EA045369B1 - RECOMBINANT HYPOSIALYLATED HUMAN ERYTHROPOETIN, ITS METHODS OF PRODUCTION AND APPLICATION IN NERVOUS SYSTEM DISORDERS - Google Patents
RECOMBINANT HYPOSIALYLATED HUMAN ERYTHROPOETIN, ITS METHODS OF PRODUCTION AND APPLICATION IN NERVOUS SYSTEM DISORDERS Download PDFInfo
- Publication number
- EA045369B1 EA045369B1 EA202290636 EA045369B1 EA 045369 B1 EA045369 B1 EA 045369B1 EA 202290636 EA202290636 EA 202290636 EA 045369 B1 EA045369 B1 EA 045369B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rhepo
- hyposialylated
- group
- glycans
- treated
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 claims description 3
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 5
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 claims 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 claims 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 claims 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 68
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 68
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 17
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 17
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 17
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 17
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 16
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 16
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N (4-methoxyphenyl)-(4-methylpiperazin-1-yl)methanone Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C)CC1 DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 5
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N (N-Acetyl)-glucosamin-4-beta-galaktosid Natural products OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 2
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 2
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 241000023813 Isia Species 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N N-acetyllactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N 0.000 description 2
- HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N N-acetyllactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010050081 Neonatal hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 101100037618 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ant-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- -1 Quaternary Ammonium Anion Chemical class 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000007745 plasma electrolytic oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048964 Carotid artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N L-homocitrulline Chemical compound NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000012996 alamarblue reagent Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009886 enzymatic interesterification Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000011556 gerbil model Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000208 hepatic perisinusoidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)C(=N)N=C(N)N OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к получению фармацевтической композиции рекомбинантного эритропоэтина человека с паттерном гликозилирования, который придает ему свойства, которые позволяют использовать его при расстройствах нервной системы.The present invention relates to the fields of biotechnology and medicine, in particular to the production of a pharmaceutical composition of recombinant human erythropoietin with a glycosylation pattern that gives it properties that allow its use in disorders of the nervous system.
Уровень техникиState of the art
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеиновый гормон, образованный 166 аминокислотами, который имеет молекулярную массу 30,4 кДа (Lanfranco, F. and Strasburger, С. J. (2016) Sports Endocrinology 47: 115-27). ЕРО естественным образом продуцируется в перисинусоидальных клетках печени у эмбриона и в перинатальный период, а во взрослом возрасте главным образом в интерстициальных фибробластах почек. Этот гормон стимулирует продуцирование эритроцитов в костном мозге и играет важную роль в реакции мозга на повреждение нейронов (Siren L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044-9. ЕРО представляет собой сильно гликозилированную молекулу, и ее углеводная часть составляет 40% ее молекулярной массы. Этот белок содержит четыре сложных цепочки олигосахаридов, связанных с полипептидной цепочкой, три из них соединениями N-типа и одна соединением О-типа, расположение которых было хорошо описано разными авторами Elliott, S. et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry, 279(16): 16854-16862; Watson et al. (1994) Glycobiology 4(2): 227-237. Олигосахариды с соединением N-типа могут содержать разное число терминальных остатков сиаловой кислоты и являются важными для секреции, молекулярной стабильности, рецепторного связывания и активности in vivo (Egrie, J. and Browne, J. (2001) Br. J. Cancer, 84(1): 3-10; Goldwasser et al. (1974) J. Biol. Chem 249: 42024206).Erythropoietin (EPO) is a 166 amino acid glycoprotein hormone with a molecular weight of 30.4 kDa (Lanfranco, F. and Strasburger, C. J. (2016) Sports Endocrinology 47: 115-27). EPO is naturally produced in the perisinusoidal cells of the liver in the embryo and perinatal period, and in adulthood mainly in interstitial fibroblasts of the kidney. This hormone stimulates the production of red blood cells in the bone marrow and plays an important role in the brain's response to neuronal damage (Siren L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044-9. EPO is a highly glycosylated molecule, and its carbohydrate portion constitutes 40% of its molecular weight.This protein contains four complex chains of oligosaccharides linked to a polypeptide chain, three of them N-type compounds and one O-type compound, the arrangement of which has been well described by various authors Elliott, S. et al (2004) The Journal of Biological Chemistry 279(16): 16854-16862 Watson et al (1994) Glycobiology 4(2): 227-237 N-type oligosaccharides may contain varying numbers of terminal sialic acid residues and are important for secretion, molecular stability, receptor binding and activity in vivo (Egrie, J. and Browne, J. (2001) Br. J. Cancer, 84(1): 3-10; Goldwasser et al. (1974) J Biol Chem 249: 42024206).
С девяностых годов последнего столетия и до настоящего времени было накоплено большое число доказательств нейрозащитных свойств рекомбинантного ЕРО человека (rhEPO). В 1998 г. Sakanara и коллеги в модели глобальной ишемии у песчанок показали, что после окклюзии общей сонной артерии подача rhEPO через боковые желудочки приводила к снижению ишемического повреждения гиппокампальных нейронов в области СА1 (Sakanara, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4635-4640).From the nineties of the last century to the present, a large amount of evidence has accumulated regarding the neuroprotective properties of recombinant human EPO (rhEPO). In 1998, Sakanara et al showed in a gerbil model of global ischemia that after common carotid artery occlusion, delivery of rhEPO through the lateral ventricles resulted in reduced ischemic damage to hippocampal neurons in the CA1 region (Sakanara, M. et al. (1998) Proc. Natl Acad Sci USA, 95: 4635-4640).
Цитопротекторное действие ЕРО на центральную нервную систему было показано Maiese и коллегами в 2004 г. и позднее Viviani и коллегами в 2005 г. (Maiese, K. et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25 (11): 577-83; Viviani, D. et al. (2005) Journal of Neurochemistry 93 (2): 257-268). Несмотря на всю информацию, накопленную в неклинических исследованиях касательно гематопоэтического ЕРО, достигнутые результаты не было воспроизведены в клинической среде из-за осложнений, связанных с его длительным использованием, которые возникают у пациентов.The cytoprotective effects of EPO on the central nervous system were demonstrated by Maiese and colleagues in 2004 and later by Viviani and colleagues in 2005 (Maiese, K. et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25 (11): 577-83; Viviani , D. et al (2005) Journal of Neurochemistry 93 (2): 257-268). Despite all the information accumulated in non-clinical studies regarding hematopoietic EPO, the achieved results have not been replicated in the clinical environment due to the complications associated with its long-term use that occur in patients.
У взрослых экспрессия рецептора ЕРО в нервной системе главным образом обнаруживается в нейронах, астроцитах и микроглии, тогда как астроциты продуцируют ЕРО, это гипосиаллилированный ЕРО (Nagai, A. et al. (2001) Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 60 (4): 317-319).In adults, EPO receptor expression in the nervous system is mainly found in neurons, astrocytes and microglia, while astrocytes produce EPO, which is hyposiallylated EPO (Nagai, A. et al. (2001) Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 60 (4): 317-319).
Значительное число исследователей предпринимали попытку модификации rhEPO для получения лекарственного средства, которое имеет такие же нейропротективные свойства, но без осложнений, вызываемых гематопоэтическим действием. ЕРО, называемый AsialoEPO (US 2004/0122216), который получают посредством общего ферментативного десиалилирования rhEPO, имеет желаемые свойства, указанные выше, этот вид ЕРО имеет высокую аффинность к рецептору rhEPO, но ограниченное протективное действие из-за очень короткого срока полужизни в плазме. Другой пример модификации эритропоэтина состоит в превращении лизина в гомоцитруллин путем карбамилирования белка, которое дает карбамилированный ЕРО, называемый СЕРО (Leist, M., Ghezzi, P., Grasso, G., et al. (2004) 305 (5681): 239242). Хотя оба ЕРО не показали гематопоэтического действия, в клинических испытаниях, проводимых с СЕРО, даже если не наблюдалось никаких неблагоприятных эффектов, нейропротективная эффективность не была показана.A significant number of researchers have attempted to modify rhEPO to produce a drug that has the same neuroprotective properties without the hematopoietic complications. EPO, called AsialoEPO (US 2004/0122216), which is produced by general enzymatic desialylation of rhEPO, has the desired properties mentioned above, this type of EPO has high affinity for the rhEPO receptor, but limited protective effect due to a very short half-life in plasma. Another example of modification of erythropoietin is the conversion of lysine to homocitrulline by carbamylation of the protein, which produces carbamylated EPO, called CEPO (Leist, M., Ghezzi, P., Grasso, G., et al. (2004) 305 (5681): 239242) . Although both EPOs did not show hematopoietic effects, in clinical trials conducted with EPOs, even if no adverse effects were observed, neuroprotective efficacy was not shown.
Патентная заявка WO 2007/009404 заявляет различные назальные составы ЕРО с низким содержанием сиаловой кислоты, позднее названные NeuroEPO в публикации ее авторов (Garcia, JC and Sosa, I. (2009), The Scientific World Journal, 9: 970-981). Этот rhEPO получается путем процесса ферментации полой волоконной мембраны и ионообменной хроматографии при очистке для отделения наиболее кислых изоформ (тех, которые имеют большее содержание сиаловой кислоты относительно тех, у которых меньшее содержание сиаловой кислоты). Указанный NeuroEPO имеет профиль из 13 изоформ, из которых он делит 9 с гематопоэтическим rhEPO, называемым EPOCIM®.Patent application WO 2007/009404 claims various low sialic acid nasal formulations of EPO, later referred to as NeuroEPO by its authors (Garcia, JC and Sosa, I. (2009), The Scientific World Journal, 9: 970-981). This rhEPO is produced through a process of hollow fiber membrane fermentation and ion exchange chromatography purification to separate the most acidic isoforms (those with higher sialic acid content relative to those with lower sialic acid content). This NeuroEPO has a profile of 13 isoforms, of which it shares 9 with the hematopoietic rhEPO called EPOCIM®.
Впервые авторы настоящего изобретения описали процесс получения в баке-смесителе (ST), объединенном со стадией очистки, проводимой посредством хроматографии, используя монолитную колонку в качестве анионообменника с четвертичным аммонийным лигандом Q, способным повышать экспрессию гипосиалилированных изоформ rhEPO без дополнительных химических и генетических модификаций. Эти изоформы имеют профиль изоэлектрической точки в диапазоне рН от 4,25 до 5,85 и третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового в NeuroEPO, что дает им большую эффективность в механизмах нейрозащиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.We first described a tank mixing (ST) production process combined with a chromatographic purification step using a monolithic column as an anion exchanger with a quaternary ammonium ligand Q capable of increasing the expression of hyposialylated rhEPO isoforms without additional chemical and genetic modifications. These isoforms have an isoelectric point profile in the pH range of 4.25 to 5.85 and a tertiary structure associated with glycosylation different from that of NeuroEPO, which gives them greater potency in mechanisms of neuroprotection and neurorestoration both in vitro and in vivo.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
В одном варианте осуществления объектом настоящего изобретения является фармацевтическаяIn one embodiment, the present invention is a pharmaceutical
- 1 045369 композиция, содержащая в качестве действующего средства rhEPO с профилем изоформ, изоэлектрическая точка которых находится в диапазоне от 4,25 до 5,85. Указанный rhEPO имеет микрогетерогенность фукозилированных N-гликанов, образованных би-, три- и тетраантенарными структурами, которые имеют моно- и бисиалилированные остатки сиаловой кислоты, которые составляют 40-60% всех гликанов, трисиалилированные остатки, которые составляют 40-43%, и тетрасиалилированные остатки, которые представляют 10-13%, а также фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.- 1 045369 composition containing rhEPO as an active agent with a profile of isoforms whose isoelectric point is in the range from 4.25 to 5.85. Said rhEPO has a microheterogeneity of fucosylated N-glycans formed by bi-, tri- and tetraantennary structures that have mono- and bisialylated sialic acid residues that make up 40-60% of all glycans, trisialylated residues that make up 40-43%, and tetrasialylated residues that represent 10-13%, as well as a pharmaceutically acceptable excipient.
В частности, сайт О-гликозилирования в серине 126 имеет 3 сиалоформы, которые имеют 0-2 остатка сиаловой кислоты, причем моносиалилированная структура является наиболее распространенной и составляет 78-82% всех гликанов, тогда как асиалированные структуры составляют 6-10% всех гликанов. Сайт N-гликозилирования аспарагина 83 содержит фукозилированные биантенарные структуры с 1 и 2 остатками сиаловой кислоты, где указанные структуры составляют 8-12% всех гликанов, фукозилированные триантенарные структуры с 1, 2 и 3 остатками сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 17-21% всех гликанов, фукозилированные тетраантенарные структуры, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 27-31% всех гликанов, и фукозилированные тетраантенарные структуры с N-ацетиллактозамином 1 и 2 типа, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, эти структуры составляют 38-42% всех гликанов.Specifically, the O-glycosylation site at serine 126 has 3 sialylated forms that have 0-2 sialic acid residues, with the monosialylated structure being the most common and accounting for 78-82% of all glycans, while asialylated structures make up 6-10% of all glycans. The N-glycosylation site of asparagine 83 contains fucosylated biantenary structures with 1 and 2 sialic acid residues, where these structures constitute 8-12% of all glycans, fucosylated triantenary structures with 1, 2 and 3 sialic acid residues, where these structures constitute 17-21% of all glycans, fucosylated tetraantennary structures that have 1-4 sialic acid residues, where these structures constitute 27-31% of all glycans, and fucosylated tetraantennary structures with N-acetyllactosamine types 1 and 2, which have 1-4 sialic acid residues, these structures make up 38-42% of all glycans.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества для фармацевтической композиции, заявленной в настоящем изобретении, включают, помимо прочего, биоадгезивные полимеры, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, и стабилизаторы белка, такие как L-триптофан, L-лейцин, гидрохлорид L-аргинина и гидрохлорид L-гистидина.Pharmaceutically acceptable excipients for the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, bioadhesive polymers such as hydroxypropyl methylcellulose and protein stabilizers such as L-tryptophan, L-leucine, L-arginine hydrochloride and L-histidine hydrochloride.
Вышеописанная структура изоформ rhEPO, которые являются частью фармацевтических композиций объекта настоящего изобретения, придает им большую эффективность в механизмах нейрозащиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.The above-described structure of the rhEPO isoforms that are part of the pharmaceutical compositions of the present invention makes them highly effective in mechanisms of neuroprotection and neurorestoration both in vitro and in vivo.
В другом варианте осуществления объект настоящего изобретения представляет собой способ получения немодифицированного rhEPO, где процесс ферментации происходит в ST в режиме перфузии в диапазоне температуры 34±2°С, с безбелковой культуральной средой и с диапазоном рН от 7,2 до 7,3, эта среда дополняется глутамином до получения конечной концентрации глутамина в диапазоне 8-12 ммоль/л. Этот способ также включает процесс очистки, который имеет хроматографический этап, на котором монолитную колонку используют как анионообменник с четвертичным аммонийным лигандом Q, причем равновесный буфер является раствором 20 ммоль/л трис в 10 ммоль/л HCl, рН которого находится в диапазоне от 7,9 до 8,10, с диапазоном проводимости 1,35-1,65 мСм/см, и который использует 50 ммоль/л буфер для элюирования на основе ацетата натрия с рН от 4,3 до 4,5 и проводимостью от 2 до 3,5 мСм/см. При помощи способа, описанного в настоящей заявке, можно получить фармацевтическую композицию с увеличенным количеством изоформ с низким содержанием сиаловой кислоты, которые имеют третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового для NeuroEPO, что придает им большую эффективность в механизмах нейрозищиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo.In another embodiment, the subject matter of the present invention is a method for producing unmodified rhEPO, where the fermentation process occurs in ST in perfusion mode in a temperature range of 34±2°C, with a protein-free culture medium and with a pH range of 7.2 to 7.3, this the medium is supplemented with glutamine to obtain a final glutamine concentration in the range of 8-12 mmol/l. This method also includes a purification process that has a chromatographic step in which a monolithic column is used as an anion exchanger with a quaternary ammonium ligand Q, the equilibrium buffer being a solution of 20 mmol/L Tris in 10 mmol/L HCl, the pH of which is in the range of 7. 9 to 8.10, with a conductivity range of 1.35-1.65 mS/cm, and which uses a 50 mmol/L sodium acetate elution buffer with a pH of 4.3 to 4.5 and a conductivity of 2 to 3 .5 mS/cm. Using the method described in this application, it is possible to obtain a pharmaceutical composition with an increased number of isoforms with low sialic acid content, which have a tertiary structure associated with glycosylation, different from that of NeuroEPO, which gives them greater effectiveness in mechanisms of neuroprotection and neurorestoration as in both in vitro and in vivo.
Также объектом настоящего изобретения является применение фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для лечения деменции, инсульта, болезни Паркинсона, атаксии, черепно-мозговой травмы, глаукомы, аутизма, гипоксии новорожденных, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза и неврологического повреждения, вызываемого травмой, отравлением или облучением. В частности, описан способ лечения этой фармацевтической композицией субъекта, нуждающегося в этом, где введение указанной композиции проводят от одного до трех раз в неделю периодами от 6 до 12 месяцев в диапазоне введения от 0,1 до 4 мг в объеме 1 мл.It is also an object of the present invention to use the pharmaceutical composition described herein for the treatment of dementia, stroke, Parkinson's disease, ataxia, traumatic brain injury, glaucoma, autism, neonatal hypoxia, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and neurological damage caused by trauma, poisoning or radiation. In particular, a method of treating a subject in need thereof with this pharmaceutical composition is described, wherein the administration of said composition is carried out one to three times a week for periods of 6 to 12 months in an administration range of 0.1 to 4 mg in a volume of 1 ml.
Подробное описание изобретения Фармацевтические композицииDetailed description of the invention Pharmaceutical compositions
Объект настоящего изобретения rhEPO отличается тем, что он имеет профиль изоэлектрической точки от 4,25 до 5,85 и вторичную и третичную структуру белка, не связанную с гликозилированием подобно rhEPO, сохраняя такую же третичную структуру, связанную с гликозилированием с сайтом Огликозилирования в серине 126 и тремя сайтами N-гликозилирования в аспарагине 24, 38 и 83. Углеводный состав rhEPO, описанного в настоящем документе, отличает его от других rhEPO. Микрогетерогенность фукозилированных N-гликанов состоит из би-, три- и тетраантенарных структур, которые имеют моно- и бисиалилированные остатки сиаловой кислоты в диапазоне 40-60% всех углеводов, предпочтительно в диапазоне 43-50%, трисиалилированные остатки в диапазоне 40-43% и тетрасиалилированные остатки в диапазоне 10-13% всех углеводов. В частности, сайт О-гликозилирования в серине 126 имеет 3 сиалоформы, которые имеют от 0 до 2 остатков сиаловой кислоты, моносиалилированная структура является наиболее распространенной и составляет 78-82% всех гликанов, а асиалилированные структуры составляют 6-10% всех гликанов.The subject matter of the present invention, rhEPO, is characterized in that it has an isoelectric point profile of 4.25 to 5.85 and a non-glycosylation secondary and tertiary protein structure similar to rhEPO, while retaining the same glycosylation-associated tertiary structure with a glycosylation site at serine 126 and three N-glycosylation sites at asparagine 24, 38 and 83. The carbohydrate composition of the rhEPO described herein distinguishes it from other rhEPOs. The microheterogeneity of fucosylated N-glycans consists of bi-, tri- and tetraantennary structures that have mono- and bisialylated sialic acid residues in the range of 40-60% of total carbohydrates, preferably in the range of 43-50%, trisialylated residues in the range of 40-43% and tetrasialylated residues in the range of 10-13% of all carbohydrates. In particular, the O-glycosylation site at serine 126 has 3 sialylated forms that have 0 to 2 sialic acid residues, the monosialylated structure is the most common and makes up 78-82% of all glycans, and the asialylated structures make up 6-10% of all glycans.
Сайт N-гликозилирования аспарагина 83 содержит фукозилированные биантенарные структуры с 1 и 2 остатками сиаловой кислоты, где указанныеThe N-glycosylation site of asparagine 83 contains fucosylated biantenar structures with 1 and 2 sialic acid residues, where indicated
- 2 045369 структуры составляют 8-12% всех гликанов, фукозилированные триантенарные структуры с 1, 2 и 3 остатками сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 17-21% всех гликанов, фукозилированные тетраантенарные структуры, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры составляют 27-31% всех гликанов, и фукозилированные тетраантенарные структуры с N-ацетиллактозамином 1 и 2 типа, которые имеют 1-4 остатка сиаловой кислоты, где эти структуры находятся в диапазоне 38-42% относительно всех гликанов.- 2 045369 structures make up 8-12% of all glycans, fucosylated triantenary structures with 1, 2 and 3 sialic acid residues, where these structures make up 17-21% of all glycans, fucosylated tetraantennary structures that have 1-4 sialic acid residues, where these structures constitute 27-31% of all glycans, and fucosylated tetraantennary structures with N-acetyllactosamine types 1 and 2, which have 1-4 sialic acid residues, where these structures range from 38-42% of all glycans.
Термины гипосиалилированный rhEPO, EPO, HS или основные изоформы используются взаимозаменяемо в настоящем изобретении для ссылки на фармацевтические композиции с характеристиками, описанными выше, также в общем называемые NeuroEPO plus.The terms hyposialylated rhEPO, EPO, HS or basic isoforms are used interchangeably in the present invention to refer to pharmaceutical compositions with the characteristics described above, also generally referred to as NeuroEPO plus.
Фармацевтические композиции объекта настоящего изобретения имеют в качестве активного ингредиента гипосиалилированные изоформы rhEPO. Эти гипосиалилированные изоформы получаются путем процесса, описанного в настоящем документе, который не предполагает химической и/или генетической модификации rhEPO для получения указанных изоформ. Изоформы rhEPO, которые являются частью действующего вещества указанных фармацевтических композиций, имеют третичную структуру, связанную с гликозилированием, отличным от такового для NeuroEPO, что придает им большую эффективность в механизмах нейрозищиты и нейровосстановления как in vitro, так и in vivo. Фармацевтические композиции объекта настоящего изобретения вводят путем назального или офтальмологического путей введения, и они находятся в форме водных растворов, готовые лекарственные формы которых представляют назальные капли, назальные спреи или глазные капли. Указанные фармацевтические составы содержат гипосиалилированный rhEPO в качестве активного ингредиента и необязательно фармацевтически подходящие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы.The pharmaceutical compositions of the present invention have hyposialylated isoforms of rhEPO as the active ingredient. These hyposialylated isoforms are produced by the process described herein, which does not involve chemical and/or genetic modification of rhEPO to produce these isoforms. The isoforms of rhEPO that are part of the active ingredient of these pharmaceutical compositions have a tertiary structure associated with glycosylation that is different from that of NeuroEPO, which makes them more effective in mechanisms of neuroprotection and neurorestoration both in vitro and in vivo. The pharmaceutical compositions of the present invention are administered by the nasal or ophthalmic routes, and are in the form of aqueous solutions, the finished dosage forms of which are nasal drops, nasal sprays or eye drops. Said pharmaceutical compositions contain hyposialylated rhEPO as the active ingredient and optionally pharmaceutically acceptable excipients and/or stabilizers.
Фармацевтически подходящие вспомогательные вещества и/или стабилизаторы являются нетоксичными для субъектов, которые их принимают, в используемых дозах и концентрациях и могут содержать биоадгезивные полимеры, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и метилцеллюлоза; стабилизаторы белков, такие как L-триптофан, L-лейцин, гидрохлорид L-аргинина и/или гидрохлорид L-гистидина и его соли.Pharmaceutically acceptable excipients and/or stabilizers are non-toxic to the subjects who take them, in the doses and concentrations used, and may contain bioadhesive polymers such as hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose and methylcellulose; protein stabilizers such as L-tryptophan, L-leucine, L-arginine hydrochloride and/or L-histidine hydrochloride and salts thereof.
Терапевтическое применение и способы леченияTherapeutic uses and treatment methods
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, пригодные для лечения расстройств нервной системы, таких как: цереброваскулярные, психиатрические и нейродегенеративные заболевания. В частности, указанные заболевания могут представлять собой: деменцию, инсульт, болезнь Паркинсона, атаксию, черепно-мозговую травму, глаукому, аутизм, гипоксию новорожденных, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и неврологическое повреждение, вызываемое травмой, отравлением или облучением. Настоящее изобретение также обеспечивает способ, включающий введение гипосиалилированного rhEPO субъекту, нуждающемуся в таком лечении, один-три раза в неделю периодами в 6-12 месяцев. Указанное введение будет проводиться интраназально (и/н), медленно, путем инстилляции лекарственного средства в слизистую. Доза введения находится в диапазоне 0,1-4 мг, предпочтительно 0,5-1 мг. Максимальный объем введения на дозу составляет 1; 0,5 мл на ноздрю для общей суточной дозы 3 мл. Указанный объем можно распределять на меньшие объемы с интервалами по времени 5-15 мин между каждым введением, предпочтительно каждые 15 мин.The present invention provides pharmaceutical compositions useful for the treatment of nervous system disorders such as cerebrovascular, psychiatric and neurodegenerative diseases. In particular, these diseases may include: dementia, stroke, Parkinson's disease, ataxia, traumatic brain injury, glaucoma, autism, neonatal hypoxia, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and neurological damage caused by trauma, poisoning or radiation. The present invention also provides a method comprising administering hyposialylated rhEPO to a subject in need of such treatment one to three times per week for periods of 6-12 months. This administration will be carried out intranasally (i/n), slowly, by instilling the drug into the mucous membrane. The administration dose is in the range of 0.1-4 mg, preferably 0.5-1 mg. The maximum volume of administration per dose is 1; 0.5 ml per nostril for a total daily dose of 3 ml. This volume can be divided into smaller volumes at time intervals of 5-15 minutes between each administration, preferably every 15 minutes.
Способ получения гипосиалилированных изоформ rhEPOMethod for obtaining hyposialylated isoforms of rhEPO
Способ, заявленный в настоящем изобретении, состоит из различных этапов и использует клеточные линии, описанные ниже.The method claimed in the present invention consists of various steps and uses the cell lines described below.
Клеточные линииCell lines
Клеточные линии, которые можно использовать для выполнения способа объекта настоящего изобретения, являются такими же, как указано для получения rhEPO.The cell lines that can be used to perform the method of the present invention are the same as those indicated for the production of rhEPO.
Среди линий наиболее используемыми являются: СНО, COS, BHK, Namalwa, HeLa,Among the lines the most used are: CHO, COS, BHK, Namalwa, HeLa,
Нер3В, HepG2, предпочтительно для настоящего изобретения используется линия СНО.Hep3B, HepG2, preferably the CHO line is used for the present invention.
Процесс ферментацииFermentation process
Процесс ферментации настоящего изобретения проводят, используя технологию ST. Этот процесс состоит из нескольких этапов, первый содержит размораживание ампулы из рабочего банка клеток до достижения комнатной температуры (18-24°С).The fermentation process of the present invention is carried out using ST technology. This process consists of several stages, the first involves thawing the ampoule from the working cell bank until it reaches room temperature (18-24°C).
Затем проводят этап размножения, на котором клетки масштабируют до концентрации клеток и жизнеспособности клеток, которая обеспечивает надлежащее инокулирование инокулятора с целью увеличения биомассы.An expansion step is then carried out where the cells are scaled up to a cell concentration and cell viability that ensures proper inoculation of the inoculum to increase biomass.
Как только достигалась плотность клеток > 1x106 клеток/мл, ферментацию начинали с различными режимами работы. Эти режимы могут быть периодическим культивированием, непрерывным культивированием с удержанием биомассы или без него.Once cell density >1x106 cells/ml was reached, fermentation was started with different operating modes. These modes can be batch cultivation, continuous cultivation with or without biomass retention.
Для получения гипосиалилированных изоформ на этом этапе ферментации следует обеспечивать температуру в диапазоне 34±2°С и рН в диапазоне 6,8±0,4.To obtain hyposialylated isoforms, a temperature in the range of 34±2°C and a pH in the range of 6.8±0.4 should be maintained at this stage of fermentation.
- 3 045369- 3 045369
Клетки должны расти в безбелковой культуральной среде до получения конечной концентрации глутамина в диапазоне 8-12 ммоль/л.Cells should be grown in protein-free culture medium to obtain a final glutamine concentration in the range of 8-12 mmol/L.
Процесс очисткиCleaning process
Процесс очистки гипосиалилированного rhEPO включает следующие хроматографические этапы.The purification process for hyposialylated rhEPO involves the following chromatographic steps.
Во-первых, проводят псевдоаффинную хроматографию в окрашенном лиганде.First, pseudoaffinity chromatography is performed on the colored ligand.
Целью этого этапа является захват rhEPO и частичное удаление основных загрязняющих веществ, присутствующих в супернатанте (SN). Затем гельфильтрационную хроматографию проводят для замены буфера белка на буфер раствора введения для следующего хроматографического этапа.The purpose of this step is to capture rhEPO and partially remove the major contaminants present in the supernatant (SN). Gel filtration chromatography is then performed to replace the protein buffer with the injection solution buffer for the next chromatographic step.
Затем проводят псевдоаффинную хроматографию хелатами металлов. Этот этап направлен на захват rhEPO и полное исключение фракции загрязняющих веществ, которые не были удалены на предыдущем этапе процесса. Гельфильтрационную хроматографию проводят снова для замены буфера на буфер для раствора введения следующего хроматографического этапа.Pseudoaffinity chromatography is then performed with metal chelates. This step aims to capture rhEPO and completely eliminate the fraction of contaminants that were not removed in the previous step of the process. Gel filtration chromatography is carried out again to exchange the buffer with the buffer for the introduction solution of the next chromatographic step.
В качестве важной стадии процесса получения проводят анионнообменную хроматографию с лигандом четвертичного аммония Q. На этом хроматографическом этапе используют монолитные колонки. Целями этой хроматографии являются отделение гипосиалилированных (биологически активных) изоформ от кислотных, удержание ДНК и концентрирование продукта.Anion exchange chromatography with quaternary ammonium ligand Q is performed as an important step in the preparation process. Monolithic columns are used in this chromatographic step. The goals of this chromatography are to separate hyposialylated (biologically active) isoforms from acidic ones, retain DNA, and concentrate the product.
Все это гарантирует, что получаются гипосиалилированные изоформы без загрязнения или смешивания с кислотными изоформами.All this ensures that hyposialylated isoforms are obtained without contamination or mixing with acidic isoforms.
Наконец, гельфильтрационную хроматографию проводят снова с целью замены буфера и обеспечения элюирования белка в виде активного сырого материала.Finally, gel filtration chromatography is performed again to exchange the buffer and ensure elution of the protein as active crude material.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1. Профиль изоформ:Fig. 1. Isoform profile:
А) Определение доли изоформ;A) Determination of the proportion of isoforms;
В) SN, образованный в культурах при оцениваемых условиях температуры и рН;B) SN formed in cultures under the evaluated temperature and pH conditions;
фиг. 2 - доля гипосиалилированных изоформ в культурах при оцениваемых условиях температуры и рН;fig. 2 - the proportion of hyposialylated isoforms in cultures under the assessed conditions of temperature and pH;
фиг. 3 - доля гипосиалилированных изоформ в каждой культуре при условиях, оцениваемых в полупромышленном масштабе;fig. 3 - the proportion of hyposialylated isoforms in each culture under conditions assessed on a semi-industrial scale;
фиг. 4 - относительная интенсивность менее кислотных изоформ в SN;fig. 4 - relative intensity of less acidic isoforms in SN;
фиг. 5 - влияние рН и проводимости подвижной фазы на статическую поглощающую способность в четвертичном аммонийном лиганде Q изоформ rhEPO: (А) гипосиалилированные (основные), (В) кислотные;fig. 5 - influence of pH and conductivity of the mobile phase on the static absorption capacity in the quaternary ammonium ligand of Q isoforms of rhEPO: (A) hyposialylated (basic), (B) acidic;
фиг. 6 - кривые проскока:fig. 6 - breakthrough curves:
А) Хроматографическая матрица Q SFF,A) Q SFF chromatographic matrix,
В) Монолитная колонка CIM QA;B) Monolithic column CIM QA;
фиг. 7 - влияние рН буфера для элюирования на рабочие характеристики основных и кислотных изоформ;fig. 7 - effect of elution buffer pH on the performance characteristics of basic and acidic isoforms;
фиг. 8 - распределение гипосиалилированных изоформ rhEPO в производственном масштабе;fig. 8 - distribution of hyposialylated rhEPO isoforms on a production scale;
фиг. 9 - изучение N-гликанов гипосиалилированного rhEPO путем жидкостной хроматографии с цвиттер-ионным гидрофильным взаимодействием, совмещенной с масс-спектрометрией;fig. 9 - study of N-glycans of hyposialylated rhEPO by liquid chromatography with zwitterionic hydrophilic interaction combined with mass spectrometry;
фиг. 10 - электроферограмма извлеченных ионов (EIE) гликоформ гликопептида O126 гипосиалилированного rhEPO, наблюдаемая при ферментативном расщеплении с: а) трипсином и нейраминидазой и b)трипсином;fig. 10 - extracted ion electropherogram (EIE) of glycoforms of glycopeptide O126 of hyposialylated rhEPO observed upon enzymatic digestion with: a) trypsin and neuraminidase and b) trypsin;
фиг. 11 - EIE наблюдаемых гликоформ гликопептида N83, полученных при ферментативном расщеплении с трипсином и нейраминидазой;fig. 11 - EIE of observed glycoforms of glycopeptide N83 obtained by enzymatic digestion with trypsin and neuraminidase;
фиг. 12 - EIE наблюдаемых гликоформ гликопептида N83 гипосиалилированного rhEPO, полученных при ферментации с: а) трипсином и нейраминидазой и b) трипсином;fig. 12 - EIE of observed glycoforms of glycopeptide N83 hyposialylated rhEPO obtained by fermentation with: a) trypsin and neuraminidase and b) trypsin;
фиг. 13 - профиль выживаемости клеток культуры астроцитов через 24 и 48 ч после повреждения клеток 8% диметилсульфоксидом (DMSO) и последующей обработкой гипосиалилированным rhEPO;fig. 13 - cell survival profile of astrocyte culture 24 and 48 hours after cell damage with 8% dimethyl sulfoxide (DMSO) and subsequent treatment with hyposialylated rhEPO;
фиг. 14 - график Каплана-Мейера, выживаемость в течение 7 дней наблюдения;fig. 14 - Kaplan-Meier plot, survival within 7 days of observation;
фиг. 15 - неврологический статус животных через 24 ч после инфаркта;fig. 15 - neurological status of animals 24 hours after infarction;
фиг. 16 - эффект применения различных изоформ rhEPO на количество ретикулоцитов в нормоцитемической мышиной модели.fig. 16 - Effect of different rhEPO isoforms on reticulocyte counts in a normocythemic mouse model.
Настоящее изобретение также дополнено следующими примерами и фигурами.The present invention is also supplemented by the following examples and figures.
Однако эти примеры не подразумеваются как ограничивающие объем настоящего изобретения.However, these examples are not intended to limit the scope of the present invention.
ПримерыExamples
Пример 1. Влияние рН и температуры на профиль изоформ rhEPO в лабораторном масштабеExample 1: Effect of pH and Temperature on the RhEPO Isoform Profile at Laboratory Scale
Из клеточной линии СНО, трансфицированной геном ЕРО человека, получали банк семенных клеток, который приспосабливали к росту в суспензии в безбелковой среде. Полное приспосабливание к этой культуральной среде получали через 37 поколений, представляющих 25 дней культивирования.From the CHO cell line transfected with the human EPO gene, a bank of seed cells was obtained, which was adapted for growth in suspension in a protein-free medium. Full adaptation to this culture medium was obtained after 37 generations, representing 25 days of culture.
Для оценки рабочих характеристик клеточной линии в присутствии различных условий рН и температуры проводили план эксперимента, где объединяли обе переменные. Экспериментальные условияTo evaluate the performance of the cell line in the presence of different pH and temperature conditions, an experimental design was carried out where both variables were combined. Experimental conditions
- 4 045369 показаны в табл. 1. рН культуры контролировали добавлением 0,5 моль/л гидроксида натрия. Таблица 1. Экспериментальные условия для оценки влияния переменных рН и температуры на профиль изоформ rhEPO- 4 045369 are shown in table. 1. The pH of the culture was controlled by adding 0.5 mol/L sodium hydroxide. Table 1. Experimental conditions to evaluate the effects of pH and temperature variables on the rhEPO isoform profile
Профиль изоформ rhEPO, соответствующий образцам SN, полученным в культурах при различных оцениваемых условиях, определяли изоэлектрическим фокусированием. Использовали смесь амфолинов с диапазоном рН от 2 до 5 и от 3 до 10, внутренний эталонный материал EPOCIM® использовали как контроль.The rhEPO isoform profile corresponding to SN samples obtained in cultures under the different conditions evaluated was determined by isoelectric focusing. A mixture of ampholines with a pH range of 2 to 5 and 3 to 10 was used, internal reference material EPOCIM® was used as a control.
Процент интенсивности каждой изоформы в образцах анализировали денситометрией, используя программу Gene Tools. Изоформы со значениями рН в диапазоне от 2,80 до 4,25 определяли как кислотные изоформы, а со значением рН в диапазоне от 4,25 до 6,55 - как основные изоформы (фиг. 1А).The percentage intensity of each isoform in the samples was analyzed by densitometry using Gene Tools software. Isoforms with pH values ranging from 2.80 to 4.25 were defined as acidic isoforms, and those with pH values ranging from 4.25 to 6.55 were defined as basic isoforms (Fig. 1A).
Фиг. 1В показывает, что на профиль изоформ сильно влияла температура.Fig. Figure 1B shows that the isoform profile was strongly influenced by temperature.
Несмотря на рН, когда образцы SN, соответствующие каждому условию, сравнивали при температуре 37°С с контролем наблюдали 7 кислотных изоформ. С другой стороны, при 35°С наблюдалась потеря кислотных изоформ, что было более выраженным при условиях с рН 7,2 и 7,3.Despite the pH, when SN samples corresponding to each condition were compared at 37°C with the control, 7 acidic isoforms were observed. On the other hand, at 35°C there was a loss of acidic isoforms, which was more pronounced under pH 7.2 and 7.3 conditions.
Фиг. 2 показывает, что при условиях рН 7,2 и 7,3 и температуре 35°С все полученные изоформы (100%) были основными изоформами.Fig. 2 shows that under conditions of pH 7.2 and 7.3 and a temperature of 35°C, all isoforms obtained (100%) were major isoforms.
Пример 2. Влияние рН и температуры на профиль изоформ rhEPO в полупромышленном масштабеExample 2: Effect of pH and Temperature on the RhEPO Isoform Profile at a Pilot Scale
Влияние наилучших культуральных условий, полученных в лабораторном масштабе (температура 35°С, рН 7,2 и 7,3), оценивали в более контролируемой и подходящей среде для клеточной культуры. Из банка семенных клеток, описанного в примере 1, разрабатывали четыре цикла ферментации, используя биореактор типа ST (Infors-AGCH 4103, Боттминген) с эффективным объемом 3,5 л. Рабочие условия показаны в табл. 2. Исходная выживаемость клеток была больше чем 90% при всех оцениваемых условиях.The effects of the best culture conditions obtained at laboratory scale (temperature 35°C, pH 7.2 and 7.3) were assessed in a more controlled and suitable cell culture environment. From the seed cell bank described in Example 1, four fermentation cycles were developed using a bioreactor type ST (Infors-AGCH 4103, Bottmingen) with an effective volume of 3.5 L. Operating conditions are shown in table. 2. Initial cell survival was greater than 90% under all conditions assessed.
Таблица 2. Рабочие условия, соответствующие каждому циклу ферментированияTable 2. Operating conditions corresponding to each fermentation cycle
Образцы отбирали в конце каждой ферментации и профиль изоформ образцов SN, образованных в культурах для оцениваемых условий в биореакторе, определяли посредством техники изоэлектрического фокусирования. Как только получали эти профили, использовали программу Gene Tools и начиная с изображения, соответствующего гелю изоэлектрического фокусирования, определяли интенсивность каждой полосы, присутствующей в геле, и оценивали долю гипосиалилированных изоформ для каждого условия.Samples were collected at the end of each fermentation and the isoform profile of the SN samples produced in the cultures for the bioreactor conditions evaluated was determined using an isoelectric focusing technique. Once these profiles were obtained, the Gene Tools program was used and, starting with the image corresponding to the isoelectric focusing gel, the intensity of each band present in the gel was determined and the proportion of hyposialylated isoforms was estimated for each condition.
Как можно увидеть на фиг. 3 в условиях культивирования 2 и 3 (35°С, рН 7,2-7,3), доля гипосиали- 5 045369 лированных изоформ была выше, чем при условиях 1 и 4. Эти результаты подтверждают обнаружения, полученные на лабораторном уровне, а именно, что путем модификации рабочих условий до рН 7,2-7,3 и температуры 35°С, профиль изоформ rhEPO изменяется, причем большая интенсивность достигается при значениях рН от 4,25 до 5,85.As can be seen in FIG. 3, under culture conditions 2 and 3 (35°C, pH 7.2-7.3), the proportion of hyposialylated isoforms was higher than under conditions 1 and 4. These results confirm the findings obtained at the laboratory level, and namely, that by modifying the operating conditions to pH 7.2-7.3 and temperature 35°C, the profile of rhEPO isoforms changes, with greater intensity being achieved at pH values from 4.25 to 5.85.
Пример 3. Путем увеличения концентрации глютамина в культуральной среде происходит содействие экспрессии основных изоформ rhEPOExample 3: By increasing the concentration of glutamine in the culture medium, the expression of the main isoforms of rhEPO is promoted
Для оценки, имело ли повышение концентрации глютамина в культуральной среде влияние на увеличение гипосиалилированных изоформ, оценивали рабочие характеристики клеточной линии СНО, продуцирующей rhEPO. Использовали банк семенных клеток, который подвергали действию различных концентраций глутамина в культуральной среде, и приспособление к культуральной среде проводили в течение 15 дней. Оценка начиналась с исходной концентрации клеток 0,5x106 клеток/мл в конечном объеме 300 мл культуральной среды, используя вращающиеся бутылки, которые выдерживали в инкубаторах при 37°С со скоростью встряхивания 600 об/мин. Конечные концентрации глутамина в культуральной среде составляли 8, 12 и 16 ммоль/л, и культуральную среду с 6 ммоль/л глутамина использовали как контроль.To assess whether increasing glutamine concentration in the culture medium had an effect on the increase in hyposialylated isoforms, the performance characteristics of the rhEPO-producing CHO cell line were assessed. A seed cell bank was used, which was exposed to various concentrations of glutamine in the culture medium, and adaptation to the culture medium was carried out for 15 days. The evaluation began with an initial cell concentration of 0.5 x 106 cells/ml in a final volume of 300 ml of culture medium using spinner bottles maintained in incubators at 37°C with shaking speed of 600 rpm. The final concentrations of glutamine in the culture medium were 8, 12, and 16 mmol/L, and culture medium with 6 mmol/L glutamine was used as a control.
Относительную интенсивность гипосиалилированных изоформ в SN культур оценивали по денситометрии через семь дней обработки различными концентрациями глутамина.The relative intensity of hyposialylated isoforms in SN cultures was assessed by densitometry after seven days of treatment with different concentrations of glutamine.
Фиг. 4 показывает, что с каждым из трех оцененных вариантов большие доли гипосиалилированных изоформ получали относительно контроля, таким образом подтверждая, что с повышением концентрации глутамина в культуральной среде получение гипосиалилированных изоформ в SN является предпочтительным. Наибольшее значение этих изоформ наблюдали с 8 ммоль/л глутамина (87%).Fig. 4 shows that with each of the three treatments evaluated, higher proportions of hyposialylated isoforms were obtained relative to the control, thus confirming that with increasing glutamine concentration in the culture medium, production of hyposialylated isoforms in SN is favored. The highest value of these isoforms was observed with 8 mmol/L glutamine (87%).
Пример 4. Влияние рН и проводимости на адсорбцию кислотных и основных изоформ в сильном четвертичном аммонийном анионообменнике Q в лабораторном масштабеExample 4: Effect of pH and Conductivity on the Adsorption of Acid and Basic Isoforms to a Strong Quaternary Ammonium Anion Exchanger Q at Laboratory Scale
С целью определения условий рН и проводимости, которые благоприятствуют наибольшей адсорбции кислотных изоформ в сильном четвертичном аммонийном анионообменнике Q оценивали следующие буферные растворы: 20 ммоль/л фосфата натрия (безводный двухосновный и одноосновный дигидрат) и 20 ммоль/л трис с 10 ммоль/л HCl. Буферные растворы изучали при различных значениях рН и проводимости, рН от 6 до 8 и проводимость от 1,5 до 5 мСм/см.To determine the pH and conductivity conditions that favor the greatest adsorption of acidic isoforms into the strong quaternary ammonium anion exchanger Q, the following buffer solutions were evaluated: 20 mmol/L sodium phosphate (anhydrous dibasic and monobasic dihydrate) and 20 mmol/L Tris with 10 mmol/L HCl . Buffer solutions were studied at different pH and conductivity values, pH from 6 to 8 and conductivity from 1.5 to 5 mS/cm.
Наибольшая адсорбция кислотных изоформ для обменника наблюдалась с условиями рН 6 и проводимостью 1,50 мСм/см. С другой стороны, адсорбция гипосиалилированных (основных) изоформ максимизируется при рН 8 и проводимости 1,50 мСм/см. Результаты показаны на фиг. 5.The highest adsorption of acidic isoforms for the exchanger was observed with conditions of pH 6 and conductivity of 1.50 mS/cm. On the other hand, adsorption of hyposialylated (basic) isoforms is maximized at pH 8 and conductivity 1.50 mS/cm. The results are shown in Fig. 5.
Пример 5. Сильная анионная матрица Q, которая использует технологию монолитной колонки, имеет лучшие рабочие характеристики в отношении емкости к отдельным изоформам rhEPO по сравнению с той, что использует обычную технологию хроматографических гелей в лабораторном масштабеExample 5: A strong anionic Q matrix that uses monolithic column technology has superior performance in terms of capacity to individual rhEPO isoforms compared to one that uses conventional laboratory scale chromatography gel technology
Динамическую адсорбционную способность (Q) каждой технологии при изучении рассчитывали с двумя кривыми проскока, используя два из линейных расходов, рекомендуемых изготовителем каждой технологии - 100 см/ч и 600 см/ч для технологии хроматографических гелей (Q SFF) и 156 и 624 см/ч для монолитной колонки (CIM QA). Равновесный раствор, используемый для экспериментов с обычной технологией и для технологии монолитной колонки, представлял буфер трис-HCL с рН 8 и проводимостью 1,5 мСм/см согласно результатам, полученным в примере 4.The dynamic adsorption capacity (Q) of each technology in the study was calculated with two breakthrough curves using two of the linear flow rates recommended by the manufacturer of each technology - 100 cm/h and 600 cm/h for chromatographic gel technology (Q SFF) and 156 and 624 cm/h. h for a monolithic column (CIM QA). The equilibrium solution used for the conventional and monolithic column technology experiments was Tris-HCL buffer with a pH of 8 and a conductivity of 1.5 mS/cm according to the results obtained in Example 4.
Образец rhEPO применяли к колонкам и на выходе из них образцы отбирали в различное время. Концентрацию белков (С) в каждом образце определяли спектрофотометрией. С известными значениями С в каждом из образцов рассчитывали долю неадсорбированного белка С/Со. Загрузку, которая является массой белка, внесенного в колонку, на единицу объема геля, данную в мг rhEPO/мл матрицы Q, рассчитывали для каждого времени.The rhEPO sample was applied to the columns and samples were collected at various times at the outlet. The protein concentration (C) in each sample was determined by spectrophotometry. With known C values in each sample, the fraction of unadsorbed protein C/Co was calculated. The loading, which is the mass of protein loaded onto the column per unit volume of gel, given in mg rhEPO/ml Q matrix, was calculated for each time.
На фиг. 6 значения С/Со относительно динамической адсорбционной способности представлены графически на кривых проскока, что позволяет узнать Q геля на долю неадсорбированного белка С/С0=0,1 при определенных расходах. Фиг. 6А показывает кривую проскока, полученную с обычной технологией хроматографических гелей, где самый низкий расход был таковым с самой высокой динамической способностью. Фиг. 6В показывает, что монолитная колонка имеет очень похожую динамическую адсорбционную способность с двумя протестированными линейными расходами, поэтому она может работать при более высоких расходах, не испытывая вариаций в динамической адсорбционной способности матрицы.In fig. 6, the C/Co values relative to the dynamic adsorption capacity are presented graphically on the breakthrough curves, which makes it possible to find out the Q of the gel for the fraction of unadsorbed protein C/C 0 =0.1 at certain flow rates. Fig. 6A shows the breakthrough curve obtained with conventional chromatographic gel technology, where the lowest flow rate was that with the highest dynamic capacity. Fig. 6B shows that the monolithic column has very similar dynamic adsorption capacity with the two linear flow rates tested, so it can operate at higher flow rates without experiencing variations in the dynamic adsorption capacity of the matrix.
Табл. 3 показывает значения Q, полученные с различными выполненными измерениями.Table 3 shows the Q values obtained with the different measurements performed.
Таблица 3. Значения Q, полученные с каждым из расходов, изученных в колонках Q SFF и CIM QATable 3. Q values obtained with each of the flow rates studied in the Q SFF and CIM QA columns
- 6 045369- 6 045369
При сравнении результатов исследований Q, проводимых в сильных анионообменниках в набивке фильтра и технологии монолитной колонки, наблюдали, что обе технологии имеют подобный Q при самой низкой исследованной линейной скорости. Однако при самой высокой линейной скорости монолитная колонка имеет динамическую адсорбционную способность в 1,40 раза больше, чем у традиционной оцененной хроматографической матрицы. Таким образом, можно сделать вывод, что монолитная колонка обеспечивает увеличение рабочего потока процесса без влияния на емкость обработки массы rhEPO, которую необходимо очищать.When comparing the results of Q studies conducted in strong anion exchangers in the filter pack and monolithic column technology, both technologies were observed to have similar Q at the lowest linear velocity tested. However, at the highest linear velocity, the monolithic column has a dynamic adsorption capacity 1.40 times greater than that of a traditionally evaluated chromatography matrix. Thus, it can be concluded that the monolithic column provides an increase in process flow without affecting the processing capacity of the rhEPO mass that needs to be purified.
Пример 6. Путем снижения рН оказывается содействие элюированию гипосиалилированных изоформ rhEPO в монолитной колонке в лабораторном масштабеExample 6 By lowering the pH, the elution of hyposialylated rhEPO isoforms is promoted in a monolithic column on a laboratory scale
Проводили экспериментальные тесты, используя колонки Q SFF и CIM QA. Равновесный раствор, используемый для обеих технологий, представлял собой буфер трис-HCl при рН 8 и проводимости 1,5 мСм/см согласно примеру 4. Рабочая линейная скорость колонки Q SFF составляла 600 см/ч, а у монолитной колонки - 624 см/ч. Продукт, используемый для экспериментов, был полученным из молекулярно-эксклюзионной хроматографической колонки Sephadex G-25, после проведения смены буфера на таковой для равновесного раствора, указанный выше. Для элюирования основных изоформ несколько циклов проводили при помощи монолитной анионообменной колонки, используя 50 ммоль/л натрийацетатного буфера с твин 20 при 0,01% со значениями рН: 4,41; 4,81; 5,06; 5,20. Извлечения, полученные при элюировании гипосиалилированных (основных) изоформ и кислотных изоформ в каждом цикле, показаны на фиг. 7. Из анализа этих результатов определили, что, когда рН раствора буфера для элюирования основных изоформ повышается, их рабочие характеристики снижаются, таким образом 50 ммоль/л натрий-ацетатного буфера при рН 4,41 выбирали для элюирования.Experimental tests were carried out using Q SFF and CIM QA columns. The equilibrium solution used for both technologies was Tris-HCl buffer at pH 8 and conductivity 1.5 mS/cm according to Example 4. The operating linear velocity of the Q SFF column was 600 cm/h, and the monolithic column was 624 cm/h . The product used for the experiments was obtained from a Sephadex G-25 molecular exclusion chromatography column, after carrying out the buffer change to that of the equilibrium solution indicated above. To elute the major isoforms, several cycles were carried out using a monolithic anion exchange column using 50 mmol/L sodium acetate buffer with Tween 20 at 0.01% with pH values: 4.41; 4.81; 5.06; 5.20. The recoveries obtained by eluting the hyposialylated (basic) isoforms and the acidic isoforms in each cycle are shown in FIG. 7. From the analysis of these results, it was determined that when the pH of the elution buffer solution of the major isoforms increased, their performance decreased, thus 50 mmol/L sodium acetate buffer at pH 4.41 was selected for elution.
Пример 7. Процесс получения гипосиалилированного rhEPO на промышленном уровне является последовательным с точки зрения разделения изоформ и степени чистотыExample 7 The industrial process for producing hyposialylated rhEPO is consistent in terms of isoform separation and purity.
Из банка семенных клеток, описанного в примере 1, проводили цикл ферментации, причем исходная выживаемость клеток была больше 90%. Этап ферментации проводили при температуре 35°С в безбелковой культуральной среде, которую дополняли для достижения конечной концентрации 8 ммоль/л глутамина, рН среды поддерживали от 7,2 до 7,3.From the seed cell bank described in Example 1, a fermentation cycle was carried out, and the initial cell survival rate was greater than 90%. The fermentation step was carried out at 35°C in protein-free culture medium, which was supplemented to achieve a final concentration of 8 mmol/L glutamine, the pH of the medium was maintained from 7.2 to 7.3.
Как только получали четыре урожая, проводили стадию очистки, где для важной стадии использовали анионообменник с четвертичным лигандом Q, используя монолитную колонку. Раствор трис-HCl при рН 8 и проводимости 1,5 мСм/см использовали как равновесный буфер и 50 ммоль/л натрийацетатного буфера с рН 4,41 использовали для элюирования.Once four crops were obtained, a purification step was carried out, where a quaternary Q ligand anion exchanger was used for an important step using a monolithic column. Tris-HCl solution at pH 8 and conductivity 1.5 mS/cm was used as equilibrium buffer and 50 mmol/L sodium acetate buffer at pH 4.41 was used for elution.
Профиль изоформ четырех партий активного сырого материала, полученных после процесса очистки, определяли посредством техники изоэлектрического фокусирования. Смесь амфолинов с диапазоном рН от 2 до 5 и от 3 до 10 использовали, и внутренний эталонный материал EPOCIM® использовали как контроль. Фиг. 8 показывает согласованность в разделении изоформ, где наблюдается профиль изоформ, сконфигурированный шестью основными изоформами, из которого только две совпадают с контролем.The isoform profile of four batches of active crude material obtained after the purification process was determined by isoelectric focusing technique. A mixture of ampholines with a pH range of 2 to 5 and 3 to 10 was used, and the internal reference material EPOCIM® was used as a control. Fig. 8 shows the consistency in isoform separation, where an isoform profile configured by six major isoforms is observed, of which only two match the control.
Кроме того, содержание сиаловой кислоты очищенных изоформ определяли согласно процедуре для определения этой молекулы, описанной в Европейской фармакопее 8.0 (2014), а чистоту - при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой. Табл. 4 показывает полученные результаты в отношении содержания сиаловой кислоты и чистоты.In addition, the sialic acid content of the purified isoforms was determined according to the procedure for the determination of this molecule described in European Pharmacopoeia 8.0 (2014), and the purity was determined using reverse phase HPLC. Table 4 shows the results obtained regarding sialic acid content and purity.
Таблица 4. Результаты в отношении содержания сиаловой кислоты и чистоты гипосиалилированного rhEPOTable 4. Results regarding sialic acid content and purity of hyposialylated rhEPO
Содержание сиаловой кислоты было менее 10 моль сиаловой кислоты/молекулу белка, а чистота была больше 95% в четырех партиях, из чего можно сделать вывод, что процесс получения гипосиалилированного rhEPO гарантирует получение изоформ в диапазоне рН от 4,25 до 5,85, что отличается от наблюдаемого в NeuroEPO.The sialic acid content was less than 10 mol sialic acid/protein molecule and the purity was greater than 95% in four batches, suggesting that the hyposialylated rhEPO process ensures isoforms in the pH range of 4.25 to 5.85, which differs from that observed in NeuroEPO.
- 7 045369- 7 045369
Пример 8. Третичная структура, связанная с гликозилированием гипосиалилированного rhEPO, показывает характерную микрогетерогенностьExample 8 Tertiary structure associated with glycosylation of hyposialylated rhEPO shows characteristic microheterogeneity
Анализ гликановGlycan analysis
Для изучения его профиля N-гликанов гипосиалилированный rhEPO подвергается процессу денатурирования и ферментативного расщепления с пептидом N-гликозидазой F (PNGase F). Как только Nгликаны высвобождались, их очищали твердофазной экстракцией, используя картриджи HyperSep Hypercab SPE (Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta 940: 92-103). Затем их дериватизировали согласно процедуре, описанной Gimenez и соавт. в 2015 (Gimenez, E et al. (2015) Anal. Chim. Acta, 866: 5968).To study its N-glycan profile, hyposialylated rhEPO is subjected to a denaturation process and enzymatic digestion with peptide N-glycosidase F (PNGase F). Once the Nglycans were released, they were purified by solid phase extraction using HyperSep Hypercab SPE cartridges (Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta 940: 92-103). They were then derivatized according to the procedure described by Gimenez et al. in 2015 (Gimenez, E et al. (2015) Anal. Chim. Acta, 866: 5968).
Капиллярную жидкостную хроматографию цвиттер-ионного-гидрофильного взаимодействия, совмещенную с масс-спектрометрией, проводили, следуя методике, описанной Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta, 940: 92-103.Capillary liquid chromatography zwitterionic-hydrophilic interaction coupled to mass spectrometry was performed following the procedure described by Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta, 940: 92-103.
Фиг. 9 показывает масс-спектры трех гликанов, обнаруженные в гипосиалилированном rhEPO. Как можно увидеть, гликан 3Ant2SiA1Fuc является наиболее распространенным, тогда как гликан 4Ant4SiA1Fuc обнаруживается в сниженных количествах.Fig. 9 shows the mass spectra of three glycans found in hyposialylated rhEPO. As can be seen, the 3Ant2SiA1Fuc glycan is the most abundant, while the 4Ant4SiA1Fuc glycan is found in reduced amounts.
Табл. 5 показывает процент относительной площади гликанов согласно структуре.Table Figure 5 shows the relative area percentage of glycans according to structure.
Таблица 5. Процент относительной площади гликанов согласно структуреTable 5. Percentage of relative area of glycans according to structure.
Табл. 6 показывает гликаны, обнаруживаемые с соответствующими относительными площадями, моноизопотной экспериментальной молекулярной массой (Мэксп.) и погрешностью по массе. Как можно видеть, есть значительное количество гликанов с менее сиалилированными структурами.Table 6 shows glycans detected with corresponding relative areas, monoisopotent experimental molecular weight (Mexp.) and mass uncertainty. As can be seen, there are a significant number of glycans with less sialylated structures.
Таблица 6. N-Гликаны, обнаруживаемые в гипосиалилированном rhEPO капиллярной жидкостной хроматографией цвиттерионного-гидрофильного взаимодействия, совмещенной с масс-спектрометриейTable 6. N-Glycans detected in hyposialylated rhEPO by zwitterionic-hydrophilic interaction capillary liquid chromatography coupled to mass spectrometry
- 8 045369- 8 045369
* Это представляет относительную площадь относительно всех обнаруженных гликанов.* This represents the relative area relative to all glycans detected.
* * Это представляет относительную площадь, сгруппированную антенарными структурами относительно всех обнаруженных гликанов.* * This represents the relative area clustered by antenary structures relative to all glycans detected.
Как можно увидеть в табл. 6, гликаны с более сиалилированными структурами (четыре молекулы сиаловой кислоты) обнаруживаются в низком отношении. Напротив, обнаруживаются структуры с молекулой сиаловой кислоты, которые не были обнаружены в других rhEPO, таких как 3Ant1SiA1Fuc, 4Ant1SiA1Fuc, 4Ant1LacNAc1SiA1Fuc и 4Ant3LacNAc1SiA1Fuc. Гликан 4Ant3Sia1Fuc распространен в гипосиалилированном rhEPO. Также можно увидеть, что процент относительной площади антенарных структур относительно всех обнаруженных гликанов отличается от другого rhEPO и что структуры с одним или двумя остатками сиаловой кислоты представляют более 50% относительной площади антенарных структур.As can be seen in table. 6, glycans with more sialylated structures (four sialic acid molecules) are found in low ratio. In contrast, structures with a sialic acid molecule are found that were not found in other rhEPOs, such as 3Ant1SiA1Fuc, 4Ant1SiA1Fuc, 4Ant1LacNAc1SiA1Fuc and 4Ant3LacNAc1SiA1Fuc. The 4Ant3Sia1Fuc glycan is abundant in hyposialylated rhEPO. It can also be seen that the percentage of the relative area of the antenar structures relative to all glycans detected is different from other rhEPO and that structures with one or two sialic acid residues represent more than 50% of the relative area of the antenar structures.
Анализ гликопептидовGlycopeptide Analysis
Для обнаружения всех глюкоформ, присутствующих в гликопептидах O126 и N83, rhEPO и rhEPOCRS (эталонный продукт фармакопеи) подвергали ферментативному расщеплению с трипсином и нейраминидазой (HS-TN rhEPO). Все сиалоформы в каждой обнаруженной глюкоформе изучали в анализе ферментативного расщепления с трипсином (HS-T rhEPO). Образцы анализировали масс-спектрометрией согласно процедуре, описанной Gimenez, E. et al. (2011) Rapid Commun Mass Spectrom. 25: 2307-2316.To detect all glucoforms present in glycopeptides O126 and N83 , rhEPO and rhEPOCRS (pharmacopoeial reference product) were enzymatically digested with trypsin and neuraminidase (HS-TN rhEPO). All sialoforms in each glucoform detected were examined in a trypsin enzymatic digestion assay (HS-T rhEPO). Samples were analyzed by mass spectrometry according to the procedure described by Gimenez, E. et al. (2011) Rapid Commun Mass Spectrom. 25: 2307-2316.
Фиг. 10А и В показывают EIE гликоформ гликопептида O126, обнаруженного в дигестатах rhEPO HS-TN и HS-T, соответственно. В первом наблюдается один пик, соответствующий таковому гликоформы O126/0SiA, поскольку нейраминидаза дает полное десиалилирование гликопептида, так что все сиалоформы становятся одной гликоформой. Напротив, когда ферментативно расщепляется только с трипсином, наблюдалось три сиалоформы с 0, 1 и 2 молекулами сиаловой кислоты. Табл. 7 показывает сиалоформы O126, обнаруженные с соответствующими относительными площадями, моноизопотной экспериментальной молекулярной массой (Мэксп.) и погрешностью по массе.Fig. 10A and B show EIE of glycoforms of the O 126 glycopeptide found in rhEPO HS-TN and HS-T digestates, respectively. In the first, there is a single peak corresponding to that of the O 126 /0SiA glycoform, since neuraminidase gives complete desialylation of the glycopeptide, so that all sialoforms become one glycoform. In contrast, when enzymatically cleaved with trypsin alone, three sialic forms were observed with 0, 1 and 2 sialic acid molecules. Table 7 shows the O 126 sialoforms detected with corresponding relative areas, monoisopotent experimental molecular weight (Mexp.) and mass uncertainty.
Таблица 7. Гликоформы, обнаруженные в гликопептиде O126гипосиалилированного rhEPO и rhEPO CRS, ферментативно расщепляющихся с трипсиномTable 7. Glycoforms found in glycopeptide O 126 of hyposialylated rhEPO and rhEPO CRS enzymatically digested with trypsin
Полученные результаты показывают, что наиболее распространенная сиалоформа является таковой, которая содержит одну молекулу сиаловой кислоты. Как процент относительной площади асиалилированных изоформ, так и изоформ с только одной сиаловой кислотой выше при сравнении с описанными для другого rhEPO, обнаруживая различия в доле обеих сиалоформ с CRS rhEPO.The results obtained indicate that the most common sialoform is that which contains one molecule of sialic acid. Both the percentage of relative area of asialylated isoforms and isoforms with only one sialic acid are higher when compared with those reported for other rhEPO, revealing differences in the proportion of both sialyforms with CRS rhEPO.
В случае гликопептида N83 при анализе ферментативного расщепления rhEPO HS-TN обнаруживали шесть пиков, соответствующих шести различным гликоформам без сиаловой кислоты. Полученные EIE показаны на фиг. 11, а обнаруженные гликоформы - в табл. 8. Полученные результаты показывают, что на сайте N83 есть больший процент сложных десиалилированных тетраантенарных структур.For glycopeptide N83, the enzymatic digestion assay of rhEPO HS-TN revealed six peaks corresponding to six different glycoforms without sialic acid. The resulting EIEs are shown in Fig. 11, and the detected glycoforms are in table. 8. Our results indicate that the N83 site contains a higher percentage of complex desialylated tetraantennary structures.
- 9 045369- 9 045369
Таблица 8. Обнаруженные гликоформы гликопептида N83 EPO HS-TNTable 8. Detected glycoforms of glycopeptide N 83 EPO HS-TN
Фиг. 12А показывает, что нет разделения между различными тетраантенарными структурами в дигестате HS-TN rhEPO. Напротив, когда сиалилированные гликоформы дигестата HS-T rhEPO анализируют, наблюдается явное разделение между ними, причем те, которые имеют три остатка сиаловой кислоты, имеют большую интенсивность (фиг. 12В). Эти результаты согласуются с обнаружениями из исследования гликанов.Fig. 12A shows that there is no separation between the different tetraantennary structures in the HS-TN rhEPO digestate. In contrast, when the sialylated glycoforms of the HS-T rhEPO digestate are analyzed, there is a clear separation between them, with those having three sialic acid residues having greater intensity (Figure 12B). These results are consistent with findings from glycan studies.
Табл. 9 показывает все обнаруженные сиалоформы и соответствующие относительные площади, моноизопотные экспериментальные молекулярные массы (Мэксп.) и погрешность по массе.Table Figure 9 shows all detected sialoforms and corresponding relative areas, monoisopotent experimental molecular weights (Mexp.) and mass uncertainty.
Таблица 9. Гликоформы гликопептида N83, обнаруженные в дигестатах с трипсином и трипсином/нейраминидазойTable 9. Glycoforms of glycopeptide N83 found in digestates with trypsin and trypsin/neuraminidase
Результаты подтверждают, что гипосиалилированный rhEPO отличается наличием меньшего количества сиалилированных структур (например, 2Ant1SiA1Fuc или 3Ant1SiA1Fuc), когда белок расщепляется только с помощью трипсина. Когда подтверждали процент относительных площадей моно- и бисиалилированных структур, результаты показали, что они составляют приблизительно 60%. Тетраантенарные структуры в гликопептиде N83 обнаруживаются в наибольшем проценте по сравнению с другими гликоформами, причем имеющие два остатка сиаловой кислоты являются теми, которые имеют наибольшую долю.The results confirm that hyposialylated rhEPO is characterized by having fewer sialylated structures (e.g., 2Ant1SiA1Fuc or 3Ant1SiA1Fuc) when the protein is cleaved only by trypsin. When the percentage of relative areas of mono- and bisialylated structures was confirmed, the results showed that they were approximately 60%. Tetraantennary structures in glycopeptide N83 are found in the highest percentage compared to other glycoforms, with those having two sialic acid residues being those with the largest proportion.
Пример 9. Гипосиалилированный rhEPO имеет восстанавливающее действие для астроцитов против цитотоксичности DMSOExample 9 Hyposilylated rhEPO has astrocyte restorative effects against DMSO cytotoxicity
Линию астроцитов PG4 культивировали в культуральной среде - модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 3,7 г/л NaHCO3 и 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS). Клетки инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2/95% воздуха. Через определенное время SN экстрагировали и клетки подвергали повреждению, вызванному 8% DMSO, и снова инкубировали в течение 24 ч. Затем SN удаляли и добавляли 2% культуральной среды DMEM с различными концентрациями гипосиалилированного rhEPO (1,25; 2,5; 5 и 10 нг/мл). В 24 и 48 ч добавляли реагент Alamar Blue, затем клетки инкубировали в течение 6 ч и считывания выполняли при 540/630 нм. Все инкубации проводили при температуре 37°С вThe PG4 astrocyte line was cultured in high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 3.7 g/L NaHCO 3 and 10% fetal bovine serum (FBS). Cells were incubated for 24 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 /95% air. After a certain time, the SN was extracted and the cells were subjected to 8% DMSO injury and incubated again for 24 hours. The SN was then removed and 2% DMEM culture medium with various concentrations of hyposialylated rhEPO (1.25, 2.5, 5 and 10) was added. ng/ml). Alamar Blue reagent was added at 24 and 48 h, then cells were incubated for 6 h and readings were performed at 540/630 nm. All incubations were carried out at 37°C in
--
Claims (3)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2019-0077 | 2019-09-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045369B1 true EA045369B1 (en) | 2023-11-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100593143B1 (en) | Erythropoietin conjugates | |
| EP1781697B1 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
| US8883726B2 (en) | Fibroblast growth factor 21 variants | |
| AU2017239640B2 (en) | Method for selection of high M6P recombinant proteins | |
| UA121959C2 (en) | Purification of iduronate-2-sulfatase | |
| US20120220757A1 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
| US20220305084A1 (en) | Human Recombinant Hyposialylated Erythropoietin, Methods of Purification and Therapeutic Uses Thereof | |
| US20040101524A1 (en) | Precursor N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, methods of treatment using said enzyme and methods for producing and purifying said enzyme | |
| EA045369B1 (en) | RECOMBINANT HYPOSIALYLATED HUMAN ERYTHROPOETIN, ITS METHODS OF PRODUCTION AND APPLICATION IN NERVOUS SYSTEM DISORDERS | |
| KR102414649B1 (en) | Erythropoietin-derived peptide, preparation method therefor, and use thereof | |
| US7229809B2 (en) | Use of modified lysozyme c to prepare medicinal compositions for the treatment of some serious diseases | |
| EA022220B1 (en) | Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase | |
| CN1997665B (en) | Novel carbamylated EPO and method for its production | |
| JPH01102100A (en) | Human interferon beta having sugar chain | |
| CN117018167A (en) | Stable thymosin beta 4 eye drop preparation formula | |
| DE102009032179A1 (en) | Process for purifying interferon beta | |
| KR20070032000A (en) | Novel carbamylated epo and method for its production |