EA045709B1 - METHOD FOR PRODUCING LOW MOLECULAR HEPARINS AND HEPARINS PRODUCED BY THE SAME METHOD - Google Patents
METHOD FOR PRODUCING LOW MOLECULAR HEPARINS AND HEPARINS PRODUCED BY THE SAME METHOD Download PDFInfo
- Publication number
- EA045709B1 EA045709B1 EA202292690 EA045709B1 EA 045709 B1 EA045709 B1 EA 045709B1 EA 202292690 EA202292690 EA 202292690 EA 045709 B1 EA045709 B1 EA 045709B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- molecular weight
- heparin
- low molecular
- residues
- hours
- Prior art date
Links
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 claims description 95
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims description 74
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 42
- NDKBVBUGCNGSJJ-UHFFFAOYSA-M benzyltrimethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 NDKBVBUGCNGSJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 37
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 claims description 36
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 34
- OHGSYWFDRHAACA-IVMDWMLBSA-N (1R,2S,3R,4R)-4-amino-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-2,3-diol Chemical group C12[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO2 OHGSYWFDRHAACA-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 33
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 claims description 15
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 claims description 7
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 229960000610 enoxaparin Drugs 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000010555 transalkylation reaction Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 3
- 229960005153 enoxaparin sodium Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- CIJQTPFWFXOSEO-NDMITSJXSA-J tetrasodium;(2r,3r,4s)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-6-[(1r,2r,3r,4r)-4-[(2r,3s,4r,5r,6r)-5-acetamido-6-[(4r,5r,6r)-2-carboxylato-4,5-dihydroxy-6-[[(1r,3r,4r,5r)-3-hydroxy-4-(sulfonatoamino)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl]oxy]oxan-3-yl]oxy-2-(hydroxy Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1O)NC(C)=O)O[C@@H]1C(C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](OC2C(O[C@@H](OC3[C@@H]([C@@H](NS([O-])(=O)=O)[C@@H]4OC[C@H]3O4)O)[C@H](O)[C@H]2O)C([O-])=O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]1C)C([O-])=O)[C@@H]1OC(C([O-])=O)=C[C@H](O)[C@H]1O CIJQTPFWFXOSEO-NDMITSJXSA-J 0.000 description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229960003872 benzethonium Drugs 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 2
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- SIYLLGKDQZGJHK-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(phenylmethyl)-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethyl]ammonium Chemical compound C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SIYLLGKDQZGJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- UHEOHHJUBKIEMB-PQMKYFCFSA-N (1R,2S,3S,4S,5S)-5-amino-2,3-dihydroxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-4-sulfonic acid Chemical compound S(=O)(=O)(O)[C@@H]1[C@]2(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O)O)CO2)N UHEOHHJUBKIEMB-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N Carbon-13 Chemical compound [13C] OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- GKTNLYAAZKKMTQ-UHFFFAOYSA-N n-[bis(dimethylamino)phosphinimyl]-n-methylmethanamine Chemical compound CN(C)P(=N)(N(C)C)N(C)C GKTNLYAAZKKMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates
Настоящее изобретение относится к способу получения низкомолекулярных гепаринов (НМГ) и к низкомолекулярным гепаринам, полученным тем же способом.The present invention relates to a method for producing low molecular weight heparins (LMWH) and to low molecular weight heparins obtained by the same method.
Уровень техникиState of the art
Гепарин - это полисахарид семейства гликозаминогликанов, состоящий из уроновой кислоты (L-идуроновой кислоты или D-глюкуроновой кислоты) и D-глюкозамина, попеременно связанных между собой. L-идуроновая кислота может быть 2-O-сульфатированной, а D-глюкозамин может быть N-сульфатированным и/или 6-O-сульфатированным, и в меньшей степени N-ацетилированным или 3-Oсульфатированным. Гепарин предпочтительно используется в виде натриевой соли, но может также использоваться в виде соли других щелочных или щелочноземельных металлов и в основном применяется в качестве антитромботического и антикоагулянтного препарата.Heparin is a polysaccharide of the glycosaminoglycan family, consisting of uronic acid (L-iduronic acid or D-glucuronic acid) and D-glucosamine, alternately linked to each other. L-iduronic acid can be 2-O-sulfated, and D-glucosamine can be N-sulfated and/or 6-O-sulfated, and to a lesser extent N-acetylated or 3-Osulfated. Heparin is preferably used as the sodium salt, but may also be used as other alkali or alkaline earth metal salts and is primarily used as an antithrombotic and anticoagulant drug.
Гепарины можно классифицировать на основе их молекулярной массы как нефракционированный гепарин (НФГ), НМГ и гепарин с очень низкой молекулярной массой (ОНМГ). НМГ и ОНМГ получены в результате деполимеризации исходной молекулы НФГ.Heparins can be classified based on their molecular weight as unfractionated heparin (UFH), LMWH, and very low molecular weight heparin (VLLW). LMWH and ONMH are obtained as a result of depolymerization of the original UFH molecule.
В настоящее время технически описаны различные способы получения НМГ. Один из них соответствует щелочной деполимеризации по механизму β-элиминации.Currently, various methods for producing LMWH have been technically described. One of them corresponds to alkaline depolymerization via the β-elimination mechanism.
EP 0040144 описывает процесс получения НМГ с помощью способа, включающего стадии трансалкилирования соли гепарина до гепарината бензетония, этерификации гепарината бензетония бензилхлоридом, очистки и получения натриевой соли бензилового эфира гепарина, деполимеризации гидроксидом натрия с омылением сложного эфира и очистки продукта.EP 0040144 describes a process for preparing LMWH by a process comprising the steps of transalkylation of a heparin salt to benzethonium heparinate, esterification of benzethonium heparinate with benzyl chloride, purification and production of the sodium salt of heparin benzyl ester, depolymerization with sodium hydroxide with ester saponification and purification of the product.
EP 1070503 описывает процесс получения НМГ с помощью способа, включающего стадии трансалкилирования соли гепарина в гепаринат бензалкония, деполимеризации в неводной среде с Triton B и очистки продукта.EP 1070503 describes the process of producing LMWH by a process comprising the steps of transalkylation of a heparin salt into benzalkonium heparin, depolymerization in a non-aqueous medium with Triton B and purification of the product.
EP 2881404 описывает процесс получения НМГ, включающий первый этап трансалкилирования, деполимеризацию с фосфазеновым основанием или основанием, полученным из гуанидина, и заключительный этап трансалкилирования.EP 2881404 describes a process for the preparation of LMWHs, comprising a first transalkylation step, depolymerization with a phosphazene or guanidine-derived base, and a final transalkylation step.
Существует потребность в более воспроизводимых и стабильных процессах, которые позволяют получать НМГ, особенно НМГ с более высокой стабильностью.There is a need for more reproducible and stable processes that produce LMWHs, especially LMWHs with higher stability.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Авторы настоящего изобретения нашли способ приготовления низкомолекулярных гепаринов (НМГ), которые демонстрируют превосходную стабильность при сохранении хорошей анти-FXa и антиFIIa активности. Этот метод получения НМГ включает обработку сырого деполимеризованного гепарина H2O2 при расходе от 0,04 до 1,0 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина.The present inventors have found a method for preparing low molecular weight heparins (LMWHs) that exhibit excellent stability while maintaining good anti-FXa and anti-FIIa activity. This method of producing LMWH involves treating crude depolymerized heparin with H 2 O 2 at a rate of 0.04 to 1.0 L H 2 O 2 with 33% w/v/kg depolymerized heparin.
Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу получения низкомолекулярных гепаринов со средней молекулярной массой от 3 до 3,8 кДа, включающему следующие стадии:Thus, in a first aspect, the invention relates to a method for producing low molecular weight heparins with an average molecular weight of 3 to 3.8 kDa, comprising the following steps:
приготовление водного раствора гепарина натрия;preparation of an aqueous solution of sodium heparin;
добавление хлорида бензалкония к раствору этапа (а), чтобы получить гепаринат бензалкония;adding benzalkonium chloride to the solution of step (a) to obtain benzalkonium heparinate;
растворение гепарината бензалкония, полученного на этапе (b), в Cl2CH2, добавление Triton B и выдержка при 20-40°C в течение 24-48 ч; и выполнение по меньшей мере двух обработок H2O2 деполимеризованного гепарина, полученного на этапе (c), из расчета от 0,04 до 1,0 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина, для каждой обработки.dissolving the benzalkonium heparinate obtained in step (b) in Cl 2 CH 2 , adding Triton B and maintaining at 20-40°C for 24-48 hours; and performing at least two H2O2 treatments of the depolymerized heparin obtained in step (c) at a rate of 0.04 to 1.0 L of H2O2 33% w/v/kg depolymerized heparin for each treatment.
Второй аспект изобретения относится к низкомолекулярному гепарину, получаемому способом по изобретению.The second aspect of the invention relates to low molecular weight heparin obtained by the method of the invention.
Было установлено, что содержание 1,6-ангидроостатков в полученных НМГ составляет от 1 до 15%. Таким образом, третий аспект изобретения относится к низкомолекулярному гепарину со средней молекулярной массой от 3 до 3,8 кДа, имеющему содержание 1,6-ангидроостатков от 1 до 15% на восстановительном конце его олигосахаридных цепей.It was found that the content of 1,6-anhydro residues in the resulting LMWHs ranges from 1 to 15%. Thus, the third aspect of the invention relates to low molecular weight heparin with an average molecular weight of from 3 to 3.8 kDa, having a content of 1,6-anhydro residues from 1 to 15% at the reducing end of its oligosaccharide chains.
Определения и варианты осуществления, описанные для одного аспекта, в равной степени применимы ко всем другим аспектам изобретения.The definitions and embodiments described for one aspect are equally applicable to all other aspects of the invention.
В настоящем изобретении низкомолекулярный гепарин или НМГ определяется в монографии Гепарины, низкомолекулярная масса (Heparins, Low-Molecular-Mass), 0828, Европейская фармакопея 9-е изд., как смесь полисахаридов, полученная из гепарина и имеющая среднюю молекулярную массу менее 8000 Да, в котором по крайней мере 60% от общей массы имеет молекулярную массу менее 8000 Да. Средняя молекулярная масса НМГ по изобретению была определена по способу Европейской фармакопеи (Европейская фармакопея, 9-е изд.).In the present invention, low molecular weight heparin or LMWH is defined in the monograph Heparins, Low-Molecular-Mass, 0828, European Pharmacopoeia 9th ed., as a mixture of polysaccharides derived from heparin and having an average molecular weight of less than 8000 Da, in which at least 60% of the total mass has a molecular weight of less than 8000 Da. The average molecular weight of the LMWH according to the invention was determined according to the method of the European Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia, 9th ed.).
В настоящем изобретении под 1,6-ангидро остатками понимаются различные химические группы, которые образуются в терминальных положениях НМГ в процессе деполимеризации. Неограничивающими примерами этих групп являются 2-сульфо-амино-1,6-ангидро-2-дезокси-в-О-глюкопираноза (1,6-ангидроглюкозамин) и 2-сульфо-амино-1,6-ангидро-2-дезокси-β-D-маннопираноза (1,6-ангидроманозамин). Количество этих остатков в НМГ выражается как процент олигосахаридных цепей с этими типами остатковIn the present invention, 1,6-anhydro residues refer to various chemical groups that are formed at the terminal positions of LMWH during depolymerization. Non-limiting examples of these groups are 2-sulfo-amino-1,6-anhydro-2-deoxy-in-O-glucopyranose (1,6-anhydroglucosamine) and 2-sulfo-amino-1,6-anhydro-2-deoxy- β-D-mannopyranose (1,6-anhydromanosamine). The number of these residues in LMWH is expressed as the percentage of oligosaccharide chains with these types of residues
- 1 045709 на их восстановительном конце.- 1 045709 on their recovery end.
Содержание в 1,6-безводных концах НМГ может быть получено с помощью аналитического метода, описанного в монографии Эноксапарин натрия (Enoxaparin Sodium), 1097, Европейская фармакопея, 9-е изд., описанной в разделе Идентификация B. В этом методе молекула интенсивно деполимеризуется смесью гепариназ I, II и III, а образовавшиеся остатки разделяются и количественно определяются с помощью хроматографии сильного анионного обмена (SAX-HPLC). Содержание 1,6-ангидро, например, определяется по следующей формуле:The content of the 1,6-anhydrous ends of LMWH can be obtained using the analytical method described in the monograph Enoxaparin Sodium, 1097, European Pharmacopoeia, 9th ed., described in section Identification B. In this method, the molecule is extensively depolymerized a mixture of heparinases I, II and III, and the resulting residues are separated and quantified using strong anion exchange chromatography (SAX-HPLC). The 1,6-anhydro content, for example, is determined by the following formula:
% 1,6-ангидро = Mw * (Ai + А2 + А3) * 100 / 2Mwx * Ах в которой Mw - средневесовая молекулярная масса;% 1,6-anhydro = Mw * (Ai + A 2 + A 3 ) * 100 / 2Mw x * A x in which Mw is the weight-average molecular weight;
Mwx - молекулярная масса производного x (см. табл. 1097-1 в монографии Эноксапарин натрия (Enoxaparin Sodium), 1097, Европейская фармакопея, 9-е изд.);Mw x is the molecular weight of derivative x (see Table 1097-1 in the monograph Enoxaparin Sodium, 1097, European Pharmacopoeia, 9th ed.);
Ax - площадь пика производной x;A x - peak area of the derivative x;
Ai - площадь пика 1,6-ангидропроизводного ΔIS;Ai is the peak area of the 1,6-anhydro derivative ΔIS;
A2 - площадь пика производного 1,6-ангидропроизводного ΔIIS;A2 is the peak area of the 1,6-anhydro derivative ΔIIS;
A3 - площадь пика 1,6-ангидропроизводного ΔIS-IS.A 3 - peak area of the 1,6-anhydro derivative ΔIS-IS.
Доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина и 1,6-ангидроманозамина в НМГ может быть определена с помощью ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), например, путем 1H 13C HSQC. Соотношение между двумя остатками может быть определено путем интегрирования сигналов, соответствующих каждому из этих остатков в спектре 1H 13C HSQC.The proportion of 1,6-anhydroglucosamine and 1,6-anhydromanosamine residues in LMWH can be determined by nuclear magnetic resonance (NMR), for example by 1 H 13 C HSQC. The relationship between two residues can be determined by integrating the signals corresponding to each of these residues in the 1H 13 C HSQC spectrum.
Анти-FXa и анти-FIIa активность НМГ по изобретению была определена с помощью хромогенного способа Европейской фармакопеи (Европейская фармакопея, 9-е изд., Монография 0828) и была выражена в международных единицах по мг.The anti-FXa and anti-FIIa activity of the LMWH according to the invention was determined using the chromogenic method of the European Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia, 9th ed., Monograph 0828) and was expressed in international units of mg.
Степень окрашенности НМГ может быть определена в соответствии с методом II Европейской фармакопеи, глава 2.2.2. Термин температура окружающей среды относится к температуре от 20 до 25°C.The degree of coloration of LMWH can be determined in accordance with Method II of the European Pharmacopoeia, Chapter 2.2.2. The term ambient temperature refers to temperatures between 20 and 25°C.
Как используется в настоящем документе, термин приблизительно означает ±10% от заданного значения.As used herein, the term approximately means ±10% of the set value.
НМГ по настоящему изобретению имеет среднюю молекулярную массу (Mw) от 3 до 3,8 кДа, предпочтительно от 3 до 3,6 кДа.The LMWH of the present invention has an average molecular weight (Mw) of 3 to 3.8 kDa, preferably 3 to 3.6 kDa.
В одном варианте осуществления изобретения НМГ имеет содержание 1,6-ангидро остатков от 1 до 15% на восстановительном конце своих олигосахаридных цепей; предпочтительно от 2 до 13%, более предпочтительно от 4 до 11%.In one embodiment of the invention, LMWH has a content of 1,6-anhydro residues from 1 to 15% at the reducing end of its oligosaccharide chains; preferably 2 to 13%, more preferably 4 to 11%.
Предпочтительно молярная доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина в НМГ по настоящему изобретению больше или равна молярной доле остатков 1,6-ангидроманозамина. В конкретном варианте осуществления молярное соотношение остатков 1,6-ангидроглюкозамина и остатков 1,6-ангидроманозамина в НМГ составляет от 1:1 до 3:1, предпочтительно от 1:1 до 2,5:1 или от 1,05:1 до 2,5:1.Preferably, the mole fraction of 1,6-anhydroglucosamine residues in the LMWH of the present invention is greater than or equal to the mole fraction of 1,6-anhydroglucosamine residues. In a specific embodiment, the molar ratio of 1,6-anhydroglucosamine residues to 1,6-anhydroglucosamine residues in the LMWH is from 1:1 to 3:1, preferably from 1:1 to 2.5:1 or from 1.05:1 to 2.5:1.
В конкретном варианте осуществления изобретения НМГ имеют среднюю молекулярную массу от 3 до 3,8 кДа, содержание 1,6-ангидро-остатков от 1 до 15% на восстановительном конце их олигосахаридных цепей и соотношение 1,6-ангидроглюкозаминовых остатков больше или равно соотношению 1,6-ангидроманозаминовых остатков, предпочтительно от 1:1 до 3:1.In a specific embodiment, LMWHs have an average molecular weight of 3 to 3.8 kDa, a content of 1,6-anhydroglucosamine residues from 1 to 15% at the reducing end of their oligosaccharide chains, and a ratio of 1,6-anhydroglucosamine residues greater than or equal to the ratio of 1 ,6-anhydromanosamine residues, preferably from 1:1 to 3:1.
Предпочтительно НМГ по настоящему изобретению проявляет анти-FXa-активность в диапазоне 80-120 МЕ/мг и анти-FIIa-активность в диапазоне 5-20 МЕ/мг. В одном конкретном варианте осуществления они проявляют анти-FXα-активность в диапазоне 95-120 МЕ/мг и анти-FIIα-активность в диапазоне 10-20 МЕ/мг.Preferably, the LMWH of the present invention exhibits anti-FXa activity in the range of 80-120 IU/mg and anti-FIIa activity in the range of 5-20 IU/mg. In one particular embodiment, they exhibit anti-FXα activity in the range of 95-120 IU/mg and anti-FIIα activity in the range of 10-20 IU/mg.
В конкретном варианте осуществления изобретения НМГ имеют среднюю молекулярную массу от 3 до 3,8 кДа, содержание 1,6-ангидро-остатков от 1 до 15% на восстановительном конце их олигосахаридных цепей и соотношение 1,6-ангидроглюкозаминовых остатков больше или равно соотношению 1,6-ангидроманозаминовых остатков, предпочтительно от 1:1 и 3:1, анти-FXa активность в пределах 80-120 МЕ/мг и анти-FIIa активность в пределах 5-20 МЕ/мг.In a specific embodiment, LMWHs have an average molecular weight of 3 to 3.8 kDa, a content of 1,6-anhydroglucosamine residues from 1 to 15% at the reducing end of their oligosaccharide chains, and a ratio of 1,6-anhydroglucosamine residues greater than or equal to the ratio of 1 ,6-anhydromanosamine residues, preferably from 1:1 and 3:1, anti-FXa activity in the range of 80-120 IU/mg and anti-FIIa activity in the range of 5-20 IU/mg.
Предпочтительно, чтобы НМГ по настоящему изобретению имела степень окрашивания, большую или равную 6, в диапазоне эталонных цветовых растворов, установленных в Европейской Фармакопее, глава 2.2.2. (метод II) в течение не менее 24 месяцев, предпочтительно не менее 36 месяцев, при комнатной температуре и относительной влажности 60%. Это определение может быть выполнено в соответствии с методом, описанным в Европейской Фармакопее (глава 2.2.2; метод II), или автоматически с помощью колориметра.Preferably, the LMWH of the present invention has a color level greater than or equal to 6, within the range of reference color solutions established in the European Pharmacopoeia, Chapter 2.2.2. (method II) for at least 24 months, preferably at least 36 months, at room temperature and 60% relative humidity. This determination can be performed according to the method described in the European Pharmacopoeia (Chapter 2.2.2; Method II) or automatically using a colorimeter.
Было отмечено, что НМГ по настоящему изобретению обладают высокой стабильностью. В частности, было обнаружено, что они стабильны не менее 24 месяцев или даже не менее 36 месяцев при комнатной температуре и относительной влажности 60%.It was noted that the LMWHs of the present invention are highly stable. In particular, they have been found to be stable for at least 24 months or even at least 36 months at room temperature and 60% relative humidity.
В одном аспекте изобретение относится к способу получения низкомолекулярных гепаринов со средней молекулярной массой от 3 до 3,8 кДа, включающему следующие этапы:In one aspect, the invention relates to a method for producing low molecular weight heparins with an average molecular weight of 3 to 3.8 kDa, comprising the following steps:
приготовление водного раствора гепарина натрия;preparation of an aqueous solution of sodium heparin;
добавление хлорида бензалкония к раствору этапа (а), чтобы получить гепаринат бензалкония;adding benzalkonium chloride to the solution of step (a) to obtain benzalkonium heparinate;
- 2 045709 растворение гепаринат бензалкония, полученного на стадии (b), в CH2C12, добавление Triton B и выдержка при 20 до 40°C в течение 24-48 ч; и выполнение по меньшей мере двух обработок H2O2 деполимеризованного гепарина, полученного после этапа c), из расчета от 0,04 до 1,0 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина, для каждой обработки.- 2 045709 dissolving the benzalkonium heparinate obtained in stage (b) in CH2C12, adding Triton B and maintaining at 20 to 40°C for 24-48 hours; and performing at least two treatments with H 2 O 2 depolymerized heparin obtained after step c), at a rate of 0.04 to 1.0 L H 2 O 2 33% w/v/kg depolymerized heparin, for each treatment .
Конкретные и предпочтительные варианты реализации низкомолекулярного гепарина описаны выше в этой статье.Specific and preferred embodiments of low molecular weight heparin are described above in this article.
В конкретном воплощении водный раствор гепарина натрия на этапе а) готовят из гепарина, полученного из слизистой оболочки кишечника свиньи.In a specific embodiment, the aqueous sodium heparin solution in step a) is prepared from heparin obtained from porcine intestinal mucosa.
Добавление Triton B на этапе c) может быть осуществлено путем одного или нескольких последовательных добавлений, например путем 1, 2, 3 или 4 последовательных добавлений Triton B.The addition of Triton B in step c) can be done by one or more sequential additions, for example by 1, 2, 3 or 4 sequential additions of Triton B.
В конкретном воплощении добавление Triton B на этапе c) осуществляется максимум тремя последовательными добавлениями, т.е. 1, 2 или 3, каждое с добавлением Triton B в весовом соотношении от 0,2:1 до 0,3:1 Triton B: гепаринат бензалкония. Предпочтительно добавление Triton B на стадии с) проводят тремя последовательными добавлениями Triton B, и предпочтительно каждое из них с добавлением Triton B в весовом соотношении от 0,2:1 до 0,3:1 Triton B: бензалкония гепарината.In a specific embodiment, the addition of Triton B in step c) is carried out in a maximum of three consecutive additions, i.e. 1, 2 or 3, each with the addition of Triton B in a weight ratio of 0.2:1 to 0.3:1 Triton B: benzalkonium heparin. Preferably, the addition of Triton B in step c) is carried out in three successive additions of Triton B, and preferably each with the addition of Triton B in a weight ratio of from 0.2:1 to 0.3:1 Triton B:benzalkonium heparinate.
В варианте осуществления изобретения добавление Triton B на стадии с) осуществляется путем трех последовательных добавлений Triton B, таким образом, что после первого добавления реакция поддерживается в течение 6-10 ч до второго добавления, после второго добавления реакция поддерживается в течение 12-20 ч до третьего добавления, и после третьего добавления реакция поддерживается в течение 6-10 ч. В другом варианте осуществления после первого добавления реакция поддерживается в течение 7-9 ч до второго добавления, после второго добавления реакция поддерживается в течение 14-18 ч до третьего добавления, а после третьего добавления реакция поддерживается в течение 7-9 ч. В другом дополнительном варианте осуществления время реакции после первого, второго и третьего добавления составляет примерно 8 ч, примерно 16 ч и примерно 8 ч соответственно.In an embodiment of the invention, the addition of Triton B in step c) is carried out by three successive additions of Triton B, such that after the first addition the reaction is maintained for 6-10 hours before the second addition, after the second addition the reaction is maintained for 12-20 hours before third addition, and after the third addition, the reaction is maintained for 6-10 hours. In another embodiment, after the first addition, the reaction is maintained for 7-9 hours before the second addition, after the second addition, the reaction is maintained for 14-18 hours until the third addition, and after the third addition the reaction is maintained for 7-9 hours. In another further embodiment, the reaction time after the first, second and third addition is about 8 hours, about 16 hours and about 8 hours, respectively.
В одном варианте осуществления температура на стадии с) составляет от 25 до 35°С, предпочтительно от 27 до 32°С.In one embodiment, the temperature in step c) is from 25 to 35°C, preferably from 27 to 32°C.
В предпочтительном воплощении обработку H2O2 на этапе d) проводят на водном растворе деполимеризованного гепарина.In a preferred embodiment, the H 2 O 2 treatment in step d) is carried out on an aqueous solution of depolymerized heparin.
Предпочтительно каждая обработка H2O2 на этапе d) проводится при расходе от 0,04 до 0,5 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина, более предпочтительно от 0,04 до 0,3 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина. В конкретном варианте осуществления каждую обработку H2O2 на стадии d) проводят из расчета от 0,04 до 0,2 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина. В предпочтительном варианте осуществления стадия d) включает первую обработку деполимеризованным гепарином H2O2, полученным после стадии c), в соотношении от 0,05 до 0,25 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина, и вторая обработка с использованием H2O2 в соотношении от 0,04 до 0,25 л H2O2 33% мас./об./кг деполимеризованного гепарина.Preferably, each H2O2 treatment in step d) is carried out at a flow rate of 0.04 to 0.5 L H2O2 33% w/v / kg depolymerized heparin, more preferably 0.04 to 0.3 L H2O2 33% w/v/kg depolymerized heparin. In a specific embodiment, each H 2 O 2 treatment in step d) is carried out at a rate of 0.04 to 0.2 L of H 2 O 2 33% w/v/kg depolymerized heparin. In a preferred embodiment, step d) comprises a first treatment with depolymerized heparin H 2 O 2 obtained from step c), in a ratio of 0.05 to 0.25 l H 2 O 2 33% w/v/kg depolymerized heparin, and a second treatment using H 2 O 2 in a ratio of 0.04 to 0.25 L H2O2 33% w/v/kg depolymerized heparin.
В другом варианте осуществления стадия d) включает в себя три процедуры с H2O2.In another embodiment, step d) includes three procedures with H2O2.
Предпочтительно этап d) проводят при температуре от 20 до 50°С, предпочтительно от 25 до 45°С.Preferably, step d) is carried out at a temperature of from 20 to 50°C, preferably from 25 to 45°C.
Предпочтительно каждую обработку H2O2 проводить в течение не менее 3 ч. Например, от 3 до 20 ч. В конкретном варианте первая обработка H2O2 проводится в течение 12-20 ч, предпочтительно 14-18 ч. Предпочтительно вторую и последующие обработки H2O2 проводят в течение 3-7 ч, предпочтительно 4-6 ч.Preferably, each H 2 O 2 treatment is carried out for at least 3 hours. For example, from 3 to 20 hours. In a particular embodiment, the first H 2 O 2 treatment is carried out for 12-20 hours, preferably 14-18 hours. Preferably the second and subsequent H 2 treatments O 2 is carried out for 3-7 hours, preferably 4-6 hours.
В предпочтительном варианте осуществления стадию d) проводят при pH от 10,5 до 11,5. Кроме того, способ по изобретению может включать дополнительную стадию осаждения деполимеризованного гепарина в метаноле после каждой обработки H2O2 на стадии d). В конкретном варианте осуществления проводят две обработки H2O2 и проводят стадию осаждения деполимеризованного гепарина в метаноле между двумя обработками H2O2. В другом варианте осуществления проводят три обработки H2O2 и проводят стадию осаждения деполимеризованного гепарина в метаноле между первой и второй обработками H2O2 и между второй и третьей обработками H2O2.In a preferred embodiment, step d) is carried out at a pH of 10.5 to 11.5. In addition, the method of the invention may include the additional step of precipitating depolymerized heparin in methanol after each H 2 O 2 treatment in step d). In a specific embodiment, two H 2 O 2 treatments are performed and a step of precipitation of depolymerized heparin in methanol is performed between the two H 2 O 2 treatments. In another embodiment, three H 2 O 2 treatments are performed and a step of precipitation of depolymerized heparin in methanol is performed between the first and second H 2 O 2 treatments and between the second and third H 2 O 2 treatments.
Предпочтительно после первой обработки H2O2 на этапе d) деполимеризованный гепарин осаждают в растворе ацетата натрия в метаноле.Preferably, after the first treatment with H2O2 in step d), the depolymerized heparin is precipitated in a solution of sodium acetate in methanol.
В предпочтительном варианте осуществления НМГ, полученная в способе по изобретению, очищается осаждением метанолом.In a preferred embodiment, the LMWH obtained in the process of the invention is purified by methanol precipitation.
Полученный НМГ можно подвергнуть сублимационной сушке.The resulting LMWH can be freeze-dried.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На фиг. 1 показан спектр 1H ЯМР НМГ, полученного по способу изобретения, с расширением аномерной зоны.In fig. 1 shows the 1H NMR spectrum of LMWH obtained according to the method of the invention, with expansion of the anomeric zone.
На фиг. 2 показан спектр 1H 13C HSQC НМГ, полученного по способу изобретения, с расширением аномерной зоны.In fig. Figure 2 shows the 1H 13 C HSQC spectrum of LMWH obtained according to the method of the invention, with expansion of the anomeric zone.
- 3 045709- 3 045709
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of implementing the invention
Примеры.Examples.
Приведенные ниже конкретные примеры служат для иллюстрации сущности настоящего изобретения. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничение заявленного здесь изобретения.The following specific examples serve to illustrate the essence of the present invention. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be interpreted as limiting the invention claimed herein.
Пример 1.Example 1.
г Гепарина натрия растворяют в очищенной воде и при перемешивании добавляют раствор 50% (мас./об.) хлорида бензалкония с образованием гепарината бензалкония. Сформованный продукт несколько раз промывают водой для удаления избытка хлоридов и, наконец, высушивают сублимационной сушкой.g Sodium heparin is dissolved in purified water and a solution of 50% (w/v) benzalkonium chloride is added with stirring to form benzalkonium heparinate. The molded product is washed several times with water to remove excess chlorides and finally freeze-dried.
Бензалкония гепаринат растворяют в метиленхлориде и регулируют температуру до 30±5°С. Бензилтриметиламмоний гидроксид (Triton B) добавляют при 40% мас./об. в метаноле при массовом соотношении 0,25:1 к Triton B:бензалкония гепаринату и оставляют для реакции при указанной выше температуре. Добавление повторяют еще два раза, оставляя первое добавление Triton B на 8 ч, второе на 16 ч, а третье еще на 8 ч.Benzalkonium heparinate is dissolved in methylene chloride and the temperature is adjusted to 30±5°C. Benzyltrimethylammonium hydroxide (Triton B) is added at 40% w/v. in methanol at a mass ratio of 0.25:1 to Triton B:benzalkonium heparinate and leave to react at the above temperature. The addition is repeated two more times, leaving the first addition of Triton B for 8 hours, the second for 16 hours, and the third for another 8 hours.
При растворении деполимеризованного продукта и при pH от 10,5 до 11,5 добавляется H2O2 33% мас./об., в частности добавляется 0,1±10% л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината, и дают прореагировать при 30% мас./об.±5°C в течение более 3 ч (от 14 до 18 ч). По истечении времени реакции его осаждают при растворении ацетата натрия в метаноле, выделяя неочищенный низкомолекулярный гепарин центрифугированием.When the depolymerized product is dissolved and at a pH of 10.5 to 11.5, H 2 O 2 33% w/v is added, in particular 0.1 ± 10% l H 2 O 2 33% w/v is added. kg benzalkonium heparinate and allowed to react at 30% w/v ± 5°C for over 3 hours (14 to 18 hours). After the reaction time, it is precipitated by dissolving sodium acetate in methanol, isolating the crude low molecular weight heparin by centrifugation.
Этот неочищенный низкомолекулярный гепарин растворяют в воде и снова осаждают метанолом. Осадок растворяют в очищенной воде и обрабатывают H2O2 33% мас./об./кг, а именно добавляют 0,08±10% л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°С в течение более 3 ч (около 5 ч). По истечении периода реакции раствор нейтрализуется и осаждается метанолом.This crude low molecular weight heparin is dissolved in water and precipitated again with methanol. The precipitate is dissolved in purified water and treated with H 2 O 2 33% w/v/kg, namely, 0.08±10% l of H 2 O 2 33% w/v/kg of benzalkonium heparinate is added at a temperature of 40± 2°C for more than 3 hours (about 5 hours). After the reaction period, the solution is neutralized and precipitated with methanol.
Осадок повторно растворяют в очищенной воде и снова обрабатывают 0,05±10% литра H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°C в течение более 3 ч (около 5 ч). По истечении периода реакции раствор нейтрализуется и осаждается метанолом.The precipitate is redissolved in purified water and again treated with 0.05 ± 10% liter of H2O2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate at a temperature of 40 ± 2°C for more than 3 hours (about 5 hours). After the reaction period, the solution is neutralized and precipitated with methanol.
Концентрация гепарината бензалкония в растворе, в котором проводится как деполимеризация, так и первая обработка перекисью водорода, составляет 20% по массе/объему±2% в этом и во всех других примерах, если не указано иное. Количество перекиси водорода, добавляемого на разных стадиях, эквивалентно количеству как бензалкония гепарината, так и деполимеризованного гепарина, поскольку при различных добавлениях Triton B присутствующий в реакции бензалкония гепаринат деполимеризуется, образуя деполимеризованный гепарин.The concentration of benzalkonium heparinate in the solution in which both the depolymerization and the first hydrogen peroxide treatment are performed is 20% w/v ± 2% in this and all other examples unless otherwise noted. The amount of hydrogen peroxide added at various stages is equivalent to the amount of both benzalkonium heparinate and depolymerized heparin, since with various additions of Triton B, the benzalkonium heparinate present in the reaction is depolymerized to form depolymerized heparin.
Очищенный продукт растворяют в воде и проводят лиофилизацию, получая 6,00 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3241 Да, анти-FXa-активностью 118 МЕ/мг и анти-FIIaактивностью 13,7 МЕ/мг и присутствует на восстановительном конце его олигосахаридных цепей содержание 1,6-безводных остатков от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или равна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов.The purified product is dissolved in water and lyophilized to obtain 6.00 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3241 Da, anti-FXa activity of 118 IU/mg and anti-FIIa activity of 13.7 IU/mg and is present at the reducing end of its oligosaccharide chains the content of 1,6-anhydrous residues is from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equal to the proportion of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 2.Example 2.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 1, получают 6,01 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3259 Да, анти-FXa-активностью 103 МЕ/мг и анти-FIIa-активностью 15,2 МЕ/мг. Этот низкомолекулярный гепарин отличается тем, что на восстановительном конце его олигосахаридных цепей содержание 1,6-безводных остатков составляет от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина выше, чем доля остатков 1,6-ангидроманозамина. В отличие от других низкомолекулярных гепаринов.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps specified in example 1, 6.01 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3259 Da, anti-FXa activity of 103 IU/mg and anti-FIIa activity of 15.2 IU/mg are obtained . This low molecular weight heparin is characterized in that at the reducing end of its oligosaccharide chains the content of 1,6-anhydrous residues ranges from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is higher than the proportion of 1,6-anhydromanosamine residues. Unlike other low molecular weight heparins.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности > 6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, exhibiting a color grade > 6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines the color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 3.Example 3.
г Гепарина натрия растворяют в очищенной воде и при перемешивании добавляют раствор 50% (мас./об.) хлорида бензалкония с образованием гепарината бензалкония. Сформованный продукт несколько раз промывают водой для удаления избытка хлоридов и, наконец, высушивают сублимационg Sodium heparin is dissolved in purified water and a solution of 50% (w/v) benzalkonium chloride is added with stirring to form benzalkonium heparinate. The molded product is washed several times with water to remove excess chlorides and finally freeze dried
- 4 045709 ной сушкой.- 4 045709 drying.
Бензалкония гепаринат растворяют в метиленхлориде и регулируют температуру до 30±5°C. Бензилтриметиламмоний гидроксид (Triton B) добавляют при 40% мас./об. в метаноле при массовом соотношении 0,25:1 к Triton B:бензалкония гепаринату и оставляют для реакции при указанной выше температуре. Добавление повторяют еще два раза, оставляя первое добавление Triton B на 8 ч, второе на 16 ч, а третье еще на 8 ч.Benzalkonium heparinate is dissolved in methylene chloride and the temperature is adjusted to 30±5°C. Benzyltrimethylammonium hydroxide (Triton B) is added at 40% w/v. in methanol at a mass ratio of 0.25:1 to Triton B:benzalkonium heparinate and leave to react at the above temperature. The addition is repeated two more times, leaving the first addition of Triton B for 8 hours, the second for 16 hours, and the third for another 8 hours.
При растворении деполимеризованного продукта и при pH от 10,5 до 11,5 добавляется H2O2 33% мас./об., в частности добавляется 0,1±10% ли H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината, и дают прореагировать при 30% мас./об.±5°C в течение 16 ч. По истечении времени реакции его осаждают при растворении ацетата натрия в метаноле, выделяя неочищенный низкомолекулярный гепарин центрифугированием.When dissolving the depolymerized product and at a pH of 10.5 to 11.5, H 2 O 2 33% w/v is added, in particular 0.1 ± 10% or H 2 O 2 33% w/v is added. kg benzalkonium heparinate, and allowed to react at 30% w/v ± 5°C for 16 hours. After the reaction time, it is precipitated by dissolving sodium acetate in methanol, isolating the crude low molecular weight heparin by centrifugation.
Этот неочищенный низкомолекулярный гепарин растворяют в воде и снова осаждают метанолом. Осадок растворяют в очищенной воде и обрабатывают H2O2 33% мас./об./кг, а именно добавляют 0,08±10% л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°C. По истечении 5 ч реакции раствор нейтрализуется и осаждается метанолом.This crude low molecular weight heparin is dissolved in water and precipitated again with methanol. The precipitate is dissolved in purified water and treated with H 2 O 2 33% w/v/kg, namely, 0.08±10% l of H 2 O 2 33% w/v/kg of benzalkonium heparinate is added at a temperature of 40± 2°C. After 5 hours of reaction, the solution is neutralized and precipitated with methanol.
Очищенный продукт растворяют в воде и проводят лиофилизацию, получая 5,21 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3269 Да, анти-FXa-активностью 119 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 13,70 МЕ/мг. и присутствует на восстановительном конце его олигосахаридных цепей содержание 1,6-безводных остатков от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или равна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов.The purified product was dissolved in water and lyophilized to obtain 5.21 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3269 Da, anti-FXa activity of 119 IU/mg and anti-FIIa activity of 13.70 IU/mg. and present at the reducing end of its oligosaccharide chains is a content of 1,6-anhydrous residues from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equal to the proportion of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 4.Example 4.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 1, получают 6,25 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3172 Да, анти-FXa-активностью 108 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 13,1 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-Безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 1, 6.25 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3172 Da, anti-FXa activity of 108 IU/mg and anti-FIIa activity of 13.1 IU/mg or more are obtained. high activity profile. The 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains range from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 5.Example 5.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 1, получают 6,34 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3347 Да, анти-FXa-активностью 110 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 14,7 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 1, 6.34 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3347 Da, anti-FXa activity of 110 IU/mg and anti-FIIa activity of 14.7 IU/mg or more are obtained high activity profile. 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)). Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 6.Example 6.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 1, получают 7,11 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3400 Да, анти-FXa-активностью 119 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 15,0 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 1, 7.11 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3400 Da, anti-FXa activity of 119 IU/mg and anti-FIIa activity of 15.0 IU/mg or more are obtained. high activity profile. 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную сThis low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, exhibiting a color grade of >6 measured with
- 5 045709 помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)). Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.- 5 045709 using a colorimeter of the LICO® brand, which determines the color in accordance with the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 7.Example 7.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 1, получают 6,92 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3328 Да, анти-FXa-активностью 117 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 14,9 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 1, 6.92 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3328 Da, anti-FXa activity of 117 IU/mg and anti-FIIa activity of 14.9 IU/mg or more are obtained high activity profile. 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)). Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен в течение 24-36 месяцев.This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). The degree of coloration, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable for 24-36 months.
Пример 8.Example 8.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 3, получают 7,04 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3331 Да, анти-FXa-активностью 113 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 15,3 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 3, 7.04 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3331 Da, anti-FXa activity of 113 IU/mg and anti-FIIa activity of 15.3 IU/mg or more are obtained. high activity profile. 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)). Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Пример 9.Example 9.
Начиная с 10 г гепарина натрия и повторяя шаги, указанные в примере 3, получают 7,09 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3366 Да, анти-FXa-активностью 115 МЕ/мг и антиFIIa-активностью 16,0 МЕ/мг и более высокий профиль активности. 1,6-безводных остатков на восстановительном конце его олигосахаридных цепей от 1 до 15%, в котором доля остатков 1,6-ангидроглюкозамина больше или эквивалентна доле остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от других низкомолекулярных гепаринов, таких как эноксапарин.Starting with 10 g of sodium heparin and repeating the steps indicated in example 3, 7.09 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3366 Da, anti-FXa activity of 115 IU/mg and anti-FIIa activity of 16.0 IU/mg or more are obtained high activity profile. 1,6-anhydrous residues at the reducing end of its oligosaccharide chains from 1 to 15%, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is greater than or equivalent to that of 1,6-anhydromanosamine residues, in contrast to other low molecular weight heparins such as enoxaparin.
Этот низкомолекулярный гепарин, кроме того, обладает тем преимуществом, что стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашенности >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который определяет цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)). Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев.This low molecular weight heparin also has the advantage of being stable at room temperature for 24-36 months, showing a color grade of >6 measured with a LICO® brand colorimeter, which determines color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). Color grade, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was stable at room temperature for 24-36 months.
Сравнительный пример 10 (без обработки с H2O2).Comparative Example 10 (without H 2 O 2 treatment).
г Гепарина натрия растворяют в очищенной воде и при перемешивании добавляют раствор 50% (мас./об.) хлорида бензалкония с образованием гепарината бензалкония. Сформованный продукт несколько раз промывают водой для удаления избытка хлоридов и, наконец, высушивают сублимационной сушкой.g Sodium heparin is dissolved in purified water and a solution of 50% (w/v) benzalkonium chloride is added with stirring to form benzalkonium heparinate. The molded product is washed several times with water to remove excess chlorides and finally freeze-dried.
Бензалкония гепаринат растворяют в метиленхлориде и регулируют температуру до 30±5°C. Бензилтриметиламмоний гидроксид (Triton B) добавляют при 40% мас./об. в метаноле при массовом соотношении 0,25:1 к Triton B:бензалкония гепаринату и оставляют для реакции при указанной выше температуре. Добавление повторяют еще два раза, оставляя первое добавление Triton B на 8 ч, второе на 16 ч, а третье еще на 8 ч.Benzalkonium heparinate is dissolved in methylene chloride and the temperature is adjusted to 30±5°C. Benzyltrimethylammonium hydroxide (Triton B) is added at 40% w/v. in methanol at a mass ratio of 0.25:1 to Triton B:benzalkonium heparinate and leave to react at the above temperature. The addition is repeated two more times, leaving the first addition of Triton B for 8 hours, the second for 16 hours, and the third for another 8 hours.
Раствор деполимеризованного продукта осаждают при растворении ацетата натрия в метаноле, при этом неочищенный низкомолекулярный гепарин выделяют центрифугированием.A solution of the depolymerized product is precipitated by dissolving sodium acetate in methanol, while the crude low molecular weight heparin is isolated by centrifugation.
Этот неочищенный низкомолекулярный гепарин растворяют в воде и снова осаждают метанолом. Осадок растворяется в очищенной воде при температуре 40±2°C при pH 11. По истечении 5 ч раствор нейтрализуется и осаждается метанолом.This crude low molecular weight heparin is dissolved in water and precipitated again with methanol. The precipitate dissolves in purified water at a temperature of 40±2°C at pH 11. After 5 hours, the solution is neutralized and precipitated with methanol.
Очищенный продукт растворяют в воде и проводят лиофилизацию, получая 5,28 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 3280 Да, анти-FXa-активностью 112 МЕ/мг и анти-FIIaактивностью 13,70 МЕ/мг и присутствует на восстановительном конце его олигосахаридных цепей со- 6 045709 держание 1,6-безводных отходов составляет 18,5%.The purified product is dissolved in water and lyophilized to obtain 5.28 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 3280 Da, anti-FXa activity of 112 IU/mg and anti-FIIa activity of 13.70 IU/mg and is present at the reducing end of its oligosaccharide chains The content of 1,6-anhydrous waste is 18.5%.
Кроме того, анализируется соотношение остатков 1,6-ангидроглюкозамина и остатков 1,6-ангидроманозамина, в отличие от предыдущих примеров, остатки 1,6-ангидроманозамина больше, чем остатки 1,6-ангидроглюкозамина.In addition, the ratio of 1,6-anhydroglucosamine residues to 1,6-anhydroglucosamine residues is analyzed; in contrast to the previous examples, 1,6-anhydroglucosamine residues are larger than 1,6-anhydroglucosamine residues.
Далее анализируется степень стабильности, коррелирующая с цветом образца, отмечая, что начиная с десятого месяца при комнатной температуре он имеет цветовую степень 4, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который связывает цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).Next, the degree of stability correlated with the color of the sample is analyzed, noting that from the tenth month at room temperature it has a color degree of 4, measured using a LICO® brand colorimeter, which relates the color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт не был стабильным в течение более 9 месяцев при комнатной температуре, поэтому добавки H2O2, по-видимому, ответственны за это поведение.The degree of coloration, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was not stable for more than 9 months at room temperature, so H2O2 additives appear to be responsible for this behavior.
Сравнительный пример 11 (деполимеризация при 60°C).Comparative Example 11 (depolymerization at 60°C).
г Гепарина натрия растворяют в очищенной воде и при перемешивании добавляют раствор 50% (мас./об.) хлорида бензалкония с образованием гепарината бензалкония. Сформованный продукт несколько раз промывают водой для удаления избытка хлоридов и, наконец, высушивают сублимационной сушкой.g Sodium heparin is dissolved in purified water and a solution of 50% (w/v) benzalkonium chloride is added with stirring to form benzalkonium heparinate. The molded product is washed several times with water to remove excess chlorides and finally freeze-dried.
Гепаринат бензокалия растворяют в хлористом метилене и регулируют температуру до 60±5°C. Бензилтриметиламмоний гидроксид (Triton B) добавляют при 40% мас./об. в метаноле при массовом соотношении 0,25:1 к Triton B:бензалкония гепаринату и оставляют для реакции при указанной выше температуре. Добавление повторяют еще два раза, оставляя первое добавление Triton B на 8 ч, второе на 16 ч, а третье еще на 8 ч.Benzopotassium heparinate is dissolved in methylene chloride and the temperature is adjusted to 60±5°C. Benzyltrimethylammonium hydroxide (Triton B) is added at 40% w/v. in methanol at a mass ratio of 0.25:1 to Triton B:benzalkonium heparinate and leave to react at the above temperature. The addition is repeated two more times, leaving the first addition of Triton B for 8 hours, the second for 16 hours, and the third for another 8 hours.
При растворении деполимеризованного продукта и при pH от 10,5 до 11,5 добавляется перекись водорода с концентрацией 33% мас./об./кг , в частности, 0,1±10% л H2O2 добавляют с концентрацией 33% мас./об./кг бензалкония гепарината и оставляют для реакции при 30±5°C на 16 ч. По истечении времени реакции его осаждают при растворении ацетата натрия в метаноле, выделяя неочищенный низкомолекулярный гепарин центрифугированием.When dissolving the depolymerized product and at a pH of 10.5 to 11.5, hydrogen peroxide is added with a concentration of 33% w/v/kg, in particular, 0.1 ± 10% l H 2 O 2 is added with a concentration of 33% wt ./vol./kg of benzalkonium heparinate and left to react at 30±5°C for 16 hours. After the reaction time, it is precipitated by dissolving sodium acetate in methanol, isolating the crude low molecular weight heparin by centrifugation.
Этот неочищенный низкомолекулярный гепарин растворяют в воде и снова осаждают метанолом. Осадок растворяют в очищенной воде и обрабатывают перекисью водорода 33% мас./об./кг , а именно добавляют 0,08±10% л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°C. По истечении 5 ч реакции раствор нейтрализуется и осаждается метанолом.This crude low molecular weight heparin is dissolved in water and precipitated again with methanol. The precipitate is dissolved in purified water and treated with hydrogen peroxide 33% w/v/kg, namely adding 0.08±10% l H 2 O 2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate at a temperature of 40±2° C. After 5 hours of reaction, the solution is neutralized and precipitated with methanol.
Осадок повторно растворяют в очищенной воде и снова обрабатывают 0,05±10% литра H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината H2O2 33% мас./об./кг при температуре 40±2°C в течение примерно 5 ч. По истечении периода реакции раствор нейтрализуется и осаждается метанолом. Очищенный продукт растворяют в воде и проводят лиофилизацию, получая 5,10 г низкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 2341 Да, анти-FXa-активностью 109 МЕ/мг и анти-FИa-активностью 2,8 МЕ/мг и присутствует на восстановительном конце его олигосахаридных цепей содержание 1,6-безводных остатков составляет 21%, в котором доля 1,6-ангидроглюкозаминовых остатков намного ниже, чем у 1,6-ангидроманозаминовых остатков.The precipitate is re-dissolved in purified water and again treated with 0.05±10% liter of H 2 O 2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate H 2 O 2 33% w/v/kg at a temperature of 40±2° C for about 5 hours. After the reaction period, the solution is neutralized and precipitated with methanol. The purified product is dissolved in water and lyophilized to obtain 5.10 g of low molecular weight heparin with an average molecular weight of 2341 Da, anti-FXa activity of 109 IU/mg and anti-FIa activity of 2.8 IU/mg and is present at the reducing end of it oligosaccharide chains contain 21% 1,6-anhydrous residues, in which the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues is much lower than that of 1,6-anhydromanosamine residues.
Далее анализируется степень стабильности, коррелирующая с цветом образца, отмечая, что начиная с десятого месяца при комнатной температуре он имеет цветовую степень 4, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который связывает цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Европейская фармакопея (2.2.2. Метод II)).Next, the degree of stability correlated with the color of the sample is analyzed, noting that from the tenth month at room temperature it has a color degree of 4, measured using a LICO® brand colorimeter, which relates the color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Степень окрашенности, параметр, напрямую связанный со стабильностью продукта, позволил определить, что конечный упакованный продукт не был стабильным в течение более 10-11 месяцев при комнатной температуре, что требовало холодной цепи для обеспечения стабильности продукта более 12 месяцев.The degree of coloration, a parameter directly related to product stability, determined that the final packaged product was not stable for more than 10-11 months at room temperature, requiring a cold chain to ensure product stability for more than 12 months.
Пример 12.Example 12.
Продукты, полученные в примерах с 1 по 11, анализируют на процентное содержание 1,6-безводных остатков конкретным способом в соответствии с методом, описанным в монографии Эноксапарин натрия (Enoxaparin Sodium monograph), 1097, Европейская Фармакопея 9-е изд., описанный в разделе Идентификация B, получены следующие результаты.The products obtained in Examples 1 to 11 were analyzed for the percentage of 1,6-anhydrous residues in a specific manner in accordance with the method described in Enoxaparin Sodium monograph, 1097, European Pharmacopoeia 9th ed., described in Section Identification B, the following results were obtained.
- 7 045709- 7 045709
Пример 13.Example 13.
Продукт, полученный в примере 1, анализируется методом ядерного магнитного резонанса, в частности, с помощью экспериментов 1Н-ЯМР и 1H-13C HSQC.The product obtained in Example 1 is analyzed by nuclear magnetic resonance, in particular by 1H -NMR and 1H- 13C HSQC experiments.
Спектроскопия 1Н-ЯМР была наиболее широко используемым методом для изучения этих соединений из-за их богатых ядер и высокого гиромагнитного отношения. Область между 1,8-2,1 промилле содержит сигналы, соответствующие N-ацетильным или метильным группам восстановительных окончаний, которые могут быть включены синтетически. Область между 2,8-4,6 промилле содержит большинство сигналов сахаридного кольца и имеет высокую степень перекрытия между ними, что затрудняет извлечение структурной информации непосредственно из этой области. Между 4,6-6,0 промилле находятся сигналы, соответствующие аномерным протонам. Поскольку это гораздо менее населенная сигналами область, из нее можно извлечь много полезной информации. Кроме того, в случае НМГ, полученных с помощью механизма β-элиминации, они также содержат сигналы, соответствующие Н4, с невосстанавливающих концов молекулы. 1H -NMR spectroscopy has been the most widely used technique to study these compounds due to their rich cores and high gyromagnetic ratio. The region between 1.8-2.1 ppm contains signals corresponding to N-acetyl or methyl groups of reducing ends that can be incorporated synthetically. The region between 2.8–4.6 ppm contains most of the saccharide ring signals and has a high degree of overlap between them, making it difficult to extract structural information directly from this region. Between 4.6-6.0 ppm there are signals corresponding to anomeric protons. Since this is a much less signal-populated area, a lot of useful information can be extracted from it. In addition, in the case of LMWHs produced by the β-elimination mechanism, they also contain H4 signals from the non-reducing ends of the molecule.
В частности, сигналы, соответствующие остаткам 1,6-ангидро, появляются при 5,57 и 5,62 промилле, что соответствует аномерному протону структур 1,6-ангидроманозамина и 1,6-ангидроглюкозамина, соответственно, и как описано в литературе.In particular, signals corresponding to 1,6-anhydro residues appear at 5.57 and 5.62 ppm, corresponding to the anomeric proton of the 1,6-anhydromanosamine and 1,6-anhydroglucosamine structures, respectively, and as described in the literature.
Другим двумерным экспериментом, имеющим особое значение для структурной характеристики соединений этого типа, является ^-^C HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляция), который коррелирует химические сдвиги протонов с химическими сдвигами углерода-13 и позволяет сопоставить первичные структуры олигосахаридов, полученных из GAGs, и моносахаридный состав.Another two-dimensional experiment of particular importance for the structural characterization of compounds of this type is ^-^C HSQC (heteronuclear single quantum correlation), which correlates the chemical shifts of protons with the chemical shifts of carbon-13 and allows the comparison of the primary structures of oligosaccharides derived from GAGs and the monosaccharide compound.
Увеличение спектральной дисперсии, достигаемое с помощью этого двумерного метода, позволяет количественно определять интегралы сигналов, которые перекрываются в соответствующих одномерных спектрах.The increase in spectral dispersion achieved with this two-dimensional method allows the quantification of signal integrals that overlap in the corresponding one-dimensional spectra.
Сигналы, соответствующие 1,6-безводным остаткам, появляются при 5,57-103,9 и 5,61-104,3 промилле, что соответствует аномерному протону 1,6-ангидроманозаминовой и 1,6-ангидроглюкозаминовой структур, соответственно, и как описано в литературе и как показано на рисунках 1 и 2 для образца продукта получено в примере 1.Signals corresponding to 1,6-anhydrous residues appear at 5.57-103.9 and 5.61-104.3 ppm, which correspond to the anomeric proton of the 1,6-anhydromanosamine and 1,6-anhydroglucosamine structures, respectively, and as described in the literature and as shown in Figures 1 and 2 for a sample product obtained in Example 1.
Пример 14.Example 14.
Продукты, полученные в примерах с 1 по 11, анализировали на содержание остатков 2-сульфоамино1,6-безводной-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы (1,6-ангидроглюкозамина или 1,6-ан.А) и 2-сульфоамино1,6-ангидро-2-дезокси-β-D-манопиранозу (1,6-ангидроманозамин или 1,6-М) в соответствии с способом, известном в современном мире для экспериментов с ^-^C HSQC, получены следующие результаты.The products obtained in Examples 1 to 11 were analyzed for the content of 2-sulfoamino1,6-anhydrous-2-deoxy-β-D-glucopyranose (1,6-anhydroglucosamine or 1,6-an.A) and 2-sulfoamino1 residues ,6-anhydro-2-deoxy-β-D-manopyranose (1,6-anhydromanosamine or 1,6-M) according to the method known in the modern world for experiments with ^-^C HSQC, the following results were obtained.
- 8 045709- 8 045709
Пример 15. Воспроизведение примера 1 из EP 1070503 и того же примера с добавлением обработки перекисью водорода.Example 15 Reproduction of example 1 from EP 1070503 and the same example with the addition of hydrogen peroxide treatment.
Пример 1, описанный в EP1070503, был воспроизведен в том виде, в каком он описан, и с одним вариантом: добавление после деполимеризации Triton B двух стадий обработки перекисью водорода при pH от 10,5 до 11,5, в котором на первой стадии добавляли 0,08 л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°С (5 ч реакции) и на второй стадии 0,05 л H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината при температуре 40±2°С в течение примерно 5 ч.Example 1 described in EP1070503 was reproduced as described and with one variation: adding after depolymerization of Triton B two stages of treatment with hydrogen peroxide at pH from 10.5 to 11.5, in which the first stage was added 0.08 l H2O2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate at a temperature of 40±2°C (5 h reaction) and in the second stage 0.05 l H2O2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate at a temperature 40±2°C for about 5 hours.
При воспроизведении примера 1 EP 1070503 был получен низкомолекулярный гепарин, который имел на восстановительном конце своих олигосахаридных цепей содержание 1,6-ангидро остатков 0,3%, в то время как при добавлении двух стадий обработки перекисью водорода, описанных выше, это содержание составляло 6%. Кроме того, остатки 1,6-ангидроманозамина больше, чем остатки 1,6-ангидроглюкозамина, при воспроизведении примера 1 EP 1070503, тогда как при обработке перекисью водорода, описанной выше, молярная доля остатков 1,6-ангидроманозамина была больше или равна молярной доле остатков 1,6-ангидроманозамина.By reproducing example 1 of EP 1070503, a low molecular weight heparin was obtained which had at the reducing end of its oligosaccharide chains a content of 1,6-anhydro residues of 0.3%, while with the addition of the two hydrogen peroxide treatment steps described above, this content was 6 %. In addition, the 1,6-anhydromanosamine residues are larger than the 1,6-anhydroglucosamine residues when reproducing Example 1 of EP 1070503, whereas when treated with hydrogen peroxide described above, the mole fraction of the 1,6-anhydromanosamine residues was greater than or equal to the mole fraction 1,6-anhydromanosamine residues.
Воспроизводя пример 1 из EP 1070503 и анализируя степень стабильности, коррелирующую с цветом образца, было замечено, что начиная с десятого месяца при комнатной температуре он имеет цветовую степень 4, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который связывает цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопея (Фармакопея фармакопея (2.2.2. Метод II)). Однако при обработке пероксидом, описанной выше, было обнаружено, что полученный продукт стабилен при комнатной температуре в течение 24-36 месяцев, демонстрируя степень окрашивания >6, измеренную с помощью колориметра марки LICO®, который связывает цвет в соответствии с эталонным цветовым диапазоном, установленным в Фармакопеи (Фармакопея фармакопея (2.2.2. Метод II)).Reproducing example 1 from EP 1070503 and analyzing the degree of stability correlating with the color of the sample, it was observed that from the tenth month at room temperature it has a color degree of 4, measured using a LICO® brand colorimeter, which relates the color according to a reference color range , established in the Pharmacopoeia (Pharmacopoeia pharmacopoeia (2.2.2. Method II)). However, with the peroxide treatment described above, the resulting product was found to be stable at room temperature for 24-36 months, demonstrating a color grade of >6 as measured using a LICO® brand colorimeter, which relates color according to the reference color range established in the Pharmacopoeia (Pharmacopoeia pharmacopoeia (2.2.2. Method II)).
Пример 16.Example 16.
Примеры 1 и 3 повторяли, варьируя добавленные количества перекиси водорода, которые всегда варьировались при каждой обработке от 0,04 до 1,0 л H2O2 33% мас./об./кг гепарината бензалкония (или деполимеризованного гепарина) и в промежутках от 3 до 20 ч. _____________________Examples 1 and 3 were repeated varying the amounts of hydrogen peroxide added, which always varied at each treatment from 0.04 to 1.0 L H 2 O 2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate (or depolymerized heparin) and in between from 3 to 20 o'clock _____________________
* Литры H2O2 33% мас./об./кг бензалкония гепарината.* Liters H 2 O 2 33% w/v/kg benzalkonium heparinate.
Во всех случаях полученные гепарины показали среднюю молекулярную массу от 3 до 3,8 кДа иIn all cases, the resulting heparins showed an average molecular weight of 3 to 3.8 kDa and
- 9 045709 aHTu-FXa-активность от 80 до 120 МЕ/мг и анти-РИа-активность от 5 до 20 МЕ/мг.- 9 045709 aHTu-FXa activity from 80 to 120 IU/mg and anti-RIA activity from 5 to 20 IU/mg.
Аналогичным образом во всех случаях полученные гепарины представляли на восстановительном конце своих олигосахаридных цепей содержание 1,6-ангидро остатков от 1 до 15%, а доля 1,6-ангидроглюкозаминовых остатков была больше или равна доле 1,6-ангидроманозаминовых остатков.Similarly, in all cases, the resulting heparins presented at the reducing end of their oligosaccharide chains a content of 1,6-anhydro residues from 1 to 15%, and the proportion of 1,6-anhydroglucosamine residues was greater than or equal to the proportion of 1,6-anhydromanosamine residues.
Claims (19)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ESPCT/ES2020/070271 | 2020-04-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045709B1 true EA045709B1 (en) | 2023-12-19 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173818B1 (en) | heparin derivative | |
| Yang et al. | Chemical modification, characterization and structure-anticoagulant activity relationships of Chinese lacquer polysaccharides | |
| Marais et al. | A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum | |
| Zhao et al. | Structure and anticoagulant activity of fucosylated glycosaminoglycan degraded by deaminative cleavage | |
| EP2526122B1 (en) | Evaluating heparin preparations | |
| CN102329397B (en) | Fucosylated glycosaminoglycan derivative and preparation method thereof | |
| IE64884B1 (en) | Low molecular weight heparins of regular structure their preparation and their biological uses | |
| Percival | Carbohydrate sulphates | |
| JP6472808B2 (en) | Fuc3S4S-substituted low-molecular glycosaminoglycan and method for producing the same | |
| CA2285383C (en) | Glycosaminoglycans having high antithrombotic activity | |
| EP0053612A1 (en) | Improved anticoagulant substance | |
| CN103145868B (en) | A kind of lower molecular weight osamine polysaccharid derivative and pharmaceutical composition thereof and its preparation method and application | |
| US10494452B2 (en) | Low-molecular-weight glycosaminoglycan derivative containing terminal 2, 5-anhydrated talose or derivative thereof | |
| US6388060B1 (en) | Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides | |
| JPH01501316A (en) | Production method of alginate (polyuronide) with changed physical properties | |
| RU2512768C1 (en) | Method of obtaining low-molecular heparin | |
| EA045709B1 (en) | METHOD FOR PRODUCING LOW MOLECULAR HEPARINS AND HEPARINS PRODUCED BY THE SAME METHOD | |
| EP2980103B1 (en) | Low molecular weight glycosaminoglycan derivative, pharmaceutical composition thereof, preparation method therefor and use thereof | |
| CA1218986A (en) | Process for the depolymerisation and sulfatation of polysaccharides | |
| KR920703644A (en) | Novel Heparin Derivatives | |
| CN109666086B (en) | Preparation method and application of high-purity heparin quaternary ammonium salt | |
| EP4144766A1 (en) | Method for obtaining low-molecular-weight heparins and low-molecular-weight heparins thereby obtained | |
| CN115417937A (en) | Heparin decabiose containing double-antithrombin binding sequence and preparation method and application thereof | |
| JPH03185001A (en) | N-acetylation product of heparin and its preparation | |
| CN118459618A (en) | Novel galactosylated glycosaminoglycan and preparation method and application thereof |