EA046868B1 - Коровый белок вируса гепатита в и поверхностный антигенный белок и содержащая их вакцина - Google Patents
Коровый белок вируса гепатита в и поверхностный антигенный белок и содержащая их вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- EA046868B1 EA046868B1 EA202090759 EA046868B1 EA 046868 B1 EA046868 B1 EA 046868B1 EA 202090759 EA202090759 EA 202090759 EA 046868 B1 EA046868 B1 EA 046868B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- hbv
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 283
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 256
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 157
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title description 347
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 title description 127
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 262
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 220
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 158
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 158
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 67
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 40
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 26
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 claims 2
- 101100232738 Gallus gallus IFNL3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 247
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 219
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 217
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 201
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 142
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 121
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 120
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 82
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 68
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 61
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 60
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 60
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 56
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 52
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 47
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 46
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 44
- 230000004044 response Effects 0.000 description 44
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 43
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 41
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 40
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 38
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 36
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 33
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 33
- -1 TNFe Proteins 0.000 description 33
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 30
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 28
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 27
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 27
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 24
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 21
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 19
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 19
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 18
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 18
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 14
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 14
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 13
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 13
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 11
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 11
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 10
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 10
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 10
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 10
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 10
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 9
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 9
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 9
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 9
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 9
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 9
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 8
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 8
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 8
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 7
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 6
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 6
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 5
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 5
- 102100021933 C-C motif chemokine 25 Human genes 0.000 description 5
- 101710112540 C-C motif chemokine 25 Proteins 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 5
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000285387 HBV genotype A Species 0.000 description 4
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 4
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 4
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 4
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 4
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 4
- 101150056647 TNFRSF4 gene Proteins 0.000 description 4
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 4
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102100021596 Interleukin-31 Human genes 0.000 description 3
- 101710181613 Interleukin-31 Proteins 0.000 description 3
- 102000017761 Interleukin-33 Human genes 0.000 description 3
- 108010067003 Interleukin-33 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 101710084021 Large envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008349 antigen-specific humoral response Effects 0.000 description 3
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 101710130332 ETS domain-containing protein Elk-4 Proteins 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000285424 HBV genotype C Species 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101000872838 Hepatitis B virus genotype C subtype adr (isolate China/NC-1/1988) Small envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000991061 Homo sapiens MHC class I polypeptide-related sequence B Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 2
- 101100100117 Homo sapiens TNFRSF10B gene Proteins 0.000 description 2
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 2
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 2
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 2
- 101000679921 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Proteins 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 2
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 2
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 101710199015 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 2
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150074862 KLRC3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150018199 KLRC4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 description 2
- 102100030300 MHC class I polypeptide-related sequence B Human genes 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 108010060408 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100028194 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 Human genes 0.000 description 2
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 2
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100372761 Mus musculus Flt1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 2
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022701 NKG2-E type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022700 NKG2-F type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 101710111275 Non-structural 3 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 2
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100028688 Putative glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710138742 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase H Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102400000830 Saposin-B Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 2
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 2
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 2
- 102100022205 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 2
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 108010012704 sulfated glycoprotein p50 Proteins 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100031077 Calcineurin B homologous protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 1
- 101710088341 Dermatopontin Proteins 0.000 description 1
- 101100347633 Drosophila melanogaster Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000285452 HBV genotype B Species 0.000 description 1
- 241000285366 HBV genotype D Species 0.000 description 1
- 241000285370 HBV genotype E Species 0.000 description 1
- 241000560067 HIV-1 group M Species 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010037165 Hepatitis C virus NS3-4A serine protease Proteins 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 101000777270 Homo sapiens Calcineurin B homologous protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 1
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000002989 hepatic vein Anatomy 0.000 description 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000019585 progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940114241 recombivax Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим коровые белки вируса гепатита В (HBV) поверхностные антигенные белки, их фрагменты и комбинации, к коровым белкам вируса гепатита В (HBV), поверхностным антигенным белкам, их фрагментам и комбинациям, к улучшенным HBV-вакцинам, к улучшенным способам индукции иммунного ответа на HBV и к улучшенным способам профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против HBV.
Уровень техники
Гепатит В является общей инфекцией, распространенной по всему земному шару, которая приводит к развитию цирроза, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциноме. Значительное число случаев гепатита не сообщается из-за бессимптомного характера заболевания. Тем не менее, сообщается об около 350 миллионов хронических случаев гепатита В каждый год. Большая часть зараженного гепатитом населения находится в слаборазвитых и развивающихся странах.
Вирус подразделяется на четыре основных серотипа (adr, adw, ayr, ayw), исходя из антигенных эпитопов, присутствующих на его белковых оболочках. Имеется по меньшей мере восемь генотипов (А-Н) вируса гепатита согласно изменениям геномных последовательностей. Альтернативные генотипы HBV имеют превалирующее географическое распределение.
В табл. 1 показано географическое распределение генотипов HBV.
Таблица 1
Географическое распределение генотипов HBV /
Cl, С2 | Ayr | высокая | Дальний Восток | |
С1, СЗ | adw2 | низкая | Дальний Восток | |
С4 | ayw3 | низкая | Дальний Восток, Тихоокеанский регион | |
D | DI, D3, D4 | ayw2 | высокая | Западная Азия, Восточная Европа, Средиземноморье |
D2, D3 | ayw3 | высокая | По всему миру | |
Not identified | adw3 | низкая | Восточная Европа, Испания | |
D2 | ayw4 | низкая | Восточная Европа, Испания, США | |
Е | - | ayw4 | высокая | Африка |
F | Fl, F2 | adw4q- | высокая | Латинская Америка, Аляска, Тихоокеанский регион |
Fl, F2 | ayw4 | низкая | Латинская Америка | |
G | - | adw2 | низкая | Европа, Северная Америка |
Н | - | ayw4 | низкая | Центральная Америка |
J. Med. Virol, DOI 10.1002jmv
Геном HBV представляет собой круговую молекулу ДНК, в основном двухцепочечную, но имеет одноцепочечную область, вытекающую из одной нити, более длинной, чем другая. Двухцепочечная область возникает из-за гибридизации короткой цепи, составляющей приблизительно 3020 нуклеотидов, с более длительной цепью, составляющей приблизительно 3320 нуклеотидов. Одноцепочечной область на негибридизированных нуклеотидах более длинной цепи связана с ДНК-полимеразой HBV. Геномная ДНК HBV и ДНК-полимераза HBV обе содержатся в нуклеокапсиде, образованном множеством молекул корового белка HBV (HBcAg). Коровый белок HBV окутан HBV-поверхностным белком или антигеном (HBsAgs) и липидными молекулами. Геном HBV содержит четыре открытые рамки считывания (ORF), которые кодируют семь различных белков: 1) ORF, которая кодирует ДНК-полимеразу HBV, 2) ORF, которая имеет два стартовых кодона, причем последовательность, присоединенная к второму стартовому кодону, кодирует коровый белок, а последовательность, которая содержит дополнительный апстрим стартовый кодон, кодирует последовательность, названную пре-С; 3) ORF, которая имеет три стартовых кодона, причем один кодирует поверхностный белок (S белок; gp27), один включает апстрим стартовый кодон, который кодирует последовательность, названную пре^2 (gp36), а другой, который включает дополнительный апстрим стартовый кодон, который кодирует последовательность, названную pre-S1 (GP42); и 4) ORF, которая кодирует HBxAg, белок, функция которого менее понятна (фиг. 1). Эти белки включают 3 поверхностных белка или антигена (HBsAg): preS1, preS2 и основной S.
Характеристики HBsAgs проиллюстрированы на фиг. 2. Эпитопы HBsAgs, участвующие в экспрессии подтипов специфичности, расположены в области, которая включает две внешние петли молекул поверхностного антигена HBV (т.е. аминокислоты 110-180 из S-белка) и являются тем, что делает штаммы HBV антигенно разнообразными. Эта же область содержит неизвестное количество эпитопов, которые определяют какую-то детерминанту HBsAg, которая является общей для всех известных штаммов HBV дикого типа.
- 1 046868
Профилактические вакцины и методы лечения HBV-инфекции включают введение субвирусных частиц, выделенных из плазмы хронических носителей, или субвирусных частиц, продуцируемых в виде рекомбинантных белков в стабильно трансфецированных эукариотических клеточных линиях. Субвирусные частицы представляют собой вирусные белки и такие вакцины часто называют субъединичными вакцинами. Белки HBV вводят индивидууму и они становятся мишенями для иммунной системы индивидуума. У неинфицированных индивидуумов иммунный ответ на субъединичную вакцину защищает неинфицированного индивидуума от HBV-инфекции. У инфицированных индивидуумов, иммунный ответ, индуцированный вакциной, может иметь терапевтический эффект.
Chisari F.V., Am J Pathol., 2000. 156:1117-1132 и Pumpeus P. et al. Intervirology 2001. 44:98-114 раскрывают геномную организацию HBV. Deny P. и F. Zoulim, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):245 53 обсудили диагностику и лечение вируса гепатита В. Michel M.L. и P. Tiollais, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):288 95 обсуждают вакцины гепатита В и их защитную эффективность и терапевтический потенциал. Публикация РСТ WO2004026899 раскрывает использование иммуногена, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью HBV. Опубликованная заявка РСТ WO2008093976 раскрывает HBV-кодирующие последовательности, белки и вакцины, включая вакцину, содержащую рекомбинантный полноразмерный поверхностный антиген HBV и коровый антиген HBV. Полноразмерный поверхностный антиген HBV состоит из трех типов поверхностного белка (L белка, М белка и S белка). Опубликованная заявка РСТ WO2009130588 раскрывает HBV-кодирующие последовательности, белки и вакцины, включая нуклеиновую кислоту, кодирующую коровый антиген вируса гепатита В, который оптимизирован по кодонам для экспрессии в организме человека. Публикация РСТ WO2010127115 раскрывает доставку последовательностей HBV с использованием рекомбинантных векторов.
Доступные вакцины HBV демонстрируют некоторую эффективность, но являются дорогостоящими в производстве. Кроме того, полученные из плазмы субъединичные вакцины также сомнительны относительно безопасности. Несколько вакцинных подходов были изучены, в том числе на основе рекомбинантных живых векторов, синтетических пептидов и ДНК-вакцин, которые содержат кодоноптимизированные кодирующие последовательности белков HBV. Эти и другие подходы до сих пор были ограничены различной эффективностью. Кроме того, из-за геномных различий некоторые вакцины HBV демонстрировали положительную эффективность в некоторых географических районах и ограниченную эффективность в других регионах.
Имеющиеся в настоящее время вакцины на основе HBsAg, полученные из дрожжей, трансфецированных ДНК, кодирующей S-белок (например, ENGERIX-B, доступная от SmithKline Biologicals, находящейся в Бельгии, и RECOMBIVAX/HB-VAXII, доступная от Merck & Co., находящейся в США) не вызывают реакцию у приблизительно 5-10% пациентов (С. Belloni, Immunogenicity of hepatitis В vaccine in term and preterm infants. Acta Paediatrica, 1998. 87: p. 336-338). Кроме того, уровень отсутствия ответа увеличивается до 30% у пожилых лиц и иммунитет против HBV может снизиться через несколько лет после вакцинации. Также для достижения полной защиты используются многократные дозы. Безопасность представляет проблему с основанной на HBsAg вакциной ENGERIX-B поскольку ENGERIX-B увеличивает риск воспалительной демиелинизации центральной нервной системы (ЦНС) в три раза.
Остальные HBsAg-вакцины, полученные из клеток млекопитающих, используют пре^1 и пре^2 в дополнение к S-белку. Антигены пре^1 и пре^2 экспрессируют высокоиммуногенные Т и В-клеточные эпитопы и одна такая вакцина вызывает иммунную реакцию у приблизительно 80% неотвечающих или слабо отвечающих индивидуумов (Rendi-Wagner, P. et al., Comparative immunogenicity of PreS/S hepatitis В vaccine in non- and low responders to conventional vaccine. Vaccine, 2006. 24: p. 2781-9).
Было изучено прямое введение последовательностей нуклеиновых кислот для вакцинации против заболеваний животных и человека и много усилий было сосредоточено на эффективных и действенных средствах доставки нуклеиновой кислоты с целью получения необходимой экспрессии желательных антигенов, приводящих к иммунному ответу, и, в конечном счете, к успеху этого способа.
ДНК-вакцины делают возможным эндогенный антигенный синтез, который индуцирует CD8 + гистосовместимый комплекс, цитотоксические Т-лимфоциты, рестриктированные I классом комплекса гистосовместимости, которые редко получают с субъединичными вакцинами. Кроме того, антигенный синтез, который происходит в течение длительного периода, может помочь преодолеть низкую чувствительность и устранить или уменьшить потребность в бустер-инъекциях. Кроме того, ДНК-вакцины, по всей видимости, очень стабильны и просты в изготовлении.
ДНК-вакцины являются безопасными, стабильными, легко получаемыми и хорошо переносятся пациентами в доклинических испытаниях, указывая на отсутствие признаков интеграции плазмиды [Martin, Т., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. Кроме того, ДНК-вакцины хорошо подходят для повторного введения в связи с тем, что эффективность вакцины не зависит от уже существующих титров антител к вектору [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. Однако, одни из основных препятствий для клинического
- 2 046868 принятия ДНК-вакцин было снижение иммуногенности при переходе на более крупных животных [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. Последние технологические достижения в проектировании ДНК-вакцинного иммуногена улучшили экспрессию и иммуногенность ДНК-вакцин, такие как кодонная оптимизация, РНК-оптимизации и добавление иммуноглобулиновых лидерных последовательностей [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], а также, в последнее время разработаны технологии систем доставки плазмид, такие как электропорация [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis С virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. In vivo технология электропорации была использована в клинических испытаниях на людях для доставки противораковых препаратов, таких как блеомицин, и во многих доклинических исследований на большом числе видов животных. Кроме того, исследования показали, что использование консенсусных иммуногенов может увеличить широту клеточного иммунного ответа по сравнению с только нативными антигенами [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype В consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14]. Антитела и цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) к различным антигенам HBV могут принимать участие в снижении вирусной нагрузки и очистки HBV-инфицированных клеток из печени. Основная задача для современных вакцин-кандидатов состоит в индукции как гуморального, так и клеточного иммунитета к множественным HBV-антигенам-мишеням и против основных генотипов HBV. По этой причине сохраняется потребность в конструктах нуклеиновых кислот, которые кодируют белок HBV, и композициях, пригодных для индукции иммунного ответа против HBV. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах против HBV, которые экономичны и эффективны. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах, которые увеличивают нейтрализующие титры антител и вовлекают компонент Т-клеток. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах против HBV, в том числе тех, которые эффективны против штаммов HBV, имеющих широкий спектр генотипов, и предпочтительно, в универсальной вакцине, которая будет глобально эффективной.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6; (b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и (с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15.
Настоящее изобретение также может быть направлено на вакцину, содержащую (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6; (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и (с) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
Вакцина может быть плазмидой, содержащей нуклеиновые кислоты, описанные выше. Молекулы
- 3 046868 нуклеиновых кислот могут быть включены в вирусные частицы. Вакцина может дополнительно содержать адъювантную молекулу. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, СТАСК, ТЕСК, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFa, TNFe, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинация; и в некоторых вариантах реализации изобретения IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
Настоящее изобретение также относится к способу защиты субъекта от HBV-инфекции, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
Настоящее изобретение дополнительно включает вакцины, полезные для индукции иммунного ответа против HBV. Разработка HBV- иммунной терапевтической вакцины с широкой эффективностью против множества генотипов может быть обеспечена с помощью терапевтической ДНК-вакцины HBV, основанной на направленном воздействии на универсально консервативные короспецифические антигены HBV.
Использование консенсусных HBV-иммуногенов индуцирует более широкие клеточный иммунный ответы и может быть полезно, чтобы свести к минимуму степень несходства последовательностей между различными штаммами вируса.
В настоящей заявке предлагаются белки, выбранные из группы, состоящей из: белков, содержащих SEQ ID NO: 2, белков, которые на 95% идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; фрагментов SEQ ID NO: 2; белков, которые на 95% идентичны фрагментам SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4, белков, которые на 95% идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; фрагментов SEQ ID NO: 4; белков, которые на 95% идентичны фрагментам SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, белков, которые на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; фрагментов SEQ ID NO: 6; и белков, которые на 95% идентичны фрагментам SEQ ID NO: 6.
В настоящей заявке предлагается белок, выбранный из группы, состоящей из (a) SEQ ID NO: 2; (b) белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2; (с) иммуногенного фрагмента SEQ ID NO: 2, содержащего 20 или более аминокислот SEQ ID NO: 2; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 95% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, содержащего 20 или более аминокислот.
Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности, которые кодируют одну или несколько молекул белка, указанных выше, также предоставляются. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; фрагмента SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична фрагменту SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; фрагмента SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична фрагменту SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; фрагмента SEQ ID NO: 5; и последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95% идентична фрагменту SEQ ID NO: 5.
Некоторые аспекты изобретения предлагают способы индуцирования иммунной реакции HBV, включающие этап введения индивидууму молекул корового антигена HBV и/или поверхностного антигена HBV и/или композиций.
Дополнительные аспекты изобретения предлагают способы защиты индивидуума против HBVинфекции. Способы включают этап введения указанному индивидууму профилактически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей такую последовательность нуклеиновой кислоты, или композиций, где последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетках указанного индивидуума и защитная иммунная реакция индуцируется против белка, кодируемого указанной последовательностью нуклеиновой кислоты.
В некоторых аспектах изобретения предлагаются способы для лечения индивидуума, инфицированного HBV. Способ включает этап введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества таких молекул нуклеиновых кислот и/или композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: (а) белка, содержащего SeQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16; (b) белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,
- 4 046868
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16; (с) иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; (b) последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 98% идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; (с) их фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот, кодируемых последовательностью SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; и (d) их фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности белка, кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. Молекула нуклеиновой кислоты может быть плазмидой.
Молекула нуклеиновой кислоты может быть вектором экспрессии, и последовательности, кодирующие указанный один или более белков, функционально связанны с регуляторными элементами. Молекула нуклеиновой кислоты может быть инкорпорированной в вирусную частицу.
Некоторые аспекты изобретения предлагают способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению субъекту.
Некоторые аспекты изобретения предлагают способ защиты субъекта от HBV-инфекции, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению субъекту.
Некоторые аспекты изобретения предлагают способ защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению субъекту.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16;
(b) белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16;
(с) иммуногенного фрагмента последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, содержащего 20 или более аминокислот; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98% идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, содержащего 20 или более аминокислот.
Некоторые аспекты изобретения предлагают вакцину, полезную для генерации иммунного ответа против HBV у субъекта, содержащую: молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, и адъювантную молекулу. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFa, Έ№β, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинация; и в некоторых вариантах реализации изобретения - IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой карту, показывающую организацию генома HBV, который состоит из четырех перекрывающихся ORF.
Фиг. 2 иллюстрирует организацию и особенности поверхностных антигенов HBV.
Фиг. 3 иллюстрирует IgELS и эндопротеолитический сайт расщепления в консенсусном поверхностном антигене HBV.
Фиг. 4 иллюстрирует длинный консенсусный поверхностный антиген HBV (LHBs) и небольшой консенсусный поверхностный антиген HBV (SHBs).
Фиг. 5 представляет собой карту вектора pGX1801 НерВ - Mcore (SEQ ID NO: 17).
Фиг. 6 представляет собой карту вектора pGX1802 НерВ pLHBs-A (SEQ ID NO: 18).
Фиг. 7 представляет собой карту вектора pGX1803 НерВ pLHBs-C (SEQ ID NO: 19).
Фиг. 8 представляет собой карту вектора pGX1804 НерВ pSHBs-A (SEQ ID NO: 20).
Фиг. 9 представляет собой карту вектора pGX1805 НерВ SHBs-C (SEQ ID NO: 21).
Фиг. 10 иллюстрирует филогенетический анализ консенсусной последовательности HBcAg по сравнению с индивидуальными генотипами А, В, С, D и Е.
Фиг. 11А и 11В демонстрируют результаты экспериментов по поводу экспрессии рМ Core. Фиг. 11А показывает результаты in vitro трансляционного протокола.
Фиг. 11В показывает результаты вестерн-блоттинга.
Фиг. 12 представляет собой график, иллюстрирующий плазмидную карту и последовательность
- 5 046868 pMCore.
Фиг. 13 показывает реакцию транскрипции/трансляции с использованием плазмиды pMCore, в которой полученный М-коровый белок иммуно-осаждался с анти-НА моноклональным антителом и был разогнан в геле SDS-PAGE.
Фиг. 14 показывает обнаружение М-корового белка во временно трансфецированных клетках с использованием первичного моноклонального НА маркерного антитела с последующим обнаружением DyLight 594-меченным противокроличьим вторичным антителом. Hoechst-окраску также использовали для флуоресцентного мечения клеточного ядра. Экспрессия MCore по большей части локализировалась в цитоплазме, как показано окрашиванием вне ядра.
Фиг. 15 иллюстрирует схему иммунизации. 4 мышей иммунизировали внутримышечно 30 мкг pMCore.
Фиг. 16 показывает увеличенную амплитуду секреции IFN-γ в CD8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 17 показывает увеличенную амплитуду секреции IFN-γ в CD8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 18 показывает увеличенную амплитуду секреции TNF-α в CD8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 19 показывает увеличенную амплитуду секреции TNF-α в CD8+ и CD4+ Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 20 показывает увеличенную амплитуду секреции CD 107а в CD8+ и CD4+ Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 21 показывает увеличенную амплитуду секреции f CD 107а в CD8+ и CD4+ Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 22 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8 IFN-Y+, TNF-a+ секретирующих клеток от мышей Balb/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном pMCore.
Фиг. 23 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8 дважды положительно продуцирующих клеток от мышей Balb/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном pMCore.
Фиг. 24 показывает интерферон-гамма Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 25 показывает интерферон-гамма Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 26 показывает фактора-α некроза опухоли Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 27 показывает фактора-α некроза опухоли Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных pM-Core.
Фиг. 28 показывает процент HBcAg-специфических CD4 и CD8 IFN-Y+, TNF-a+ продуцирующих клеток в печени мышей Balb/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном pMCore.
Фиг. 29 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8 дважды положительных продуцирующих клеток в печени мышей Balb/c, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном pMCore.
Фиг. 30 показывает спленоциты, продуцирующие антиген-специфическое антитело. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно t-тесту Стьюдента.
Фиг. 31 показывает данные анализа ELISPOT.
Фиг. 32 показывает частоту HBcAg-специфических IFN-γ пятнообразующих единиц (SFU) на миллион спленоцитов после стимуляции клеток селезенки иммунизированных мышей.
Фиг. 33 показывает данные экспериментов с использованием CSFE-меченных клеток для сравнения элиминации пептида обработанных клеток-мишеней in vivo с помощью CD8 Т-клеток у вакцинированных и невакцинированных животных.
Фиг. 34 показывает in vivo специфический киллинг. Две группы мышей, иммунизированных pVax (контроль) или pMCore, получали CFSE-меченные клетки-мишени (CFSEh пульсировали с иррелевантным пептидом или CFSEhi пульсировали с эпитоп-специфическим пептидом) через хвостовую вену. CFSE-меченные клетки, восстановленные и проанализированные с помощью FACS, использовали для определения процента киллинга.
Фиг. 35 показывает сравнение процента пролиферации CD3+CD4+ клеток и CD3+CD8+, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой pMCore, которая экспрессирует HBV М-кор.
Фиг. 36 показывает процент пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток.
Фиг. 37А и 37В показывает сравнение анти-HBV кора IgG и IgA в серийном разведении сыворотки
- 6 046868 от животных, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой pMCor, которая экспрессирует HBV М-кор.
Фиг. 38 показывает HBcAg-специфический гуморальный иммунный ответ, вызванный pMCore, в сыворотке и спленоцитах. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно t-тесту Стьюдента.
Фиг. 39 показывает HBcAg-специфический гуморальный иммунный ответ, вызванный pMCore, в сыворотке и спленоцитах. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно t-тесту Стьюдента.
Фиг. 40 показывает процент TNF-α и IFN-γ из CD4+ и CD8+ клеток селезенки и печени.
Фиг. 41 показывает данные экспериментов по определению того, воздействует ли клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, на печень, путем измерения уровней ALT в сыворотке.
Фиг. 42 показывает иммунное окрашивание отделов печени, взятых через три дня после гидродинамической инъекции PBS, pMCore (HBcAg) или pNS3/4A (HCV NS3-4A) от наивных мышей и мышей, которые были иммунизированы pMCore. Клиренс очень высокий для pMCore-иммунизированной печени по сравнению с №3/4а-трансфектированной контрольной печенью. Экспрессию pMCore или NS3/4A обнаруживали с помощью антитела к НА (белые/светло-серые клетки).
Фиг. 43 показывает 3 дня после трансфекции, в которые клетки анализировали по поводу экспрессии маркера дегрануляции, экспрессии CD107а и IFN-Y+ после стимуляции пептидами HBcAg.
Фиг. 44 показывает уровни ALT в сыворотке в день 3, 6 и 12 после трансфекции, уровни были измерены и не доказали повышения у релевантных вакцинированных животных.
Фиг. 45 показывает общие клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длинной+Ш-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 46 показывает короспецифические клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длинной+Ш-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 47 показывает клеточные иммунные ответы, специфические к поверхностному антигену А, у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 48 показывает данные анализа ELISPOT клеточных иммунных ответов, специфических к поверхностному антигену С, у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длинной+Ш-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 49 показывает общие клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длинной+Ш-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 50 показывает сравнение анти-HBV антител в серийном разведении сыворотки от обезьян, иммунизированных небольшой (т.е. pMCore, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е. pMCore, pLHb А и pLHb С) и длиной +1b-12 (т.е. pMCore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
Фиг. 51 показывает сравнение анти-HBV антител в серийном разведении сыворотки от животных, иммунизированных длинной+Ш-12 (т.е. pMcore, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакциной.
Фиг. 52 показывает ДНК-конструкт поверхностного антигена HBV и его экспрессию. (А) Филогенетический анализ консенсусных последовательностей HBs генотипов А и С по сравнению с природным HBs. Консенсусные последовательности обозначены звездочками. (В) Схематическая диаграмма генных вставок HBs в ДНК-плазмиды. pLHBs и pSHBs представляют большие и небольшие белковые антигены HBs. Белки preSl, preS2 и основной S присоединены к сайтам эндопротеолитического расщепления. (С) Выявление pLHBs и pSHBs с помощью внутриклеточного окрашивания трансфектированных клеток RD моноклональным антителом и поликлональной мышиной сывороткой.
Фиг. 53 показывает, что pLHBs и SHBs вызывают мощные антителопродуцирующий и Т-клеточные ответы у BALB/c. По пять мышей линии Balb/c на группу иммунизировали в трех различных экспериментах и проанализировали их по поводу индукции как гуморального, так и клеточного ответа. (А) HBsспецифические IgG реакции, измеренные через одну неделю после каждой иммунизации. Стрелка указывает время иммунизации. (В) Общие IFN-γ реакции, вызванные каждым конструктом к синтетическим preS1/S2 и основному S пептидам. (С) Характеристика HBs-специфических иммуногенные детерминант с помощью использования отдельных пептидов HBs в 16 и 12-матричных пулах LHBs и SHBs соответственно. Это показывает повышенную ширину клеточно-опосредованного иммунного ответа.
Фиг. 54 показывает in vivo специфический киллинг. Различные группы мышей, иммунизированные либо pVax (контроль), или любым из четырех конструктов HBs, получили CFSE-меченные клеткимишени (CFSElo, пульсирующие с иррелевантным пептидом, или CFSEhi, пульсирующие с эпитопспецифическим пептидом) через хвостовую вену. CFSE-меченые клетки извлекали и анализ с помощью FACS (флуоресцентно-активированный клеточный сортинг) использовали для количественной оценки
- 7 046868 процента киллинга.
Фиг. 55 показывает, что вакцинный коктейль HBc/HBs вызывает устойчивые иммунные реакции. (А) HBs-специфические реакции антител из сывороток от мышей, иммунизированных вакцинным коктейлем HBs/HBc в различные моменты времени иммунизации (стрелка). (В) IFN-γ ответы после ex vivo стимуляции спленоцитов от мышей, иммунизированных коктейлем HBs/HBc. Иммунизированные мыши отвечали как на коровые, так и поверхностные антигенные пептиды.
Фиг. 56 показывает, что антиген-специфические CD8 Т-клетки индуцируют противовирусные цитокины. Внутриклеточное окрашивание антивирусных цитокинов после ex-vivo стимуляции спленоцитов от мышей BALB/c из различных иммунизированных групп (табл. 3). Лимфоциты окрашивали антителами к CD3, CD4, CD8, IFN-γ, TNF-α, IL-2 и CD107а. Эти данные представлены 4 мышами из каждой группы в 3 различных экспериментах.
Фиг. 57 показывает иммуногенность у нечеловекообразных приматов. Пять макак-резусов иммунизировали внутримышечно pSHBs/pMCore, pLHBs/pMCore или pLHBs/pMCore + pIL-12 (табл. 4), а затем с помощью электропорации. Обезьяны получили три прививки. (А) Высокие титры антител к HBs наблюдались только после 2 прививки. (В) Ответы IFN-γ измеряли один раз перед первой иммунизацией и через 2 недели после каждой иммунизации. (С) Многие положительные HBs матричные пептидные пулы наблюдались у большинства обезьян из разных групп, подтверждая широкие Т-клеточные ответы у иммунизированных макак. (D) Внутриклеточное окрашивание (IFN-γ, TNF-α, ИЛ-2) PBMCs после последней иммунизации показывает продуцирование HBs и НВс-специфических антивирусных цитокинов как в CD4, так и в CD8.
Фиг. 58A-58D показывают безопасность терапевтической HBV-вакцины у макак-резусов. Образцы анализировали до вакцинации (pre), после третьей вакцинации (3rd), перед четвертой вакцинацией (pre4th), после четвертой вакцинации (4th). Была ошибка анализа на щелочную фосфатазу после третьей вакцинации. Нормальный диапазон для всех измерений изображен пунктирными линиями. (А) Сывороточная щелочная фосфатаза. (В) Уровни сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT). (С) Уровни сывороточной аспартатаминотрансферазы (AST). (D) Уровни общего билирубина в сыворотке. (Е) Уровни сывороточного креатинина. (F) сывороточные уровни азота мочевины крови.
Фиг. 59A-59D показывают аннотацию последовательностей для четырех плазмид HBs. Последовательности лидера IgE, эндопротеолитического сайта расщепления и С-концевой НА-метки подчеркнуты. Четыре HBs плазмиды: большой поверхностный белок генотипа A (pLHBs-A) (А) и небольшой поверхностный белок (pSHBs-A) (В) и большой поверхностный белок генотипа С (pLHBs-C) (С), и небольшой поверхностный белок (pSHBs-C) (D).
Подробное описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к высокооптимизированным поливалентным синтетическим иммуногенам вируса гепатита В (HBV), которые вызывают продукцию антител и клеточно-опосредованный иммунитет против HBV-поверхностных (HBs) и HBV-коровых (НВс) антигенов. Эти плазмиды, которые кодируют наиболее распространенные генотипы вируса, индуцируют связывающие антитела к HBsантигенам и возбуждают надежный клеточный иммунитет (CMI) к обоим НВс и HBs антигенам.
Плазмиды независимо вызвали широкие кросс-реактивные Т-клеточные ответы и ответы с высоким титром антител, а также вакциноиндуцированную цитотоксическую активность. Плазмидные коктейли, содержащие оба поверхностных антигена, индуцируют сильный и широкий клеточный иммунный ответ по нескольким антигенным эпитопам, в частности, широкую перекрестную реактивность между генотипами А и С вируса. Оптимизированные плазмидные коктейли, кодирующие антигены HBs и НВс, индуцировали сильный гуморальный и клеточный ответ, нацеленный на S-антиген, и повлекли различные мультиэпитопные реакции, связанные с очисткой инфицированных гепатоцитов. В частности, настоящее изобретение относится к вакцинам для вируса гепатита В (HBV), которые могут быть использованы для защиты человека от HBV-инфекции и обеспечить терапевтические преимущества индивидууму с диагнозом HBV-инфекции. Такие вакцины также могут быть использованы для индукции иммунного ответа против антигена HBV. HBV-вакцины согласно настоящему изобретению содержат одну или несколько молекул нуклеиновых кислот. В частности, молекула нуклеиновой кислоты кодирует один или несколько консенсусных коровых белков HBV. Консенсусные коровые белки HBV получают из последовательностей коровых белков генотипов А, В, С, D м Е HBV, и, следовательно, консенсусные коровые белки HBV являются уникальными. Молекулы нуклеиновых кислот могут также кодировать один или более иммуногенных фрагментов консенсусных коровых белков HBV.
Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот могут кодировать один или более консенсусных поверхностных антигенов HBV. Консенсусные поверхностные антигены HBV получают из последовательностей поверхностных антигенов из изолятов генотипа А HBV, и, следовательно, консенсусные поверхностные антигены HBV являются уникальными. Консенсусные поверхностные антигены HBV также могут быть получены из последовательностей поверхностных антигенов из изолятов генотипа С HBV, давая уникальные поверхностные антигены HBV. Молекулы нуклеиновой кислоты могут также кодировать один или более иммуногенных фрагментов консенсусных поверхностных антигенов HBV.
- 8 046868
Вакцина согласно настоящему изобретению может включать любую комбинацию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный коровый белок HBV, и/или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный поверхностный антиген HBV. Вакцина также может включать любую комбинацию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные фрагменты консенсусного корового белка HBV, и/или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные фрагменты консенсусного поверхностного антигена HBV.
Эти комбинации корового белка HBV и поверхностного антигена HBV удивительно и неожиданно индуцируют дифференциальный иммунный ответ на коровый белок HBV и поверхностный антиген HBV. Другими словами, сила иммунного ответа на коровый белок HBV и поверхностный антиген HBV отличается в зависимости от конкретной комбинации, вводимой субъекту. Соответственно, любой пользователь вакцины согласно настоящему изобретению может создать вакцину, которая содержит определенную комбинацию, чтобы вызвать желаемый иммунный ответ у субъекта, которому вводят такую разработанную вакцину. Таким образом, любой пользователь может адаптировать вакцину согласно настоящему изобретению, чтобы контролировать уровень иммунного ответа у субъекта.
Вакцина согласно настоящему изобретению широко применяется для различных типов HBV благодаря уникальным последовательностям консенсусного корового белка HBV и поверхностного антигена HBV.
Вакцина согласно настоящему изобретению может дополнительно включать одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, как описано выше, и один или несколько белков, кодируемых такой молекулой нуклеиновой кислоты.
1. Определения.
Терминология, использованная в настоящем документе с целью описания конкретных вариантов осуществления, не предназначена для ограничения. Как используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Для чтения числовых диапазонов в данном документе каждое промежуточное число между ними с той же степенью точности явно предусмотрено. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 рассматриваются в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0, числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, и 7,0 явно предусмотрены. Адъювант, как используется в данном документе, означает любую молекулу, добавленную к ДНК-плазмидным вакцинам, описанным в настоящем документе, для повышения иммуногенности антигенов, кодируемых ДНК-плазмидами и кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот, описанными в настоящем документе ниже. Антитело, как используется в данном документе, означает антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или фрагменты, или их фрагменты или производные, включая Fab, F (ab')2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифические антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из сыворотки образца млекопитающего, поликлональное антитело, аффинно-очищенное антитело или их смеси, которые обладает достаточной специфичностью связывания с нужным эпитопом или последовательностью, полученной из него.
Кодирующая последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота, как используется в данном документе, означает нуклеиновые кислоты (РНК или ДНК-молекула), которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанный с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках человека или млекопитающих, которым вводят нуклеиновою кислоту. Комплемент или комплементарный, как используется в данном документе, означает нуклеиновую кислоту, может означать спаривание оснований Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстена между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот.
Консенсус или консенсусная последовательность, как используется в данном документе, означает полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания нескольких подтипов конкретного HBV-антигена, такого как коровый или поверхностный антиген HBV. Могут быть получены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательности. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие белки, могут быть использованы для индуцирования иммунитета против широкого множества подтипов или серотипов конкретного антигена HBV.
Электропорация, электро-пермеабилизация или электро-кинетический энхансмент (ЕР), как используется в данном документе взаимозаменяемо, означает использование импульса трансмембранного электрического поля, чтобы вызвать микроскопические пути (поры) в биомембранах; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, пройти с одной стороны клеточной мембраны на другую.
Фрагмент, как используется в данном документе относительно последовательности нуклеиновой кислоты, означает последовательность нуклеиновой кислоты, или ее часть, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, которые перекрестно реагируют с полно
- 9 046868 размерным антигеном штамма HBV дикого типа. Фрагменты могут быть фрагментами ДНК, выбранными из по меньшей мере одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют белковые фрагменты, описанные ниже.
Фрагмент или иммуногенный фрагмент относительно полипептидных последовательностей означает полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с полноразмерным антигеном штамма HBV дикого типа. Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% консенсусного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 20 аминокислот или более по меньшей мере 30 аминокислот или более, по меньшей мере 40 аминокислот или более по меньшей мере 50 аминокислот или более по меньшей мере 60 аминокислот или более по меньшей мере 70 аминокислот или более по меньшей мере 80 аминокислот или более по меньшей мере 90 аминокислот или более по меньшей мере 100 аминокислот или более по меньшей мере 110 аминокислот или более по меньшей мере 120 аминокислот или более по меньшей мере 130 аминокислот или более по меньшей мере 140 аминокислот или более по меньшей мере 150 аминокислот или более по меньшей мере 160 аминокислот или более по меньшей мере 170 аминокислот или более по меньшей мере 180 аминокислот или более по меньшей мере 190 аминокислот или более по меньшей мере 200 аминокислот или более по меньшей мере 210 аминокислот или более по меньшей мере 220 аминокислот или более по меньшей мере 230 аминокислот или более, или по меньшей мере 240 аминокислот или более консенсусного белка.
Как используется в данном документе, термин генетический конструкт относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках индивидуума, которому молекулу нуклеиновой кислоты вводят. Как используется в данном документе, термин экспрессирующая форма относится к генным конструктам, содержащим необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок, таким образом, что когда они присутствуют в клетке индивидуума, кодирующая последовательность будет экспрессироваться.
Термин гомология, как используется в данном документе, относится к степени комплементарности. Может быть частичная гомология или полная гомология (т.е. идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует полностью комплементарную последовательность из гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, называют с помощью функционального термина по существу гомологичными. При использовании касательно последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, термин по существу гомологичные, как используется в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с цепью последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании касательно последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин по существу гомологичные, как используется в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с (т.е. является комплементом) матричной последовательностью одноцепочечной нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
Идентичные или идентичность, как используется в данном документе в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, означает, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются такими же в пределах определенной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения числа положений, в которых идентичные остатки присутствуют в обеих последовательностях с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее количество положений в указанной области, и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В тех случаях, когда эти две последовательности имеют разную длину или выравнивание производит один или несколько расположенных в шахматном порядке концов и определенная область сравнения включает только одну последовательность, остатки одной последовательности включены в знаменатель, но не числитель расчета. При сравнении ДНК и РНК, тимин (Т) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентичность может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательностей, такого как BLAST или BLAST 2.0. Иммунный ответ, как используется в данном документе, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена, такого как консенсусный антиген HBV. Иммунный ответ может быть в виде клеточного или гуморального ответа, или того и другого.
Нуклеиновая кислота или олигонуклеотид или полинуклеотид, как используется в данном документе означает, по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота включает также комплементарную цепь описанной одной цепи. Многие варианты нуклеиновой
- 10 046868 кислоты могут быть использованы с той же целью как и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота включает также по сути идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.
Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, или могут содержать участки как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномные, так и кДНК, РНК или гибрид, в котором нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин гипоксантин, изоцитозина и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены методами химического синтеза или рекомбинантными способами. Термин функционально связанный, как используется в данном документе, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор можно расположить в положении 5' (апстрим) или 3' (даунстрим) гена под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть примерно таким же, как расстояние между указанным промотором и геном, который он контролирует, в гене, из которого промотор получен. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может обеспечиваться без потери функции промотора.
Промотор, как используется в данном документе, означает синтетическую или природнополученную молекулу, которая способна придавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может включать одну или более конкретных последовательностей, регулирующих транскрипцию, чтобы дополнительно усилить экспрессию и/или изменить пространственную экспрессию и/или временную экспрессию нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут размещаться на расстоянии до несколько тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно, либо дифференцированно по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия или по отношению к стадии развития, при которой происходит экспрессия, либо в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогенные микроорганизмы, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промотеров включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, промотор 1ас-оператора, tac-промотор, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
Сигнальный пептид и лидерная последовательность используются здесь взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может связываться с амино-концом белка HBV, указанного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, как правило, направляют локализацию белка. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, используемые в настоящем описании, предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он произведен. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляется от остальной части белка, часто упоминаемого как зрелый белок, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности присоединяются к N-концу белка. Жесткие условия гибридизации, как используется в данном документе, означают условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) гибридизирует со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), такой как в сложной смеси нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны, чтобы составлять приблизительно на 5-10°С ниже, чем точка плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Tm может быть температурой (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируют с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, приблизительно 0,01-1,0 М концентрация иона натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, а температура составляет, по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более чем приблизительно 50 нуклеотидов Жесткие условия могут быть также достигнуты при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации, положительный сигнал может составлять, по меньшей мере от 2 до 10 раз фоновой гибридизации. Примеры жестких условий гибридизации включают следующее: 50% формамид, 5-кратный SSC и 1% SDS, инкубация при 42°С, или, 5х SSC, 1% SDS, инкубация при 65°С, с промывкой в 0,2 х SSC и 0,1% SDS при 65°С.
Практически комплементарные, как используется в данном документе, означает, что первая последовательность, по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентична комплементу второй последовательности по области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или
- 11 046868 более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируют в жестких условиях гибридизации.
Практически идентичные, как используется в данном документе, означает, что первая последовательность, по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентична по области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот или относительно к нуклеиновым кислотам, если первая последовательность, по существу, дополняет состав второй последовательности.
Подтип или серотип: как используется в данном документе, взаимозаменяемы, и относительно HBV означает генетические варианты HBV, так что один подтип распознается иммунной системой отдельно от другого подтипа. Вариант, используемый здесь в связи с нуклеиновой кислотой, означает (I) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (II) комплемент указанной нуклеотидной последовательности или ее части; (III) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (IV) нуклеиновую кислоту, которая гибридизирует в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементом, или последовательности, по существу, идентичные ей.
Вариант относительно пептида или полипептида, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативным замещением аминокислот, но сохраняет, по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант может также означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична указанному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет, по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, то есть, замена аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных участков), признается в уровне техники, как правило, таким, что включает незначительные изменения. Эти незначительные изменения могут быть определены, в частности, при рассмотрении индекса гидропатичности аминокислот, как известно в данной области. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидропатичности аминокислот Гидропатический индекс аминокислоты основан на рассмотрении его гидрофобности и заряда. Как известно в данной области техники, аминокислоты с подобными индексами гидропатичности могут быть замещенными и по-прежнему сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты, имеющие индексы гидропатичности ± 2 замещаются. Гидрофильность аминокислот может быть также использована для выявления замещений, которые могли бы дать белки, сохраняющие биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, полезное измерение, которое, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4 554 101, включенный в данный документ в полном объеме путем ссылки. Замещение аминокислот, имеющих аналогичные величины гидрофильности, может привести к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например, иммуногенность, как известно в данной области. Замещения могут быть выполнены с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в пределах ± 2 относительно друг друга. Как индекс гидрофобности, так и значение гидрофильности аминокислот зависят от конкретной боковой цепи этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением, аминокислотные замещения, которые совместимы с биологической функцией, как подразумевается, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, как обнаружено с помощью гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и других свойств. Вектор, как используется в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может быть вирусным вектором, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или искусственной хромосомой дрожжей. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть самовоспроизводящимся экстрахромосомным вектором, и предпочтительно, представляет собой плазмидную ДНК.
2. Вакцины.
Настоящее изобретение относится к вакцине против гепатита В. Вакцина против гепатита В (HBV) может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую коровый антиген HBV, поверхностный антиген HBV или их комбинацию; коровый антиген HBV, поверхностный антиген HBV или их комбинации, или комбинацию (1) нуклеиновой кислоты, кодирующей коровый антиген HBV и/или поверхностный антиген HBV, и (2) корового антигена HBV и/или поверхностного антигена HBV, или (3) их комбинации. Коровый антиген HBV может содержать консенсусный белок, полученный из аминокислотных последовательностей капсидных белков от различных генотипов HBV. Аналогичным образом, поверхностный антиген HBV может содержать консенсусный белок, полученный из аминокислотных последовательностей поверхностных антигенов от нескольких генотипов HBV. Такой коровый белок HBV и консенсусные поверхностные антигены HBV являются уникальными и имеют сходство с коровыми и поверхностными антигенами, соответственно, в целом по нескольким генотипам HBV. Таким образом, вакцина согласно настоящему изобретению применима к нескольким типам HBV и подходит для распространенных популяций. Кроме того, вакцина согласно настоящему изобретению может быть приспособлена к кон
- 12 046868 кретным нуклеиновым кислотам, кодирующим консенсусный коровый белок HBV, консенсусный поверхностный белок HBV или их комбинацию. Другими словами, вакцина согласно настоящему изобретению может быть предназначена для контроля уровня или силы иммунного ответа у субъекта против одного или нескольких серотипов HBV.
Вакцина может быть ДНК-вакциной. ДНК-вакцины раскрыты в патентах США № 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055 и 5676594, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые ингибируют ее интеграцию в хромосому.
Вакцина может быть РНК капсидного белка HBV и/или белком поверхностного антигена HBV. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
а. Коровый антиген HBV.
Вакцина согласно настоящему изобретению может содержать коровый белок HBV. Коровый белок HBV является мишенью для иммунно-опосредованного вирусного клиренса, вызывая 1) ЦТЛ ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), 2) Т-хелперные ответы и/или 3) ответы В-клеток или, предпочтительно, все вышеуказанные для перекрестной презентации.
Табл. 2 показывает сходство между генотипами корового антигена из генотипов HBV-A, HBV-B, HBV-C, HBV-D и HBV-E с консенсусным коровым белком HBV, названным в графе как HBV-M-core. Для некоторых вариантов осуществления М-коровый конструкт HBV был разработан для увеличения гомологии для широкого круга коровых мишеней HBV. Сходства генотипов для корового антигена с разработанным М-коровым конструктом увеличили гомологии для широкого круга коровых мишеней HBV. Все генотипы должны быть представлены в универсальной иммунной терапевтической вакцине для HBV.
Таблица 2
Процент идентичности коровых белков HBV
Процент идентичности
отклонение | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |||
1 | 96,2 | 96,2 | 97,8 | 95,6 | 98,4 | 1 -HBV-A-ConCore | |||
2 | 3,9 | 100 | 95,6 | 93,4 | 96,7 | 2 -HBV-B-ConCore | |||
3 | 3,9 | 0 | 95,6 | 93,4 | 96,7 | 3 -HBV-C-ConCore | |||
4 | 2,2 | 4,5 | 4,5 | 97,8 | 97,8 | 4 -HBV-D-ConCore | |||
5 | 4,5 | 6,9 | 6,9 | 2,2 | 95,6 | 5 -HBV-E-ConCore | |||
6 | 1,7 | 3,4 | 3,4 | 2,2 | 4,5 | 6 -HBV-M-Core | |||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Антиген может содержать эпитопы корового белка, которые делают их эффективными, в частности, в качестве иммуногенов, против которых анти-HBV иммунные ответы могут быть индуцированы. Антиген HBV может содержать полноразмерный продукт, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
Коровый антиген HBV может содержать консенсусный белок. Консенсусный коровый антиген HBV индуцирует антиген-специфическую Т-клетку и высокий титр антител как системно, так и в печени. Таким образом, защитный иммунный ответ обеспечивается в печени с помощью вакцин, содержащих консенсусный коровый антиген HBV. Соответственно, любой пользователь может создать вакцину согласно настоящему изобретению, которая включает консенсусный коровый антиген HBV, чтобы обеспечить иммунную терапию и/или защиту печени.
В частности, в индуцированной иммунной реакции, консенсусный коровый антиген HBV стимулирует спленоциты, в частности CD4+ клетки и CD8+ клетки, секретировать или производить аналогичные количества интерферона-гамма (INF-γ), но различные количества фактора некроза опухоли-альфа (TNFα). Интересно, индуцированный иммунный ответ отличается в селезенке и печени. В селезенке, CD8+ клетки продуцируют как INF-γ, так и TNF-α больше, чем CD4+ клетки, однако в печени происходит обратное. Другими словами, CD4+ клетки продуцируют как INF-γ, так и TNF-α больше, чем CD8+ клетки в печени. Кроме того, в печени продуцируется больше антиген-специфических IgA чем IgG, а защитный иммунный ответ удивительно и неожиданно включает антиген-специфический ответ ЦТЛ, который не вызывает повреждения печени. Соответственно, вакцина согласно настоящему изобретению, содержащая консенсусный коровый антиген HBV, может быть доставлена на периферию, чтобы наладить антиген-специфическое нацеливание в печень для очистки или устранения HBV-инфицированных клеток без повреждения или воспаления печени. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие консенсусные коровые белки HBV, представляют собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 1 кодирует консенсусный коровый белок HBV. SEQ ID NO: 3 кодирует консенсусный коровый белок HBV, присоединенный к лидеру IgE. SEQ ID NO: 5 кодирует консенсусный коровый белок HBV, присоединенный к лидеру IgE и метке НА.
- 13 046868
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих белки, идентичные или гомологичные консенсусному белку HBV, иммуногенному фрагменту из консенсусного белка HBV, и их иммуногенные фрагменты гомологичных белков. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют до 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, вплоть до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 97% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 98% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности из консенсусной последовательности и до 99% могут быть предоставлены. Кроме того, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, указанные в данном документе, и иммуногенные фрагменты белков, идентичных белкам, указанным в данном описании, также предоставляются.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 95% гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 96% гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 97% гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 98% гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 99% гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, описанными в настоящем документе, которые гомологичны кодирующей последовательности консенсусного белка, раскрытого в настоящем документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует гомологичные белковые последовательности, описанные в настоящем документе.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих белки с определенной процентной идентичностью по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового консенсусного белка HBV, иммуногенный фрагмент из корового консенсусного белка HBV и иммуногенные фрагменты коровых консенсусных белков HBV. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют до 80% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 85% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 91% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 92% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 93% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 94% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 97% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 98% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 99% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV могут быть обеспечены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, указанные в настоящем документе, и иммуногенные фрагменты белков с аналогичным процентом идентичности, как указано выше, с коровыми белками HBV, описанными в данном документе. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 80% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 83% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нук
- 14 046868 леиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 85% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 90% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 91% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 92% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 93% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 94% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 95% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 96% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 97% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 98% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 99% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, описанными в настоящем документе, которые гомологичны кодирующей последовательности консенсусного корового белка HBV, раскрытого в настоящем документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует гомологичные белковые последовательности, описанные в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидер IgE.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к фрагментам SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. Фрагменты могут составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% от последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают последовательности, которые кодируют лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фраг
- 15 046868 менты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодирует лидерную последовательность, такую как, например, лидер IgE.
Кроме того, аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV представляет собой SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV, присоединенная к лидеру IgE, представляет собой SEQ ID NO: 4. В частности, в SEQ ID NO: 4, лидер IgE присоединен к амино-концу консенсусного корового белка HBV. Аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV, присоединенного к лидеру IgE и метке НА, представляет собой SEQ ID NO: 6. Bn SEQ ID NO: 6, лидер IgE и метка НА присоединены к амино-концу и карбокси-концу, соответственно, консенсусного корового белка HBV. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые гомологичны SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 95% гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 96% гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 97% гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 98% гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 99% гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые идентичны SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 80% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 85% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 90% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 91% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 92% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 93% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 94% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 95% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 96% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 97% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 98% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам,
- 16 046868 которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 99% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации изобретения белок свободен от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения белок свободен от лидера IgE. Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% консенсусного белка. Иммуногенные фрагменты последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 могут быть обеспечены. Иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE.
Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, гомологичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% белков, которые на 95% гомологичны последовательностям SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 96% гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 97% гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 98% гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 99% гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE. Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6 могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% белков, которые на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичны по всей длине аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE. Как указано в данном описании относительно присоединения сигнального пептида или лидерной последовательности к N-концу белка, сигнальный пептид/лидерная последовательность заменяет N-концевой метионин белка, который кодируется старткодоном последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок без кодирующих последовательностей сигнального пептида. Таким образом, например, SEQ ID NO: 4 представляет собой SEQ ID
- 17 046868
NO: 2 с сигнальным пептидом/лидерной последовательностью, присоединенным к N-концу последовательности SEQ ID NO: 2, т.е. SEQ ID NO: 4 является белком, содержащим сигнальный пептид, присоединенный к N-концу последовательности SEQ ID NO: 2. Первый остаток в SEQ ID NO: 2, Хаа, как правило, является метионином в отсутствие сигнального пептида. Однако, белки, которые содержат сигнальные пептиды, присоединенные к SEQ ID NO: 2, такие как SEQ ID NO: 4, заменяют остаток 1 метионина в Хаа остатком, который присоединяет сигнальный пептид к белку. Соответственно, N-концевой остаток последовательности SEQ ID NO: 2 может быть любым, но если он кодируется последовательностью инициации, то это метионин. Связь сигнального пептида/лидерной последовательности с N-концом на SEQ ID NO: 2, как правило, исключает N-концевой метионин. Как используется в данном документе, предполагается, что SEQ ID NO: 4 содержит SEQ ID NO: 2 с сигнальным пептидом/лидерной последовательностью, связанной с N-концом на SEQ ID NO: 2, несмотря на устранение N-концевого Хаа-остатка последовательности SEQ ID NO: 2. Аналогичным образом, кодирующие последовательности для SEQ ID NO: 4 содержат последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 2 с последовательностями, кодирующими сигнальный пептид/лидерную последовательность, присоединяющиеся к 5'-концу последовательностей, кодирующих SEQ ID NO: 2. Инициирующий кодон может быть nnn в кодирующих последовательностях для SEQ ID NO: 2, но он элиминируется, когда кодирующие последовательности сигнального пептида/лидерной последовательности, связанного с 5'-концом кодирующих последовательностей, которые кодируют SEQ ID NO: 2. Как используется в данном документе, предполагается, что кодирующие последовательности для SEQ ID NO: 4 содержат кодирующие последовательности для SEQ ID NO: 2 с кодирующими последовательности для сигнального пептида/лидерной последовательности, присоединенной к 5'-концу кодирующей последовательности SEQ ID NO: 2, где встречается nnn. Таким образом, например, предполагается, что SEQ ID NO: 3 содержит SEQ ID NO: 1 с кодирующими последовательностями для сигнального пептида/лидерной последовательности, присоединенной к 5'-концу последовательности SEQ ID NO: 1 вместо nnn. В некоторых вариантах реализации изобретения nnn является кодоном инициации на 5'-конце последовательности SEQ ID NO: 1.
b. Поверхностный антиген HBV.
Вакцина может содержать поверхностный антиген HBV. Настоящая заявка предлагает поверхностные антигены HBV, способные вызывать иммунную реакцию у млекопитающих против одного или более серотипов HBV. Поверхностные антигены могут содержать эпитопы поверхностных белков, которые делают их эффективными, в частности, в качестве иммуногенов, против которых анти-HBV может быть вызвана иммунная реакция. Поверхностный антиген HBV может содержать полноразмерный трансляционный продукт, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
Поверхностный антиген HBV может содержать консенсусный белок. Консенсусные поверхностные антигены HBV получают из последовательностей поверхностных антигенов первичных изолятов генотипа А или С HBV. В частности, консенсусные поверхностные антигены HBV включают S-белок или комбинацию S-белка, пре^2 и пре-S! (фиг. 3 и 4). Эндопротеолитические сайты расщепления вводятся в консенсусные поверхностные антигены HBV для обеспечения правильного белкового фолдинга и лучшего ЦТЛ-процессирования. Использование кодонов в консенсусных поверхностных антигенах HBV было модифицировано, чтобы отразить кодонное смещение человеческих генов. Кроме того, удалось избежать областей с очень высоким (например, больше, чем 80 процентов) или очень низким (например, меньше, чем 30 процентов) содержанием GC, где находились цис-действующие мотивы, такие как внутренние ТАТА-боксы, повторные последовательности и структурированные последовательности. Последовательность Козак ввели в консенсусные поверхностные антигены HBV для повышения инициации трансляции и лидерную последовательность IgE добавили для повышения экспрессии белка.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая консенсусные поверхностные антигены HBV, представляет собой SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, и SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 9 кодирует белок длинного консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа А, и включает S-белок, пре^2 и пре-S! (LHBs-A). SEQ ID NO: 11 кодирует белок длинного консенсусного поверхностного антигена HBV, полученного из генотипа С, и включает S-белок, пре^2 и пре^1 (LHBsC). SEQ ID NO: 13 кодирует белок короткого консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа А, и включает S-белок (SHBs-A). SEQ ID NO: 15 кодирует белок короткого консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа С, и включает S-белок (SHBs-C).
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки, идентичные по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных поверхностных антигенов HBV, иммуногенным фрагментам консенсусных поверхностных антигенов HBV и иммуногенным фрагментам идентичных белков. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, которые имеют до 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV, до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV, до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV, до 97% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV,
- 18 046868 до 98% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV и до 99% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV могут быть обеспечены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, описанные в настоящей заявке, и иммуногенные фрагменты белков, идентичных по всей длине аминокислотной последовательности белкам поверхностного антигена HBV, описанным в настоящей заявке.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 95% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 96% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 97% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 98% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 99% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, раскрытыми в настоящем документе, которые идентичны по всей длине аминокислотной последовательности кодирующей последовательности белка консенсусного поверхностного антигена HBV, раскрытого в настоящем документе, включает последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует идентичные белковые последовательности, раскрытые в настоящем документе
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки с определенным процентом идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного консенсусного белка поверхностного антигена HBV, иммуногенного фрагмента консенсусного белка поверхностного антигена HBV и иммуногенных фрагментов консенсусных белков поверхностного антигена HBV. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, которые имеют до 80% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 85% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 91% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 92% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 93% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 94% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 96% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 97% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 98% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 99% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV могут быть предоставлены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, описанные в настоящей заявке, и иммуногенные фрагменты белков с похожим процентом идентичности, как указано выше, с белками поверхностных антигенов HBV, описанными в настоящей заявке.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 80% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам
- 19 046868 нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 83% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 85% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 90% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 91% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 92% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 93% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 94% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 95% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 96% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 97% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 98% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 99% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями поверхностных антигенов HBV, раскрытых в данном документе, идентичны по всей длине аминокислотной последовательности кодирующей последовательности белка консенсусного поверхностного антигена HBV, раскрытого в данном документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует идентичные белковые последовательности, раскрытые в данном документе.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидер IgE.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15. Фрагменты могут составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% последовательности SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по
- 20 046868 меньшей мере 99% идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают последовательности, которые кодируют лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодируют лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодируют лидерную последовательность, такую как лидер IgE.
Кроме того, аминокислотные последовательности консенсусных поверхностных антигенов HBV, LHBs-A, LHBs-C, SHBs-A и SHBs-C представляют собой SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, соответственно.
Белки могут быть идентичными последовательностям SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 95% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 96% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 97% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 98% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 99% идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые идентичны последовательностям SeQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID nO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 80% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 85% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 90% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 91% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 92% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 93% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 94% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 95% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 96% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 97% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO:
- 21 046868
16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 98% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 99% идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцессированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.
Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% консенсусного белка. Иммуногенные фрагменты последовательностей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID nO: 16 могут быть обеспечены. Иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.
Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% белков, которые на 95% идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.
Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% белков, которые на 95% идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 96% идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 97% идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 98% идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 99% идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу.
с. Комбинация коровых и поверхностных антигенов HBV.
Вакцина может содержать комбинацию коровых и поверхностных антигенов HBV, как описано выше. Эта комбинация антигенов HBV способна вызывать иммунный ответ у млекопитающего на один или более серотипов HBV. Вакцина может быть разработана с учетом или иметь определенную комбинацию антигенов HBV, которые, в свою очередь, обеспечивают возможность контролировать уровень или силу иммунного ответа у млекопитающего.
Комбинации могут содержать одну али более нуклеиновых кислот, кодирующих (1) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (2) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A и LHBs-C; (3) HBV-M-Core, LHBs-A, и SHBs-A; (4) HBV-M-Core и LHBs-A; (5) HBV-M-Core, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (6) HBVM-Core, LHBs-C, и SHBs-C; (7) HBV-M-Core и SHBs-C; (8) HBV-M-Core, LHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (9) HBV-M-core, LHBs-A, и SHBs-C; (10) HBV-M-Core и SHBs-C; (11) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, и
- 22 046868
SHBs-C; (12) HBV-M-Core, LHBs-A, и SHBs-C; (13) HBV-M-Core, SHBs-A, и SHBs-C; (14) LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (15) LHBs-A, SHBs-A, и LHBs-C; (16) LHBs-A и SHBs-A; (17) SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (18) LHBs-C и SHBs-C; (19) LHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (20) LHBs-A и SHBs-C; (21) LHBs-A, SHBs-A, и SHBs-C; (22) LHBs-A и SHBs-C; (23) SHBs-A и SHBs-C; (24) HBV-M-Core и SHBs-A; (25) HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C; или (26) LHBs-A и LHBs-C.
Примерный вариант осуществления изобретения относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C. Другой иллюстративный вариант осуществления относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBVM-Core, SHBs-A и SHBs-C. Еще один вариант осуществления относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C и адъювант, такой как IL-12. Комбинационная вакцина также содержит один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV в виде одной или нескольких белковых субъединиц, одну или более убитых вирусных частиц, содержащих один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок консенсусного поверхностного антигена HBV, или одну или более ослабленных вирусных частиц, содержащих один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV. Ослабленная вакцина может быть ослабленной живой вакциной, убитой вакциной и вакцинами, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных генов, которые кодируют один или несколько консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV, а также субъединицы и гликопротеиновые вакцины. Примеры ослабленных живых вакцин, тех, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных антигенов, субъединичных вакцин и вакцин гликопротеинов, описаны в патентах США № 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487;
5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668;
5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5453364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579;
5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
d. Вакцинные продукты и плазмиды.
Вакцина может содержать конструкты нуклеиновой кислоты или плазмиды, которые кодируют коровые белки HBV, поверхностные антигены HBV, и комбинации коровые белки HBV/поверхностные антигены. Предлагаемыми в настоящей заявке являются генетические конструкты, которые могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует коровый антиген HBV, описанный в настоящем документе, включая консенсусные белковые последовательности, последовательности, гомологичные консенсусным белковым последовательностям, фрагменты консенсусных белковых последовательностей и последовательности, гомологичные фрагментам консенсусных белковых последовательностей. Кроме того, предлагаемыми в настоящей заявке являются генетические конструкты, которые могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует поверхностный антиген HBV, описанный в настоящем документе, последовательности, гомологичные консенсусным белковым последовательностям, фрагменты консенсусных белковых последовательностей и последовательности, гомологичные фрагментам консенсусных белковых последовательностей. Генетический конструкт может присутствовать в клетке в виде функционирующей экстрахромосомальной молекулы. Генетический конструкт может быть линейной минихромосомой, включая центромеры, теломеры или плазмиды или космиды. Генетический конструкт может также быть частью генома рекомбинантного вирусного вектора, включая рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус ассоциированный вирус и рекомбинантный вирус осповакцины. Генетический конструкт может быть частью генетического материала в ослабленных живых микроорганизмах или рекомбинантных микробных векторов, которые живут в клетках.
Генетические конструкты могут содержать регуляторные элементы для экспрессии генов, кодирующих последовательности нуклеиновой кислоты. Регулирующие элементы могут быть промотором, энхансерным инициирующим кодоном, стоп-кодоном или сигналом полиаденилирования.
Последовательности нуклеиновых кислот могут составить генетический конструкт, который может быть вектором. Вектор может быть способен экспрессировать антиген в клетке млекопитающего в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Вектор может быть рекомбинантным. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может быть плазмидой. Вектор может быть полезным для трансфекции клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, который культивируют с трансформированной клеткой-хозяином и выдерживают в условиях, в которых экспрессия антигена имеет место. Кодирующие последовательности можно оптимизировать для стабильности и высоких уровней экспрессии. В некоторых случаях, кодоны выбирают так, чтобы уменьшить образование вторичной структуры РНК, такой как та, что формируется за счет внутримолекулярной связи.
Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, и может дополнительно содержать инициирующий кодон, который может располагаться по ходу транскрипции антигенкодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может располагаться против хода транскрипции антигенкодирующей последовательности. Кодон инициации и стоп-кодон может располагаться
- 23 046868 в рамке с антигенкодирующей последовательностью. Вектор может также содержать промотор, который функционально связан с антигенкодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей антиген, может быть промотором из вируса обезьян 40 (SV40), вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотором вируса иммунодефицита человека (HIV) промотором, таким как промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса бычьего иммунодефицита (BIV), промотором вируса Молони, промотором вируса птичьего лейкоза (ALV), промотором цитомегаловируса (CMV), промотором, таким как непосредственно ранний промотор CMV, промотором вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотором вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор может быть также промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, миозин человека, гемоглобин человека, человеческий мышечный креатин или металлотионеин. Промотор может быть также тканеспецифическим промотором, таким мышечно или кожно специфическим промотором, природным или искусственным, или кожи конкретного промотора, природные или синтетические. Примеры таких промоторов описаны в публикации патентной заявки США № US20040175727, содержание которой включено в настоящее описание во всей своей полноте.
Вектор может также содержать сигнал полиаденилирования, который может располагаться против хода транскрипции последовательности, кодирующей коровый белок HBV. Сигнал полиаденилирования может быть сигналом полиаденилирования SV40, сигналом полиаденилирования LTR, сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигналом полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигналом полиаденилирования β-глобина. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования из вектора рСЕР4 (Invitrogen, San Diego, CA).
Вектор может также содержать энхансер, расположенный против хода транскрипции последовательности, кодирующей консенсусный коровый белок HBV, или последовательности, кодирующей белок консенсусного поверхностного антигена HBV. Энхансер может быть необходим для экспрессии ДНК. Энхансер может быть человеческим актином, человеческим миозином, человеческим гемоглобином, человеческим мышечным креатином или вирусным энхансером, таким как энхансер из CMV, НА, RSV или EBV. Энхансеры функции полинуклеотида описаны в патентах США № 5 593 972, 5 962 428, а также WO 94/016737, содержание каждого из них в полном объеме включено в качестве ссылки.
Вектор может также содержать точку начала репликации от млекопитающих, чтобы поддерживать вектор экстрахромосомально и продуцировать несколько копий вектора в клетке. Вектор может быть pVAX1, pCEP4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, СА), который может содержать точку начала репликации вируса Эпштейн-Барра и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которые могут продуцировать высокого копирования эписомную репликацию без интеграции. Вектор может быть pVAX1 или вариантом pVax1 с изменениями, таким как вариантная плазмида, описанная в данном документе. Вариантной плазмидой pVax1 является вариант из 2998 пар оснований скелетной векторной плазмиды pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad СА). Промотор CMV расположен у оснований 137-724. Промотор/сайт примирования Т7 расположен у оснований 664-683. Несколько сайтов клонирования расположены у оснований 696811. Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста расположен у оснований 829-1053. Ген устойчивости к канамицину находится у оснований 1226-2020. Точка начала репликации pUC расположена у оснований 2320-2993.
Исходя из последовательности pVAX1, доступной от Invitrogen, следующие мутации могут быть обнаружены в последовательности pVAX1, которая используется в качестве скелета для плазмид 1-6, указанных в настоящем документе:
C>G 241 в промоторе CMV
C>T1942 скелет, по ходу транскрипции сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpolyA)
А> -2876 скелет, по ходу транскрипции гена устойчивости к канамицину
C>T3277 в точке начала репликации pUC (Ori), мутация с высоким числом копий (см. Nucleic Acid Research 1985)
G>C 3753 в самом конце pUC Ori против хода транскрипции сайта RNASeH
Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются от ACT до CTG в скелете, против хода транскрипции промотора CMV.
Скелетом вектора может быть pAV0242. Вектор может быть типом 5 вектора аденовируса, дефектного по репликации (Ad5).
Вектор может также содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетках млекопитающих или человека, в которые вводят вектор. Консенсусная кодирующая последовательность HBV может содержать кодон, который может позволить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.
Вектором может быть pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для продуцирования белка в Escherichia coli (E. coli). Вектором также может быть pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вектором также может быть полная бакуловирусная экспрессионная система
- 24 046868
МАХВАС™ (Invitrogen, San Diego, Calif), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Вектором также может быть pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif), которые могут быть использованы для продуцирования белка в млекопитающих клетках, таких как овариальные клетки китайского хомячка (СНО). Вектором могут быть векторы экспрессии или системы для продуцирования белка с помощью рутинных технологий и легко доступных исходных материалов, включая Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring Harbor (1989), которые включены в полном объеме в виде ссылки.
В некоторых вариантах реализации изобретения вектор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 17 кодирует консенсусный коровый белок HBV, a SEQ ID NOS: 18-21 кодируют консенсусный поверхностный антиген HBV. Карты векторов SEQ ID NOS: 17-21 показаны на фиг. 5-9, соответственно.
е. Фармацевтические композиции вакцины.
Вакцина может быть в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину.
Фармацевтические композиции могут содержать приблизительно от 5 нанограмм до приблизительно 10 мг вакцинной ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции согласно настоящем изобретению содержат приблизительно от 25 нанограмм до приблизительно 5 мг вакцинной ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 50 нанограмм до приблизительно 1 мг ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 5 до приблизительно 250 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 15 до приблизительно 150 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 100 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 до приблизительно 75 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 до приблизительно 50 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 до приблизительно 40 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 10 микрограмм до приблизительно 100 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 20 микрограмм до приблизительно 80 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 25 микрограмм до приблизительно 60 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 30 нанограмм до приблизительно 50 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 35 нанограмм до приблизительно 45 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нанограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260,
265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370,
375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480,
485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690,
695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800,
805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910,
915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может
- 25 046868 содержать по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг или более ДНК вакцины.
В других вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нанограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215,
220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325,
330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435,
440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645,
650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755,
760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865,
870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975,
980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг ДНК вакцины.
Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие агенты для целей разработки в соответствии с режимом введения, который будет использоваться. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой инъекционные фармацевтические композиции, они являются стерильными, пирогенными и свободными от частиц. Предпочтительно используют изотонический препарат. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях, предпочтительными являются изотонические растворы, такие как фосфатно-буферный раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах реализации изобретения в композицию добавляют агент для сужения сосудов. Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть функциональными молекулами в качестве наполнителей, адъювантов, носителей или разбавителей. Фармацевтически приемлемый эксципиент может быть агентом для облегчения трансфекции, который может включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален, и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные агенты для облегчения трансфекции.
Облегчающим трансфекцию агентом является полианион, поликатион, в том числе поли-Ь-глутамат LGS), или липид. Облегчающим трансфекцию агентом является поли-Ь-глутамат, и более предпочтительно, поли-Ь-глутамат присутствует в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален, и сквален и гиалуроновая кислота также могут вводиться в сочетании с генетическим конструктом. В некоторых вариантах реализации изобретения ДНК-векторные вакцины могут также включать облегчающие трансфекцию агенты, такие как липиды, липосомы, в том числе лецитин, липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, как ДНК-липосомные смеси (см. например W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты для облегчения трансфекции. Предпочтительно, облегчающим трансфекцию агентом является полианион, поликатион, включая полиL-глутамат (LGS), или липид. Концентрирование агента трансфекции в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть адъювантом. Адъювантом могут быть другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются как белки в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Адъювант может быть выбранным из группы, содержащей: α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γ-интерферон фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, ΤΝΡβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный Т-клеточный проводящий хемокин (CTACK), эпителиальный тимус-экспрессированный хемокин (TECK), мукозо-ассоциированный эпителиальный хемокин (МЕС), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, включая IL-15, имеющий удаленную сигнальную последовательность и необязательно включающий сигнальный пептид от IgE. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNFP, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинации. Примерным вариантом осуществления адъюванта является IL-12. Другие гены, которые могут быть полезными адъювантами, включают те, которые кодируют: МСР-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, Р-селектин, Е-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18,
- 26 046868
CD40, CD40L, васкулярный фактор роста, фибробластный фактор роста, IL-7, фактор роста нервов, васкулярный эндотелиальный фактор роста, Fas, рецептор TNF, Flt, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, INK, гены ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
f. Способы доставки вакцины.
В настоящей заявке предлагается способ доставки фармацевтической композиции для обеспечения генетического конструкта и белков корового белка HBV и/или поверхностного антигена HBV, которые содержат эпитопы, которые делают их особенно эффективными иммуногенами, против которых иммунный ответ на вирусные HBV-инфекции может быть вызван. С целью индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа может быть предложен способ доставки вакцины, или вакцинация. Процесс вакцинации может генерировать у млекопитающего иммунный ответ против множества генотипов HBV. Вакцина может быть доставлена индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы млекопитающего и усилить иммунный ответ. Доставка вакцины может быть трансфекцией антигеном НА в качестве молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке и доставляется на поверхность клетки, на которой иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Доставка вакцины может быть использована, чтобы индуцировать или вызвать иммунный ответ у млекопитающего против множества вирусов HBV путем введения млекопитающему вакцины, как описано в данном документе. При доставке вакцины млекопитающему, и вслед за этим вектора в клетки млекопитающего, трансфецированные клетки будут экспрессировать и секретировать консенсусный коровый белок HBV и консенсусный поверхностный антиген HBV. Эти секретируемые белки или искусственные антигены, будут признаны в качестве чужеродных иммунной системой, которая будет поднимать иммунный ответ, который может включать: антитела, полученные против антигенов, и Т-клеточный ответ именно против антигена. В некоторых примерах, млекопитающее привито вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему и при заражении вирусным штаммом HBV примированная иммунная система позволяет быстро очистить последующие вирусы HBV, будь то через гуморальную, или клеточную, или обе системы. Вакцина может быть доставлен индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы индивидуума, тем самым повышая иммунный ответ. Способы доставки ДНК вакцины описаны в патенте США № 4945050 и 5036006, оба из которых включены в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.
С целью индукции иммунного ответа у млекопитающего вакцина может быть введена в организм млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком, нечеловекообразным приматом, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, буйволом, полорогим, оленем, ежом, слоном, ламой, альпака, мышами, крысами или курицей, и, предпочтительно, человеком, коровой, свиньей или курицей.
g. Доставка вакцины с адъювантами.
Фармацевтические композиции, предпочтительно вакцины, описанные в данном документе, могут быть введены в комбинации с белками или генами, кодирующими адъюванты, которые могут включать: α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γ-интерферон, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNFe, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, МСР-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, Р-селектин, Еселектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, васкулярный фактор роста, фибробластный фактор роста, IL-7, фактор роста нервов, васкулярный эндотелиальный фактор роста, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TrAmP, Apo-3, Air, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1 или TAP2 или их функциональные фрагменты. В примерных вариантах реализации изобретения адъювантом является IL-12.
h. Способ генерации иммунного ответа на вакцину.
Вакцина может быть использована для генерации иммунного ответа у млекопитающего, в том числе терапевтического или профилактического иммунного ответа. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или киллерные Т-клетки, которые направлены на коровый антиген HBV, поверхностный антиген HBV или их комбинации. Такие антитела и Т-клетки могут быть выделенными.
Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы генерации иммунных реакций против коровых белков HBV, поверхностных антигенных белков HBV и их комбинации, которые включают введение индивидууму вакцины. Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы профилактической вакцинации индивидуума против HBV-инфекции, которые включают введение вакцины. Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы терапевтической вакци
- 27 046868 нации индивидуума, который был заражен HBV, которые включают введение вакцины.
Диагностика HBV-инфекции до введения вакцины может быть осуществлена в установленном порядке.
i. Способ лечения вакциной.
Вакцина может быть использована для получения иммунного ответа у млекопитающего, который защищает печень. Иммунный ответ может создавать антиген-специфический ЦТЛ ответ, который не вызывает повреждения или воспаления печени. В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина может быть доставлена к периферии для вызова антиген-специфического иммунного ответа, нацеленного на печень, чтобы очистить или устранить HBV-инфицированные клетки, не повреждая и не вызывая воспаление печени. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение может включать доставку вакцины, содержащей консенсусный коровый антиген HBV, к периферии для создания антигенспецифического иммунного ответа, нацеленного на печень, чтобы очистить или устранить HBVинфицированные клетки, не нанося вреда или не вызывая воспаления печени.
3. Пути введения.
Вакцину или фармацевтическую композицию можно вводить различными способами, в том числе перорально, парентерально, подъязычно, чрескожно, ректально, через слизистую, местно, путем ингаляции, посредством трансбуккального введения, внутриплеврально, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, интраназально, интратекально и внутрисуставным способом или их комбинациями. Для применения в ветеринарии, композиция может быть введена в виде соответствующим образом приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить схему дозирования и способ введения, который является наиболее подходящим для конкретного животного. Вакцина может быть введена с помощью традиционных шприцов, безыгольных инъекционных устройств, пистолетов для бомбардировки микрочастицами или другими физическими методами, такими как электропорации (ЕР), гидродинамический метод или ультразвук. Вектор вакцины может быть доставлен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекции ДНК (также упоминается как ДНК-вакцинация) с и без in vivo электропорации, липосомально опосредованные, наночастицы, рекомбинантные векторы, такие как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус ассоциированный вирус и рекомбинантный вирус коровьей оспы. Антиген HBV может быть доставлен посредством инъекции ДНК и вместе с in vivo электропорацией.
а. Электропорация.
Вакцина или фармацевтическая композиция могут быть введены путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации плазмидами вакцины может быть осуществлено с помощью электропорационных устройств, которые могут быть сформированы для доставки к целевой ткани млекопитающего импульса энергии, эффективного для создания обратимых пор, образующихся в клеточных мембранах, а предпочтительным импульсом энергии является постоянный ток, подобный заданному току, введенному пользователем. Устройство для электропорации может содержать компонент электропорации и электродный узел или узел ручки. Компонент электропорации может включать и содержать один или более различных элементов электропорационного устройств, включая: контроллер, генератор импульсов тока заданной формы, тестер импеданса, регистратор сигнала, входной элемент, элемент создание отчётов о состоянии, порт связи, компоненты памяти, источник питания и выключатель питания. Электропорация может быть осуществлена с использованием in vivo электропорационного устройства, например системы CELLECTRA® ЕР (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) для содействия трансфекции клеток плазмидой.
Примеры электропорационных устройств и способов электропорации, которые могут содействовать в получении ДНК-вакцин согласно настоящему изобретению, включают те, которые описаны в патенте США № 7 245 963, представленном Draghia-Akli, et al., патентной публикации США 2005/0052630, представленной Smith, et al., содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте. Другие устройства для электропорация и методы электропорации, которые могут быть использованы для облегчения доставки вакцин ДНК, включают предлагаемые в одновременно находящейся на рассмотрении заявке того же заявителя на патент США, серийный номер 11/874072, поданной 17 октября 2007, которая заявляет приоритет в соответствии с 35 USC 119 (е) предварительных заявок США № 60/852149, поданной 17 октября 2006, и 60/978982, поданной 10 октября 2007, все из которых включены в данное описание во всей своей полноте.
Патент США № 7245963 от Draghia-Akli и др. описывает модульные электродные системы и их применение для облегчения ввода биомолекулы в клетки выбранной ткани в теле или растении. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; гиподермическую иглу; электрический соединитель, который обеспечивает связь от программируемым контроллером импульса постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может захватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции, и прочно вставить их в выбранную ткань в теле или растении. Биомолекулы затем доставляются с помощью подкожной иглы в выбранную ткань. Контроллер программируемого импульса постоянного тока активируется и электриче
- 28 046868 ский импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в клетку между множеством электродов. Полное содержание патента США N 7245963 включено в данный документ в качестве ссылки.
Патентная публикация США 2005/0052630, представленная Smith, et al., описывает электропорационное устройство, которое может быть использовано, чтобы эффективно облегчить введение биомолекулы в клетки выбранной ткани в теле или растении. Электропорационное устройство содержит электрокинетическое устройство (EKD устройство), работа которого определяется программным обеспечением или прошивкой. Устройство EKD выпускает серию модулей программируемых импульсов постоянного тока между электродами в массиве на основе пользовательского элемента управления и ввода параметров импульса, и позволяет хранить и получать данные данных формы сигнала. Электропорационное устройство также содержит сменный электродный диск, имеющий множество игольчатых электродов, центральный канал впрыска для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Полное содержание патентной публикации США 2005/0052630 включено в данное описание в качестве ссылки. Электродные массивы и способы, описанные в патенте США № 7245963 и патентной публикации США 2005/0052630, могут быть адаптированы для глубокого проникновения не только в ткани, таких как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации матрицы электродов, инъекционная игла (для доставки выбранной биомолекулы) также вставляется до упора в орган-мишень и инъекцию вводят перпендикулярно к целевой проблеме, в область, которая предварительно очерчена электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и патентной публикации США 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и 21 калибр. Кроме того, некоторые варианты реализации изобретения, включающие электропорационные устройства и способы их использования, реализации изобретения предполагают электропорационные устройства, описанные в следующих патентах: патент США № 5273525, выданный 28 декабря 1993, патент США № 6110161, выданный 29 августа 2000, № 6261281, выданный 17 июля 2001, и патент США № 6 958 060, выданный 25 октября 2005, и патент США 6939862, выданный 6 сентября 2005. Кроме того, патенты, относящиеся к предмету, представленному в патенте США 6697669, выданном 24 февраля 2004, который касается доставки ДНК с использованием любого из множества устройств, и в патенте США 7328064, выданном 5 февраля 2008, который касается метода инъекцирования ДНК, рассматриваются в настоящем документе. Указанные выше патенты включены в качестве ссылки во всей их полноте в данный документ.
4. Способ приготовления вакцины.
В настоящей заявке предлагаются способы получения ДНК-плазмид, которые содержат вакцины, описанные в данном документе. Плазмиды ДНК, после финальной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающего могут быть использованы для инокуляции клеток культуры в крупномасштабном ферментационном чане с использованием известных методов в данной области техники. ДНКплазмиды для использования с ЕР-устройствами согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены либо изготовлены с использованием комбинации известных устройств и методов, но, предпочтительно, они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии производства плазмид, описанной в опубликованной заявке США № 20090004716, которая была подана 23 мая 2007 года. В некоторых примерах ДНК-плазмиды, использованные в этих исследованиях, могут быть получены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или содержат различные устройства и протоколы, которые, как правило, известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в патенте США с серийным номером 60/939792, в том числе те, которые описаны в лицензированном патенте, патент США № 7 238 522, который был выдан 3 июля 2007 года. Указанные выше заявка и патент США с серийным номером 60/939792 и патент США № 7 238 522, соответственно, включены в данное описание во всей своей полноте.
Примеры
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры, показывающие предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Исходя из приведенного выше обсуждения и примеров, специалист в данной области техники может установить существенные характеристики настоящего изобретения и, не отступая от сущности и объема изобретения, может сделать различные изменения и модификации изобретения, чтобы приспособить его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Такие модификации также подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Коровый белок HBV.
Консенсусный коровый белок HBV, также именуемый как HBV модифицированный, М-кор или Мкоровый конструкт, был сконструирован из эпитопных последовательностей от генотипов А, В, С, D и Е HBV. Последовательности капсидных белков HBV от этих генотипов были отобраны для включения в конструкцию консенсусного кора, который может индуцировать иммунитет против широкого спектра генотипов, тем самым обеспечивая универсальную вакцину для HBV. В некоторых вариантах реализации изобретения модификации М-корового конструкта включали добавление лидерной последователь
- 29 046868 ности IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения М-коровый белок кодируется с использованием кодоновой оптимизации и РНК-оптимизации для повышенной экспрессии.
1. Конструирование и экспрессия консенсусного корового антигена.
Коровые консенсусные нуклеотидные последовательности генотипа А, В, С, D, и Е HBV были сконструированы путем получения консенсусных последовательностей коровых генов каждого генотипа, а затем путем получения консенсусной последовательности консенсусов всех пяти генотипов, таким образом избежав смещения к сильно секвенированным генотипам. Кроме того, последовательности были собраны из разных стран, чтобы избежать отбора образцов сильно сиквенированных генотипов. Последовательности выравнивали, используя программное обеспечение CLUSTAL X для составления окончательной консенсусной последовательности HBcAg. Как показано на фиг. 10, наблюдалась относительная близость мультигенотипной консенсусной HBcAg-последовательности для всех выбранных последовательностей из разных генотипов.
После получения консенсусной последовательности было осуществлено несколько модификаций для увеличения уровней экспрессии антигена из плазмид. В частности, были добавлены высокоэффективная лидерная последовательность IgE и С-концевая НА-метка, а конструкт был оптимизирован относительно РНК и кодона. Это привело к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Мкоровую последовательность с IgE-лидером и НА-меткой (SEQ ID NO: 5), которая переваривается EcoRI и NotI, и клонируется в вектор экспрессии pVAX (Invitrogen) под контролем цитомегаловирусного предраннего промотора. Полученный конструкт затем был назван pMCore (SEQ ID NO: 17).
In vitro испытания экспрессии были выполнены с использованием конструкта pMCore и pVAX, который использовали в качестве контроля. Результаты, демонстрирующие положительную экспрессию, указаны на изображениях гелей, показанных на фиг. 11А и 11В.
Кроме того, белок HBcAg экспрессировался ДНК-плазмидой, трансфектированной pMCore, содержащим коровый ген гепатита В (фиг. 12). Экспрессию pMCore обнаруживали, используя TNT® Quick Coupled Expression of Transcription/Translation System, содержащую '^-метионин (Promega, Madison, WI). Синтезированный генный продукт осаждали, используя моноклональное антитело к НА, направленное на закодированный эпитоп НА, клон НА-7 (Sigma-Aldrich). Иммунно осажденный белок подвергли электрофорезу на 12% геле SDS-PAGE, а затем зафиксировали и высушили. Синтезированный белок со вставкой радиоактивной 35S обнаруживали с помощью авторадиографии. Этот in vitro трансляционный анализ на лизате показал обнаруживаемый HBcAg при ожидаемой молекулярной массе 28 кДа (фиг. 13). Экспрессия была дополнительно подтверждена с использованием анти-НА меченного моноклонального антитела с помощью иммунофлюоресцентного анализа. Рабдомиосаркомные (RD) клеточные линии трансфицировали pMCore, используя TURBOFECT (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Сначала клетки фиксировали 2% формальдегидом, а затем анализировали по поводу экспрессии белка. Зафиксированные клетки инкубировали с кроличьей моноклональной НА-меткой (Invitrogen), разведенной первичным стандартным раствором (0,1% BSA, 0,2% сапонина, 0,02% азида натрия) в течение одного часа при комнатной температуре, затем клетки инкубировали с DyLight 594меченым противокроличьим вторичным антителом (Thermo Scientific) в течение 20 минут при комнатной температуре, конфокальное изображение использовали для визуализации HBcAg в цитоплазме и вокруг ядра трансфецированных RD-клеток, как показано на фиг. 14. Профиль экспрессии подтвердил, что ДНК-плазмида, несущая консенсусный коровый ген, может высоко экспрессироваться в различных клетках in vitro. В частности, изображения были получены с использованием инвертированного конфокального микроскопа Zeiss Axiovert 100. Анализ и количественная оценка интенсивности флюоресценции проводились с использованием программного обеспечения Image J (NTH, Rockville, MD).
2. Иммунизация мышей.
Трансгенные мыши C57BL/6 были разделены на две группы по четыре мыши в каждой и трижды иммунизированы 20 мкг ДНК с помощью электропорации с двухнедельными интервалами (группа 1 контрольный вектор pVAX; группа 2 рМ-Core). Мышей иммунизировали в день 0, день 14, день 28 и умерщвляли в день 35. Селезенку, печень и сыворотку из умерщвленных животных брали для исследования. Кроме того, чтобы оценить получение Т и В-клеточных иммунных ответов, мышей Balb/c иммунизировали и измеряли по поводу обоих ответов в различных периферических тканях. Мыши получили три внутримышечные иммунизации 30 мкг pMCore или pVax с последующей электропорацией, как указано на иммунизационной схеме (фиг. 15). В частности, шести-восьми недельные самки мышей Balb/c были приобретены у Jackson Laboratories. Животных содержали в соответствии с нормами National Institutes of Health и the University of Pennsylvania Institutional Care и Use Committee (IACUC). Для исследования ДНК-иммунизации восемь животных разделили на две группы. Каждое животное в группе иммунизации получило в общей сложности по три иммунизации 30 мкг pMCore с интервалом в две недели в большеберцовую (ТА) мышцу. Каждая иммунизация сопровождалась in vivo электропорацией с устройством CELLECTRA для адаптивной постоянно токовой электропорации (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). По два 0,2 амперных постоянно токовых прямоугольных импульса были доставлены через треугольную 3-электродную решетку, состоящую из 26-калиберных твердых электродов из нержавеющей стали, полностью погруженных в мышцу. Каждый импульс был длительностью в 52 миллисекунды с 1
- 30 046868 секундной задержкой между импульсами. In vivo изучение мышей Balb/C показало повышение амплитуды секреции фактора некроза опухоли (TNF-α), интерферона гамма Т-клеток (IFN-γ) и CD107а в CD8 и CD4 Т-клетках, изъятых из селезенки. Фиг. 16 и 17 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/С рМCore повышала амплитуду секреции IFN-γ в CD8+ и CD4+ Т-клетках селезенки. Фиг. 18 и 19 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/С рМ-Core повышала амплитуду секреции TNF-α в CD8+ и CD4+ Тклетках селезенки. Фиг. 20 и 21 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/С pM-Core повышала амплитуду секреции CD 107а в CD8+ и CD4+ Т-клетках селезенки.
В дополнительных экспериментах, секрецию IFN-γ и TNF-α проверяли в Т-клетках. Для получения спленоцитов для этих дополнительных экспериментов, мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки изымали и помещали в среду R10 (среда RPMI, обогащенная 10% FBS и 1х антибиотиком-антимикотиком). Селезенки измельчали индивидуально, процеживали через 40 мкМ клеточный фильтр и обрабатывали 1 мл лизисного буфера ACK в течение 5 минут для лизиса эритроцитов. Спленоциты ресуспендировали в полной среде R10 и использовали для дополнительных иммунологических анализов.
Субпопуляцию спленоцитов ресуспендировали в среде R10 в концентрации 107 на мл и по 100 мкл высевали на 96-луночный круглодонный планшет. 100 мкл среды, содержащей объединенные пептиды pMCore или 10 нг/мл РМА (Sigma, St. Louis, МО, USA), и 500 нг/мл иономицина (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, CA, USA) смешали в качестве положительного контроля или 0,1% диметилсульфоксид (Sigma, St. Louis, МО, USA) в качестве отрицательного контроля. Все лунки содержали по 5 мкл/мл двух ингибиторов транспорта белков, брефелдин A (GolgiPlug) и моненсин (Golgistop) (All from BD Bioscience). Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 5 часов и окрашивали LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen) в течение 10 минут при 37°С. Внеклеточное окрашивание проводили, используя антитела, специфичные к мышиным CD3, CD4 и CD8. Спленоциты затем пермеабилизировали и промывали, используя BD CYTOFIX/CYTOPERM и PERM/WASH (BD Bioscience), соответственно. Внутриклеточное окрашивание цитокинов.
Внутриклеточные цитокины затем окрашивали антителами к мышиному интерферону-гамма и фактору-альфа некроза опухоли. Субпопуляцию лимфоцитов ресуспендировали в среде R10 в концентрации 107 на мл и по 100 мкл высевали на 96-луночный круглодонный планшет. 100 мкл среды, содержащей объединенные пептиды pMCore, или 10 нг/мл РМА (Sigma, St. Louis, МО, USA) и 500 нг/мл иономицина (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, CA, USA) смешали в качестве положительного контроля или 0,1% диметилсульфоксид (Sigma, St. Louis, МО, USA) в качестве отрицательного контроля. Все лунки содержали по 5 мкл/мл двух ингибиторов транспорта белков, брефелдин A (GolgiPlug) и моненсин (Golgistop) (All from BD Bioscience). Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 5 часов и окрашивали LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen) в течение 10 минут при 37°С. Внеклеточное окрашивание проводили, используя антитела, специфичные к мышиным CD3, CD4 и CD8. Спленоциты затем пермеабилизировали и промывали, используя BD Cytofix/Cytoperm™ и Perm/Wash™ (BD Bioscience), соответственно. Клетки затем окрашивали внутриклеточно антителами к интерферону-гамма, фактору-альфа некроза опухоли, интерлейкину-2 и лизосомно-ассоциированному мембранному белку 1.
Конъюгированные противомышиные антитела использовали во время внеклеточного и внутриклеточного окрашивания, включая: CD3-фикоэритрин/Су7 (РЕ/Су7), CD4-перидинин хлорофилловый белок (PerCP), CD8-аллофикоцианин (АРС), IFN-Y-Alexa Fluor 700, TNF-a-флюоросцеина изотиоцианат (FITC) и IL-2-фикоэритриноцианин (РЕ) (все от BD Biosciences, San Jose, CA).
Средний индуцированный HBcAg-специфический IFN-γ Т-клеточный ответ был сильным при 2000 (±210) SFU на миллион спленоцитов. Интересно, что внутриклеточное окрашивание стимулированных спленоцитов показало, что клетки CD4+ и CD8+ продуцируют почти подобное количество антигенспецифического IFN-γ, 0,74 и 0,94, соответственно, но разные уровни TNF-α с примерно 0,3% и 1,5% клеток CD4+ и CD8+, соответственно (фиг. 22). Аналогичная тенденция наблюдалась с клетками, которые были дважды положительными для обеих цитокинов. Наблюдалось меньше дважды положительных клеток CD4+, приблизительно 0,2%, в селезенке, чем дважды положительных клеток CD8+, которые составляют 0,7% (фиг. 23). Миграция HBV специфических Т-клеток в печень также была продемонстрирована у животных, которым вводили ДНК-вакцину pMCore. Нацеливание Т-клеток, специфических к коровому антигену HBV, с высокой частотой и эффекторной функцией к печени является целью для развития HBVиммунной терапии. После иммунизации животных умерщвляли и их печень удаляли и определяли миграцию HBV-специфических эффекторных Т-клеток в печень. Результаты показали, что вакцина pMCore приводит эффекторные Т-клетки в печень in vivo. Фиг. 24 и 25 демонстрируют интерферон-γ Тклеточный ответ в печени, а фиг. 26 и 27 демонстрируют иммунный ответ фактора-α некроза опухоли в печени и повышенную реакцию, которая возникает в результате вакцинации pMCore.
М-коровый консенсусный иммуноген, кодируемый ДНК-конструктом pMCore, приводит к строго уравновешенным CD4+/CD8+ Т-клеточным иммунным ответам. Индуцированные Т-клетки движутся к печени с высокой частотой и демонстрируют корректный эффекторный фенотип иммунного клиренса после HBV-инфекции, поддерживая дальнейшее развитие этой иммунной терапевтической вакцины.
- 31 046868
Также исследовали способность внутрипеченочных антиген-специфических Т-клеток продуцировать цитокины после ДНК-иммунизации. В каждую печень путем непосредственной инъекции вводили 1мл PBS в печеночную вену каждой мыши. В частности, изымали печень, измельчали и ресуспендировали в 5 мл 44% изотонического Percoll. Смеси заливали 3 мл 66% изотонического Percoll и центрифугировали в течение 20 минут при 2000 оборотов в минуту для градиентного разделения. Лимфоциты собирали и промывали 10 мл R10 и обрабатывали лизисным буфером ACK по мере необходимости. Как CD4, так и CD8 Т-клетки, выделенные из печени, продуцировали IFN-γ и TNF-α, когда стимулировались in vitro пептидом HBcAg (фиг. 28 и 29). В то время как CD4 Т-клетки демонстрировали высокий процент двойных продуцентов, CD8 демонстрировали незначительное количество или отсутствие IFN-Y+TNF-a+ продуцирующих клеток. Зато, большинство CD8 Т-клеток продуцировало или только IFN-γ или TNF-α. В печени наблюдалось накопление HBcAg-специфических CD4 Т-клеток в противоположность селезенке. Процент HBcAg-специфических CD4 Т дважды положительных Т-клеток в покоящейся печени был сопоставимым с клетками, наблюдаемыми в селезенке. Более того, периферические CD8 Т-клетки были убедительно лучшими двойными продуцентами, чем резидентные CD8 Т-клетки печени. Также наблюдались антитело-продуцирующие способности резидентных В-клеток печени иммунизированных мышей. Интересно, что печень в качестве слизистого органа продуцировала больше антиген-специфических IgA, чем IgG (фиг. 30), наблюдение, которое ранее не исследовалось.
На фиг. 31 показаны клеточные иммунные реакции, вызванные рМ-Core с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISPOT). Спленоциты стимулировали двумя пулами 15-мерных пептидов, охватывающих полную длину pMCore и перекрывающихся 8 аминокислотами. 200000 спленоцитами в среде R10 засевали 96-луночный планшет, покрытый ZFN-Y-захватывающим антителом (система R&D), стимулировали в течение ночи в присутствии специфического пептидного пула при 37°С в 5% СО2. Клетки смыли, а планшеты инкубировали в течение ночи с биотинилированным противомышиным IFN-Y-обнаруживающим антителом (система R&D). Стрептавидин-щелочную фосфатазу и 5-бром-4хлор-3'-индолилфосфат р-толуидиновую соль и нитросиний тетразолия хлорид использовали для обнаружения пятен. Пятна подсчитывали, используя автоматизированный ELISPOT-ридер (ЦТЛ Limited). Как показано на фиг. 31, иммунизация pMCore вызывает сильные клеточные иммунные реакции. Среднее HBcAg-специфических IFN-γ Т-клеточных реакций составляло приблизительно 2000 (±210) SFU на миллион спленоцитов.
Анализ ELISPOT использовали для дальнейшего исследования IFN-γ. В частности, спленоциты стимулировали двумя пулами 15-мерных пептидов, охватывающих полную длину HBcAg и перекрывающихся 8 аминокислотами. Всего было 33 индивидуальных пептидов, которые были объединены случайным образом с первыми 17 пептидами в пул 1 и последними 16 в пул 2. IgEL и НА-метка исключались, чтобы сделать пептид как можно более ближе к природному антигену. 200000 спленоцитами в среде R10 засевали 96-луночный планшет, покрытую ШЫ-/-захватывающим антителом (система R&D), стимулировали в течение ночи в присутствии специфического пептидного пула при 37°С в 5% СО2. Клетки смыли, а планшеты инкубировали в течение ночи с биотинилированным противомышиным IFN-γобнаруживающим антителом (система R&D). Стрептавидин-щелочную фосфатазу и 5-бром-4-хлор-3'индолилфосфат р-толуидиновую соль и нитросиний тетразолия хлорид использовали для обнаружения пятен. Пятна подсчитывали, используя автоматизированный ELISPOT-ридер (ЦТЛ Limited). Наблюдалось, что через одну неделю после финальной иммунизации pMCore-иммунизированные мыши демонстрировали признаки сильных HBcAg Т-клеточных реакций, как было определено с помощью IFN-γ ELISPOT-анализа после ех vivo стимуляции. На фиг. 32 показано, что доминантные эпитопы смещены в сторону пептидного пула 2.
Исследования in vivo цитотоксичности проводили, используя мечение карбоксифлюоросцеиндиацетатсукцинимидным эфиром (CFSE) в сочетании с проточной цитометрией. Спленоциты взяли от мышей, не использовавшихся ранее в опытах, и распределили в две популяции. Одна популяция, CFSE-сильно меченные, пульсировала с релевантным пептидом (например, капсидными пептидами HBV). Другая популяция, CFSE-слабо меченные, пульсировала с иррелевантным пептидом (например, №3-пептидами HCV). Объединяли меченные, обработанные пептидом клетки и использовали в экспериментах адоптивных пересадок, в которых проводили проточный анализ. Объединенные популяции обработанных, меченных клеток-мишеней вводили двум группам мышей, контрольной группе и иммунизированной группе. Спленоциты выделяли от каждой группы мышей и образцы прогоняли на проточном цитометре. Измеряли количество CFSE. Как правило, в таких экспериментах образуется два пика, первый отвечает иррелевантному пептиду; второй отвечает иммунизирующему пептиду на пике, указывающем больший CFSE.
Фиг. 33 демонстрирует, что CD8 Т-клетка, индуцированная вакцинацией, может специфически элиминировать клетки-мишени in vivo. Результаты демонстрируют, что образцы селезенки и печени от мышей, ранее не использовавшихся в опытах, содержали почти равные количества клеток, которые были на пиках иррелевантного и релевантного пептидов, между тем, как результаты показали, что среди иммунизированных групп пики клеток, полученных из селезенки и печени, пульсирующие с релевантным
- 32 046868 пептидом, были значительно меньше, чем с иррелевантным пептидом. Эти данные демонстрируют, что клетки-мишени, обработанные HBV-пептидом, специфически элиминировались у мышей, иммунизированных HBV-вакциной, но не у неиммунизированных мышей. Любая элиминация клеток-мишеней, обработанных иррелевантным пептидом, если вообще происходила, была такой же у мышей, иммунизированных HBV-вакциной, и неиммунизированных мышей и значительно ниже, чем элиминация клетокмишеней, обработанных HBV-пептидом.
Способность HBV-специфических CD8 Т-клеток, индуцированных после ДНК-иммунизации, специфически элиминировать клетки-мишени in vivo исследовалась дополнительно. Человеческие ЦТЛ, которые имеют целью коровый антиген, являются важными в сильном клиренсе HBV в сравнении с хронической инфекцией. Через одну неделю после финальной иммунизации 4 мышам из каждой группы, иммунизированной pVax или pMCore, адапционно пересаживали спленоциты-мишени, которые пульсируют с HBcAg (релевантный) или HCV-NS3/4A (иррелевантный) пептидами. Кратко, спленоциты от мышей, ранее не использовавшихся в опытах (наивные), окрашивали либо 1 мкМ или 1 нМ CFDA SE (invitrogen). Затем меченные спленоциты покрывали индикаторными пептидами (1мкМ) и по 107 клеток из каждой популяции внутривенно инъецировали наивным или иммунизированным мышам. Спустя 24 или 90 часов, клетки из селезенки и печени выделяли и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса клеток подсчитывали следующим образом: 100 - ([(% релевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках /% иррелевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках)/(% релевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках /% иррелевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках)] х 100). С помощью селекции на CFSEмеченных спленоцитах, чтобы проследить лизис клеток, наблюдалось, что pMCore-вакцинированные мыши способны индуцировать сильный специфический лизис антиген-пульсирующих клеток-мишеней, как показано на фиг. 34. Средний процент лизиса клеток, наблюдаемый в селезенке, составил приблизительно 83%, между тем, как средний процент лизиса клеток в печени составил 76%, демонстрируя, что индуцированные вакцинацией ЦТЛ, которые мигрируют и удерживаются в печени, способны лизировать HBV-пептид-пульсирующие клетки-мишени. Это было первое исследование для демонстрации индуцирования HBcAg-специфических ЦТЛ реакций в печени с помощью любого метода и, в частности, с помощью системной иммунизации. Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая иммунизация может индуцировать эффекторные клетки, которые могут мигрировать в печень и лизировать клеткимишени. Фиг. 35 показывает данные, собранные из анализа Т-клеточной пролиферации с использованием CFSE-мечения. Сравнивали процент пролиферации клеток CD3+CD4+ и клеток CD3+CD8+, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой pMCore, которая экспрессирует HBV М-кор. Кратко, выделенные спленоциты окрашивали карбоксифлюоросцеиндиацетатом, сукцинимидиловым эфиром (CFDA-SE) Cell Tracer Kit (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Окрашенные клетки трижды промывали солевым раствором и стимулировали pMCore-специфическими перекрывающимися пептидами. Клетки инкубировали при 37°С в течение 96 часов. Спустя 48 часов, 50% культуральной среды удаляли и помещали в свежую R10. На 4 день, клетки собирали и окрашивали CD3, CD4 и CD8специфическими моноклональными антителами (BD Pharmingen). Клетки фиксировали PBS с 1% параформальдегидом (PFA) и приобретенным FACScalibur Becton Dickinson). Данные анализировали, используя программу FlowJo. CFSE низкая и CFSE средняя популяция была признана в качестве пролиферировавших клеток. Как показано на фиг. 35, CD3+CD8+ Т-клетки, выделенные из селезенки, пролиферировали больше по сравнению с CD3+CD4+ Т-клетками.
Дальнейшие эксперименты с анализом Т-клеточной пролиферации также использовали CFSEмечение. В частности, выделенные спленоциты окрашивали карбоксифлюоросцеиндиацетатом, сукцинимидиловым эфиром (CFDA-SE) Cell Tracer Kit (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Окрашенные клетки трижды промывали солевым раствором и засевали в 96-луночный U-донный планшет в общем объеме 200 мкл среды, содержащей HBcAg объединенных пептидов в концентрации 1 мкг/мл. клетки инкубировали при 37°С в течение 96 часов. Спустя 48 часов, 50% культуральной среды отбирали и переносили в свежую R10. Разница в продуцировании цитокинов между CD4 и CD8 Т-клетками, как описано выше, была сравнима с их максимальной пролиферативной способностью. После 4 дней стимуляции антиген-специфическими пептидами CD8 + Т-клетки, пролиферирующие более чем в 2 раза выше, чем CD4+ клетки (фиг. 36), показывают четкое CD8 Т-клеточное смещение в ответ.
На фиг. 37А и 37В представлены данные ELISA, демонстрирующие сравнение антитела к кору HBV в серийном разведении сыворотки от животных, обработанных вектором pVax vector (контроль) или плазмидой pMCore, которая экспрессирует HBV M-кор. Кратко, высокосвязывающие планшеты ELISA (Costar, Coining, NY) покрывали 1 мкг/мл белка HBcAg в PBS при 4°С в течение 24 часов, а затем промывали PBS-Tween и блокировали PBS, содержащим 1% BSA, в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания связанное сывороточное антитело было обнаружено с помощью HRP-меченого козьего противомышиного IgG (фиг. 37А) или IgA (фиг. 37В). Пероксидазоконъюгированные Ab были обнаружены с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, a OD при 450 нм была измерена с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера. Наблюда
- 33 046868 ли антиген-специфический гуморальный ответ в сыворотках иммунизированных мышей. Для дальнейшего изучения иммунного ответа, индуцированного у pMCore-иммунизированных мышей, антигенспецифические IgG и IgA реакции анализировали с помощью В-клеточного ELISpot, а также в ELISA с использованием спленоцитов и сывороток, соответственно, собранных после вакцинации. Спленоциты выделяли и очищали, как описано выше. Для ELISA, высокосвязывающие планшеты ELISA (Costar, Corning, NY) покрывали 1 мкг/мл белка HBcAg в PBS при 4°С в течение 24 ч, а затем промывали 0,1% PBS-Tween, а затем блокировали PBS, содержащим 1% BSA, в течение 2 ч при комнатной температуре. Серийно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания связанное сывороточное антитело было обнаружено с помощью HRP-меченого козьего противомышиного IgG или IgA. Пероксидазоконъюгированные Ab были обнаружены с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, a OD при 450 нм была измерена с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера. Высокий IgG и IgA титр наблюдался в сыворотке иммунизированных мышей по сравнению с контрольными животными (фиг. 38). В-клеточный ELISpot иммунизированных мышей (фиг. 39) демонстрирует HBcAg-специфические IgG и IgA приблизительно в 200 SFU и 100 SFU на миллион клеток, соответственно. Это иллюстрирует активацию Вклеточного компартмента иммунизацией pMCore. Искусственная плазмида HBcAg эффективно индуцировала антиген-специфические клеточные и гуморальные реакций после 3 иммунизации.
Фиг. 40 демонстрирует процент TNF-α и IFN-γ из CD4+ и CD8+ клеток селезенки и печени.
В отсутствие небольших модельных животных для HBV, был использован HBcAg для временной трансфекции печени мышей путем гидродинамической инъекции. Печени иммунизированных мышей трансфицировали pMCore или HCV NS3/4A. Иммуногистохимическое окрашивание через три дня после трансфекции показало клиренс HBcAg-трансфецированных гепатоцитов по сравнению с NS3/4Aтрансфецированными гепатоцитами. Уровни ALT в сыворотке измеряли чтобы гарантировать, что клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, не вызывал повреждение печени. Результаты на фиг. 41 показали, что клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, не вызывал повреждение печени.
Прямая гидродинамическая инъекция была также использована для временной трансфекции печени мышей. Здесь иммунизированные или наивные печени мышей трансфицировались либо pMCore или иррелевантной плазмидой, кодирующей антигены гепатита С (HCV NS3/4A) Кратко, иммунизированных мышей инъецировали внутривенно 100 мкг плазмиды в 2 мл (около 10% объема веса мыши) раствора Рингера в течение 7 секунд для временной трансфекции печени. Экспрессию или клиренс плазмиды определяли путем окрашивания печени моноклональными антителами к НА. Иммуногистохимическое окрашивание через три дня после трансфекции (фиг. 42) показало клиренс HBcAg-трансфецированных гепатоцитов по сравнению с №3/4А-трансфецированными печенями животных. CD8 Т-клетки, выделенные из pMCore гидродинамически инъецированных мышей, на фиг. 43 показали более высокую частоту IFN-Y+ CD107a+, маркера дегрануляции, по сравнению с иммунизированными печенями животных, трансфецированных иррелевантной плазмиды.
Так как клиренс pMCore-трансфецированных гепатоцитов, кажется, включает дегрануляцию, считалось, что лизис клеток может привести к повреждению печени. Чтобы исследовать, способны ли иммунизированные мыши очищаться от трансфецированных гепатоцитов, не вызывая значительного повреждение печени, был использован анализ измерения активности фермента аланинаминотрансферазы (ALT), чтобы указать на наличие повреждений печени при повышенных уровнях фермента в сыворотке (фиг. 44). В частности, активность сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) измеряли с использованием анализа, базирующегося на оптической плотности (Stanbio Laboratory), на BioTek Synergy 2 микропланшет-ридере. Результаты представлены в виде единиц на литр (Ед./л) и представляют собой количество фермента, который окисляет один мкмоль/л NADH в минуту. Эти исследования показали, что удельный клиренс HBcAg-трансфецированных гепатоцитов не повышает уровни ALT у трансфецированных иммунизированных животных за пределы нормального диапазона 5-30 Ед./л (фиг. 44).
Пример 2.
Поверхностные белки HBV.
1. Конструирование HBsAg ДНК-вакцины.
Использование консенсусных иммуногенов в контексте вариабельных патогенов с сильно изменяющимися антигенными последовательностями может быть эффективным в индукции более прямого иммунного ответа на борьбу с природным вирусным разнообразием по сравнению с иммунизацией одним природным иммуногеном. Восемьдесят две последовательности больших поверхностных антигенов генотипа А гепатита и семьдесят последовательностей больших поверхностных антигенов генотипа С гепатита были собраны из GenBank, а консенсусные последовательности генотип-специфических поверхностных антигенов и небольших поверхностных антигенов были получены после выполнения нескольких выравниваний. Программное обеспечение Clustal X (версия 1.8), используемое для создания нескольких выравниваний, использовали для создания консенсусной последовательности.
Были получены ДНК-конструкты, кодирующие только основной S или preS1/S2 плюс основной S
- 34 046868 поверхностный белок оболочки HBV с использованием консенсусных последовательностей, кодирующих генотипы А или С, которые являются одними из наиболее распространенных генотипов в мире (фиг. 52А, фиг. 59A-59D). Разницу в иммунных ответах, вызванных конструктами, кодирующими полноразмерные НВ или только основной S, исследовали по поводу того, как амино-концевой домен в preS1 может помочь вирусному прикреплению и вхождению, тогда, как карбоксильный концевой preS2 может быть вовлечен в инфекционность. Конструкты только основного S были названы небольшими НВ (SHB), тогда как плазмиды, которые содержали preS1/S2, были названы большими НВ (LHB).
Консенсусные поверхностные белки HBV были разработаны с эпитопными последовательностями из первичных изолятов генотипа A HBV, так что полученный консенсусный белок имел идентичность последовательности, составляющую от 94,2 процента до 99,8 процента, с поверхностными белками первичных изолятов генотипа А HBV. В частности, были разработаны две версии такого консенсусного белка (фиг. 4 и фиг. 52В). Один включал белок S, также упоминается как SHBs-A, в котором последовательность SEQ ID NO: 13 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность. Второй включал белок S, пре^2 и пре-S!. также упоминается как LHBs-A, в котором последовательность SEQ ID NO: 9 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность.
Консенсусные поверхностные белки HBV также были разработаны из эпитопных последовательностей первичных изолятов генотипа С HBV, так что полученный консенсусный белок имел идентичность последовательности, составляющую от 96,5 процента до 99,8 процента, с поверхностными белками первичных изолятов генотипа С HBV. В частности, было разработано две версии такого консенсусного белка (фиг. 4). Один включал белок S, также упоминается как SHBs-C, в котором SEQ ID NO: 15 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность. Второй включал белок S, пре^2 и пре-81, также упоминается как LHBs-C, в котором SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность.
После получения консенсусных последовательностей больших и небольших поверхностных антигенов консенсусных генотипов А или С проводили кодон-оптимизацию и РНК-оптимизацию. Для указанных выше консенсусных поверхностных антигенов HBV, эндопротеолитические сайты расщепления были введены в консенсусные поверхностные антигены HBV для обеспечения надлежащего фолдинга белка и лучшего процессирования антигена (фиг. 3). Использование кодонов в консенсусных поверхностных антигенах HBV было модифицировано, чтобы отразить кодонное смещение человеческих генов. Кроме того, удалось избежать областей с очень высоким (например, больше, чем 80 процентов) или очень низким (например, меньше, чем 30 процентов) содержанием GC, где находились цис-действующие мотивы, такие как внутренние ТАТА-боксы, повторные последовательности и структурированные последовательности. Последовательность Козак ввели в консенсусные поверхностные антигены HBV для повышения инициации трансляции. Высокоэффективную лидерную последовательность IgE добавили против хода транскрипции стартового кодона для повышения и увеличения белковой экспрессии, как описано ранее (Yan et al., Vaccine (2008) 26:5210-5215) (смотри фиг. 3 и 52В). Были синтезированы оптимизированные гены и подтверждены последовательности.
Консенсусные HBV-поверхностные антигены SHBs-A, LHBs-A, SHBs-C и LHBs-C были клонированы в вектор экспрессии для получения конструктов pSHb А (также упоминается как pSHb-A), pLHb А (также упоминается как pLHb-A), pSHb С (также упоминается как pSHb-C) и pLHb С (также упоминается как pLHb-C), соответственно (фиг. 4). Синтезированные гены больших и небольших поверхностных антигенов генотипа А субклонировали в вектор экспрессии pGX0001 в сайты BamHI и XhoI, тогда как синтезированные гены больших и небольших поверхностных антигенов генотипа С субклонировали в pGX0001 в сайты EcoRI и NotI. Получение плазмиды HBcAg (pMCore) описано в примере 1.
2. In vitro экспрессия комбинированных ДНК-вакцин HbsAg.
Клеточные линии рабдосаркомы (RD) и карциномы печени человека (Hep G2) трансфицировали pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A и pSHBs-C, используя TurboFect™ (Thermo Scientific) согласно инструкциям производителя. Для внутриклеточного анализа клетки промывали и фиксировали, используя Cytofix/Cytoperm kit (BD PharMingen, San Diego, CA) согласно инструкциям производителя. После фиксации клетки окрашивали сывороткой от иммунизированных мышей или мышиным моноклональным антителом к поверхности вируса гепатита В (Abcam, Cambridge, MA). Затем клетки окрашивали вторичным противомышиным антителом, конъюгированным с изотиоцианатом флуоресцеина (BD Biosciences, San Jose, CA). Клетки промывали и фиксировали 2% параформальдегидом. Окрашенные и зафиксированные клетки были получены на приборе LSR с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
После конструирования и оптимизации четырех конструктов, экспрессия белка из каждой плазмиды была подтверждена внутриклеточным окрашиванием. RD или Hep G2 клетки временно трансфицировали отдельными конструктами или пустым вектором pGX0001 в качестве контроля. Клетки окрашивали
- 35 046868 внутриклеточно через 48 часов с помощью анти-HBsAg поликлональной мышиной сыворотки или коммерчески приобретенного мышиного моноклонального антитела. Экспрессия была подтверждена с помощью проточной цитометрии (фиг. 52С). Повышенные уровни экспрессии белка HBs наблюдались в клетках, трансфецированных каждым конструктом, по сравнению с клетками, трансфецированными пустыми векторами (pGX0001).
Пример 3.
Иммуногенность отдельных искусственных HBsAg ДНК-плазмид в моделях небольших животных.
После исследований экспрессии, способность отдельных плазмид индуцировать антигенспецифические гуморальные и клеточные реакции оценивали in vivo. Шести-восьми недельные самки мышей Balb/c были приобретены у Jackson Laboratories. Животных содержали в соответствии с нормами National Institutes of Health and the University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee (IACUC). Мышей Balb/c иммунизировали трижды внутримышечно (EVI) иммунизировали три раза с 2-недельным интервалом в недели 0, 2 и 4 15 мкг плазмид, экспрессирующих небольшой или большой S-антиген, или контрольной pGX0001. Каждый вакцинация была сразу после электропорации в месте инфекции, как описано выше (Hirao et al., Vaccine (2008) 26:440-448).
Для иммунизации все ДНК разбавляли водой без нуклеазы (Qiagen, Valencia, CA 91355). Каждое животное в группе иммунизации получило в общей сложности три внутримышечные иммунизации по 15 мкг соответствующей плазмиды. Для комплексного изучения, каждое животное получило в общей сложности по 45 мкг ДНК в обе передние большеберцовые (ТА) мышцы. Каждая иммунизация сопровождалась in vivo электропорацией с устройством CELLECTRA® для адаптивной постоянно токовой электропорации (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). По два 0,2 амперных постоянно токовых прямоугольных импульса были доставлены через треугольную 3-электродную решетку, состоящую из 26-калиберных твердых электродов из нержавеющей стали, полностью погруженных в мышцу. Каждый импульс был длительностью в 52 миллисекунды с 1-секундной задержкой между импульсами. Индуцированные вакциной гуморальные ответы были рассмотрены впервые, поскольку давнишние ДНК-вакцины не были в состоянии вызывать значительные реакции антител.
1. Анализ антител с помощью ELISA.
ELISA проводили для анализа антиген-специфических IgG реакций в сыворотке, собранной от мышей спустя 7 дней после каждой иммунизации с использованием полноразмерного белка HBsAg в качестве антигена-мишени. Высокосвязывающие планшеты ELISA plates (Costar, Corning, NY) покрывали 1 мкг/мл рекомбинантного белка в PBS при 4°С в течение 24 часов, а затем промывали 0,1% PBS-Tween и блокировали PBS, содержащим 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре, стерильно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, после промывания связанный IgG обнаруживали с помощью HRP-меченного козьего противомышиного IgG. Пероксидазно конъюгированные антитела обнаруживали с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, а значения OD при 450 нм измеряли с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера.
Обе pLHBs и pSHBs из любого генотипа были высоко иммуногенными. Дополнительная иммунизация повысила эти реакции с реакциями антител, демонстрируя наибольшее увеличение спустя две недели после третьей иммунизации (фиг. 53А). В противоположность этому, мыши, иммунизированные только контрольной pGX0001, демонстрировали фоновый уровень реакций IgG. Хотя некоторые различия в амплитуде реакции IgG были обнаружены в каждой группе, постепенное повышение после каждой иммунизации было постоянным в пределах групп.
2. IFN-γ ELISPOT.
Способность конструктов pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A и pSHBs-C индуцировать клеточные иммунные реакции исследовалась с помощью IFN-γ ELISPOT. Matching HepB consensus core, 15-мерные пептиды поверхностного антигена А и поверхностного антигена С синтезировали с помощью Genescript (Piscataway, NJ) и ресуспендировали в DMSO и объединяли в пул при приблизительно конечной концентрации 1 мкг/мл каждого пептида. Клеточные реакции измеряли с использованием IFN-γ ELISpot (MabTech, Sweden) согласно инструкциям производителя. Образцы были проведены в трех повторностях с R10 (RPMI 1640, содержащей L-глутамин с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллина/стрептомицина) и контролем PMA/IM (РМА 0,1 мкг/мл и иономицином 0,5 мкг/мл, Sigma Aldrich, St. Louis, МО).
HBsAg-специфические IFN-γ секретирующие клетки проанализировали в ответ на два пула искусственных пептидов, полученных из консенсусного большого поверхностного белка HBV. Первый пептидный пул содержал пептиды, охватывающие preS1 и preS2 белки, тогда как второй пептидный пул состоял из пептидов, охватывающих основной S-белок. Все четыре консенсусные конструкты были способны индуцировать сильные реакции Т-клеток, а перекрестная иммунная реактивность наблюдалась в пределах двух генотипов (фиг. 53В). Хотя, вместе preS белки почти одинаковы по размеру с основным Sбелком, было эпитопное смещения в клеточноопосредованных иммунитетных (CMI) реакциях по отношению к основному S-белку. Эти результаты указывают, что искусственные ДНК-иммуногены, коди
- 36 046868 рующие полноразмерный поверхностный антиген или только основную S-часть поверхностного антигена HBV, демонстрируют иммуногенность, которая является достаточно разнотипной, чтобы нацелиться на основные генотипы HBV. Полноразмерные конструкты не продемонстрировали существенных отличий в индукции IgG к природному белку HBV по сравнению с более короткими конструктами.
3. Картирование поверхностных антигенных (15-мерных) пептидов HBV.
После подтверждения амплитуды CMI была исследована ширина клеточных реакций на генотипспецифические мишени. Соответственно, наборы Интерферон-гамма ELISPOT анализов проводили против различных пулов матриксных пептидов. Два комплекта пептидов, охватывающих белок LBHs-A или LHBs-C, каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, перекрывающихся 8 аминокислотами, были синтезированы с помощью GenScript (Piscataway, NJ). Для того, чтобы отобразить иммунодоминантные эпитопы, два комплекта пептидов были объединены в 16 или 12 пулов для больших или малых групп HBsAg соответственно. IFN-γ ELISpot анализ осуществляли, как описано выше. Эти различные комплекты объединенных пептидов были использованы в матриксном анализе для картирования эпитопов каждого конструкта. Реакции в более 50 SFU на миллион клеток считались положительными. Эти данные показывают, что различные эпитопные реакции были вызваны этими искусственными плазмидами поверхностного антигена у мышей линии BALB/c. Наблюдались в 12 из 16 положительных LHBs-A матриксных пулов у pLHBs-A-иммунизированных мышей и 8 из 16 положительных LHBs-C матриксных пулов у pLHBs-C-иммунизированных мышей. Небольшие плазмиды HBS показали более высокие количества реакций с pSHBs-A-иммунизированными мышами, отвечая на 9 из 12 SHBs-A матриксных пептидов, в то время как pSHBs-C-иммунизированные мыши демонстрировали ответы на все матричные пулы SHBs-C (фиг. 53С). Эти данные указывают на высокую степень широких перекрестнореактивных клеточные реакции, вызванных этими 4 HBs-конструктами. В результате, эти генотипспецифические консенсусные вакцины могут быть способны индуцировать перекрестно-реактивные клеточные реакции против различных первичных поверхностных антигенных изолятов, которые до 8% отличаются от этих генотипов.
Пример 4.
Анализ цитотоксичности и антиген-специфических ЦТЛ, обнаруженных в печени и селезенках вакцинированных мышей.
Противовирусные эффекторные CD8 Т-клетки индуцируют цитотоксичность, которая представляет собой клеточную активность для элиминирования HBV-инфицированных гепатоцитов. Способность конструктов генерировать HBs-специфические ЦТЛ в периферии, которые могут также является родными для печени иммунизированных мышей, оценивали с помощью in vivo анализа цитотоксичности. Спленоциты наивных мышей окрашивали либо 1 мкМ (высокая) или 1 нМ (низкая) CFDA SE (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Меченые спленоциты затем покрывали указанными пептидами (релевантными или иррелевантными пептидами) (1 мкМ) и по 107 клеток каждой популяции внутривенно вводили наивным или иммунизированным мышам. Спустя 90 часов, выделяли клетки из крови, селезенки или печени и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса клеток рассчитывали следующим образом: 100 -([(% релевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках /% иррелевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках)/(% релевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках /% иррелевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках)] х 100).
Миграция HBV-специфических ЦТЛ в печень имеет важное значение для внутрипеченочного элиминирования инфицированных клеток. Антиген-специфическая элиминация адоптивно пересаженных спленоцитов-мишеней, которые пульсировали с искусственными пептидами HBsAg, не наблюдалась. Средний процент лизиса клеток-мишеней в селезенке у мышей, иммунизированных конструктами SHBs, составлял 39% и 48% для генотипа А и С, соответственно. Средняя элиминация клеток-мишеней для конструктов LHBs составила 35% для генотипа А и 51% для генотипа С. Клиренс был сильным, но не столь мощным, как реакция, наблюдаемая у мышей, которые были иммунизированы только коровой Agплазмидой, как описано в примере 1, у которых 83% и 76% целевой коиренс был отмечен в селезенке и печени, соответственно. Демонстрация того, что ЦТЛ, генерированные против HBs, могут устранять антиген-мишень в печени, способствует тому, что она поддерживает комбинацию HBs и НВс для дальнейшего расширения клеточной силы и ограничения утечки. Процент элиминации клеток-мишеней в печени составил 45% и 66% для SHBs-A и SHBs-C, и 60% и 74% в группах LHBs-A и LHBs-C (фиг. 54). Имея вакциноспецифический ЦТЛ трафик в печень, орган, как известно, подавляет Т-клеточный ответ и индуцирует толерантность, подчеркивает эффективность конструктов в стимулировании функционального CMI.
Пример 5. Иммуногенность HBsAg-HBcAg ДНК-коктейля.
Поскольку иммунизация каждой искусственной HBsAg-плазмидой вызвала широкие перекрестнореактивные иммунные ответы, ответы были расширены за пределы поверхностного антигена для дальнейшего повышения иммуногенности в отношении различных антигенов в пределах вируса. Плазмиды HBs объединили с плазмидой, кодирующей HBcAg (pMCore), для создания HBs-HBc ДНК-вакцинных
- 37 046868 коктейлей для иммунизации, чтобы определить, повысит ли коктейль клеточную реакцию путей повышения количества иммунных эпитопов, которые Т-клетка будет распознавать для элиминирования, так как коровый антиген HBV участвует в вирусном клиренсе через индукцию HBcAg-специфических ЦТЛ реакций.
Пять групп мышей, иммунизированных вакцинными коктейлями только антигенов HBs или объединенных антигенов HBs и НВс. Каждая мышь получила две инъекции с последующей электропорацией в обеих ТА. Мышей иммунизировали либо коктейлями, содержащими только поверхностные антигены (обеих генотипов), или коктейлями, содержащими как поверхностные антигены, так и консенсусную плазмиду корового антигена (pMCore), описанную в примере 1 (см. табл. 3). Мыши, иммунизированные только HBsAg, генерировали высокий титр IgG в своих сыворотках. Интересно, похожие титры наблюдались в группе SHBs-pMCore, но были менее сильными в группе коктейлей LHBs-pMCore (фиг. 55А). Увеличение антигена-мишени, возможно, вызвало некоторое торможение антител.
Таблица 3 Иммунизационные группы мышей для исследования ДНК-коктейлей HBs-HBc
Группы мышей | ДНК-коктейль |
Группа 1 | pGXOOOlonly |
Группа 2 | pLHBs-A/pLHBs-C |
Группа 3 | pSHBs-A/pSHBs-C |
Группа 4 | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore |
Группа 5 | pSHBs-A/pSHBs-C/pMCore |
Для дальнейшего изучения иммунного ответа, вызываемого HBS-HBc-иммунизированными мышами, оценивали продуцирование IFN-γ из каждой иммунизированной группы. Среднее SFU на миллион спленоцитов для групп, не имеющих pMCore, составило 689 и 666 для генотипа А и 1160 и 1312 против пептидов генотипа С, соответственно. Кроме того, добавление pMCore в среднем увеличило общее SFU на миллион спленоцитов на 400 точек против генотипа C и в два раза реакцию, когда спленоциты стимулировали пептидами генотипа А (фиг. 55В).
CD8 Т-клетки, как известно, являются основными эффекторными клетками, ответственными за клиренс HBV. Важно определить, какой тип Т-клеток является причиной наблюдаемого производства IFN-γ и изучить, могут ли эти Т-клетки вызывать несколько противовирусных функций в ответ на антигенное повторное столкновение, высвобождая другие противовирусные цитокины, такие как TNF-α и IL -2 и маркеры дегрануляции, такие как CD107а. Способность CD8 Т-клеток от иммунизированных мышей индуцировать эти цитокины и маркеры оценивали после ex vivo стимуляции пригодными пептидами. Разноцветный проточный анализ показал, что значительный процент CD8 Т-клеток из каждой группы были полифункциональными (т.е. продуцируется несколько цитокинов), активированные CD8 Т-клетки во всех группах (фиг. 56A-F). Также наблюдалась антиген-специфическая индукция маркера лимфоцитной дегрануляции, CD107а, в этих CD8 Т-клетках. CD8 Т-клетки из группы коктейлей HBS-HBc показали высокую полифункциональную активность при стимуляции петидом поверхностного антигена, что подтверждает синергетический эффект в CD8 Т-клеточных противовирусных цитокинах, таких как IFN-γ TNF-α и IL-2, и маркера дегрануляции, CD107а. Также наблюдалась индукция ЦТЛ через клиренс пересаженных антигенпульсирующих клеток. В то время как имелось уменьшение ответов антител к HBs для коктейлей, включая конструкты LHBs, коктейли вакцин SHBs-pMCore поддерживали гуморальные ответы, обнаруженные у животных, иммунизированных только SHBs.
Пример 6.
Иммунизация резус-макак коктейлем индуцирует сильные клеточные НВс- и HBs-специфические и гуморальные HBs-специфические иммунные реакции.
Эффективность ДНК-вакцины предыдущих ДНК-конструктов была последовательно слабой у крупных животных и людей. Сильные ответы антител и Т-клеточные ответы, стимулированные комбинацией pLHBs или pSHBs и pMCore у мышей приводят к оценке иммуногенности этих конструктов в модели нечеловекообразных приматов (NHP), который более точно имитируют иммунный ответ человека. Это препятствие для иммуногенности вакцины в качестве большего размера и аутбредной МНСпопуляции NHP, как правило, приводит к снижению или отсутствию иммуногенности по сравнению с мышиными моделями. Для этих исследований L-12, Th-1-ведущий цитокин, был добавлен для анализа. Было показано, что IL-12 приводит CMI, способствуя примированию и экспансии CD8 Т-клеток, при добавлении к иммунизации в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа против различных антигенов из различных патогенов. Этот адъювант увеличивает Т-клеточные ответы ДНК-вакцины у мышей и макак, и человека.
- 38 046868
1. Вакцинация.
Пятнадцать индийских макак-резусов были размещены в Bioqual (Rockville, MD) в соответствии со стандартами Американской ассоциации по аккредитации в области лабораторных животных. Обезьяны резус-макак были помещены в группы, где каждая группа содержит 5 обезьян. См. табл. 4.
Таблица 4
Группы иммунизации нечеловекообразных приматов
группы обезьян | ДНК-коктейль |
группа А | pSHBs-A/pSHBs-C/pMCore |
группа В | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore |
группа С | pLHBs-A/pLHBs-C/pMCore + IL-12 |
Одной группе вводили путем внутримышечной (IM) доставки (также известной как in vivo электропорация) вакцину, содержащую 1,0 мг каждого из конструктов pMCore, pSHb А и pSHb С; эта группа называется небольшой группой. Второй группе вводили посредством IM доставки вакцину, содержащую 1,0 мг каждого из конструктов pMCore, pLHb А и pLHb С; эта группа называется длинной группой. Третьей группе вводили через IM доставку вакцину, содержащую по 1,0 мг каждого из конструктов pMCore, pLHb A и pLHb С и 0,4 мг prhIL-12 (плазмида, экспрессирующая оптимизированный резус IL12); эта группа упоминается как длинная+ГЬ-12 или pLHBs+12 группа. Конструкт prhIL-12 кодирует белок IL-12 резус-макаки. ДНК была доставлена к единичному сайту в четырехглавой мышце с последующей in vivo ЕР с помощью устройства постоянного тока CELLECTRA® (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) 3 импульсами при 0,5 А постоянного тока, длительность импульса 52 мс и 1 с отдыха между импульсы. Животные были вакцинированы в недели 0, 4, 12 и 30.
2. Отбор проб.
Образцы брали от обезьян до иммунизации в неделю 0, а также после каждой иммунизации (т.е. после недель 0, 4 и 12). У животных брали кровь через 2 недели после каждой иммунизации. Кровь (20 мл в каждый момент времени) собирали в пробирки с ЭДТА, а РВМС выделяли с использованием стандартной процедуры фиколл-гипак с пробирками Accuspin (Sigma-Aldrich). Дополнительные 5 мл крови собирали в пробирки для отделения плазмы, а сыворотку делили на аликвоты для анализа.
Реакции с высоким титром антител против HBsAg наблюдались после двух иммунизации pSHBs/pMCore, но не с pLHBs/pMCore. Этот ответ был сопоставим с данными мышиного антитела на фиг. 55 А. Ответ против pLHBs/pMCore поднялся после третьей иммунизации. Адъювант IL-12 повысил титр антител иммунизации коктейлем pLHBs/pMCore уже после всего лишь двух иммунизации (фиг. 57А). Клеточные иммунные реакции от РВМС показывают практически отсутствие HBs или НВСспецифических ответов после первой иммунизации. Однако, ответы наблюдались после второй иммунизации и увеличивались после каждой последующей иммунизации. Сильные ответы свыше 2000 SFU на миллион РВМС наблюдались во всех группах после третьей иммунизации и были в значительной степени направлены против корового антигена. Добавление адъюванта IL-12 усиливало амплитуду Тклеточного ответа 1000 SFU на миллио РВМС по сравнению с только коктейлем pLHBs/pMCore (фиг. 57В). Для дальнейшего определения широты клеточного ответа были созданы матриксные пулы консенсусных коровых пептидов для определения количества возможных эпитопов. Реакции Т-клеток охватили несколько пептидных пулов со средним ответом на 12 пептидных эпитопов (фиг. 57С). Эти ответы совпадают с полученными ранее, как показано на небольших животных моделях. Эти результаты позволяют предположить, что коктейли способны индуцировать клеточный ответ с сильной амплитудой и шириной, и что амплитуда этих ответов может быть расширена путем добавления IL-12.
На фиг. 45-48 показаны клеточные иммунные реакции, вызванные вакцинами, введенными в небольших, длинных и ддинная-П.-12 группах. Анализ иммуноферментных пятен (ELISPOT) был использован для определения клеточного иммунного ответа, как описано выше в примере 1. Как показано на фиг. 45-48 Т-клеточный ответ повышался с каждой вакцинацией. Однако, коровый антиген HBV был более иммуногенным, чем HBV-поверхностный антиген А и HBV-поверхностный антиген С. Эти данные также показывают, что более длинный консенсусный поверхностный антиген HBV (т.е. включает белок S, preS2 и preS1) является иммуногенным в качестве небольшого поверхностного антигена HBV (т.е. включает белок S).
Подобно фиг. 45-48, на фиг. 49 показаны клеточные иммунные ответы, вызванные вакцинами, введенными в небольших, длинных и длинная+IL-12 группах, как измерено с помощью анализа ELISPOT, кроме того были исследованы различные пулы пептидов, охватывающие коровый антиген, поверхностный антиген А и поверхностный антиген С. Опять же, ответ Т-клеток повышался с каждой вакцинацией, добавление IL-12 усиливало клеточный иммунный ответ, а длинные и короткие консенсусные поверхностные антигены HBV были аналогично иммуногенными.
На фиг. 50 показаны данные ELISA, сравнивающие ответы антител против HBV для небольших, длинных и длинная+IL-12 групп. ELISA были выполнены, как описано выше в примере 1. Наблюдались антиген-специфические гуморальные реакции в сыворотке, полученной от иммунизированных обезьян.
- 39 046868
В частности, вакцины, включающие длинный консенсусный поверхностный антиген (т.е. S-белок, preS2 и preS1) имеют лучшую реакцию антитела, которая может быть из-за дополнительных эпитопов, присутствующих в вакцине.
На фиг. 51 показаны данные ELISA, сравнивающие ответы антител против HBV для группы длинная+[к-12 до иммунизации (prevac) и после иммунизации в неделю 0, неделю 4 и неделю 12 (то есть, после 1-й, после 2-й и после 3-ей иммунизации, соответственно). ELISA проводили, как описано выше в примере 1. Данные на фиг. 51 показывают, что две иммунизации или дозы необходимы для измеримого продуцирования антител. Кроме того, значительное повышение ответа антитела к HBV наблюдали после третьей иммунизации или дозы.
Пример 7.
Как и в экспериментах с мышами в примере 5, спленоциты, т.е. CD8 и CD4 Т-клетки, были выделены от иммунизированных макак резус в примере 6 для исследования уровней INF-γ и секреции TNF-α в ответ на введение комбинации консенсусных коровых и консенсусных поверхностных антигенов. CD8 и CD4 Т-клетки были изучены с помощью полифункционального и фенотипического анализа потока, чтобы изучить секрецию фактора некроза опухоли, гамма-интерферона и CD107а из этих CD8 и CD4 Тклеток, чтобы определить, имеют ли CD8 и CD4 Т-клетки иммунизированных обезьян из Примера 6 сходные характеристики с мышиными CD8 и CD4 Т-клетками, изученными в примере 1. Для дальнейшего определения функции клеточного иммунного ответа, внутриклеточное окрашивание противовирусных цитокинов проводили после стимуляции коровых и поверхностных антигенов из генотипов А и С. Внутриклеточное окрашивание антителами к противовирусным цитокинам показало, что антигенспецифическое продуцирование противовирусных цитокинов (IFN-γ, TNF-α и IL-2) индуцировалось в обеих CD4 и CD8 Т-клетках от иммунизированных обезьян. Фиг. 57D показывает, что после трех иммунизаций наблюдались HBV-специфические CD4 и CD8 Т-клеточные реакции. Подобно результатам, показанным в IFN-γ ELISpot, ответы против корового антигена доминировали. Добавление IL-12 усиливало общую амплитуду отклика, однако, как ожидалось, этот эффект был более выраженным для CD8 Тклеток. Индукция как CD4, так и CD8 ответов, составляющая в среднем 1%, предполагает индукцию широкого иммунного ответа, состоящего из Th1 и Th2 иммунитета и является сильно обнадеживающей для продвижения этой стратегии в испытаниях на людях. Антитела и Т-клеточные ответы на антигены HBs и НВс были аналогичны результатам, полученным с мышами в примере 5. Эти ответы были еще более впечатляющими, когда IL-12, Th1 поляризационный цитокиновый адъювант был добавлен в коктейль pLHBs-pMCore. Похоже, что pLHBs-pMCore + IL-12 рецептура была весьма эффективной в качестве предпочтительной комбинации. Следует отметить, что ни один вакцинный препарат не привел к повышению параметров, связанных с повреждением печени.
Пример 8.
Анализ функции печени у нечеловекообразных приматов после вакцинации с использованием панелей для химического анлиза крови из печени.
Поскольку клинические исследования пациентов, активно инфицированных HBV, предположили возможность того, что Т-клеточный ответ может быть связанным с патологией печени в течение болезни, то проводили предварительный анализ общей безопасности этих поливалентных вакцин в отношении функции печени. Для того чтобы исследовать функцию печени, сывороточные уровни щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и общего билирубина были проанализированы у вакцинированных животных до иммунизации, после третьей вакцинации и непосредственно перед четвертой вакцинацией и после четвертой вакцинации. Панели для химического анализа крови были прогнаны IDEXX Laboratories и содержали щелочную фосфатазу, аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу и общий билирубин. Результаты этого анализа показаны на фиг. 58. Отсутствие повышения щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и общего билирубина в тестах на функцию печени до, во время и после завершения периода иммунизации предположил, что индукция HBV-специфического иммунного ответа не вызывала значительный ущерба печени вакцинированных животных.
Взятые вместе, эти данные подтверждают, что введение этого искусственного ДНК-вакцинного коктейля, кодирующего сконструированные антигены HBV, в комбинации со специфической электропорацией приводит к сильным и разнообразным клеточным и гуморальным реакциям у мышей и NHP, избегая при этом ощутимой токсичности.
Понятно, что приведенное выше подробное описание и сопровождающие примеры являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, который определен исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Различные изменения и модификации раскрытых вариантов осуществления будут очевидны специалистам в данной области техники. Такие изменения и модификации, в том числе, без ограничения, касающиеся химической структуры, заместителей, производных, промежуточных соединений, композиций, составов или способов использования изобретения, могут быть сделаны без отступления от сущности и объема изобретения.
-
Claims (22)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Вакцина для индуцирования иммунного ответа против HBV у человека, содержащая одну или более молекул нуклеиновых кислот, выбранных из:(a) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 96% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 97% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, и аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и (b) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 96% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 97% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
- 2. Вакцина по п.1, дополнительно содержащая:(с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.
- 3. Вакцина по п.2, содержащая:(a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 96% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 97% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, и аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и (b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из: SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 96% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 97% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; и (с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.
- 4. Вакцина по п.3, содержащая:(a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13;(b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 и содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15; и (c) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6, и содержащую одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5, соответственно.
- 5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду.
- 6. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включена в вирусную частицу.
- 7. Вакцина по п.1, дополнительно содержащая адъювант.
- 8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что указанный адъювант представляет собой IL-12, IL-15, IL28 или RANTES.- 41 046868
- 9. Способ индукции у человека иммунного ответа против HBV, включающий введение вакцины по п.1.
- 10. Способ защиты человека от HBV-инфекции, включающий введение вакцины по п.1.
- 11. Способ лечения человека, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение вакцины по п. 1.
- 12. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность, которая кодирует одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из:(а) аминокислотной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 14;(d) аминокислотной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 16;(e) аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; и (f) аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
- 13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, содержащая одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из:(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13;(b) нуклеотидной последовательности, которая на 98% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13;(c) нуклеотидной последовательности, которая на 99% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13;(d) нуклеотидной последовательности, содержащей SEQ ID NO: 15;(e) нуклеотидной последовательности, которая на 98% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 15; и (f) нуклеотидной последовательности, которая на 99% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 15.
- 14. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду.
- 15. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор экспрессии, и нуклеотидная последовательность, кодирующая одну или более аминокислотных последовательностей, функционально связана с регуляторным элементом.
- 16. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включена в вирусную частицу.
- 17. Способ индукции у человека иммунного ответа против HBV, включающий введение человеку молекулы нуклеиновой кислоты по п. 12.
- 18. Способ защиты человека от HBV-инфекции, включающий введение человеку молекулы нуклеиновой кислоты по п.12.
- 19. Способ лечения человека, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение человеку молекулы нуклеиновой кислоты по п.12.
- 20. Белок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из:(a) SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16;(b) аминокислотной последовательности, которая на 98% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; и (c) аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична по всей длине полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
- 21. Вакцина для индуцирования иммунного ответа против HBV у человека, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 и адъювант.
- 22. Вакцина по п.21, отличающаяся тем, что указанный адъювант представляет собой IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13/622,965 | 2012-09-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA046868B1 true EA046868B1 (ru) | 2024-04-27 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7050310B2 (ja) | B型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原タンパク質をコードする核酸分子ならびにそれを含むワクチン | |
US10695421B2 (en) | Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and vaccine comprising the same | |
US8927692B2 (en) | Consensus prostate antigens, nucleic acid molecule encoding the same and vaccine and uses comprising the same | |
US20080044384A1 (en) | Recombinant Human Cytomegalovirus And Vaccines Comprising Heterologous Antigens | |
MX2012004967A (es) | Proteinas de consenso del virus de la fiebre aftosa (fmdv), secuencias codificantes para estas y vacunas fabricadas a partir de estas. | |
EA046868B1 (ru) | Коровый белок вируса гепатита в и поверхностный антигенный белок и содержащая их вакцина | |
Mauch et al. | Induction of cytotoxic T lymphocyte responses against hepatitis delta virus antigens which protect against tumor formation in mice |