KR20070032000A - Novel carbamylated epo and method for its production - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴의 제조 방법 및 신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도를 개시한다.The present invention discloses a process for the preparation of novel carbamylated erythropoietin, compositions comprising the novel carbamylated erythropoietin, pharmaceutical compositions comprising the same and uses thereof.
신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴 New Carbamylated Erythropoietin
Description
본 발명은 신규 화합물뿐만 아니라, 상기 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 신규 화합물인 카르바밀화된 에리스로포이에틴 (CEPO) 은 분자의 리신의 모든 또는 대부분의 1 차 아민 및 N-말단 아미노산 상에서 카르바밀화되어 있는 것을 특징으로 하며, 또한 상기 화합물은 분자 내에서 다른 아미노산의 1 차 아민의 카르바밀화의 수준은 낮다. 더욱이, 본 신규 화합물은 응집된 단백질 및 중합체가 없고, 예를 들어 주요 EPO 수용체를 발현하는 기타 조직 및 중추 또는 말초 신경계에서의 질환의 치료를 위한 약학적 조성물에서의 용도에 적합하다. 본 제조 방법의 하나의 다른 놀랄만한 이점은, 본 방법이 에리스로포이에틴에 대해 기술된 기타 공지된 카르바밀화 방법으로부터 달성된 생성물보다, 응집된 단백질 및 중합체를 거의 함유하지 않는 생성물을 제공한다는 사실이다.The present invention relates not only to novel compounds, but also to methods of preparing such compounds. The novel compound carbamylated erythropoietin (CEPO) is characterized by carbamylation on all or most of the primary amines and N-terminal amino acids of the lysine of the molecule. The level of carbamylation of primary amines is low. Moreover, the novel compounds are free of aggregated proteins and polymers and are suitable for use in pharmaceutical compositions for the treatment of diseases in the central or peripheral nervous system and other tissues expressing major EPO receptors, for example. One other surprising advantage of the present preparation method is the fact that the present method provides a product containing little aggregated proteins and polymers than the product achieved from other known carbamylation methods described for erythropoietin.
카르바밀화된 EPO 의 생물학적 조혈 작용의 손상은 [Satake, R. 등 (1990) Biochimica et Biophysica Acta ; 1038: 125-129 및 Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18 : 13 - 17] 에 나타나 있다. Brines 등의 2003 년 미국 특허 출원 20030072737 은 조혈 작용의 손실이 EPO 의 조직 보호 특성을 방해하 지 않았음을 나타내었다.Of carbamylated EPO Impairment of biological hematopoietic action is described by Satake, R. et al. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 and Mun, KC. and Golper, TA (2000) Blood Purif .; 18: 13-17. 2003 US patent application 20030072737 by Brines et al. Showed that loss of hematopoietic activity did not interfere with the tissue protective properties of EPO.
단백질의 카르바밀화는 단백질의 정제에서 우레아를 사용한 부작용으로서 그리고 높은 우레아 혈청 농도의 결과로서 널리 알려져 있다. 이는, 우레아의 시아네이트로의 자발적인 분해에 의해 야기된다. 시아네이트는 단백질의 1 차 아민의 카르바밀화를 맡고 있어서, 단백질의 N-말단 및 리신이 카르바밀화되기 쉽다 (도 1). 추가로, 카르바밀화되기 쉬운 기타 잠재적인 아미노산 잔기는 아르기닌, 시스테인, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산 및 히스티딘이나, 반응은 pH 의존적이고, N-말단 및 리신 잔기와 함께 쉽게 수행되지 않는다.Carbamylation of proteins is well known as a side effect of using urea in the purification of proteins and as a result of high urea serum concentrations. This is caused by spontaneous decomposition of urea to cyanate. Cyanate is responsible for carbamylation of the primary amine of the protein, so that the N-terminus and lysine of the protein tend to be carbamylated (FIG. 1). In addition, other potential amino acid residues that are susceptible to carbamylation are arginine, cysteine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid and histidine, but the reaction is pH dependent and is not easily performed with N-terminal and lysine residues.
단백질의 카르바밀화가 단백질의 생물학적 작용을 향상 또는 손상시킬 수 있는지 알아보기 위한 연구가 [Hoerkkoe, S. 등 (1992) Kidney International.; 41 : 1175 - 1181, Plapp, B.V. 등 (1971) Jour. Biol. Chem.; 246 (4) : 939 - 945, Satake, R. 등 (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038 : 125 - 129 및 Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18 : 13 - 17] 에 의해 수행되었다. 그들은 시아네이트 원으로서 KCNO 를 사용함으로써 단백질의 카르바밀화의 생물학적 효과를 연구하였다. 그들은 모두 증가된 카르바밀화의 결과로서 생물학적 작용에서의 감소 또는 변화를 관찰하였다. 카르바밀화의 정도의 평가를 2 가지 분석 방법을 바탕으로 하였다 :Studies to determine whether carbamylation of proteins can enhance or impair the biological action of proteins are described in Hoerkkoe, S. et al. (1992) Kidney International .; 41: 1175-1181, Plapp, B.V. Et al. (1971) Jour. Biol. Chem .; 246 (4): 939-945, Satake, R. et al. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 and Mun, K-C. and Golper, T. A. (2000) Blood Purif .; 18: 13-17]. They studied the biological effects of carbamylation of proteins by using KCNO as the cyanate source. They all observed a decrease or change in biological action as a result of increased carbamylation. The assessment of the degree of carbamylation was based on two analytical methods:
1. 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 어세이를 사용하여 자유 아미노기에서의 감소의 측정 및1. Determination of the reduction in free amino groups using trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) assay and
2. 호모시트룰린 잔기로 전환된 리신을 결정하는 아미노산 분석. 2. Amino acid analysis to determine lysine converted to homocitrulline residues.
Hoerkkoe S. 등 (1992) 은 2 M KCNO 로 37℃ 에서 최대 6 시간 동안 저-농도 지질단백질을 카르바밀화시켰으나, TNBS 어세이로 측정된 바와 같은 완전히 카르바밀화된 단백질을 수득하지 못했다.Hoerkkoe S. et al. (1992) carbamylated low-concentration lipoprotein for up to 6 hours at 37 ° C. with 2 M KCNO, but did not yield fully carbamylated protein as measured by TNBS assay.
Plapp, B.V. 등 (1971) 은 시간의 효과를 연구하고, 37℃ 에서 1 M KCNO 로 24 시간 처리 후 거의 완전히 카르바밀화된 소 췌장 데옥시리보뉴클레아제 A 를 수득하였다. Plapp, BV et al. (1971) studied the effect of time and obtained almost completely carbamylated bovine pancreatic deoxyribonuclease A after treatment for 24 hours with 1 M KCNO at 37 ° C.
Mun, K-C. 및 Golper, T.A. (2000) 는 2 M KCNO 를 사용하여 최대 6 시간의 반응 시간을 사용한 시간의 효과를 연구하였다. 그들은 또한 6 시간의 모든 반응을 37℃에서 수행하고 KCNO 농도를 증가시키는 효과를 연구하였다. Mun, K-C. 및 Golper, T.A. (2000) 는 실험 디자인으로부터는 카르바밀화의 정확한 정도를 증명할 수 없었다 (페이지 16 의 33 - 35 줄 참조).Mun, K-C. And Golper, T.A. (2000) studied the effect of time using a reaction time of up to 6 hours using 2 M KCNO. They also conducted all reactions of 6 hours at 37 ° C. and studied the effect of increasing KCNO concentrations. Mun, K-C. And Golper, T.A. (2000) could not prove the exact degree of carbamylation from the experimental design (see lines 33-35 on page 16).
본 출원인은 이제 본 발명에서 EPO 의 카르바밀화가 중합체 및 응집체를 제공하고, 그것들을 생약학제로서 부적합하도록 만든다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 출원인은 상기 중합체 및 응집체의 정보가 카르바밀화를 위한 공정 조건에 의존한다는 것을 발견하였다. 따라서, pH, 시간, 시아네이트 농도, 온도, 단백질 농도 및 가장 중요하게는 단백질 중합의 정도에 관한 최적의 변수를 갖는 방법의 개발이 필요하였다. 본 발명은 낮은 정도의 중합 및 응집을 갖는 생성물을 제공하는 최적의 카르바밀화 방법을 포함하고, 더욱이, 놀랍게도, 본 출원인은 N-말단 및 모든 리신 잔기 (모든 리신 잔기는 특정 pH-범위에서 발생함) 에서 목표로 하는 완전히 카르바밀화된 EPO 가 수득되었음을 발견하였다. 본 발명의 방법의 후속 단계는 형성된 응집체 및 중합체를 제거하기 위해 이루어졌다. 생성 카르바밀화된 순수한 EPO 는 신규 화합물이고, 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 함께 본 출원에서와 같이 청구된다.Applicants have now found that the carbamylation of EPO in the present invention provides polymers and aggregates and makes them unsuitable as biopharmaceuticals. Applicants have also found that the information of the polymers and aggregates depends on the process conditions for carbamylation. Therefore, there was a need for the development of a method with optimal parameters regarding pH, time, cyanate concentration, temperature, protein concentration and most importantly the degree of protein polymerization. The present invention includes an optimal method of carbamylation that provides a product with a low degree of polymerization and aggregation, and furthermore, surprisingly, Applicants have found that the N-terminal and all lysine residues (all lysine residues occur in specific pH-ranges). It was found that the target fully carbamylated EPO was obtained. Subsequent steps of the process of the present invention were made to remove the formed aggregates and polymers. The resulting carbamylated pure EPO is a novel compound and is claimed as in this application together with a pharmaceutical composition comprising the compound.
이미 카르바밀화의 정도는 시아네이트 농도 및 시간에 의존한다는 것을 예시하였다. 그러나, 생약학제의 제조를 위한 측정가능한 카르바밀화 방법을 수득하는 방법에 대해서는 기술되어 있지 않다.It has already been illustrated that the degree of carbamylation depends on cyanate concentration and time. However, no method is described for obtaining a measurable carbamylation method for the preparation of a biopharmaceutical.
차선의 제조에 의한 응집체의 존재는 항체의 유도와 연관되어 있다. 따라서, 응집체의 존재는 인간에 사용하기에 부적합한 생약학적 제조물을 초래한다.The presence of aggregates by suboptimal production is associated with the induction of antibodies. Thus, the presence of aggregates results in biopharmaceutical preparations that are not suitable for use in humans.
본 발명에서 기술된 카르바밀화 및 정제 방법은 가능한 한 중합체 또는 응집체의 최저 형성을 갖는 완전히 카르바밀화되고, 최종 생성물의 최소의 손실을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 초래한다. 그러므로, 경제적으로 성장할 만한 단계가 되게 한다.The method of carbamylation and purification described herein results in a protein characterized as fully carbamylated with the lowest formation of polymers or aggregates as possible, with minimal loss of final product. Therefore, it is a stage to grow economically.
카르바밀화된 단백질의 추가의 공정은, 생성물이 응집체 및 중합체로 인한 단백질에 대한 면역학적 반응의 발생 위험이 단지 최소인 생약학제로서 유용하게 되도록 한다.Further processing of carbamylated proteins allows the product to be useful as a biopharmaceutical with only minimal risk of developing an immunological response to the protein due to aggregates and polymers.
완전 카르바밀화의 평가를 위한 분석 방법은 아미노산 분석 외에도 ; 자유 1 차 아미노기에 대한 TNBS 및 마침내 MALDI-TOF 에 의한 생성물 및 분해된 생성물의 특징화이다.Analytical methods for the evaluation of complete carbamylation include, in addition to amino acid analysis; Characterization of the decomposed and degraded products by TNBS and finally MALDI-TOF for free primary amino groups.
분자의 N-말단 및 리신에 있는 자유 아미노기 상에서 완전히 카르바밀화되며, 추가로 2.5% 초과의 함량으로 집합되지도 중합되지도 않고, 최소의 과다 (over)- 또는 하위 (under)-카르바밀화된 에리스로포이에틴을 함유하는 에리스로포이에틴인 본 발명의 신규 화합물은 고유의 에리스로포이에틴의 신경보호적 효과에 대해 반응성인 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.Fully carbamylated on the free amino groups at the N-terminus and lysine of the molecule, further aggregated or polymerized to a content of greater than 2.5%, with minimal over- or under-carbamylation The novel compounds of the invention, which are erythropoietins containing erythropoietins, can be used in the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of diseases that are responsive to the neuroprotective effects of native erythropoietin.
발명의 개요Summary of the Invention
본 발명은 생약학제의 제조를 위한 스케일있는 단백질 카르바밀화 과정에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 방법의 생성물, 및 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a scaled protein carbamylation process for the preparation of a biopharmaceutical. Moreover, the present invention relates to the products of the above methods, and to pharmaceutical compositions comprising the compounds, and to the use of such compositions.
본 출원에서 기술된 카르바밀화 및 정제 방법은 가능한 한 중합체 또는 응집체의 형성이 최저이고, 최종 생성물의 손실이 최소인 완전히 카르바밀화된 것을 특징으로 하는 단백질을 초래한다.The method of carbamylation and purification described herein results in a protein characterized as fully carbamylated with the lowest possible formation of polymers or aggregates and minimal loss of final product.
카르바밀화 방법은 최저량의 중합체 및 응집체로 카르바밀화된 단백질을 제공하도록 최적화되어, 상기 방법이 경제적으로 실용적인 방법이 되게 하였다. 최종 생성물은 추가로 과다- 및/또는 하위-카르바밀화된 에리스로포이에틴 (분자 당 9 개 미만 또는 초과의 카르바밀화) 의 제한된 양의 이성체 (isoform) 를 함유한다. 하위-카르바밀화된 EPO 는 9 개 미만의 카르바밀 잔기를 함유하고 있는데, 즉, 8 개의 리신 및 N-말단 모두가 카르바밀화되어 있지 않다. 하위-카르바밀화된 EPO 는 적게나마 5 개 정도의 카르바밀 잔기를 가질 수 있고, 또한 표준적인 적혈구 생성 작용은 가지지 않아서, 본 발명에서 사용하기에 적합하게 되게 한다. 과다-카르바밀화된 EPO 는 9 개 초과의 카르바밀 잔기를 갖고, 8 개의 리신 잔기 및 N-말단 이외의 아미노산에서 카르바밀화를 가질 것이다. CEPO 는 15 개만큼의 카르바밀 잔기를 가질 수 있고, 또한 목적하는 효과를 가지는데, 즉 표준적인 적혈구 생성 작용이 없을 수 있다. 약 90% 이상, 및 거의 95% 정도의 CEPO 이성체는 8 개의 리신 잔기 및 N-말단에서만 카르바밀화된다.The carbamylation process has been optimized to provide carbamylated proteins with the lowest amount of polymers and aggregates, making the process economically viable. The final product further contains a limited amount of isoforms of over- and / or sub-carbamylated erythropoietin (less than or more than 9 carbamylated per molecule). Sub-carbamylated EPO contains less than 9 carbamyl residues, ie all eight lysines and N-terminus are not carbamylated. Sub-carbamylated EPO may have as little as 5 carbamyl residues and also does not have a standard red blood cell production action, making it suitable for use in the present invention. Over-carbamylated EPO will have more than 9 carbamyl residues and will have carbamylation at eight lysine residues and amino acids other than the N-terminus. CEPO may have as many as 15 carbamyl residues and also have the desired effect, i.e., may not have a standard red blood cell production. At least about 90% and almost 95% of the CEPO isomers are carbamylated at only eight lysine residues and at the N-terminus.
카르바밀화된 단백질의 추가의 공정은 집합 및 중합된 생성물을 최대 3% 또는 2.5% 수준으로 제거하고, 그로 인해 응집체 및 중합체로 인한 단백질에 대한 면역학적 반응의 발생의 위험을 단지 최소한으로 갖는 생약학제로서 유용한 생성물이 되게 한다.Further processing of carbamylated proteins removes up to 3% or 2.5% of aggregated and polymerized products, thereby providing a biopharmaceutical with only minimal risk of developing an immunological response to proteins due to aggregates and polymers As a useful product.
카르바밀화의 평가를 위한 분석 방법은 아미노산 분석 뿐만 아니라 ; 자유 1 차 아미노기에 대한 TNBS 및 MALDI-TOF 및 LC-MS/MS 에 의한 생성물 및 분해된 생성물의 특징화이다.Analytical methods for the evaluation of carbamylation include amino acid analysis as well; Characterization of the degraded product and the product by TNBS and MALDI-TOF and LC-MS / MS for free primary amino groups.
발명의 상세한 설명Detailed description of the invention
제조 방법Manufacturing method
6 단계가 단백질의 카르바밀화 방법을 구성한다 :Six steps constitute a method of carbamylation of proteins:
1. 초여과에 의한 농축.1. Concentration by Ultrafiltration.
2. 카르바밀화에 의한 개질. 2. Modification by carbamylation.
3. 젤여과에 의한 탈염.3. Desalting by gel filtration.
4. 음이온-교환에 의한 정제. 4. Purification by anion-exchange.
5. 5. 초여과Ultrafiltration 및 And 정용여과에In diafiltration 의한 농축 및 By thickening and 완충액Buffer 교환. exchange.
6. 0.22 ㎛ 여과. 6. 0.22 μm filtration.
본 카르바밀화 방법의 출발 물질은 유리하게는 정제된 인간 EPO 이나, 동물 또는 인간 유형의 임의의 EPO 형태일 수 있으며, 비-제한적 예에서는 아시알로-EPO, 인간 EPO 의 돌연변이, 즉 아미노산 서열에서의 변화가 도입된 분자, EPO 단편, EPO 펩티드, 기타 단백질, 또는 여러 단백질이 카르바밀화되길 원한다면 단백질의 혼합물과 같은 합성, 재조합 인간 EPO 이거나 또는 생물학적으로 또는 화학적으로 개질된 인간 EPO 이다. The starting material of the present carbamylation method is advantageously purified human EPO, but can be in the form of any EPO of animal or human type, and in non-limiting examples, asialo-EPO, mutation of human EPO, ie in amino acid sequence Molecules, EPO fragments, EPO peptides, other proteins, or multiple proteins introduced with a change in are synthetic, recombinant human EPO, such as mixtures of proteins, or biologically or chemically modified human EPO, if desired.
상기 방법의 제 1 단계는 초여과에 의한 단백질 농축 조정을 포함하는데, 여기서 단백질 농축은 낮은 공정 부피를 유지하기 위해 조정된다. 0.05 - 10 mg/ml 또는 0.05 - 8 mg/ml 의 단백질 농도가 바람직한 구현예이다. 더욱 바람직한 구현예는 0.05 - 7 mg/ml 이고, 가장 바람직한 것은 2 - 5 mg/ml 이다. 농도가 증가되면, 응집체는 증가해서 형성된다. 초여과는 MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용하여 수행된다. 다른 필터가 사용될 수 있다. 또한, 단백질의 용해도는 안정화제를 첨가함으로써 조정될 수 있다.The first step of the method involves adjusting protein concentration by ultrafiltration, where the protein concentration is adjusted to maintain a low process volume. Protein concentrations of 0.05-10 mg / ml or 0.05-8 mg / ml are preferred embodiments. A more preferred embodiment is 0.05-7 mg / ml, most preferred 2-5 mg / ml. As the concentration is increased, aggregates are formed to increase. Ultrafiltration is performed using BioMax (Millipore) with a MWCO of 5 kDa. Other filters may be used. In addition, the solubility of the protein can be adjusted by adding stabilizers.
농축 단계가 완료된 후, 단백질 용액은 pH 가 7 - 11 또는 pH 가 7 - 10 인 K-보레이트 테트라 하이드레이트, K-시아네이트와 혼합된다. 바람직한 구현예에서, pH 는 8 - 10 이고, 가장 바람직하게는 9.0 이다. 10 분 - 30 일 또는 30 분 - 30 일 또는 1 시간 - 30 일 또는 1 시간 - 20 일 또는 1 시간 - 10 일 또는 1 시간 - 5 일 또는 1 시간 - 2 일 또는 1 시간 - 26 일 또는 18 - 26 일 또는 바람직하게는 22 시간 - 26 시간, 가장 바람직하게는 24 시간 동안, 온도는 0℃ 내지 60℃ 또는 0℃ 내지 50℃ 또는 0℃ 내지 40℃ 또는 0℃ 내지 37℃ 미만의 범위이나, 바람직한 구현예는 30℃ - 34℃, 바람직하게는 32℃ 의 온도 간격을 갖는다. 그러나, 다른 공정 변수, 즉, 온도, 시아네이트 농도 및 단백질 농도가 변한다면, 상기 바람직한 간격이 변할 수 있다.After the concentration step is complete, the protein solution is mixed with K-borate tetra hydrate, K-cyanate, pH 7-11 or pH 7-10. In a preferred embodiment, the pH is 8-10, most preferably 9.0. 10 minutes-30 days or 30 minutes-30 days or 1 hour-30 days or 1 hour-20 days or 1 hour-10 days or 1 hour-5 days or 1 hour-2 days or 1 hour-26 days or 18- For 26 days or preferably 22 hours-26 hours, most preferably 24 hours, the temperature is in the range of 0 ° C to 60 ° C or 0 ° C to 50 ° C or 0 ° C to 40 ° C or 0 ° C to 37 ° C, Preferred embodiments have a temperature interval of 30 ° C-34 ° C, preferably 32 ° C. However, if other process variables, namely temperature, cyanate concentration and protein concentration change, the preferred interval may change.
온도가 한계 미만이면, 카르바밀화가 느리고 불충분하여 수율이 낮을 것이다. 온도 한계가 초과되면, 증가된 응집으로 인해 수율이 낮을 것이다. 또다른 중요한 변수는 시간인데, 이는 시간이 감소되거나 또는 시간이 증가된다면 응집체의 형성이 관찰되고 그로 인해 낮은 수율이 초래되어 카르바밀화가 완전하지 않을 것이기 때문이다. If the temperature is below the limit, the carbamylation will be slow and insufficient and the yield will be low. If the temperature limit is exceeded, the yield will be low due to the increased aggregation. Another important variable is time, because if time is reduced or if time is increased the formation of aggregates will be observed, resulting in low yields and thus incomplete carbamylation.
따라서, 연접 변수 (coherent parameter) 가 있는 공정이 존재하는데, 즉 온도가 저하되면, 감소된 카르바밀화 반응은 시아네이트 농도 및/또는 반응 시간을 증가시킴으로써 보충될 수 있다. 추가로, 반응 시간이 감소되면, 감소된 카르바밀화 반응은 온도 및/또는 시아네이트 농도를 증가시킴으로써 보충될 수 있다. 마지막으로, 감소된 시아네이트 농도를 사용한 공정에서, 감소된 카르바밀화 반응은 반응 시간 및/또는 온도를 증가시킴으로써 보충될 수 있다.Thus, there is a process with coherent parameters, i.e. if the temperature is lowered, the reduced carbamylation reaction can be supplemented by increasing the cyanate concentration and / or reaction time. In addition, if the reaction time is reduced, the reduced carbamylation reaction can be supplemented by increasing the temperature and / or cyanate concentration. Finally, in processes with reduced cyanate concentrations, the reduced carbamylation reaction can be supplemented by increasing the reaction time and / or temperature.
따라서, 결론적으로 하나의 중요한 변수 (시간, 온도, 시아네이트 농도 및 단백질 농도) 중의 하나의 유의한 변화는 응집체 및 중합체의 형성이 낮은 완전히 카르바밀화된 분자를 수득하기 위해, 하나 이상의 다른 중요한 변수에서의 변화를 포함할 것이다.Thus, in conclusion, a significant change in one of the important variables (time, temperature, cyanate concentration and protein concentration) is one or more other important variables in order to obtain fully carbamylated molecules with low formation of aggregates and polymers. It will include a change in.
시아네이트가 본래부터 양성자의 취득 하에 가수분해하고 중합하며, 완충액 용량이 부족하면 용액의 pH 의 이동을 초래하기 때문에, 보레이트 완충액의 농도는 0.05 - 2 M 일 수 있으나, 바람직한 구현예에서는 0.1 - 1 M 및 가장 바람직하게는 0.5 M 일 수 있다.The concentration of borate buffer may be 0.05-2 M, but in preferred embodiments 0.1-1, since cyanate inherently hydrolyzes and polymerizes under the acquisition of protons, and a lack of buffer capacity results in a shift in pH of the solution. M and most preferably 0.5 M.
또한, 시아네이트 농도는 0.05 - 10 M 또는 0.05 - 8 M 또는 0.05 - 6 M 또는 0.05 - 4 M 또는 0.05 - 2 M 의 범위가 바람직하고, 바람직한 구현예는 0.05 - 1 M 이고, 가장 바람직하게는 0.5 M 이다. In addition, the cyanate concentration is preferably in the range of 0.05-10 M or 0.05-8 M or 0.05-6 M or 0.05-4 M or 0.05-2 M, preferred embodiments are 0.05-1 M, most preferably 0.5 M.
0.5 M 보레이트 완충액의 농축은 사용 시 0.5 M 시아네이트 농도의 양성자 취득에 의해 야기되는 pH 이동을 조절하는데 필요하다. 시아네이트 및 보레이트의 기타 염을 사용한 방법이 사용될 수 있다. 추가로, 카르보네이트 완충액 또는 포스페이트 완충액과 같이, 보레이트가 아닌 다른 반응 완충액이 사용될 수 있다.Concentration of 0.5 M borate buffer is necessary to control the pH shift caused by proton acquisition of 0.5 M cyanate concentration in use. Methods using other salts of cyanates and borate can be used. In addition, reaction buffers other than borate may be used, such as carbonate buffer or phosphate buffer.
단백질 및 시아네이트의 반응 혼합물의 탈염은 크로마토그래피 젤여과를 사용하여 수행된다. G-25 Fine (Amersham Biosciences) 매트리스가 사용된다. 샘플을 칼럼에 적용하기 전의 유지 시간은 조절되고, 2 시간을 초과해서는 안 될 것인데, 이는 추가의 카르바밀화 및 중합체 형성을 야기할 것이기 때문이다. 단백질의 탈염 및 완충액 교환은 투석, 정용여과 또는 크로마토그래피 젤여과를 사용하여 수행될 수 있다. 기타 젤여과 매트리스는 예를 들어 가교된 폴리사카라이드 또는 가교 혼합된 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌의 매트리스 또는 천연 세라믹의 매트리스와 같이 사용될 수 있다. 더욱이 칼럼 높이는 본 단계에서 다양할 수 있다.Desalting of the reaction mixture of protein and cyanate is carried out using chromatography gel filtration. A G-25 Fine (Amersham Biosciences) mattress is used. The holding time before the sample is applied to the column is controlled and should not exceed 2 hours, as this will lead to further carbamylation and polymer formation. Desalting and buffer exchange of proteins can be performed using dialysis, diafiltration or chromatography gel filtration. Other gel filtration mattresses can be used, for example, as crosslinked polysaccharides or crosslinked mixed polysaccharides, polyacrylamides, mattresses of polystyrene or mattresses of natural ceramics. Furthermore, the column height can vary at this stage.
40% 미만의 응집체 및 30% 미만 또는 25% 미만 또는 20% 미만 또는 15% 미만 또는 12.5% 미만 또는 10% 미만 또는 8% 미만 또는 7% 미만의 중합체로 된 생성물을 수득하도록 카르바밀화 단계가 조정될 수 있다. The carbamylation step is carried out to obtain a product of less than 40% aggregates and less than 30% or less than 25% or less than 20% or less than 15% or less than 12.5% or less than 10% or less than 8% or less than 7% polymer. Can be adjusted.
응집체 및 중합체의 제거는 음이온 교환을 사용한 정제 단계에 의해 수행된다. 출발 물질의 잔여물질 및 응집체/중합체로부터 카르바밀화된 EPO 를 분리할 수 있다는 것이 관찰된다. 진행 완충액 A 는 : 0.3% Tris (25 mM), 0.3% (50 mM) NaCl, pH 8.5 ± 0.2 이고, 용출 완충액 B 는 : 0.3% Tris (25 mM), 5.8% (1 M) NaCl, pH 8.5 ± 0.2 이다. 구배는 목적하는 분리를 수득하기 위해 20 칼럼 부피에 걸쳐 0 - 30% 로 수행된다. 정제 단계는 응집체 3% 미만 및 중합체 2.5% 미만 또는 2% 미만 또는 1.5% 미만 또는 1% 미만 또는 약 0.5% 미만으로 된 생성물을 초래할 수 있다.Removal of aggregates and polymers is carried out by a purification step using anion exchange. It is observed that the carbamylated EPO can be separated from the residuals and aggregates / polymers of the starting material. Progression buffer A is: 0.3% Tris (25 mM), 0.3% (50 mM) NaCl, pH 8.5 ± 0.2, and elution buffer B is: 0.3% Tris (25 mM), 5.8% (1 M) NaCl, pH 8.5 ± 0.2. The gradient is carried out at 0-30% over 20 column volumes to obtain the desired separation. The purification step can result in products with less than 3% aggregates and less than 2.5% or less than 2% or less than 1.5% or less than 1% or less than about 0.5% polymer.
카르바밀화된 EPO 피크의 용출 및 수합 및 풀링 (pooling) 은 용출된 단백질의 이성이질성, 즉, 이성체의 분포에 영향을 미친다. 즉, 과다- 및 하위-카르바밀화된 CEPO 의 양은 수합 및 풀링 과정에 따라 다양할 것이다. 협소한 풀링은 과다- 및/또는 하위-카르바밀화된 에리스로포이에틴의 함량을 저하시킬 것이다. 구배의 길이를 증가시키는 것은 일부 종을 제외시킴으로써 더욱 한정된 생성물의 선별을 허용할 것이다.Elution, pooling and pooling of carbamylated EPO peaks affects the heterogeneity of the eluted protein, ie the distribution of isomers. That is, the amount of over- and sub-carbamylated CEPO will vary depending on the harvesting and pooling process. Narrow pooling will lower the content of over- and / or sub-carbamylated erythropoietin. Increasing the length of the gradient will allow selection of more defined products by excluding some species.
ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 40 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO 의 조성물은 본 발명의 한 구현예이다. 더욱 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 35 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 30 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 25 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 20 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 15 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 10 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 5 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 2 중량% 미만인 CEPO 이다. 가장 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이,, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 1 중량% 미만인 CEPO 이다.A composition of carbamylated EPO with less than about 40% by weight of the over- and sub-carbamylated isomers as measured by an ESI-mass spectrometer is one embodiment of the present invention. A more preferred embodiment is CEPO with less than about 35% by weight of over- and sub-carbamylated isomers as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 30% by weight of over- and sub-carbamylated isomers as measured by ESI-mass spectrometry. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 25% by weight of over- and sub-carbamylated isomers as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 20% by weight of over- and sub-carbamylated isomers, as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 15% by weight of over- and sub-carbamylated isomers, as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 10% by weight of over- and sub-carbamylated isomers, as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 5% by weight of over- and sub-carbamylated isomers as measured by an ESI-mass spectrometer. Even more preferred embodiments are CEPO with less than about 2% by weight of over- and sub-carbamylated isomers as measured by an ESI-mass spectrometer. Most preferred embodiments are CEPO with less than about 1% by weight of over- and sub-carbamylated isomers, as measured by an ESI-mass spectrometer.
이성체의 전체 함량에 영향을 미치는 것 외에도, 카르바밀화된 EPO 피크의 수합 및 풀링은 과다-카르바밀화된 CEPO 의 분포에 영향을 미친다. 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 약 35 중량% 미만인 것이 바람직하다. 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 약 30 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 약 25 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 약 20 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 약 15 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하다. 가장 바람직하게는 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 CEPO 의 약 10 중량% 이하, 약 5 중량% 이하 또는 약 1 중량% 이하이어야 할 것이다.In addition to affecting the total content of isomers, the pooling and pooling of carbamylated EPO peaks affects the distribution of over-carbamylated CEPO. It is preferred that the amount of over-carbamylated CEPO isomers is less than about 35% by weight as measured by an ESI-mass spectrometer. It is even more preferred that the amount of over-carbamylated CEPO isomers is less than about 30% by weight, as measured by ESI-mass spectrometry, and that the amount of over-carbamylated CEPO isomers is less than about 25% by weight. Even more preferred, less than about 20% by weight, even more preferably less than about 15% by weight. Most preferably the amount of over-carbamylated EPO should be about 10% by weight or less, about 5% by weight or less or about 1% by weight or less of the total CEPO.
다른 진행 및 용출 완충액이 다른 음이온 교환 매트리스로서 사용될 수 있고, 충전된 필터가 사용될 수 있다. 비제한적 실시예에서의 매트리스는 가교된 폴리사카라이드 또는 가교 혼합된 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 또는 천연 세라믹의 매트리스이다 .Different run and elution buffers can be used as other anion exchange mattresses, and filled filters can be used. The mattress in a non-limiting embodiment is a mattress of crosslinked polysaccharide or crosslinked mixed polysaccharide, polyacrylamide, polystyrene or natural ceramic.
양이온 교환 외에도, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기별 배제 크로마토그래피가 정제에 사용될 수 있다.In addition to cation exchange, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and size exclusion chromatography can be used for purification.
농도 및 완충액의 조정을 위한 다음 단계에서, 정용여과/초여과 접선 유동 여과 단위 (tangential flow filtration unit) 가 사용된다. 카르바밀화된 EPO 는 농도가 > 0.5 mg/ml 로 조정되고, 완충액을 20 mM 시트레이트, 100 mM NaCl 완충액으로 변경하였다. 농도 및 완충액 변경은 MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용하여 수행된다. 다른 필터가 사용될 수 있다.In the next step for the adjustment of concentration and buffer, a diafiltration / superfiltration tangential flow filtration unit is used. Carbamylated EPO was adjusted to concentration> 0.5 mg / ml and the buffer was changed to 20 mM citrate, 100 mM NaCl buffer. Concentration and buffer changes are performed using BioMax (Millipore) with a MWCO of 5 kDa. Other filters may be used.
마침내, 정제된 생약학적 약물 성분은 Millipak (Millipore) 를 사용하여 0.22 ㎛ 여과되어, 병원균을 감소시킨다. 임의의 0.22 ㎛ 필터가 사용될 수 있다.Finally, the purified biopharmaceutical drug component is 0.22 μm filtered using Millipak (Millipore) to reduce pathogens. Any 0.22 μm filter can be used.
상기 방법을 사용하여, 완전히 카르바밀화된 EPO 는 SEC-HPLC 에 의해 측정된 바와 같이 응집체가 3% 미만 또는 바람직하게는 2.5% 미만으로 수득된다. 8 개의 리신 잔기의 완전한 카르바밀화는 전환된 리신을 호모시크룰린으로 결정하는 아미노산 분석을 사용하여 증명된다. 더욱이, 이어서 1 차 아민의 결정을 위한 TNBS 어세이를 사용하여 카르바밀화하고, 그리하여 리신 및 N-말단의 완전한 카르바밀화를 보여주었다. Using this method, fully carbamylated EPO is obtained with less than 3% or preferably less than 2.5% aggregates as measured by SEC-HPLC. Complete carbamylation of eight lysine residues is demonstrated using amino acid analysis to determine converted lysine to homocyclin. Moreover, carbamylation was then performed using a TNBS assay for the determination of primary amines, thus showing complete carbamylation of lysine and the N-terminus.
또한, MALDI-TOF 를 사용한 완전한 특징화는 PNGase 처리된 단백질 및 N-글리칸이 있는 단백질 둘 다의 고유 질량에서의 변화를 결정하였다. 또한, MALDI-TOF 펩티드 질량 지문 분석/LC-MS/MS 분석은, 모든 8 개의 리신 및 N-말단이 카르바밀화되어 있음을 보여주었다. 바로 그 카르바밀화된 아미노산이 검출되었고, 글리칸의 어떠한 개질도 검출되지 않았다. 더욱이, EPO 의 과다- 및 하위-카르바밀화된 형태가 감소된 함량으로 최종 생성물 내에서 수득된다. 본 생성물은 신규이고, 청구된다.In addition, complete characterization with MALDI-TOF determined the change in intrinsic mass of both PNGase treated proteins and proteins with N-glycans. In addition, MALDI-TOF peptide mass fingerprint analysis / LC-MS / MS analysis showed that all eight lysines and N-terminus were carbamylated. The very carbamylated amino acid was detected, and no modification of the glycan was detected. Moreover, over- and sub-carbamylated forms of EPO are obtained in the final product in reduced content. The product is new and claimed.
본 발명의 한 구현예는 카르바밀화 단계 후, 그러나 음이온 교환 정제 전에 수득되는 조성물로서, 응집체 및 중합체가 약 40 중량% 미만, 또는 약 30 중량 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 12.5 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 8 중량% 미만, 또는 약 7 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO, 및 상당량의 시아네이트를 포함한다.One embodiment of the invention is a composition obtained after the carbamylation step, but before anion exchange purification, wherein the aggregates and polymers are less than about 40 weight percent, or less than about 30 weight percent, or less than about 25 weight percent, or about 20 weight Carbamylated EPO that is less than%, or less than about 15 weight percent, or less than about 12.5 weight percent, or less than about 10 weight percent, or less than about 8 weight percent, or less than about 7 weight percent, and a substantial amount of cyanate do.
본 발명의 한 추가의 구현예는 응집체 및 중합체가 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 또는 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1 중량% 미만 또는 약 0.5 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO 를 포함하는, 음이온 교환 정제 후에 수득되는 조성물이다. 추가로, 본 조성물은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 40 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 35 중량% 미만, 또는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 7.5 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만의 양으로 과다- 또는 하위-카르바밀화된 EPO 로 이루어진 이성체를 포함한다. 추가로, 상기 조성물 내의 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 35 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 7.5 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만일 수 있다.One further embodiment of the invention provides that the aggregates and polymers are less than about 3 weight percent, or less than about 2.5 weight percent, or less than about 2 weight percent, or less than about 1.5 weight percent, or less than about 1 weight percent or about 0.5 weight. A composition obtained after anion exchange purification, comprising less than% carbamylated EPO. In addition, the composition may comprise less than about 40 weight percent, or more preferably less than about 35 weight percent, or less than about 30 weight percent, or less than about 25 weight percent, or less than about 20 weight percent of total carbamylated EPO. , Or less than about 15 wt%, or less than about 10 wt%, or less than about 7.5 wt%, or less than about 5 wt%, or less than about 2 wt%, and most preferably less than about 1 wt% Or isomers consisting of sub-carbamylated EPO. In addition, the amount of over-carbamylated EPO in the composition is less than about 35 weight percent, or more preferably less than about 30 weight percent, or less than about 25 weight percent, or about 20 weight percent of total carbamylated EPO. Or less than about 15 weight percent, or less than about 10 weight percent, or less than about 7.5 weight percent, or less than about 5 weight percent, or less than about 2 weight percent, and most preferably less than about 1 weight percent. .
본 발명의 약학적 조성물Pharmaceutical Compositions of the Invention
본 발명의 한 측면은 하기 기술된 증상의 치료를 위해 인간 또는 포유류에서 사용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도이다.One aspect of the invention is the use of a compound of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for use in humans or mammals for the treatment of the conditions described below.
본 발명의 한 구현예는 응집체 및 중합체를 약 3 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 또는 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 중량% 미만의 치료적 유효량의 카르바밀화된 EPO 를 포함하는 약학적 조성물이고, 추가로, 상기 조성물은 과다- 또는 하위-카르바밀화된 EPO 의 양이 총 카르바밀화된 EPO 의 약 40 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 35 중량% 미만, 또는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만으로 이루어진 이성체를 포함한다. 추가로, 조성물 내의 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 35 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만일 수 있다.One embodiment of the invention provides less than about 3 weight percent, or more preferably less than about 2.5 weight percent, or less than about 2 weight percent, or less than about 1.5 weight percent, or less than about 1 weight percent of aggregates and polymers, and Most preferably a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of carbamylated EPO of less than about 0.5% by weight, wherein the composition further comprises a total carbamylated amount of over- or sub-carbamylated EPO. Less than about 40 weight percent, more preferably less than about 35 weight percent, or less than about 30 weight percent, or less than about 25 weight percent, or less than about 20 weight percent, or less than about 15 weight percent, or about 10 weight percent of the EPO Isomers consisting of less than, or less than about 5 weight percent, or less than about 3 weight percent, or less than about 2 weight percent and most preferably less than about 1 weight percent. In addition, the amount of over-carbamylated EPO in the composition is less than about 35 weight percent, or more preferably less than about 30 weight percent, or less than about 25 weight percent, or about 20 weight percent of total carbamylated EPO. Less than about 15 weight percent, or less than about 10 weight percent, or less than about 5 weight percent, or less than about 3 weight percent, or less than about 2 weight percent and most preferably less than about 1 weight percent.
본 발명의 한 측면의 실행에서, 본 발명의 화합물을 함유하는 상기 기술된 바와 같은 약학적 조성물은, 내피 세포벽을 가로지른 전위 (translocation) 및 반응성 세포 상에 유익한 효과를 허용하기 위해 맥관 구조에 본 발명의 화합물을 충분한 농도로 제공하는 임의의 경로에 의해 포유류에 투여가능할 수 있다. 조직 또는 기관을 관류하기 위해 사용되는 경우, 유사한 결과를 목적으로 한다. 세포 또는 조직이 비-혈관생성되어 있고/있거나 또는 본 발명의 조성물로 세포 또는 조직을 씻김으로써 투여되는 경우, 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 효과적인 반응성 세포-유익한 양으로 제공한다. 본 발명의 화합물이 가로질러 전위할 수 있는 내피 세포벽은 밀착 연접 (tight junction), 다공 연접 (perforated junction), 유창 연접 (fenestrated junction), 및 포유류에 존재하는 내피세포 벽의 임의의 다른 유형을 포함한다. 바람직한 벽은 내피세포 밀착 연접이나, 본 발명은 그런 식으로 제한하지는 않는다.In the practice of one aspect of the present invention, a pharmaceutical composition as described above containing a compound of the present invention is applied to the vasculature to allow beneficial effects on translocation and reactive cells across the endothelial cell wall. It may be administrable to a mammal by any route that provides a sufficient concentration of a compound of the invention. When used to perfuse a tissue or organ, similar results are intended. When a cell or tissue is non-angiogenic and / or administered by washing the cell or tissue with a composition of the invention, the pharmaceutical composition provides the compound of the invention in an effective reactive cell-beneficial amount. Endothelial cell walls that can be transposed across the compounds of the present invention include tight junctions, perforated junctions, fenestrated junctions, and any other type of endothelial cell wall present in mammals. do. Preferred walls are endothelial cell tight junctions, but the invention is not so limited.
본 발명의 전술된 화합물은 일반적으로 원발성 신경학적 또는 정신 증후군, 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장, 비뇨 질환 및 산과 질환, 소화기 질환 및 내분비 이상 및 대사 이상을 갖는 인간의 중추 신경계 또는 말초 신경계 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 사용된다. 특히, 상기 증상 및 질환은 예를 들어, 뇌, 심장, 또는 망막/눈과 같은 중추 신경계 조직, 말초신경계 조직, 또는 심 조직 또는 망막 조직의 흥분성 조직과 같은 흥분성 조직에 악영향을 미치는 저산소 증상을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 조건 및 환경에서 저산소 증상으로 인한 흥분성 조직에의 손상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 상기 조건 및 환경의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공된다.The above-mentioned compounds of the present invention are generally used in the central nervous system of humans with primary neurological or psychiatric syndromes, eye diseases, cardiovascular diseases, cardiopulmonary diseases, respiratory diseases, kidneys, urinary diseases and obstetric diseases, digestive diseases and endocrine abnormalities and metabolic abnormalities. Or for the therapeutic or prophylactic treatment of peripheral nervous system diseases. In particular, the symptoms and diseases include hypoxia symptoms that adversely affect excitatory tissues such as, for example, central nervous system tissues such as brain, heart, or retina / eye, peripheral nervous system tissues, or excitatory tissues of cardiac or retinal tissues. do. Thus, the compounds of the present invention can be used to treat or prevent damage to excitatory tissue due to hypoxia symptoms in a variety of conditions and environments. Non-limiting examples of such conditions and environments are provided in the table below.
본 발명에 따라 치료가능한 신경 조직 병상의 보호의 예에서, 상기 병상은 신경 조직의 감소된 산화로 인한 것들을 포함한다. 산소의 신경 조직에의 이용가능성을 감소시켜서, 스트레스, 손상, 및 마침내 신경 세포 사멸을 초래하는 임의의 증상은 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 일반적으로 저산소증 및/또는 허혈증이라고 하는, 상기 증상은 발작, 혈관 폐쇄, 태아기 또는 생후 산소 부족, 질식, 숨막힘, 익수 사고, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술 및 방사선치료를 포함하여 외상, 기절, 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄성 폐질환, 기종, 성인 호흡곤란 증후군, 저혈압 쇼크, 패혈성 쇼크, 아나플락시 쇼크, 인슐린 쇼크, 겸상 세포 발증, 심정지, 부정맥, 질소 중독, 및 심폐 바이패스 수술에 의해 야기되는 신경 결손으로부터 야기되거나 또는 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the example of the protection of a neural tissue condition treatable in accordance with the present invention, the condition includes those due to reduced oxidation of neural tissue. Any condition that reduces the availability of oxygen to neural tissue, resulting in stress, damage, and finally neuronal cell death, can be treated by the methods of the present invention. These symptoms, commonly referred to as hypoxia and / or ischemia, include trauma, fainting, epilepsy, including seizures, vascular obstruction, prenatal or postnatal oxygen deficiency, choking, choking, drowning accidents, carbon monoxide poisoning, smoke inhalation, surgery and radiotherapy Nerve caused by hypoglycemia, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, adult respiratory distress syndrome, hypotension shock, septic shock, anaflash shock, insulin shock, sickle cell development, cardiac arrest, arrhythmia, nitrogen poisoning, and cardiopulmonary bypass surgery It results from or includes, but is not limited to, a deficiency.
한 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 포함하는 특정 약학적 조성물은 종양 절제 또는 대동맥류 수술과 같은 외과 수술 동안에 상해 또는 조직 손상의 위험으로부터 야기되는 상해 또는 조직 손상을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 의해 치료가능한 저혈당증에 의해 야기되는 또는 초래되는 다른 병상에는 의원성 고인슐린혈증이라고도 하는 인슐린 과다투여, 인슐린종, 성장 호르몬 부족, 코르티솔 결핍증, 약물 과다투여, 및 특정 종양이 포함된다.In one embodiment, for example, certain pharmaceutical compositions comprising a composition of the present invention are administered to prevent injury or tissue damage resulting from the risk of injury or tissue damage during surgical operations such as tumor resection or aortic aneurysm surgery. Can be. Other conditions caused or caused by hypoglycemia treatable by the methods described herein include overdoses of insulin, also called clinic hyperinsulinemia, insulin species, growth hormone deficiency, cortisol deficiency, drug overdosing, and certain tumors do.
흥분성 신경 조직 손상으로 인한 다른 병상에는 간질, 경련, 또는 만성 발작성 질환과 같은 발작성 질환이 포함된다. 다른 치료가능한 증상 및 질환에는,발작 (허혈성 발작, 거미막하 출혈, 뇌내 출혈), 다발성 경화증, 저혈압, 심정지, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성 소아마비, 뇌 척수 외상, AIDS 치매, 인지 능력의 연령-관련 상실 (age-related loss of cognitive function), 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 발작성 질환, 알콜 중독, 망막 허혈, 녹내장으로 인한 안신경 손상, 및 신경 상실과 같은 질환이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.Other conditions caused by excitatory nerve tissue damage include seizure diseases such as epilepsy, convulsions, or chronic paroxysmal diseases. Other treatable symptoms and diseases include seizures (ischemic seizures, subarachnoid hemorrhages, intracranial hemorrhages), multiple sclerosis, hypotension, cardiac arrest, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral palsy, cerebral spinal cord trauma, AIDS dementia, age-related cognitive ability Diseases include, but are not limited to, age-related loss of cognitive function, memory loss, amyotrophic lateral sclerosis, paroxysmal disease, alcoholism, retinal ischemia, optic nerve damage due to glaucoma, and nerve loss.
본 발명의 특정 조성물 및 방법은 물리적으로 또는 화학적으로 유도된 염증과 같은 질환 증상 또는 다양한 외상으로 인한 염증을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 외상에는 맥관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 측두 동맥염, 뇌염, 뇌막염, 횡단성 척수염, 피부근육염, 다발성근육염, 괴사성 근막염, 간염, 및 괴사성 소장결장염이 포함될 수 있었다. Certain compositions and methods of the present invention can be used to treat disease symptoms such as physically or chemically induced inflammation or inflammation due to various traumas. The trauma includes vasculitis, chronic bronchitis, pancreatitis, osteomyelitis, rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, optic neuritis, temporal arthritis, encephalitis, meningitis, transverse myelitis, dermatitis, polymyositis, necrotizing fasciitis, hepatitis, and necrotizing colitis Could be included.
활성화된 성상세포가 신경독소를 생성함으로써 신경에 대해 세포독성 역할을 행사할 수 있다는 것이 증명되었다. 산화질소, 활성 산소종, 및 사이토카인은 뇌 허혈에 대해 반응하는 신경교세포로부터 방출된다 (Becker, K.J. 2001. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic Stroke. Curr Opinion Neurol 14:349-353 및 Mattson, M.P., Culmsee, C., and Yu, Z.F. 2000. Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in Stroke. Cell Tissue Res 301:173-187 참조). 연구는 추가로, 신경퇴행 모델에서, 신경교세포의 활성 및 후속한 염증성 사이토카인의 생성이 1 차 신경 손상에 의존한다고 서술하였다 (Viviani, B., Corsini, E., Galli, C.L., Padovani, A., Ciusani, E., and Marinovich, M. 2000. Dying neural cells activate glia through the release of a protease product. Glia 32:84-90 and Rabuffetti, M., Scioratti, C., Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A.A., and Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci 20:4398-4404 참조). 염증 및 신경교세포 활성은 뇌 허혈, 뇌상 및 실험 알레르기 뇌척수염, 에리스로포이에틴이 신경 보호 효과를 발휘하는 장애를 포함하여 상이한 유형의 신경 퇴행 장애에서 공통적이다. 에리스로포이에틴에 의한 사이토카인 생성의 억제는 적어도 일부 그의 보호 효과를 매개할 수 있었다. 그러나, 종양 괴사 인자 생성을 직접적으로 억제시키는 IL-10 및 IL-13 과 같은 "표준적인" 항-염증 사이토카인과는 달리, 에리스로포이에틴은 신경 사멸의 존재 하에서만 활성인 것으로 보인다.It has been demonstrated that activated astrocytes can play a cytotoxic role on nerves by producing neurotoxins. Nitric oxide, reactive oxygen species, and cytokines are released from glial cells that respond to cerebral ischemia (Becker, KJ 2001. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic Stroke.Curr Opinion Neurol 14: 349-353 and Mattson, MP, Culmsee, C., and Yu, ZF 2000. Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in Stroke.Cell Tissue Res 301: 173-187. The study further described that, in the neurodegenerative model, the activity of glial cells and the subsequent production of inflammatory cytokines depend on primary nerve damage (Viviani, B., Corsini, E., Galli, CL, Padovani, A). ., Ciusani, E., and Marinovich, M. 2000. Dying neural cells activate glia through the release of a protease product.Glia 32: 84-90 and Rabuffetti, M., Scioratti, C., Tarozzo, G., Clementi , E., Manfredi, AA, and Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci 20: 4398-4404). Inflammatory and glial cell activity is common in different types of neurodegenerative disorders, including cerebral ischemia, cerebral and experimental allergic encephalomyelitis, and disorders in which erythropoietin exerts a neuroprotective effect. Inhibition of cytokine production by erythropoietin could mediate at least some of its protective effects. However, unlike “standard” anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and IL-13 that directly inhibit tumor necrosis factor production, erythropoietin appears to be active only in the presence of neuronal death.
임의의 특별한 이론에 얽매이지 않기를 바라는 한편, 상기 항-염증 작용은 다수의 비-제한적 이론에 의해 가설적으로 설명될 수 있는 것으로 보인다. 우선, 에리스로포이에틴이 세포자멸사를 예방하기 때문에, 세포자멸사에 의해 이끌어지는 염증 작용이 예방될 것이다. 추가로, 에리스로포이에틴은 신경교세포를 자극하거나 또는 상기 생성물에 대한 그의 반응을 감소시키는 신경교세포 상에 직접 작용할 수 있는 죽어가는 뉴런으로부터의 분자 신호의 방출을 예방할 수 있다. 또다른 가능성은, 에리스로포이에틴이 세포자멸사 및 염증 둘 다를 이끄는 염증 캐스캐이드 (예를 들어, 캐스페이즈 1, 활성 산소 또는 질소 중간체) 의 더욱 가까운 원 (member) 을 표적으로 하는 것이다.While not wishing to be bound by any particular theory, it appears that the anti-inflammatory action can be hypothetically explained by a number of non-limiting theories. First, because erythropoietin prevents apoptosis, the inflammatory action induced by apoptosis will be prevented. In addition, erythropoietin can prevent the release of molecular signals from dying neurons that can act directly on glial cells to stimulate glial cells or reduce their response to the product. Another possibility is that erythropoietin targets a closer member of the inflammatory cascade (eg, caspase 1, free radicals or nitrogen intermediates) leading to both apoptosis and inflammation.
더욱이, 에리스로포이에틴은 전형적으로 덱사메타손과 같은 다른 항-염증 화합물과 연관된 반동 효과 없이 항-염증 보호를 제공하는 것으로 보인다. 다시 한번, 임의의 특별한 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 산화질소 (NO) 와 같은 다목적성 신경 독소에 대한 에리스로포이에틴의 영향으로 인할 수 있는 것으로 보인다. 활성화된 성상세포 및 미세아교세포가 다양한 외상에 대해 반응하는 NO 를 신경독소의 양으로 생성하더라도, NO 는 필수 생리학적 작용을 조정하는 것을 포함하여 신체 내에서 많은 목적을 제공한다. 따라서, 항-염증을 사용하여 NO 또는 다른 신경 독소를 억제시킴으로써 염증을 완화시킬 수 있더라도, 항-염증이 너무 긴 반감기를 갖고 있다면 항-염증은 또한 염증을 초래하는 외상으로 인한 손상을 회복시키는 상기 화학물질의 역할을 방해할 수 있다. 본 발명의 화합물은 NO 와 같은 신경독소의 회복력을 방해하면서 염증을 완화시킬 수 있다고 가정된다.Moreover, erythropoietin typically appears to provide anti-inflammatory protection without the rebound effect associated with other anti-inflammatory compounds such as dexamethasone. Once again, it appears to be due to the effect of erythropoietin on multipurpose neurotoxins such as nitric oxide (NO), hoping not to be bound by any particular theory. Although activated astrocytes and microglia produce NO in the amount of neurotoxins that respond to various traumas, NO serves many purposes in the body, including coordinating essential physiological actions. Thus, although anti-inflammatory can be used to relieve inflammation by inhibiting NO or other neurotoxins, if anti-inflammatory has too long a half-life, anti-inflammatory can also be said to restore damage due to trauma that causes inflammation. May interfere with the chemical's role. It is assumed that the compounds of the present invention can alleviate inflammation while interfering with the recovery of neurotoxins such as NO.
본 발명의 특정 조성물 및 방법은 망막 조직의 증상 및 망막 조직에의 손상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 장애에는, 망막 허혈, 황반 변성, 망막 박리, 망막 색소 변형증, 동맥경화성 망막변증, 고혈압성 망막변증, 망막 동맥 차단, 망막 정맥 차단, 저혈압, 및 당뇨병성 망막변증이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.Certain compositions and methods of the invention can be used to treat retinal tissue symptoms and damage to retinal tissue. Such disorders include, but are not limited to, retinal ischemia, macular degeneration, retinal detachment, retinitis pigmentosa, atherosclerotic retinopathy, hypertensive retinopathy, retinal artery blockage, retinal vein blockage, hypotension, and diabetic retinopathy Do not.
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 원리는 흥분성 조직에의 방사선 손상 또는 화학치료 유도성 손상으로 인한 손상을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 비제한적 예에서, 말초 신경병증을 유도하는 잠재력이 있는 탁산, 시스플라틴 및 기타 화학치료제와 같은 화합물에 의해 야기되는 손상으로부터 보호하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 추가의 유용성은 도모이산 조개 중독, 뉴로래티리즘 (neurolathyrism), 및 Guam 질환, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병과 같은 신경독소 중독의 치료에 있다.In another embodiment, the methods and principles of the present invention can be used to protect or treat damage due to radiation damage or chemotherapy induced damage to excitatory tissue. In a non-limiting example, it can be used to protect against damage caused by compounds such as taxanes, cisplatin and other chemotherapeutic agents that have the potential to induce peripheral neuropathy. Further usefulness of the methods of the present invention lies in the treatment of domoic acid clam poisoning, neurorolathyrism, and neurotoxin poisoning such as Guam disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson's disease.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물의 말초 투여에 의한 포유류에서의 흥분성 조직 기능의 증진 방법에 관한 것이다. 다양한 질환 및 증상이 상기 방법을 사용한 치료를 받을 수 있고, 추가로 상기 방법은 임의의 증상 및 질환이 없는 인지 작용의 증대에 유용하다. 본 발명의 상기 용도는 하기에 더욱 상세히 기술되고, 인간 및 비-인간 포유류 둘 다에서의 학습 및 훈련의 증대를 포함한다. As mentioned above, the present invention also relates to a method of enhancing excitatory tissue function in a mammal by peripheral administration of a compound of the present invention as described above. Various diseases and symptoms can be treated using this method, and further, the method is useful for augmenting cognitive function without any symptoms and diseases. The use of the present invention is described in more detail below and includes the augmentation of learning and training in both human and non-human mammals.
중추 신경계에 관한 본 발명의 상기 측면의 방법에 의해 치료가능한 증상 및 질환에는, 기분 장애, 분노 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 부족 항진 장애, 및 인지기능 장애가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 증상은 신경 작용의 확장으로부터 유익하다. 본 발명의 교시에 따라 치료가능한 기타 장애에는, 예를 들어, 수면 방해, 수면 무호흡증, 및 여행-관련 장애 ; 거미막하 및 동맥류성 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕, 패혈성 쇼크, 아나플락시 쇼크, 및 다양한 뇌염 및 뇌수막염의 후유증, 예를 들어, 루푸스와 같은 연골 조직 질환-관련 대뇌염(cerebritides) 이 포함된다. 기타 용도는 도모이산 조개 중독과 같은 신경독소에 의한 중독, 뉴로래틸리즘, 및 Guam 질환, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병 ; 색전성 또는 허혈성 손상에 대한 수술 후 치료 ; 전체 뇌 방사선조사 ; 겸상 세포 발증 ; 및 자간으로부터의 예방 또는 보호를 포함한다.Symptoms and diseases treatable by the method of this aspect of the present invention with respect to the central nervous system include, but are not limited to, mood disorders, anger disorders, depression, autism, attention deficit disorders, and cognitive impairment. The symptoms benefit from the expansion of nerve function. Other disorders treatable in accordance with the teachings of the present invention include, for example, sleep disturbances, sleep apnea, and travel-related disorders; Subarachnoid and aneurysm hemorrhage, hypotension shock, shaking, septic shock, anafloxi shock, and sequelae of various encephalitis and meningitis, such as cartilage tissue disease-related cerebrates such as lupus. Other uses include poisoning by neurotoxins, such as domoic clam poisoning, neurolattilism, and Guam disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease; Postoperative treatment for embolic or ischemic injury; Whole brain irradiation; Sickle cell development; And prevention or protection from tracking.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 증상의 추가의 군은 선천성 또는 후천성의 미토콘드리아 기능장애를 포함하는데, 이는 신경 손상 및 사멸에 의해 유형화되는 다양한 신경학적 질환의 원인이다. 예를 들어, Leigh 질환 (아급성 괴사성 뇌병증) 은 신경 드롭 아웃 (drop out) 으로 인한 급진적 시각 상실과 뇌병증 및 근질환을 특징으로 한다. 상기 경우에, 불완전한 미토콘드리아 대사 (defective mitochondrial metabolism) 는 흥분성 세포의 대사에 연료를 공급하기에 충분히 높은 에너지 기질을 제공하는데 실패한다. 에리스로포이에틴 수용체 작용 조정자는 다양한 미토콘드리아 질환에서의 작용을 실패하는 것을 최적화시킨다. 상기 언급된 바와 같이, 저산소 증상은 흥분성 조직에 악영향을 미친다. 흥분성 조직에는, 중추 신경계 조직, 말초 신경계 조직, 및 심 조직이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술된 증상 외에도, 본 발명의 방법은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인 호흡곤란 증후군, 숨막힘, 및 익수 사고의 치료에 유용하다. 추가로, 저산소 증상을 일으키거나 또는 다른 방법에 의해 흥분성 조직 손상을 유도하는 증상에는, 부적절한 인슐린의 투여, 또는 인슐린-생성 신생종 (인슐린종) 에서 발생할 수 있는 저혈당증이 포함된다.A further group of symptoms treatable by the methods of the present invention include congenital or acquired mitochondrial dysfunction, which is the cause of various neurological diseases that are typified by nerve damage and death. For example, Leigh disease (subacute necrotic encephalopathy) is characterized by radical vision loss due to nerve drop out and encephalopathy and myopathy. In this case, defective mitochondrial metabolism fails to provide an energy substrate high enough to fuel metabolism of excitable cells. Erythropoietin receptor action modulators optimize the failure of action in various mitochondrial diseases. As mentioned above, hypoxia symptoms adversely affect excitatory tissue. Excitatory tissues include, but are not limited to, central nervous system tissue, peripheral nervous system tissue, and cardiac tissue. In addition to the symptoms described above, the methods of the present invention are useful for the treatment of inhalation poisoning such as carbon monoxide and smoke inhalation, severe asthma, adult respiratory distress syndrome, choking, and drowning accidents. In addition, symptoms that cause hypoxic symptoms or induce excitatory tissue damage by other methods include improper administration of insulin, or hypoglycemia that can occur in insulin-producing neoplasia (insulinoma).
흥분성 조직 손상으로 인해 발생하는 것으로 믿어지는 다양한 신경정신학적 장애는 본 발명의 방법에 의해 치료가능하다. 신경 손상이 관련되고, 본 발명에 의해 치료가 제공되는 만성 장애에는 인지 기능의 연령-관련 손실 및 노인성 치매, 만성 발작성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절성 경화증, 윌슨병 대뇌 및 진핵성 핵상 마비, Guam 질환, Lewy 신체 치매, 프리온 질환, 해면성 뇌증, 예를 들어, Creutzfeldt-Jakob 질환, 헌팅턴병, 근이양증, Charcot-Marie-Tooth 질환, Freidrich's 운동실조증 및 기타 운동실조증뿐만 아니라, Gilles de la Tourette's 증후군, 간질 및 만성 발작성 질환과 같은 발작성 질환, 발작, 뇌 척수 외상, AIDS 치매, 알콜 중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면 장애와 같은 자율신경계 기능 장애, 및 정신분열증, 분열정동성 장애, 주의력 부족 장애 기능항진, 기분변조 장애, 주요 우울증, 조병, 강박 장애, 정신활성 물질 사용 장애, 분노, 공황 장애뿐만 아니라, 단극성 및 양극성 정동성 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 신경정신병적 장애를 포함하여 중추 신경계 및/또는 말초신경계 관련 장애가 포함된다. Various neuropsychiatric disorders believed to occur due to excitatory tissue damage are treatable by the methods of the invention. Chronic disorders involving nerve damage and treatment provided by the present invention include age-related loss of cognitive function and senile dementia, chronic paroxysmal disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, dementia, memory loss, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis , Nodular sclerosis, Wilson's cerebral and eukaryotic nuclear palsy, Guam disease, Lewy dementia, prion disease, spongy encephalopathy, eg Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, muscular dystrophy, Charcot-Marie-Tooth disease, Freidrich's ataxia And other ataxia, as well as seizure diseases such as Gilles de la Tourette's syndrome, epilepsy and chronic seizure disorders, seizures, cerebral spinal cord trauma, AIDS dementia, alcoholism, autism, autonomic nervous system such as retinal ischemia, glaucoma, hypertension and sleep disorders Dysfunction, and schizophrenia, schizoaffective disorder, attention deficit disorder hyperactivity, mood modulation disorder, major depression, manic, obsessive compulsive disorder, New active substance use disorders, as well as anger, panic disorder, including a single polarity, and bipolar disorder jeongdongseong including but not limited to neuropsychiatric disorders includes disorders related to the central nervous system and / or peripheral nervous system.
추가의 신경정신병적 및 신경퇴행성 장애에는 예를 들어, 그 전체가 본원에서 참조로써 인용된 [American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), the most current version, IV] 에서 언급된 것들이 포함된다.Additional neuropsychiatric and neurodegenerative disorders include, for example, those mentioned in the American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), the most current version, IV, which is hereby incorporated by reference in its entirety. do.
또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 재조합 키메라 독소 분자는 암과 같은 증식 장애, 또는 아급성 경화성 전뇌염과 같은 바이러스성 장애를 치료하기 위한 독소의 치료적 전달에 사용될 수 있다.In another embodiment, recombinant chimeric toxin molecules comprising a compound of the present invention can be used for therapeutic delivery of toxins to treat proliferative disorders such as cancer, or viral disorders such as subacute sclerotic proencephalitis.
표 1 은 본 발명의 전술된 화합물에 의한 치료를 받을 수 있는 다양한 증상 및 질환에 관한 추가의 실례의, 비-제한적 지침을 열거한다.Table 1 lists additional exemplary, non-limiting guidelines regarding various symptoms and diseases that may be treated by the aforementioned compounds of the present invention.
상기 전술된 바와 같이, 상기 질환, 장애 또는 증상은 단지 본 발명의 화합물에 의해 제공되는 이점의 범위의 예시일 뿐이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 인간 질환의 물리적 외상의 결과의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다. CNS 및/또는 말초신경계의 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 바람직하다. 정신병 치료 성분을 갖는, 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 제공된다. 안과의, 심혈관의, 심폐의, 호흡기의, 신장, 비뇨기, 산과, 소화기, 내분비, 또는 대사 성분을 갖는 것들을 포함하여, 그러나 이에 제한되지 않는 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 제공된다. As mentioned above, the disease, disorder or condition is merely illustrative of the range of benefits provided by the compounds of the present invention. Accordingly, the present invention generally provides a therapeutic or prophylactic treatment of the consequences of physical trauma in human disease. Therapeutic or prophylactic treatment of diseases, disorders or symptoms of the CNS and / or peripheral nervous system is preferred. Therapeutic or prophylactic treatment of a disease, disorder or condition is provided having a psychotic therapeutic component. Provided is a therapeutic or prophylactic treatment of a disease, disorder or condition including, but not limited to, ophthalmic, cardiovascular, cardiopulmonary, respiratory, kidney, urinary, obstetric, digestive, endocrine, or metabolic components do.
한 구현예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 상기 약학적 조성물은 표적 세포, 조직, 또는 기관을 보호 또는 증진시키기 위해 전신으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 흡입을 통해 비경구로, 또는 점막으로, 예를 들어, 경구로, 비강으로, 직장으로, 질내로, 혀밑으로, 점막내로, 또는 피내로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 예를 들어, 정맥 내 또는 복강 내 주사, 및 또한 동맥-내, 근육내, 피내, 및 피하 투여를 포함하나, 그러나 이에 제한되지 않는 비경구이다.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention may be administered systemically to protect or enhance target cells, tissues, or organs. The administration can be administered parenterally, or by inhalation, for example, orally, nasal, rectally, intravaginally, sublingually, intramucosally, or intradermally. Preferably, the administration is parenteral, including but not limited to, for example, intravenous or intraperitoneal injection, and also intraarterial, intramuscular, intradermal, and subcutaneous administration.
관류물의 사용, 기관 내로의 주입, 또는 기타 국소 투여와 같은 다른 투여 경로를 위해서는, 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물의 유사 농도를 초래하도록 제공될 것이다. 약 0.01 pM 내지 30 nM 의 농도가 바람직하다. For other routes of administration such as the use of perfusion, infusion into the trachea, or other topical administration, the pharmaceutical compositions will be provided to result in similar concentrations of the compounds of the invention as described above. A concentration of about 0.01 pM to 30 nM is preferred.
본 발명의 약학적 조성물은 치료적 유효량의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한" 은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인받거나 또는 U.S. 조제서 또는 기타 일반적으로 인정된 외국의 동물에서의 사용용, 및 더욱 특히 인간에서의 사용용 조제서에서 열거되는 것을 의미한다. 용어 "담체" 는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 말한다. 상기 약학적 담체는 물, 및 피넛 오일, 두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물유, 식물유, 또는 합성 기원의 오일을 포함하여 오일 중의 식염수와 같은 멸균액일 수 있다. 식염수는 약학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주입 용액용 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건성 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요하다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께 좌제로서 제형될 수 있다. 본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등의 유래의 것들과 같은 자유 아미노기로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유래의 것들과 같은 자유 카르복실기로 형성된 것들을 포함한다. 적합한 약학적 담체의 예에는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin] 에 기술되어 있다. 상기 조성물은 치료적 유효량의 화합물을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 함유하여, 환자에 투여하기 적절한 형태를 제공할 것이다. 제제는 투여의 형태로 적합하게 되어야 할 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention may comprise a therapeutically effective amount of a compound, and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the term “pharmaceutically acceptable” is approved by a federal or state regulatory authority or is in U.S. By encapsulation or other generally accepted foreign animal use, and more particularly in human use. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. The pharmaceutical carrier may be a sterile liquid such as saline in oil, including water and petroleum, animal oil, vegetable oil, or oils of synthetic origin, such as peanut oil, soy milk, mineral oil, sesame oil and the like. Saline is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used, in particular, as liquid carriers for infusion solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry scheme milk, glycerol, propylene, glycol, Water, ethanol and the like. If desired, the composition may also contain small amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffers. The composition may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release preparations and the like. The compositions can be formulated as suppositories with traditional binders and carriers such as triglycerides. The compounds of the present invention may be formulated in neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free amino groups such as those derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid and the like, and sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, isopropylamine, triethyl And those formed with free carboxyl groups such as those derived from amines, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers include those described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]. The composition will contain a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier to provide a form suitable for administration to a patient. The formulation will have to be adapted in the form of administration.
경구 투여에 적합하게 된 약학적 조성물은 캡슐 또는 정제로서 ; 분말 또는 과립으로서 ; 용액, 시럽 또는 현탁액 (수성 또는 비-수성 액체 중) 으로서 ; 먹을 수 있는 형태 또는 휩 (whip) 으로서 ; 또는 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경성 젤라틴 캡슐은 락토스, 전분 또는 그의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연성 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 준-고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.Pharmaceutical compositions adapted for oral administration include capsules or tablets; As a powder or granules; As a solution, syrup or suspension (in aqueous or non-aqueous liquid); As an edible form or whip; Or as an emulsion. Tablets or hard gelatin capsules may include lactose, starch or derivatives thereof, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, stearic acid or salts thereof. Soft gelatin capsules may include vegetable oils, waxes, fats, semi-solids, liquid polyols, and the like. Solutions and syrups may include water, polyols and sugars.
경구 투여용으로 고안된 활성제는 위장관로에서 활성제의 분해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질 (예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있음) 로 코팅되거나 또는 그러한 물질과 혼합될 수 있다. 따라서, 서방성 활성제는 많은 시간에 걸쳐 달성될 수 있고, 필요하다면, 활성제는 위에서 분해되는 것으로부터 보호될 수 있다. 경구 투여용 약학적 조성물은 특정 pH 또는 효소적 증상으로 인해 특정 위장관 위치에서 활성제의 방출을 용이하게 하도록 제형될 수 있다.Active agents designed for oral administration are coated with or mixed with a substance that delays the degradation and / or absorption of the active agent in the gastrointestinal tract (eg, glyceryl monostearate or glyceryl distearate may be used). Can be. Thus, sustained release actives can be achieved over many hours and, if necessary, the actives can be protected from degradation in the stomach. Pharmaceutical compositions for oral administration may be formulated to facilitate release of the active agent at specific gastrointestinal tract locations due to certain pH or enzymatic symptoms.
경피 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 연장된 기간 동안에 수여자의 외피와 직접 접촉하도록 고안된 개별 패치로서 제공될 수 있다. 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 젤, 스프레이, 아에로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 기타 외부 조직에의 국소 투여를 위해, 국소 연고 또는 크림이 바람직하게 사용된다. 연고로 제형되는 경우, 활성 성분은 파라핀계 또는 물-혼화성 연고 베이스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수-중-유 베이스 또는 유-중-수 베이스와 함께 크림으로 제형될 수 있다. 눈에의 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 점안액을 포함한다. 상기 조성물에서, 활성 성분은 적합한 담체, 예를 들어, 수성 용매 내에서 용해 또는 현탁될 수 있다. 입에의 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 론제지, 향정, 및 구강세척액을 포함한다. Pharmaceutical compositions adapted for transdermal administration may be presented as individual patches designed to be in direct contact with the recipient's envelope for an extended period of time. Pharmaceutical compositions adapted for topical administration may be provided as ointments, creams, lotions, powders, solutions, pastes, gels, sprays, aerosols or oils. For topical administration to the skin, mouth, eyes or other external tissues, topical ointments or creams are preferably used. When formulated in an ointment, the active ingredient can be used with paraffinic or water-miscible ointment bases. Alternatively, the active ingredient may be formulated as a cream with an oil-in-water base or an oil-in-water base. Pharmaceutical compositions adapted for topical administration to the eye include eye drops. In such compositions, the active ingredient may be dissolved or suspended in a suitable carrier such as an aqueous solvent. Pharmaceutical compositions adapted for topical administration to the mouth include long papers, pastilles, and mouthwashes.
비내 및 폐 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 분말 (바람직하게는 입자 크기의 범위가 20 내지 500 마이크론 범위인 분말) 과 같은 고체 담체를 포함한다. 분말은 코담배가 취해지는 방식, 즉, 코에 가깝게 위치한 분말의 용기로부터 코를 통한 급속 흡입에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 비내 투여용으로 적합하게 된 조성물은 액체 담체, 예를 들어, 비내 스프레이 또는 비점액을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폐에의 직접적인 흡입은 깊게 흡입 또는 입에 대는 부분을 통한 인두중앙부에의 설비 (installation) 에 의해 달성될 수 있다. 상기 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성액을 포함할 수 있다. 흡입에 의해 투여되는 조성물은 활성 성분의 예정된 투여량을 제공하도록 구축될 수 있는 가압 아에로졸, 흡입기 또는 취입기를 포함하나 이에 제한되지 않는, 특별히 적합하게 된 장치로 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비강으로 직접 또는 비내 또는 인두중앙부를 통해 폐로 투여된다.Pharmaceutical compositions adapted for intranasal and pulmonary administration include solid carriers such as powders (preferably powders having a particle size in the range of 20 to 500 microns). The powder may be administered by way of rapid inhalation through the nose from the way the snuff is taken, ie from a container of powder located close to the nose. Alternatively, a composition adapted for intranasal administration may comprise a liquid carrier such as an intranasal spray or nasal mucus. Alternatively, direct inhalation into the lung can be achieved by installation in the central pharynx through deep inhalation or mouth-to-mouth sections. The composition may comprise an aqueous or oily solution of the active ingredient. Compositions administered by inhalation may be provided in specially adapted devices, including but not limited to pressurized aerosols, inhalers or inhalers, which may be constructed to provide a predetermined dosage of the active ingredient. In a preferred embodiment, the pharmaceutical compositions of the present invention are administered to the lungs either directly into the nasal cavity or through the nasal or central pharynx.
직장 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공될 수 있다. 질 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제로서 제공될 수 있다.Pharmaceutical compositions adapted for rectal administration may be presented as suppositories or enemas. Pharmaceutical compositions adapted for vaginal administration may be presented as pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or spray formulations.
비경구 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은, 조성물을 원하는 수여자의 혈액으로 실질적으로 등장성이게 하는 항산화제, 완충액, 세균발육저지제, 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 조성물에 존재할 수 있는 기타 성분은 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물유를 포함한다. 비경구 투여용으로 적합하게 된 조성물은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단일-투여 또는 다중-투여 용기 내에 존재할 수 있고, 사용 직전 멸균 주사용 식염수와 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된 (동결건조된) 조건 하에 보관될 수 있다. 임시 주입 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 화합물의 주사용액을 포함하는 자동주입기가 앰뷸런스, 응급실, 및 전쟁 상황에 의한 긴박한 용도를 위해 제공될 수 있고, 가정생활에서, 특히 잔디깎이 기계의 무분별한 사용에 의한 것과 같은 외상의 절단의 가능성이 일어날 수 있는 가정생활 중에서 자가-투여용으로 조차 제공될 수 있다. 상태가 심각한 발 또는 발가락의 세포 및 조직이 재결합 후에 살아남을 가능성은, 의료진이 위치에 도달하기 전, 또는 상태가 심각한 발을 가지고 고민하는 개인이 응급실에 도달하기 전일지라도, 실행가능한 한 빨리, 상태가 심각한 부분 중 여러 부위에 본 발명의 화합물을 투여함으로써 증가될 수 있다.Pharmaceutical compositions adapted for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterilization which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, and solutes that substantially make the composition isotonic in the blood of a desired recipient. Injections or suspensions. Other components that may be present in the composition include, for example, water, alcohols, polyols, glycerin and vegetable oils. Compositions adapted for parenteral administration may be present in single- or multi-dose containers, such as, for example, sealed ampoules and vials, and require only the addition of a sterile liquid carrier such as sterile injectable saline immediately before use. Can be stored under freeze-dried (freeze-dried) conditions. Temporary infusion solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets. In one embodiment, an autoinjector comprising an injectable solution of a compound of the invention may be provided for urgent use by ambulances, emergency rooms, and war situations, and at home, in particular by indiscriminate use of lawn mowers. It can even be provided for self-administration in family life where the possibility of amputation of the same trauma may occur. The likelihood that cells and tissues of a severe foot or toe survive after recombination is as soon as practicable, even before the medical staff has reached the position or before an individual suffering from a severe foot has reached the emergency room. Can be increased by administering a compound of the invention to several of the more serious areas.
바람직한 구현예에서, 조성물은 인간에 정맥 내 투여하기에 적합하게 된 약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제형된다. 전형적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 주입 위치의 통증을 완화시키기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제 및 용해제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어, 활성제의 양을 지시하는 앰플 또는 샤켓과 같은 건성 동결건조된 분말 또는 물-없는 농축물로서 밀봉-포장된 용기 내에서 단일 투여량 형태로 분리해서 또는 함께 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 조제될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 식염수의 앰플은 활성 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.In a preferred embodiment, the composition is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans. Typically, the composition for intravenous administration is sterile isotonic aqueous buffer. If desired, the composition may also include a local anesthetic such as lidocaine and a dissolving agent to relieve pain at the infusion site. In general, the components are provided separately or together in a single dosage form in a sealed-packed container as a dry lyophilized powder or water-free concentrate, such as, for example, an ampoule or a stool indicating the amount of the active agent. . When the composition is administered by infusion, it may be formulated into an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, ampoules of sterile saline may be provided such that the active ingredient can be mixed prior to administration.
좌제는 일반적으로 0.5 중량% 내지 10 중량% 의 범위 내에서 활성 성분을 함유하고 ; 경구 제제는 바람직하게는 활성 성분을 10% 내지 95% 로 함유한다.Suppositories generally contain the active ingredient in the range of 0.5% to 10% by weight; Oral formulations preferably contain from 10% to 95% active ingredient.
관류 조성물은 이식된 기관 배스에 사용하기 위해, 그 자리에서의 관류를 위해, 또는 기관 수합 전에 기관 공여자의 맥관 구조에 투여하기 위해 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개인에의 급성 또는 만성, 국소 또는 전신 투여용에 적합하지 않은 농도의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있으나, 처리된 기관 또는 조직을 일반적인 순환에 노출시키거나 또는 되돌려 보내기 전에 거기에 함유된 본 발명의 화합물의 농도를 제거 또는 감소시키기 전에 시체, 기관 배스, 기관 관류물, 또는 그 자리에서의 관류물 내에서 본원에서 의도된 작용을 제공할 것이다.Perfusion compositions may be provided for use in an implanted organ bath, for in-situ perfusion, or for administration to an organ donor's vasculature prior to organ harvest. The pharmaceutical composition may comprise a compound of the invention at a concentration not suitable for acute or chronic, topical or systemic administration to an individual, but prior to exposing or returning the treated organ or tissue to the general circulation. It will provide the intended action herein in the body, organ bath, organ perfusion, or in situ perfusate before removing or reducing the concentration of a compound of the present invention contained therein.
본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 용기(들)와 임의로 관련된 것은 인간 투여용으로서의 제조, 용도, 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영하는, 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 주의일 수 있다.The invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical compositions of the invention. Optionally associated with the container (s) may be in the form prescribed by a government agency regulating the manufacture, use, or sale of a pharmaceutical or biological product, reflecting approval by the agency of manufacture, use, or sale for human administration. It can be attention.
또다른 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 화합물은 서방성계에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 정맥 내 주입, 이식가능한 삼투성 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 기타 투여 형태를 사용하여 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또다른 구현예에서, 화합물은 비히클, 특히 리포좀에서 전달될 수 있다 (Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; U.S. Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid ., pp. 317-327; see generally ibid . 참조). 또다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953 참조 ; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조).In another embodiment, for example, the compounds of the present invention can be delivered in a sustained release system. For example, the polypeptide can be administered using intravenous infusion, implantable osmotic pumps, transdermal patches, liposomes, or other dosage forms. In one embodiment, pumps may be used (Langer, supra ; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et. al ., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al ., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). In another embodiment, the compound may be delivered in a vehicle, in particular liposomes (Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al ., in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; US Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid ., Pp. 317-327; see generally ibid . Reference). In another embodiment, polymeric materials can be used (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; see also Levy et. al ., 1985, Science 228: 190; During et al ., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al ., 1989, J. Neurosurg. 71: 105).
더욱 또다른 구현예에서, 서방성계는 치료적 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관에 근접해서 위치할 수 있고, 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, pp. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984 참조). 기타 서방성계는 Langer 에 의한 리뷰에서 토의되어 있다 (1990, Science 249:1527-1533).In yet another embodiment, the sustained release system can be located in close proximity to a therapeutic target, i.e., a target cell, tissue or organ, and therefore only requires a portion of the systemic dosage ( eg, Goodson, pp. 115-). 138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra , 1984). Other sustained-release systems are discussed in a review by Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적절하게 제형되어서, 비내, 경구, 직장, 질, 또는 혀밑 투여에 의해 투여될 수 있다.In another embodiment, the compounds of the present invention may be suitably formulated and administered by intranasal, oral, rectal, vaginal, or sublingual administration.
특정 구현예에서, 치료가 필요한 영역에 국소적으로 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있으며 ; 이는 예를 들어, 제한 없이, 수술 동안의 국소 주입, 예를 들어, 수술 후 상처 부위의 드레싱과 함께 국소 적용, 카테터, 좌제, 또는 이식체를 사용한 주입에 의해 수행될 수 있으며, 상기 이식체는 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함하여, 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질로 되어 있다.In certain embodiments, it may be desirable to administer the compositions of the invention locally to the area in need of treatment; This can be done, for example, without limitation, by topical infusion during surgery, for example by topical application, with a catheter, suppository, or implant with the dressing of the wound site after surgery, wherein the implant is It is made of a porous, non-porous, or gelatinous material, including a membrane, such as a plastic membrane, or a fiber.
바람직한 유효 투여량의 선택은 당업자에게 공지될 다양한 요소를 고려하는 것을 바탕으로 숙련된 기술자에 의해 결정될 것이다. 상기 요소는 본 발명의 화합물의 특별한 형태, 및 생체이용율, 대사성, 반감기 등과 같은 그의 약동학적 변수를 포함하고, 이는 약학적 화합물의 규제적 승인을 수득하는데 전형적으로 사용되는 통상의 개발 과정 동안에 구축되었을 것이다. 투여량을 고려하는 추가의 요소는 치료되는 증상 또는 질환 또는 정상인에서 달성되는 이점, 환자의 몸 질량, 투여 경로, 투여가 급성 또는 만성이든간에, 동시수반의 약제, 및 투여되는 약학적 제제의 효능에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있는 기타 요소를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 주치의의 판단 및 각 환자의 상태, 예를 들어 개별 환자의 증상 및 면역 상태에 따라, 그리고 표준 임상 기술에 따라 결정되어야 할 것이다.Selection of the preferred effective dosage will be determined by the skilled artisan based on consideration of various factors that will be known to those skilled in the art. Such elements include particular forms of the compounds of the present invention and their pharmacokinetic variables such as bioavailability, metabolism, half-life, etc., which may have been established during conventional development processes typically used to obtain regulatory approval of pharmaceutical compounds. will be. Additional factors to consider dosage include the benefits achieved in the symptom or disease or normal person being treated, the body mass of the patient, the route of administration, the concurrent medication, and the efficacy of the pharmaceutical agent administered, whether the administration is acute or chronic. Includes other factors that are well known to affect Therefore, the exact dosage will have to be determined according to the judgment of the attending physician and the condition of each patient, e.
본 발명의 또다른 측면에서, 관류물 또는 관류액은 이식용 기관의 관류 및 저장을 위해 제공되고, 관류액은 반응성 세포 및 관련 세포, 조직, 또는 기관을 보호하기에 유효한, 본 발명의 화합물 상당량을 포함한다. 이식은, 기관 (세포, 조직 또는 기타 신체 부분을 포함) 을 한 공여자로부터 수합하고, 그것을 다른 수여자에게 이식하는 이종 기관 이식 ; 및 벤치 수술 과정을 포함하여, 기관을 한 신체의 한 일부에서 취하고, 그것을 또다른 부분에 되돌리는 동종 기관 이식 (기관이 제거될 수 있고, 한편 생체 외에서 종양 제거와 같은 절단, 복구 또는 그렇지 않다면 증식되고, 그런 다음 원래의 위치에 되돌리는 것) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 관류액은 에리스로포이에틴 약 1 내지 약 25 U/ml, 5% 히드록시에틸 전분 (분자량이 약 200,000 내지 약 300,000 이고, 실질적으로 에틸렌 글리콜, 에틸렌 클로로히드린, 염화나트륨 및 아세톤이 없음) ; 25mM KH2PO4 ; 3mM 글루타티온 ; 5mM 아데노신 ; 10mM 글루코스 ; 10mM HEPES 완충액 ; 5mM 마그네슘 글루코네이트 ; 1.5mM CaCl2 ; 105mM 나트륨 글루코네이트 ; 200,000 유닛 페니실린 ; 40 유닛 인슐린 ; 16mg 덱사메타손 ; 12mg 페놀 레드를 함유하고 ; pH 가 7.4-7.5 이고, 삼투성이 약 320 mOSm/l 인 University of Wisconsin (UW) 용액 (U.S. Patent No. 4,798,824) 이다. 상기 용액은 이식 전에 시체의 신장 및 췌장을 유지시키는데 사용된다. 상기 용액을 사용하여, 시체의 신장 보존 동안에 권고되는 30-시간 제한을 넘어서서 연장 보존할 수 있다. 이러한 특별한 관류물은 단지 본 발명의 화합물의 유효량을 포함하여 본 사용에 적합하게 될 수 있는 수많은 그러한 용액의 예시일 뿐이다. 추가의 구현예에서, 관류물 용액은 본 발명의 화합물 약 0.01 pg/ml 내지 약 400 ng/ml 또는 본 발명의 화합물 약 40 내지 약 300 ng/ml 을 함유할 수 있다. In another aspect of the invention, a perfusate or perfusate is provided for perfusion and storage of an organ for transplantation, the perfusate being a substantial amount of a compound of the invention effective to protect reactive cells and related cells, tissues, or organs It includes. Transplantation is a heterogeneous organ transplantation that collects organs (including cells, tissues, or other body parts) from a donor and transplants them to another recipient; And allogeneic organ transplantation (tracheal can be removed, while cutting, repairing or otherwise proliferating, such as tumor removal in vitro, taking the organ in one part of the body and returning it to another part, including a bench surgical procedure) And then return to its original position). In one embodiment, the perfusate is erythropoietin about 1 to about 25 U / ml, 5% hydroxyethyl starch (molecular weight is about 200,000 to about 300,000, substantially free of ethylene glycol, ethylene chlorohydrin, sodium chloride and acetone) ; 25mM KH 2 PO 4 ; 3 mM glutathione; 5 mM adenosine; 10 mM glucose; 10 mM HEPES buffer; 5 mM magnesium gluconate; 1.5 mM CaCl 2 ; 105 mM sodium gluconate; 200,000 units penicillin; 40 unit insulin; 16 mg dexamethasone; Contains 12 mg phenol red; University of Wisconsin (UW) solution (US Patent No. 4,798,824) having a pH of 7.4-7.5 and an osmoticity of about 320 mOSm / l. The solution is used to maintain the kidneys and pancreas of the body prior to transplantation. The solution can be used to extend preservation beyond the 30-hour limit recommended during renal preservation of the body. This particular perfusion is merely illustrative of a number of such solutions that may be suitable for this use, including effective amounts of the compounds of the present invention. In further embodiments, the perfusion solution may contain about 0.01 pg / ml to about 400 ng / ml of the compound of the present invention or about 40 to about 300 ng / ml of the compound of the present invention.
본원 전체를 통해서 목적을 위한 본 발명의 화합물의 바람직한 수여자가 인간인 한편, 본원의 방법은 다른 포유류, 특히 가축, 가축류, 애완동물 및 동물원 동물에도 동등하게 적용한다. 그러나, 본 발명은 그렇게 제한하려는 것은 아니고, 유리한 점은 임의의 동물에 적용될 수 있다.While the preferred recipients of the compounds of the present invention for purposes throughout this application are humans, the methods herein apply equally to other mammals, particularly livestock, livestock, pets and zoo animals. However, the present invention is not intended to be so limited, and the advantage may be applied to any animal.
본 발명의 화합물의 Of the compounds of the present invention 치료적Therapeutic 및 And 예방적Preventive 용도 Usage
하기 실시예 1 에서 주지한 바와 같이, 인간 뇌의 모세혈관 내피세포 내에 에리스로포이에틴 수용체가 존재한다는 것은, 본 발명의 화합물의 표적이 인간 뇌에 존재하고, 본 발명의 상기 화합물에 대한 동물 연구가 직접적으로 인간의 치료 또는 예방에 옮겨질 수 있음을 지시한다.As noted in Example 1 below, the presence of the erythropoietin receptor in the capillary endothelial cells of the human brain indicates that the target of the compound of the present invention is present in the human brain, and animal studies of the compound of the present invention directly Indicates that it can be transferred to the treatment or prevention of humans.
본 발명의 또다른 측면에서, 내피세포 벽에 의해 맥관 구조로부터 단리되지 않는 세포, 조직, 또는 기관의 생존율을 증진시키기 위한 방법 및 조성물은 세포, 조직, 또는 기관을 직접 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 노출시킴으로써, 또는 조직 또는 기관의 맥관 구조에 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 투여 또는 접촉시킴으로써 제공된다. 처리된 조직 또는 기관 내의 반응성 세포의 증진된 작용은 발휘되는 긍정적 효과에 기여한다.In another aspect of the invention, methods and compositions for enhancing the survival of cells, tissues, or organs that are not isolated from the vasculature by the endothelial cell wall directly comprise the compounds of the invention. By exposure to a pharmaceutical composition or by administering or contacting a pharmaceutical composition containing a compound of the invention to the vasculature of a tissue or organ. The enhanced action of reactive cells in treated tissues or organs contributes to the positive effects exerted.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 일부, 에리스로포이에틴 분자가 뇌, 망막 및 고환을 포함하여 내피 세포 밀착 연접이 있는 기관의 모세혈관의 내피 세포의 관강 표면으로부터 기저막 표면으로 수송될 수 있다는 발견을 바탕으로 한다. 따라서, 벽을 가로지르는 반응성 세포는 본 발명의 화합물의 유익한 효과를 위한 표적이 되기 쉽고, 거기에 반응성 세포 상에서 전부 또는 일부 함유하고 의존하는 다른 세포 유형 또는 조직 또는 기관은 본 발명의 방법의 표적이다. 임의의 특별한 이론에 구애받지 않는 한편, 본 발명의 화합물의 트랜스사이토시스 후에, 본 발명의 화합물은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세혈관 내피세포, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부, 또는 자궁내 세포와 같은 반응성 세포 상에서 에리스로포이에틴 수용체를 방해할 수 있고, 수용체 결합은 반응성 세포 또는 조직 내에서 유전자 발현 프로그램의 활성화를 초래하고, 세포 또는 조직 또는 기관을 독소, 화학치료제, 방사선 치료, 저산소증 등과 같은 손상으로부터 보호하는 것을 초래하는 신호 전달 캐스캐이드를 개시할 수 있다. 따라서, 반응성 세포-함유 조직을 상해 또는 저산소성 스트레스로부터 보호하고, 상기 조직의 기능을 증진시키는 방법은 본원 하기에서 상세히 기술된다. 상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 방법은 인간뿐만 아니라, 기타 동물에 동등하게 적용가능하다.As described above, the present invention is based on the discovery that some erythropoietin molecules can be transported from the lumen surface of the endothelial cells of capillaries of organs with endothelial cell tight junctions, including the brain, retina and testes, to the basal membrane surface. do. Thus, reactive cells across the wall are likely to be targets for the beneficial effects of the compounds of the invention, where other cell types or tissues or organs containing and relying in whole or in part on the reactive cells are targets of the methods of the invention. . Without wishing to be bound by any particular theory, after transcytosis of the compounds of the invention, the compounds of the invention may be found in the nerves, retina, muscle, heart, lung, liver, kidney, small intestine, adrenal cortex, adrenal medulla, capillary endothelium. May interfere with erythropoietin receptors on reactive cells such as cells, testes, ovaries, pancreas, bone, skin, or intrauterine cells, and receptor binding results in activation of gene expression programs within the reactive cells or tissues, and Or a signal transduction cascade that results in protecting the organ from damage such as toxins, chemotherapeutic agents, radiation therapy, hypoxia, and the like. Thus, methods of protecting reactive cell-containing tissues from injury or hypoxic stress and enhancing their function are described in detail herein below. As noted above, the methods of the present invention are equally applicable to humans as well as other animals.
본 발명의 한 구현예의 실행에서, 포유류 환자는 신경, 폐, 심장, 난소 또는 전립선 손상과 같은 부작용을 공통적으로 갖는 방사선 치료를 포함한 암 치료를 위한 전신 화학치료를 받는다. 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 투여는 화학치료 및/또는 방사선 치료 전 또는 동안에 수행되어, 고환을 보호하는 것과 같이, 화학치료제에 의한 손상으로부터 다양한 조직 및 기관을 보호한다. 치료는 화학치료제의 순환 수준이 포유류의 몸에 잠재적인 위험을 주는 수준 미만으로 떨어질 때까지 계속될 수 있다.In practicing one embodiment of the present invention, a mammalian patient receives systemic chemotherapy for cancer treatment, including radiation therapy, which has in common side effects such as nerve, lung, heart, ovary or prostate damage. Administration of a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention as described above is performed before or during chemotherapy and / or radiation therapy to protect various tissues and organs from damage by the chemotherapeutic agent, such as to protect the testicles. do. Treatment may continue until the circulating level of the chemotherapeutic agent drops below a level that poses a potential risk to the mammal's body.
본 발명의 또다른 구현예의 실행에서, 다양한 기관이 자동차 사고의 희생자로부터 수합되어 수많은 수여자에게 이식되도록 계획되었으며, 그 중 일부는 연장된 거리 및 기간 동안의 수송이 필요하였다. 기관 수합 전에, 희생자에게 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 주입하였다. 승선되는 수합된 기관을 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 함유하는 관류물로 관류시키고, 본 발명의 화합물을 포함하는 배스 내에서 보관하였다. 특정 기관은 박동성 관류 장치로 지속해서 관류시켜서, 본 발명에 따른 본 발명의 화합물을 함유하는 관류물을 사용하였다. 기관 기능의 최소의 저하가 수송 동안에 그리고 그 자리에서의 기관의 이식 및 재관류 시에 발생하였다.In the practice of another embodiment of the present invention, various agencies have been planned to be collected from victims of motor vehicle accidents and implanted into numerous recipients, some of which required transportation over extended distances and periods. Prior to organ harvesting, the victim was infused with a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention as described herein. The embarked harvested organ was perfused with a perfusion containing the compound of the present invention as described herein and stored in a bath containing the compound of the present invention. Certain organs were continuously perfused with a pulsatile perfusion device, using a perfusion containing the compound of the present invention according to the present invention. Minimal degradation of organ function occurred during transport and upon transplantation and reperfusion of organs in situ.
본 발명의 또다른 구현예에서, 심장 판막을 복구하기 위한 외과 수술 과정은 일시적인 심정지 및 동맥 폐색을 필요로 하였다. 수술 전에, 환자에 체중 Kg 당 본 발명의 화합물 4 ㎍ 으로 주입하였다. 상기 처치는 특히 재관류 후의 저산소성 허혈성 세포 손상을 예방하였다.In another embodiment of the present invention, surgical procedures for repairing the heart valves required temporary cardiac arrest and arterial occlusion. Prior to surgery, patients were injected with 4 μg of compounds of the invention per Kg body weight. This treatment particularly prevented hypoxic ischemic cell damage after reperfusion.
본 발명의 또다른 구현예에서, 심폐 바이패스 수술에서와 같이 임의의 외과 수술 과정에서, 본 발명의 화합물이 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 투여를 뇌, 심장 및 기타 기관의 기능을 보호하기 위해, 바이패스 수술 전, 동안 및/또는 후에 수행한다. In another embodiment of the invention, the compounds of the invention may be used in any surgical procedure, such as in cardiopulmonary bypass surgery. In one embodiment, administration of the pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention as described above is performed before, during and / or after bypass surgery to protect the function of the brain, heart and other organs.
본 발명의 화합물을 생체 외 적용에 사용하거나, 또는 신경 조직, 망막 조직, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세 혈관 내피세포, 고환, 난소 또는 자궁내 세포와 같은 반응성 세포 또는 조직을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명은 투여량 단위 당 본 발명의 화합물 약 0.01 pg 내지 5 mg, 1 pg 내지 5 mg, 500 pg 내지 5 mg, 1 ng 내지 5 mg, 500 ng 내지 5 mg, 1 ㎍ 내지 to 5 mg, 500 ㎍ 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 5 mg 범위 내의 유효적 비-독성 양으로 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 맥관 구조와 떨어져 있는 반응성 세포, 조직 또는 기관의 보호 또는 증진에 적합하도록 된 투여량 단위 형태 내에서 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물의 양은 약 1 ng 내지 5 mg 의 범위 내이다.Use of the compounds of the invention for in vitro application or reactivity such as neural tissue, retinal tissue, heart, lung, liver, kidney, small intestine, adrenal cortex, adrenal medulla, capillary endothelial cells, testes, ovaries or intrauterine cells When used to treat cells or tissues, the present invention provides about 0.01 pg to 5 mg, 1 pg to 5 mg, 500 pg to 5 mg, 1 ng to 5 mg, 500 ng to per compound of the present invention per dosage unit. Reactive cells apart from the vasculature, including effective non-toxic amounts within the range of 5 mg, 1 μg to 5 mg, 500 μg to 5 mg, or 1 mg to 5 mg and comprising a pharmaceutically acceptable carrier Pharmaceutical compositions are provided in dosage unit forms adapted for the protection or enhancement of tissues or organs. In a preferred embodiment, the amount of the compound of the present invention is in the range of about 1 ng to 5 mg.
본 발명의 추가의 측면에서, EPO 투여는 뇌 외상을 겪은 동물에 인지 기능을 복구시키는 것으로 발견되었다. 본 발명의 화합물은 EPO 로서 동일한 세포 보호 효과를 갖는 것으로 기대될 것이다. 5 일 또는 30 일의 지연 후에, EPO 는 여전히 샴-처리된 동물과 비교해 기능을 복구할 수 있었으며, 이는 뇌 기능을 재생 또는 복구시키는 EPO 의 능력을 지시한다. 따라서, 본 발명은 또한 상해 후에 잘 치료하는 것을 포함하여 (예를 들어, 3 일, 5 일, 1 주, 1 달 또는 더 길게), 뇌 외상 및 기타 인지기능 장애의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 화합물의 투여에 의한 상해 후 인지기능 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 화합물은 본 발명의 이러한 측면에 사용될 수 있다.In a further aspect of the invention, EPO administration has been found to restore cognitive function in animals suffering from brain trauma. The compounds of the present invention will be expected to have the same cytoprotective effect as EPO. After a delay of 5 or 30 days, EPO could still restore function compared to sham-treated animals, indicating the ability of EPO to regenerate or restore brain function. Accordingly, the present invention also provides for the use of pharmaceutical compositions for the treatment of brain trauma and other cognitive impairments, including well treated after injury (eg, 3 days, 5 days, 1 week, 1 month or longer). It relates to the use of the compounds of the invention for the preparation. The invention also relates to a method of treating cognitive impairment after injury by administration of an effective amount of a compound of the invention. Any compound of the invention as described herein can be used in this aspect of the invention.
더욱이, 본 발명의 이러한 회복 측면은 세포, 조직 또는 기관 이상의 회복용 약학적 조성물의 제조를 위한 본원 발명의 화합물 중 임의의 것의 용도에 관한 것이며, 여기서 치료는 이상을 초래하는 최초의 손상 후에 개시된다. 더욱이, 본 발명의 화합물을 사용한 치료는 급성 기 (phase) 뿐만 아니라 만성 기 동안에 질환 또는 증상의 경과를 파악할 수 있다.Moreover, this recovery aspect of the present invention relates to the use of any of the compounds of the present invention for the preparation of a pharmaceutical composition for repair of a cell, tissue or organ abnormality, wherein the treatment is initiated after the first injury causing the abnormality. . Moreover, treatment with the compounds of the present invention can determine the course of a disease or condition during the acute phase as well as during the chronic phase.
화합물이 적혈구 생성 작용을 갖는 경우에, 화합물은 투여 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍/kg (체중), 바람직하게는 약 5 ㎍ 내지 약 50 ㎍/kg (체중), 가장 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 약 30 ㎍/kg (체중) 의 투여량으로 전신 투여될 수 있다. 상기 유효 투여량은 화합물의 혈청 농도를 화합물 투여 후 약 10,000, 15,000, 또는 20,000 mU/ml (혈청) 보다 더 크게 달성되게 하기에 충분해야 할 것이다. 상기 혈청 농도는 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 시간째에 달성될 수 있다. 상기 투여량은 필요한 만큼 반복될 수 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요한 한 오랫동안, 매일, 또는 적절한 간격 후에, 예를들어 매 1 내지 12 주, 그러나 바람직하게는 매 1 내지 3 주째에 투여가 반복될 수 있다. 유효량의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체는 단일 투여량 바이알 또는 기타 용기에 담아질 수 있다. 그러나, 본 발명의 화합물은 비적혈구 생성인데, 즉 헤모글로빈 농도 또는 헤마토크리트 (hematocrit) 에서의 증가를 야기하지 않으면서 본원에서 기술된 활성을 부여할 수 있다. 상기 비-적혈구 생성 화합물은 본 발명의 방법이 만성적으로 제공되게 된 경우에 특히 바람직하다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적혈구 생성을 최대로 자극시키는데 필요할 자연적 에리스로포이에틴의 상응하는 투여량 (W/W) 의 것보다 더 큰 투여량으로 제공된다. 상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 적혈구 생성 작용을 갖지 않고, 따라서 단위로 표현되는 상기 투여량은 단지 자연적 에리스로포이에틴의 상응하는 양에 대한 실례일 뿐이며 ; 본원에서 투여량에 대한 상기 몰 당량은 본 발명의 임의의 화합물에 적용가능하게 제공된다.If the compound has an erythropoietic action, the compound may contain about 1 μg to about 100 μg / kg body weight, preferably about 5 μg to about 50 μg / kg body weight, and most preferably about 10 μg per dose. Systemically at a dosage of from about 30 μg / kg body weight. The effective dosage will have to be sufficient to achieve a serum concentration of the compound greater than about 10,000, 15,000, or 20,000 mU / ml (serum) after administration of the compound. The serum concentration may be achieved about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 hours after administration. The dosage can be repeated as necessary. For example, administration may be repeated for as long as clinically necessary, daily, or after appropriate intervals, for example every 1 to 12 weeks, but preferably every 1 to 3 weeks. Effective amounts of compounds and pharmaceutically acceptable carriers may be contained in single dose vials or other containers. However, the compounds of the present invention can impart activity described herein without causing erythropoiesis, ie without causing an increase in hemoglobin concentration or hematocrit. Such non-erythropoietic compounds are particularly preferred when the methods of the invention are to be provided chronically. In another embodiment, the compounds of the present invention are provided at a higher dosage than that of the corresponding dose (W / W) of natural erythropoietin required to maximize stimulation of erythropoiesis. As noted above, the compounds of the present invention have no erythropoietic action, and thus the dosages expressed in units are merely illustrative of the corresponding amounts of natural erythropoietin; The molar equivalents to the dosages herein are provided as applicable to any compound of the invention.
본 발명은 본 발명의 실례로서 제공되는 하기 비-제한적 실시예를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 더욱 완전히 예시하기 위해 나타내어진다. 그러나, 그것들은 어떤 식으로든 본 발명의 광범위한 범주를 제한해서는 안 될 것이다.The invention may be better understood with reference to the following non-limiting examples, which serve as examples of the invention. The following examples are presented to more fully illustrate preferred embodiments of the invention. However, they should not in any way limit the broad scope of the invention.
실시예Example 1 One
카르바밀화된Carbamylated 에리스로포이에틴의 제조 Preparation of Erythropoietin
본 실시예의 공정의 출발 물질은 정제된 재조합 인간 EPO 였다.The starting material of the process of this example was purified recombinant human EPO.
우선, 단백질 농도를 낮은 공정 부피를 유지하기 위해 초여과에 의해 조정하였다. 단백질 농도를 3 mg/ml 로 조정하였다. MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용해 초여과를 수행하였다. First, protein concentration was adjusted by ultrafiltration to maintain a low process volume. Protein concentration was adjusted to 3 mg / ml. Ultrafiltration was performed using BioMax (Millipore) with a MWCO of 5 kDa.
농축 단계의 완료 후, EPO 용액을 0.5 M K-보레이트 테트라 하이드레이트 0.5 M K-시아네이트와 혼합하고, pH 9.0 에서 상기 용액을 32℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. After completion of the concentration step, the EPO solution was mixed with 0.5 M K-borate tetra hydrate 0.5 M K-cyanate and the solution was incubated at 32 ° C. for 24 hours.
EPO 및 시아네이트의 반응 혼합물의 탈염을 젤여과에 의해 수행하였다. 단백질을 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 완충액으로 탈염시켰다. G-25 Fine (Amersham Biosciences) 수지를 사용하였다.Desalting of the reaction mixture of EPO and cyanate was carried out by gel filtration. Proteins were desalted with 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 buffer. G-25 Fine (Amersham Biosciences) resin was used.
대략 15 cm 높이 칼럼 상에서 90 cm/h 의 유속을 사용해, 대략 20% 칼럼 부 피의 샘플 로딩을 사용하였다.A sample loading of approximately 20% column volume was used, using a flow rate of 90 cm / h on an approximately 15 cm high column.
탈염된 카르바밀화된 EPO 를 추가의 공정을 위해 수합하였다.Desalted carbamylated EPO was harvested for further processing.
이 때, 중합체/응집체 함량은 7.3% 였다.At this time, the polymer / aggregate content was 7.3%.
다음 단계는 음이온 교환을 사용한 정제 단계에 의해 수행되는 응집체 및 중합체의 제거였다. SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) 수지를 정제에 사용하였다. 카르바밀화된 EPO 를 대략 4.5 mg/ml 로 칼럼에 적용하였다. 진행 완충액 A 는 : 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 이었고, 용출 완충액 B 는 : 25 mM Tris, 1 M NaCl pH 8.5 이었다. 구배는, 카르바밀화된 EPO 의 주요 피크가 수합 및 풀링되는 20 칼럼 부피에 걸쳐 0-30 % 로 수행되었다. The next step was the removal of aggregates and polymers carried out by the purification step using anion exchange. SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) resin was used for purification. Carbamylated EPO was applied to the column at approximately 4.5 mg / ml. Progression buffer A was: 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5, and elution buffer B was: 25 mM Tris, 1 M NaCl pH 8.5. The gradient was performed at 0-30% over 20 column volumes where the main peak of carbamylated EPO was collected and pooled.
정제 단계로부터의 풀 (pool) 은 농도 > 0.5 mg/ml 로 조정되었고, 완충액을 정용여과/초여과 접선 유동 여과 단위를 사용하여 20 mM 시트레이트, 100 mM NaCl 완충액으로 변경하였다. 농도 및 완충액 변경은 MWCO 가 5 kDa 인 0.1m2 BioMax (Millipore) 상에서 수행하였다. The pool from the purification step was adjusted to concentration> 0.5 mg / ml and the buffer was changed to 20 mM citrate, 100 mM NaCl buffer using diafiltration / superfiltration tangential flow filtration units. Concentration and buffer changes were performed on 0.1m 2 BioMax (Millipore) with a MWCO of 5 kDa.
마침내, 정제된 생약학적 약물 성분을 Millipak 필터 (Millipore) 를 사용해 0.22 ㎛ 여과하여, 병원균을 감소시켰다. Finally, the purified biopharmaceutical drug component was 0.22 μm filtered using a Millipak filter (Millipore) to reduce pathogens.
상기 공정은 생약학제로서 유용하게 하는 특성을 가진 카르바밀화된 EPO 를 초래하였다 ; The process resulted in carbamylated EPO with properties that make it useful as a biopharmaceutical;
·중합체/응집체 함량은 SEC-HPLC 에 의해 결정된 바와 같이 0.5% 였음.Polymer / aggregate content was 0.5% as determined by SEC-HPLC.
·카르바밀화된 리신은 아미노산 분석에 의해 결정된 바와 같이 100% 였음. Carbamylated lysine was 100% as determined by amino acid analysis.
·농도는 0.5 mg/ml 초과였음.Concentration was above 0.5 mg / ml.
PNGase 처리된 단백질 및 N-글리칸이 있는 단백질 둘 다에 대한 고유 질량의 변화의 결정을 위해 MALDI-TOF 를 사용한 특징화를 수행하였다. 또한, MALDI-TOF 펩티드 질량 지문 분석/LC-MS/MS 분석을 하기와 같이 수행하였다 :Characterization using MALDI-TOF was performed for determination of changes in intrinsic mass for both PNGase treated proteins and proteins with N-glycans. In addition, MALDI-TOF peptide mass fingerprint analysis / LC-MS / MS analysis was performed as follows:
1. CEPO 및 EPO 를 POROS R1 칼럼 (POROS R1 역상 칼럼 물질, PerSeptive Biosystems (1-1259-06)) 상에서 정제하였다. 사용 전에 칼럼 물질을 HPLC VWR 152525R 용 50% HiPerSolv 에 보관하였다. R1 칼럼을 평형화시키고, 5% 포름산 (33015, Riedl de Haeon) 중에서 세척하였다. 샘플을 Agilent MALDI HCCA 품질 매트릭스 용액 (G2037A) 을 사용해 칼럼으로부터 용출하였다. Bruker Reflex IV MALDI-TOF 장비 상에서 분석하여 고유 질량을 결정하였다. 1. CEPO and EPO were purified on POROS R1 column (POROS R1 reverse phase column material, PerSeptive Biosystems (1-1259-06)). The column material was stored in 50% HiPerSolv for HPLC VWR 152525R before use. The R1 column was equilibrated and washed in 5% formic acid (33015, Riedl de Haeon). Samples were eluted from the column using Agilent MALDI HCCA Quality Matrix Solution (G2037A). Intrinsic mass was determined by analysis on a Bruker® Reflex IV MALDI-TOF instrument.
2. 0.3 pmol CEPO 및/또는 EPO 를 PNGase F 및 PNGase F/O-글리코시다제 1 유닛으로 밤새 처리하였다. 전체 질량을 MALDI-TOF 를 사용하여 결정하였다.2. 0.3 pmol CEPO and / or EPO were treated overnight with 1 unit of PNGase F and PNGase F / O-glycosidase. Total mass was determined using MALDI-TOF.
3. CEPO 및 EPO (1.5pmol) 를 50ul 10mM DTT, 50mM NH4CO3 가 있는 용액 내에서 환원시키고, 이어서 50ul 55 mM 요오도아세트아미드, 50mM NH4CO3 중에서 알킬화된 용액으로 알킬화시켰다. 샘플을 트립신 분해 전에 POROS R1 칼럼 상에서 정제하였다. 분해된 샘플의 일부를 MALDI-TOF 분석 (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)) 전에 POROS R2 칼럼 상에서 정제하였다. R2 칼럼을 평형화시키고, 0.1% 트리플루오로아세트산 (99+% 스펙트럼 등급, Aldrich 302031-100ml) 중에서 세척하였다. 샘플을 Agilent MALDI HCCA 품질 매트릭스 용액 (G2037A) 으로 칼럼으로부터 용출하였다. 트립신 분해에 의해 수득된 펩티드의 풀 (pool) 을 PNGase F 로 처리하고, POROS R2 칼럼을 거쳐 정제하고, MALDI-TOF 에 의해 특징화시켰다.3. CEPO and EPO (1.5 pmol) were reduced in a solution with 50ul 10mM DTT, 50mM NH 4 CO 3 and then alkylated with an alkylated solution in 50ul 55mM iodoacetamide, 50mM NH 4 C0 3 . Samples were purified on POROS R1 column prior to trypsin digestion. Some of the digested samples were purified on POROS R2 columns before MALDI-TOF analysis (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)). The R2 column was equilibrated and washed in 0.1% trifluoroacetic acid (99 +% spectral grade, Aldrich 302031-100 ml). Samples were eluted from the column with Agilent MALDI HCCA Quality Matrix Solution (G2037A). A pool of peptides obtained by trypsin digestion was treated with PNGase F, purified via POROS R2 column, and characterized by MALDI-TOF.
4. CEPO 및 EPO 를 DTT 로 용액 중에서 환원시키고, 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 샘플을 Glu-C 분해 전에 POROS R1 칼럼 상에서 정제하였다. 분해된 샘플의 일부를 MALDI-TOF 분석 (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)) 전에 POROS R2 칼럼 상에서 정제하였다. Glu-C 분해에 의해 수득된 펩티드의 풀 (pool) 을 PNGase F 로 처리하고, POROS R2 칼럼을 거쳐 정제하였다.4. CEPO and EPO were reduced in solution with DTT and alkylated with iodoacetamide. Samples were purified on POROS R1 columns prior to Glu-C digestion. Some of the digested samples were purified on POROS R2 columns before MALDI-TOF analysis (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)). A pool of peptides obtained by Glu-C digestion was treated with PNGase F and purified via POROS R2 column.
5. 부분적으로 카르바밀화된 CEPO 를 가질 가능성을 알아보기 위해, 고유의 EPO 및 CEPO 를 Lys-C 로 분해하였다. 샘플을 MALDI-TOF 를 사용해 분석하였다.5. To identify the possibility of having partially carbamylated CEPO, native EPO and CEPO were digested with Lys-C. Samples were analyzed using MALDI-TOF.
결론은, 8 개의 리신 및 N-말단이 카르바밀화되었다는 것이었다. 다른 카르바밀화된 아미노산은 검출되지 않았고, 글리칸의 개질은 검출되지 않았다.The conclusion was that eight lysines and the N-terminus were carbamylated. No other carbamylated amino acids were detected and no modification of the glycans was detected.
참조 :Reference :
MSMS 에 의한 일반적인 단백질 규명 : Common protein identification by:
Mann M, Hojrup P, Roepstorff P. (1993) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases, Biol Mass Spectrom 22, 338-345Mann M, Hojrup P, Roepstorff P. ( 1993 ) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases , Biol Mass Spectrom 22 , 338-345
Yates, J R, Speicher S, Griffin P R, Hunkapiller T. (1993) peptide mass maps: a highly informative approach to proteins identification , Anal Biochem 214, 397-408Yates, JR, Speicher S, Griffin PR, Hunkapiller T. ( 1993 ) peptide mass maps: a highly informative approach to proteins identification , Anal Bioche m 214 , 397-408
고유 질량 :Intrinsic Mass:
Laugesen S, Roepstorff P. (2003) Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 14(9), 992-1002.Laugesen S, Roepstorff P. ( 2003 ) Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analys is. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (9), 992-1002.
분해/decomposition/ 그래피트Graffiti : :
Larsen MR, Hojrup P, Roepstorff P. (2005) Characterization of gel -separated glycoproteins using two - step proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 4(2), 107-19.Larsen MR, Hojrup P, Roepstorff P. ( 2005 ) Characterization of gel -separated glycoproteins using two - step proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry . Mol Cell Proteomics. 4 (2), 107-19.
EPO 의 카르바밀화의 정도 및 균질성, 카르바밀화의 특이성 및 카르바밀화 부위의 동일성 (identity), 및 카르바밀화 및 정제 공정의 부반응으로 인한 잠재적인 비특이성 개질의 존재를 알아보기 위해 추가의 연구를 행하였다. 데글리코실화된 단백질 샘플의 총 질량 분석 및 펩티드 평가를 위한 분해 및 LC/MS 분석을 위해 엔도프로테아제 LysC 및 트립신을 사용하여 펩티드 맵핑하여 샘플을 분석하였다. To determine the extent and homogeneity of carbamylation of EPO, the specificity of carbamylation and the identity of carbamylation sites, and the presence of potential nonspecific modifications due to side reactions of the carbamylation and purification processes. The study was conducted. Samples were analyzed by peptide mapping using endoprotease LysC and trypsin for digestion and LC / MS analysis for total mass spectrometry and peptide evaluation of deglycosylated protein samples.
실시예Example 2 2
총 질량 분석Total mass spectrometry
실시예 1 의 방법을 사용하여 카르바밀화된 3 개의 EPO 샘플 상에서 분석을 수행하였다. 모든 3 개의 샘플을 실시예 1 에서 기술된 바와 같이, 음이온 교 환을 사용한 카르바밀화 반응 후에 정제하였다. CEPO 샘플 (CEPO-CMC 로 지정함) 중 하나를 1 그램 제조 규모 (농도: 0.82 mg/ml; 완충액: 20 mM Na-시트레이트, 0.3 mM 시트르산, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3) 로부터 CMC Biotech 에 의해 제조하였다. CEPO-1 및 CEPO-2 로 지정한 남은 2 개의 샘플을 70 mg 실험실 제조 규모 (농도: 1.1 mg/ml; 완충액: 25 mM Tris, 0.2.M NaCl, pH 8.3-8.7) 로부터 제조하였다. 상기 CEPO 샘플을 비개질된 또는 출발 EPO (농도: 0.82 mg/ml; 완충액: 2 mM Na-시트레이트, 0.3mM 시트르산, 0.1 NaCl, pH6.9-7.3) 및 모크 (mock) CEPO (K-시아네이트의 추가 없이 EPO 는 카르바밀화 공정을 수행) (농도: 0.38 mg/ml; 완충액: 20mM Na-시트레이트, 0.3 mM 시트르산, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3) 와 비교하였다. The analysis was performed on three carbamylated EPO samples using the method of Example 1. All three samples were purified after carbamylation reaction using anion exchange, as described in Example 1. One of the CEPO samples (designated CEPO-CMC) was taken from a 1 gram preparation scale (concentration: 0.82 mg / ml; buffer: 20 mM Na-citrate, 0.3 mM citric acid, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3) Prepared by CMC Biotech. The remaining two samples designated CEPO-1 and CEPO-2 were prepared from a 70 mg laboratory preparation scale (concentration: 1.1 mg / ml; buffer: 25 mM Tris, 0.2.M NaCl, pH 8.3-8.7). The CEPO samples were either unmodified or starting EPO (concentration: 0.82 mg / ml; buffer: 2 mM Na-citrate, 0.3 mM citric acid, 0.1 NaCl, pH6.9-7.3) and mock CEPO (K-sia EPO was performed with a carbamylation process without the addition of Nate) (concentration: 0.38 mg / ml; buffer: 20 mM Na-citrate, 0.3 mM citric acid, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3).
ESIESI -질량 분석계Mass spectrometer
총 질량 분석 전에, 샘플을 효소적으로 데글리코실화시켰다. 각각의 샘플을 0.5 mg/ml 의 단백질 농도에서 N-글리코시다제 F (Prozyme from Glyko), A. 우레아파시엔스 (A. ureafaciens) 로부터의 재조합 뉴라미니다제 (neuraminidase) 및 O-글리코시다제 50 ㎍ 으로 밤새 인큐베이션시켰다. 데글리코실화 반응의 완료를 12% Tris-글리신 젤 내로 각각의 샘플 3 ㎍ 을 로딩함으로써 SDS-PAGE 에 의해 체크하였다. 각각의 샘플로부터 남은 물질을 질량 분석에 사용하였다.Prior to total mass spectrometry, the samples were enzymatically deglycosylated. Each sample of the N- glycosidase F at 0.5 mg / ml protein concentration (Prozyme from Glyko), urea A. Pacifico Enschede The recombinant New lamina from (A. ureafaciens) claim (neuraminidase) and O- glycosidase Incubate overnight at 50 μg. Completion of the deglycosylation reaction was checked by SDS-PAGE by loading 3 μg of each sample into 12% Tris-glycine gel. The material remaining from each sample was used for mass spectrometry.
데글리코실화된 샘플을 적절한 양의 구아니디늄 하이드로클로라이드 저장 용액을 첨가함으로써 4-5 M 구아니디늄 하이드로클로라이드의 농도가 되게 하고, 이어서 2% 포름산 및 40% 아세토니트릴을 함유하는 완충액으로 탈염시켰다. 질량 스펙트럼 분석을 위해 데글리코실화된 EPO 및 CEPO 의 높은 회수를 보장하기 위해 구아니디늄 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이온화의 ESI-나노스프레이 원이 제공된 Waters ESI-Q-Tof- 또는 Waters ESI-LCT-질량 분석계를 사용해 질량 측정을 수행하였다. Mass Lynx 4.0 소프트웨어를 사용한 흥미로운 특정 피크의 자동화 데콘볼레이션 (deconvolation) 및 수동 평가에 의해 데이타의 평가를 수행하였다. 상이하게 카르바밀화된 CEPO 종의 상대 비율의 평가를 m/z 스펙트럼에서 기록된 신호 세기를 기준으로 상대 비율을 계산함으로써 수행하였다.The deglycosylated sample was brought to a concentration of 4-5 M guanidinium hydrochloride by addition of an appropriate amount of guanidinium hydrochloride stock solution, followed by desalting with a buffer containing 2% formic acid and 40% acetonitrile. . Guanidinium hydrochloride was added to ensure high recovery of deglycosylated EPO and CEPO for mass spectral analysis. Mass measurements were performed using a Waters ESI-Q-Tof- or Waters ESI-LCT-mass spectrometer provided with an ESI-nanospray source of ionization. Evaluation of the data was performed by automated deconvolation and manual evaluation of certain peaks of interest using Mass Lynx 4.0 software. Evaluation of the relative proportions of different carbamylated CEPO species was performed by calculating the relative ratios based on the signal strengths recorded in the m / z spectrum.
샘플의 데글리코실화는 완전히 제거되는 N-연결된 당을 초래하였다. 그러나, O-연결된 당의 방출은 특히 CEPO 샘플에 대해 불완전하였다. Deglycosylation of the sample resulted in an N-linked sugar that was completely removed. However, the release of O-linked sugars was incomplete, especially for CEPO samples.
기대된 바와 같이, 카르바밀화로 인해, CEPO 샘플은 EPO 및 모크-CEPO 샘플과 비교해 상이한 질량 스펙트럼을 보여주었다. 표 2 에서 나타낸 바와 같이, 스펙트럼의 데콘볼레이션은 다양한 샘플에 대해 이론적으로 기대된 바와 같은 주요 피크에 대한 질량을 초래하였다. 모든 CEPO 샘플에서, 단지 고도로 카르바밀화된 CEPO 분자가 발견되었고, 주요 이성체는 8 개의 리신 및 N-말단, 즉 9 개의 카르마빌 잔기가 완전히 카르바밀화된 전체적으로 카르바밀화된 이성체였다. CEPO 샘플은 CEPO 에 결합된 8, 10 및 11 개의 카르마빌 잔기에 상응하는 추가의 이성체를 함유하는 이성이질성을 보여주었다. 8 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 종을 하위-카르바밀화되었다고 지정할 것이고, 1 개 이상의 카르바밀 잔기를 잃은 것이다. 10 및 11 개의 카르바밀 잔기가 있는 종을 과다-카르바밀화되었다고 지정할 것이고, 여분의 카르바밀 잔기는 리신 이외의 아미노산에 비-특이적 방 식으로 결합될 것이다. 샘플 모두의 스펙트럼 중에서 일부 작은 신호가 있었으나, 어느 것도 비-특이적으로 개질된 종으로 여겨지지 않았다. 작은 신호 중 일부를 EPO 및 CEPO 샘플 둘 다에서 발견하였고, 출발 EPO 에 이미 존재하고 있는 오염물질로 여겼다.As expected, due to carbamylation, CEPO samples showed different mass spectra compared to EPO and Mok-CEPO samples. As shown in Table 2, the deconvolution of the spectra resulted in masses for the main peaks as theoretically expected for the various samples. In all CEPO samples, only highly carbamylated CEPO molecules were found, the main isomer being a totally carbamylated isomer with eight lysines and N-terminus, i. The CEPO sample showed isomerism containing additional isomers corresponding to 8, 10 and 11 carmarville residues bound to CEPO. A species containing eight carbamyl residues will be designated as sub-carbamylated and one or more carbamyl residues are lost. Species with 10 and 11 carbamyl residues will be designated as over-carbamylated and the extra carbamyl residues will bind non-specifically to amino acids other than lysine. There were some small signals in the spectra of all the samples, but none were considered non-specifically modified species. Some of the small signals were found in both EPO and CEPO samples and were considered contaminants already present in the starting EPO.
표 3 은 다양한 이성체의 상대 비율을 보여준다. 하위-카르바밀화된 CEPO 는 샘플에 따라 총 CEPO 의 약 1.5 내지 5.5% 의 범위이고, 과다-카르바밀화된 CEPO 는 샘플에 따라 약 11 내지 22% 의 범위이다. CEPO-1 및 CEPO-2 는 이성체의 유사한 분포를 갖는 한편, CEPO-CMC 는 다른 2 개의 샘플과 비교해 하위-카르바밀화된 종을 거의 갖지 않는다. 상이한 제조 규모는 상이한 분포를 가진 생성물을 발생시키나, 표 3 은 실험실 제조 규모에 대해 보여주기 때문에, 제조는 유사한 과정으로 반복될 수 있다. 이전에 토의된 바와 같이, 임의의 주어진 제조 규모에서, 음이온 교환 칼럼으로부터의 풀링을 조정함으로써 분포를 조정할 수 있다.Table 3 shows the relative proportions of the various isomers. Sub-carbamylated CEPO ranges from about 1.5 to 5.5% of total CEPO depending on the sample, and over-carbamylated CEPO ranges from about 11 to 22% depending on the sample. CEPO-1 and CEPO-2 have similar distributions of isomers, while CEPO-CMC has few sub-carbamylated species compared to the other two samples. Different production scales result in products with different distributions, but because Table 3 shows the laboratory production scale, the production can be repeated in a similar process. As discussed previously, at any given production scale, the distribution can be adjusted by adjusting the pooling from the anion exchange column.
표 3 의 수 (number) 는 하위- 및 과다-카르바밀화된 CEPO 의 최소 비율을 나타낸다. 이에 대한 이유는, 카르바밀화 (8-배 내지 11- 배) 의 정도가 하위, 완전히 및 과다-카르바밀화된 CEPO 의 정확한 정도를 명시할 수 없어서이다. 예를 들어, 질량 분석에 의해 결정된 바와 같이 8 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 CEPO 분자는 리신에 특이적으로 결합된 단지 7 개의 카르바밀기만을 가질 수 있고, 남은 카르바밀 잔기는 또다른 아미노산에 비-특이적으로 결합될 것이다. 이러한 상황은 비-특이적으로 결합된 카르바밀기가 있더라도, 단지 하위-카르바밀화된 것으로 여겨질 것이다. 반대로, 10 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 CEPO 분자는 단지 8 개의 잔기에 특이적으로 결합할 수 있고, 2 개는 비-특이적으로 결합한다. 이러한 상황에서, CEPO 이성체는 모든 리신이 카르바밀화되어 있지 않더라도, 단지 과다-카르바밀화된 것으로 여긴다.The numbers in Table 3 represent the minimum proportions of sub- and over-carbamylated CEPO. The reason for this is that the degree of carbamylation (8- to 11-fold) cannot specify the exact degree of sub, fully and over-carbamylated CEPO. For example, a CEPO molecule containing eight carbamyl residues, as determined by mass spectrometry, may have only seven carbamyl groups specifically bound to lysine, and the remaining carbamyl residues are non-another amino acid. -Will bind specifically. This situation would only be considered sub-carbamylated, even if there were non-specifically bound carbamyl groups. In contrast, a CEPO molecule containing ten carbamyl residues can specifically bind to only eight residues, and two bind non-specifically. In this situation, the CEPO isomers are only considered to be over-carbamylated, even though not all lysines are carbamylated.
실시예Example 3 3
LysCLysC 펩티드 Peptide 맵핑Mapping
EPO 및 CEPO 샘플의 펩티드 맵 분석을 절편화를 위한 엔도프로테아제 LysC 및 트립신을 사용해 수행하였다. 모든 펩티드 맵 분석을 데글리코실화된 펩티드로 수행하였다. 펩티드의 효소적 글리코실화를 엔도프로테아제의 분해와 동시에 수행하였다. Peptide map analysis of EPO and CEPO samples was performed using endoprotease LysC and trypsin for fragmentation. All peptide map analyzes were performed with deglycosylated peptides. Enzymatic glycosylation of the peptide was performed concurrently with the degradation of the endoprotease.
EPO 및 CEPO 샘플 (각각 약 150 ㎍) 을 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 DTT 로 인큐베이션시킴으로써 변성 및 환원시켰다. 자유 술피드릴기를 요오도아세트산으로 알킬화시켰다. 알킬화된 샘플을 탈염시키고, 완충액을 단일 용도 젤 여과 칼럼을 사용해 적절한 완충액으로 교환하였다.EPO and CEPO samples (about 150 μg each) were denatured and reduced by incubating with guanidinium hydrochloride and DTT. Free sulfidyl groups were alkylated with iodoacetic acid. The alkylated sample was desalted and the buffer was exchanged into the appropriate buffer using a single use gel filtration column.
엔도프로테아제, N-글리코시다제 및 뉴라미니다제를 알킬화된 EPO 및 CEPO 샘플에 동시에 첨가하였다. 샘플을 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 각 분해물 약 5 ㎍ 을 Water 사의 ESI-LCT 에 커플링된 Phenomenix 사의 Jupiter, C18 RP-칼럼을 시용하여 RP-HPLC/MS 분석에 사용하였다. 질량 분석계 중의 220 nM 에서의 UV 신호 및 전체 이온 수 (TIC) 를 기록하였다. 수득된 펩티드의 규명 및 정량화를 위해 TIC 를 평가하였다.Endoproteases, N-glycosidase and neuraminidase were added simultaneously to the alkylated EPO and CEPO samples. Samples were incubated overnight at 37 ° C. After incubation, about 5 μg of each digest was used for RP-HPLC / MS analysis using Phenomenix's Jupiter, C18 RP-column, coupled to ESI-LCT from Water. The UV signal and total ion number (TIC) at 220 nM in the mass spectrometer were recorded. TIC was evaluated for identification and quantification of the obtained peptides.
LysC 는 카르바밀화된 리신을 절단할 수 없을 것이기 때문에, 모든 리신이 카르바밀화된다면, 어떠한 절편도 LysC 와 함께 분해되어 형성되지 않을 것으로 예상되며, 이는 카르바밀화의 특이성을 지시한다. 하위-카르바밀화의 경우, CEPO 의 특정 절편이 형성해야 할 것이다. 표 4 는 EPO, 완전히 및 과다-카르바밀화된 CEPO 및 하위-카르바밀화된 CEPO 에 대해 LysC 분해로부터 이론적으로 형성된 절편을 열거한다.Since LysC will not be able to cleave carbamylated lysine, it is expected that if all lysines are carbamylated, no fragments will form with LysC to form, indicating the specificity of carbamylation. In the case of sub-carbamylation, certain segments of CEPO will have to form. Table 4 lists the sections theoretically formed from LysC digestion for EPO, fully and over-carbamylated CEPO and sub-carbamylated CEPO.
예상된 바와 같이, LysC 로 분해된 EPO 및 CEPO 샘플에 대해 수득된 LysC 펩티드 패턴은 완전히 상이하였다. 출발 EPO 및 모크-CEPO 를 LysC 로 분해하면, 예상된 바와 같은 펩티드 패턴을 초래하였다. 두 샘플 모두에서, 모든 펩티드 K1 내지 K9 를 규명할 수 있었다. 펩티드 K5 및 K1 은 EPO 및 모크-CEPO 둘 다에서 부분적으로 비특이적인 방식으로 절단되었다. 유의한 추가의 피크가 규명될 수 없었고, 출발 EPO 와 비교해 모크-CEPO 의 LysC 맵에서는 손실된 피크도 없었다. 상기 데이타로부터, 카르바밀화 및 정제 공정 동안에 EPO 단백질의 유의한 비-특이적 공유 개질이 발생하지 않았다는 것을 결론내릴 수 있다.As expected, the LysC peptide patterns obtained for the EPO and CEPO samples digested with LysC were completely different. Degradation of the starting EPO and mok-CEPO with LysC resulted in the peptide pattern as expected. In both samples, all peptides K1 to K9 could be identified. Peptides K5 and K1 were cleaved in a partially nonspecific manner in both EPO and Mok-CEPO. No significant additional peak could be identified and no peaks were lost in the LysC map of Mok-CEPO compared to the starting EPO. From the data, it can be concluded that no significant non-specific covalent modification of the EPO protein occurred during the carbamylation and purification process.
CEPO 샘플의 펩티드 맵은 출발 EPO 와 상이한 펩티드 패턴을 가졌다. 하나의 단일 주요 피크 및 몇 개의 작은 피크가 있었다. 표 5 에서 나타낸 바와 같이, 피크로부터 수득된 질량은 하위-카르바밀화된 CEPO 의 LysC 절단으로부터의 절편 및 절단되지 않은 CEPO 에 대해 예상된 질량과 잘 관련되어 있었다. 주요 피크 (A) 는 고유의, 데글리코실화된, 완전히 카르바밀화된 CEPO (9x 카르바밀) 및 과다-카르바밀화된 CEPO (10x 카르바밀) 를 함유하였다 (표 5). 4 개의 작은 피크 (B-E) 는 특정 리신에서 카르바밀화되지 않은 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하는 상이한 피크와 함께, 하위-카르바밀화된 CEPO (8x 카르바밀) 를 함유하였다. 피크 B 및 C 는 Lys45 에서 특이적으로 카르바밀화가 없는 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하였고, 한편 피크 D 및 E 는 Lys97 에서 특이적으로 카르바밀화가 없는 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하였다 (표 5).The peptide map of the CEPO sample had a different peptide pattern from the starting EPO. There was one single main peak and several small peaks. As shown in Table 5, the mass obtained from the peaks correlated well with the expected mass for the sections from the LysC cleavage of the sub-carbamylated CEPO and for the uncut CEPO. Main peak (A) contained native, deglycosylated, fully carbamylated CEPO (9 × carbamyl) and over-carbamylated CEPO (10 × carbamyl) (Table 5). Four small peaks (B-E) contained sub-carbamylated CEPO (8x carbamyl), with different peaks containing sub-carbamylated CEPO not carbamylated in certain lysines. Peaks B and C contained sub-carbamylated CEPO specifically free of carbamylation at Lys45, while Peaks D and E contained sub-carbamylated CEPO specifically free of carbamylation at Lys97. (Table 5).
상이한 CEPO 샘플에 대한 피크의 상대적 비율에서 일부 차이가 있었다. CEPO 샘플 1 및 2 는 CEPO-CMC 보다 더욱 지배적인 피크 D 및 E 를 가졌고, 이는 그것들이 더 많은 하위-카르바밀화된 CEPO 종을 함유하고 있음을 지시하였다.There was some difference in the relative proportions of the peaks for the different CEPO samples. CEPO samples 1 and 2 had more dominant peaks D and E than CEPO-CMC, indicating that they contained more sub-carbamylated CEPO species.
기술적 제한으로 인해 주요 피크와 관련된 작은 피크를 정량화하기가 어려웠다. 그러나, 다양한 종의 상대적 비율에 대한 조 (crude) 지침으로서 UV-검출로부터 피크 영역을 사용하여, 하위-카르바밀화된 CEPO 가 샘플에서 CEPO 이성체가 10% 미만일 수 있고, CEPO-1 및 CEPO-2 가 CEPO-CMC 보다 2 배 정도의 양의 하위-카르바밀화된 이성체를 갖고 있음을 추정할 수 있었다. 총 질량 분석에 사용된 것과 동일한 과정을 사용하여, 피크 A 에 위치한 과다-카르바밀화된 종의 정량은 CEPO-CMC 에 대해서는 약 21% 및 CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해서는 12% 였다. Technical limitations made it difficult to quantify the small peaks associated with the main peak. However, using peak regions from UV-detection as a crude guide for the relative proportions of the various species, sub-carbamylated CEPO can have less than 10% CEPO isomers in the sample, and CEPO-1 and CEPO- It can be estimated that 2 has about twice the amount of sub-carbamylated isomers than CEPO-CMC. Using the same procedure used for total mass spectrometry, the quantification of the over-carbamylated species located at peak A was about 21% for CEPO-CMC and 12% for CEPO-1 and CEPO-2.
결국, LysC 펩티드 맵핑으로부터의 데이타는 실시예 2 에서 기술된 총 질량 분석과 잘 일치한다. CEPO-CMC 는 하위-카르바밀화된 CEPO 이성체를 거의 함유하지 않았고, 한편 CEPO-1 및 CEPO-2 는 더 많은 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체를 함유하였다. 본 펩티드 맵핑은 또한, 리신 45 및 리신 97 이 하위-카르바밀화의 위치를 나타낼 수 있음을 지시하였다.In the end, the data from the LysC peptide mapping is in good agreement with the total mass spectrometry described in Example 2. CEPO-CMC contained little sub-carbamylated CEPO isomers, while CEPO-1 and CEPO-2 contained more over-carbamylated CEPO isomers. This peptide mapping also indicated that lysine 45 and lysine 97 can indicate the location of sub-carbamylation.
실시예Example 4 4
트립신 펩티드 Trypsin peptide 맵핑Mapping
트립신을 사용한 샘플의 분해를 실시예 3 에서 기술한다. Decomposition of the sample using trypsin is described in Example 3.
EPO 및 모크 CEPO 를 트립신으로 분해하면, 예상된 바와 같은 펩티드 패턴을 나타내었다. 두 샘플에서, 일부 작은 디- 및 트리-펩티드 (T21 과 같은) 를 제외하고는, 트립신 분해에 대해 예상된 바와 같이 대부분의 펩티드 (T1 내지 T21) 가 규명될 수 있었다. 표 6 참조. LysC 분해의 경우에서처럼, 출발 EPO 와 비교해, 유의한 추가의 피크도 없었고, 또한 모크-CEPO 로부터 손실된 피크도 없었다. 상기 데이타로부터, 카르바밀화 및 정제 공정 동안에 EPO 단백질의 비-특이적 공유 개질이 없었다고 결론내렸다.Digestion of EPO and Mok CEPO with trypsin showed the peptide pattern as expected. In both samples, with the exception of some small di- and tri-peptides (such as T21), most of the peptides (T1 to T21) could be identified as expected for trypsin digestion. See Table 6. As in the case of LysC digestion, there were no significant additional peaks and no peaks lost from Mok-CEPO compared to the starting EPO. From the data, it was concluded that there was no non-specific covalent modification of the EPO protein during the carbamylation and purification process.
CEPO 샘플의 펩티드 패턴은 비개질된 EPO 와 상이하였다. 트립신은 보통 리신 및 아르기닌에서 절단하고, 따라서 완전히 카르바밀화된 EPO 의 경우, 단지 절편화가 아르기닌의 절단에 의해 발생할 것으로 기대될 것이다. 따라서, 펩티드 패턴이 트립신으로 수득된 후, 특정 카르바밀화 위치 및 비특이적으로 카르바밀화된 펩티드가 규명될 수 있었다. 단지 아르기닌 (R) 에서 절단하는 것으로 예상되는 CEPO 분자의 트립신 분해로부터 예상되는 펩티드를 표 6 에 나타낸다.Peptide patterns of CEPO samples differed from unmodified EPO. Trypsin is usually cleaved at lysine and arginine, so for fully carbamylated EPO, only fragmentation will be expected to occur by cleavage of arginine. Thus, after the peptide pattern was obtained with trypsin, specific carbamylated sites and nonspecific carbamylated peptides could be identified. Peptides expected from trypsin digestion of CEPO molecules that are expected to cleave only in arginine (R) are shown in Table 6.
트립신 절단으로부터 예상되는 모든 펩티드는 C-말단 펩티드 R13 을 제외하고는, CEPO 샘플 모두에서 주요 피크로서 규명되었다. 상기 펩티드는 또한 출발 EPO 또는 모크-CEPO 에서 발견되지 않았다. 광범위한 다수의 펩티드에 대해 설명되는 단지 아르기닌의 특이적 절단으로 인한 R1 내지 R12 의 피크가 CEPO 샘플에서 검출되었다. 더욱이, 모든 리신-함유 펩티드가 완전히 카르바밀화된 형태로 거의 배제적으로 검출되었다. 상기 데이타는, 리신 및 N-말단에서의 특이적 카르바밀화의 정도가 높음을 지시한다. All peptides expected from trypsin cleavage were identified as major peaks in all CEPO samples except for the C-terminal peptide R13. The peptide was also not found in starting EPO or Mok-CEPO. Peaks of R1 to R12 due to specific cleavage of only arginine, which is described for a wide range of peptides, were detected in CEPO samples. Moreover, all lysine-containing peptides were detected almost exclusively in fully carbamylated form. The data indicate a high degree of specific carbamylation at the lysine and N-terminus.
주요 펩티드 뿐만 아니라, 6 개의 작은 펩티드 또한 CEPO 샘플 모두에서 검출되었다. 작은 펩티드 중 3 가지는 과다-카르바밀화된 CEPO 의 트립신 절단의 결과로서 질량 분석에 의해 규명되었고, 나머지 3 가지는 하위-카르바밀화된 CEPO 로부터 발생되었다. In addition to the main peptide, six small peptides were also detected in all CEPO samples. Three of the small peptides were identified by mass spectrometry as a result of trypsin cleavage of the over-carbamylated CEPO and the remaining three were generated from the sub-carbamylated CEPO.
표 7 은 분석된 3 가지 CEPO 샘플의 트립신 맵에서 규명된 모든 펩티드를 열거한다. 완전히 그리고 특이적으로 카르바밀화된 EPO 로부터 형성된 고도의 풍부한 펩티드, R1 내지 R12 는 일반적인 글씨체이고, 옳게 카르바밀화된 EPO 는 추가로 굵은 형태로 나타내었다. 하위-카르바밀화된 CEPO 의 절단에 의해 대부분 거의 형성된 펩티드를 이탈릭체로 나타내고, 과다-카르바밀화된 CEPO 의 절단에 의해 형성된 펩티드를 밑줄로 나타낸다.Table 7 lists all peptides identified in the trypsin map of the three CEPO samples analyzed. Highly abundant peptides formed from fully and specifically carbamylated EPO, R1 to R12, are in general font, and correctly carbamylated EPO is shown in bold form. Peptides formed mostly by cleavage of sub-carbamylated CEPO are shown in italics, and peptides formed by cleavage of over-carbamylated CEPO are underlined.
표 7 에 관해서, 펩티드 R6_a1 및 R6_b1 을 각각 함유하는 작은 피크 T9 및 T10 은 거의 대부분 Lys97 에서 카르바밀화되지 않는 하위-카르바밀화된 CEPO 분자의 절단으로부터 유도된다. Lys45 아미노산이 카르바밀화되지 않는다면, 펩티드 R4_b1+1xcarb 가 형성된다. 펩티드 R6_a1 (피크 T9) 은 CEPO-CMC 보다 CEPO-1 및 CEPO-2 샘플에서 더욱 풍부하고, 이는 전자가 하위-카르바밀화된 CEPO 를 2 배의 양으로 가질 수 있음을 지시한다. 펩티드 R6_b1 및 R4_b1+1xcarb 는 모든 CEPO 샘플에서 동일한 양으로 존재하였다.With respect to Table 7, the small peaks T9 and T10 containing peptides R6_a1 and R6_b1, respectively, are mostly derived from cleavage of sub-carbamylated CEPO molecules that are not carbamylated in Lys97. If the Lys45 amino acid is not carbamylated, peptide R4_b1 + 1xcarb is formed. Peptide R6_a1 (peak T9) is more abundant in CEPO-1 and CEPO-2 samples than CEPO-CMC, indicating that the former can have twice the amount of sub-carbamylated CEPO. Peptides R6_b1 and R4_b1 + 1xcarb were present in equal amounts in all CEPO samples.
상기 데이타로부터 하위-카르바밀화된 CEPO 의 상대적 함량을 계산하는 것은 기술적 제한으로 인해 어려웠다. 그러나, 모든 것을 함께 관찰하여, 하위-카르바밀화 종이 총 질량 분석 및 LysC 펩티드 맵핑으로부터 추론된 바와 같이 약 10% 임을 추정하였다.It was difficult due to technical limitations to calculate the relative content of sub-carbamylated CEPO from the data. However, everything was observed together, presuming that the sub-carbamylated species was about 10% as deduced from total mass spectrometry and LysC peptide mapping.
다른 펩티드와 공동-용출된 3 가지 다른 작은 펩티드는 하나의 여분의 카르바밀 잔기, 즉, 과다-카르바밀화된 CEPO 를 함유하는 질량에 의해 방해받았다. 펩티드 R10_2xcarb 및R7_1xcarb 는 미량으로 검출되었고, 여기서 R12_3xcarb 는 유의한 신호 세기를 가졌음을 발견하였다. CEPO-CMC 는 CEPO-1 및 CEPO-2 로서 과다-카르바밀화된 CEPO 종의 2-배 더 높은 함량을 가졌다. 이는, 총 질량 분석으로부터의 결과와 일치한다. 또한, EPO 의 아미노산 서열 151-62 가 비특이적 카르바밀화 위치임을 상기 데이타로부터 결론내릴 수 있었다.Three different small peptides co-eluted with other peptides were hampered by a mass containing one extra carbamyl residue, ie, over-carbamylated CEPO. Peptides R10_2xcarb and R7_1xcarb were detected in trace amounts, where R12_3xcarb was found to have significant signal intensity. CEPO-CMC had 2-fold higher content of over-carbamylated CEPO species as CEPO-1 and CEPO-2. This is consistent with the results from total mass spectrometry. In addition, it can be concluded from the data that amino acid sequences 151-62 of EPO are non-specific carbamylation sites.
또, 하위-카르바밀화의 정량화에서와 동일한 이유에서, 과다-카르바밀화된 종의 정량화가 어려웠다. 그러나, 카르바밀화의 정도만 상이한 펩티드의 이온화 효능은 유사한 것으로 가정하여, CEPO 약 3-7% 가 과다-카르바밀화된 종인 R12-유도체의 상대적 이온 계수에 의해 계산하였다. 이는, 총 질량 분석에 의해 계산된 과다-카르바밀화된 이성체의 양보다 더 낮다.In addition, for the same reasons as in the quantification of sub-carbamylation, it was difficult to quantify over-carbamylated species. However, assuming that the ionization potency of peptides differing only in the degree of carbamylation was similar, the CEPO was calculated by the relative ionic count of R12-derivatives, wherein about 3-7% of the over-carbamylated species. This is lower than the amount of over-carbamylated isomers calculated by total mass spectrometry.
일반적으로, 하기는 EPO 및 CEPO 의 총 질량 분석 및 펩티드 맵핑 데이타로부터 결론내어질 수 있다. In general, the following can be concluded from the total mass spectrometry and peptide mapping data of EPO and CEPO.
총 질량 분석으로부터, CEPO 샘플은 카르바밀화가 보다 높은 정도로 된 것으로 보였다. 모든 분자의 약 95-98% 는 완전히 카르바밀화되어 있고, 9 개 이상의 카르바밀 잔기를 함유한다 (표 3 참조). LysC 및 트립신 맵핑은 특정 위치에서의 높은 정도의 카르바밀화를 확인시키고, CEPO 분자의 95% 를 초과하는 거의 대부분이 8 개의 리신 및 N-말단에서 완전히 카르바밀화되어 있다고 확인시킨다.From total mass spectrometry, CEPO samples appeared to have a higher degree of carbamylation. About 95-98% of all molecules are fully carbamylated and contain at least 9 carbamyl residues (see Table 3). LysC and trypsin mapping confirm a high degree of carbamylation at certain locations and almost 95% of the CEPO molecules are fully carbamylated at 8 lysines and N-terminus.
데이타는 또한 발견된 4 가지 CEPO 의 이성체를 보여주었다. 8, 9, 10 및 11 개의 카르바밀 잔기를 가진 종이 분석된 CEPO 샘플에서 검출되었고, 9 개의 카르바밀 이성체가 지배적인 종이었다. 9 개 대신에 8 개의 카르바밀 잔기를 함유한 CEPO 분자의 소수 부분 (minor portion) 은 하위-카르바밀화된 것으로 여겨졌다. CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해, 상기 이성체는 전체의 약 5% 였고, CEPO-CMC 에 대해서는, 상기 이성체는 총 CEPO 분자 중 약 1.5% 로 이루어졌다.The data also showed isomers of the four CEPOs found. Species with 8, 9, 10 and 11 carbamyl residues were detected in the analyzed CEPO samples, with 9 carbamyl isomers predominant. The minor portion of the CEPO molecule containing eight carbamyl residues instead of nine was considered sub-carbamylated. For CEPO-1 and CEPO-2, the isomer was about 5% of the total and for CEPO-CMC, the isomer consisted of about 1.5% of the total CEPO molecules.
더욱 유의한 비율의 CEPO 분자가 과다-카르바밀화되었는데, 즉 10 또는 11 개의 카르바밀 잔기를 함유한다. 과다-카르바밀화된 CEPO 는 CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해 약 11% 내지 CEPO-CMC 에서는 약 22% 의 범위이다.More significant proportions of CEPO molecules were over-carbamylated, ie they contained 10 or 11 carbamyl residues. Over-carbamylated CEPO ranges from about 11% for CEPO-1 and CEPO-2 to about 22% for CEPO-CMC.
펩티드 맵핑으로부터의 데이타는, 8 개의 리신 및 N-말단에서의 카르바밀화의 특이성의 정도가 높음을 보여주었다. 더욱이, 펩티드 맵핑은 일반적으로 총 질량 분석의 결과를 확인시켜 주었다. CEPO 분자 중 약 90-95% 이상이 리신 및 N-말단 모두에서 카르바밀 잔기에 의해 특이적으로 개질된 것으로 보였다. 그러나, 상기 데이타는 또한 하위- 및 과다-카르바밀화 CEPO 종을 보여주었다. 일부 기술적 제한으로 인해, 하위-카르바밀화된 종의 정확한 비율을 결정하기가 어려웠으나, 총 질량 분석에서 발견되는 수와 일치하는 약 10% 이하의 범위 내에 있는 것으로 추정된다. 더욱이, EPO, Lys45 및 Lys97 상에서의 2 가지 구별되는 위치를 카르바밀화의 결핍이 가장 잘 발생할 위치로서 규명하였다.Data from peptide mapping showed a high degree of specificity of carbamylation at the eight lysines and N-terminus. Moreover, peptide mapping generally confirmed the results of total mass spectrometry. At least about 90-95% of the CEPO molecules appeared to be specifically modified by carbamyl residues at both the lysine and N-terminus. However, the data also showed sub- and over-carbamylated CEPO species. Because of some technical limitations, it was difficult to determine the exact proportion of the sub-carbamylated species, but is estimated to be within the range of about 10% or less, consistent with the number found in the total mass spectrometry. Moreover, two distinct positions on EPO, Lys45 and Lys97 were identified as sites where the deficiency of carbamylation is most likely to occur.
펩티드 맵핑의 2 가지 세팅 모두에서, 과다-카르바밀화된 종이 또한 발견되었다. 또, 기술적 제한으로 인해, 과다-카르바밀화된 종의 정확한 양을 정량화하기가 어려웠다. 수득된 데이타로부터, 과다-카르바밀화된 종이 펩티드 맵핑에서 거의 검출되지 않았음을 추정할 수 있었다. 단지 과다-카르바밀화된 종의 1/3 내지 1/4 만이 총 질량 분석과 비교해 펩티드 맵핑에 의해 규명되었다. 이러한 불일치에 대한 타당한 설명은, 모든 과다-카르바밀화된 펩티드가 모두 또는 정확한 양으로 규명되지 않았다는 것이다. LysC 맵에서, 10 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 절단되지 않은 CEPO 종을 유의한 양으로 검출하였고, 트립신 맵핑에서, 3 개의 펩티드가 하나의 여분의 카르바밀 잔기를 함유하는 것으로 검출되었다. 상기 절편 중 2 개는 단지 미량으로 검출되었다. C-말단에 근접한 제 3 펩티드인 CEPO 펩티드 아미노산 152-162 는 과다-카르바밀화 1/3 을 설명하는 것으로 보이고, EPO 에서 비-특이적 카르바밀화를 위한 위치일 수 있다.In both settings of peptide mapping, over-carbamylated species were also found. In addition, due to technical limitations, it was difficult to quantify the exact amount of the over-carbamylated species. From the data obtained, it can be estimated that little was detected in the over-carbamylated species peptide mapping. Only 1/3 to 1/4 of the over-carbamylated species were identified by peptide mapping compared to total mass spectrometry. A valid explanation for this discrepancy is that not all over-carbamylated peptides have been identified in all or exact amounts. In the LysC map, significant amounts of uncleaved CEPO species containing 10 carbamyl residues were detected, and in trypsin mapping, three peptides were detected containing one extra carbamyl residue. Two of these fragments were detected only in trace amounts. The third peptide close to the C-terminus, the CEPO peptide amino acids 152-162, seems to account for over-carbamylation 1/3, and may be the site for non-specific carbamylation in EPO.
유의한 양의 다른 비-특이적 (카르바밀이 관련되지 않음) 개질은 수행된 임의의 분석에 의해 CEPO 샘플 또는 모크 CEPO 샘플에서 검출되지 않았다. Significant amounts of other non-specific (no carbamyl related) modifications were not detected in the CEPO samples or the mock CEPO samples by any analysis performed.
도 1 은 시아네이트와 단백질의 N-말단 및 리신 잔기와의 반응을 나타낸다.1 shows the reaction of cyanates with the N-terminal and lysine residues of the protein.
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