RU2575773C2 - Carbamylated darbepoetin 9c-depo, method for production thereof and use thereof as medicinal agent having cytoprotective action - Google Patents
Carbamylated darbepoetin 9c-depo, method for production thereof and use thereof as medicinal agent having cytoprotective action Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575773C2 RU2575773C2 RU2013131194/15A RU2013131194A RU2575773C2 RU 2575773 C2 RU2575773 C2 RU 2575773C2 RU 2013131194/15 A RU2013131194/15 A RU 2013131194/15A RU 2013131194 A RU2013131194 A RU 2013131194A RU 2575773 C2 RU2575773 C2 RU 2575773C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- darbepoetin
- carbamylated
- depo
- erythropoietin
- amino acid
- Prior art date
Links
- 230000001120 cytoprotect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 7
- 210000004897 N-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 abstract description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 150000001913 cyanates Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 28
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 28
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 28
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 18
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 14
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 14
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 10
- 210000004413 Myocytes, Cardiac Anatomy 0.000 description 9
- 210000002317 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 6
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 206010061256 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 4
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000000913 erythropoietic Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940115115 Aranesp Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 2
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 2
- GKKCIDNWFBPDBW-UHFFFAOYSA-M Potassium cyanate Chemical compound [K]OC#N GKKCIDNWFBPDBW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108060006633 Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 2
- 206010002026 Amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 102100015655 BCL2L1 Human genes 0.000 description 1
- 101710032374 BCL2L1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010013683 Drug effect increased Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100016635 EPOR Human genes 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N Homocitrulline Chemical group NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010061255 Ischaemia Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 102000015774 TYK2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010010057 TYK2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000011087 biopharmaceutical technology Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 201000006474 brain ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002017 cytoprotector Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области создания лекарственных средств с цитопротекторным действием, в частности - карбамилированного дарбэпоэтина, полученного путем карбамилирования всех аминокислотных остатков лизина, входящего в молекулу дарбэпоэтина, а также карбамилированный аминокислотный остаток аланина в N-концевой области этого белка - 9C-DEPO, представляющего собой гипергликозилированное производное рекомбинантного эритропоэтина человека.The invention relates to the field of drugs with a cytoprotective effect, in particular, carbamylated darbepoetin obtained by carbamylation of all amino acid residues of lysine in the darbepoetin molecule, as well as a carbamylated amino acid residue of alanine in the N-terminal region of this protein, 9C-DEPO, which is hyperglycosylated derivative of recombinant human erythropoietin.
Это соединение предназначено для использования в качестве активного компонента при изготовлении лекарственных средств для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с повреждением ткани вследствие некроза (непосредственном повреждением и гибели клеток), апоптоза (програмируеммой клеточной смерти) и воспалением, в частности для нейрозащиты, например лечения острого (например, инсульта) и хронического заболевания (например, амиотрофического бокового склероза) нервной системы.This compound is intended for use as an active ingredient in the manufacture of drugs for the treatment or prevention of a condition associated with tissue damage due to necrosis (direct damage and cell death), apoptosis (programmed cell death) and inflammation, in particular for neuroprotection, for example, treatment of acute (e.g., stroke) and chronic diseases (e.g., amyotrophic lateral sclerosis) of the nervous system.
Ишемический инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождающееся повреждением ткани мозга, является проблемой чрезвычайной медицинской и социальной значимости, влияние которой на уровень здоровья и жизни населения всего мира, по данным аналитических исследований, проведенных ВОЗ, будет последовательно нарастать (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/).Ischemic stroke - an acute violation of cerebral circulation, accompanied by damage to brain tissue, is a problem of extreme medical and social significance, the impact of which on the level of health and life of the population of the world, according to analytical studies conducted by WHO, will gradually increase (http: // www. who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/).
Специфическая лекарственная терапия при ишемическом инсульте проводится по двум стратегическим направлениям: реперфузия и нейрональная протекция.Specific drug therapy for ischemic stroke is carried out in two strategic directions: reperfusion and neuronal protection.
Реперфузия направлена на восстановление или усиление кровотока по сосудам в области повреждения.Reperfusion is aimed at restoring or increasing blood flow through the vessels in the area of damage.
Нейрональная протекция направлена на предотвращение гибели слабо или почти не функционирующих, но все еще жизнеспособных нейронов, располагающихся вокруг очага инфаркта (зона «ишемической полутени»).Neuronal protection is aimed at preventing the death of weakly or almost non-functioning, but still viable neurons located around the hearth infarction (zone of "ischemic penumbra").
Гибель клеток в области «ишемической полутени» происходит по механизмам некроза и апоптоза (часть клеток гибнет в результате програмирруемой клеточной смерти в условиях недостатка кислорода - апоптоза, остальная вследствие некроза - непосредственного омертвления клеток вследствие их повреждения) и приводит к увеличению размеров инфаркта. Однако эти клетки в течение определенного времени могут сохранять свою жизнеспособность и выполнять свои функции, их гибель можно предотвратить при восстановлении кровотока в зоне «ишемической полутени» в течение 3-6 ч (Lapchak, 2010).Cell death in the area of “ischemic penumbra” occurs according to the mechanisms of necrosis and apoptosis (some cells die as a result of programmed cell death under conditions of oxygen deficiency - apoptosis, the rest due to necrosis - direct necrosis of cells due to their damage) and leads to an increase in infarction. However, these cells can maintain their viability and perform their functions for a certain time; their death can be prevented by restoring blood flow in the ischemic penumbra zone for 3-6 hours (Lapchak, 2010).
Гликопротеидный гормон - эритропоэтин (ЭПО), продуцируемый первично клетками капилляров почечных клубочков, хорошо охарактеризован и получил широкую известность как гормон гемопоэза (кроветворения), однако его биологическая роль этим не ограничивается. Рецепторы эритропоэтина экспрессируется не только в клетках кроветворных тканей, но и в таких тканях, как мозг. Известно, что также они есть на поверхности нейронов (Sanchis-Gomar, et al., 2013).The glycoprotein hormone erythropoietin (EPO), produced primarily by the cells of the capillaries of the renal glomeruli, is well characterized and is widely known as the hormone hematopoiesis (hematopoiesis), but its biological role is not limited to this. Erythropoietin receptors are expressed not only in hematopoietic tissue cells, but also in tissues such as the brain. It is known that they also exist on the surface of neurons (Sanchis-Gomar, et al., 2013).
Продемонстрировано in vitro и in vivo, что ЭПО является сильным ингибитором нейронного апоптоза, индуцируемого ишемией и кислородной недостаточностью (Bernaudin, et al., 1999; Morishita, et al., 1997; Ruscher, et al., 2002). Добавление ЭПО к нейронным культурам защищает их против недостатка кислорода и токсичности глутаминовой кислоты (Henn and Braus, 1999; Vogeley, et al., 2001) и уменьшает неврологическую дисфункцию в моделях инсульта грызунов (Bernaudin, et al., 1999; Brines, et al., 2000).It has been demonstrated in vitro and in vivo that EPO is a potent inhibitor of neuronal apoptosis induced by ischemia and oxygen deficiency (Bernaudin, et al., 1999; Morishita, et al., 1997; Ruscher, et al., 2002). Adding EPO to neural cultures protects them against oxygen deficiency and glutamic acid toxicity (Henn and Braus, 1999; Vogeley, et al., 2001) and reduces neurological dysfunction in rodent stroke models (Bernaudin, et al., 1999; Brines, et al ., 2000).
Механизм действия эритропоэтина хорошо изучен (Livnah, et al., 1998; Middleton, et al., 1999). При связывании молекулы ЭПО с рецептором EpoR запускается каскад реакций фосфорилирования ключевых белков, таких как Ras-митогенактивирующая протеинкиназа, янусовая тирозинкиназа-2 и др. (набор протеинкиназ может изменяться, в зависимости от типа ткани), которые, в свою очередь, активируют экспрессию генов семейства bcl-xL и синтез антиапоптозных белков, подавляющих апоптотическую гибель клеток.The mechanism of action of erythropoietin is well understood (Livnah, et al., 1998; Middleton, et al., 1999). When the EPO molecule binds to the EpoR receptor, a cascade of phosphorylation reactions of key proteins, such as Ras-mitogen-activating protein kinase, Janus tyrosine kinase-2, etc., starts (the set of protein kinases can vary, depending on the type of tissue), which, in turn, activate gene expression the bcl-xL family and the synthesis of anti-apoptotic proteins that suppress apoptotic cell death.
Природным стимулом, активирующим продукцию эритропоэтина как в кроветворных, так и некроветворных тканях является кислородная недостаточность. Таким образом, эритропоэтин способствует сохранению жизнеспособности клеток в условиях недостатка кислорода. Именно недостаток кислорода является причиной гибели нейронов при ишемических инсультах.Oxygen deficiency is a natural stimulus that activates the production of erythropoietin in both hematopoietic and non-blood-forming tissues. Thus, erythropoietin helps maintain cell viability in conditions of oxygen deficiency. It is the lack of oxygen that causes the death of neurons in ischemic strokes.
Кроветворная активность эритропоэтина вызывает побочный нежелательный эффект - повышение артериального давления и риск образования тромбов, что, в случае ишемического инсульта, категорически противопоказано, даже если ЭПО применялся достаточно короткий период.Hematopoietic activity of erythropoietin causes an undesirable side effect - increased blood pressure and the risk of blood clots, which, in the case of ischemic stroke, is strictly contraindicated, even if an EPO has been used for a rather short period.
В связи с этим известны попытки создания модифицированного ЭПО, у которого бы отсутствовало кроветворное действие, но при этом сохранялись цитопротекторные свойства.In this regard, there are known attempts to create a modified EPO, which would have no hematopoietic effect, but at the same time retained cytoprotective properties.
Одним из таких вариантов модифицированного ЭПО является его десиалированная форма (asialo-EPO), которая обладает высокой аффиностью к классическим рецепторам EpoR, но не успевает проявить кроветворную активность in vivo в связи с коротким периодом полужизни в плазме крови.One of such variants of modified EPO is its desialized form (asialo-EPO), which has high affinity for the classic EpoR receptors, but does not have time to exhibit hematopoietic activity in vivo due to the short half-life in plasma.
Другой вариант модифицированного ЭПО представляет собой карбамилированный эритропоэтин (СЕРО).Another variant of the modified EPO is carbamylated erythropoietin (CEPO).
Карбамилирование белков широко известно как побочный эффект применения мочевины в очистке белков и как результат высокого уровня мочевины в сыворотке. В таких случаях карбамилирование вызвано спонтанным разложением мочевины до цианата. Цианат отвечает за карбамилирование первичных аминов белка в N-концевой области и подверженных карбамилированию аминокислотных остатков лизина белка. Другие возможно подверженные карбамилированию аминокислотные остатки представляют собой аргинин, цистеин, тирозин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и гистидин, однако реакция зависит от pH и не протекает так быстро, как с N-концевым остатком и остатком лизина. Карбамилирование эритропоэтина по имеющимся 7 остаткам лизина замещает их на остатки гомоцитруллина, не сильно затрагивая профиль гликозилирования целой молекулы. Показано, что карбамилированный эритропоэтин не взаимодействует с классическим ЭПО рецептором, но сохраняет цитопротекторные свойства (Leist, et al., 2004). Основное преимущество СЕРО в сравнении с asialo-ЭПО в том, что карбамилирование в отличие от десиалирования не изменяет существенно кинетический профиль. Время полужизни СЕРО в плазме крови, как было показано на крысах, такое же, как и ЭПО - 3-6 ч, что обусловлено сохранением остатков сиаловых кислот (Torup and Leist, 2006).Protein carbamylation is widely known as a side effect of the use of urea in protein purification and as a result of high serum urea. In such cases, carbamylation is caused by spontaneous decomposition of urea to cyanate. Cyanate is responsible for the carbamylation of primary protein amines in the N-terminal region and the carbamylated amino acid residues of protein lysine. Other possibly carbamylated amino acid residues are arginine, cysteine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid and histidine, however, the reaction is pH dependent and does not proceed as quickly as with the N-terminal residue and the lysine residue. The carbamylation of erythropoietin at the available 7 lysine residues replaces them with homocitrulline residues, without affecting the glycosylation profile of the whole molecule. It has been shown that carbamylated erythropoietin does not interact with the classical EPO receptor, but retains cytoprotective properties (Leist, et al., 2004). The main advantage of CEPO compared with asialo-EPO is that carbamylation, unlike desialization, does not significantly change the kinetic profile. The half-life of CEPO in blood plasma, as shown in rats, is the same as EPO - 3-6 hours, due to the conservation of sialic acid residues (Torup and Leist, 2006).
Дарбэпоэтин представляет собой генно-модифицировнный эритропоэтин и обладает всеми свойствами природного аналога. По сравнению со стандартным эритропоэтином дарбэпоэтин имеет большую молекулярную массу (37.1 кДа, а не 30.4 кДа) и максимально возможное количество остатков сиаловой кислоты (22 против 14 у ЭПО) за счет введения дополнительных 2 сайтов гликозилирования. Результатом этого является увеличение периода полувыведения и, как следствие, снижение частоты применения препарата.Darbepoetin is a genetically modified erythropoietin and has all the properties of a natural analogue. Compared to standard erythropoietin, darbepoetin has a higher molecular weight (37.1 kDa rather than 30.4 kDa) and the maximum possible amount of sialic acid residues (22 versus 14 in EPO) due to the introduction of an additional 2 glycosylation sites. The result is an increase in half-life and, as a consequence, a decrease in the frequency of use of the drug.
Дарбэпоэтин, гипергликозилированный вариант рекомбинантного эритропоэтина человека, являясь столь же эффективным цитопротектором, обладает втрое большим периодом полужизни (Messe, et al., 2013; Yilmaz, et al., 2012). При инсультах его эффективность на животных моделях при еженедельном применении соответствует эффективности ЭПО при ежедневном применении (Grasso, et al., 2009). Таким образом, его эффективная доза меньше, а частота применения может быть реже, чем у ЭПО, в 7 раз.Darbepoetin, a hyperglycosylated variant of recombinant human erythropoietin, being an equally effective cytoprotector, has a triple half-life (Messe, et al., 2013; Yilmaz, et al., 2012). In strokes, its effectiveness in animal models for weekly use corresponds to the effectiveness of EPO for daily use (Grasso, et al., 2009). Thus, its effective dose is less, and the frequency of use can be 7 times less than that of EPO.
Обнаруженная в источниках информация о карбамилированном дарбэпоэтине (Ramirez, et al., 2009) является неполной и не описывает способа получения и применения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO, содержащего карбамилированные группы по всем аминокислотным остаткам лизина и остатка аланина в N-концевой области.Information on carbamylated darbepoetin found in the sources (Ramirez, et al., 2009) is incomplete and does not describe a method for the preparation and use of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO containing carbamylated groups on all amino acid residues of lysine and the alanine residue in the N-terminal region.
В качестве ближайшего аналога лекарственного средства с цитопротекторным действием рассмотрим карбамилированный дарбэпоэтин, для которого продемонстрирована способность предохранять от апоптоза предшественники эндотелиальных клеток, изолированных из венозной крови пациентов, подвергнувшихся гемодиализу, не стимулируя их пролиферацию (Ramirez, et al., 2009).We will consider carbamylated darbepoetin as the closest analogue of the drug with cytoprotective action, for which the ability to protect endothelial cells precursors isolated from the venous blood of hemodialysis patients without stimulating their proliferation has been demonstrated to prevent apoptosis (Ramirez, et al., 2009).
Задача заявляемой группы изобретений:The task of the claimed group of inventions:
- расширить арсенал лекарственных средств, обладающих цитопротекторным действием.- expand the arsenal of drugs with cytoprotective effect.
Задача решена путемThe problem is solved by
- получения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO, содержащего карбамилированные группы всех восьми аминокислотных остатков лизина, входящего в молекулу дарбэпоэтина, а также карбамилированный аминокислотный остаток аланина в N-концевой области этого белка;- obtaining carbamylated darbepoetin 9C-DEPO containing carbamylated groups of all eight amino acid residues of lysine included in the darbepoetin molecule, as well as a carbamylated amino acid residue of alanine in the N-terminal region of this protein;
- разработки способа получения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO путем инкубирования дарбэпоэтина в присутствии цианатов в подходящих условиях в течение 20-28 часов при pH 8,8-9,2 с последующей очисткой полученного карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO методом анионообменной хроматографии;- development of a method for producing carbamylated darbepoetin 9C-DEPO by incubating darbepoetin in the presence of cyanates under suitable conditions for 20-28 hours at a pH of 8.8-9.2, followed by purification of the resulting carbamylated darbepoetin 9C-DEPO by anion exchange chromatography;
- применение карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO в качестве лекарственного средства с цитопротекторным действием.- the use of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO as a drug with a cytoprotective effect.
Заявляемый карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO не обладает гематопоэтической активностью, но сохраняет цитопротекторные свойства.The inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO does not have hematopoietic activity, but retains cytoprotective properties.
Изобретение проиллюстрировано следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
Фиг.1. Последовательность дарбэпоэтина. Серым цветом выделены аминокислотные остатки, подвергающиеся карбамилированию для получения 9C-DEPO.Figure 1. The sequence of darbepoetin. The amino acid residues subjected to carbamylation to obtain 9C-DEPO are highlighted in gray.
Фиг.2. Эритропоэтическая активность карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO in vitro в тесте на пролиферацию с клетками лейкемической клеточной линии TF1 (Kitamura, et al., 1989). 
Фиг.3. Оценка цитопротекторного действия карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO. Цитопротекторное действие определялось как процент апоптотических клеток (вертикальная ось) после воздействия гипоксии с последующей оксигенацией: а) контрольная группа, не подвергавшаяся гипоксии; б) гипоксия + оксигенация; в) гипоксия + оксигенация + 9CDEPO.Figure 3. Assessment of the cytoprotective effect of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO. The cytoprotective effect was determined as the percentage of apoptotic cells (vertical axis) after exposure to hypoxia followed by oxygenation: a) a control group that did not undergo hypoxia; b) hypoxia + oxygenation; c) hypoxia + oxygenation + 9CDEPO.
Способ в общем видеThe method in General
Способ получения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO, карбамилированного по всем восьми аминокислотным остаткам лизина и остатку аланина в N-концевой области, состоит из нескольких стадий.The method for producing carbamylated darbepoetin 9C-DEPO carbamylated at all eight amino acid residues of lysine and an alanine residue in the N-terminal region consists of several stages.
1. Перевод в буфер для карбамилирования диафильтрацией.1. Transfer to carbamylation buffer by diafiltration.
2. Модифицирование карбамилированием.2. Modification by carbamylation.
3. Обессоливание диафильтрацией.3. Desalination by diafiltration.
4. Очистка с помощью анионообменной хроматографии.4. Purification using anion exchange chromatography.
5. Концентрирование и замена буфера ультра- и диафильтрацией.5. Concentration and buffer replacement by ultra- and diafiltration.
6. Стерильная фильтрация.6. Sterile filtration.
Исходный материал представляет собой субстанцию очищенного рекомбинантного дарбэпоэтина с концентрацией около 1,5 мг/мл.The starting material is a purified recombinant darbepoetin substance with a concentration of about 1.5 mg / ml.
Первый шаг процесса осуществляют путем перевода дарбэпоэтина в 0,5 М боратный буфер, pH 8.8-9.2, на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System с использованием кассеты UPF-10-C-3X2MA. По окончании диафильтрации к раствору дарбэпоэтина в боратном буфере добавляют сухой цианат калия до концентрации 0,25 М.The first step of the process is carried out by transferring darbepoetin to 0.5 M borate buffer, pH 8.8–9.2, on an ultra- and diafiltration system Quix Stand Benchtop System using a UPF-10-C-3X2MA cartridge. After diafiltration, dry potassium cyanate is added to a solution of darbepoetin in borate buffer to a concentration of 0.25 M.
Смесь перемешивают и инкубируют при температуре 37°С в течение 20-28 часов. После инкубации смесь быстро охлаждают на льду до t +4 - +8°С. В результате получают смесь, содержащую изоформы карбамилированного дарбэпоэтина, в том числе заявляемый карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO. Заявляемый карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO содержит 9 карбамилированных остатков на молекулу - остатки лизина и N-концевой аланин. При этом в смеси после инкубации с цианатом также содержится недостаточно карбамилированный дарбэпоэтин: содержит менее 9 карбамильных остатков, т.е. карбамилированы не все из 8 лизинов и N-концевая аминокислота, например около 5 карбамильных остатков. Избыточно карбамилированный дарбэпоэтин имеет более 9 карбамильных остатков и карбамилирован по аминокислотам, отличным от восьми лизиновых остатков и N-концевой аминокислоты, и может иметь 15 карбамильных остатков.The mixture is stirred and incubated at a temperature of 37 ° C for 20-28 hours. After incubation, the mixture is rapidly cooled on ice to t +4 - + 8 ° C. The result is a mixture containing isoforms of carbamylated darbepoetin, including the inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO. The inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO contains 9 carbamylated residues per molecule — lysine residues and N-terminal alanine. Moreover, the mixture after incubation with cyanate also contains insufficiently carbamylated darbepoetin: it contains less than 9 carbamyl residues, i.e. not all of the 8 lysines and the N-terminal amino acid are carbamylated, for example about 5 carbamyl residues. Excessively carbamylated darbepoetin has more than 9 carbamyl residues and is carbamylated by amino acids other than eight lysine residues and an N-terminal amino acid, and may have 15 carbamyl residues.
Затем осуществляют разделение находящихся в этой смеси изоформ, а также отделение агрегатов методом анионообменной хроматографии на сорбенте Fractogel TMAE (S). Для этого смесь, содержащую карбамилированный дарбэпоэтин, переводят в буфер для анионообменной хроматографии на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System с использованием кассеты UPF-10-C-3X2MA.Then, the isoforms contained in this mixture are separated, and the aggregates are separated by anion exchange chromatography on a Fractogel TMAE (S) sorbent. For this, a mixture containing carbamylated darbepoetin is transferred to the buffer for anion exchange chromatography on an ultra- and diafiltration system Quix Stand Benchtop System using a UPF-10-C-3X2MA cassette.
Буфер для анионообменной хроматографии (буфер А) содержит 20 мМ трис, 50 мМ NaCl, pH 8,3±0,2. Элюентный буфер (В) содержит 20 мМ трис, 1 М NaCl, pH 8,3±0,2. Элюцию карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO производят линейным градиентом из буфера А в буфер В от 0 до 30% за 25 колоночных объемов.Anion exchange chromatography buffer (buffer A) contains 20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.3 ± 0.2. The eluent buffer (B) contains 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.3 ± 0.2. The carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is eluted with a linear gradient from buffer A to buffer B from 0 to 30% over 25 column volumes.
Основной пик карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO собирают, анализируют и объединяют. Карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO концентрируют и переводят в буфер, содержащий 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ натрия хлорида, на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System.The main peak of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is collected, analyzed and combined. The carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is concentrated and transferred to a buffer containing 20 mM sodium citrate, 100 mM sodium chloride, on an ultix and diafiltration system Quix Stand Benchtop System.
Полученный заявляемым способом карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO (фиг.1) обладает свойствами, определяющими его как приемлемый в качестве биофармацевтического. Определенное методом гель-хроматографии (Tayyab, et al., 1991) содержание полимер-агрегат составляет не более 0,5%. Определенные анализом TNBSA (Cayot and Tainturier, 1997) карбамилированные лизины составляют 100%. Выход целевого продукта от 60 до 80% от исходного количества очищенного рекомбинантного дарбэпоэтина.Obtained by the claimed method, carbamylated darbepoetin 9C-DEPO (figure 1) has properties that define it as acceptable as a biopharmaceutical. The polymer aggregate content determined by gel chromatography (Tayyab, et al., 1991) is not more than 0.5%. The carbamylated lysines determined by the TNBSA assay (Cayot and Tainturier, 1997) are 100%. The yield of the target product is from 60 to 80% of the initial amount of purified recombinant darbepoetin.
Конечный продукт содержит не менее 90-95% заявляемого дарбэпоэтина 9C-DEPO, карбамилированного только по 8 лизиновым остаткам и N-концевому остатку аланина, что подтверждено методом аминокислотного анализа.The final product contains at least 90-95% of the claimed darbepoetin 9C-DEPO, carbamylated at only 8 lysine residues and the N-terminal residue of alanine, as confirmed by amino acid analysis.
Пример 1. Получение карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPOExample 1. Obtaining carbamylated darbepoetin 9C-DEPO
Очищенный рекомбинантный дарбэпоэтин в количестве 40 мг в концентрации 1,5 мг на мл переводят в 0,5 М боратный буфер, pH 9,0, на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System с использованием кассеты UPF-10-C-3X2MA. По окончании диафильтрации к раствору дарбэпоэтина в боратном буфере добавляют сухой цианат калия до концентрации 0,25 М. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре 37°C в течение 23 часа. После инкубации смесь быстро охлаждают на льду до t +4°C. В результате получают смесь, содержащую карбамилированный дарбэпоэтин.Purified recombinant darbepoetin in an amount of 40 mg at a concentration of 1.5 mg per ml was transferred to 0.5 M borate buffer, pH 9.0, on an ultra- and diafiltration system Quix Stand Benchtop System using a UPF-10-C-3X2MA cassette. After diafiltration, dry potassium cyanate was added to a solution of darbepoetin in borate buffer to a concentration of 0.25 M. The mixture was stirred and incubated at 37 ° C for 23 hours. After incubation, the mixture is rapidly cooled on ice to t + 4 ° C. The result is a mixture containing carbamylated darbepoetin.
Затем методом анионообменной хроматографии на сорбенте Fractogel TMAE (S) осуществляют отделение карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO от примеси, состоящей из недокарбамилированного и перекарбамилированного дарбэпоэтина, а также образующихся при карбамилировании агрегатов. Для этого смесь, содержащую карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO, переводят в буфер для анионообменной хроматографии на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System с использованием кассеты UPF-10-C-3X2MA.Then, by means of anion exchange chromatography on a Fractogel TMAE (S) sorbent, carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is separated from an impurity consisting of non-carbamylated and recarbamated darbepoetin, as well as aggregates formed during carbamylation. For this, the mixture containing carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is transferred to the anion exchange chromatography buffer on the Quix Stand Benchtop System ultra- and diafiltration system using the UPF-10-C-3X2MA cassette.
Буфер для анионообменной хроматографии (буфер А) содержит 20 мМ трис, 50 мМ NaCl, pH 8,3±0,2. Элюентный буфер (В) содержит 20 мМ трис, 1 М NaCl, pH 8,3±0,2. Элюцию заявляемого карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO производят линейным градиентом из буфера А в буфер В от 0 до 30% за 25 колоночных объемов.Anion exchange chromatography buffer (buffer A) contains 20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.3 ± 0.2. The eluent buffer (B) contains 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.3 ± 0.2. The inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is eluted with a linear gradient from buffer A to buffer B from 0 to 30% over 25 column volumes.
Основной пик карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO собирают, анализируют и объединяют. 9C-DEPO концентрируют и переводят в буфер, содержащий 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ натрия хлорида, на системе ультра- и диафильтрации Quix Stand Benchtop System.The main peak of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO is collected, analyzed and combined. 9C-DEPO was concentrated and transferred to a buffer containing 20 mM sodium citrate, 100 mM sodium chloride, on a Quix Stand Benchtop System.
Конечный продукт содержит 90% заявляемого дарбэпоэтина 9C-DEPO, карбамилированного только по 8 лизиновым остаткам и N-концевому остатку аланина, что подтверждено методом аминокислотного анализа. Количество аминокислотных остатков лизина в продукте, определенное анализом TNBSA, составляет 100%. Содержание полимер-агрегатов, определенное методом гель-хроматографии, составляет 0,5%. Выход конечного продукта 28 мг, что составляет 70% от исходного продукта.The final product contains 90% of the claimed darbepoetin 9C-DEPO, carbamylated at only 8 lysine residues and the N-terminal residue of alanine, as confirmed by amino acid analysis. The amount of amino acid residues of lysine in the product, determined by analysis of TNBSA, is 100%. The content of polymer aggregates, determined by gel chromatography, is 0.5%. The yield of the final product is 28 mg, which is 70% of the starting product.
Пример 2. Определение эритропоэтической активности заявляемого карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPOExample 2. Determination of the erythropoietic activity of the inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO
Эритропоэтическую активность карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO оценивают в тесте in vitro с клетками лейкемической клеточной линии TF1 (АТСС® CRL-2003™), осуществленном по методу Kitamura, Т., et al. (1989). В качестве контроля используют стандарт эритропоэтина BRP: фармакопейный (Европейской Фармакопеи) стандарт эритропоэтина человека и дарбэпоэтин альфа Аранесп (Amgen, США). Полученные данные роста клеточной линии показывают, что 9C-DEPO в концентрациях до 100 нг в мл не стимулирует пролиферацию клеток линии TF1. Результаты (фиг.2) позволяют сделать вывод, что заявляемый карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO не проявляет эритропоэтической активности in vitro.The erythropoietic activity of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO was evaluated in an in vitro test with TF1 leukemic cell line cells (ATCC® CRL-2003 ™), carried out according to the method of Kitamura, T., et al. (1989). The BRP erythropoietin standard is used as a control: the pharmacopoeial (European Pharmacopoeia) standard of human erythropoietin and darbepoetin alpha Aranesp (Amgen, USA). The obtained cell line growth data show that 9C-DEPO at concentrations up to 100 ng per ml does not stimulate the proliferation of TF1 cells. The results (figure 2) allow us to conclude that the inventive carbamylated darbepoetin 9C-DEPO does not show erythropoietic activity in vitro.
Пример 3. Определение цитопротекторного действия карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPOExample 3. Determination of the cytoprotective effect of carbamylated darbepoetin 9C-DEPO
Первичную культуру кардиомиоцитов получают из новорожденных крыс, как описано (De Windt, et al., 2000). Для этого из собранных сердец удаляют предсердия. Желудочки разрезают на мелкие куски и обрабатывают трипсином 10 раз. Кардиомиоциты помещают в 6-луночные культуральные планшеты и культивируют 36 часов в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенницилин/стрептомицин 100 ед/мл и L-глутамин 2 ммоль/л. Когда слой кардиомиоцитов покрывают 80% поверхности лунки в 6 луночном планшете, их подвергают воздействию гипоксии (недостатка кислорода) 1 час (95% N2 и атмосфере 5% CO2), а затем интенсивной оксигенации (возобновление подачи кислорода), как описано (Tramontano, et al., 2003). 9C-DEPO в конечной концентрации 100 нг/мл добавляют сразу после гипоксии, перед реоксигенацией.A primary culture of cardiomyocytes is obtained from newborn rats as described (De Windt, et al., 2000). For this, atria are removed from the collected hearts. The ventricles are cut into small pieces and trypsinized 10 times. Cardiomyocytes were placed in 6-well culture plates and cultured for 36 hours in DMEM medium (PanEco, Russia) supplemented with 10% fetal bovine serum, pennicillin / streptomycin 100 u / ml and L-glutamine 2 mmol / l. When a layer of cardiomyocytes covers 80% of the surface of the well in a 6 well plate, they are exposed to hypoxia (lack of oxygen) for 1 hour (95% N2 and 5% CO 2 atmosphere), and then intensive oxygenation (renewed oxygen supply) as described (Tramontano, et al., 2003). 9C-DEPO at a final concentration of 100 ng / ml is added immediately after hypoxia, before reoxygenation.
Эксперимент состоит из трех групп кардиомиоцитов: подвергнутые гипоксии + оксигенации; не подвергнутые воздействию гипоксии; подвергнутые гипоксии + оксигенации и обработанные заявляемым карбамилированным дарбэпоэтином 9C-DEPO. Процент апоптотических клеток определен с помощью анализа активности фермента каспазы 3 с использованием набора CaspGLOWTM fluorescein caspase-3 staining kit (Biovision, США), последующего разделения и подсчета меченых клеток на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter, США). Кардиомиоциты собирают через 4 часа после реоксигенации и инкубируют с флуоресцентным маркером FITC-DEVD-MK, входящего в набор CaspGLOWTM (Biovision, США) 60 минут при 37°C в атмосфере 5% CO2. Далее ресуспендированные кардиомиоциты анализируют на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter, США), процент неокрашенных и окрашенных флуоресцентной меткой клеток в цитофлуориметре соответствует проценту нормальных и апоптотических клеток.The experiment consists of three groups of cardiomyocytes: subjected to hypoxia + oxygenation; not exposed to hypoxia; subjected to hypoxia + oxygenation and treated with the claimed carbamylated darbepoetin 9C-DEPO. The percentage of apoptotic cells was determined by analyzing the activity of the caspase 3 enzyme using the CaspGLOWTM fluorescein caspase-3 staining kit (Biovision, USA), followed by separation and counting of labeled cells on a flow cytometer (Beckman Coulter, USA). Cardiomyocytes are harvested 4 hours after reoxygenation and incubated with the fluorescent marker FITC-DEVD-MK, included in the CaspGLOWTM kit (Biovision, USA) for 60 minutes at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Next, resuspended cardiomyocytes are analyzed on a flow cytometer (Beckman Coulter, USA), the percentage of unstained and fluorescently stained cells in the cytofluorimeter corresponds to the percentage of normal and apoptotic cells.
Полученные результаты демонстрируют (фиг.3), что карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO уменьшает процент апоптотических кардиомиоцитов - до 54% (9.15%±0.14 vs 19.98%±0.55, n=3, #P<0.05) в сравнении с группой гипоксия + оксигенация, в которой значительно увеличен уровень апоптотических кардиомиоцитов, до 300% (19.98±0.55 vs 4.64±0.32, n=3, *P<0.05) по сравнению с группой клеток, не подвергнутых действию гипоксии.The results obtained demonstrate (Fig. 3) that carbamylated darbepoetin 9C-DEPO reduces the percentage of apoptotic cardiomyocytes to 54% (9.15% ± 0.14 vs 19.98% ± 0.55, n = 3, #P <0.05) in comparison with the hypoxia + oxygenation group , in which the level of apoptotic cardiomyocytes is significantly increased, up to 300% (19.98 ± 0.55 vs 4.64 ± 0.32, n = 3, * P <0.05) compared with the group of cells not exposed to hypoxia.
Таким образом, внесение 100 нг/мл препарата 9C-DEPO почти наполовину уменьшает проявление апоптоза на культуре клеток кардиомиоцитов крысы в условиях гипоксии в сравнении с контрольной группой гипоксия + оксигенация, что подтверждает цитопротекторный эффект заявляемого лекарственного средства.Thus, the introduction of 100 ng / ml of the 9C-DEPO preparation almost halves the manifestation of apoptosis on the cell culture of rat cardiomyocytes under hypoxia compared with the control group hypoxia + oxygenation, which confirms the cytoprotective effect of the claimed drug.
Таким образом, разработан способ получения карбамилированного дарбэпоэтина 9C-DEPO, карбамилированного по всем восьми остаткам лизина и остатку аланина в N-концевой области этого белка, и получен карбамилированный дарбэпоэтин 9C-DEPO, который обладает более длительным временем полужизни в сравнении с карбамилированным эритропоэтином (СЕРО), а следовательно, может быть перспективен при применении in vivo в качестве цитопротекторного лекарственного средства при заболеваниях, приводящих к гибели клеток, вызванной гипоксией. Заявляемый способ получения лекарственного средства на основе карбамилированного дарбэпоэтина 9С-DEPO требует по сравнению с ближайшим аналогом в два раза меньше времени для осуществления.Thus, a method was developed for producing carbamylated darbepoetin 9C-DEPO carbamylated at all eight lysine residues and an alanine residue in the N-terminal region of this protein, and carbamylated darbepoetin 9C-DEPO was obtained, which has a longer half-life compared to carbamylated erythropoietin (CEPO ), and therefore, can be promising when used in vivo as a cytoprotective drug for diseases that lead to cell death caused by hypoxia. The inventive method for producing a medicinal product based on carbamylated darbepoetin 9C-DEPO requires two times less time for implementation in comparison with the closest analogue.
Список литературыBibliography
Bernaudin, M., et al. (1999) A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice, J Cereb Blood Flow Metab, 19, 643-651.Bernaudin, M., et al. (1999) A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice, J Cereb Blood Flow Metab, 19, 643-651.
Brines, M.L., et al. (2000) Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-10531.Brines, M. L., et al. (2000) Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-10531.
Cayot, P. and Tainturier, G. (1997) The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination, Anal Biochem, 249, 184-200.Cayot, P. and Tainturier, G. (1997) The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination, Anal Biochem, 249, 184-200.
De Windt, L.J., et al. (2000) Calcineurin-mediated hypertrophy protects cardiomyocytes from apoptosis in vitro and in vivo: An apoptosis-independent model of dilated heart failure, Circ Res, 86, 255-263.De Windt, L. J., et al. (2000) Calcineurin-mediated hypertrophy protects cardiomyocytes from apoptosis in vitro and in vivo: An apoptosis-independent model of dilated heart failure, Circ Res, 86, 255-263.
Grasso, G., et al. (2009) Neuroprotective effect of erythropoietin and darbepoetin alfa after experimental intracerebral hemorrhage, Neurosurgery, 65, 763-769; discussion 769-770.Grasso, G., et al. (2009) Neuroprotective effect of erythropoietin and darbepoetin alfa after experimental intracerebral hemorrhage, Neurosurgery, 65, 763-769; discussion 769-770.
Henn, F.A. and Braus, D.F. (1999) Structural neuroimaging in schizophrenia. An integrative view of neuromorphology, EurArch Psychiatry Clin Neurosci, 249 Suppl 4, 48-56.Henn, F.A. and Braus, D.F. (1999) Structural neuroimaging in schizophrenia. An integrative view of neuromorphology, EurArch Psychiatry Clin Neurosci, 249 Suppl 4, 48-56.
Kitamura, Т., et al. (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin, J Cell Physiol, 140, 323-334.Kitamura, T., et al. (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin, J Cell Physiol, 140, 323-334.
Lapchak, P.A. (2010) Erythropoietin molecules to treat acute ischemic stroke: a translational dilemmal, Expert Opin Investig Drugs, 19, 1179-1186.Lapchak, P.A. (2010) Erythropoietin molecules to treat acute ischemic stroke: a translational dilemmal, Expert Opin Investig Drugs, 19, 1179-1186.
Leist, M., et al. (2004) Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 305, 239-242.Leist, M., et al. (2004) Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 305, 239-242.
Livnah, O., et al. (1998) An antagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation, Nat Struct Biol, 5, 993-1004.Livnah, O., et al. (1998) An antagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation, Nat Struct Biol, 5, 993-1004.
Messe, S.R., et al. (2013) A pilot study of darbepoetin alfa for prophylactic neuroprotection in aortic surgery, Neurocrit Care, 18, 75-80.Messe, S. R., et al. (2013) A pilot study of darbepoetin alfa for prophylactic neuroprotection in aortic surgery, Neurocrit Care, 18, 75-80.
Middleton, S.A., et al. (1999) Shared and unique determinants of the erythropoietin (EPO) receptor are important for binding EPO and EPO mimetic peptide, J Biol Chem, 274, 14163-14169.Middleton, S. A., et al. (1999) Shared and unique determinants of the erythropoietin (EPO) receptor are important for binding EPO and EPO mimetic peptide, J Biol Chem, 274, 14163-14169.
Morishita, E., et al. (1997) Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons, and erythropoietin prevents in vitro glutamate-induced neuronal death, Neuroscience, 76, 105-116.Morishita, E., et al. (1997) Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons, and erythropoietin prevents in vitro glutamate-induced neuronal death, Neuroscience, 76, 105-116.
Ramirez, R., et al. (2009) Carbamylated darbepoetin derivative prevents endothelial progenitor cell damage with no effect on angiogenesis, J Mol Cell Cardiol, 47, 781-788.Ramirez, R., et al. (2009) Carbamylated darbepoetin derivative prevents endothelial progenitor cell damage with no effect on angiogenesis, J Mol Cell Cardiol, 47, 781-788.
Ruscher, K., et al. (2002) Erythropoietin is a paracrine mediator of ischemic tolerance in the brain: evidence from an in vitro model, J Neurosci, 22, 10291-10301.Ruscher, K., et al. (2002) Erythropoietin is a paracrine mediator of ischemic tolerance in the brain: evidence from an in vitro model, J Neurosci, 22, 10291-10301.
Sanchis-Gomar, F., Perez-Quilis, C. and Lippi, G. (2013) Erythropoietin Receptor (EpoR) Agonism Is Used to Treat a Wide Range of Disease, Mol Med, 19, 62-64.Sanchis-Gomar, F., Perez-Quilis, C. and Lippi, G. (2013) Erythropoietin Receptor (EpoR) Agonism Is Used to Treat a Wide Range of Disease, Mol Med, 19, 62-64.
Tayyab, S., Qamar, S. and Islam, M. (1991) Size exclusion chromatography and size exclusion HPLC of proteins, Biochemical Education, 19, 149-152.Tayyab, S., Qamar, S. and Islam, M. (1991) Size exclusion chromatography and size exclusion HPLC of proteins, Biochemical Education, 19, 149-152.
Torup, L. and Leist, M. (2006) Development of Non-Erythropoietic Erythropoietin Variants for Neuroprotection. In Höke, A. (ed), Erythropoietin and the Nervous System. Springer US, pp.211-219.Torup, L. and Leist, M. (2006) Development of Non-Erythropoietic Erythropoietin Variants for Neuroprotection. In Höke, A. (ed), Erythropoietin and the Nervous System. Springer US, pp. 211-219.
Tramontano, A.F., et al. (2003) Erythropoietin protects cardiac myocytes from hypoxia-induced apoptosis through an Akt-dependent pathway, Biochem Biophys Res Commun, 308, 990-994.Tramontano, A.F., et al. (2003) Erythropoietin protects cardiac myocytes from hypoxia-induced apoptosis through an Akt-dependent pathway, Biochem Biophys Res Commun, 308, 990-994.
Vogeley, K., et al. (2001) Right frontal hypergyria differentiation in affected and unaffected siblings from families multiply affected with schizophrenia: a morphometric mri study. Am J Psychiatry, 158, 494-496.Vogeley, K., et al. (2001) Right frontal hypergyria differentiation in affected and unaffected siblings from families multiply affected with schizophrenia: a morphometric mri study. Am J Psychiatry, 158, 494-496.
Yilmaz, E.R., et al. (2012) Effects of darbepoetin-alpha in spinal cord ischemia-reperfusion injury in the rabbit, Acta Neurochir (Wien), 154, 1037-1043; discussion 1043-1034.Yilmaz, E. R., et al. (2012) Effects of darbepoetin-alpha in spinal cord ischemia-reperfusion injury in the rabbit, Acta Neurochir (Wien), 154, 1037-1043; discussion 1043-1034.
Claims (2)
AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys
GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAsnGluThrCysSerLeuAsnGluAsnIleThr
ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla
ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu
LeuValAsnSerSerGlnValAsnGluThrLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer
GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer
ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys
LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla
CysArgThrGlyAspArg
путем перевода дарбэпоэтина в буфер для карбамилирования, инкубирования полученной смеси в течение 20-28 часов при pH 8,5-9,5 и последующего выделения из нее целевого продукта методом анионообменной хроматографии с использованием для элюции линейного градиента 1 М раствора хлористого натрия.1. A method of obtaining a variant of carbamylated darbepoetin corresponding to the sequence
AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys
GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAsnGluThrCysSerLeuAsnGluAsnIleThr
ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla
ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu
LeuValAsnSerSerGlnValAsnGluThrLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer
GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer
ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys
LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla
CysArgThrGlyAspArg
by transferring darbepoetin to a carbamylation buffer, incubating the resulting mixture for 20-28 hours at pH 8.5-9.5 and then isolating the desired product from it by anion exchange chromatography using a 1 M sodium chloride solution for linear elution.
AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys
GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAsnGluThrCysSerLeuAsnGluAsnIleThr
ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla
ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu
LeuValAsnSerSerGlnValAsnGluThrLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer
GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer
ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys
LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla
CysArgThrGlyAspArg
полученного способом по п. 1. 2. A drug with a prolonged cytoprotective effect, which is a variant of carbamylated darbepoetin corresponding to the sequence
AlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLys
GluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAsnGluThrCysSerLeuAsnGluAsnIleThr
ValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnGlnAla
ValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeu
LeuValAsnSerSerGlnValAsnGluThrLeuGlnLeuHisValAspLysAlaValSer
GlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGlnLysGluAlaIleSer
ProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrIleThrAlaAspThrPheArgLys
LeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAla
CysArgThrGlyAspArg
obtained by the method of claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131194/15A RU2575773C2 (en) | 2013-07-09 | Carbamylated darbepoetin 9c-depo, method for production thereof and use thereof as medicinal agent having cytoprotective action |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131194/15A RU2575773C2 (en) | 2013-07-09 | Carbamylated darbepoetin 9c-depo, method for production thereof and use thereof as medicinal agent having cytoprotective action |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013131194A RU2013131194A (en) | 2015-01-20 |
| RU2575773C2 true RU2575773C2 (en) | 2016-02-20 |
Family
ID=
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2643579C1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-02-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for preventing ischemic neuropathy of the optic nerve by carbamylated darbepoetin in experiment |
| RU2695334C1 (en) * | 2018-09-25 | 2019-07-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for preventing renal dysfunctions with carbamylated darbepoetin in experiment |
| RU2720103C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-04-24 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of correction of microcirculation disorders in placenta with carbamylated darbepoetin in adma-like model of preeclampsia |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007120614A2 (en) * | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Homogeneous erythropoietin and other peptides and proteins, methods and intermediates for their preparation |
| WO2008065372A2 (en) * | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007120614A2 (en) * | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Homogeneous erythropoietin and other peptides and proteins, methods and intermediates for their preparation |
| WO2008065372A2 (en) * | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RAMIREZ R. et al. Carbamylated darbepoetin derivative prevents endothelial progenitor cell damage with no effect on angiogenesis. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 47 (2009). PP. 781-788. * |
| VILLA P. et al. Reduced functional deficits, neuroinflammation, and secondary tissue damage after treatment of stroke by nonerythropoietic erythropoietin derivatives. J Cereb Blood Flow Metab. 2007 Mar; 27(3), PP. 552-563. LEIST M. et al. Derivatives of Erythropoietin That Are Tissue Protective ButNot Erythropoietic. SCIENCE VOL 305 9 JULY 2004. PP. 239-242. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2643579C1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-02-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for preventing ischemic neuropathy of the optic nerve by carbamylated darbepoetin in experiment |
| RU2695334C1 (en) * | 2018-09-25 | 2019-07-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for preventing renal dysfunctions with carbamylated darbepoetin in experiment |
| RU2720103C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-04-24 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of correction of microcirculation disorders in placenta with carbamylated darbepoetin in adma-like model of preeclampsia |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5025470B2 (en) | Novel carbamylated EPO and process for producing the same | |
| KR100507715B1 (en) | Neuropathic Pain Reduction Method Using Prosaposin-based Peptides | |
| US6472178B1 (en) | Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof | |
| JP5231214B2 (en) | Erythropoietin mutant | |
| JP6258197B2 (en) | Retinal disease treatment method | |
| DK1729810T3 (en) | PROCEDURE FOR REDUCING AGGREGATION OF IL-1RA | |
| KR20200075044A (en) | Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage | |
| KR20240025721A (en) | Methods and compositions for treating age-associated conditions | |
| US10501497B2 (en) | Cyclic polypeptides, method for obtaining them and the therapeutic use thereof | |
| US6262024B1 (en) | Neuron regulatory factor for promoting neuron survival | |
| CN109111517B (en) | Modified growth differentiation factor and preparation method and application thereof | |
| DK2733149T3 (en) | RELATIONS AND PHARMACEUTICAL COMBINATION FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE and ischemic BRAIN DISEASES | |
| EA009771B1 (en) | Neublastin polypeptide, method for making thereof and use | |
| RU2575773C2 (en) | Carbamylated darbepoetin 9c-depo, method for production thereof and use thereof as medicinal agent having cytoprotective action | |
| KR102414649B1 (en) | Erythropoietin-derived peptide, preparation method therefor, and use thereof | |
| JP2018506506A (en) | Neurodegenerative disorder | |
| CA2038208A1 (en) | Process for the isolation and expression of the human ciliary neuronotrophic factor by recombinant dna technology | |
| WO1998039357A1 (en) | Method of alleviating neuropathic pain | |
| EA039314B1 (en) | Polypeptide pharmaceutically acceptable salts and use thereof | |
| Jones et al. | In Silico Investigation of the binding of MCoTI-II plant defense knottin to the γ-NGF serine protease of the 7S nerve growth factor complex and biological activity of its NGF mimetic properties | |
| Knorr et al. | The cytokine receptor CRLF3 is a human neuroprotective EV-3 (Epo) receptor | |
| US6809175B1 (en) | Cadherin derived growth factor and its use | |
| DE60038731T2 (en) | HISTIDINE PROTEIN PHOSPHATASE | |
| JP7248676B2 (en) | neuroprotective peptide | |
| JP2003507393A (en) | Modified ciliary neurotrophic factors, methods of making them and methods of using them |