825 N/A N/A 21760 21775 TACCATGATCAGGTCA 0 617
916845 N/A N/A 22713 22728 GTAAAGATGTGAGTGA 85 618
916865 N/A N/A 23606 23621 GTTTACAAAAGCTGCC 17 619
916885 N/A N/A 24375 24390 TGAACTCCGGCTCAGT 0 620
Таблица 10
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID % SEQ
соеди- NO: 1, NO: 1, NO: 2, NO: 2, Последовательность (5'-3') подавле- ID
нения старто- стоп- старто- стоп- ния NO
- 71 047395
вый сайт сайт вый сайт сайт PNPLA3
915348 28 43 2766 2781 GGGCATTCCCAGCGCG 0 621
915368 59 74 2797 2812 CGCTCTCTACCCTGCC 0 622
915388 114 129 2852 2867 GATCGGGAATCGGCTC 32 623
915408 199 214 2937 2952 CCCGCGAAGGACAAGC 6 624
915428 275 290 3013 3028 GTCGCGGAGGAGGTGC 0 625
915448 352 367 N/A N/A GTCTGCTCCAGCGGGA 4 626
915468 392 407 5966 5981 ACTCCTGGCCTTCCGC 87 627
915488 434 449 6008 6023 CTTGCTTAAGTTGAAG 0 628
915508 457 472 6031 6046 TTGCAGAGACCCTGTC 63 629
915528 495 510 6069 6084 TGCCGGAGATGAGCTG 0 630
915548 516 531 6090 6105 TGGTAAGAGAGATGCC 18 631
915568 564 579 6138 6153 CTTTGGACCGAAAGTC 10 632
915608 704 719 11922 11937 GATGGTTGTTTTGGCA 98 633
915628 772 787 11990 12005 ACATGAAGAAAGTTCG 41 634
915648 832 847 12050 12065 GCTCTCGAGAGAAGGT 55 635
915668 884 899 13620 13635 ATATCCTCGAAGGCAT 33 636
915688 962 977 16082 16097 CCCTTCTGAGGATGAC 11 637
915708 998 1013 16118 16133 GTTTGCCCAGCTGGGC 0 638
915728 1067 1082 16187 16202 GTCTAGCAGCTCATCT 68 639
915748 1137 1152 16257 16272 CTGTAGCGAGCCTGGG 0 640
915768 1198 1213 19038 19053 GGTAGCAAGTTGCAAA 90 641
915788 1234 1249 19074 19089 GTACAGGGCAGCATTA 69 642
915808 1317 1332 23722 23737 GCAACCACAGGACATC 51 643
915828 1354 1369 23759 23774 ATCAGCACTCGAGTGA 0 644
915848 1410 1425 25173 25188 GGGAGGCCTGTTGGCT 17 645
915868 1510 1525 25273 25288 CTGAGGATGGACCGCG 53 646
915888 1554 1569 25317 25332 CACCAGCAGGTACTTT 0 647
915908 1612 1627 25375 25390 CAAGTGACTCACAGAC 91 648
915928 1639 1654 25402 25417 TGAAAGAATCTGCTAG 59 649
915948 1691 1706 25454 25469 CTACACAGCAATGCGG 20 650
915968 1773 1788 25536 25551 CAGGCGAAAGGTTGCT 60 651
915988 1794 1809 25557 25572 GTTAAGTGCTGGACCG 86 652
- 72 047395
916008 1820 1835 25583 25598 GAATTAACGCATGCTG 88 653
916028 1865 1880 25628 25643 GGGACCCTCTGCACTG 0 654
916048 1889 1904 25652 25667 ATAGGGCCACGAAACA 75 655
916068 1919 1934 25682 25697 GAACCTCATGCTGGAA 72 656
916088 1962 1977 25725 25740 CCCATCACAAGGCCCC 37 657
916108 1984 1999 25747 25762 TCACACATGGGCCAGC 84 658
916128 2079 2094 25842 25857 CTGACAGGCAGTGTCG 10 659
916147 2107 2122 25870 25885 AGTCAAGGTTATCATC 81 660
916167 2144 2159 25907 25922 ATCATCTTGTTACCCC 88 661
916187 2276 2291 26039 26054 ATTCTACTAACATCTC 90 662
916207 2629 2644 26392 26407 GAATGCCCTGCACACT 72 663
916227 2691 2706 26454 26469 GCTCCAGTGGAGAGGA 14 664
916247 2713 2728 26476 26491 ATAAGCCAGGTTCAAG 88 665
916287 N/A N/A 4308 4323 GTGAGAAACAAACCCT 92 666
916307 N/A N/A 4882 4897 TCTATACCAGAGTGAG 84 667
916327 N/A N/A 5514 5529 AGGAATGAGTCTCCCA 17 668
916347 N/A N/A 5873 5888 GGTAATACTTTTGGCA 70 669
916367 N/A N/A 7106 7121 CGCTTATGAAAGCATC 0 670
916387 N/A N/A 7605 7620 CCCTTAACAACCCTGT 28 671
916547 N/A N/A 12167 12182 TTTGATTGTGCAGACA 98 672
916567 N/A N/A 12345 12360 TCCTAATACCCATACT 74 673
916587 N/A N/A 12969 12984 ACAAACTTTGCAGCCT 95 674
916607 N/A N/A 13742 13757 GTTAGAACTAAGGCAA 94 675
916627 N/A N/A 14301 14316 GAGCAGATAAATACAC 91 676
916647 N/A N/A 14892 14907 TGGTATCTCGCTTCCT 0 677
916667 N/A N/A 15613 15628 TAAAGCCACGCAGCCA 46 678
916687 N/A N/A 16656 16671 CCAGATGCAGGACCCC 0 679
916707 N/A N/A 17326 17341 AAACTAATGCACCTGG 43 680
916727 N/A N/A 18257 18272 CTGAATATACCCCACA 75 681
916747 N/A N/A 19360 19375 AGCTGCTATGTGAGGC 12 682
916766 N/A N/A 20520 20535 TCAGTAACCAGATTGA 25 683
916786 N/A N/A 20778 20793 TTTAATCAAGTGCCCT 81 684
916806 N/A N/A 21216 21231 CAGGATGTAGCTGTGT 84 685
916826 N/A N/A 21887 21902 TAAGATCCCATCTTAC 13 686
916846 N/A N/A 22739 22754 AAAGTAAACACCCACC 42 687
916866 N/A N/A 23625 23640 GCTTACAACACTACCC 57 688
916886 N/A N/A 24393 24408 GTAATGGGAGCCAGGC 38 689
Таблица 11
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915349 29 44 2767 2782 AGGGCATTCCCAGCGC 0 690
915369 60 75 2798 2813 GCGCTCTCTACCCTGC 23 691
915389 115 130 2853 2868 GGATCGGGAATCGGCT 54 692
915409 200 215 2938 2953 GCCCGCGAAGGACAAG 32 693
915429 276 291 3014 3029 CGTCGCGGAGGAGGTG 0 694
915449 364 379 5938 5953 AGGACCTGCAGAGTCT 21 695
915469 394 409 5968 5983 CGACTCCTGGCCTTCC 59 696
915489 435 450 6009 6024 ACTTGCTTAAGTTGAA 86 697
915509 466 481 6040 6055 GGGAGGCATTTGCAGA 57 698
915529 496 511 6070 6085 TTGCCGGAGATGAGCT 40 699
915549 518 533 6092 6107 TCTGGTAAGAGAGATG 61 700
915569 565 580 6139 6154 TCTTTGGACCGAAAGT 9 701
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 99 702
915629 776 791 11994 12009 GTCCACATGAAGAAAG 32 703
915649 833 848 12051 12066 AGCTCTCGAGAGAAGG 36 704
915669 885 900 13621 13636 AATATCCTCGAAGGCA 55 705
915689 969 984 16089 16104 GATCCATCCCTTCTGA 20 706
915709 999 1014 16119 16134 TGTTTGCCCAGCTGGG 5 707
915729 1077 1092 16197 16212 GACGCAGGTGGTCTAG 0 708
915749 1138 1153 N/A N/A GCTGTAGCGAGCCTGG 71 709
915769 1200 1215 19040 19055 TGGGTAGCAAGTTGCA 81 710
- 73 047395
915789 1235 1250 19075 19090 GGTACAGGGCAGCATT 88 711
915809 1318 1333 23723 23738 TGCAACCACAGGACAT 40 712
915829 1355 1370 23760 23775 CATCAGCACTCGAGTG 0 713
915849 1424 1439 25187 25202 CTCAGGTGTGCATGGG 61 714
915869 1511 1526 25274 25289 CCTGAGGATGGACCGC 70 715
915889 1556 1571 25319 25334 AGCACCAGCAGGTACT 35 716
915909 1613 1628 25376 25391 TCAAGTGACTCACAGA 84 717
915929 1645 1660 25408 25423 CACCTCTGAAAGAATC 89 718
915949 1692 1707 25455 25470 ACTACACAGCAATGCG 33 719
915969 1774 1789 25537 25552 ACAGGCGAAAGGTTGC 88 720
915989 1795 1810 25558 25573 AGTTAAGTGCTGGACC 84 721
916009 1823 1838 25586 25601 GCTGAATTAACGCATG 67 722
916029 1866 1881 25629 25644 AGGGACCCTCTGCACT 15 723
916049 1890 1905 25653 25668 AATAGGGCCACGAAAC 52 724
916069 1920 1935 25683 25698 AGAACCTCATGCTGGA 85 725
916089 1963 1978 25726 25741 CCCCATCACAAGGCCC 20 726
916109 1985 2000 25748 25763 ATCACACATGGGCCAG 72 727
916129 2080 2095 25843 25858 CCTGACAGGCAGTGTC 15 728
916148 2108 2123 25871 25886 TAGTCAAGGTTATCAT 87 729
916168 2146 2161 25909 25924 TTATCATCTTGTTACC 82 730
916188 2279 2294 26042 26057 CTTATTCTACTAACAT 87 731
916208 2630 2645 26393 26408 TGAATGCCCTGCACAC 68 732
916228 2692 2707 26455 26470 TGCTCCAGTGGAGAGG 80 733
916248 2726 2741 26489 26504 GTCCCTGCAGAAAATA 0 734
916288 N/A N/A 4337 4352 AGCATACCACACCCCA 75 735
916308 N/A N/A 5086 5101 GGACATGCTCAGCAGC 68 736
916328 N/A N/A 5533 5548 TGCTGTAGGCCTCAGC 0 737
916348 N/A N/A 5874 5889 TGGTAATACTTTTGGC 86 738
916368 N/A N/A 7132 7147 GTAAATGGAGTCCTTC 80 739
916388 N/A N/A 7612 7627 CATAATCCCCTTAACA 32 740
916548 N/A N/A 12195 12210 TTAACCATCAAGGACA 77 741
916568 N/A N/A 12665 12680 TCTTAGTGGCTGGGTA 85 742
916588 N/A N/A 12973 12988 CCTAACAAACTTTGCA 32 743
916608 N/A N/A 13749 13764 ACTAAGTGTTAGAACT 76 744
916628 N/A N/A 14338 14353 CTGCAGTATCCCTAGC 0 745
916648 N/A N/A 15012 15027 TCCCATCGGTCATTTC 45 746
916668 N/A N/A 15682 15697 GAAACCACTATCATCA 62 747
916688 N/A N/A 16671 16686 GTAATAGGCCAAGTCC 0 748
916708 N/A N/A 17327 17342 CAAACTAATGCACCTG 66 749
916728 N/A N/A 18332 18347 CCAATATCATAGCTGA 85 750
916748 N/A N/A 19376 19391 CACAAGAGACTGGACC 64 751
916767 N/A N/A 20551 20566 TACTATGGGATGAGTA 0 752
916787 N/A N/A 20779 20794 TTTTAATCAAGTGCCC 38 753
916807 N/A N/A 21218 21233 GGCAGGATGTAGCTGT 63 754
916827 N/A N/A 21947 21962 AGTCAAACATCTTCCT 50 755
916847 N/A N/A 22759 22774 CAGACTAACTTACTAA 77 756
916867 N/A N/A 23626 23641 AGCTTACAACACTACC 13 757
916887 N/A N/A 24505 24520 ATGCTACGGGCTCTCA 0 758
- 74 047395
Таблица 12
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915350 30 45 2768 2783 CAGGGCATTCCCAGCG 0 759
915370 82 97 2820 2835 CAGCTCCGCCCGGCGC 14 760
915390 130 145 2868 2883 TTAGGATCTGGGTCGG 88 761
915410 201 216 2939 2954 AGCCCGCGAAGGACAA 0 762
915430 295 310 3033 3048 GCGCCGAACAACATGC 0 763
915450 366 381 5940 5955 AGAGGACCTGCAGAGT 83 764
915470 395 410 5969 5984 CCGACTCCTGGCCTTC 68 765
915490 436 451 6010 6025 AACTTGCTTAAGTTGA 41 766
915510 467 482 6041 6056 CGGGAGGCATTTGCAG 44 767
915530 497 512 6071 6086 TTTGCCGGAGATGAGC 92 768
915550 519 534 6093 6108 CTCTGGTAAGAGAGAT 20 769
915570 566 581 6140 6155 GTCTTTGGACCGAAAG 19 770
915590 627 642 7857 7872 GAGGGATAAGGCCACT 83 771
915610 706 721 11924 11939 GTGATGGTTGTTTTGG 97 772
915630 782 797 12000 12015 GGTGATGTCCACATGA 87 773
915650 834 849 12052 12067 AAGCTCTCGAGAGAAG 44 774
915670 887 902 13623 13638 CAAATATCCTCGAAGG 0 775
915690 970 985 16090 16105 GGATCCATCCCTTCTG 0 776
915710 1003 1018 16123 16138 CTCATGTTTGCCCAGC 68 777
915730 1078 1093 16198 16213 AGACGCAGGTGGTCTA 0 778
915750 1139 1154 N/A N/A TGCTGTAGCGAGCCTG 56 779
915770 1201 1216 19041 19056 ATGGGTAGCAAGTTGC 79 780
915790 1247 1262 19087 19102 TTCCACAGGCAGGGTA 48 781
915810 1320 1335 23725 23740 ACTGCAACCACAGGAC 22 782
915830 1356 1371 23761 23776 ACATCAGCACTCGAGT 0 783
915850 1427 1442 25190 25205 CTGCTCAGGTGTGCAT 10 784
915870 1512 1527 25275 25290 ACCTGAGGATGGACCG 69 785
915890 1557 1572 25320 25335 CAGCACCAGCAGGTAC 62 786
915910 1617 1632 25380 25395 CTCCTCAAGTGACTCA 83 787
915930 1648 1663 25411 25426 TAGCACCTCTGAAAGA 55 788
915950 1693 1708 25456 25471 CACTACACAGCAATGC 74 789
915970 1775 1790 25538 25553 CACAGGCGAAAGGTTG 72 790
915990 1797 1812 25560 25575 AGAGTTAAGTGCTGGA 92 791
916010 1824 1839 25587 25602 AGCTGAATTAACGCAT 0 792
916030 1867 1882 25630 25645 AAGGGACCCTCTGCAC 38 793
916050 1891 1906 25654 25669 TAATAGGGCCACGAAA 53 794
916070 1921 1936 25684 25699 AAGAACCTCATGCTGG 24 795
916090 1964 1979 25727 25742 CCCCCATCACAAGGCC 24 796
916110 1986 2001 25749 25764 GATCACACATGGGCCA 0 797
916130 2081 2096 25844 25859 ACCTGACAGGCAGTGT 54 798
916149 2109 2124 25872 25887 GTAGTCAAGGTTATCA 87 799
916169 2154 2169 25917 25932 TAAGTAGATTATCATC 79 800
916189 2282 2297 26045 26060 AGGCTTATTCTACTAA 85 801
- 75 047395
916209 2631 2646 26394 26409 GTGAATGCCCTGCACA 59 802
916229 2693 2708 26456 26471 GTGCTCCAGTGGAGAG 54 803
916249 2727 2742 26490 26505 GGTCCCTGCAGAAAAT 38 804
916289 N/A N/A 4338 4353 AAGCATACCACACCCC 79 805
916309 N/A N/A 5278 5293 AATCTTGGGATGCACA 95 806
916329 N/A N/A 5569 5584 CATCATGGCTTCCAGT 79 807
916349 N/A N/A 5879 5894 TGGGATGGTAATACTT 0 808
916369 N/A N/A 7134 7149 AAGTAAATGGAGTCCT 5 809
916389 N/A N/A 7615 7630 TTGCATAATCCCCTTA 33 810
916409 N/A N/A 8165 8180 TTAACTAGATCACTGA 58 811
916429 N/A N/A 9109 9124 TCCTAATGCGAGTCCC 86 812
916449 N/A N/A 9522 9537 TGCTGCTGGGTGCACT 45 813
916469 N/A N/A 10199 10214 GGTGATGACACAGCAT 94 814
916489 N/A N/A 10382 10397 GCCATGTACAACTTTT 52 815
916509 N/A N/A 11152 11167 TACAATTTGGACAGAG 71 816
916529 N/A N/A 11546 11561 ACCTATAGGAGTGCCC 35 817
916549 N/A N/A 12204 12219 TTATTTCCGTTAACCA 97 818
916569 N/A N/A 12672 12687 AGAATCATCTTAGTGG 94 819
916589 N/A N/A 12989 13004 CGGAATAAGCCTCCAC 0 820
916609 N/A N/A 13752 13767 GGCACTAAGTGTTAGA 57 821
916629 N/A N/A 14375 14390 TCTCACAAGGCTGGCA 84 822
916649 N/A N/A 15137 15152 GCCATACCGGCTCCCT 30 823
916669 N/A N/A 15691 15706 GGCCTTACAGAAACCA 15 824
916689 N/A N/A 16672 16687 AGTAATAGGCCAAGTC 16 825
916709 N/A N/A 17328 17343 ACAAACTAATGCACCT 42 826
916729 N/A N/A 18333 18348 TCCAATATCATAGCTG 32 827
916749 N/A N/A 19445 19460 CTACTAGGCATCTCTA 32 828
916768 N/A N/A 20553 20568 CTTACTATGGGATGAG 83 829
916788 N/A N/A 20808 20823 TAATATTCAGACCAGG 94 830
916808 N/A N/A 21252 21267 CCATGCATGGCACAGT 4 831
916828 N/A N/A 21968 21983 AGACAGGAATCCAACC 0 832
916848 N/A N/A 22767 22782 GGACATGACAGACTAA 96 833
916868 N/A N/A 23637 23652 GCAGACACAACAGCTT 40 834
916888 N/A N/A 24507 24522 CCATGCTACGGGCTCT 0 835
- 76 047395
Таблица 13
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, _________нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2______
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915351 33 48 2771 2786 GGCCAGGGCATTCCCA 0 836
915371 83 98 2821 2836 GCAGCTCCGCCCGGCG 2 837
915391 132 147 2870 2885 GGTTAGGATCTGGGTC 54 838
915411 222 237 2960 2975 GGTAGAAGCCCAGGAA 57 839
915431 321 336 3059 3074 CGACGCAGTGCAACGC 49 840
915451 368 383 5942 5957 TGAGAGGACCTGCAGA 0 841
915471 400 415 5974 5989 ATGTTCCGACTCCTGG 82 842
915491 437 452 6011 6026 GAACTTGCTTAAGTTG 23 843
915511 468 483 6042 6057 CCGGGAGGCATTTGCA 0 844
915531 498 513 6072 6087 TTTTGCCGGAGATGAG 84 845
915551 520 535 6094 6109 ACTCTGGTAAGAGAGA 5 846
915571 567 582 6141 6156 cgtctttggaccgaaa 64 847
915611 708 723 11926 11941 CGGTGATGGTTGTTTT 98 848
915631 783 798 12001 12016 TGGTGATGTCCACATG 0 849
915651 835 850 12053 12068 AAAGCTCTCGAGAGAA 35 850
915671 890 905 13626 13641 ATCCAAATATCCTCGA 42 851
915691 971 986 16091 16106 AGGATCCATCCCTTCT 0 852
915711 1005 1020 16125 16140 GACTCATGTTTGCCCA 73 853
915731 1079 1094 16199 16214 GAGACGCAGGTGGTCT 0 854
915751 1140 1155 N/A N/A GTGCTGTAGCGAGCCT 0 855
915771 1202 1217 19042 19057 AATGGGTAGCAAGTTG 80 856
915791 1248 1263 19088 19103 ATTCCACAGGCAGGGT 37 857
915811 1327 1342 23732 23747 GTCACCCACTGCAACC 52 858
915831 1357 1372 23762 23777 CACATCAGCACTCGAG 29 859
915851 1429 1444 25192 25207 TCCTGCTCAGGTGTGC 2 860
915871 1513 1528 25276 25291 GACCTGAGGATGGACC 20 861
915891 1558 1573 25321 25336 TCAGCACCAGCAGGTA 68 862
915911 1620 1635 25383 25398 CGCCTCCTCAAGTGAC 48 863
915931 1652 1667 25415 25430 ACTTTAGCACCTCTGA 93 864
915951 1695 1710 25458 25473 GTCACTACACAGCAAT 84 865
915971 1776 1791 25539 25554 GCACAGGCGAAAGGTT 74 866
915991 1798 1813 25561 25576 TAGAGTTAAGTGCTGG 84 867
916011 1825 1840 25588 25603 CAGCTGAATTAACGCA 0 868
916031 1868 1883 25631 25646 TAAGGGACCCTCTGCA 54 869
916051 1892 1907 25655 25670 TTAATAGGGCCACGAA 75 870
916071 1922 1937 25685 25700 TAAGAACCTCATGCTG 56 871
916091 1965 1980 25728 25743 CCCCCCATCACAAGGC 9 872
916111 1987 2002 25750 25765 AGATCACACATGGGCC 26 873
916131 2084 2099 25847 25862 ACCACCTGACAGGCAG 80 874
916150 2110 2125 25873 25888 AGTAGTCAAGGTTATC 92 875
916170 2174 2189 25937 25952 TGAAAAAGGTGTTCTA 49 876
916190 2283 2298 26046 26061 AAGGCTTATTCTACTA 79 877
916210 2633 2648 26396 26411 AGGTGAATGCCCTGCA 71 878
916230 2694 2709 26457 26472 TGTGCTCCAGTGGAGA 75 879
916250 2728 2743 26491 26506 TGGTCCCTGCAGAAAA 79 880
916290 N/A N/A 4397 4412 TGCCTACTGGCTCACA 14 881
916310 N/A N/A 5279 5294 AAATCTTGGGATGCAC 94 882
916330 N/A N/A 5572 5587 TGACATCATGGCTTCC 93 883
916350 N/A N/A 6158 6173 GCTTACATCCACGACT 0 884
916370 N/A N/A 7135 7150 CAAGTAAATGGAGTCC 77 885
916390 N/A N/A 7620 7635 ATCTATTGCATAATCC 86 886
916550 N/A N/A 12205 12220 TTTATTTCCGTTAACC 96 887
916570 N/A N/A 12694 12709 TTCTTGACCGTGTTTC 98 888
916590 N/A N/A 12990 13005 CCGGAATAAGCCTCCA 47 889
916610 N/A N/A 13822 13837 TGTACAATGGGACGGA 69 890
916630 N/A N/A 14418 14433 ATCGACACAGCATCAC 92 891
916650 N/A N/A 15138 15153 TGCCATACCGGCTCCC 0 892
- 77 047395
916670 N/A N/A 15758 15773 GGTTTATAACAACTGA 89 893
916690 N/A N/A 16722 16737 GCCTTGAGGTGGGTGG 0 894
916710 N/A N/A 17512 17527 AGTCATGGGATGTGCA 58 895
916730 N/A N/A 18395 18410 ATGTTTGGAAGTCGCC 92 896
916750 N/A N/A 19473 19488 AAGGATCCTGCTTCTA 9 897
916769 N/A N/A 20554 20569 GCTTACTATGGGATGA 62 898
916789 N/A N/A 20809 20824 GTAATATTCAGACCAG 96 899
916809 N/A N/A 21254 21269 ATCCATGCATGGCACA 72 900
916829 N/A N/A 21979 21994 GTCAGACACGGAGACA 0 901
916849 N/A N/A 23110 23125 GGCTTTTGAAGGAGAG 84 902
916869 N/A N/A 23787 23802 TATTTACCTGGAGGCG 0 903
916889 N/A N/A 24612 24627 CAAATCGGATCTTTGC 44 904
Таблица 14
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3’) % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915352 34 49 2772 2787 CGGCCAGGGCATTCCC 0 905
915372 86 101 2824 2839 GCAGCAGCTCCGCCCG 48 906
915392 135 150 2873 2888 GCGGGTTAGGATCTGG 25 907
915412 225 240 2963 2978 CGTGGTAGAAGCCCAG 2 908
915432 322 337 3060 3075 CCGACGCAGTGCAACG 31 909
915452 371 386 5945 5960 ATCTGAGAGGACCTGC 72 910
915472 401 416 5975 5990 AATGTTCCGACTCCTG 77 911
915492 438 453 6012 6027 GGAACTTGCTTAAGTT 55 912
915512 469 484 6043 6058 GCCGGGAGGCATTTGC 3 913
915532 499 514 6073 6088 ATTTTGCCGGAGATGA 86 914
915552 521 536 6095 6110 CACTCTGGTAAGAGAG 8 915
915612 709 724 11927 11942 ACGGTGATGGTTGTTT 87 916
915632 787 802 12005 12020 AGCTTGGTGATGTCCA 38 917
- 78 047395
915652 836 851 12054 12069 AAAAGCTCTCGAGAGA 0 918
915672 891 906 13627 13642 CATCCAAATATCCTCG 82 919
915692 972 987 16092 16107 CAGGATCCATCCCTTC 0 920
915712 1006 1021 16126 16141 AGACTCATGTTTGCCC 77 921
915732 1081 1096 16201 16216 CTGAGACGCAGGTGGT 87 922
915752 1141 1156 N/A N/A AGTGCTGTAGCGAGCC 1 923
915772 1203 1218 19043 19058 TAATGGGTAGCAAGTT 77 924
915792 1257 1272 19097 19112 CAATGGCAGATTCCAC 56 925
915812 1328 1343 23733 23748 GGTCACCCACTGCAAC 58 926
915832 1358 1373 23763 23778 ACACATCAGCACTCGA 66 927
915852 1430 1445 25193 25208 GTCCTGCTCAGGTGTG 52 928
915872 1518 1533 25281 25296 GGCTGGACCTGAGGAT 0 929
915892 1570 1585 25333 25348 GTGGAGAGCCCCTCAG 47 930
915912 1621 1636 25384 25399 TCGCCTCCTCAAGTGA 8 931
915932 1654 1669 25417 25432 AAACTTTAGCACCTCT 90 932
915952 1696 1711 25459 25474 GGTCACTACACAGCAA 82 933
915972 1777 1792 25540 25555 TGCACAGGCGAAAGGT 64 934
915992 1799 1814 25562 25577 TTAGAGTTAAGTGCTG 91 935
916012 1826 1841 25589 25604 CCAGCTGAATTAACGC 32 936
916032 1869 1884 25632 25647 GTAAGGGACCCTCTGC 73 937
916052 1894 1909 25657 25672 CATTAATAGGGCCACG 81 938
916072 1923 1938 25686 25701 CTAAGAACCTCATGCT 70 939
916092 1966 1981 25729 25744 ACCCCCCATCACAAGG 30 940
916112 1988 2003 25751 25766 AAGATCACACATGGGC 86 941
916132 2085 2100 25848 25863 GACCACCTGACAGGCA 61 942
916151 2111 2126 25874 25889 TAGTAGTCAAGGTTAT 88 943
916171 2176 2191 25939 25954 GGTGAAAAAGGTGTTC 84 944
916191 2284 2299 26047 26062 TAAGGCTTATTCTACT 76 945
916211 2634 2649 26397 26412 GAGGTGAATGCCCTGC 0 946
916231 2695 2710 26458 26473 GTGTGCTCCAGTGGAG 87 947
916251 2729 2744 26492 26507 CTGGTCCCTGCAGAAA 67 948
916291 N/A N/A 4419 4434 CAATGCTACTTGCCCC 68 949
916311 N/A N/A 5280 5295 TAAATCTTGGGATGCA 94 950
916331 N/A N/A 5576 5591 ACAATGACATCATGGC 97 951
916351 N/A N/A 6165 6180 GCAAACTGCTTACATC 0 952
916371 N/A N/A 7172 7187 GTTAGACGCGCCAGGC 7 953
916391 N/A N/A 7624 7639 TCTCATCTATTGCATA 0 954
916551 N/A N/A 12206 12221 TTTTATTTCCGTTAAC 73 955
916571 N/A N/A 12714 12729 TAAACTACCGAACGCA 96 956
916591 N/A N/A 12991 13006 CCCGGAATAAGCCTCC 47 957
916611 N/A N/A 13823 13838 CTGTACAATGGGACGG 23 958
916631 N/A N/A 14422 14437 TCCCATCGACACAGCA 95 959
916651 N/A N/A 15206 15221 GGAATATTGCCAGGTA 95 960
916671 N/A N/A 15759 15774 TGGTTTATAACAACTG 29 961
916691 N/A N/A 16746 16761 ATTAGGAGAGGTCTCA 55 962
916711 N/A N/A 17602 17617 CTTGATAGTGAATGTG 90 963
916731 N/A N/A 18859 18874 GGCACTCACAAAAGCG 10 964
916751 N/A N/A 20182 20197 CCCTATGTTCTACTTT 54 965
916770 N/A N/A 20572 20587 CAACATCTCTAGCTGG 82 966
916790 N/A N/A 20810 20825 GGTAATATTCAGACCA 0 967
916810 N/A N/A 21265 21280 TGAAGCTACAGATCCA 74 968
916830 N/A N/A 22042 22057 GGAAATCTGTCAGAGC 18 969
916850 N/A N/A 23142 23157 GAATCTAGGAAGGCGA 77 970
916870 N/A N/A 23789 23804 AGTATTTACCTGGAGG 0 971
916890 N/A N/A 24738 24753 AGCCTTAGGAAGCCTC 16 972
- 79 047395
Таблица 15
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915353 35 50 2773 2788 TCGGCCAGGGCATTCC 0 973
915373 87 102 2825 2840 CGCAGCAGCTCCGCCC 0 974
915393 136 151 2874 2889 CGCGGGTTAGGATCTG 0 975
915413 239 254 2977 2992 GCGGGTCGCCCCGACG 0 976
915433 325 340 3063 3078 ACGCCGACGCAGTGCA 0 977
915453 372 387 5946 5961 GATCTGAGAGGACCTG 24 978
915473 402 417 5976 5991 CAATGTTCCGACTCCT 73 979
915493 441 456 6015 6030 GGAGGAACTTGCTTAA 87 980
915513 470 485 6044 6059 GGCCGGGAGGCATTTG 0 981
915533 500 515 6074 6089 TATTTTGCCGGAGATG 75 982
915553 522 537 6096 6111 ACACTCTGGTAAGAGA 0 983
915613 710 725 11928 11943 CACGGTGATGGTTGTT 64 984
915633 788 803 12006 12021 GAGCTTGGTGATGTCC 74 985
915653 837 852 12055 12070 CAAAAGCTCTCGAGAG 0 986
915673 892 907 13628 13643 GCATCCAAATATCCTC 81 987
915693 973 988 16093 16108 TCAGGATCCATCCCTT 10 988
915713 1007 1022 16127 16142 CAGACTCATGTTTGCC 0 989
915733 1082 1097 16202 16217 GCTGAGACGCAGGTGG 64 990
915753 1142 1157 N/A N/A CAGTGCTGTAGCGAGC 0 991
915773 1204 1219 19044 19059 CTAATGGGTAGCAAGT 72 992
915793 1258 1273 19098 19113 GCAATGGCAGATTCCA 57 993
915813 1329 1344 23734 23749 AGGTCACCCACTGCAA 56 994
915833 1359 1374 23764 23779 GACACATCAGCACTCG 43 995
915853 1431 1446 25194 25209 AGTCCTGCTCAGGTGT 66 996
915873 1525 1540 25288 25303 AAGTTCAGGCTGGACC 54 997
915893 1571 1586 25334 25349 GGTGGAGAGCCCCTCA 0 998
915913 1622 1637 25385 25400 CTCGCCTCCTCAAGTG 52 999
915933 1660 1675 25423 25438 GATGGGAAACTTTAGC 85 1000
915953 1697 1712 25460 25475 GGGTCACTACACAGCA 78 1001
915973 1778 1793 25541 25556 CTGCACAGGCGAAAGG 35 1002
915993 1800 1815 25563 25578 ATTAGAGTTAAGTGCT 63 1003
916013 1827 1842 25590 25605 ACCAGCTGAATTAACG 66 1004
916033 1873 1888 25636 25651 GTCAGTAAGGGACCCT 52 1005
916053 1897 1912 25660 25675 GACCATTAATAGGGCC 51 1006
916073 1924 1939 25687 25702 TCTAAGAACCTCATGC 55 1007
916093 1967 1982 25730 25745 TACCCCCCATCACAAG 15 1008
- 80 047395
916113 1990 2005 25753 25768 ACAAGATCACACATGG 72 1009
916133 2086 2101 25849 25864 AGACCACCTGACAGGC 79 1010
916152 2112 2127 25875 25890 TTAGTAGTCAAGGTTA 84 1011
916172 2177 2192 25940 25955 AGGTGAAAAAGGTGTT 88 1012
916192 2285 2300 26048 26063 TTAAGGCTTATTCTAC 82 1013
916212 2635 2650 26398 26413 TGAGGTGAATGCCCTG 58 1014
916232 2696 2711 26459 26474 TGTGTGCTCCAGTGGA 89 1015
916252 2730 2745 26493 26508 GCTGGTCCCTGCAGAA 44 1016
916272 N/A N/A 3328 3343 GGGACGCACGAGAGTC 0 1017
916292 N/A N/A 4432 4447 GTCAATAGCTTCACAA 86 1018
916312 N/A N/A 5281 5296 ATAAATCTTGGGATGC 92 1019
916332 N/A N/A 5577 5592 CACAATGACATCATGG 95 1020
916352 N/A N/A 6170 6185 GATAAGCAAACTGCTT 19 1021
916372 N/A N/A 7192 7207 GAGGATGCAACTGGCT 84 1022
916392 N/A N/A 7644 7659 TCGGACTTCAGGCCCA 0 1023
916552 N/A N/A 12208 12223 CCTTTTATTTCCGTTA 97 1024
916572 N/A N/A 12745 12760 GCATACTAAAACCACC 85 1025
916592 N/A N/A 13375 13390 GACTTTGCAGGCACCC 92 1026
916612 N/A N/A 13909 13924 TGACATCCCAGTTCAA 30 1027
916632 N/A N/A 14427 14442 TACTTTCCCATCGACA 81 1028
916652 N/A N/A 15207 15222 AGGAATATTGCCAGGT 88 1029
916672 N/A N/A 15768 15783 GGTTAGTGTTGGTTTA 92 1030
916692 N/A N/A 16790 16805 CATTCGATGGAGGTTC 58 1031
916712 N/A N/A 17629 17644 GGCGGATTTCCCCACT 11 1032
916732 N/A N/A 18894 18909 TAAAATACGCCCGTCC 7 1033
916752 N/A N/A 20183 20198 TCCCTATGTTCTACTT 32 1034
916771 N/A N/A 20574 20589 ATCAACATCTCTAGCT 46 1035
916791 N/A N/A 20811 20826 GGGTAATATTCAGACC 43 1036
916811 N/A N/A 21313 21328 TTTACTAGAGACTCTG 69 1037
916831 N/A N/A 22071 22086 GTAGGATAGGACTAGA 45 1038
916851 N/A N/A 23219 23234 ATAAATGCCTGACCAC 64 1039
916871 N/A N/A 23861 23876 TGTTTCTAGAATGTCG 68 1040
916891 N/A N/A 24873 24888 GCCTATCAGTTTCCCC 0 1041
- 81 047395
Таблица 16
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915354 36 51 2774 2789 CTCGGCCAGGGCATTC 0 1042
915374 89 104 2827 2842 TCCGCAGCAGCTCCGC 60 1043
915394 137 152 2875 2890 GCGCGGGTTAGGATCT 0 1044
915414 240 255 2978 2993 AGCGGGTCGCCCCGAC 21 1045
915434 337 352 3075 3090 ATACCGGAGAGGACGC 85 1046
915454 374 389 5948 5963 AAGATCTGAGAGGACC 24 1047
915474 403 418 5977 5992 CCAATGTTCCGACTCC 95 1048
915494 442 457 6016 6031 CGGAGGAACTTGCTTA 93 1049
915514 471 486 6045 6060 TGGCCGGGAGGCATTT 0 1050
915534 501 516 6075 6090 CTATTTTGCCGGAGAT 87 1051
915554 523 538 6097 6112 GACACTCTGGTAAGAG 26 1052
915614 711 726 11929 11944 ACACGGTGATGGTTGT 46 1053
915634 791 806 12009 12024 ACTGAGCTTGGTGATG 87 1054
915654 838 853 12056 12071 ACAAAAGCTCTCGAGA 0 1055
915674 900 915 13636 13651 ACCTGAATGCATCCAA 93 1056
915694 974 989 16094 16109 CTCAGGATCCATCCCT 43 1057
915714 1008 1023 16128 16143 CCAGACTCATGTTTGC 0 1058
915734 1083 1098 16203 16218 TGCTGAGACGCAGGTG 50 1059
915754 1143 1158 N/A N/A TCAGTGCTGTAGCGAG 42 1060
915774 1208 1223 19048 19063 TATCCTAATGGGTAGC 53 1061
915794 1260 1275 19100 19115 TCGCAATGGCAGATTC 67 1062
915814 1333 1348 23738 23753 TGTGAGGTCACCCACT 0 1063
915834 1360 1375 23765 23780 AGACACATCAGCACTC 24 1064
915854 1432 1447 25195 25210 CAGTCCTGCTCAGGTG 54 1065
915874 1526 1541 25289 25304 GAAGTTCAGGCTGGAC 75 1066
915894 1572 1587 25335 25350 AGGTGGAGAGCCCCTC 0 1067
- 82 047395
915914 1623 1638 25386 25401 ACTCGCCTCCTCAAGT 0 1068
915934 1661 1676 25424 25439 AGATGGGAAACTTTAG 84 1069
915954 1724 1739 25487 25502 GGCTGGGATCCTCCAC 24 1070
915974 1779 1794 25542 25557 GCTGCACAGGCGAAAG 56 1071
915994 1801 1816 25564 25579 TATTAGAGTTAAGTGC 75 1072
916014 1828 1843 25591 25606 AACCAGCTGAATTAAC 55 1073
916034 1875 1890 25638 25653 CAGTCAGTAAGGGACC 70 1074
916054 1898 1913 25661 25676 TGACCATTAATAGGGC 74 1075
916074 1925 1940 25688 25703 TTCTAAGAACCTCATG 22 1076
916094 1968 1983 25731 25746 CTACCCCCCATCACAA 0 1077
916114 1992 2007 25755 25770 CCACAAGATCACACAT 0 1078
916134 2087 2102 25850 25865 CAGACCACCTGACAGG 78 1079
916153 2113 2128 25876 25891 TTTAGTAGTCAAGGTT 93 1080
916173 2178 2193 25941 25956 TAGGTGAAAAAGGTGT 89 1081
916193 2306 2321 26069 26084 ACCCAACCGATTTTTT 61 1082
916213 2636 2651 26399 26414 CTGAGGTGAATGCCCT 73 1083
916233 2697 2712 26460 26475 TTGTGTGCTCCAGTGG 92 1084
916253 2746 2761 26509 26524 TCACTGACCATGTGGG 16 1085
916273 N/A N/A 3362 3377 CTTCATGCACGGGCGC 37 1086
916293 N/A N/A 4462 4477 GCATAATCTCCTGCCT 0 1087
916313 N/A N/A 5284 5299 GCCATAAATCTTGGGA 37 1088
916333 N/A N/A 5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 97 1089
916353 N/A N/A 6529 6544 TACAACTGCCTGTGTT 0 1090
916373 N/A N/A 7218 7233 AAAGCTTCCGCAAACA 51 1091
916393 N/A N/A 7657 7672 CTAACATACACCCTCG 0 1092
916553 N/A N/A 12225 12240 AGCTTCTGGGACAAGC 10 1093
916573 N/A N/A 12746 12761 GGCATACTAAAACCAC 55 1094
916593 N/A N/A 13397 13412 TTGAATGTCACCCTTC 91 1095
916613 N/A N/A 13914 13929 AGTCATGACATCCCAG 93 1096
916633 N/A N/A 14442 14457 TCTCATTGGCACCTGT 86 1097
916653 N/A N/A 15252 15267 CCCTATCAGATGCCCT 81 1098
916673 N/A N/A 15799 15814 CATATCTGGTTTCATG 0 1099
916693 N/A N/A 16842 16857 GACCATAGCACTGTCT 0 1100
916713 N/A N/A 17737 17752 ATTAATCTGGTCATAT 0 1101
916733 N/A N/A 18898 18913 TCCATAAAATACGCCC 69 1102
916753 N/A N/A 20195 20210 GAAAGATGGAATTCCC 86 1103
916772 N/A N/A 20604 20619 TACGATCATCATTATT 91 1104
916792 N/A N/A 20841 20856 GTATTAGCTCAATATT 0 1105
916812 N/A N/A 21314 21329 GTTTACTAGAGACTCT 64 1106
916832 N/A N/A 22080 22095 GTAAAAACTGTAGGAT 0 1107
916852 N/A N/A 23220 23235 GATAAATGCCTGACCA 29 1108
916872 N/A N/A 24011 24026 CCGACGGGAAGTCTTC 0 1109
916892 N/A N/A 24874 24889 GGCCTATCAGTTTCCC 0 1110
- 83 047395
Таблица 17
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915355 37 52 2775 2790 TCTCGGCCAGGGCATT 0 1111
915375 90 105 2828 2843 ATCCGCAGCAGCTCCG 52 1112
915395 138 153 2876 2891 GGCGCGGGTTAGGATC 0 1113
915415 241 256 2979 2994 CAGCGGGTCGCCCCGA 8 1114
915435 338 353 3076 3091 GATACCGGAGAGGACG 30 1115
915455 378 393 5952 5967 GCACAAGATCTGAGAG 72 1116
915475 405 420 5979 5994 TGCCAATGTTCCGACT 0 1117
915495 443 458 6017 6032 TCGGAGGAACTTGCTT 69 1118
915515 472 487 6046 6061 TTGGCCGGGAGGCATT 9 1119
915535 502 517 6076 6091 CCTATTTTGCCGGAGA 96 1120
915555 524 539 6098 6113 AGACACTCTGGTAAGA 2 1121
915615 712 727 11930 11945 GACACGGTGATGGTTG 32 1122
915635 792 807 12010 12025 GACTGAGCTTGGTGAT 93 1123
915655 839 854 12057 12072 GACAAAAGCTCTCGAG 40 1124
915675 901 916 13637 13652 AACCTGAATGCATCCA 92 1125
915695 975 990 16095 16110 CCTCAGGATCCATCCC 0 1126
915715 1011 1026 16131 16146 AATCCAGACTCATGTT 67 1127
915735 1088 1103 16208 16223 CAGGATGCTGAGACGC 86 1128
915755 1144 1159 N/A N/A CTCAGTGCTGTAGCGA 25 1129
915775 1209 1224 19049 19064 TTATCCTAATGGGTAG 23 1130
915795 1261 1276 19101 19116 ATCGCAATGGCAGATT 0 1131
915815 1337 1352 23742 23757 CACCTGTGAGGTCACC 35 1132
915835 1361 1376 23766 23781 CAGACACATCAGCACT 54 1133
915855 1433 1448 25196 25211 CCAGTCCTGCTCAGGT 23 1134
915875 1530 1545 25293 25308 AGAAGAAGTTCAGGCT 81 1135
915895 1574 1589 25337 25352 AAAGGTGGAGAGCCCC 76 1136
915915 1624 1639 25387 25402 GACTCGCCTCCTCAAG 75 1137
915935 1674 1689 25437 25452 GGTAGCTGCACAAAGA 76 1138
915955 1726 1741 25489 25504 GAGGCTGGGATCCTCC 0 1139
915975 1780 1795 25543 25558 CGCTGCACAGGCGAAA 0 1140
915995 1805 1820 25568 25583 GATGTATTAGAGTTAA 82 1141
916015 1829 1844 25592 25607 CAACCAGCTGAATTAA 59 1142
916035 1876 1891 25639 25654 ACAGTCAGTAAGGGAC 81 1143
916055 1899 1914 25662 25677 CTGACCATTAATAGGG 49 1144
916075 1929 1944 25692 25707 GTCATTCTAAGAACCT 81 1145
916095 1969 1984 25732 25747 CCTACCCCCCATCACA 21 1146
916115 1995 2010 25758 25773 ACCCCACAAGATCACA 0 1147
916135 2088 2103 25851 25866 GCAGACCACCTGACAG 44 1148
916154 2131 2146 25894 25909 CCCCGCCATGGAGACG 68 1149
916174 2180 2195 25943 25958 GTTAGGTGAAAAAGGT 90 1150
916194 2308 2323 26071 26086 GCACCCAACCGATTTT 83 1151
916214 2637 2652 26400 26415 GCTGAGGTGAATGCCC 52 1152
916234 2698 2713 26461 26476 GTTGTGTGCTCCAGTG 88 1153
916254 2747 2762 26510 26525 CTCACTGACCATGTGG 13 1154
916274 N/A N/A 3524 3539 GCAAATCGGCCCCTCG 3 1155
916294 N/A N/A 4463 4478 GGCATAATCTCCTGCC 0 1156
916314 N/A N/A 5324 5339 TGGCATGCAAGACCAC 0 1157
916334 N/A N/A 5606 5621 ACTTTATTCAATGTGG 95 1158
- 84 047395
916354 N/A N/A 6556 6571 GTTTATGTCACTCTGG 68 1159
916374 N/A N/A 7245 7260 GAACAGACAAGTGCTG 38 1160
916394 N/A N/A 7658 7673 ACTAACATACACCCTC 31 1161
916554 N/A N/A 12249 12264 ATAATCAGGGTGGTGC 0 1162
916574 N/A N/A 12747 12762 AGGCATACTAAAACCA 47 1163
916594 N/A N/A 13500 13515 GAATCATGCAAGCTCT 50 1164
916614 N/A N/A 13996 14011 TAAACTAAGGGTCACA 37 1165
916634 N/A N/A 14497 14512 ATCCATCCTGCATGAG 76 1166
916654 N/A N/A 15254 15269 GGCCCTATCAGATGCC 0 1167
916674 N/A N/A 15802 15817 CTACATATCTGGTTTC 0 1168
916694 N/A N/A 16844 16859 TGGACCATAGCACTGT 60 1169
916714 N/A N/A 17738 17753 TATTAATCTGGTCATA 18 1170
916734 N/A N/A 18926 18941 CCACTTTACTCTGTTG 64 1171
916754 N/A N/A 20210 20225 AACTATGCCTAGAACG 43 1172
916773 N/A N/A 20606 20621 TTTACGATCATCATTA 77 1173
916793 N/A N/A 20842 20857 TGTATTAGCTCAATAT 0 1174
916813 N/A N/A 21319 21334 TGGGAGTTTACTAGAG 66 1175
916833 N/A N/A 22118 22133 AGAGAGTACTCTTGGA 11 1176
916853 N/A N/A 23222 23237 CTGATAAATGCCTGAC 78 1177
916873 N/A N/A 24038 24053 ATCAATGCTGCACTCA 88 1178
916893 N/A N/A 24889 24904 ACGAATCCCTGGAGGG 0 1179
Таблица 18
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915356 38 53 2776 2791 GTCTCGGCCAGGGCAT 0 1180
915376 93 108 2831 2846 CTGATCCGCAGCAGCT 28 1181
915396 165 180 2903 2918 CGTACATGGCGGCGGC 0 1182
915416 242 257 2980 2995 GCAGCGGGTCGCCCCG 0 1183
- 85 047395
915436 339 354 3077 3092 GGATACCGGAGAGGAC 64 1184
915456 379 394 5953 5968 CGCACAAGATCTGAGA 79 1185
915476 406 421 5980 5995 ATGCCAATGTTCCGAC 83 1186
915496 444 459 6018 6033 GTCGGAGGAACTTGCT 35 1187
915516 473 488 6047 6062 ATTGGCCGGGAGGCAT 0 1188
915536 503 518 6077 6092 GCCTATTTTGCCGGAG 77 1189
915556 525 540 6099 6114 CAGACACTCTGGTAAG 62 1190
915616 730 745 11948 11963 TACTCCCCATAGAAGG 8 1191
915636 794 809 12012 12027 TAGACTGAGCTTGGTG 90 1192
915656 840 855 12058 12073 GGACAAAAGCTCTCGA 60 1193
915676 902 917 13638 13653 GAACCTGAATGCATCC 72 1194
915696 978 993 16098 16113 CGACCTCAGGATCCAT 0 1195
915716 1012 1027 16132 16147 GAATCCAGACTCATGT 0 1196
915736 1089 1104 16209 16224 GCAGGATGCTGAGACG 55 1197
915756 1145 1160 N/A N/A ACTCAGTGCTGTAGCG 12 1198
915776 1210 1225 19050 19065 ATTATCCTAATGGGTA 28 1199
915796 1262 1277 19102 19117 AATCGCAATGGCAGAT 0 1200
915816 1339 1354 23744 23759 AACACCTGTGAGGTCA 56 1201
915836 1365 1380 23770 23785 GGAGCAGACACATCAG 53 1202
915856 1434 1449 25197 25212 GCCAGTCCTGCTCAGG 21 1203
915876 1531 1546 25294 25309 AAGAAGAAGTTCAGGC 85 1204
915896 1575 1590 25338 25353 GAAAGGTGGAGAGCCC 78 1205
915916 1626 1641 25389 25404 TAGACTCGCCTCCTCA 32 1206
915936 1676 1691 25439 25454 GAGGTAGCTGCACAAA 91 1207
915956 1737 1752 25500 25515 AACTCAGCTCAGAGGC 46 1208
915976 1781 1796 25544 25559 CCGCTGCACAGGCGAA 0 1209
915996 1807 1822 25570 25585 CTGATGTATTAGAGTT 93 1210
916016 1830 1845 25593 25608 CCAACCAGCTGAATTA 21 1211
916036 1877 1892 25640 25655 AACAGTCAGTAAGGGA 82 1212
916056 1900 1915 25663 25678 TCTGACCATTAATAGG 13 1213
916076 1930 1945 25693 25708 TGTCATTCTAAGAACC 40 1214
916096 1970 1985 25733 25748 GCCTACCCCCCATCAC 18 1215
916116 1996 2011 25759 25774 CACCCCACAAGATCAC 50 1216
- 86 047395
916136 2089 2104 25852 25867 TGCAGACCACCTGACA 58 1217
916155 2132 2147 25895 25910 CCCCCGCCATGGAGAC 33 1218
916175 2224 2239 25987 26002 CGCTTCCTTACATTTT 89 1219
916195 2309 2324 26072 26087 TGCACCCAACCGATTT 64 1220
916215 2638 2653 26401 26416 GGCTGAGGTGAATGCC 0 1221
916235 2699 2714 26462 26477 AGTTGTGTGCTCCAGT 85 1222
916255 2748 2763 26511 26526 ACTCACTGACCATGTG 0 1223
916275 N/A N/A 3555 3570 GGCCAAAGCCCCACTC 0 1224
916295 N/A N/A 4464 4479 GGGCATAATCTCCTGC 0 1225
916315 N/A N/A 5342 5357 GGCTGATCTGCACTCT 84 1226
916335 N/A N/A 5626 5641 TAATTCTACCTGTGTC 92 1227
916355 N/A N/A 6557 6572 AGTTTATGTCACTCTG 27 1228
916375 N/A N/A 7321 7336 ACACTTTGCGAAGCAC 27 1229
916395 N/A N/A 7660 7675 GAACTAACATACACCC 1 1230
916555 N/A N/A 12252 12267 CCCATAATCAGGGTGG 0 1231
916575 N/A N/A 12758 12773 GTAGAGTGGTAAGGCA 95 1232
916595 N/A N/A 13502 13517 AAGAATCATGCAAGCT 34 1233
916615 N/A N/A 13997 14012 TTAAACTAAGGGTCAC 65 1234
916635 N/A N/A 14549 14564 TTAATGTGGATTCACG 76 1235
916655 N/A N/A 15295 15310 CCAAGATAACCTCACA 64 1236
916675 N/A N/A 15806 15821 CCATCTACATATCTGG 26 1237
916695 N/A N/A 16854 16869 CACAATCATTTGGACC 72 1238
916715 N/A N/A 17739 17754 GTATTAATCTGGTCAT 87 1239
916735 N/A N/A 19113 19128 CACCTCTGGACAATCG 29 1240
916755 N/A N/A 20212 20227 CAAACTATGCCTAGAA 70 1241
916774 N/A N/A 20608 20623 ATTTTACGATCATCAT 91 1242
916794 N/A N/A 20846 20861 TGCCTGTATTAGCTCA 90 1243
916814 N/A N/A 21345 21360 CACATAAAGTCAAACG 87 1244
916834 N/A N/A 22124 22139 AGAACAAGAGAGTACT 3 1245
916854 N/A N/A 23250 23265 CACATAAAGGACCCCC 54 1246
916874 N/A N/A 24126 24141 CGCTATCTGACACTCC 87 1247
916894 N/A N/A 24896 24911 TCCACCAACGAATCCC 50 1248
- 87 047395
Таблица 19
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915357 39 54 2777 2792 TGTCTCGGCCAGGGCA 0 1249
915377 94 109 2832 2847 CCTGATCCGCAGCAGC 0 1250
915397 182 197 2920 2935 CCAGCCGCGCTCTGCG 0 1251
915417 243 258 2981 2996 GGCAGCGGGTCGCCCC 0 1252
915437 341 356 3079 3094 CGGGATACCGGAGAGG 57 1253
915457 380 395 5954 5969 CCGCACAAGATCTGAG 71 1254
915477 407 422 5981 5996 GATGCCAATGTTCCGA 93 1255
915497 445 460 6019 6034 TGTCGGAGGAACTTGC 85 1256
915517 474 489 6048 6063 CATTGGCCGGGAGGCA 0 1257
915537 504 519 6078 6093 TGCCTATTTTGCCGGA 44 1258
915557 526 541 6100 6115 TCAGACACTCTGGTAA 26 1259
915617 732 747 11950 11965 CGTACTCCCCATAGAA 66 1260
915637 796 811 12014 12029 CGTAGACTGAGCTTGG 98 1261
915657 857 872 12075 12090 CACCTTGAGATCCGGG 0 1262
915677 903 918 13639 13654 AGAACCTGAATGCATC 78 1263
915697 979 994 16099 16114 GCGACCTCAGGATCCA 1 1264
915717 1031 1046 16151 16166 GGCAGCCGACTCCGGG 19 1265
915737 1109 1124 16229 16244 CAGGATGCTCTCATCC 0 1266
915757 1146 1161 N/A N/A CACTCAGTGCTGTAGC 33 1267
915777 1214 1229 19054 19069 AGACATTATCCTAATG 42 1268
915797 1263 1278 19103 19118 CAATCGCAATGGCAGA 49 1269
915817 1340 1355 23745 23760 GAACACCTGTGAGGTC 44 1270
915837 1398 1413 25161 25176 GGCTGCTCACTGGCAT 18 1271
915857 1435 1450 25198 25213 GGCCAGTCCTGCTCAG 0 1272
915877 1534 1549 25297 25312 CCCAAGAAGAAGTTCA 76 1273
915897 1576 1591 25339 25354 GGAAAGGTGGAGAGCC 24 1274
- 88 047395
915917 1627 1642 25390 25405 CTAGACTCGCCTCCTC 77 1275
915937 1679 1694 25442 25457 GCGGAGGTAGCTGCAC 16 1276
915957 1738 1753 25501 25516 CAACTCAGCTCAGAGG 61 1277
915977 1782 1797 25545 25560 ACCGCTGCACAGGCGA 34 1278
915997 1809 1824 25572 25587 TGCTGATGTATTAGAG 83 1279
916017 1831 1846 25594 25609 CCCAACCAGCTGAATT 42 1280
916037 1878 1893 25641 25656 AAACAGTCAGTAAGGG 92 1281
916057 1901 1916 25664 25679 GTCTGACCATTAATAG 64 1282
916077 1931 1946 25694 25709 CTGTCATTCTAAGAAC 41 1283
916097 1971 1986 25734 25749 AGCCTACCCCCCATCA 0 1284
916117 1997 2012 25760 25775 CCACCCCACAAGATCA 0 1285
916137 2090 2105 25853 25868 TTGCAGACCACCTGAC 65 1286
916156 2133 2148 25896 25911 ACCCCCGCCATGGAGA 54 1287
916176 2225 2240 25988 26003 ACGCTTCCTTACATTT 84 1288
916196 2310 2325 26073 26088 CTGCACCCAACCGATT 58 1289
916216 2639 2654 26402 26417 GGGCTGAGGTGAATGC 46 1290
916236 2700 2715 26463 26478 AAGTTGTGTGCTCCAG 86 1291
916256 2751 2766 26514 26529 GAAACTCACTGACCAT 41 1292
916276 N/A N/A 4068 4083 GGAAACAACTTTCCTC 0 1293
916296 N/A N/A 4730 4745 GATCATGTGGCGGTCT 68 1294
916316 N/A N/A 5364 5379 CACTTACTGGCCTGGC 30 1295
916336 N/A N/A 5645 5660 ATATTGGGCTCAATGA 89 1296
916356 N/A N/A 6575 6590 ATCACTGGAGGTGTAC 0 1297
916376 N/A N/A 7328 7343 CAGGATCACACTTTGC 17 1298
916396 N/A N/A 7661 7676 GGAACTAACATACACC 0 1299
916556 N/A N/A 12272 12287 GTATATGTTCCCAGGT 81 1300
916576 N/A N/A 12788 12803 GTGTACATGGTCTGCA 94 1301
916596 N/A N/A 13529 13544 ATCATTGGAAGACCGC 89 1302
916616 N/A N/A 13998 14013 GTTAAACTAAGGGTCA 85 1303
916636 N/A N/A 14550 14565 CTTAATGTGGATTCAC 91 1304
916656 N/A N/A 15351 15366 TCCAACTTCAGGCTGA 74 1305
916676 N/A N/A 15819 15834 AGCTTTGTGGGCTCCA 69 1306
916696 N/A N/A 16982 16997 GTTTAATAAGGGCACC 63 1307
916716 N/A N/A 17740 17755 CGTATTAATCTGGTCA 93 1308
916736 N/A N/A 19126 19141 CACCTAAAATGCTCAC 17 1309
916756 N/A N/A 20213 20228 ACAAACTATGCCTAGA 58 1310
916775 N/A N/A 20609 20624 AATTTTACGATCATCA 78 1311
916795 N/A N/A 20927 20942 GACAGATCAGCACTCG 80 1312
916815 N/A N/A 21407 21422 CAATTCTAGACATGGC 88 1313
916835 N/A N/A 22338 22353 TGCACCTACCCTTTTC 39 1314
916855 N/A N/A 23251 23266 ACACATAAAGGACCCC 48 1315
916875 N/A N/A 24241 24256 GCATTACCAGGCACCT 61 1316
916895 N/A N/A 24912 24927 GACATCACAGGTGTTG 5 1317
- 89 047395
Таблица 20
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915358 40 55 2778 2793 GTGTCTCGGCCAGGGC 0 1318
915378 96 111 2834 2849 GTCCTGATCCGCAGCA 0 1319
915398 184 199 2922 2937 CTCCAGCCGCGCTCTG 14 1320
915418 244 259 2982 2997 AGGCAGCGGGTCGCCC 0 1321
915438 342 357 3080 3095 GCGGGATACCGGAGAG 44 1322
915458 381 396 5955 5970 TCCGCACAAGATCTGA 41 1323
915478 408 423 5982 5997 AGATGCCAATGTTCCG 95 1324
915498 446 461 6020 6035 CTGTCGGAGGAACTTG 40 1325
915518 475 490 6049 6064 ACATTGGCCGGGAGGC 5 1326
915538 505 520 6079 6094 ATGCCTATTTTGCCGG 61 1327
915558 527 542 6101 6116 ATCAGACACTCTGGTA 0 1328
915618 748 763 11966 11981 ACTTTAGGGCAGATGT 87 1329
915638 818 833 12036 12051 GTAGAGGTTCCCTGTG 87 1330
915658 859 874 N/A N/A AGCACCTTGAGATCCG 0 1331
915678 926 941 N/A N/A GTTGCAGATGCCCTTC 24 1332
915698 980 995 16100 16115 GGCGACCTCAGGATCC 0 1333
915718 1032 1047 16152 16167 AGGCAGCCGACTCCGG 8 1334
915738 1114 1129 16234 16249 GTGTCCAGGATGCTCT 41 1335
915758 1147 1162 N/A N/A TCACTCAGTGCTGTAG 59 1336
915778 1217 1232 19057 19072 ATAAGACATTATCCTA 85 1337
915798 1264 1279 19104 19119 ACAATCGCAATGGCAG 66 1338
915818 1342 1357 23747 23762 GTGAACACCTGTGAGG 58 1339
915838 1400 1415 25163 25178 TTGGCTGCTCACTGGC 79 1340
915858 1436 1451 25199 25214 GGGCCAGTCCTGCTCA 0 1341
915878 1535 1550 25298 25313 GCCCAAGAAGAAGTTC 54 1342
915898 1590 1605 25353 25368 CTAGTGAAAAACTGGG 34 1343
915918 1628 1643 25391 25406 GCTAGACTCGCCTCCT 33 1344
915938 1680 1695 25443 25458 TGCGGAGGTAGCTGCA 0 1345
915958 1756 1771 25519 25534 CCTAGCTTTTCATAAA 0 1346
915978 1783 1798 25546 25561 GACCGCTGCACAGGCG 24 1347
915998 1810 1825 25573 25588 ATGCTGATGTATTAGA 86 1348
916018 1832 1847 25595 25610 TCCCAACCAGCTGAAT 3 1349
916038 1879 1894 25642 25657 GAAACAGTCAGTAAGG 64 1350
916058 1902 1917 25665 25680 AGTCTGACCATTAATA 86 1351
916078 1933 1948 25696 25711 ACCTGTCATTCTAAGA 18 1352
916098 1972 1987 25735 25750 CAGCCTACCCCCCATC 41 1353
916118 1999 2014 25762 25777 CTCCACCCCACAAGAT 0 1354
916138 2092 2107 25855 25870 CTTTGCAGACCACCTG 65 1355
916157 2134 2149 25897 25912 TACCCCCGCCATGGAG 57 1356
916177 2237 2252 26000 26015 CAACAGGTAACAACGC 88 1357
916197 2579 2594 26342 26357 GTCAGACTTTCACTCA 81 1358
916217 2659 2674 26422 26437 GTGCTTGGCTCCTGCC 43 1359
916237 2701 2716 26464 26479 CAAGTTGTGTGCTCCA 73 1360
916257 2769 2784 26532 26547 CATCGCCACACATGGG 61 1361
916277 N/A N/A 4105 4120 AGGAAGGGTCCCAAAC 0 1362
916297 N/A N/A 4731 4746 TGATCATGTGGCGGTC 80 1363
916317 N/A N/A 5391 5406 TGCTATCAGGTGCAGG 60 1364
916337 N/A N/A 5646 5661 TATATTGGGCTCAATG 71 1365
- 90 047395
916357 N/A N/A 6594 6609 GTTTACAAACATGGAC 26 1366
916377 N/A N/A 7464 7479 TCATTAGCATCACCGG 33 1367
916397 N/A N/A 7662 7677 GGGAACTAACATACAC 0 1368
916557 N/A N/A 12274 12289 GGGTATATGTTCCCAG 0 1369
916577 N/A N/A 12830 12845 TGCATAGCCTTCTTTC 84 1370
916597 N/A N/A 13530 13545 CATCATTGGAAGACCG 62 1371
916617 N/A N/A 14016 14031 TCTTTAACTTCGGCCC 70 1372
916637 N/A N/A 14551 14566 TCTTAATGTGGATTCA 88 1373
916657 N/A N/A 15388 15403 TCAGACAACCACAGCT 66 1374
916677 N/A N/A 15852 15867 TAAAGCAGGACACACG 74 1375
916697 N/A N/A 17077 17092 AGACATGTTGGTGTCT 0 1376
916717 N/A N/A 17788 17803 CCCCAGTCTTTTATTC 0 1377
916737 N/A N/A 19140 19155 GGAAGACACGGAGCCA 20 1378
916757 N/A N/A 20240 20255 CCTAACTGCTGGCTCT 85 1379
916776 N/A N/A 20610 20625 TAATTTTACGATCATC 76 1380
916796 N/A N/A 20939 20954 CTCTTTGTAGCAGACA 90 1381
916816 N/A N/A 21439 21454 CAATATACTGAGAGGA 92 1382
916836 N/A N/A 22392 22407 GTAGACATCCTTCCCG 65 1383
916856 N/A N/A 23252 23267 GACACATAAAGGACCC 59 1384
916876 N/A N/A 24242 24257 TGCATTACCAGGCACC 37 1385
916896 N/A N/A 24913 24928 GGACATCACAGGTGTT 19 1386
Таблица 21
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915359 41 56 2779 2794 AGTGTCTCGGCCAGGG 0 1387
915379 97 112 2835 2850 GGTCCTGATCCGCAGC 0 1388
915399 185 200 2923 2938 GCTCCAGCCGCGCTCT 26 1389
915419 245 260 2983 2998 CAGGCAGCGGGTCGCC 0 1390
- 91 047395
915439 343 358 3081 3096 AGCGGGATACCGGAGA 69 1391
915459 382 397 5956 5971 TTCCGCACAAGATCTG 71 1392
915479 409 424 5983 5998 AAGATGCCAATGTTCC 93 1393
915499 448 463 6022 6037 CCCTGTCGGAGGAACT 30 1394
915519 477 492 6051 6066 GGACATTGGCCGGGAG 88 1395
915539 506 521 6080 6095 GATGCCTATTTTGCCG 60 1396
915559 529 544 6103 6118 CCATCAGACACTCTGG 30 1397
915579 595 610 7825 7840 CAGGAACATACCAAGG 98 1398
915599 674 689 11892 11907 GTTGTCACTCACTCCT 98 1399
915619 749 764 11967 11982 GACTTTAGGGCAGATG 96 1400
915639 819 834 12037 12052 GGTAGAGGTTCCCTGT 92 1401
915659 860 875 N/A N/A CAGCACCTTGAGATCC 0 1402
915679 928 943 N/A N/A CTGTTGCAGATGCCCT 58 1403
915699 981 996 16101 16116 TGGCGACCTCAGGATC 40 1404
915719 1033 1048 16153 16168 AAGGCAGCCGACTCCG 0 1405
915739 1115 ИЗО 16235 16250 GGTGTCCAGGATGCTC 40 1406
915759 1148 1163 N/A N/A TTCACTCAGTGCTGTA 29 1407
915779 1219 1234 19059 19074 ACATAAGACATTATCC 86 1408
915799 1268 1283 19108 19123 CTGGACAATCGCAATG 42 1409
915819 1344 1359 23749 23764 GAGTGAACACCTGTGA 81 1410
915839 1401 1416 25164 25179 GTTGGCTGCTCACTGG 85 1411
915859 1437 1452 25200 25215 AGGGCCAGTCCTGCTC 0 1412
915879 1538 1553 25301 25316 ATTGCCCAAGAAGAAG 54 1413
915899 1591 1606 25354 25369 TCTAGTGAAAAACTGG 0 1414
915919 1629 1644 25392 25407 TGCTAGACTCGCCTCC 72 1415
915939 1681 1696 25444 25459 ATGCGGAGGTAGCTGC 39 1416
915959 1764 1779 25527 25542 GGTTGCTTCCTAGCTT 87 1417
915979 1784 1799 25547 25562 GGACCGCTGCACAGGC 0 1418
915999 1811 1826 25574 25589 CATGCTGATGTATTAG 35 1419
916019 1833 1848 25596 25611 TTCCCAACCAGCTGAA 0 1420
916039 1880 1895 25643 25658 CGAAACAGTCAGTAAG 80 1421
916059 1905 1920 25668 25683 AACAGTCTGACCATTA 85 1422
916079 1934 1949 25697 25712 CACCTGTCATTCTAAG 45 1423
- 92 047395
916099 1973 1988 25736 25751 CCAGCCTACCCCCCAT 53 1424
916119 2022 2037 25785 25800 GTGGGATCATGCTATT 76 1425
916139 2093 2108 25856 25871 TCTTTGCAGACCACCT 85 1426
916158 2135 2150 25898 25913 TTACCCCCGCCATGGA 0 1427
916178 2238 2253 26001 26016 TCAACAGGTAACAACG 87 1428
916198 2620 2635 26383 26398 GCACACTAGATTATTT 66 1429
916218 2673 2688 26436 26451 CGGAAGCTCCTGCTGT 27 1430
916238 2702 2717 26465 26480 TCAAGTTGTGTGCTCC 91 1431
916258 2770 2785 26533 26548 TCATCGCCACACATGG 49 1432
916278 N/A N/A 4211 4226 TCATTTCCAGGAGTAC 75 1433
916298 N/A N/A 4735 4750 CAAATGATCATGTGGC 93 1434
916318 N/A N/A 5394 5409 TAATGCTATCAGGTGC 95 1435
916338 N/A N/A 5648 5663 GATATATTGGGCTCAA 97 1436
916358 N/A N/A 6596 6611 GGGTTTACAAACATGG 75 1437
916378 N/A N/A 7465 7480 TTCATTAGCATCACCG 78 1438
916398 N/A N/A 7686 7701 GTTAATCCATGGGTCA 49 1439
916418 N/A N/A 8992 9007 AGCCTAAACTTCCTCC 63 1440
916438 N/A N/A 9318 9333 AGAAGAGCCGCCCTGC 77 1441
916458 N/A N/A 9795 9810 GCAAGACTAGCAAGTG 85 1442
916478 N/A N/A 10301 10316 AGCATGCGGTATGTAC 67 1443
916498 N/A N/A 10849 10864 CACACAATTTCTAGGG 82 1444
916518 N/A N/A 11346 11361 TTGACAATTAGAACCA 96 1445
916538 N/A N/A 11711 11726 ACAAATCCTTACCGAG 54 1446
916558 N/A N/A 12285 12300 GTTTTAGGTCTGGGTA 94 1447
916578 N/A N/A 12831 12846 TTGCATAGCCTTCTTT 93 1448
916598 N/A N/A 13660 13675 CATACATACCCTTCTC 9 1449
916618 N/A N/A 14025 14040 CGCAGAAACTCTTTAA 89 1450
916638 N/A N/A 14552 14567 GTCTTAATGTGGATTC 93 1451
916658 N/A N/A 15421 15436 AGCATTGGCACACTGG 70 1452
916678 N/A N/A 15857 15872 GGCTTTAAAGCAGGAC 62 1453
916698 N/A N/A 17079 17094 GCAGACATGTTGGTGT 2 1454
916718 N/A N/A 17839 17854 TACAAGCTGGTCCTTG 0 1455
916738 N/A N/A 19211 19226 GACAATCCAGGTCCCA 70 1456
916758 N/A N/A 20285 20300 GAGGAAGCCCAATCAA 81 1457
916777 N/A N/A 20611 20626 CTAATTTTACGATCAT 81 1458
916797 N/A N/A 20984 20999 TTAAACTGCCAAGTCC 83 1459
916817 N/A N/A 21440 21455 CCAATATACTGAGAGG 96 1460
916837 N/A N/A 22406 22421 GGTAGCACCGCCAAGT 0 1461
916857 N/A N/A 23301 23316 CACCATGGAGAGGTCT 0 1462
916877 N/A N/A 24243 24258 TTGCATTACCAGGCAC 17 1463
916897 N/A N/A 24934 24949 GCTACCTGGACACCTC 47 1464
- 93 047395
Таблица 22
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
841947 2094 2109 25857 25872 ATCTTTGCAGACCACC 89 1464
912986 N/A N/A 20288 20303 TCAGAGGAAGCCCAAT 92 254
20318 20333
915360 42 57 2780 2795 CAGTGTCTCGGCCAGG 0 1466
915380 98 113 2836 2851 GGGTCCTGATCCGCAG 0 1467
915400 186 201 2924 2939 AGCTCCAGCCGCGCTC 0 1468
915420 246 261 2984 2999 TCAGGCAGCGGGTCGC 78 1469
915440 344 359 3082 3097 CAGCGGGATACCGGAG 72 1470
915460 383 398 5957 5972 CTTCCGCACAAGATCT 0 1471
915480 411 426 5985 6000 GGAAGATGCCAATGTT 94 1472
915500 449 464 6023 6038 ACCCTGTCGGAGGAAC 40 1473
915520 480 495 6054 6069 GGTGGACATTGGCCGG 38 1474
915540 507 522 6081 6096 AGATGCCTATTTTGCC 76 1475
915560 556 571 6130 6145 CGAAAGTCAGACACCA 69 1476
915620 750 765 11968 11983 TGACTTTAGGGCAGAT 89 1477
915640 821 836 12039 12054 AAGGTAGAGGTTCCCT 10 1478
915660 875 890 13611 13626 AAGGCATATCTCTCCC 47 1479
- 94 047395
915680 929 944 N/A N/A CCTGTTGCAGATGCCC 22 1480
915700 982 997 16102 16117 ATGGCGACCTCAGGAT 58 1481
915720 1034 1049 16154 16169 CAAGGCAGCCGACTCC 63 1482
915740 1121 1136 16241 16256 CGAGAGGGTGTCCAGG 0 1483
915760 1149 1164 N/A N/A CTTCACTCAGTGCTGT 13 1484
915780 1226 1241 19066 19081 CAGCATTACATAAGAC 94 1485
915800 1270 1285 19110 19125 CTCTGGACAATCGCAA 55 1486
915820 1345 1360 23750 23765 CGAGTGAACACCTGTG 83 1487
915840 1402 1417 25165 25180 TGTTGGCTGCTCACTG 77 1488
915860 1470 1485 25233 25248 CTGGACAGCCCTTGGG 29 1489
915880 1539 1554 25302 25317 TATTGCCCAAGAAGAA 18 1490
915900 1598 1613 25361 25376 ACTCTTCTCTAGTGAA 67 1491
915920 1630 1645 25393 25408 CTGCTAGACTCGCCTC 88 1492
915940 1682 1697 25445 25460 AATGCGGAGGTAGCTG 0 1493
915960 1765 1780 25528 25543 AGGTTGCTTCCTAGCT 55 1494
915980 1785 1800 25548 25563 TGGACCGCTGCACAGG 82 1495
916000 1812 1827 25575 25590 GCATGCTGATGTATTA 52 1496
916020 1837 1852 25600 25615 TCATTTCCCAACCAGC 94 1497
916040 1881 1896 25644 25659 ACGAAACAGTCAGTAA 79 1498
916060 1907 1922 25670 25685 GGAACAGTCTGACCAT 22 1499
916080 1936 1951 25699 25714 AACACCTGTCATTCTA 71 1500
916100 1974 1989 25737 25752 GCCAGCCTACCCCCCA 23 1501
916120 2023 2038 25786 25801 AGTGGGATCATGCTAT 0 1502
916159 2136 2151 25899 25914 GTTACCCCCGCCATGG 47 1503
916179 2239 2254 26002 26017 TTCAACAGGTAACAAC 84 1504
916199 2621 2636 26384 26399 TGCACACTAGATTATT 0 1505
916219 2674 2689 26437 26452 GCGGAAGCTCCTGCTG 6 1506
916239 2704 2719 26467 26482 GTTCAAGTTGTGTGCT 85 1507
916259 2771 2786 26534 26549 CTCATCGCCACACATG 85 1508
916279 N/A N/A 4218 4233 CGGAATCTCATTTCCA 0 1509
916299 N/A N/A 4736 4751 GCAAATGATCATGTGG 93 1510
916319 N/A N/A 5396 5411 CTTAATGCTATCAGGT 83 1511
916339 N/A N/A 5649 5664 GGATATATTGGGCTCA 96 1512
916359 N/A N/A 6597 6612 AGGGTTTACAAACATG 32 1513
916379 N/A N/A 7466 7481 ATTCATTAGCATCACC 52 1514
916399 N/A N/A 7687 7702 GGTTAATCCATGGGTC 0 1515
916559 N/A N/A 12286 12301 AGTTTTAGGTCTGGGT 89 1516
916579 N/A N/A 12833 12848 CATTGCATAGCCTTCT 96 1517
916599 N/A N/A 13661 13676 CCATACATACCCTTCT 21 1518
916619 N/A N/A 14077 14092 ACCCACACCTGACTGG 16 1519
916639 N/A N/A 14572 14587 CGCTCCTACTTATCCC 96 1520
916659 N/A N/A 15427 15442 TCTTACAGCATTGGCA 38 1521
916679 N/A N/A 15973 15988 CATCTACCAAACTGCA 73 1522
916699 N/A N/A 17135 17150 AACAAACATCGATTTT 47 1523
916719 N/A N/A 17844 17859 AGCTTTACAAGCTGGT 0 1524
916739 N/A N/A 19213 19228 ACGACAATCCAGGTCC 14 1525
916778 N/A N/A 20612 20627 TCTAATTTTACGATCA 92 1526
916798 N/A N/A 20985 21000 ATTAAACTGCCAAGTC 72 1527
916818 N/A N/A 21441 21456 ACCAATATACTGAGAG 92 1528
916838 N/A N/A 22409 22424 AGCGGTAGCACCGCCA 0 1529
916858 N/A N/A 23323 23338 TCACATGTGAGCCCAG 46 1530
916878 N/A N/A 24271 24286 GTACAACAGAGGGTGG 19 1531
916898 N/A N/A 24978 24993 GGCTGATGTCACCACC 32 1532
- 95 047395
Таблица 23
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915361 43 58 2781 2796 TCAGTGTCTCGGCCAG 0 1533
915381 105 120 2843 2858 TCGGCTCGGGTCCTGA 0 1534
915401 188 203 2926 2941 CAAGCTCCAGCCGCGC 22 1535
915421 247 262 2985 3000 CTCAGGCAGCGGGTCG 48 1536
915441 345 360 3083 3098 CCAGCGGGATACCGGA 0 1537
915461 384 399 5958 5973 CCTTCCGCACAAGATC 59 1538
915481 414 429 5988 6003 GATGGAAGATGCCAAT 83 1539
915501 450 465 6024 6039 GACCCTGTCGGAGGAA 26 1540
915521 482 497 6056 6071 CTGGTGGACATTGGCC 0 1541
915541 508 523 6082 6097 GAGATGCCTATTTTGC 92 1542
915561 557 572 6131 6146 CCGAAAGTCAGACACC 0 1543
915601 691 706 11909 11924 GCATCAATGAAGGGTA 91 1544
915621 751 766 11969 11984 TTGACTTTAGGGCAGA 85 1545
915641 822 837 12040 12055 GAAGGTAGAGGTTCCC 74 1546
915661 876 891 13612 13627 GAAGGCATATCTCTCC 32 1547
915681 930 945 16050 16065 GCCTGTTGCAGATGCC 0 1548
915701 983 998 16103 16118 CATGGCGACCTCAGGA 0 1549
915721 1035 1050 16155 16170 CCAAGGCAGCCGACTC 79 1550
915741 1122 1137 16242 16257 GCGAGAGGGTGTCCAG 0 1551
915761 1150 1165 18990 19005 TCTTCACTCAGTGCTG 41 1552
915781 1227 1242 19067 19082 GCAGCATTACATAAGA 75 1553
915801 1273 1288 N/A N/A AGTCTCTGGACAATCG 0 1554
915821 1346 1361 23751 23766 TCGAGTGAACACCTGT 52 1555
915841 1403 1418 25166 25181 CTGTTGGCTGCTCACT 80 1556
915861 1471 1486 25234 25249 GCTGGACAGCCCTTGG 0 1557
915881 1540 1555 25303 25318 TTATTGCCCAAGAAGA 75 1558
915901 1599 1614 25362 25377 GACTCTTCTCTAGTGA 67 1559
915921 1631 1646 25394 25409 TCTGCTAGACTCGCCT 50 1560
915941 1683 1698 25446 25461 CAATGCGGAGGTAGCT 39 1561
915961 1766 1781 25529 25544 AAGGTTGCTTCCTAGC 71 1562
915981 1786 1801 25549 25564 CTGGACCGCTGCACAG 0 1563
916001 1813 1828 25576 25591 CGCATGCTGATGTATT 73 1564
916021 1840 1855 25603 25618 GTGTCATTTCCCAACC 61 1565
916041 1882 1897 25645 25660 CACGAAACAGTCAGTA 34 1566
916061 1910 1925 25673 25688 GCTGGAACAGTCTGAC 82 1567
916081 1942 1957 25705 25720 CATCCAAACACCTGTC 69 1568
916101 1975 1990 25738 25753 GGCCAGCCTACCCCCC 2 1569
916121 2024 2039 25787 25802 AAGTGGGATCATGCTA 26 1570
- 96 047395
916140 2095 2110 25858 25873 CATCTTTGCAGACCAC 92 1571
916160 2137 2152 25900 25915 TGTTACCCCCGCCATG 51 1572
916180 2257 2272 26020 26035 GATTCACATAATACAA 87 1573
916200 2622 2637 26385 26400 CTGCACACTAGATTAT 0 1574
916220 2675 2690 26438 26453 GGCGGAAGCTCCTGCT 0 1575
916240 2705 2720 26468 26483 GGTTCAAGTTGTGTGC 69 1576
916260 2772 2787 26535 26550 TCTCATCGCCACACAT 72 1577
916280 N/A N/A 4220 4235 TACGGAATCTCATTTC 80 1578
916300 N/A N/A 4791 4806 GGCCACCTTGGGATAC 17 1579
916320 N/A N/A 5398 5413 GCCTTAATGCTATCAG 67 1580
916340 N/A N/A 5650 5665 TGGATATATTGGGCTC 97 1581
916360 N/A N/A 6603 6618 ACATTCAGGGTTTACA 18 1582
916380 N/A N/A 7468 7483 GTATTCATTAGCATCA 51 1583
916400 N/A N/A 7688 7703 AGGTTAATCCATGGGT 29 1584
916560 N/A N/A 12287 12302 GAGTTTTAGGTCTGGG 95 1585
916580 N/A N/A 12905 12920 CTTATAAAGCACACGG 95 1586
916600 N/A N/A 13683 13698 GGGCATGGCTGATCCT 8 1587
916620 N/A N/A 14099 14114 CAAACTTGTCTAGTGG 67 1588
916640 N/A N/A 14600 14615 TCGCATCCATGGGTCC 83 1589
916660 N/A N/A 15429 15444 GCTCTTACAGCATTGG 51 1590
916680 N/A N/A 15974 15989 CCATCTACCAAACTGC 61 1591
916700 N/A N/A 17195 17210 GACTTAGTCCGTGTTC 49 1592
916720 N/A N/A 17883 17898 CAGCATCTATGTTCTC 67 1593
916740 N/A N/A 19239 19254 ATAGACTGTGAGCTGT 82 1594
916759 N/A N/A 20354 20369 GACCATTCTGCTCCCC 20 1595
916779 N/A N/A 20632 20647 GCCCATACCTTTTATC 47 1596
916799 N/A N/A 20987 21002 GTATTAAACTGCCAAG 81 1597
916819 N/A N/A 21444 21459 CTAACCAATATACTGA 73 1598
916839 N/A N/A 22506 22521 GGCTGGTGATGAAACA 0 1599
916859 N/A N/A 23345 23360 CCTCATGGTTTGCTGT 31 1600
916879 N/A N/A 24273 24288 CAGTACAACAGAGGGT 81 1601
916899 N/A N/A 25064 25079 CACATTGCCGGCCAGT 58 1602
- 97 047395
Таблица 24
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915362 44 59 2782 2797 CTCAGTGTCTCGGCCA 0 1603
915382 106 121 2844 2859 ATCGGCTCGGGTCCTG 30 1604
915402 189 204 2927 2942 ACAAGCTCCAGCCGCG 24 1605
915422 248 263 2986 3001 GCTCAGGCAGCGGGTC 33 1606
915442 346 361 N/A N/A TCCAGCGGGATACCGG 0 1607
915462 385 400 5959 5974 GCCTTCCGCACAAGAT 60 1608
915482 415 430 5989 6004 GGATGGAAGATGCCAA 60 1609
915502 451 466 6025 6040 AGACCCTGTCGGAGGA 75 1610
915522 487 502 6061 6076 ATGAGCTGGTGGACAT 74 1611
915542 509 524 6083 6098 AGAGATGCCTATTTTG 91 1612
915562 558 573 6132 6147 ACCGAAAGTCAGACAC 0 1613
915602 692 707 11910 11925 GGCATCAATGAAGGGT 88 1614
915622 752 767 11970 11985 CTTGACTTTAGGGCAG 86 1615
915642 824 839 12042 12057 GAGAAGGTAGAGGTTC 81 1616
915662 878 893 13614 13629 TCGAAGGCATATCTCT 16 1617
915682 931 946 16051 16066 GGCCTGTTGCAGATGC 0 1618
915702 984 999 16104 16119 GCATGGCGACCTCAGG 24 1619
915722 1036 1051 16156 16171 GCCAAGGCAGCCGACT 0 1620
915742 1123 1138 16243 16258 GGCGAGAGGGTGTCCA 0 1621
915762 1173 1188 19013 19028 TGTATCCACCTTTGTC 85 1622
915782 1228 1243 19068 19083 GGCAGCATTACATAAG 73 1623
915802 1283 1298 N/A N/A CCATGTCACCAGTCTC 59 1624
915822 1347 1362 23752 23767 CTCGAGTGAACACCTG 0 1625
915842 1404 1419 25167 25182 CCTGTTGGCTGCTCAC 88 1626
915862 1472 1487 25235 25250 TGCTGGACAGCCCTTG 0 1627
915882 1541 1556 25304 25319 TTTATTGCCCAAGAAG 38 1628
- 98 047395
915902 1600 1615 25363 25378 AGACTCTTCTCTAGTG 60 1629
915922 1632 1647 25395 25410 ATCTGCTAGACTCGCC 86 1630
915942 1684 1699 25447 25462 GCAATGCGGAGGTAGC 38 1631
915962 1767 1782 25530 25545 AAAGGTTGCTTCCTAG 77 1632
915982 1787 1802 25550 25565 GCTGGACCGCTGCACA 79 1633
916002 1814 1829 25577 25592 ACGCATGCTGATGTAT 72 1634
916022 1841 1856 25604 25619 GGTGTCATTTCCCAAC 80 1635
916042 1883 1898 25646 25661 CCACGAAACAGTCAGT 87 1636
916062 1912 1927 25675 25690 ATGCTGGAACAGTCTG 78 1637
916082 1943 1958 25706 25721 CCATCCAAACACCTGT 64 1638
916102 1976 1991 25739 25754 GGGCCAGCCTACCCCC 0 1639
916122 2025 2040 25788 25803 GAAGTGGGATCATGCT 71 1640
916141 2097 2112 25860 25875 ATCATCTTTGCAGACC 91 1641
916161 2138 2153 25901 25916 TTGTTACCCCCGCCAT 89 1642
916181 2259 2274 26022 26037 CTGATTCACATAATAC 91 1643
916201 2623 2638 26386 26401 CCTGCACACTAGATTA 59 1644
916221 2676 2691 26439 26454 AGGCGGAAGCTCCTGC 0 1645
916241 2706 2721 26469 26484 AGGTTCAAGTTGTGTG 87 1646
916281 N/A N/A 4224 4239 AATGTACGGAATCTCA 83 1647
916301 N/A N/A 4810 4825 GTCCATGTGGGTGTCC 74 1648
916321 N/A N/A 5399 5414 GGCCTTAATGCTATCA 13 1649
916341 N/A N/A 5711 5726 TAGTATGAAATATCTC 96 1650
916361 N/A N/A 6862 6877 ATTGTAACTGCCAGGC 0 1651
916381 N/A N/A 7471 7486 CCGGTATTCATTAGCA 0 1652
916401 N/A N/A 7728 7743 GAGCAGGGCAACAAAC 22 1653
916561 N/A N/A 12315 12330 ATATAACCACAGCCTG 54 1654
916581 N/A N/A 12906 12921 GCTTATAAAGCACACG 94 1655
916601 N/A N/A 13702 13717 TAGTAAATGCTTGTCA 95 1656
916621 N/A N/A 14123 14138 GGCAGAAATGTGCTCT 60 1657
916641 N/A N/A 14632 14647 CTTCATGCCATCCTGT 83 1658
916661 N/A N/A 15430 15445 TGCTCTTACAGCATTG 0 1659
916681 N/A N/A 16262 16277 GGTACCTGTAGCGAGC 0 1660
916701 N/A N/A 17197 17212 TTGACTTAGTCCGTGT 93 1661
916721 N/A N/A 18220 18235 AGCTACATCAGGCTGG 0 1662
916741 N/A N/A 19244 19259 TGCACATAGACTGTGA 0 1663
916760 N/A N/A 20373 20388 GACTGCTGAGCCAAGC 61 1664
916780 N/A N/A 20657 20672 AGAAATTGCAGTGCCC 92 1665
916800 N/A N/A 20988 21003 GGTATTAAACTGCCAA 0 1666
916820 N/A N/A 21447 21462 ТСАСТААССААТАТАС 47 1667
916840 N/A N/A 22602 22617 ATAAATCTGCAAGAGC 62 1668
916860 N/A N/A 23369 23384 TCTCATGGTCAAGACC 52 1669
916880 N/A N/A 24305 24320 GACTGCTAGGCTTCAC 54 1670
916900 N/A N/A 25100 25115 CGCTGCTGCAGTGTGC 34 1671
Набор праймеров и зондов для человека RTS36075 (прямая последовательность TGAGGCTGGAGGGAGATG, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 14; обратная последовательность GCTCATGTATCCACCTTTGTCT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 15; последовательность зонда CTAGACCACCTGCGTCTCAGCATC, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 16) также использовали для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA PNPLA3 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента подавления PNPLA3 относительно необработанных контрольных клеток.
- 99 047395
Таблица 25
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
898558 581 596 N/A N/A GGCATCCACGACTTCG 87 1672
912709 27 42 2765 2780 GGCATTCCCAGCGCGA 0 17
912710 95 ПО 2833 2848 TCCTGATCCGCAGCAG 0 18
912711 103 118 2841 2856 GGCTCGGGTCCTGATC 0 19
912712 131 146 2869 2884 GTTAGGATCTGGGTCG 76 20
912713 164 179 2902 2917 GTACATGGCGGCGGCG 0 21
912714 183 198 2921 2936 TCCAGCCGCGCTCTGC 29 22
912715 196 211 2934 2949 GCGAAGGACAAGCTCC 31 23
912716 197 212 2935 2950 CGCGAAGGACAAGCTC 0 24
912717 272 287 ЗОЮ 3025 GCGGAGGAGGTGCGGG 0 25
912718 273 288 ЗОН 3026 CGCGGAGGAGGTGCGG 0 26
912719 274 289 3012 3027 TCGCGGAGGAGGTGCG 16 27
912720 290 305 3028 3043 GAACAACATGCGCGCG 0 28
912721 291 306 3029 3044 CGAACAACATGCGCGC 2 29
912722 292 307 3030 3045 CCGAACAACATGCGCG 0 30
912723 293 308 3031 3046 GCCGAACAACATGCGC 0 31
912724 294 309 3032 3047 CGCCGAACAACATGCG 0 32
912725 323 338 3061 3076 GCCGACGCAGTGCAAC 0 33
912726 324 339 3062 3077 CGCCGACGCAGTGCAA 0 34
912727 340 355 3078 3093 GGGATACCGGAGAGGA 32 35
912728 370 385 5944 5959 TCTGAGAGGACCTGCA 31 36
912729 375 390 5949 5964 CAAGATCTGAGAGGAC 60 37
912730 404 419 5978 5993 GCCAATGTTCCGACTC 52 38
912731 410 425 5984 5999 GAAGATGCCAATGTTC 31 39
912732 429 444 6003 6018 TTAAGTTGAAGGATGG 93 40
912733 432 447 6006 6021 TGCTTAAGTTGAAGGA 82 41
912734 478 493 6052 6067 TGGACATTGGCCGGGA 73 42
912735 479 494 6053 6068 GTGGACATTGGCCGGG 44 43
912736 484 499 6058 6073 AGCTGGTGGACATTGG 29 44
912737 528 543 6102 6117 CATCAGACACTCTGGT 0 45
912738 531 546 6105 6120 CCCCATCAGACACTCT 55 46
912739 552 567 6126 6141 AGTCAGACACCAGAAC 23 47
912740 582 597 N/A N/A AGGCATCCACGACTTC 40 1673
912741 584 599 N/A N/A CAAGGCATCCACGACT 55 1674
912742 591 606 N/A N/A AACATACCAAGGCATC 59 1675
912743 593 608 N/A N/A GGAACATACCAAGGCA 69 1676
912744 594 609 7824 7839 AGGAACATACCAAGGC 85 1677
912745 625 640 7855 7870 GGGATAAGGCCACTGT 71 1678
912746 626 641 7856 7871 AGGGATAAGGCCACTG 12 1679
912747 630 645 7860 7875 AAGGAGGGATAAGGCC 0 1680
- 100 047395
912748 652 667 N/A N/A ACATATCGCACGCCTC 35 1681
912749 653 668 N/A N/A CACATATCGCACGCCT 3 1682
912750 654 669 N/A N/A CCACATATCGCACGCC 27 1683
912751 656 671 N/A N/A ATCCACATATCGCACG 24 1684
912752 660 675 11878 11893 CTCCATCCACATATCG 87 1685
912753 689 704 11907 11922 ATCAATGAAGGGTACG 79 1686
912754 690 705 11908 11923 CATCAATGAAGGGTAC 63 1687
912755 693 708 11911 11926 TGGCATCAATGAAGGG 68 48
912756 698 713 11916 11931 TGTTTTGGCATCAATG 88 49
912757 746 761 11964 11979 TTTAGGGCAGATGTCG 75 50
912758 747 762 11965 11980 CTTTAGGGCAGATGTC 82 51
912759 795 810 12013 12028 GTAGACTGAGCTTGGT 96 52
912760 820 835 12038 12053 AGGTAGAGGTTCCCTG 0 53
912761 841 856 12059 12074 GGGACAAAAGCTCTCG 0 54
912762 873 888 13609 13624 GGCATATCTCTCCCAG 0 55
912763 874 889 13610 13625 AGGCATATCTCTCCCA 0 56
912764 886 901 13622 13637 AAATATCCTCGAAGGC 71 57
912765 888 903 13624 13639 CCAAATATCCTCGAAG 37 58
912766 889 904 13625 13640 TCCAAATATCCTCGAA 0 59
912767 894 909 13630 13645 ATGCATCCAAATATCC 42 60
912768 925 940 N/A N/A TTGCAGATGCCCTTCT 5 61
912769 968 983 16088 16103 ATCCATCCCTTCTGAG 6 62
912770 986 1001 16106 16121 GGGCATGGCGACCTCA 0 63
912771 1004 1019 16124 16139 ACTCATGTTTGCCCAG 67 64
912782 1195 1210 19035 19050 AGCAAGTTGCAAATCT 71 75
912783 1199 1214 19039 19054 GGGTAGCAAGTTGCAA 37 76
912784 1205 1220 19045 19060 CCTAATGGGTAGCAAG 25 77
912785 1206 1221 19046 19061 TCCTAATGGGTAGCAA 64 78
- 101 047395
Таблица 26
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
912786 1207 1222 19047 19062 ATCCTAATGGGTAGCA 65 79
912787 1211 1226 19051 19066 CATTATCCTAATGGGT 43 80
912788 1212 1227 19052 19067 ACATTATCCTAATGGG 0 81
912789 1213 1228 19053 19068 GACATTATCCTAATGG 59 82
912790 1220 1235 19060 19075 TACATAAGACATTATC 8 83
912791 1224 1239 19064 19079 GCATTACATAAGACAT 86 84
912792 1245 1260 19085 19100 CCACAGGCAGGGTACA 58 85
912793 1246 1261 19086 19101 TCCACAGGCAGGGTAC 5 86
912794 1253 1268 19093 19108 GGCAGATTCCACAGGC 68 87
912795 1259 1274 19099 19114 CGCAATGGCAGATTCC 84 88
912796 1265 1280 19105 19120 GACAATCGCAATGGCA 63 89
912797 1266 1281 19106 19121 GGACAATCGCAATGGC 54 90
912798 1267 1282 19107 19122 TGGACAATCGCAATGG 59 91
912799 1285 1300 23690 23705 AGCCATGTCACCAGTC 51 92
912800 1289 1304 23694 23709 TGGAAGCCATGTCACC 32 93
912801 1290 1305 23695 23710 CTGGAAGCCATGTCAC 44 94
912802 1297 1312 23702 23717 GGCATATCTGGAAGCC 0 95
912803 1298 1313 23703 23718 GGGCATATCTGGAAGC 0 96
912804 1351 1366 23756 23771 AGCACTCGAGTGAACA 6 97
912805 1386 1401 N/A N/A GCATTTGGGACCTGGA 54 98
912806 1387 1402 N/A N/A GGCATTTGGGACCTGG 33 99
912807 1388 1403 25151 25166 TGGCATTTGGGACCTG 0 100
912808 1394 1409 25157 25172 GCTCACTGGCATTTGG 7 101
912809 1523 1538 25286 25301 GTTCAGGCTGGACCTG 17 102
912810 1547 1562 25310 25325 AGGTACTTTATTGCCC 30 103
912811 1550 1565 25313 25328 AGCAGGTACTTTATTG 55 104
912812 1653 1668 25416 25431 AACTTTAGCACCTCTG 87 105
912813 1655 1670 25418 25433 GAAACTTTAGCACCTC 85 106
912814 1656 1671 25419 25434 GGAAACTTTAGCACCT 26 107
912815 1669 1684 25432 25447 CTGCACAAAGATGGGA 66 108
- 102 047395
912816 1671 1686 25434 25449 AGCTGCACAAAGATGG 41 109
912817 1685 1700 25448 25463 AGCAATGCGGAGGTAG 35 ПО
912818 1740 1755 25503 25518 ACCAACTCAGCTCAGA 76 111
912819 1741 1756 25504 25519 AACCAACTCAGCTCAG 77 112
912820 1757 1772 25520 25535 TCCTAGCTTTTCATAA 18 113
912821 1788 1803 25551 25566 TGCTGGACCGCTGCAC 1 114
912822 1796 1811 25559 25574 GAGTTAAGTGCTGGAC 90 115
912823 1802 1817 25565 25580 GTATTAGAGTTAAGTG 86 116
912824 1803 1818 25566 25581 TGTATTAGAGTTAAGT 79 117
912825 1806 1821 25569 25584 TGATGTATTAGAGTTA 89 118
912826 1808 1823 25571 25586 GCTGATGTATTAGAGT 79 119
912827 1821 1836 25584 25599 TGAATTAACGCATGCT 73 120
912828 1822 1837 25585 25600 CTGAATTAACGCATGC 69 121
912829 1870 1885 25633 25648 AGTAAGGGACCCTCTG 0 122
912830 1871 1886 25634 25649 CAGTAAGGGACCCTCT 44 123
912831 1872 1887 25635 25650 TCAGTAAGGGACCCTC 67 124
912832 1874 1889 25637 25652 AGTCAGTAAGGGACCC 50 125
912833 1893 1908 25656 25671 ATTAATAGGGCCACGA 78 126
912834 1895 1910 25658 25673 CCATTAATAGGGCCAC 72 127
912835 1896 1911 25659 25674 ACCATTAATAGGGCCA 65 128
912836 1906 1921 25669 25684 GAACAGTCTGACCATT 82 129
912837 1908 1923 25671 25686 TGGAACAGTCTGACCA 39 130
912838 1909 1924 25672 25687 CTGGAACAGTCTGACC 84 131
912839 1911 1926 25674 25689 TGCTGGAACAGTCTGA 72 132
912840 1916 1931 25679 25694 CCTCATGCTGGAACAG 84 133
912841 1928 1943 25691 25706 TCATTCTAAGAACCTC 87 134
912842 1945 1960 25708 25723 АСССАТССАААСАССТ 18 135
912843 1982 1997 25745 25760 ACACATGGGCCAGCCT 46 136
912844 1989 2004 25752 25767 CAAGATCACACATGGG 71 137
912845 2057 2072 25820 25835 GGGACGAACTGCACCC 0 138
912846 2098 2113 25861 25876 TATCATCTTTGCAGAC 68 139
912847 2116 2131 25879 25894 GTTTTTAGTAGTCAAG 90 140
912848 2117 2132 25880 25895 CGTTTTTAGTAGTCAA 94 141
912849 2145 2160 25908 25923 TATCATCTTGTTACCC 87 142
912850 2148 2163 25911 25926 GATTATCATCTTGTTA 60 143
912851 2150 2165 25913 25928 TAGATTATCATCTTGT 50 144
912852 2151 2166 25914 25929 GTAGATTATCATCTTG 72 145
912853 2152 2167 25915 25930 AGTAGATTATCATCTT 79 146
912854 2175 2190 25938 25953 GTGAAAAAGGTGTTCT 64 147
912855 2182 2197 25945 25960 TAGTTAGGTGAAAAAG 77 148
912856 2188 2203 25951 25966 TTATTTTAGTTAGGTG 82 149
912857 2190 2205 25953 25968 CATTATTTTAGTTAGG 77 150
912858 2273 2288 26036 26051 СТАСТААСАТСТСАСТ 48 151
912859 2274 2289 26037 26052 ТСТАСТААСАТСТСАС 91 152
912860 2278 2293 26041 26056 ТТАТТСТАСТААСАТС 37 153
912861 2280 2295 26043 26058 GCTTATTCTACTAACA 77 154
912862 2281 2296 26044 26059 GGCTTATTCTACTAAC 70 155
912863 2632 2647 26395 26410 GGTGAATGCCCTGCAC 42 156
Исследование 2.
Культивируемые клетки А431 при плотности 5000 клеток на лунку трансфицировали путем свободного поглощения с помощью 1000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составлявшего примерно 24 ч, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни mRNA PNPLA3 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней mRNA использовали набор праймеров и зондов для человека RTS36070. Уровни mRNA PNPLA3 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента подавления PNPLA3 относительно необработанных контрольных клеток.
- 103 047395
Таблица 27
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 97 702
959270 413 428 5987 6002 ATGGAAGATGCCAATG 32 1688
959280 491 506 6065 6080 GGAGATGAGCTGGTGG 66 1689
959290 793 808 12011 12026 AGACTGAGCTTGGTGA 78 1690
959300 899 914 13635 13650 CCTGAATGCATCCAAA 69 1691
959310 1084 1099 16204 16219 ATGCTGAGACGCAGGT 0 1692
959320 1256 1271 19096 19111 AATGGCAGATTCCACA 25 1693
959330 1642 1657 25405 25420 CTCTGAAAGAATCTGC 75 1694
959340 1659 1674 25422 25437 ATGGGAAACTTTAGCA 77 1695
959350 1839 1854 25602 25617 TGTCATTTCCCAACCA 79 1696
959360 2114 2129 25877 25892 TTTTAGTAGTCAAGGT 88 1697
959370 2223 2238 25986 26001 GCTTCCTTACATTTTT 85 1698
959380 2269 2284 26032 26047 TAACATCTCACTGATT 42 1699
959390 N/A N/A 4311 4326 CTAGTGAGAAACAAAC 0 1700
959400 N/A N/A 4761 4776 TTATTGTTGCTAAACC 32 1701
959410 N/A N/A 4863 4878 ACTTTAGGCTCCTGGG 60 1702
959420 N/A N/A 5285 5300 AGCCATAAATCTTGGG 24 1703
959430 N/A N/A 5573 5588 ATGACATCATGGCTTC 93 1704
959440 N/A N/A 5603 5618 TTATTCAATGTGGCTT 95 1705
959450 N/A N/A 5640 5655 GGGCTCAATGAAATTA 12 1706
959460 N/A N/A 5713 5728 CTTAGTATGAAATATC 86 1707
959470 N/A N/A 5808 5823 TACTGTCTACTATGGG 91 1708
959480 N/A N/A 6157 6172 CTTACATCCACGACTT 35 1709
959660 N/A N/A 12153 12168 CAGTAACTGGTAGCTC 74 1710
959670 N/A N/A 12169 12184 TGTTTGATTGTGCAGA 95 1711
959680 N/A N/A 12210 12225 CGCCTTTTATTTCCGT 92 1712
959690 N/A N/A 12313 12328 ATAACCACAGCCTGGG 66 1713
959700 N/A N/A 12675 12690 ATAAGAATCATCTTAG 7 1714
959710 N/A N/A 12711 12726 ACTACCGAACGCAGTT 41 1715
959720 N/A N/A 12757 12772 TAGAGTGGTAAGGCAT 84 1716
959730 N/A N/A 12793 12808 GGTTGGTGTACATGGT 96 1717
959740 N/A N/A 12880 12895 TCCTGTTAGACAGCTT 93 1718
959750 N/A N/A 12902 12917 ATAAAGCACACGGGAA 86 1719
959760 N/A N/A 12931 12946 TAAGAGCTGTCTCCTC 85 1720
959770 N/A N/A 12972 12987 CTAACAAACTTTGCAG 79 1721
- 104 047395
959780 N/A N/A 13392 13407 TGTCACCCTTCCACGG 15 1722
959790 N/A N/A 13526 13541 ATTGGAAGACCGCAGA 43 1723
959800 N/A N/A 13706 13721 CCGCTAGTAAATGCTT 44 1724
959810 N/A N/A 13737 13752 AACTAAGGCAAATCTC 77 1725
959820 N/A N/A 13915 13930 GAGTCATGACATCCCA 89 1726
959830 N/A N/A 14299 14314 GCAGATAAATACACAT 93 1727
959840 N/A N/A 14424 14439 TTTCCCATCGACACAG 78 1728
959850 N/A N/A 14571 14586 GCTCCTACTTATCCCC 76 1729
959860 N/A N/A 15202 15217 TATTGCCAGGTATCTG 64 1730
959870 N/A N/A 15599 15614 CAATACATAGCAGAGC 23 1731
959880 N/A N/A 17192 17207 TTAGTCCGTGTTCAGG 90 1732
959890 N/A N/A 17222 17237 GTAGCTGGTTTGTGGG 20 1733
959900 N/A N/A 17295 17310 CATCTCTTAGGGCACC 79 1734
959910 N/A N/A 18393 18408 GTTTGGAAGTCGCCAT 77 1735
959920 N/A N/A 20284 20299 AGGAAGCCCAATCAAG 85 1736
959930 N/A N/A 20512 20527 CAGATTGAGTCTCCTG 10 1737
959940 N/A N/A 20607 20622 TTTTACGATCATCATT 72 1738
959950 N/A N/A 20661 20676 GCTTAGAAATTGCAGT 75 1739
959960 N/A N/A 20812 20827 AGGGTAATATTCAGAC 86 1740
959970 N/A N/A 20934 20949 TGTAGCAGACAGATCA 74 1741
959980 N/A N/A 21000 21015 TTTAACAGCTCAGGTA 66 1742
959990 N/A N/A 21405 21420 ATTCTAGACATGGCCA 51 1743
960000 N/A N/A 21442 21457 AACCAATATACTGAGA 71 1744
960010 N/A N/A 21545 21560 AGACATATGACATTTC 91 1745
960020 N/A N/A 22765 22780 ACATGACAGACTAACT 55 1746
960030 N/A N/A 24039 24054 CATCAATGCTGCACTC 13 1747
Таблица 28
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, старто- SEQ ID NO: 1, стоп- SEQ ID NO: 2, старто- SEQ ID NO: 2, стоп- Последовательность (5'-3') % подавления SEQ ID NO
- 105 047395
вый сайт сайт вый сайт сайт PNPLA3
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959271 425 440 5999 6014 GTTGAAGGATGGATGG 90 1748
959281 511 526 6085 6100 AGAGAGATGCCTATTT 73 1749
959291 813 828 12031 12046 GGTTCCCTGTGCAGAG 79 1750
959301 904 919 13640 13655 AAGAACCTGAATGCAT 48 1751
959311 1085 1100 16205 16220 GATGCTGAGACGCAGG 0 1752
959321 1602 1617 25365 25380 ACAGACTCTTCTCTAG 45 1753
959331 1643 1658 25406 25421 CCTCTGAAAGAATCTG 81 1754
959341 1673 1688 25436 25451 GTAGCTGCACAAAGAT 69 1755
959351 1842 1857 25605 25620 TGGTGTCATTTCCCAA 19 1756
959361 2115 2130 25878 25893 TTTTTAGTAGTCAAGG 91 1757
959371 2240 2255 26003 26018 ATTCAACAGGTAACAA 69 1758
959381 2271 2286 26034 26049 ACTAACATCTCACTGA 33 1759
959391 N/A N/A 4313 4328 AGCTAGTGAGAAACAA 47 1760
959401 N/A N/A 4764 4779 CTTTTATTGTTGCTAA 77 1761
959411 N/A N/A 4868 4883 AGTGTACTTTAGGCTC 90 1762
959421 N/A N/A 5286 5301 CAGCCATAAATCTTGG 0 1763
959431 N/A N/A 5574 5589 AATGACATCATGGCTT 74 1764
959441 N/A N/A 5604 5619 TTTATTCAATGTGGCT 96 1765
959451 N/A N/A 5642 5657 TTGGGCTCAATGAAAT 0 1766
959461 N/A N/A 5714 5729 GCTTAGTATGAAATAT 78 1767
959471 N/A N/A 5809 5824 GTACTGTCTACTATGG 78 1768
959481 N/A N/A 6160 6175 CTGCTTACATCCACGA 4 1769
959661 N/A N/A 12154 12169 ACAGTAACTGGTAGCT 72 1770
959671 N/A N/A 12170 12185 CTGTTTGATTGTGCAG 50 1771
959681 N/A N/A 12211 12226 GCGCCTTTTATTTCCG 14 1772
959691 N/A N/A 12322 12337 CCTGACTATATAACCA 56 1773
959701 N/A N/A 12689 12704 GACCGTGTTTCCAAAT 97 1774
959711 N/A N/A 12712 12727 AACTACCGAACGCAGT 48 1775
959721 N/A N/A 12759 12774 GGTAGAGTGGTAAGGC 95 1776
959731 N/A N/A 12828 12843 CATAGCCTTCTTTCTT 93 1777
959741 N/A N/A 12882 12897 AATCCTGTTAGACAGC 90 1778
- 106 047395
959751 N/A N/A 12903 12918 TATAAAGCACACGGGA 82 1779
959761 N/A N/A 12933 12948 AATAAGAGCTGTCTCC 87 1780
959771 N/A N/A 12974 12989 CCCTAACAAACTTTGC 62 1781
959781 N/A N/A 13394 13409 AATGTCACCCTTCCAC 90 1782
959791 N/A N/A 13527 13542 CATTGGAAGACCGCAG 76 1783
959801 N/A N/A 13707 13722 ACCGCTAGTAAATGCT 35 1784
959811 N/A N/A 13740 13755 TAGAACTAAGGCAAAT 65 1785
959821 N/A N/A 13916 13931 GGAGTCATGACATCCC 42 1786
959831 N/A N/A 14302 14317 TGAGCAGATAAATACA 75 1787
959841 N/A N/A 14425 14440 CTTTCCCATCGACACA 79 1788
959851 N/A N/A 14573 14588 GCGCTCCTACTTATCC 0 1789
959861 N/A N/A 15203 15218 ATATTGCCAGGTATCT 67 1790
959871 N/A N/A 15763 15778 GTGTTGGTTTATAACA 13 1791
959881 N/A N/A 17194 17209 ACTTAGTCCGTGTTCA 45 1792
959891 N/A N/A 17224 17239 CTGTAGCTGGTTTGTG 42 1793
959901 N/A N/A 17296 17311 CCATCTCTTAGGGCAC 53 1794
959911 N/A N/A 18394 18409 TGTTTGGAAGTCGCCA 87 1795
959921 N/A N/A 20289 20304 ATCAGAGGAAGCCCAA 84 1796
959931 N/A N/A 20514 20529 ACCAGATTGAGTCTCC 91 1797
959941 N/A N/A 20613 20628 CTCTAATTTTACGATC 70 1798
959951 N/A N/A 20662 20677 AGCTTAGAAATTGCAG 0 1799
959961 N/A N/A 20813 20828 CAGGGTAATATTCAGA 87 1800
959971 N/A N/A 20936 20951 TTTGTAGCAGACAGAT 18 1801
959981 N/A N/A 21001 21016 TTTTAACAGCTCAGGT 71 1802
959991 N/A N/A 21406 21421 AATTCTAGACATGGCC 25 1803
960001 N/A N/A 21443 21458 TAACCAATATACTGAG 72 1804
960011 N/A N/A 22023 22038 CGCAAAAAGACAACGA 16 1805
960021 N/A N/A 22766 22781 GACATGACAGACTAAC 76 1806
960031 N/A N/A 24040 24055 CCATCAATGCTGCACT 61 1807
- 107 047395
Таблица 29
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 97 702
959272 426 441 6000 6015 AGTTGAAGGATGGATG 76 1808
959282 517 532 6091 6106 CTGGTAAGAGAGATGC 64 1809
959292 815 830 12033 12048 GAGGTTCCCTGTGCAG 81 1810
959302 905 920 13641 13656 CAAGAACCTGAATGCA 65 1811
959312 1087 1102 16207 16222 AGGATGCTGAGACGCA 66 1812
959322 1604 1619 25367 25382 TCACAGACTCTTCTCT 50 1813
959332 1644 1659 25407 25422 ACCTCTGAAAGAATCT 69 1814
959342 1675 1690 25438 25453 AGGTAGCTGCACAAAG 78 1815
959352 1903 1918 25666 25681 CAGTCTGACCATTAAT 77 1816
959362 2173 2188 25936 25951 GAAAAAGGTGTTCTAA 85 1817
959372 2242 2257 26005 26020 AAATTCAACAGGTAAC 62 1818
959382 2275 2290 26038 26053 TTCTACTAACATCTCA 80 1819
959392 N/A N/A 4732 4747 ATGATCATGTGGCGGT 80 1820
959402 N/A N/A 4765 4780 ACTTTTATTGTTGCTA 86 1821
959412 N/A N/A 4869 4884 GAGTGTACTTTAGGCT 94 1822
959422 N/A N/A 5389 5404 CTATCAGGTGCAGGAG 93 1823
959432 N/A N/A 5575 5590 CAATGACATCATGGCT 90 1824
959442 N/A N/A 5607 5622 TACTTTATTCAATGTG 0 1825
959452 N/A N/A 5643 5658 ATTGGGCTCAATGAAA 35 1826
959462 N/A N/A 5716 5731 TGGCTTAGTATGAAAT 80 1827
959472 N/A N/A 5864 5879 TTTGGCAAGGCCAGAA 0 1828
959482 N/A N/A 6960 6975 GCATAGAGGAAGCTCG 32 1829
959662 N/A N/A 12155 12170 GACAGTAACTGGTAGC 92 1830
959672 N/A N/A 12172 12187 TTCTGTTTGATTGTGC 97 1831
959682 N/A N/A 12280 12295 AGGTCTGGGTATATGT 93 1832
959692 N/A N/A 12323 12338 CCCTGACTATATAACC 32 1833
959702 N/A N/A 12691 12706 TTGACCGTGTTTCCAA 94 1834
959712 N/A N/A 12713 12728 AAACTACCGAACGCAG 92 1835
959722 N/A N/A 12760 12775 TGGTAGAGTGGTAAGG 94 1836
- 108 047395
959732 N/A N/A 12829 12844 GCATAGCCTTCTTTCT 87 1837
959742 N/A N/A 12883 12898 CAATCCTGTTAGACAG 13 1838
959752 N/A N/A 12904 12919 TTATAAAGCACACGGG 87 1839
959762 N/A N/A 12934 12949 CAATAAGAGCTGTCTC 81 1840
959772 N/A N/A 13370 13385 TGCAGGCACCCCAGCA 0 1841
959782 N/A N/A 13395 13410 GAATGTCACCCTTCCA 90 1842
959792 N/A N/A 13528 13543 TCATTGGAAGACCGCA 84 1843
959802 N/A N/A 13708 13723 GACCGCTAGTAAATGC 57 1844
959812 N/A N/A 13741 13756 TTAGAACTAAGGCAAA 78 1845
959822 N/A N/A 13917 13932 TGGAGTCATGACATCC 0 1846
959832 N/A N/A 14303 14318 CTGAGCAGATAAATAC 74 1847
959842 N/A N/A 14553 14568 AGTCTTAATGTGGATT 76 1848
959852 N/A N/A 14667 14682 AGTGTCCCCATCCCCA 54 1849
959862 N/A N/A 15204 15219 AATATTGCCAGGTATC 56 1850
959872 N/A N/A 15765 15780 TAGTGTTGGTTTATAA 89 1851
959882 N/A N/A 17196 17211 TGACTTAGTCCGTGTT 43 1852
959892 N/A N/A 17225 17240 TCTGTAGCTGGTTTGT 61 1853
959902 N/A N/A 17298 17313 TCCCATCTCTTAGGGC 24 1854
959912 N/A N/A 18396 18411 TATGTTTGGAAGTCGC 91 1855
959922 N/A N/A 20290 20305 AATCAGAGGAAGCCCA 40 1856
959932 N/A N/A 20515 20530 AACCAGATTGAGTCTC 72 1857
959942 N/A N/A 20614 20629 TCTCTAATTTTACGAT 23 1858
959952 N/A N/A 20663 20678 CAGCTTAGAAATTGCA 24 1859
959962 N/A N/A 20814 20829 CCAGGGTAATATTCAG 87 1860
959972 N/A N/A 20937 20952 CTTTGTAGCAGACAGA 50 1861
959982 N/A N/A 21003 21018 TATTTTAACAGCTCAG 94 1862
959992 N/A N/A 21409 21424 TGCAATTCTAGACATG 12 1863
960002 N/A N/A 21445 21460 ACTAACCAATATACTG 55 1864
960012 N/A N/A 22541 22556 CAACAGATTACTGGAC 28 1865
960022 N/A N/A 22768 22783 AGGACATGACAGACTA 66 1866
960032 N/A N/A 24041 24056 ACCATCAATGCTGCAC 79 1867
- 109 047395
Таблица 30
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959273 427 442 6001 6016 AAGTTGAAGGATGGAT 86 1868
959283 694 709 11912 11927 TTGGCATCAATGAAGG 73 1869
959293 816 831 12034 12049 AGAGGTTCCCTGTGCA 80 1870
959303 906 921 13642 13657 CCAAGAACCTGAATGC 65 1871
959313 1090 1105 16210 16225 GGCAGGATGCTGAGAC 43 1872
959323 1605 1620 25368 25383 CTCACAGACTCTTCTC 81 1873
959333 1646 1661 25409 25424 GCACCTCTGAAAGAAT 51 1874
959343 1677 1692 25440 25455 GGAGGTAGCTGCACAA 73 1875
959353 1904 1919 25667 25682 ACAGTCTGACCATTAA 85 1876
959363 2179 2194 25942 25957 TTAGGTGAAAAAGGTG 91 1877
959373 2258 2273 26021 26036 TGATTCACATAATACA 71 1878
959383 2277 2292 26040 26055 TATTCTACTAACATCT 38 1879
959393 N/A N/A 4733 4748 AATGATCATGTGGCGG 93 1880
959403 N/A N/A 4767 4782 TGACTTTTATTGTTGC 87 1881
959413 N/A N/A 4870 4885 TGAGTGTACTTTAGGC 94 1882
959423 N/A N/A 5392 5407 ATGCTATCAGGTGCAG 0 1883
959433 N/A N/A 5578 5593 GCACAATGACATCATG 86 1884
959443 N/A N/A 5608 5623 TTACTTTATTCAATGT 9 1885
959453 N/A N/A 5644 5659 TATTGGGCTCAATGAA 80 1886
959463 N/A N/A 5798 5813 TATGGGAGCCACATGT 4 1887
959473 N/A N/A 5866 5881 CTTTTGGCAAGGCCAG 0 1888
959483 N/A N/A 7199 7214 TTAAACAGAGGATGCA 31 1889
959663 N/A N/A 12156 12171 AGACAGTAACTGGTAG 75 1890
959673 N/A N/A 12199 12214 TCCGTTAACCATCAAG 95 1891
959683 N/A N/A 12282 12297 TTAGGTCTGGGTATAT 94 1892
- 110 047395
959693 N/A N/A 12324 12339 CCCCTGACTATATAAC 0 1893
959703 N/A N/A 12692 12707 CTTGACCGTGTTTCCA 97 1894
959713 N/A N/A 12715 12730 TTAAACTACCGAACGC 95 1895
959723 N/A N/A 12761 12776 ATGGTAGAGTGGTAAG 77 1896
959733 N/A N/A 12832 12847 ATTGCATAGCCTTCTT 95 1897
959743 N/A N/A 12884 12899 CCAATCCTGTTAGACA 83 1898
959753 N/A N/A 12908 12923 CTGCTTATAAAGCACA 2 1899
959763 N/A N/A 12935 12950 ACAATAAGAGCTGTCT 85 1900
959773 N/A N/A 13372 13387 TTTGCAGGCACCCCAG 63 1901
959783 N/A N/A 13396 13411 TGAATGTCACCCTTCC 53 1902
959793 N/A N/A 13531 13546 GCATCATTGGAAGACC 86 1903
959803 N/A N/A 13713 13728 ACCAAGACCGCTAGTA 38 1904
959813 N/A N/A 13743 13758 TGTTAGAACTAAGGCA 79 1905
959823 N/A N/A 13919 13934 CCTGGAGTCATGACAT 7 1906
959833 N/A N/A 14304 14319 TCTGAGCAGATAAATA 39 1907
959843 N/A N/A 14554 14569 AAGTCTTAATGTGGAT 84 1908
959853 N/A N/A 14669 14684 TTAGTGTCCCCATCCC 78 1909
959863 N/A N/A 15205 15220 GAATATTGCCAGGTAT 86 1910
959873 N/A N/A 15766 15781 TTAGTGTTGGTTTATA 92 1911
959883 N/A N/A 17198 17213 TTTGACTTAGTCCGTG 86 1912
959893 N/A N/A 17226 17241 CTCTGTAGCTGGTTTG 82 1913
959903 N/A N/A 17601 17616 TTGATAGTGAATGTGT 83 1914
959913 N/A N/A 18397 18412 ATATGTTTGGAAGTCG 91 1915
959923 N/A N/A 20291 20306 CAATCAGAGGAAGCCC 34 1916
959933 N/A N/A 20516 20531 TAACCAGATTGAGTCT 66 1917
959943 N/A N/A 20615 20630 GTCTCTAATTTTACGA 53 1918
959953 N/A N/A 20664 20679 ACAGCTTAGAAATTGC 89 1919
959963 N/A N/A 20843 20858 CTGTATTAGCTCAATA 67 1920
959973 N/A N/A 20938 20953 TCTTTGTAGCAGACAG 84 1921
959983 N/A N/A 21004 21019 TTATTTTAACAGCTCA 92 1922
959993 N/A N/A 21410 21425 CTGCAATTCTAGACAT 29 1923
960003 N/A N/A 21535 21550 CATTTCAGAGTATAAG 46 1924
960013 N/A N/A 22708 22723 GATGTGAGTGAAATAA 69 1925
960023 N/A N/A 22769 22784 AAGGACATGACAGACT 68 1926
960033 N/A N/A 24043 24058 CCACCATCAATGCTGC 58 1927
- 111 047395
Таблица 31
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 99 702
959284 695 710 11913 11928 TTTGGCATCAATGAAG 69 1928
959294 817 832 12035 12050 TAGAGGTTCCCTGTGC 83 1929
959314 1091 1106 16211 16226 GGGCAGGATGCTGAGA 22 1930
959324 1606 1621 25369 25384 ACTCACAGACTCTTCT 68 1931
959334 1647 1662 25410 25425 AGCACCTCTGAAAGAA 67 1932
959344 1678 1693 25441 25456 CGGAGGTAGCTGCACA 85 1933
959354 1926 1941 25689 25704 ATTCTAAGAACCTCAT 51 1934
959384 N/A N/A 4303 4318 AAACAAACCCTCCGTC 10 1935
959394 N/A N/A 4734 4749 AAATGATCATGTGGCG 94 1936
959404 N/A N/A 4768 4783 CTGACTTTTATTGTTG 74 1937
959414 N/A N/A 4871 4886 GTGAGTGTACTTTAGG 98 1938
959424 N/A N/A 5393 5408 AATGCTATCAGGTGCA 31 1939
959434 N/A N/A 5579 5594 TGCACAATGACATCAT 88 1940
959444 N/A N/A 5621 5636 CTACCTGTGTCTTTTA 90 1941
959454 N/A N/A 5647 5662 ATATATTGGGCTCAAT 81 1942
959474 N/A N/A 5867 5882 ACTTTTGGCAAGGCCA 17 1943
959484 N/A N/A 7211 7226 CCGCAAACAAGGTTAA 22 1944
959684 N/A N/A 12283 12298 TTTAGGTCTGGGTATA 93 1945
959694 N/A N/A 12325 12340 CCCCCTGACTATATAA 18 1946
959704 N/A N/A 12693 12708 TCTTGACCGTGTTTCC 97 1947
959734 N/A N/A 12834 12849 GCATTGCATAGCCTTC 96 1948
959744 N/A N/A 12886 12901 AACCAATCCTGTTAGA 59 1949
959754 N/A N/A 12909 12924 TCTGCTTATAAAGCAC 100 1950
959774 N/A N/A 13373 13388 CTTTGCAGGCACCCCA 72 1951
959784 N/A N/A 13398 13413 CTTGAATGTCACCCTT 92 1952
959804 N/A N/A 13715 13730 TTACCAAGACCGCTAG 47 1953
959824 N/A N/A 14228 14243 ACTTTTAGTATTAAAG 0 1954
959844 N/A N/A 14555 14570 AAAGTCTTAATGTGGA 88 1955
959854 N/A N/A 14670 14685 CTTAGTGTCCCCATCC 76 1956
959874 N/A N/A 15767 15782 GTTAGTGTTGGTTTAT 95 1957
959884 N/A N/A 17199 17214 GTTTGACTTAGTCCGT 96 1958
959914 N/A N/A 18398 18413 AATATGTTTGGAAGTC 87 1959
959934 N/A N/A 20518 20533 AGTAACCAGATTGAGT 96 1960
959954 N/A N/A 20665 20680 CACAGCTTAGAAATTG 88 1961
959964 N/A N/A 20844 20859 CCTGTATTAGCTCAAT 92 1962
959974 N/A N/A 20940 20955 CCTCTTTGTAGCAGAC 84 1963
959984 N/A N/A 21006 21021 GGTTATTTTAACAGCT 85 1964
959994 N/A N/A 21412 21427 ACCTGCAATTCTAGAC 61 1965
960014 N/A N/A 22710 22725 AAGATGTGAGTGAAAT 70 1966
960024 N/A N/A 22770 22785 AAAGGACATGACAGAC 87 1967
- 112 047395
Таблица 32
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
959275 440 455 6014 6029 GAGGAACTTGCTTAAG 81 1968
959285 696 711 11914 11929 TTTTGGCATCAATGAA 62 1969
959305 1066 1081 16186 16201 TCTAGCAGCTCATCTC 64 1970
959335 1649 1664 25412 25427 TTAGCACCTCTGAAAG 72 1971
959345 1804 1819 25567 25582 ATGTATTAGAGTTAAG 77 1972
959355 1927 1942 25690 25705 CATTCTAAGAACCTCA 71 1973
959365 2183 2198 25946 25961 TTAGTTAGGTGAAAAA 81 1974
959375 2261 2276 26024 26039 CACTGATTCACATAAT 70 1975
959395 N/A N/A 4737 4752 TGCAAATGATCATGTG 66 1976
959405 N/A N/A 4769 4784 GCTGACTTTTATTGTT 84 1977
959415 N/A N/A 4872 4887 AGTGAGTGTACTTTAG 94 1978
959425 N/A N/A 5395 5410 TTAATGCTATCAGGTG 81 1979
959435 N/A N/A 5580 5595 ATGCACAATGACATCA 86 1980
959445 N/A N/A 5624 5639 ATTCTACCTGTGTCTT 97 1981
959455 N/A N/A 5651 5666 TTGGATATATTGGGCT 97 1982
959475 N/A N/A 5868 5883 TACTTTTGGCAAGGCC 70 1983
959485 N/A N/A 7697 7712 GCACAGAGTAGGTTAA 72 1984
959655 N/A N/A 12146 12161 TGGTAGCTCCTGGCAA 55 1985
959675 N/A N/A 12201 12216 TTTCCGTTAACCATCA 94 1986
959695 N/A N/A 12667 12682 CATCTTAGTGGCTGGG 93 1987
959705 N/A N/A 12695 12710 GTTCTTGACCGTGTTT 97 1988
959715 N/A N/A 12717 12732 GGTTAAACTACCGAAC 11 1989
959725 N/A N/A 12783 12798 CATGGTCTGCAAATTT 89 1990
959745 N/A N/A 12887 12902 AAACCAATCCTGTTAG 46 1991
959755 N/A N/A 12910 12925 ATCTGCTTATAAAGCA 42 1992
959775 N/A N/A 13374 13389 ACTTTGCAGGCACCCC 87 1993
959785 N/A N/A 13399 13414 GCTTGAATGTCACCCT 94 1994
959805 N/A N/A 13716 13731 TTTACCAAGACCGCTA 86 1995
959825 N/A N/A 14230 14245 CAACTTTTAGTATTAA 0 1996
959835 N/A N/A 14417 14432 TCGACACAGCATCACC 62 1997
959855 N/A N/A 14671 14686 TCTTAGTGTCCCCATC 78 1998
959865 N/A N/A 15209 15224 TTAGGAATATTGCCAG 93 1999
959875 N/A N/A 15769 15784 GGGTTAGTGTTGGTTT 94 2000
959895 N/A N/A 17288 17303 TAGGGCACCTCAAGAA 0 2001
959915 N/A N/A 18400 18415 CAAATATGTTTGGAAG 50 2002
959925 N/A N/A 20293 20308 CCCAATCAGAGGAAGC 41 2003
959935 N/A N/A 20599 20614 TCATCATTATTACCTG 91 2004
959955 N/A N/A 20803 20818 TTCAGACCAGGGTAAT 91 2005
959965 N/A N/A 20845 20860 GCCTGTATTAGCTCAA 90 2006
959975 N/A N/A 20941 20956 GCCTCTTTGTAGCAGA 0 2007
959995 N/A N/A 21434 21449 TACTGAGAGGAAATGA 64 2008
960015 N/A N/A 22714 22729 TGTAAAGATGTGAGTG 78 2009
960025 N/A N/A 22772 22787 TCAAAGGACATGACAG 80 2010
960037 N/A N/A 22590 22605 GAGCAACGAGGAAGGA 68 2011
- 113 047395
Таблица 33
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959276 447 462 6021 6036 CCTGTCGGAGGAACTT 37 2012
959286 699 714 11917 11932 TTGTTTTGGCATCAAT 73 2013
959296 895 910 13631 13646 AATGCATCCAAATATC 0 2014
959306 1069 1084 16189 16204 TGGTCTAGCAGCTCAT 25 2015
959316 1221 1236 19061 19076 TTACATAAGACATTAT 35 2016
959326 1614 1629 25377 25392 CTCAAGTGACTCACAG 85 2017
959336 1650 1665 25413 25428 TTTAGCACCTCTGAAA 24 2018
959346 1834 1849 25597 25612 TTTCCCAACCAGCTGA 60 2019
959356 2096 2111 25859 25874 TCATCTTTGCAGACCA 90 2020
959366 2184 2199 25947 25962 TTTAGTTAGGTGAAAA 57 2021
959376 2262 2277 26025 26040 TCACTGATTCACATAA 86 2022
959386 N/A N/A 4306 4321 GAGAAACAAACCCTCC 0 2023
959396 N/A N/A 4738 4753 GTGCAAATGATCATGT 69 2024
959406 N/A N/A 4771 4786 AAGCTGACTTTTATTG 57 2025
959416 N/A N/A 5276 5291 TCTTGGGATGCACAGG 49 2026
959426 N/A N/A 5397 5412 CCTTAATGCTATCAGG 0 2027
959436 N/A N/A 5581 5596 AATGCACAATGACATC 69 2028
959446 N/A N/A 5625 5640 AATTCTACCTGTGTCT 82 2029
959456 N/A N/A 5652 5667 TTTGGATATATTGGGC 95 2030
959466 N/A N/A 5802 5817 CTACTATGGGAGCCAC 64 2031
- 114 047395
959476 N/A N/A 5871 5886 TAATACTTTTGGCAAG 29 2032
959486 N/A N/A 7784 7799 TTATAGGCGAGAGCAC 0 2033
959656 N/A N/A 12147 12162 CTGGTAGCTCCTGGCA 44 2034
959666 N/A N/A 12164 12179 GATTGTGCAGACAGTA 95 2035
959676 N/A N/A 12202 12217 ATTTCCGTTAACCATC 93 2036
959686 N/A N/A 12288 12303 TGAGTTTTAGGTCTGG 96 2037
959696 N/A N/A 12669 12684 ATCATCTTAGTGGCTG 91 2038
959706 N/A N/A 12696 12711 TGTTCTTGACCGTGTT 98 2039
959716 N/A N/A 12719 12734 AAGGTTAAACTACCGA 6 2040
959726 N/A N/A 12785 12800 TACATGGTCTGCAAAT 90 2041
959736 N/A N/A 12838 12853 CATTGCATTGCATAGC 96 2042
959746 N/A N/A 12888 12903 AAAACCAATCCTGTTA 47 2043
959756 N/A N/A 12911 12926 CATCTGCTTATAAAGC 81 2044
959766 N/A N/A 12967 12982 AAACTTTGCAGCCTAT 93 2045
959776 N/A N/A 13376 13391 AGACTTTGCAGGCACC 90 2046
959786 N/A N/A 13400 13415 GGCTTGAATGTCACCC 69 2047
959796 N/A N/A 13697 13712 AATGCTTGTCAAAAGG 70 2048
959806 N/A N/A 13717 13732 CTTTACCAAGACCGCT 82 2049
959816 N/A N/A 13747 13762 TAAGTGTTAGAACTAA 30 2050
959826 N/A N/A 14232 14247 ACCAACTTTTAGTATT 79 2051
959836 N/A N/A 14419 14434 CATCGACACAGCATCA 59 2052
959846 N/A N/A 14557 14572 CCAAAGTCTTAATGTG 53 2053
959856 N/A N/A 14676 14691 CCATCTCTTAGTGTCC 88 2054
959866 N/A N/A 15210 15225 CTTAGGAATATTGCCA 87 2055
959876 N/A N/A 15770 15785 AGGGTTAGTGTTGGTT 89 2056
959886 N/A N/A 17202 17217 TCTGTTTGACTTAGTC 70 2057
959896 N/A N/A 17290 17305 CTTAGGGCACCTCAAG 30 2058
959906 N/A N/A 17735 17750 TAATCTGGTCATATGG 43 2059
959916 N/A N/A 18445 18460 TGCTTACGGAGCATAG 0 2060
959926 N/A N/A 20472 20487 CTCTAGACGGGAAGCT 31 2061
959936 N/A N/A 20601 20616 GATCATCATTATTACC 71 2062
959946 N/A N/A 20652 20667 TTGCAGTGCCCTGGCC 31 2063
959956 N/A N/A 20804 20819 ATTCAGACCAGGGTAA 87 2064
959966 N/A N/A 20847 20862 ATGCCTGTATTAGCTC 65 2065
959976 N/A N/A 20942 20957 AGCCTCTTTGTAGCAG 5 2066
959986 N/A N/A 21008 21023 GAGGTTATTTTAACAG 69 2067
959996 N/A N/A 21435 21450 ATACTGAGAGGAAATG 68 2068
960006 N/A N/A 21539 21554 ATGACATTTCAGAGTA 88 2069
960016 N/A N/A 22715 22730 GTGTAAAGATGTGAGT 84 2070
960026 N/A N/A 24033 24048 TGCTGCACTCAAAGAG 0 2071
960038 N/A N/A 19377 19392 TCACAAGAGACTGGAC 31 2072
- 115 047395
Таблица 34
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959277 481 496 6055 6070 TGGTGGACATTGGCCG 5 2073
959287 707 722 11925 11940 GGTGATGGTTGTTTTG 85 2074
959297 896 911 13632 13647 GAATGCATCCAAATAT 0 2075
959307 1070 1085 16190 16205 GTGGTCTAGCAGCTCA 66 2076
959317 1223 1238 19063 19078 CATTACATAAGACATT 46 2077
959327 1615 1630 25378 25393 CCTCAAGTGACTCACA 83 2078
959337 1651 1666 25414 25429 CTTTAGCACCTCTGAA 71 2079
959347 1835 1850 25598 25613 ATTTCCCAACCAGCTG 49 2080
959357 2099 2114 25862 25877 TTATCATCTTTGCAGA 48 2081
959367 2185 2200 25948 25963 TTTTAGTTAGGTGAAA 43 2082
959377 2263 2278 26026 26041 CTCACTGATTCACATA 79 2083
959387 N/A N/A 4307 4322 TGAGAAACAAACCCTC 0 2084
959397 N/A N/A 4739 4754 TGTGCAAATGATCATG 82 2085
959407 N/A N/A 4859 4874 TAGGCTCCTGGGACCT 0 2086
959417 N/A N/A 5277 5292 ATCTTGGGATGCACAG 89 2087
959427 N/A N/A 5567 5582 TCATGGCTTCCAGTGT 78 2088
- 116 047395
959437 N/A N/A 5600 5615 TTCAATGTGGCTTCTA 96 2089
959447 N/A N/A 5627 5642 TTAATTCTACCTGTGT 72 2090
959457 N/A N/A 5706 5721 TGAAATATCTCATTAG 77 2091
959467 N/A N/A 5805 5820 TGTCTACTATGGGAGC 83 2092
959477 N/A N/A 5875 5890 ATGGTAATACTTTTGG 75 2093
959657 N/A N/A 12148 12163 ACTGGTAGCTCCTGGC 78 2094
959667 N/A N/A 12165 12180 TGATTGTGCAGACAGT 97 2095
959677 N/A N/A 12203 12218 TATTTCCGTTAACCAT 91 2096
959687 N/A N/A 12289 12304 CTGAGTTTTAGGTCTG 96 2097
959697 N/A N/A 12671 12686 GAATCATCTTAGTGGC 94 2098
959707 N/A N/A 12697 12712 TTGTTCTTGACCGTGT 98 2099
959717 N/A N/A 12753 12768 GTGGTAAGGCATACTA 35 2100
959727 N/A N/A 12789 12804 GGTGTACATGGTCTGC 97 2101
959737 N/A N/A 12839 12854 GCATTGCATTGCATAG 92 2102
959747 N/A N/A 12890 12905 GGAAAACCAATCCTGT 69 2103
959757 N/A N/A 12927 12942 AGCTGTCTCCTCTACT 70 2104
959767 N/A N/A 12968 12983 CAAACTTTGCAGCCTA 95 2105
959777 N/A N/A 13377 13392 GAGACTTTGCAGGCAC 88 2106
959787 N/A N/A 13402 13417 TCGGCTTGAATGTCAC 67 2107
959797 N/A N/A 13700 13715 GTAAATGCTTGTCAAA 91 2108
959807 N/A N/A 13720 13735 AGTCTTTACCAAGACC 0 2109
959817 N/A N/A 13911 13926 CATGACATCCCAGTTC 29 2110
959827 N/A N/A 14233 14248 AACCAACTTTTAGTAT 27 2111
959837 N/A N/A 14420 14435 CCATCGACACAGCATC 89 2112
959847 N/A N/A 14567 14582 CTACTTATCCCCAAAG 16 2113
959857 N/A N/A 14677 14692 GCCATCTCTTAGTGTC 36 2114
959867 N/A N/A 15211 15226 CCTTAGGAATATTGCC 75 2115
959877 N/A N/A 15771 15786 GAGGGTTAGTGTTGGT 93 2116
959887 N/A N/A 17218 17233 CTGGTTTGTGGGTTCT 75 2117
959897 N/A N/A 17291 17306 TCTTAGGGCACCTCAA 53 2118
959907 N/A N/A 17736 17751 TTAATCTGGTCATATG 0 2119
959917 N/A N/A 18852 18867 ACAAAAGCGACAAGGT 33 2120
959927 N/A N/A 20508 20523 TTGAGTCTCCTGACCA 65 2121
959937 N/A N/A 20602 20617 CGATCATCATTATTAC 87 2122
959947 N/A N/A 20653 20668 ATTGCAGTGCCCTGGC 69 2123
959957 N/A N/A 20805 20820 TATTCAGACCAGGGTA 89 2124
959967 N/A N/A 20848 20863 GATGCCTGTATTAGCT 72 2125
959977 N/A N/A 20944 20959 GCAGCCTCTTTGTAGC 0 2126
959987 N/A N/A 21010 21025 CTGAGGTTATTTTAAC 40 2127
959997 N/A N/A 21436 21451 TATACTGAGAGGAAAT 47 2128
960007 N/A N/A 21541 21556 ATATGACATTTCAGAG 91 2129
960017 N/A N/A 22716 22731 CGTGTAAAGATGTGAG 87 2130
960027 N/A N/A 24035 24050 AATGCTGCACTCAAAG 31 2131
960039 N/A N/A 20215 20230 TAACAAACTATGCCTA 44 2132
- 117 047395
Таблица 35
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959274 439 454 6013 6028 AGGAACTTGCTTAAGT 73 2133
959284 695 710 11913 11928 TTTGGCATCAATGAAG 60 1928
959294 817 832 12035 12050 TAGAGGTTCCCTGTGC 77 1929
959304 1063 1078 16183 16198 AGCAGCTCATCTCCCT 62 2134
959314 1091 1106 16211 16226 GGGCAGGATGCTGAGA 13 1930
959324 1606 1621 25369 25384 ACTCACAGACTCTTCT 72 1931
959334 1647 1662 25410 25425 AGCACCTCTGAAAGAA 65 1932
959344 1678 1693 25441 25456 CGGAGGTAGCTGCACA 86 1933
959354 1926 1941 25689 25704 ATTCTAAGAACCTCAT 54 1934
959364 2181 2196 25944 25959 AGTTAGGTGAAAAAGG 92 2135
959374 2260 2275 26023 26038 ACTGATTCACATAATA 78 2136
959384 N/A N/A 4303 4318 AAACAAACCCTCCGTC 2 1935
959394 N/A N/A 4734 4749 AAATGATCATGTGGCG 94 1936
959404 N/A N/A 4768 4783 CTGACTTTTATTGTTG 72 1937
959414 N/A N/A 4871 4886 GTGAGTGTACTTTAGG 97 1938
959424 N/A N/A 5393 5408 AATGCTATCAGGTGCA 31 1939
959434 N/A N/A 5579 5594 TGCACAATGACATCAT 87 1940
959444 N/A N/A 5621 5636 CTACCTGTGTCTTTTA 90 1941
959454 N/A N/A 5647 5662 ATATATTGGGCTCAAT 80 1942
959464 N/A N/A 5799 5814 CTATGGGAGCCACATG 24 2137
959474 N/A N/A 5867 5882 ACTTTTGGCAAGGCCA 23 1943
959484 N/A N/A 7211 7226 CCGCAAACAAGGTTAA 0 1944
959664 N/A N/A 12157 12172 CAGACAGTAACTGGTA 96 2138
959674 N/A N/A 12200 12215 TTCCGTTAACCATCAA 97 2139
959684 N/A N/A 12283 12298 TTTAGGTCTGGGTATA 93 1945
959694 N/A N/A 12325 12340 CCCCCTGACTATATAA 26 1946
959704 N/A N/A 12693 12708 TCTTGACCGTGTTTCC 98 1947
959714 N/A N/A 12716 12731 GTTAAACTACCGAACG 35 2140
959724 N/A N/A 12763 12778 CTATGGTAGAGTGGTA 93 2141
959734 N/A N/A 12834 12849 GCATTGCATAGCCTTC 97 1948
959744 N/A N/A 12886 12901 AACCAATCCTGTTAGA 55 1949
959754 N/A N/A 12909 12924 TCTGCTTATAAAGCAC 0 1950
959764 N/A N/A 12937 12952 GGACAATAAGAGCTGT 91 2142
959774 N/A N/A 13373 13388 CTTTGCAGGCACCCCA 72 1951
959784 N/A N/A 13398 13413 CTTGAATGTCACCCTT 92 1952
959794 N/A N/A 13532 13547 AGCATCATTGGAAGAC 92 2143
959804 N/A N/A 13715 13730 TTACCAAGACCGCTAG 57 1953
959814 N/A N/A 13744 13759 GTGTTAGAACTAAGGC 94 2144
959824 N/A N/A 14228 14243 ACTTTTAGTATTAAAG 0 1954
959834 N/A N/A 14306 14321 TTTCTGAGCAGATAAA 66 2145
959844 N/A N/A 14555 14570 AAAGTCTTAATGTGGA 87 1955
959854 N/A N/A 14670 14685 CTTAGTGTCCCCATCC 77 1956
959864 N/A N/A 15208 15223 TAGGAATATTGCCAGG 89 2146
959874 N/A N/A 15767 15782 GTTAGTGTTGGTTTAT 94 1957
959884 N/A N/A 17199 17214 GTTTGACTTAGTCCGT 95 1958
959894 N/A N/A 17228 17243 AACTCTGTAGCTGGTT 41 2147
- 118 047395
959904 N/A N/A 17603 17618 TCTTGATAGTGAATGT 73 2148
959914 N/A N/A 18398 18413 AATATGTTTGGAAGTC 89 1959
959924 N/A N/A 20292 20307 CCAATCAGAGGAAGCC 58 2149
959934 N/A N/A 20518 20533 AGTAACCAGATTGAGT 81 1960
959944 N/A N/A 20617 20632 CTGTCTCTAATTTTAC 75 2150
959954 N/A N/A 20665 20680 CACAGCTTAGAAATTG 87 1961
959964 N/A N/A 20844 20859 CCTGTATTAGCTCAAT 92 1962
959974 N/A N/A 20940 20955 CCTCTTTGTAGCAGAC 83 1963
959984 N/A N/A 21006 21021 GGTTATTTTAACAGCT 85 1964
959994 N/A N/A 21412 21427 ACCTGCAATTCTAGAC 54 1965
960004 N/A N/A 21537 21552 GACATTTCAGAGTATA 93 2151
960014 N/A N/A 22710 22725 AAGATGTGAGTGAAAT 69 1966
960024 N/A N/A 22770 22785 AAAGGACATGACAGAC 75 1967
960034 N/A N/A 24613 24628 GCAAATCGGATCTTTG 32 2152
Таблица 36
Подавление mRNA PNPLA3 с помощью cEt-гэпмеров 3-10-3, нацеливающихся на SEQ ID NO: 1 и 2
Номер соединения SEQ ID NO: 1, стартовый сайт SEQ ID NO: 1, стопсайт SEQ ID NO: 2, стартовый сайт SEQ ID NO: 2, стопсайт Последовательность (5'-3') % подавления PNPLA3 SEQ ID NO
915609 705 720 11923 11938 TGATGGTTGTTTTGGC 98 702
959275 440 455 6014 6029 GAGGAACTTGCTTAAG 80 1968
959285 696 711 11914 11929 TTTTGGCATCAATGAA 63 1969
959295 823 838 12041 12056 AGAAGGTAGAGGTTCC 48 2153
959305 1066 1081 16186 16201 TCTAGCAGCTCATCTC 66 1970
959315 1093 1108 16213 16228 CAGGGCAGGATGCTGA 2 2154
959325 1608 1623 25371 25386 TGACTCACAGACTCTT 60 2155
959335 1649 1664 25412 25427 TTAGCACCTCTGAAAG 54 1971
959345 1804 1819 25567 25582 ATGTATTAGAGTTAAG 79 1972
959355 1927 1942 25690 25705 CATTCTAAGAACCTCA 68 1973
959365 2183 2198 25946 25961 TTAGTTAGGTGAAAAA 69 1974
- 119 047395
959375 2261 2276 26024 26039 CACTGATTCACATAAT 73 1975
959385 N/A N/A 4305 4320 AGAAACAAACCCTCCG 70 2156
959395 N/A N/A 4737 4752 TGCAAATGATCATGTG 69 1976
959405 N/A N/A 4769 4784 GCTGACTTTTATTGTT 83 1977
959415 N/A N/A 4872 4887 AGTGAGTGTACTTTAG 94 1978
959425 N/A N/A 5395 5410 TTAATGCTATCAGGTG 82 1979
959435 N/A N/A 5580 5595 ATGCACAATGACATCA 84 1980
959445 N/A N/A 5624 5639 ATTCTACCTGTGTCTT 95 1981
959455 N/A N/A 5651 5666 TTGGATATATTGGGCT 97 1982
959465 N/A N/A 5800 5815 ACTATGGGAGCCACAT 26 2157
959475 N/A N/A 5868 5883 TACTTTTGGCAAGGCC 69 1983
959485 N/A N/A 7697 7712 GCACAGAGTAGGTTAA 70 1984
959655 N/A N/A 12146 12161 TGGTAGCTCCTGGCAA 50 1985
959665 N/A N/A 12162 12177 TTGTGCAGACAGTAAC 87 2158
959675 N/A N/A 12201 12216 TTTCCGTTAACCATCA 95 1986
959685 N/A N/A 12284 12299 TTTTAGGTCTGGGTAT 81 2159
959695 N/A N/A 12667 12682 CATCTTAGTGGCTGGG 91 1987
959705 N/A N/A 12695 12710 GTTCTTGACCGTGTTT 97 1988
959715 N/A N/A 12717 12732 GGTTAAACTACCGAAC 26 1989
959725 N/A N/A 12783 12798 CATGGTCTGCAAATTT 89 1990
959735 N/A N/A 12837 12852 ATTGCATTGCATAGCC 95 2160
959745 N/A N/A 12887 12902 AAACCAATCCTGTTAG 54 1991
959755 N/A N/A 12910 12925 ATCTGCTTATAAAGCA 43 1992
959765 N/A N/A 12964 12979 CTTTGCAGCCTATCCC 95 2161
959775 N/A N/A 13374 13389 ACTTTGCAGGCACCCC 86 1993
959785 N/A N/A 13399 13414 GCTTGAATGTCACCCT 95 1994
959795 N/A N/A 13534 13549 TCAGCATCATTGGAAG 60 2162
959805 N/A N/A 13716 13731 TTTACCAAGACCGCTA 82 1995
959815 N/A N/A 13745 13760 AGTGTTAGAACTAAGG 93 2163
959825 N/A N/A 14230 14245 CAACTTTTAGTATTAA 9 1996
959835 N/A N/A 14417 14432 TCGACACAGCATCACC 59 1997
959845 N/A N/A 14556 14571 CAAAGTCTTAATGTGG 84 2164
959855 N/A N/A 14671 14686 TCTTAGTGTCCCCATC 78 1998
959865 N/A N/A 15209 15224 TTAGGAATATTGCCAG 91 1999
959875 N/A N/A 15769 15784 GGGTTAGTGTTGGTTT 93 2000
959885 N/A N/A 17200 17215 TGTTTGACTTAGTCCG 96 2165
959895 N/A N/A 17288 17303 TAGGGCACCTCAAGAA 0 2001
959905 N/A N/A 17734 17749 AATCTGGTCATATGGT 42 2166
959915 N/A N/A 18400 18415 CAAATATGTTTGGAAG 55 2002
959925 N/A N/A 20293 20308 CCCAATCAGAGGAAGC 57 2003
959935 N/A N/A 20599 20614 TCATCATTATTACCTG 93 2004
959945 N/A N/A 20651 20666 TGCAGTGCCCTGGCCT 40 2167
959955 N/A N/A 20803 20818 TTCAGACCAGGGTAAT 93 2005
959965 N/A N/A 20845 20860 GCCTGTATTAGCTCAA 88 2006
959975 N/A N/A 20941 20956 GCCTCTTTGTAGCAGA 0 2007
959985 N/A N/A 21007 21022 AGGTTATTTTAACAGC 94 2168
959995 N/A N/A 21434 21449 TACTGAGAGGAAATGA 65 2008
960005 N/A N/A 21538 21553 TGACATTTCAGAGTAT 87 2169
960015 N/A N/A 22714 22729 TGTAAAGATGTGAGTG 75 2009
960025 N/A N/A 22772 22787 TCAAAGGACATGACAG 78 2010
960037 N/A N/A 22590 22605 GAGCAACGAGGAAGGA 64 2011
Пример 2. Дозозависимое антисмысловое подавление PNPLA3 человека в клетках А431.
Гэпмеры из примера 1, демонстрирующие in vitro значительное подавление mRNA PNPLA3 отбирали и тестировали в различных дозах в клетках А431. Антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов, в которых были сходные условия культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в показанных ниже отдельных таблицах. Клетки высевали при плотности 10000 кле
- 120 047395 ток на лунку и трансфицировали путем свободного поглощения с помощью различных концентраций антисмыслового олигонуклеотида, как указано в приведенных ниже таблицах. После периода обработки, составлявшего примерно 16 ч, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни mRNA PNPLA3 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней mRNA использовали набор праймеров и зондов для человека RTS36070. Уровни mRNA PNPLA3 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN®. Результаты представлены в виде процента подавления PNPLA3 относительно необработанных контрольных клеток.
Также представлена концентрация полу максимального ингибирования (IC50) для каждого олигонуклеотида. Уровни mRNA PNPLA3 значимо снижались дозозависимым образом в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами.
Таблица 37
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912712 27 67 76 74 0,2
912732 54 78 88 87 <0,1
912733 45 74 85 88 <0,1
912734 33 64 80 83 0,1
912756 46 72 89 92 <0,1
912757 31 62 78 86 0,2
912758 38 70 85 90 0,1
912759 66 92 97 98 <0,1
912772 46 63 79 88 0,1
912795 40 64 83 84 0,1
912812 43 81 88 88 <0,1
912822 81 83 92 86 <0,1
912823 67 80 91 86 <0,1
912825 58 80 86 88 <0,1
912834 37 75 81 84 0,1
912841 17 62 79 69 0,3
912847 70 83 90 91 <0,1
912848 80 89 90 90 <0,1
912855 48 62 77 80 0,1
Таблица 38
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 68 94 94 98 <0,1
912813 57 84 90 87 <0,1
912856 60 81 91 88 <0,1
912859 48 79 81 72 <0,1
912864 60 88 90 90 <0,1
912870 67 81 91 94 <0,1
912871 21 67 84 89 0,2
912872 18 73 90 92 0,2
912876 43 70 87 92 0,1
912933 68 89 90 90 <о,1
912940 86 91 95 96 <0,1
912941 87 94 96 96 <0,1
912952 68 85 90 91 <0,1
912953 80 90 95 93 <0,1
912964 59 78 88 91 <0,1
912973 53 70 87 91 <0,1
912980 54 77 84 88 <0,1
912985 23 61 81 87 0,2
912988 65 83 86 89 <0,1
- 121 047395
Таблица 39
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 72 95 97 99 <0,1
912874 78 90 96 97 <0,1
912875 64 83 92 94 <0,1
912886 49 78 85 92 <0,1
912931 68 88 94 95 <0,1
912934 57 83 90 92 <0,1
912936 50 78 89 89 <0,1
912938 57 73 85 87 <0,1
912943 64 84 90 93 <0,1
912954 80 92 93 94 <0,1
912970 44 73 86 90 <0,1
912986 56 78 91 92 <0,1
912987 79 90 92 88 <0,1
912992 21 59 74 81 0,3
915603 50 88 96 98 <0,1
915623 81 96 98 98 <0,1
915643 67 89 94 96 <0,1
916602 79 92 95 96 <0,1
916642 44 83 91 93 <0,1
Таблица 40
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 73 94 98 99 <о,1
915484 67 87 93 95 <0,1
915543 34 69 87 90 0,1
915604 54 78 91 95 <0,1
915763 63 80 87 87 <0,1
915904 50 83 92 94 <0,1
915923 63 74 82 87 <0,1
916183 33 78 89 91 0,1
916303 58 73 84 91 <0,1
916343 15 72 76 87 0,2
916563 46 74 90 95 <0,1
916582 48 74 89 91 <0,1
916623 64 81 91 94 <0,1
916702 45 70 78 79 <0,1
916761 46 75 85 88 <0,1
916781 55 79 86 87 <0,1
916782 62 87 91 93 <0,1
916802 66 88 94 91 <0,1
916822 29 72 83 87 0,1
- 122 047395
Таблица 41
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 72 95 98 99 <0,1
915525 51 76 88 84 <0,1
915546 39 79 90 94 0,1
915605 59 84 96 96 <0,1
915606 74 94 99 98 <0,1
915625 72 82 91 95 <0,1
915944 36 71 75 83 0,1
916065 36 62 78 79 0,1
916144 71 86 90 92 <0,1
916163 36 67 81 74 0,1
916164 82 88 89 92 <0,1
916184 60 79 87 89 <0,1
916304 46 65 80 84 0,1
916324 57 77 87 92 <0,1
916344 41 70 83 88 0,1
916564 38 66 88 94 0,1
916604 67 87 95 96 <0,1
916624 43 59 79 87 0,1
916803 67 84 93 92 <0,1
Таблица 42
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 70 94 98 99 <о,1
915486 35 64 82 90 0,1
915487 62 89 94 95 <0,1
915626 67 83 92 94 <0,1
915786 65 84 88 88 <0,1
916145 53 66 85 87 <0,1
916146 62 77 86 86 <0,1
916165 71 86 89 88 <0,1
916166 71 83 87 88 <0,1
916305 57 86 90 92 <0,1
916306 86 96 98 98 <0,1
916325 59 78 83 86 <0,1
916345 21 47 67 73 0,4
916545 63 88 95 94 <0,1
916546 66 85 92 95 <0,1
916625 47 71 84 92 <0,1
916706 22 65 80 85 0,2
916765 67 85 92 93 <0,1
916845 38 71 80 87 0,1
Таблица 43
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 97 99 100 100 <о,1
915608 66 91 97 97 <0,1
- 123 047395
915609 71 97 99 99 <0Д
915627 0 26 53 62 1,3
915768 39 69 86 91 0,1
915908 49 70 80 85 <0,1
915987 47 60 75 78 0,1
916008 45 69 84 83 <0,1
916187 71 82 88 92 <0,1
916247 34 72 83 84 0,1
916287 31 70 90 91 0,1
916547 79 93 97 97 <0,1
916566 8 45 73 81 0,5
916586 47 67 89 91 <0,1
916587 48 81 90 94 <0,1
916606 18 64 87 90 0,2
916607 72 94 94 95 <0,1
916627 18 51 82 79 0,3
916805 18 65 78 81 0,2
Таблица 44
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 64 92 97 99 <о,1
915610 74 94 98 99 <0,1
915789 35 72 82 85 0,1
915909 52 69 82 86 <0,1
915929 13 32 60 59 1,0
915969 39 54 74 74 0,2
915989 46 67 81 86 0,1
916069 24 59 75 56 0,3
916148 42 71 85 80 <0,1
916168 28 54 74 68 0,3
916188 22 42 72 70 0,4
916309 30 77 91 96 0,1
916348 41 57 65 73 0,1
916549 64 85 94 96 <0,1
916568 54 66 81 87 <0,1
916569 60 86 92 95 <0,1
916728 22 50 68 73 0,4
916788 60 89 94 96 <о,1
916848 49 75 89 95 <0,1
- 124 047395
Таблица 45
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 81 93 98 100 <0,1
915390 9 40 67 77 0,6
915611 46 80 93 88 <0,1
915630 52 69 81 82 <0,1
915910 44 64 79 80 0,1
915931 83 88 89 86 <0,1
916149 73 87 89 83 <0,1
916150 51 68 77 84 <0,1
916189 60 73 77 79 <0,1
916310 45 77 88 95 <0,1
916330 48 67 84 86 <0,1
916550 62 85 94 97 <0,1
916570 89 96 98 98 <0,1
916629 26 53 73 86 0,3
916630 52 68 87 91 <0,1
916670 43 77 78 85 <0,1
916730 61 74 82 86 <0,1
916768 35 57 67 72 0,2
916789 79 92 96 96 <0,1
Таблица 46
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 76 94 96 99 <о,1
915532 31 66 82 92 0,1
915612 54 77 86 90 <0,1
915732 42 63 80 84 0,1
915932 45 71 88 89 <0,1
915951 26 58 71 74 0,3
915991 67 84 85 85 <0,1
915992 54 78 86 87 <0,1
916112 35 67 76 78 0,1
916151 51 79 87 90 <0,1
916311 36 70 81 87 0,1
916331 56 85 93 95 <0,1
916332 82 91 94 96 <0,1
916390 30 41 68 64 0,5
916552 79 93 96 97 <0,1
916571 53 78 90 94 <0,1
916631 48 77 86 90 <0,1
916651 81 89 94 95 <0,1
916711 37 66 85 91 0,1
- 125 047395
Таблица 47
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 58 90 98 99 <0,1
915474 51 79 90 93 <0,1
915493 48 58 83 80 0,1
915494 46 73 86 90 <0,1
915674 49 72 89 93 <0,1
915933 40 63 75 79 0,1
916153 68 86 89 91 <0,1
916172 85 89 87 87 <0,1
916173 81 90 91 88 <0,1
916292 64 83 92 92 <0,1
916312 60 84 91 92 <0,1
916333 75 92 96 96 <0,1
916572 29 62 79 88 0,2
916592 52 74 89 90 <0,1
916593 25 67 83 93 0,2
916613 46 75 89 92 <0,1
916652 65 83 91 88 <0,1
916672 73 89 93 90 <0,1
916772 50 61 83 89 <0,1
Таблица 48
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 50 89 96 99 <0,1
915534 0 33 66 57 1,1
915535 51 81 92 96 <0,1
915634 18 67 79 84 0,2
915635 44 72 86 91 0,1
915675 36 68 82 90 0,1
915735 45 68 73 84 0,1
915936 36 67 78 83 0,1
915995 78 87 90 89 <0,1
915996 83 91 93 92 <0,1
916174 80 84 86 81 <0,1
916175 55 82 86 89 <0,1
916334 50 82 92 94 <0,1
916335 52 76 89 93 <0,1
916575 62 88 93 93 <0,1
916753 49 69 76 74 <0,1
916774 49 72 86 91 <0,1
916794 26 64 85 85 0,2
916873 16 49 72 82 0,4
- 126 047395
Таблица 49
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 57 90 97 99 <0,1
915477 47 65 88 93 0,1
915478 47 78 90 95 <0,1
915497 63 68 79 86 <0,1
915637 67 91 97 98 <0,1
916037 15 47 70 61 0,6
916236 80 87 90 88 <0,1
916336 52 67 81 87 <0,1
916576 50 76 89 93 <0,1
916596 55 82 93 94 <0,1
916636 42 71 87 90 0,1
916637 56 85 90 93 <0,1
916715 27 38 68 68 0,5
916716 35 77 89 93 0,1
916796 14 62 84 89 0,3
916814 22 44 70 79 0,4
916815 56 79 87 89 <0,1
916816 33 72 83 93 0,1
916874 5 34 61 70 0,8
Таблица 50
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
912759 56 91 97 100 <0,1
915479 38 70 89 94 0,1
915618 42 63 75 85 0,1
915619 65 87 96 97 <0,1
915638 31 64 80 82 0,2
915639 33 78 88 93 0,1
915778 41 50 78 87 0,2
916058 26 34 73 81 0,4
916177 38 55 83 82 0,1
916238 84 91 93 93 <0,1
916298 79 87 92 94 <0,1
916318 59 71 91 94 <0,1
916338 71 91 94 92 <0,1
916558 73 89 94 94 <0,1
916577 41 66 78 82 0,1
916578 69 85 91 93 <0,1
916638 46 84 90 92 <0,1
916757 33 60 82 88 0,2
916817 31 67 82 87 0,1
- 127 047395
Таблица 51
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ
841947 50 78 89 92 <0,1
912759 75 50 85 99 <0,1
912986 54 78 90 95 <0,1
915480 61 87 94 97 <0,1
915519 47 77 86 85 <0,1
915620 46 75 88 91 <0,1
915780 24 76 92 94 0,1
915920 23 65 79 82 0,2
916020 45 80 85 81 <0,1
916299 59 87 92 93 <0,1
916339 88 95 97 97 <0,1
916340 83 96 97 98 <0,1
916559 41 68 83 89 0,1
916579 71 86 96 96 <0,1
916580 59 90 95 96 <0,1
916618 10 47 70 78 0,5
916639 38 58 80 86 0,1
916778 68 87 92 94 <0,1
916818 60 77 90 91 <0,1
Таблица 52
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер % подавления PNPLA3 IC50
соединения 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ 4000 нМ (мкМ)
912759 60 0 85 99 0,3
915541 48 71 89 91 <0,1
915542 50 72 86 93 <0,1
915601 8 53 84 84 0,3
915602 1 56 77 91 0,4
915621 21 54 75 80 о,з
915622 0 44 73 84 0,5
915922 27 64 79 85 0,2
916042 6 57 89 88 о,з
916140 43 82 90 89 <0,1
916141 72 88 93 91 <0,1
916180 33 62 69 83 0,2
916181 53 80 89 92 <0,1
916341 0 78 94 94 0,3
916560 72 91 95 94 <0,1
916581 38 76 91 91 0,1
916601 44 80 88 90 <0,1
916701 61 83 91 93 <0,1
916780 75 91 93 94 <0,1
- 128 047395
Таблица 53
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
915609 52 86 96 99 <0,01
959430 42 76 90 95 <0,01
959440 39 73 92 98 0,02
959470 46 73 89 94 <0,01
959670 52 90 96 98 <0,01
959680 50 75 91 96 <0,01
959730 83 96 98 98 <0,01
959740 50 70 90 96 <0,01
959820 40 69 85 92 0,02
959830 46 69 93 97 0,02
959880 34 62 85 93 0,03
960010 48 78 92 95 <0,01
Таблица 54
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
915609 53 87 98 99 <0,01
959271 55 74 91 91 <0,01
959360 7 43 79 85 0,1
959361 60 87 93 94 <0,01
959411 56 76 91 94 <0,01
959441 50 81 93 97 <0,01
959460 0 29 75 90 0,2
959701 62 91 97 98 <0,01
959721 80 94 97 97 <0,01
959731 25 64 82 91 0,05
959741 41 65 83 91 0,02
959750 0 26 65 87 0,2
959761 28 60 84 91 0,05
959781 39 58 75 87 0,04
959911 20 54 78 90 ОД
959921 37 61 83 91 0,03
959931 48 72 89 92 <0,01
959960 И 51 79 90 0,1
959961 38 64 85 92 0,03
Таблица 55
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 ICso (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
- 129 047395
915609 И 71 93 98 ОД
959412 52 77 90 94 <0,01
959413 34 82 95 97 0,02
959422 15 50 80 87 ОД
959432 33 60 86 95 0,04
959662 0 53 84 92 0,1
959672 54 85 95 97 <0,01
959673 18 62 88 95 0,1
959682 46 77 90 91 <0,01
959702 39 71 91 96 0,02
959703 81 96 99 99 <0,01
959712 4 30 75 92 0,1
959713 0 53 86 96 0,1
959722 33 80 90 94 0,02
959733 31 68 92 96 0,03
959782 35 63 86 94 0,03
959872 29 64 77 89 0,04
959912 25 69 89 92 0,04
959982 21 61 83 91 0,1
Табл шца 56
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер % подавления PNPLA3 IC50
соединения 15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ (мкМ)
915609 2 73 93 98 0,1
959363 49 82 91 91 <0,01
959393 38 71 87 95 0,02
959394 27 73 91 97 0,03
959414 69 94 98 99 <0,01
959664 51 77 95 98 <0,01
959674 43 74 95 98 0,02
959683 14 71 90 96 0,05
959704 57 92 98 99 <0,01
959724 0 68 90 95 0,1
959734 71 93 98 98 <0,01
959814 24 76 90 95 0,03
959873 38 53 83 90 0,04
959874 51 82 95 97 <0,01
959884 44 77 94 97 <0,01
959913 18 50 85 92 0,1
959953 6 51 85 92 0,1
959983 22 54 81 92 0,1
960004 10 71 92 96 0,1
- 130 047395
Таблица 57
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
915609 12 69 93 98 0,1
959364 32 72 89 91 0,03
959415 21 70 91 96 0,04
959444 6 47 82 91 0,1
959445 32 70 92 97 0,03
959455 61 87 95 97 <0,01
959675 20 56 80 94 0,1
959684 8 47 83 86 0,1
959705 77 95 98 99 <0,01
959735 12 67 90 95 0,1
959764 4 32 80 92 0,1
959765 1 59 88 93 0,1
959784 3 35 75 90 0,1
959785 27 72 92 96 0,03
959794 0 0 53 83 0,3
959864 26 61 84 91 0,05
959885 49 81 95 96 <0,01
959914 7 43 76 89 0,1
959964 17 55 83 91 0,1
Таблица 58
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 IC50 (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
915609 0 73 95 97 0,1
959456 66 90 97 98 <0,01
959666 29 60 89 97 0,04
959676 15 44 81 93 0,1
959686 71 92 97 97 <0,01
959695 40 75 91 93 0,02
959696 21 81 90 92 0,03
959706 81 95 98 98 <0,01
959725 8 55 76 84 0,1
959726 0 59 88 91 0,1
959736 46 84 94 98 <0,01
959766 22 57 83 94 0,1
959776 1 53 87 93 0,1
959815 31 67 89 91 0,03
959865 6 49 84 91 0,1
959875 34 74 91 92 0,02
959935 22 55 84 94 0,1
959955 0 55 83 89 0,1
959985 29 71 88 93 0,03
- 131 047395
Таблица 59
Многодозовый анализ cEt-гэпмеров 3-10-3 в клетках А431
Номер соединения % подавления PNPLA3 1С50 (мкМ)
15,6 нМ 62,5 нМ 250 нМ 1000 нМ
915609 37 80 96 99 0,02
959356 40 71 87 88 0,02
959417 25 58 83 92 0,1
959437 65 88 94 95 <0,01
959667 37 69 90 95 0,02
959677 29 56 82 92 0,05
959687 51 79 93 97 <0,01
959697 51 75 93 95 <0,01
959707 81 94 98 98 <0,01
959727 71 92 96 96 <0,01
959737 45 75 89 94 <0,01
959767 47 76 93 96 <0,01
959797 32 59 87 94 0,04
959856 13 35 67 80 0,1
959876 38 75 89 90 0,02
959877 40 81 89 94 <0,01
959956 25 25 66 85 0,1
960006 13 40 68 83 0,1
960007 24 59 88 91 0,05
Пример 3. Переносимость модифицированных олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека, у мышей линии BALB/c.
Мыши линии BALB/c представляют собой многоцелевую модель на мышах, часто применяемую для тестирования безопасности и эффективности. Мышей обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, отобранными после проведения исследований, описанных выше, и оценивали в отношении изменений уровней различных биохимических маркеров плазмы крови.
Олигонуклеотиды Ionis, отобранные после проведения вышеприведенных исследований, конъюгировали с концевой кэп-структурой 3'-ТНА-С6-GalNAc3-(3R,5S)-5-(гидроксиметил)пирролидин-3олфосфатом (в дальнейшем называемой 3'-ТНА).
Обработка.
Г руппам самцов мышей в возрасте от 6 до 7 недель однократно вводили путем инъекции подкожно 200 мг/кг модифицированных олигонуклеотидов. Одной группе самцов мышей BALB/c вводили путем инъекции PBS. Мышей подвергали эвтаназии через 72-96 ч после однократной дозы и плазму крови собирали для дальнейшего анализа.
Для оценки эффекта модифицированных олигонуклеотидов в отношении функции печени, измеряли уровни трансаминаз в плазме крови с помощью автоматического биохимического анализатора (Beckman Coulter AU480, Брея, Калифорния). Из дальнейших исследований исключали модифицированные олигонуклеотиды, которые обуславливали изменения уровней трансаминаз, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, которые считались переносимыми в данном исследовании и были отобраны для дальнейшей оценки, представлены в приведенной ниже таблице. 'Исходный олигонуклеотид' указывает на олигонуклеотид Ionis, который был описан в вышеприведенных исследованиях и который конъюгировали с 3'-ТНА и тестировали в данном исследовании.
- 132 047395
Таблица 60 Антисмысловые олигонуклеотиды, которые использовали в исследовании
на мышах BALB/c
ID ID исходного
соединения олигонуклеотида
975746 916339
975747 912941
975748 916306
975755 916332
975760 912848
975764 916298
975766 916552
975767 916789
975768 916602
975770 912874
975771 916333
975772 916780
975775 916672
975777 916558
975780 916607
975783 916338
975788 912847
975790 916778
975792 912870
975794 916802
975797 916637
975799 912732
975800 912733
975803 912813
975804 912823
975805 912834
975806 912855
975807 912856
975808 912864
975809 912871
975810 912872
975811 912875
975813 912931
975814 912934
975815 912936
975816 912938
975817 912943
975820 912988
- 133 047395
975822 915486
975829 915619
975836 915780
975840 915989
975844 916151
975849 916292
975850 916299
975851 916303
975852 916309
975853 916310
975854 916312
975855 916318
975856 916324
975857 916331
975858 916334
975859 916335
975860 916336
975861 916549
975862 916550
975864 916563
975865 916564
975866 916568
975868 916571
975869 916575
975870 916580
975871 916581
975873 916586
975875 916601
975878 916624
975879 916625
975880 916636
975881 916638
975883 916670
975886 916711
975887 916716
975888 916774
975889 916781
975890 916782
975891 916788
975893 916815
975894 916816
975895 916817
975896 916818
975897 916822
975898 916845
994288 959455
994289 960010
994290 959361
994291 959271
Пример 4. Эффект антисмыслового подавления PNPLA3 в модели на трансгенных мышах
Применяли модель на мышах, трансгенных по PNPLA3, созданную Калифорнийским университетом, Ирвайн, на основе мышей C57BL/6 дикого типа. Модель на мышах предусматривала геномную конструкцию, содержащую фосмиду с полным геном PNPLA3, любезно предоставленную Вашингтонским
- 134 047395 университетом. В данной модели оценивали эффективность олигонуклеотидов lonis.
Обработка
Трансгенных мышей выдерживали в условиях цикла чередования 12 ч света и темноты и кормили стандартным кормом для мышей Purina без ограничений. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 7 дней в исследовательской лаборатории перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) получали в забуференном солевом растворе (PBS) и стерилизовали путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% PBS для инъекций.
Мышей, трансгенных по hPNPLA3, разделяли на группы по 2 мыши в каждой. Группы получали подкожные инъекции олигонуклеотида Ionis в дозе 2,5 мг/кг в дни 1 и 8. Одна группа из 4 мышей получала подкожные инъекции PBS в дни 1 и 8. Группа, которой вводили путем инъекции физиологический раствор, служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали группы, обработанные олигонуклеотидами.
Анализ РНК.
В день 10 РНК экстрагировали из печени для ПЦР-анализа в реальном времени с целью измерения экспрессии mRNA PNPLA3. Оба набора праймеров и зондов RTS36070 и RTS36075 применяли для измерения уровней mRNA PNPLA3. Результаты представлены в виде процентного изменения уровня mRNA по сравнению с PBS-контролем, нормализованного с помощью RIBOGREEN®. Как представлено в приведенной ниже таблице, обработка с помощью антисмысловых олигонуклеотидов Ionis приводила к значительному снижению уровня mRNA PNPLA3 по сравнению с PBS-контролем. '0' указывает на то, что олигонуклеотиды не подавляли экспрессию mRNA.
Таблица 61
Процент подавления mRNA PNPLA3 в печени трансгенных
- 135 047395
975771 98 99
975772 96 96
975775 90 91
975777 85 89
975780 44 63
975783 87 90
975788 0 26
975790 0 0
975792 9 34
975794 44 50
975797 0 0
975799 0 0
975800 0 5
975803 68 68
975804 И 38
975805 0 0
975806 0 0
975807 0 0
975808 47 58
975809 0 19
975810 12 22
975811 19 32
975813 36 39
975814 48 54
975815 78 77
975816 56 56
975817 84 86
975820 35 45
975822 0 0
975829 98 98
975836 85 91
- 136 047395
975840 19 44
975844 21 31
975849 88 89
975850 41 48
975851 5 18
975852 24 41
975853 0 0
975854 0 0
975855 0 0
975856 45 31
975857 73 67
975858 58 40
975860 92 92
975861 66 49
975862 46 36
975864 16 21
975865 0 0
975866 40 41
975868 56 48
975869 30 19
975870 0 14
975871 0 0
975875 75 73
975878 18 12
975879 7 0
975880 0 0
975881 54 54
975883 77 80
975886 18 28
975887 49 57
975888 10 9
975889 90 91
975890 96 98
975891 97 98
975893 95 95
975894 85 87
975895 89 89
975896 91 89
975898 94 95
975897 96 97
975873 99 99
994288 99 99
994289 98 99
994290 98 99
994291 95 95
975859 95 96
Пример 5. Переносимость модифицированных олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека, у мышей CD1.
Мыши CD1® (Charles River, Массачусетс) представляют собой многоцелевую мышиную модель, часто применяемую для тестирования безопасности и эффективности. Мышей обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами Ionis, отобранными после проведения исследований, описанных выше, и оценивали в отношении изменений уровней различных биохимических маркеров плазмы крови.
- 137 047395
Олигонуклеотиды lonis, отобранные после проведения вышеприведенных исследований, конъюгировали с концевой кэп-структурой 5'-mрисгексиламино-(ТНА)-C6GalNAC3 (в дальнейшем называемой 5'ТНА). Тестируемые олигонуклеотиды Ionis представлены в приведенной ниже таблице. '№ ION неконъюгированного исходного соединения' относится к олигонуклеотиду Ionis, описанному в вышеприведенных исследованиях in vitro, который имеет такую же последовательность. '№ ION аналога, конъюгированного с 3'-ТНА относится к олигонуклеотиду, конъюгированному с 3'-ТНА, который имеет такую же последовательность и оценивался выше в исследованиях на мышах.
Таблица 62
5'-ТНА-олигонуклеотиды, тестируемые в исследовании переносимости у мышей CD 1
ID соединения № ION неконъюгированного исходного соединения № ION аналога, конъюгированного с З'-ТНА Последовательность SEQ ID NO
975591 916339 975746 GGATATATTGGGCTCA 1512
975592 912941 975747 TTGCATTGCATAGCCT 182
975593 916306 975748 GTGTACTTTAGGCTCC 598
975600 916332 975755 CACAATGACATCATGG 1020
975605 912848 975760 CGTTTTTAGTAGTCAA 141
975611 916552 975766 CCTTTTATTTCCGTTA 1024
975612 916789 975767 GTAATATTCAGACCAG 899
975613 916602 975768 CTAGTAAATGCTTGTC 330
975615 912874 975770 ATACTTTTGGCAAGGC 217
975616 916333 975771 CTTTATTCAATGTGGC 1089
975617 916780 975772 AGAAATTGCAGTGCCC 1665
975674 915619 975829 GACTTTAGGGCAGATG 1400
975704 916335 975859 TAATTCTACCTGTGTC 1227
975718 916586 975873 AACTTTGCAGCCTATC 605
975735 916782 975890 CTTAGAAATTGCAGTG 408
975736 916788 975891 TAATATTCAGACCAGG 830
975738 916815 975893 CAATTCTAGACATGGC 1313
975742 916822 975897 TATGACATTTCAGAGT 410
975743 916845 975898 GTAAAGATGTGAGTGA 618
994282 959455 994288 TTGGATATATTGGGCT 1982
994283 960010 994289 AGACATATGACATTTC 1745
994284 959361 994290 TTTTTAGTAGTCAAGG 1757
994285 959271 994291 GTTGAAGGATGGATGG 1748
Обработка.
Группам по четыре мыши CD1 в каждой в течение 6 недель еженедельно вводили путем подкожной инъекции олигонуклеотиды Ionis в количестве 15 мг/кг, предусматривая при этом одну нагрузочную дозу в день 4 (в общей сложности 8 доз). Одной группе самцов мышей CD1 в течение 6 недель вводили путем инъекции подкожно PBS. Мышей подвергали эвтаназии через 48 ч после последней дозы и собирали органы и плазму крови для дополнительного анализа.
Биохимические маркеры плазмы крови.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении функции печени и почек измеряли уровни трансаминаз (ALT и AST), альбумина, общего билирубина и креатинина в плазме крови в неделю 3 с помощью автоматического биохимического анализатора (Beckman Coulter AU480, Брея, Калифорния). Результаты представлены в приведенной ниже таблице. Из дальнейших исследовании исключали олигонуклеотиды Ionis, которые обуславливали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
- 138 047395
Таблица 63
Уровни различных биохимических маркеров плазмы крови у мышей CD1 в неделю 3
Альбумин (г/дл) ALT (МЕ/л) AST (МЕ/л) Общий билирубин (мг/дл) Креатинин (мг/дл)
PBS 2,9 31 64 0,4 0,1
975611 2,7 640 385 о,з 0,1
994282 2,4 76 83 0,3 0,1
975592 з,о 786 942 0,5 0,1
975600 2,7 334 431 о,з 0,1
975591 2,6 62 115 0,4 0,1
975718 2,4 1717 2183 1,2 0,1
994284 2,7 41 97 0,3 0,1
994283 2,8 216 154 0,3 0,1
975616 з,о 69 137 0,3 0,1
975612 2,7 47 218 0,4 0,1
975674 2,9 134 114 0,4 0,1
975613 2,8 60 277 о,з 0,1
975593 2,7 429 405 0,4 0,1
975736 2,9 46 63 0,2 0,2
975735 2,5 46 79 0,2 0,1
975742 2,6 152 96 0,2 0,1
975615 2,9 207 189 0,4 0,1
975617 2,9 65 70 о,з 0,1
975605 2,9 67 92 о,з 0,1
975704 2,4 33 61 0,2 0,1
975738 2,6 43 67 0,2 0,1
975743 2,9 119 126 0,4 0,1
994285 2,8 400 353 0,2 0,1
Гематологические анализы.
Кровь, полученную от выбранных групп мышей в неделю 6, отправляли в IDEXX BioResearch для измерения числа тромбоцитов. Результаты представлены в приведенных ниже таблицах. Из дальнейших исследований исключали олигонуклеотиды Ionis, которые обусловливали изменения числа тромбоцитов, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
Таблица 64
Число тромбоцитов _____у мышей CD1______
Тромбоциты (х103/мкл)
PBS 1067
975605 1202
975612 1200
975613 1417
975616 1178
975617 922
975674 618
975591 941
975743 1127
994282 1384
994284 1255
975704 939
- 139 047395
Пример 6. Переносимость модифицированных олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека, у крыс линии Спрег-Доули.
Крысы линии Спрег-Доули представляют собой многоцелевую модель, используемую для оценивания безопасности и эффективности. Крыс обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами Ionis из исследований, описанных в примерах выше, и оценивали в отношении изменений уровней различных биохимических маркеров плазмы крови.
Обработка.
Крыс линии Спрег-Доули выдерживали в условиях цикла чередования 12 ч света и темноты и кормили стандартным кормом для крыс Purina, рационом 5001, без ограничений. Группам по 4 крысы линии Спрег-Доули в каждой в течение 6 недель еженедельно вводили путем подкожной инъекции олигонуклеотиды Ionis в количестве 15 мг/кг, предусматривая при этом одну нагрузочную дозу в день 4 (в общей сложности 8 доз). Через 48 ч после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, а органы и плазму крови собирали для дальнейшего анализа.
Биохимические маркеры плазмы крови.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении функции печени измеряли уровни трансаминаз в плазме крови с помощью автоматического биохимического анализатора (Beckman Coulter AU480, Брея, Калифорния). Измеряли уровни ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) в плазме крови, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в приведенной ниже таблице. Также измеряли уровни билирубина, креатинина, альбумина и BUN в плазме крови с помощью того же самого клинико-биохимического анализатора, и результаты, выраженные в мг/дл, также представлены в приведенной ниже таблице. Из дальнейших исследований исключали олигонуклеотиды Ionis, которые обуславливали изменения уровней каких-либо маркеров функции печени, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
Таблица 65
Биохимических маркеры плазмы крови у крыс линии Спрег-Доули
Альбумин (г/дл) ALT (МЕ/л) AST (МЕ/л) Общий билирубин (мг/дл) Креатинин (мг/дл) BUN (мг/дл)
PBS 3 35 81 0,2 0,2 12
975591 3 57 161 0,2 о,з 14
975605 4 62 176 о,з 0,2 14
975612 3 106 153 0,2 о,з 13
975613 3 32 94 0,2 0,2 12
975616 4 31 106 0,2 о,з 13
975617 3 49 263 0,2 0,2 12
975735 3 44 128 0,2 0,2 14
975736 3 73 293 о,з о,з 14
994282 3 41 135 0,1 о,з 12
994284 3 32 95 0,1 0,2 13
Функция почек.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении функции почек измеряли уровни белка и креатинина в моче с помощью автоматического биохимического анализатора (Beckman Coulter AU480, Брея, Калифорния). Значения соотношения общего белка и креатинина представлены в приведенной ниже таблице. Из дальнейших исследований исключали олигонуклеотиды Ionis, которые обуславливали изменения уровней соотношения, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
- 140 047395
Таблица 66
Соотношение общего белка и креатинина у крыс линии Спрег-Доули
PBS 1,5
975591 2,0
975605 1,6
975612 1,9
975613 2,3
975616 2,0
975617 1,4
975735 2,2
975736 1,1
994282 2,1
994284 2,1
Значения массы органов.
В конце исследования измеряли значения массы печени, сердца, селезенки и почек, и они представлены в приведенной ниже таблице. Из дальнейших исследований исключали олигонуклеотиды Ionis, которые обуславливали любые изменения значений массы органов, выходящие за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
Таблица 67
Показатели массы органов (г)
Печень Почка Селезенка
Физиологический раствор 16 3 1
975591 16 4 1
975605 21 1
975612 12 3 1
975613 16 3 1
975616 15 о 1
975617 19 4 2
975735 14 4 1
975736 15 о 1
994282 14 3 1
994284 15 3 1
Пример 7. Эффект антисмыслового подавления PNPLA3 в модели на трансгенных мышах.
Олигонуклеотиды Ionis тестировали в трансгенной по hPNPLA3 модели в ходе многодозового ана лиза.
Обработка.
Трансгенных мышей выдерживали в условиях цикла чередования 12 ч света и темноты и кормили стандартным кормом для мышей Purina без ограничений. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 7 дней в исследовательской лаборатории перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) получали в забуференном солевом растворе (PBS) и стерилизовали путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,2 микрона. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% PBS для инъекций.
Исследование 1.
Мышей, трансгенных по hPNPLA3, разделяли на группы по 4 мыши в каждой. Группы получали подкожные инъекции олигонуклеотида Ionis в недельной дозе 5, 1 или 0,25 мг/кг, вводимые в дни 1, 5, 8, 15 и 23. Одна группа из 4 мышей получала подкожные инъекции PBS в дни 1, 5, 8, 15 и 23. Группа, которой вводили путем инъекции физиологический раствор, служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали группы, обработанные олигонуклеотидами.
Анализ РНК
В день 26 РНК экстрагировали из печени для ПЦР-анализа в реальном времени с целью измерения экспрессии mRNA PNPLA3. Оба набора праймеров и зондов RTS36070 и RTS36075 применяли для измерения уровней mRNA PNPLA3. Результаты представлены в виде процентного изменения уровня mRNA по сравнению с PBS-контролем, нормализованного с помощью RIBOGREEN®. Как представлено в приведенной ниже таблице, обработка с помощью антисмысловых олигонуклеотидов Ionis приводила к значительному дозозависимому снижению уровня mRNA PNPLA3 по сравнению с PBS-контролем.
- 141 047395
Таблица 68
Процент подавления mRNA PNPLA3 в печени трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем
мг/кг/неделя Подавление, измеренное с помощью RT S3 6070 Подавление, измеренное с помощью RTS36075 ECso (мкг/г)
5 93 90
975605 1 66 57 2,2
0,25 45 46
975612 5 98 99 3,1
1 89 88
0,25 34 44
5 98 97
975613 1 87 85 1,0
0,25 58 56
5 93 93
975616 1 85 87 0,5
0,25 60 63
5 97 97
975617 1 76 78 о,з
0,25 55 53
5 97 98
975735 1 74 75 1,5
0,25 29 33
5 98 98
975736 1 73 71 0,9
0,25 44 45
5 98 98
994282 1 91 80 0,2
0,25 62 58
5 99 100
994284 1 89 88 о,з
0,25 53 47
Исследование 2.
Мышей, трансгенных по hPNPLA3, разделяли на группы по 4 мыши в каждой. Группы получали подкожные инъекции олигонуклеотида Ionis в недельной дозе 5, 2,5, 1, 0,5 или 0,25 мг/кг, вводимые в дни 1, 5, 8, 15 и 23. Одна группа из 4 мышей получала подкожные инъекции PBS в дни 1, 5, 8, 15 и 23. Группа, которой вводили путем инъекции физиологический раствор, служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали группы, обработанные олигонуклеотидами.
Анализ РНК.
В день 26 РНК экстрагировали из печени для ПЦР-анализа в реальном времени с целью измерения экспрессии mRNA PNPLA3. Оба набора праймеров и зондов RTS36070 и RTS36075 применяли для измерения уровней mRNA PNPLA3. Результаты представлены в виде процентного изменения уровня mRNA по сравнению с PBS-контролем, нормализованного с помощью RIBOGREEN®. Как представлено в приведенной ниже таблице, обработка с помощью антисмысловых олигонуклеотидов Ionis приводила к значительному дозозависимому снижению уровня mRNA PNPLA3 по сравнению с PBS-контролем.
- 142 047395
Таблица 69
Процент подавления mRNA PNPLA3 в печени трансгенных мышей по сравнению с PBS-контролем
мг/кг/неделя Подавление, измеренное с помощью RTS36070 Подавление, измеренное с помощью RTS36075 ECso (мкг/г) ЕС9о (мкг/г)
975612 5 96 97 1,0 8,6
2,5 98 98
1 95 96
0,5 82 83
0,25 43 44
975613 5 99 99 0,9 7,7
2,5 99 99
1 91 91
0,5 82 83
0,25 69 74
975616 5 96 96 1,0 9,4
2,5 94 93
1 89 89
0,5 81 81
0,25 73 60
Пример 8. Эффект модифицированных олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека, у макаков-крабоедов.
Макаков-крабоедов обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами Ionis, отобранными после исследований, описанных в примерах выше. Оценивали переносимость антисмысловых олигонуклеотидов.
Обработка.
До начала исследования обезьян содержали на карантине, в течение которого проводили ежедневное обследование общего состояния здоровья у животных. Обезьяны имели возраст 2-4 года и массу тела 2-4 кг. Девяти группам по 5 случайным образом распределенных самцов макаков-крабоедов в каждой вводили путем подкожной инъекции олигонуклеотиды Ionis или PBS в четыре разных участка на спине в направлении вращения часовой стрелки. Обезьянам два раза в неделю (дни 1, 5, 9 и 14) в течение первых 2 недель, а затем один раз в неделю в течение 10 недель вводили олигонуклеотид Ionis в дозе 10 мг/кг в дни 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 и 84. Контрольная группа из 5 макаков-крабоедов получала инъекции PBS аналогичным образом и служила в качестве контрольной группы.
В течение периода исследования обезьян обследовали два раза в день в отношении признаков заболевания или дистресса. Любое животное, у которого проявлялись более чем кратковременные или слабые боль или дистресс вследствие обработки, повреждение или болезнь, получало от сотрудниковветеринаров лечение одобренными обезболивающими или болеутоляющими средствами после консультации с руководителем исследования. Любое животное, имеющее неудовлетворительное состояние здоровья или находящееся в возможном агональном состоянии, определяли для дополнительного контроля и возможной эвтаназии. Запланированную эвтаназию животных проводили в день 86 примерно через 48 ч после введения последней дозы путем кровопускания в условиях глубокой анестезии. Протоколы, описанные в данном примере, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
Измерения массы тела и органов.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении общего состояния здоровья животных измеряли значения массы тела и органов. Значения массы тела и органов измеряли в день 86, и данные представлены в приведенной ниже таблице. Результаты указывают на то, что эффект обработки антисмысловыми олигонуклеотидами в отношении значений массы тела и органов находился в пределах ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов. В частности, обработка с помощью ION 945616 хорошо переносилась с точки зрения значений массы тела и органов обезьян.
- 143 047395
Таблица 70
Конечные показатели массы тела и органов у макаков-крабоедов
Масса тела (кг) Селезенка (г) Почка (г) Печень с желчным пузырем (г)
PBS-контроль 2797 2,6 13,1 53
994284 2789 3,3 14,7 69
975605 2685 4,1 12,2 58
975616 2868 3,1 12,9 63
994282 2782 4,4 12,1 62
975613 2704 з,о 13,5 60
975617 2761 3,8 14,1 61
975735 2765 4,1 15,5 67
975736 2844 з,о 14,1 66
975612 2711 2,8 13,2 60
Функция печени.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении функции печени образцы крови отбирали у всех исследуемых групп в день 86. Обезьяны не получали пищи в течение ночи перед отбором крови. Кровь собирали в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки крови. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение не менее 90 мин, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для получения сыворотки крови. Уровни различных маркеров функции печени измеряли с помощью биохимического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Измеряли уровни ALT и AST в плазме крови, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в приведенной ниже таблице. Сходным образом измеряли уровни билирубина, маркера функции печени, и результаты, выраженные в мг/дл, представлены в приведенной ниже таблице. Результаты указывают на то, что антисмысловые олигонуклеотиды не оказывают эффекта в отношении функции печени, выходящего за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
Таблица 71
Маркеры функции печени в плазме крови ___________ у макака-крабоеда ________
ALT (МЕ/л) AST (МЕ/л) Билирубин (мг/дл) Альбумин (г/дл)
PBS-контроль 38 55 0,2 4,3
994284 64 48 0,2 3,7
975605 48 54 о,з 4,0
975616 54 57 о,з 3,9
994282 89 53 о,з 4,0
975613 60 71 0,4 4,0
975617 65 61 о,з 4,0
975735 59 79 о,з 4,1
975736 70 56 0,3 3,9
975612 61 66 о,з 3,9
Функция почек.
Для оценки эффекта олигонуклеотидов Ionis в отношении функции почек образцы крови отбирали у всех исследуемых групп в день 86. Обезьяны не получали пищи в течение ночи перед отбором крови. Кровь собирали в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки крови. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение не менее 90 мин, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для получения сыворотки крови. Уровни BUN и креатинина измеряли с помощью биохимического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в приведенной ниже таблице.
Данные биохимического анализа плазмы крови указывают на то, что большинство олигонуклеотидов Ionis не оказывали какой-либо эффект в отношении функции почек, выходящий за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов.
- 144 047395
Таблица 72
Уровни BUN и креатинина в плазме крови (мг/дл) _____у макаков-крабоедов_____
BUN Креатинин
PBS-контроль 23 0,8
994284 24 0,8
975605 27 0,7
975616 21 0,8
994282 24 0,8
975613 23 0,9
975617 21 0,7
975735 20 0,8
975736 23 0,8
975612 20 0,8
Г ематология.
Для оценки наличия у макаков-крабоедов каких-либо эффектов олигонуклеотидов Ionis в отношении гематологических параметров, у каждого из доступных исследуемых животных в день 86 отбирали образцы, составляющие примерно по 0,5 мл крови. Образцы отбирали в пробирки, содержащие K2-EDTA. Образцы анализировали в отношении числа эритроцитов (RBC), числа лейкоцитов (WBC), числа отдельных разновидностей лейкоцитов, как например моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, а также в отношении числа тромбоцитов, содержания гемоглобина и гематокрита с помощью гематологического анализатора ADVIA2120i (Siemens, США).
Данные указывают на то, что олигонуклеотиды не вызывали каких-либо изменений гематологических параметров, выходящих за пределы ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов в такой дозе.
Таблица 73
Значения числа клеток крови у макаков-крабоедов
RBC (х 106/мкл) Тромбоциты (х 103/мкл) WBC (х 103/мкл) Нейтрофилы (х 103/мкл) Лимфоциты (х 103/мкл) Моноциты (х 103/мкл)
PBSконтроль 6,0 342 12 3,2 7,8 0,3
994284 6,0 410 10 2,7 6,7 0,3
975605 5,8 326 10 4,8 4,5 0,4
975616 6,0 362 10 3,4 5,8 0,3
994282 5,8 359 10 3,9 5,5 0,3
975613 0,0 327 8 2,6 0,0 0,2
975617 6,1 358 10 3,1 6,4 0,3
975735 5,9 241 13 5,4 6,6 0,4
975736 5,8 360 10 3,5 6,4 0,2
975612 6,2 421 11 5,1 5,7 0,2
- 145 047395
Таблица 74
Анализ провоспалителъных белков.
Для оценки любого воспалительного эффекта олигонуклеотидов lonis у макаков-крабоедов, прово дили отбор образцов крови для анализа. Обезьяны не получали пищи в течение ночи перед отбором крови. У каждого животного отбирали примерно 1,5 мл крови в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки крови. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение минимум 90 мин и затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре для получения сыворотки крови. Уровни С-реактивного белка (CRP), который синтезируется в печени и который служит маркером воспаления, и компонента системы комплемента С3 измеряли с помощью химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония).
Пример 9. Измерение вязкости антисмысловых олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека.
Вязкость антисмысловых олигонуклеотидов, отобранных после исследований, описанных выше, измеряли с целью отсеивания антисмысловых олигонуклеотидов, которые обладают вязкостью более 40 сП. Олигонуклеотиды, обладающие вязкостью более 40 сП, будут характеризоваться менее чем оптимальной вязкостью.
Олигонуклеотиды (32-35 мг) отвешивали в стеклянный флакон, добавляли 120 мкл воды, а антисмысловой олигонуклеотид растворяли в растворе путем нагревания флакона при 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретого образца отмеряли пипеткой в микровискозиметр (Cambridge). Температуру в микровискозиметре устанавливали на 25°С и измеряли вязкость образца. Другую часть (20 мкл) предварительно нагретого образца отмеряли пипеткой в 10 мл воды для считывания показаний в UV-диапазоне при 260 нм и 85°С (прибор Cary UV). Результаты представлены в приведенной ниже таблице, где концентрация каждого антисмыслового олигонуклеотида составляла 200 мг/мл, и указывают на то, что большинство растворов антисмысловых олигонуклеотидов обладают оптимальной вязкостью в соответствии с критерием, приведенным выше.
Таблица 75
Вязкость антисмысловых олигонуклеотидов
Пример 10. Конструкция олигонуклеотидов в области сайта ION 975616.
Конструировали дополнительный антисмысловые олигонуклеотиды, нацеливающиеся на нуклеиновую кислоту PNPLA3, которые перекрывают сайт-мишень ION 916333, который является неконъюги
- 146 047395 рованной версией ION 975616, и характеризующиеся различающимися химическими модификациями и мотивами.
Новые сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в приведенных ниже таблицах обозначены как cEt-гэпмеры 3-10-3 или дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотиды. cEt-гэпмеры 3-10-3 имеют длину 16 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов и фланкирован фланговыми сегментами в 5'-направлении и в 3'-направлении, каждый из которых содержит по три нуклеозида. Каждый нуклеозид в 5'-концевом фланговом сегменте и каждый нуклеозид в 3'-концевом фланговом сегменте имеет cEt-модификацию сахара. Все межнуклеозидные связи в каждом гэпмере являются фосфотиоатными (P=S) связями. Все цитозиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозин. Дезокси-, МОЕ- и (S)-cEt-олигонуклеотиды составляют 16 нуклеозидов в длину, при этом нуклеозид имеет либо МОЕ-модификацию сахара, либо (S)-cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. В столбце Химические характеристики описаны модификации сахара в каждом олигонуклеотиде. k обозначает ^^^модификацию сахара; d обозначает дезоксирибозу; число после d обозначает число дезоксирибозных остатков; и е обозначает МОЕ-модификацию. Все межнуклеозидные связи в каждом гэпмере являются фосфотиоатными (P=S) связями. Все цитозиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозин. Стартовый сайт указывает на нуклеозид, наиболее близкий к 5'-концу в последовательности гена человека (SEQ ID NO: 2), на которую нацелен гэпмер.
Таблица 76
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеливающихся на PNPLA3 человека
SEQ
Стартовый Номер Химические
Стоп-сайт Последовательность ID
сайт соединения характеристики NO
5599 5614 TCAATGTGGCTTCTAG 995553 kkk-dlO-kkk 2170
5600 5615 TTCAATGTGGCTTCTA 959437 kkk-dlO-kkk 2089
5601 5616 ATTCAATGTGGCTTCT 959438 kkk-dlO-kkk 2171
5602 5617 TATTCAATGTGGCTTC 959439 kkk-dlO-kkk 2172
5603 5618 TTATTCAATGTGGCTT 959440 kkk-dlO-kkk 1705
5603 5618 TTATTCAATGTGGCTT 995696 k-dlO-kekek 1705
5603 5618 TTATTCAATGTGGCTT 995906 kk-d9-eeekk 1705
5603 5618 TTATTCAATGTGGCTT 996116 kk-d9-ekeke 1705
5604 5619 TTTATTCAATGTGGCT 959441 kkk-dlO-kkk 1765
5604 5619 TTTATTCAATGTGGCT 995697 k-dlO-kekek 1765
5604 5619 TTTATTCAATGTGGCT 995907 kk-d9-eeekk 1765
5604 5619 TTTATTCAATGTGGCT 996117 kk-d9-ekeke 1765
5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 916333 kkk-dlO-kkk 1089
5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 995698 k-dlO-kekek 1089
5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 995908 kk-d9-eeekk 1089
5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 996118 kk-d9-ekeke 1089
5605 5620 CTTTATTCAATGTGGC 996277 kek-d9-eekk 1089
5606 5621 ACTTTATTCAATGTGG 916334 kkk-dlO-kkk 1158
5606 5621 ACTTTATTCAATGTGG 995699 k-dlO-kekek 1158
5606 5621 ACTTTATTCAATGTGG 995909 kk-d9-eeekk 1158
5606 5621 ACTTTATTCAATGTGG 996119 kk-d9-ekeke 1158
5607 5622 TACTTTATTCAATGTG 959442 kkk-dlO-kkk 1825
5608 5623 TTACTTTATTCAATGT 959443 kkk-dlO-kkk 1885
Олигонуклеотиды тестировали в ходе серии экспериментов. Культивируемые клетки А-431 при плотности 10000 клеток на лунку обрабатывали модифицированными олигонуклеотидами, разбавленными до разных концентраций, при свободном поглощении. После периода обработки, составляющего примерно 48 ч, измеряли уровни mRNA PNPLA3 с применением набора праймеров и зондов для PNPLA3 человека RTS36070, как описано ранее. Уровни mRNA PNPLA3 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RJBOGREEN®. Значения соотношения IC50, полученные в ходе анализов, представлены в таблицах ниже, которые представляют собой соотношение значения IC50
- 147 047395 олигонуклеотида для сопоставления и значения IC50 олигонуклеотида. Таким образом, более высокое значение соотношения указывает на то, что олигонуклеотид является более активным, чем олигонуклеотид для сопоставления.
Таблица 77
Эффективность модифицированных олигонуклеотидов, нацеливающихся на PNPLA3 человека
Стартовый сайт Стоп-сайт Номер соединения Химические характеристики Соотношение IC50
5600 5615 959437 kkk-dlO-kkk 1,42
5601 5616 959438 kkk-dlO-kkk 0,49
5602 5617 959439 kkk-dlO-kkk 0,36
5603 5618 959440 kkk-dlO-kkk 0,55
5603 5618 995906 kk-d9-eeekk 1,42
5604 5619 959441 kkk-dlO-kkk 1,66
5605 5620 916333 kkk-dlO-kkk 1,96
5605 5620 995908 kk-d9-eeekk 0,70
5606 5621 916334 kkk-dlO-kkk 0,95
5606 5621 995909 kk-d9-eeekk 1,47

Claims (9)

1. Соединение, анионная форма (SEQ ID NO: 1089):
в виде его фармацевтически приемлемой соли.
2. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и состоит из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
- 148 047395
З'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа расположена на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида и представляет собой:
3. Соединение, анионная форма которого характеризуется следующей формулой (SEQ ID NO: 1089): о о
в виде его фармацевтически приемлемой соли.
4. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и состоит из последовательности нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа содержит кластер GalNAc, содержащий 1-3 GalNAc-лиганда.
5. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгированную группу, где модифицированный олигонуклеотид имеет длину 16 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, где модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом; при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин; и при этом конъюгированная группа содержит кластер GalNAc, со
- 149 047395 держащий 1-3 GalNAc-лиганда.
6. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований под SEQ ID NO: 1089, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
3'-концевой фланговый сегмент, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-концевым фланговым сегментом и 3'-концевым фланговым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого флангового сегмента содержит cEt-caxap; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
7. Соединение по любому из пп.1-3, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль.
8. Соединение по любому из пп.1-3, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой калиевую соль.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-5 или модифицированный олигонуклеотид по п.6 и фармацевтически приемлемый носитель.
EA202190708 2018-09-19 2019-09-18 Модуляторы экспрессии pnpla3 EA047395B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/733,152 2018-09-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA047395B1 true EA047395B1 (ru) 2024-07-15

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7422816B2 (ja) Ｐｎｐｌａ３発現のモジュレーター
TWI841564B (zh) Ａｐｏｌ１表現之調節劑
JP7289347B2 (ja) Ｐｃｓｋ９発現のモジュレーター
JP7394137B2 (ja) Ｈｓｄ１７ｂ１３発現のモジュレータ
EP4045062A1 (en) Modulators of pnpla3 expression
TWI856973B (zh) Pnpla3表現之調節劑
EA047395B1 (ru) Модуляторы экспрессии pnpla3
EA044295B1 (ru) Модуляторы экспрессии apol1