EA042409B1

EA042409B1 - Полипептиды, связывающие cd3

Info

Publication number: EA042409B1
Application number: EA201890613
Authority: EA
Inventors: Филип ТАН; Джон В. БЛАНКЕНШИП
Original assignee: Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2023-02-10

Description

Данная заявка заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки на патент США №

62/221190, поданной 21 сентября 2015 г. Содержание этой заявки в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

Описание текстового файла, поданного в электронной форме

Содержание текстового файла, поданного в электронной форме, в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки: копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (название файла: APVO_052_01WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 21 сентября 2016 г., размер файла составляет 544 кБ).

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к молекулам, которые специфически связываются с CD3, которые могут иметь по меньшей мере один гуманизированный CD3-связывающий домен. Белковое терапевтическое средство, связывающее CD3, может представлять собой белковое терапевтическое средство или мультиспецифическое белковое терапевтическое средство. Мультиспецифическое белковое терапевтическое средство может связывать субъединицы как опухолевого антигена, так и CD3 комплекса Тклеточного рецептора на Т-клетках, чтобы индуцировать мишень-зависимую цитотоксичность, активацию и пролиферацию Т-клеток.

Уровень техники изобретения

Нацеливание анти-CD3 антител на комплекс Т-клеточного рецептора (ТКР) на человеческих Тклетках было предложено для лечения аутоиммунного заболевания и родственных нарушений, например для лечения отторжения органного аллотрансплантата. Кроме моноспецифических терапевтических средств, нацеленных на CD3, мультиспецифические полипептиды, которые избирательно связываются как с Т-клетками, так и с опухолевыми клетками, могут обеспечивать механизм для перенаправления Тклеточной цитотоксичности на опухолевые клетки. Такие мультиспецифические полипептиды могут быть полезны для лечения рака. Клиническое применение некоторых анти-CD3 антител было затруднено серьезными побочными явлениями. Например, ОКТЗ, мышиное моноклональное антитело, специфическое в отношении человеческого CD3, индуцировало пролиферацию Т-клеток и выработку цитокинов in vitro и приводило к масштабному высвобождению цитокинов in vivo (Hirsch et al. (1989) J. Immunol 142: 737-43). Высвобождение цитокинов (также называемое цитокиновым штормом) в свою очередь приводило к гриппоподобному синдрому, характеризуемому лихорадкой, ознобом, головными болями, тошнотой, рвотой, диареей, дыхательной недостаточностью, септическим менингитом и гипотензией (Chatenoud (2003) Nature Reviews 3:123-132).

Существует потребность в CD3-связывающих молекулах, которые имеют улучшенную термостабильность с благоприятным профилем в отношении возможности производства и сниженными неблагоприятными явлениями.

Сущность изобретения

Данное изобретение включает в себя CD3-связывающие домены и полипептиды, которые имеют обеспечивающий преимущество профиль возможности производства. Описанные в данном документе полипептиды, содержащие CD3-связывающие домены, могут быть термически стабильными. В некоторых случаях полипептид имеет улучшенную термостабильность по сравнению с другим CD3связывающим полипептидом. Описанные в данном документе CD3-связывающие домены и полипептиды могут иметь сниженные побочные явления (например, могут приводить к высвобождению низких уровней цитокинов при введении субъекту). В определенных вариантах реализации данное изобретение относится к CD3-связывающему домену, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина; при этом вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая (а) по меньшей мере на приблизительно 93% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 88; или (b) по меньшей мере на приблизительно 94% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 89; и при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 82% идентична, по меньшей мере на приблизительно 85% идентична, по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 86. CD3-связывающий домен может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизи- 1 042409 тельно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 84. CD3-связывающий домен может содержать SEQ ID

NO: 83 или SEQ ID NO: 84.

В одном варианте реализации CD3-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность LCDR1 согласно SEQ ID NO: 94, аминокислотную последовательность LCDR2 согласно SEQ ID NO: 95 и аминокислотную последовательность LCDR3 согласно SEQ ID NO: 96, и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность HCDR1 согласно SEQ ID NO: 91, аминокислотную последовательность HCDR2 согласно SEQ ID NO: 92 и аминокислотную последовательность HCDR3 согласно SEQ ID NO: 93. В другом варианте реализации CD3-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность LCDR1 согласно SEQ ID NO: 202, аминокислотную последовательность LCDR2 согласно SEQ ID NO: 203 и аминокислотную последовательность LCDR3 согласно SEQ ID NO: 204, и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность HCDR1 согласно SEQ ID NO: 199, аминокислотную последовательность HCDR2 согласно SEQ ID NO: 200 и аминокислотную последовательность HCDR3 согласно SEQ ID NO: 201. В определенных аспектах CD3-связывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которые содержат каркасные области, и по меньшей мере одна из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина и вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина может быть гуманизирована. В одном варианте реализации вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGKV3D-20*1. В другом варианте реализации вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGHV1-69*02. В некоторых вариантах реализации аминокислотный остаток в позиции 52 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой аргинин и/или аминокислотный остаток в позиции 53 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой триптофан. Аминокислотный остаток в позиции 27 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена может представлять собой тирозин. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий домен содержит одно или более из следующего: (а) аминокислотный остаток в позиции 9 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой пролин; (b) аминокислотный остаток в позиции 53 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой изолейцин; и (с) аминокислотный остаток в позиции 21 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой метионин. Аминокислотный остаток в позиции 87 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена может представлять собой тирозин. Аминокислотный остаток в позиции 86 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена может представлять собой аспарагиновую кислоту. В одном варианте реализации аминокислотный остаток в позиции 86 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой аспарагиновую кислоту, а аминокислотный остаток в позиции 87 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой тирозин. Данное изобретение также включает CD3-связывающий домен, который представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых аспектах scFv может содержать линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи. В одном варианте реализации линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи содержит аминокислотную последовательность QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи scFv является аминоконцевой относительно вариабельной области легкой цепи scFv. В других вариантах реализации вариабельная область легкой цепи scFv является аминоконцевой относительно вариабельной области тяжелой цепи scFv. Данное изобретение включает CD3-связывающий домен, который имеет термостабильность, повышенную по меньшей мере на 10% по сравнению с термостабильностью CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Средняя точка термоперехода (Tm) CD3связывающего домена может быть повышена по меньшей мере на приблизительно 3°С, по меньшей мере на приблизительно 4°С, по меньшей мере на приблизительно 5°С или по меньшей мере на приблизительно 6°С и до приблизительно 20°С по сравнению с Tm CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Средняя точка термоперехода CD3-связывающего домена может составлять по меньшей мере приблизительно 54°С, по меньшей мере приблизительно 55°С, по меньшей мере

- 2 042409 приблизительно 56°С или по меньшей мере приблизительно 57°С и до приблизительно 72°С. Термостабильность или среднюю точку термоперехода CD3-связывающего домена можно определить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии или дифференциальной сканирующей флуориметрии. Описанный в данном документе CD3-связывающий домен может характеризоваться стабильностью при хранении, повышенной по меньшей мере на приблизительно 5%, по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90% и до приблизительно 100% по сравнению со стабильностью при хранении CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Стабильность при хранении можно определить после хранения CD3-связывαющего домена в ФСБ при приблизительно 25°С. В одном варианте реализации CD3-связывающий домен стабилен при хранении в ФСБ при приблизительно 25°С в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, по меньшей мере приблизительно 10 суток или по меньшей мере приблизительно 13 суток и до приблизительно 90 суток.

В некоторых аспектах описанный в данном документе CD3-связывающий домен имеет уровень высокомолекулярных агрегатов, образуемых во время рекомбинантной экспрессии, который по меньшей мере на приблизительно 5%, по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20% снижен, по меньшей мере приблизительно 30% снижен и до приблизительно 50% снижен по сравнению с уровнем высокомолекулярных агрегатов, образуемых во время рекомбинантной экспрессии, CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87.

Данное изобретение также относится к CD3-связывающему домену, который связывается с человеческим CD3 с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 10 нМ или меньше. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий домен согласно изобретению также может специфически связываться с CD3 яванского макака. Например, CD3-связывающий домен может связываться с CD3 яванского макака с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 нМ или меньше.

Данное изобретение включает CD3-связывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, причем (а) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность LCDR1 согласно SEQ ID NO: 94, аминокислотную последовательность LCDR2 согласно SEQ ID NO: 95 и аминокислотную последовательность LCDR3 согласно SEQ ID NO: 96, а вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность HCDR1 согласно SEQ ID NO: 91, аминокислотную последовательность HCDR2 согласно SEQ ID NO: 92 и аминокислотную последовательность HCDR3 согласно SEQ ID NO: 93; или (b) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность LCDR1 согласно SEQ ID NO: 202, аминокислотную последовательность LCDR2 согласно SEQ ID NO: 203 и аминокислотную последовательность LCDR3 согласно SEQ ID NO: 204, а вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность HCDR1 согласно SEQ ID NO: 199, аминокислотную последовательность HCDR2 согласно SEQ ID NO: 200 и аминокислотную последовательность HCDR3 согласно SEQ ID NO: 201; и при этом CD3-связывающий домен имеет одно или более свойств, описанных в данном документе. Например, (i) средняя точка термоперехода CD3связывающего домена (или белка, содержащего CD3-связывающий домен) составляет по меньшей мере приблизительно 54°С, по меньшей мере приблизительно 55°С, по меньшей мере приблизительно 56°С или по меньшей мере приблизительно 57°С и до приблизительно 72°С; (ii) CD3-связывающий домен (или белок, содержащий CD3-связывающий домен) стабилен при хранении в ФСБ при приблизительно 25°С в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, по меньшей мере приблизительно 10 суток или по меньшей мере приблизительно 13 суток и до приблизительно 90 суток; (iii) CD3-связывающий домен (или белок, содержащий CD3-связывающий домен) связывается с человеческим CD3 с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 10 нМ или меньше; и (iv) CD3-связывающий домен (или белок, содержащий CD3связывающий домен) связывается с CD3 яванского макака с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 нМ или меньше.

Данное изобретение также относится к CD3-связывающему полипептиду, содержащему любой из описанных в данном документе CD3-связывающих доменов. В некоторых вариациях CD3-связывающий полипептид может содержать константную область иммуноглобулина. Эта константная область иммуноглобулина может содержать домены иммуноглобулина СН2 и СН3 из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. В некоторых вариантах реализации константная область иммуноглобулина содержит СН2домен человеческого IgG1, содержащий замены L234A, L235A, G237A и К322А, в соответствии с системой нумерации EU. В определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина содержит СН2-домен человеческого IgG1, содержащий одну или более замен L234A, L235A, G237A и K322A, в соответствии с системой нумерации EU. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид при связывании с белком CD3 на Т-клетке не индуцирует или индуцирует минимальное вы- 3 042409 являемое высвобождение цитокинов из указанной Т-клетки. В определенных аспектах CD3связывающий белок или полипептид демонстрирует сниженное высвобождение цитокинов у пациента по сравнению с высвобождением цитокинов при введении пациенту анти-CD3 антитела ОКТЗ. В некоторых случаях CD3-связывающий полипептид может индуцировать активацию Т-клеток или пролиферацию Тклеток.

В определенных аспектах CD3-связывающий полипептид дополнительно содержит второй связывающий домен. Второй связывающий домен может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах реализации второй связывающий домен связывается или взаимодействует с опухолевым антигеном (например, PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, гликопротеиновым антигеном А33 (gpA33) или СЕА).

Данное изобретение дополнительно включает CD3-связывающий полипептид, содержащий: (i) CD3-связывающий домен и (ii) второй связывающий домен. В некоторых вариантах реализации CD3связывающий полипептид содержит, в порядке от аминоконца к карбокси-концу или в порядке от карбокси-конца к аминоконцу, (i) CD3-связывающий домен, (ii) шарнирную область и (iii) константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид содержит, в порядке от аминоконца к карбокси-концу, (i) второй связывающий домен, (ii) шарнирную область, (iii) константную область иммуноглобулина, (iv) карбокси-концевой линкер и (v) CD3-связывающий домен. В других вариантах реализации CD3-связывающий полипептид содержит, в порядке от карбокси-конца к амино-концу, (i) второй связывающий домен, (ii) шарнирную область, (iii) константную область иммуноглобулина, (iv) амино-концевой линкер и (v) CD3-связывающий домен. В определенных вариациях первый и/или второй связывающий домен представляет собой scFv. Неограничивающие примеры карбокси-концевых и амино-концевых линкеров включают гибкие линкеры, содержащие глицин-сериновые (например, (Gly4Ser)) повторы, и линкеры, полученные из (i) стволовой области лектина типа II С или (ii) шарнирной области иммуноглобулина. В определенных аспектах карбокси-концевой линкер (или аминоконцевой линкер) содержит или состоит из SEQ ID NO: 196. В некоторых аспектах данное изобретение относится к CD3-связывающему полипептиду (например, мультиспецифическому), в котором (i) CD3связывающий домен содержит (а) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (b) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3; а (ii) второй связывающий домен содержит (а) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (b) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Данное изобретение включает CD3-связывающий полипептид, который индуцирует перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (ПТКЦ). Например, CD3-связывающий полипептид может индуцировать ПТКЦ с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 пМ или меньше. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид не демонстрирует или демонстрирует минимальную активность антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или активность комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). В определенных аспектах нулевую активность АЗКЦ и/или КЗЦ получают посредством мутаций в шарнирной области и константной области Ig (например, Fc).

CD3-связывающий полипептид может дополнительно содержать домен гетеродимеризации иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен CH1 иммуноглобулина или домен CL иммуноглобулина. В некоторых аспектах CD3связывающий полипептид представляет собой гетеродимерный CD3-связывающий белок, содержащий (i) первую полипептидную цепь, содержащую, в порядке от амино-конца к карбокси-концу или от карбокси-конца к амино-концу, (а) CD3-связывающий домен, который специфически связывает человеческий CD3, (b) первую шарнирную область, (с) первую константную область иммуноглобулина и (d) первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина; и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую, в порядке от амино-конца к карбокси-концу или от карбокси-конца к амино-концу, (а') вторую шарнирную область, (b') вторую константную область иммуноглобулина и (с') второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина, который отличается от первого домена гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида, причем первый и второй домены гетеродимеризации иммуноглобулина связываются друг с другом с образованием гетеродимера. В одном варианте реализации первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен СН1 иммуноглобулина, а второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен CL иммуноглобулина или первый домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен CL иммуноглобулина, а второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит домен СН1 иммуноглобулина. По меньшей мере одна из первой и второй константных областей иммуноглобулина могут содержать домены иммуноглобулина СН2 и СН3 из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD или любой их комбинации; домен иммуноглобулина СН3 из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM или любой их комбинации; или домены иммуноглобулина СН3 и СН4 из IgE, IgM или их комбинации. В некоторых аспектах вторая полипептидная цепь гетеродимерного CD3-связывающего белка может дополнительно содержать второй связывающий домен. В определенных вариантах реализации второй связывающий домен может быть амино-концевым или карбокси-концевым относительно второй шарнирной области.

- 4 042409

В некоторых вариациях CD3-связывающий полипептид может представлять собой биспецифическую одноцепочечную молекулу антитела, содержащую CD3-связывающий домен и второй связывающий домен, причем связывающие домены расположены в порядке VH CD3-VL CD3-второй связывающий домен VH-второй связывающий домен VL, или VL CD3-VH CD3-второй связывающий домен VHвторой связывающий домен VL, или второй связывающий домен VH-второй связывающий домен VL-VH CD3-VL CD3, или второй связывающий домен VH-второй связывающий домен VL-VL CD3-VH CD3. Данное изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CD3связывающий домен или CD3-связывающий полипептид, описанный в данном документе, или часть указанного CD3-связывающего домена или полипептида. В некоторых аспектах данное изобретение включает экспрессионный вектор, содержащий сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий CD3связывающий домен или CD3-связывающий полипептид, описанный в данном документе, причем сегмент нуклеиновой кислоты функционально связан с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В данное изобретение включена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор.

Данное изобретение включает экспрессионный вектор, содержащий первую и вторую экспрессионные единицы, причем первая и вторая экспрессионные единицы соответственно содержат первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты, кодирующие первую и вторую полипептидные цепи гетеродимерного CD3-связывающего полипептида, и при этом первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты функционально связаны с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегментов нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Частью данного изобретения является рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор, содержащий первую и вторую экспрессионные единицы.

Данное изобретение дополнительно относится к способу получения CD3-связывающего полипептида, включающему: культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей описанный в данном документе экспрессионный вектор, в условиях, в которых происходит экспрессия сегмента нуклеиновой кислоты и, таким образом, получение CD3-связывающего полипептида. В некоторых вариантах реализации способ получения гетеродимерного CD3-связывающего белка включает: культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей первую и вторую экспрессионные единицы, причем первая и вторая экспрессионные единицы соответственно содержат первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты, кодирующие первую и вторую полипептидные цепи гетеродимерного CD3-связывающего белка, при этом первый и второй сегменты нуклеиновой кислоты функционально связаны с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегментов нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, и при этом указанное культивирование происходит в условиях, в которых происходит экспрессия первого и второго сегментов нуклеиновой кислоты, а кодируемые полипептидные цепи получают в виде гетеродимерного CD3-связывающего белка. Эти способы могут дополнительно включать выделение CD3связывающего полипептида или гетеродимерного CD3-связывающего белка.

Данное изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую описанный в данном документе CD3-связывающий полипептид и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Данное изобретение также относится к способу индукции перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (ПТКЦ) против клеток, экспрессирующих опухолеассоциированный антиген, включающему: приведение указанной экспрессирующей опухолеассоциированный антиген клетки в контакт с CD3-связывающим полипептидом, причем указанное приведение в контакт происходит в условиях, в которых индуцируется ПТКЦ против экспрессирующей опухолеассоциированный антиген клетки. Один аспект изобретения включает способ ингибирования роста опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества CD3-связывающего полипептида или фармацевтической композиции, описанных в данном документе. Данное изобретение включает способ лечения рака или аутоиммунного нарушения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества CD3-связывающего полипептида или фармацевтической композиции, описанных в данном документе. Неограничивающие примеры рака, который можно лечить с помощью способов и CD3-связывающих полипептидов, описанных в данном документе, включают рак простаты, колоректальный рак, почечноклеточную карциному, рак мочевого пузыря, рак слюнной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), меланому, рак надпочечников, мантийноклеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому, острый миелоцитарный лейкоз (ОМЛ), В-лимфоидный лейкоз, бластное новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток (БНПДК) и лейкоз ворсистых клеток.

Данное изобретение включает CD3-связывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 60. Данное изобретение также относится к CD3-связывающему белку, который представляет собой димер из двух идентичных полипептидов, причем каждый полипептид представляет собой любой из описанных в данном документе CD3-связывающих полипептидов.

Эти и другие варианты реализации и/или другие аспекты изобретения станут очевидны после изучения нижеприведенного подробного описания изобретения и прилагающихся графических материалов.

- 5 042409

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 (верхняя панель) представляет собой график, показывающий результаты определения методом проточной цитометрии связывания конструкций CD3-связывающего домена с Т-клетками Jurkat. По оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3-связывающего домена показана по оси х. В таблице (нижняя панель) приведены значения EC₅₀, полученные по данным графика.

Фиг. 2 (верхняя панель) представляет собой график, показывающий результаты определения методом проточной цитометрии связывания конструкций CD3-связывающего домена с субклоном линии Тклеток Jurkat с более высокими уровнями экспрессии CD3. По оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3связывающего домена показана по оси х. В таблице (нижняя панель) приведены значения EC₅₀, полученные по данным графика.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий результаты исследований методом дифференциальной сканирующей флуориметрии, проводимых для конструкций CD3-связывающего домена. На фигуре также приведены значения средней точки термоперехода (Tm), полученные по данным графика.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты определения методом проточной цитометрии связывания конструкций CD3-связывающего домена с субклоном линии Т-клеток Jurkat с более высокими уровнями экспрессии CD3. По оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3-связывающего домена показана по оси х.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты определения методом проточной цитометрии связывания конструкций CD3-связывающего домена с субклоном линии Т-клеток Jurkat с более высокими уровнями экспрессии CD3. По оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3-связывающего домена показана по оси х.

Фиг. 6 (верхняя панель) представляет собой график, показывающий результаты определения методом анализа высвобождения хрома-51 эффективности биспецифических анти-PSMA и анти-CD3 конструкций в отношении индукции мишень-зависимой Т-клеточной цитотоксичности человеческими МКПК за 4 ч против клеток С4-2В. По оси у показан процент специфического лизиса по сравнению с контрольным общим лизисом. Концентрация (пМ) конструкций CD3-связывающего домена показана по оси х. В таблице (нижняя панель) приведены значения EC₅₀, полученные по данным графика.

Фиг. 7А и 7В представляют собой графики, показывающие результаты определения методом проточной цитометрии связывания конструкций CD3-связывающего домена с Т-клетками яванского макака. На каждом графике по оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3-связывающего домена показана на каждом графике по оси х.

Фиг. 8А и 8В представляют собой графики, показывающие результаты определения методом анализа высвобождения хрома-51 эффективности конструкций CD3-связывающего домена в отношении индукции мишень-зависимой Т-клеточной цитотоксичности МКПК яванского макака за 4 ч против клеток С4-2В. На каждом графике по оси у показан процент специфического лизиса по сравнению с контрольным общим лизисом. Концентрация (пМ) конструкций CD3-связывающего домена показана на каждом графике по оси х.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий результаты определения методом проточной цитометрии связывания биспецифических анти-CD37 и анти-CD3 конструкций с Т-клетками яванского макака. По оси у показана средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) связанных молекул на живых клетках. Концентрация (нМ) конструкций CD3-связывающего домена показана по оси х. TSC394 DY относится к конструкции TSC394, включающей замены E86D и F87Y.

Фиг. 10 (верхняя панель) представляет собой график, показывающий результаты определения методом анализа высвобождения хрома-51 эффективности биспецифических анти-CD37 и анти-CD3 конструкций в отношении индукции мишень-зависимой Т-клеточной цитотоксичности МКПК яванского макака за 4 ч против клеток Ramos. На каждом графике по оси у показан процент специфического лизиса по сравнению с контрольным общим лизисом. Концентрация (пМ) конструкций CD3-связывающего домена показана на каждом графике по оси х. В таблице (нижняя панель) приведены значения EC₅₀, полученные по данным графика. TSC394 DY относится к конструкции TSC394, включающей замены E86D и F87Y.

Фиг. 11 представляет собой график, показывающий результаты определения стабильности при хранении конструкций CD3-связывающего домена при 25°С в течение количества суток, указанного по оси х. CAS105 представляет собой контрольную конструкцию, содержащую CD3-связывающий домен DRA222.

Фиг. 12 представляет собой график, показывающий результаты определения сывороточной стабильности в человеческой сыворотке для анти-ROR1 х анти-CD3 биспецифических молекул в течение количества суток, указанного по оси х.

- 6 042409

На фиг. 13 показано выравнивание аминокислотных последовательностей DRA222 scFv (SEQ ID

NO: 85), TSC455 scFv (SEQ ID NO: 83) и TSC456 scFv (SEQ ID NO: 84). Последовательности этих конструкций также приведены в табл. 14.

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий результаты определения сывороточной концентрации анти-PSMA Х анти-CD3 биспецифических связывающих молекул у мышей BALB/c в виде функции от времени. Результаты выражены в виде средней сывороточной концентрации (мкг/мл) в динамике по времени для каждой из групп обработки. Каждая точка показывает среднее значение (+ стандартное отклонение) для отдельных животных.

Фиг. 15 представляет собой таблицу, в которой показано сравнение фармакокинетических параметров анти-PSMA Х анти-CD3 биспецифических связывающих молекул у мышей BALB/c.

Фиг. 16 представляет собой график, показывающий результаты определения сывороточной концентрации анти-ROR1 Х анти-CD3 биспецифических связывающих молекул у мышей NSG в виде функции от времени. Результаты выражены в виде средней сывороточной концентрации (мкг/мл) в динамике по времени для каждой из групп обработки.

Фиг. 17А и 17В представляют собой таблицы, в которых показано сравнение фармакокинетических параметров анти-ROR1 Х анти-CD3 биспецифических связывающих молекул у мышей NSG. На фиг. 17А показаны оценочные фармакокинетические параметры, рассчитанные с использованием НКА для В/В дозирования, с выборочным взятием образцов и постоянным взвешиванием для каждой группы обработки. На фиг. 17В показаны оценочные фармакокинетические параметры, определенные с помощью применения 2-компартментной В/В модели с 1/Y взвешиванием для каждой группы обработки.

Фиг. 18 представляет собой график, показывающий результаты анализа действия анти-ROR1 Х анtu-CD3 биспецифических связывающих молекул на рост ксенографтной опухоли MDA-MB-231.

Фиг. 19 представляет собой график, показывающий результаты анализа действия анти-ROR1 Х анtu-CD3 биспецифических связывающих молекул на рост ксенографтной опухоли Kasumi-2. Результаты показаны для донора человеческих Т-клеток #336.

Подробное описание изобретения

В данном изобретении предложены связывающие домены, которые специфически связываются с CD3 (кластер дифференцировки 3), и связывающие молекулы (например, полипептиды и белки), которые специфически связываются с CD3. Эти связывающие молекулы могут специфически связываться с CD3 и по меньшей мере с одной другой мишенью. В некоторых вариантах реализации описанная в данном документе CD3-связывающαя молекула имеет благоприятный профиль возможности производства, характеризуемый одним или более свойствами, описанными ниже. В определенных вариантах реализации для конструирования CD3-связывающих молекул с улучшенными и новыми свойствами использовали CDR из анти-CD3 антитела Cris7. Соответственно, данное изобретение относится к гуманизированным анти-CD3 связывающим доменам и белкам, имеющим улучшенные свойства (например, термостабильность, стабильность при хранении, сывороточное время полужизни, сниженное образование высокомолекулярных агрегатов) по сравнению с другими анти-CD3 связывающими доменами и белками. В некоторых аспектах изобретения CD3-связывающая молекула является термостабильной. Например, указанная молекула может иметь улучшенную термостабильность по сравнению с другой CD3-связывающей молекулой (например, DRA222). CD3-связывающие молекулы могут характеризоваться высоким выходом при получении и длительным сывороточным временем полужизни и длительным полупериодом хранения. Кроме того, описанные в данном документе CD3-связывающие молекулы могут характеризоваться низким риском возникновения нежелательных побочных явлений при введении субъекту. Например, CD3-связывающие молекулы могут приводить к высвобождению низких уровней цитокинов.

В настоящем описании любой диапазон концентраций, диапазон процентных значений, диапазон соотношений или диапазон целых чисел следует понимать как включающий значение любого целого числа в указанном диапазоне и, когда это целесообразно, его дробные значения (такие как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. Следует понимать, что в контексте данного документа форма единственного числа относится к одному или более из пронумерованных компонентов, если не указано иное. Применение альтернативного варианта (например, или) следует понимать как означающее один, оба или любую комбинацию альтернативных вариантов. В контексте данного документа термины включать и содержать используются как синонимы. Кроме того, следует понимать, что полипептиды, содержащие различные комбинации компонентов (например, доменов или областей) и заместителей, описанных в данном документе, раскрыты в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждый полипептид был приведен индивидуальным образом. Таким образом, выбор конкретных компонентов отдельных полипептидов входит в объем настоящего изобретения.

Все документы или части документов, цитируемые в данном тексте, включая, но не ограничиваясь этим, патенты, заявки на патенты, статьи, книги и трактаты, в полном объеме явным образом включены в данный документ посредством ссылки в любых целях. В случае, если в одном или более из включенных документов или частей документов приведено определение термина, которое противоречит определению данного термина в настоящей заявке, приоритет имеет определение, приведенное в этой заявке. При этом упоминание любого ссылочного материала, статьи, публикации, патента, публикации патента и заявки на

- 7 042409 патент, цитируемых в данном документе, не является и не должно восприниматься как признание, или любая форма предположения того, что они составляют действительный уровень техники или формируют часть общеизвестного уровня техники в любой стране мира.

В контексте данного документа связывающий домен или связывающая область относится к домену, области, части или участку белка, полипептида, олигопептида или пептиду, или антителу, или связывающему домену, полученному из антитела, которые обладают способностью специфически распознавать и связывать молекулу-мишень, такую как антиген, лиганд, рецептор, субстрат или ингибитор (например, CD3). Примеры связывающих доменов включают одноцепочечные вариабельные области антитела (например, доменные антитела, sFv, scFv, scFab), эктодомены рецепторов и лиганды (например, цитокины, хемокины). В определенных вариантах реализации связывающий домен содержит или состоит из антигенсвязывающего участка (например, содержащего вариабельную последовательность тяжелой цепи и вариабельную последовательность легкой цепи или три определяющие комплементарность области (CDR) легкой цепи и три CDR тяжелой цепи из антитела, помещенные в альтернативные каркасные области (FR) (например, человеческие FR, необязательно содержащие одну или более аминокислотных замен). Известно множество видов анализа для определения связывающих доменов согласно настоящему изобретению, которые специфически связывают конкретную мишень, включая вестернблоттинг, ELISA, скрининг библиотек фагового дисплея и анализ взаимодействия BIACORE®. В контексте данного документа CD3-связывающий полипептид может иметь первый связывающий домен и, необязательно, второй связывающий домен. В определенных вариантах реализации первый связывающий домен представляет собой CD3-связывающий домен в формате антитела или антителоподобного белка или домена. В определенных вариантах реализации, включающих содержание как первого, так и второго связывающих доменов, второй связывающий домен представляет собой домен, связывающий опухолевый антиген. В других вариантах реализации второй связывающий домен представляет собой второй CD3-связывающий домен. В других вариантах реализации второй связывающий домен представляет собой связывающий домен, отличный от домена, связывающего опухолевый антиген.

Связывающий домен или белок специфически связывает мишень, если он связывает мишень с аффинностью или K_acc. (т.е. равновесной константой ассоциации конкретного взаимодействия связывания, измеряемой в единицах 1/М), равной или превышающей 105 М-1, в то же время не демонстрируя существенного связывания других компонентов, присутствующих в исследуемом образце. Связывающие домены могут быть классифицированы как высокоаффинные связывающие домены и низкоаффинные связывающие домены. К высокоаффинным связывающим доменам относятся связывающие домены с K_acc., составляющей по меньшей мере 10⁷ М^-1, по меньшей мере 10⁸ М^-1, по меньшей мере 10⁹ М^-1, по меньшей мере 10¹⁰ М^-1, по меньшей мере 10¹¹ М^-1, по меньшей мере 10¹² М^-1 или по меньшей мере 10¹³ М^-1. К низкоаффинным связывающим доменам относятся связывающие домены с Kacc., составляющей до 10⁷ М^-1, до 10⁶ М^-1, до 105 М^-1. В альтернативном варианте аффинность можно определить с помощью равновесной константы диссоциации (KдиCC.) конкретного взаимодействия связывания, измеряемой в единицах М (например, от 10^-5 М до 10^-13 М). Аффинность содержащих связывающие домены полипептидов и одноцепочечных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением можно легко определить, используя традиционные методы (см., например, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; и патенты США № 5283173, 5468614 или эквивалентные ссылки). В данной области техники CD3 известен как мультибелковый комплекс из шести цепей (см., например, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 и 178, 1999), которые являются субъединицами комплекса Т-клеточного рецептора. У млекопитающих субъединицами CD3 комплекса Т-клеточного рецептора являются цепь CD3y, цепь CD35, две цепи CD3ε и гомодимер из цепей CD3Z. Цепи CD3y, CD3δ и CD3ε представляют собой высокородственные белки клеточной поверхности из суперсемейства иммуноглобулинов, содержащие один домен иммуноглобулина. Трансмембранные области цепей CD3y, CD3δ и CD3ε заряжены отрицательно, что позволяет этим цепям связываться с положительно заряженными цепями Т-клеточных рецепторов. Внутриклеточные хвосты каждой из цепей CD3y, CD3δ и CD3ε содержат один консервативный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM, тогда как каждая цепь CD3Z содержит три таких мотива. Считается, что ITAM важны для способности комплекса ТКР передавать сигналы. CD3, используемые в настоящем изобретении, могут происходить от различных видов животных, включая человека, обезьяну, мышь, крысу или других млекопитающих. В контексте данного документа консервативной заменой в данной области техники считается замена одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет аналогичные свойства. Примеры консервативных замен хорошо известны в данной области техники (см., например, WO 97/09433, страница 10, опубликованную 13 марта 1997 г.; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY и Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). В определенных вариантах реализации консервативная замена включает замену лейцина на серин.

В контексте данного документа термин производное относится к модификации одного или более аминокислотных остатков пептида химическими или биологическими способами, с применением или без применения фермента, например, путем гликозилирования, алкилирования, ацилирования, образования

- 8 042409 сложного эфира или образования амида.

В контексте данного документа полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из указанного полипептида или белка, относится к происхождению полипептида. В определенных вариантах реализации полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из конкретной последовательности (иногда называемой стартовой или родительской последовательностью), имеет аминокислотную последовательность, которая практически идентична стартовой последовательности или ее части, причем указанная часть состоит из по меньшей мере 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот или по меньшей мере 30-50 аминокислот, или по меньшей мере 50-150 аминокислот, или которая каким-либо другим образом идентифицируется специалистом в данной области техники, как происходящая от стартовой последовательности. Например, связывающий домен может быть получен из антитела, например, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, однодоменного антитела (sdAb) и т. д. Полипептиды, полученные из другого полипептида, могут содержать одну или более мутаций по отношению к стартовому полипептиду, например, один или более аминокислотных остатков, замещенных другим аминокислотным остатком, или содержать одну или более вставок или делеций аминокислотных остатков. Полипептид может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет неприродное происхождение. Такие вариации обязательно имеют менее 100% идентичности или сходства последовательности со стартовым полипептидом. В одном варианте реализации вариант имеет аминокислотную последовательность, имеющую от приблизительно 60% до менее чем 100% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью стартового полипептида. В другом варианте реализации вариант имеет аминокислотную последовательность, имеющую от приблизительно 75% до менее чем 100%, от приблизительно 80% до менее чем 100%, от приблизительно 85% до менее чем 100%, от приблизительно 90% до менее чем 100%, от приблизительно 95% до менее чем 100% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью стартового полипептида.

В контексте данного документа, если не указано иное, позиция аминокислотного остатка в вариабельной области молекулы иммуноглобулина нумеруется в соответствии с критерием IMGT (Brochet, X, et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508), позиция аминокислотного остатка в константной области молекулы иммуноглобулина нумеруется в соответствии с номенклатурой EU (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94). Система нумерации по Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) является альтернативной системой, используемой для обозначения позиции аминокислотного остатка в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В контексте данного документа термин димер относится к биологическому соединению, которое состоит из двух субъединиц, связанных друг с другом посредством одной или более форм внутримолекулярных сил, включая ковалентные связи (например, дисульфидные связи) и другие взаимодействия (например, электростатические взаимодействия, солевые мостики, водородное связывание и гидрофобные взаимодействия), и является стабильным в соответствующих условиях (например, в физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессии, очистки и/или хранения рекомбинантных белков, или в условиях для неденатурирующего и/или невосстановительного электрофореза). В контексте данного документа гетеродимер или гетеродимерный белок относится к димеру, образованному двумя разными полипептидами. Гетеродимер не включает антитело, образуемое четырьмя полипептидами (т.е. двумя легкими цепями и двумя тяжелыми цепями). В контексте данного документа гомодимер или гомодимерный белок относится к димеру, образованному двумя идентичными полипептидами.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид содержит, в порядке от аминоконца к карбокси-концу или в порядке от карбокси-конца к амино-концу, (i) второй связывающий домен, (ii) шарнирную область, (iii) константную область иммуноглобулина, (iv) карбокси-концевой линкер (или амино-концевой линкер) и (v) CD3-связывающий домен. Согласно данному документу и в зависимости от контекста шарнирная область или шарнир относится к полипептидной области между связывающим доменом (например, CD3-связывающим доменом или вторым связывающим доменом) и константной областью иммуноглобулина. Согласно данному документу и в зависимости от контекста линкер может относиться к (1) полипептидной области между областями V_H и V_L в одноцепочечном Fv (scFv) или (2) полипептидной области между константной областью иммуноглобулина и вторым связывающим доменом в CD3-связывающем полипептиде, содержащем два связывающих домена. Полипептидная область между константной областью иммуноглобулина и CD3-связывающим доменом в CD3связывающем полипептиде, содержащем два связывающих домена, также может называться карбоксиконцевым линкером или амино-концевым линкером. Неограничивающие примеры карбокси-концевых и амино-концевых линкеров включают гибкие линкеры, содержащие глицин-сериновые повторы, и линкеры, полученные из (а) междоменной области трансмембранного белка (например, трансмембранного белка типа I); (b) стволовой области лектина типа II С; или (с) шарнирной области иммуноглобулина. Неограничивающие примеры шарнирных областей и линкеров приведены в табл. 1 и 2. В некоторых вариантах реализации линкер обеспечивает спейсерную функцию, совместимую с взаимодействием двух связывающих поддоменов таким образом, что получаемый в результате полипептид сохраняет аффин

- 9 042409 ность специфического связывания с той же самой молекулой-мишенью, что и антитело, которое содержит такие же вариабельные области легкой и тяжелой цепи. В определенных вариантах реализации линкер состоит из от пяти до приблизительно 35 аминокислот, например, от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. Шарнирная область иммуноглобулина дикого типа относится к аминокислотным последовательностям верхней и нижней шарнирной области природного происхождения, расположенным между и соединяющим домены СН1 и СН2 (в случае IgG, IgA и IgD) или расположенным между и соединяющим домены СН1 и СН3 (в случае IgE и IgM), находящиеся в тяжелой цепи антитела. В определенных вариантах реализации последовательность шарнирной области иммуноглобулина дикого типа является человеческой и может содержать шарнирную область человеческого IgG. Измененная шарнирная область иммуноглобулина дикого типа или измененная шарнирная область иммуноглобулина относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющей до 30% аминокислотных изменений (например, до 25%, 20%, 15%, 10% или 5% аминокислотных замен или делеций), или (b) части шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющей длину от приблизительно 5 аминокислот (например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот) до приблизительно 120 аминокислот (например, имеющей длину от приблизительно 10 до приблизительно 40 аминокислот или от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот, или от приблизительно 15 до приблизительно 20 аминокислот, или от приблизительно 20 до приблизительно 25 аминокислот), имеющей до приблизительно 30% аминокислотных изменений (например, до приблизительно 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% аминокислотных замен или делеций или их комбинацию) и содержащей основную шарнирную область IgG, описанную в US 2013/0129723 и US 2013/0095097.

В контексте данного документа термин гуманизированный относится к процессу, направленному на то, чтобы сделать антитело или связывающие белки и полипептиды иммуноглобулина, полученные от нечеловеческого вида (например, мыши или крысы), менее иммуногенными для людей, но при этом сохраняющими антигенсвязывающие свойства оригинального антитела, используя методы генетической инженерии. В некоторых вариантах реализации связывающий (-ие) домен (-ы) антитела или связывающих белков и полипептидов иммуноглобулина (например, вариабельные области легкой и тяжелой цепи, Fab, scFv) являются гуманизированными. Нечеловеческие связывающие домены можно гуманизировать, используя методы, известные как прививание CDR (Jones et al., Nature 321:522 (1986)), и их варианты, включая реконструирование (Verhoeyen et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest et al., Bio/Technol. 1991 9:266-271), гиперхимеризацию (Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033; Co et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869-2873; Co et al., 1992 J. Immunol. 148:1149-1154) и венирование (Mark et al., Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies. In: Metcalf B.W., Dalton B.J., eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312). В случае получения из нечеловеческого источника, другие области антитела или связывающих белков и полипептидов иммуноглобулина, такие как шарнирная область и домены константной области, также могут быть гуманизированы.

В контексте данного документа домен димеризации иммуноглобулина или домен гетеродимеризации иммуноглобулина относится к домену иммуноглобулина полипептидной цепи, который преимущественно взаимодействует или связывается с отличным доменом иммуноглобулина второй полипептидной цепи, причем взаимодействие разных доменов гетеродимеризации иммуноглобулина обеспечивает существенный вклад или эффективно стимулирует гетеродимеризацию первой и второй полипептидных цепей (т.е. образование димера между двумя разными полипептидными цепями, который также называется гетеродимером). Взаимодействие между доменами гетеродимеризации иммуноглобулина обеспечивает существенный вклад или эффективно стимулирует гетеродимеризацию первой и второй полипептидных цепей, если наблюдается статистически значимое снижение димеризации между первой и второй полипептидными цепями в отсутствие домена гетеродимеризации иммуноглобулина первой полипептидной цепи и/или домена гетеродимеризации иммуноглобулина второй полипептидной цепи. В определенных вариантах реализации, если первая и вторая полипептидные цепи экспрессируются вместе, по меньшей мере 60%, от по меньшей мере приблизительно 60% до приблизительно 70%, от по меньшей мере приблизительно 70% до приблизительно 80%, от по меньшей мере приблизительно 80% до приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% первой и второй полипептидных цепей образуют гетеродимеры друг с другом. Типовые домены гетеродимеризации иммуноглобулина включают СН1-домен иммуноглобулина, CL-домен иммуноглобулина (например, изотипы Ск и Сλ) или их производные, включая СН1- и CL-домены и измененные (или мутированные) СН1- и CLдомены иммуноглобулина, как предложено в данном документе. Константная область иммуноглобулина или константная область является термином, который согласно определению в данном документе относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая соответствует или получена из части или всего из одного или более доменов константной области. В определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина соответствует или получена из части или всего из одного или более доменов константной области, но не всех доменов константной области служащего источником антитела. В определенных вариантах реализации константная область содержит домены СН2 и СН3 IgG,

- 10 042409 например, домены СН2 и СН3 IgG1. В определенных вариантах реализации константная область не содержит домен СН1. В определенных вариантах реализации домены константной области, составляющие константную область, являются человеческими. В некоторых вариантах реализации (например, в некоторых вариациях CD3-связывающего белка или полипептида) домены константной области слитого белка согласно данному изобретению не имеют или имеют минимальные эффекторные функции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) и активации комплемента и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), сохраняя при этом способность связывать некоторые Fc-рецепторы (такие как FcRn, неонатальный Fc-рецептор) и сохраняя относительно длительное время полужизни in vivo. В других вариациях слитый белок согласно данному изобретению содержит константные домены, которые сохраняют такую эффекторную функцию одной или обеих из АЗКЦ и КЗЦ. В определенных вариантах реализации связывающий домен согласно данному изобретению слит с константной областью человеческого IgG1, причем константная область IgG1 содержит одну или более из следующих мутированных аминокислот: лейцин в позиции 234 (L234), лейцин в позиции 235 (L235), глицин в позиции 237 (G237), глутамат в позиции 318 (Е318), лизин в позиции 320 (K320), лизин в позиции 322 (K322) или любую их комбинацию (нумерация в соответствии с EU). Например, одна или более из этих аминокислот могут быть заменены на аланин. В дополнительном варианте реализации Fc-домен IgG1 содержит каждую из L234, L235, G237, Е318, K320 и K322 (в соответствии с нумерацией EU), мутированную на аланин (т.е. L234A, L235A, G237A, Е318А, К32ОА и К322А соответственно), и также, необязательно, мутацию N297A (т.е. практически устраняя гликозилирование СН2-домена).

Fc-область или Fc-домен относится к полипептидной последовательности, соответствующей или полученной из части исходного антитела, которая отвечает за связывание с рецепторами антитела на клетках и компонентом комплемента C1q. Fc означает кристаллизующийся фрагмент, фрагмент антитела, который легко образует белковый кристалл. Разные белковые фрагменты, которые были изначально описаны с помощью протеолитического расщепления, могут определять общую структуру белка иммуноглобулина. Согласно исходному определению в литературе, Fc-фрагмент состоит из дисульфидносвязанных шарнирных областей тяжелой цепи, доменов СН2 и СН3. Однако недавно данный термин был применен к одиночной цепи, состоящей из СН3, СН2 и по меньшей мере части шарнирной области, что достаточно для образования дисульфидно-связанного димера со второй такой цепью. Обзор структуры и функции иммуноглобулина смотрите в Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; и Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. В контексте данного документа термин Fc включает варианты последовательностей природного происхождения.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий белок содержит белковый каркас, в целом описанный, например, в публикациях заявок на патент США № 2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049. CD3-связывающий белок может содержать, в порядке от амино-конца к карбокси-концу, первый связывающий домен, шарнирную область и константную область иммуноглобулина. В других вариантах реализации CD3-связывающий белок содержит белковый каркас, в целом описанный, например, в публикации заявки на патент США № 2009/0148447. CD3-связывающий белок может содержать, в порядке от карбокси-конца к амино-концу, константную область иммуноглобулина, шарнирную область и первый связывающий домен. CD3-связывающие полипептиды и белки, описанные в данном документе, могут включать каркас мультиспецифического связывающего белка. Мультиспецифические связывающие белки и полипептиды, в которых используются каркасы, описаны, например, в публикации заявки согласно РСТ № WO 2007/146968, публикации заявки на патент США № 2006/0051844, публикации заявки согласно РСТ № WO 2010/040105, публикации заявки согласно РСТ № WO 2010/003108, патенте США № 7166707 и патенте США № 8409577, которые все в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. CD3-связывающий белок может содержать два связывающих домена (домены могут быть сконструированы так, чтобы специфически связывать одну и ту же или разные мишени), две шарнирные области и константную область иммуноглобулина. CD3-связывающий белок может представлять собой гомодимерный белок, содержащий два идентичных дисульфидно-связанных полипептида. В контексте данного документа стволовая область лектина типа II С относится к части внеклеточного домена лектина типа II С, расположенной между подобным лектину С-типа доменом (CTLD; например, сходным с CTLD рецепторов естественных клеток-киллеров) и трансмембранным доменом. Например, в человеческой молекуле CD94 (номер доступа GenBank № ААС50291.1, PRI 30 ноября, 1995) внеклеточный домен соответствует аминокислотным остаткам 34-179, тогда как CTLD соответствует аминокислотным остаткам 61-176. Соответственно, стволовая область человеческой молекулы CD94 содержит аминокислотные остатки 34-60, которые находятся между мембраной и CTLD (см. Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; в отношении описания других стволовых областей см. также Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; и Figdor et al., Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002). Эти лектины типа II С также могут содержать от шести до 10 соединительных аминокислот между стволовой областью и трансмембранной областью CTLD. В другом примере 233-аминокислотный человеческий белок NKG2A (номер доступа GenBank № Р26715.1, PRI 15 июня, 2010) содержит трансмембранный домен в пределах аминокислот 71-93 и внеклеточный домен в пределах аминокислот 94-233. CTLD состоит из аминокислот 119-231, а стволовая область содержит аминокислоты 99-116, которые фланкируются соединениями

- 11 042409 из пяти и двух аминокислот. Другие лектины типа II С, а также их внеклеточные лиганд-связывающие домены, междоменные или стволовые области и CTLD, известны в данной области техники (см., например, номера доступа GenBank № NP_001993.2; ААН07037.1, PRI 15 июля, 2006; NP_001773.1, PRI 20 июня, 1010; AAL65234.1, PRI 17 января, 2002, и САА04925.1, PRI 14 ноября, 2006, в отношении последовательностей человеческих CD23, CD69, CD72, NKG2A и NKG2D и их описаний соответственно). В контексте данного документа междоменная область трансмембранного белка (например, трансмембранного белка типа I) относится к части внеклеточного домена трансмембранного белка, расположенной между двумя соседними доменами. Примеры междоменных областей включают области, связывающие соседние домены Ig представителей суперсемейства иммуноглобулинов (например, шарнирная область иммуноглобулина из IgG, IgA, IgD или IgE; область, связывающая домены IgV и IgC2 в CD2; или область, связывающая домены IgV и IgC в CD80 или CD86). Другим примером междоменной области является область, связывающая не-Ig домен и домен IgC2 из CD22, связывающий сиаловую кислоту Igподобный лектин типа I.

Полипептидная область, полученная из стволовой области лектина типа II С или полученная из междоменной области трансмембранного белка (например, шарнирной области иммуноглобулина), относится к от приблизительно пяти до приблизительно 150-аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 100-аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 50-аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 40аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 30-аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 25-аминокислотной последовательности, от приблизительно 5 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 10 до приблизительно 25-аминокислотной последовательности, от приблизительно 10 до приблизительно 20аминокислотной последовательности, от приблизительно 8 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 9 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 10 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 11 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 12 до приблизительно 20аминокислотной последовательности, от приблизительно 13 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 14 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности, от приблизительно 15 до приблизительно 20-аминокислотной последовательности или приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-аминокислотной последовательности, при этом она вся или по меньшей мере ее часть содержит (i) последовательность дикого типа стволовой области или междоменной области; (ii) фрагмент последовательности дикого типа стволовой области или междоменной области; (iii) полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности аминокислотной последовательности с любым из (i) или (ii); или (iv) любым из (i) или (ii), в которых одна, две, три, четыре или пять аминокислот имеют делецию, вставку или замену или любую их комбинацию, например, одно или более изменений являются заменами или одна или более мутаций включают только одну делецию. В некоторых вариантах реализации производное стволовой области более устойчиво к протеолитическому расщеплению по сравнению с последовательностью стволовой области дикого типа, такое как полученные из от приблизительно восьми до приблизительно 20 аминокислот NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 или CD94.

В контексте данного документе соединительные аминокислоты или соединительные аминокислотные остатки относятся к одному или более (например, приблизительно 2-10) аминокислотным остаткам между двумя соседними областями или доменами полипептида, например, между шарнирной и соседней константной областью иммуноглобулина, или между шарнирным и соседним связывающим доменом, или между пептидным линкером и соседним вариабельным доменом иммуноглобулина или соседней константной областью иммуноглобулина. Соединительные аминокислоты могут являться результатом конструкции полипептида (например, аминокислотные остатки, появившиеся в результате использования сайта рестрикционного фермента во время конструирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид). В контексте данного документа выражение линкер между СН3 и СН1 или CL относится к одному или более (например, приблизительно 2-12, приблизительно 2-10, приблизительно 4-10, приблизительно 5-10, приблизительно 6-10, приблизительно 7-10, приблизительно 8-10, приблизительно 9-10, приблизительно 8-12, приблизительно 9-12 или приблизительно 10-12) аминокислотным остаткам между С-концом домена СН3 (например, СН3 дикого типа или мутированного СН3) и N-концом домена СН1 или домена CL (например, Ск).

В контексте данного документа термин нуждающийся пациент или нуждающийся субъект относится к пациенту или субъекту, подверженному риску или страдающему от заболевания, нарушения или патологического состояния, которое поддается лечению или уменьшению интенсивности с помощью CD3-связывающего белка или полипептида или его композиции, предложенных в данном документе. В контексте данного документа термин фармацевтически приемлемый относится к молекулярным соединениям и композициям, которые в общем случае не вызывают аллергических или других серьезных нежелательных реакций при введении способами, хорошо известными в данной области техники. Молекулярные соединения и композиции, утвержденные регуляторным органом федерального правительства или прави- 12 042409 тельства штата или перечисленные в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях для применения на животных и, в частности, на людях, считаются фармацевтически приемлемыми.

В контексте данного документа термин промотор относится к области ДНК, вовлеченной в связывание РНК-полимеразы для инициации транскрипции. В контексте данного документа термины нуклеиновая кислота, молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид относятся к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. В отсутствие специального ограничения данные термины включают нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов, которые имеют такие же связывающий свойства, что и стандартная нуклеиновая кислота, и метаболизируются сходным образом с нуклеотидами природного происхождения. Если не указано иное, конкретная нуклеотидная последовательность, безусловно, также включает консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденными кодонами) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанные последовательности. В частности, замены вырожденными кодонами можно осуществить, создавая последовательности, в которых третья позиция одного или более выбранных (или всех) кодонов замещена остатками со смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). Термин нуклеиновая кислота взаимозаменяемо используется с геном, кДНК и мРНК, кодируемой геном. В контексте данного документа подразумевается, что термины нуклеиновая кислота, молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), аналоги ДНК или РНК, созданные с применением нуклеотидных аналогов, а также их производные, фрагменты и гомологи.

Термин экспрессия относится к биосинтезу продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой. Например, в случае сегмента нуклеиновой кислоты, кодирующего представляющий интерес полипептид, экспрессия включает транскрипцию сегмента нуклеиновой кислоты в мРНК и трансляцию мРНК в один или более полипептидов. Термины экспрессионная единица и экспрессионная кассета взаимозаменяемо используются в данном документе и обозначают сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий представляющий интерес полипептид и способный обеспечивать экспрессию сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Экспрессионная единица, как правило, содержит промотор транскрипции, открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес полипептид, и терминатор транскрипции, которые находятся в функциональной конфигурации. Кроме промотора и терминатора транскрипции экспрессионная единица может дополнительно содержать другие сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, энхансер или сигнал полиаденилирования. В контексте данного документа термин экспрессионный вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или кольцевой, содержащей одну или более экспрессионных единиц. Кроме одной или более экспрессионных единиц экспрессионный вектор также может содержать дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, одна или более точек начала репликации или один или более селективных маркеров. Экспрессионные векторы в общем случае получены из плазмидной или вирусной ДНК или же могут содержать элементы обеих.

В контексте данного документа термин идентичность последовательности относится к взаимосвязи между двумя или более полинуклеотидными последовательностями или между двумя или более полипептидными последовательностями. Если позиция в одной последовательности занята таким же нуклеотидным основанием или аминокислотным остатком, что и в соответствующей позиции сравниваемой последовательности, говорят, что последовательности являются идентичными в этой позиции. Процент идентичности последовательностей рассчитывают путем определения числа позиций, в которых в обеих последовательностях находится идентичное нуклеотидное основание или аминокислотный остаток, для получения числа идентичных позиций. Затем число идентичных позиций делят на общее число позиций в окне сравнения и умножают на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей. Процент идентичности последовательностей определяют, сравнивая две последовательности, выровненные оптимальным образом в окне сравнения. Окно сравнения для нуклеотидных последовательностей может иметь длину, составляющую, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более нуклеиновых кислот. Окно сравнения для полипептидных последовательностей может иметь длину, составляющую, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 или более аминокислот. В целях оптимального выравнивания последовательностей для сравнения часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции, называемые гэпами, тогда как стандартная последовательность остается неизменной. Оптимальным выравниванием является выравнивание, которое даже при наличии гэпов дает наибольшее возможное число идентичных позиций между стандартной и сравниваемой последовательностями. Процент идентичности последовательностей между двумя последовательностями можно определить, используя версию программы BLAST 2 Sequences, доступную от Национального центра биотехнологической информации с 1 сентября 2004 г. и включающую программы BLASTN (для сравнения нуклеотидных последовательностей) и BLASTP (для сравнения полипептидных

- 13 042409 последовательностей), которые основаны на алгоритме Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). При применении BLAST 2 Sequences можно использовать параметры, которые были параметрами по умолчанию на 1 сентября 2004 г., с размером слова (3), штрафом за открытие гэпа (11), штрафом за продление гэпа (1), штрафом за закрытие гэпа (50), ожидаемым значением (10) и любым другим необходимым параметром, включая, но не ограничиваясь, опцию матрицы. Считается, что две нуклеотидные или аминокислотные последовательности имеют по существу аналогичную идентичность последовательностей или существенную идентичность последовательностей, если две последовательности имеют по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательностей по отношению друг к другу. В контексте данного документа полипептид или полипептидная цепь представляет собой единообразное, линейное и непрерывное упорядочение ковалентно связанных аминокислот. Он не включает две полипептидные цепи, связанные друг с другом нелинейным образом, например, посредством межцепочечной дисульфидной связи (например, половина молекулы иммуноглобулина, в которой легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидной связью). Полипептиды могут иметь или образовывать одну или более внутрицепочечных дисульфидных связей. В отношении описанных в данном документе полипептидов ссылка на аминокислотные остатки, соответствующие определяемым SEQ ID NO, включает посттрансляционные модификации таких остатков. В контексте данного документа выражение CD3-связывающий белок может взаимозаменяемо использоваться с CD3-связывающим полипептидом. Такие молекулы специфически связываются с белком кластера дифференцировки 3 (CD3) (например, человеческим CD3).

Белок представляет собой макромолекулу, содержащую одну или более полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой вырабатывается белок, и варьируются в зависимости от типа клетки. В данном документе определение белков приведено в терминах их аминокислотных скелетных структур; заместители, такие как углеводные группы, в общем случае не указаны, но, несмотря на это, могут присутствовать. Белок может представлять собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации белок также может представлять собой молекулу scFv-Fc-scFv, димер scFv-scFv или диатело.

Термины амино-концевой и карбокси-концевой используются в данном документе для обозначения позиций в полипептидах. Там, где контекст это позволяет, эти термины используют в отношении конкретной последовательности или части полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная в полипептиде карбокситерминально к стандартной последовательности, расположена вблизи карбокси-конца стандартной последовательности, но не обязательно в карбокси-конце всего полипептида. Т-клеточный рецептор (ТКР) представляет собой молекулу, находящуюся на поверхности Т-клетки, которая, наряду с CD3, в общем случае отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Он состоит из дисульфидно-связанного гетеродимера из высоковариабельных а и β цепей в большинстве Т-клеток. В других Т-клетках экспрессируется альтернативный рецептор, состоящий из вариабельных γ и δ цепей. Каждая цепь ТКР является представителем суперсемейства иммуноглобулинов и содержит один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический хвост в С-конце (см. Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5th Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4^th Ed., Current Biology Publications, p. 148, 149 и 172, 1999). Используемые в настоящем изобретении ТКР могут быть получены от различных видов животных, включая человека, мышь, крысу или других млекопитающих.

В контексте данного документа комплекс ТКР относится к комплексу, образуемому путем ассоциации цепей CD3 с другими цепями ТКР. Например, комплекс ТКР может состоять из цепи CD3y, цепи CD3δ, двух цепей CD3ε, гомодимера из цепей CD3Z, цепи ТКРа и цепи ТКРв. В альтернативном варианте комплекс ТКР может состоять из цепи CD3y, цепи CD3δ, двух цепей CD3ε гомодимера из цепей CD3Z цепи ΤΚΡγ и цепи ТКРδ.

В контексте данного документа компонент комплекса ТКР относится к цепи ТКР (т.е. ТКРа, ΤΚΡβ, ΤΚΡγ или ΤΚΡδ), цепи CD3 (т.е. CD3y, CD3δ, CD3ε или CD3Z или комплексу, образованному двумя или более цепями ТКР или цепями CD3 (например, комплексу ТКРа и ΤΚΡβ, комплексу ΤΚΡγ и ΤΚΡδ, комплексу CD3ε и CD3δ, комплексу CD3y и CD3ε, или суб-ТКР комплексу ТКРа, ΤΚΡβ, CD3y, CD3δ и двух цепей CD3ε). В контексте данного документа антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность и АЗКЦ относится к клеточноопосредованному процессу, в котором неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR (например, моноциты, такие как естественные клетки-киллеры (NK) и макрофаги), распознают связанное антитело (или другой белок, способный связывать FcyR) на клетке-мишени и впоследствии приводят к лизису клетки-мишени. В принципе, любую эффекторную клетку с активирующим FcyR можно стимулировать в отношении опосредования АЗКЦ. Основными клетками в отношении опосредования АЗКЦ являются NK-клетки, которые экспрес- 14 042409 сируют только FcyRIII, тогда как моноциты, в зависимости от состояния их активации, локализации или дифференциации, могут экспрессировать FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Обзор экспрессии FcyR. в гемопоэтических клетках смотрите, например, в Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92.

Термин имеющий АЗКЦ-активность, используемый в данном документе в отношении полипептида или белка, означает, что полипептид или белок (например, содержащий шарнирную область иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина, содержащую домены СН2 и СН3, например полученные из IgG (например, IgG1)) способен опосредовать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) посредством связывания с цитолитическим Fc-рецептором (например, FcyRIII) на цитолитической иммунной эффекторной клетке, экспрессирующей Fc-рецептор (например, NKклетке).

В контексте данного документа комплементзависимая цитотоксичность и КЗЦ относится к процессу, в котором компоненты в нормальной сыворотке (комплемент) вместе с антителом или другим Clq-комплемент-связывающим белком, связанным с клеткой-мишенью, демонстрируют лизис клеткимишени, экспрессирующей антиген-мишень. Комплемент состоит из группы сывороточных белков, которые действуют совместно и в определенной последовательности при выполнении своей функции. В контексте данного документа термины классический путь комплемента и классическая система комплемента являются синонимами и относятся к конкретному пути активации комплемента. Для инициации классического пути необходимы комплексы антиген-антитело и он включает активацию, происходящую в определенном порядке, девяти основных белковых компонентов, обозначаемых от С1 до С9. Продуктом нескольких этапов процесса активации является фермент, который катализирует следующий этап. Этот каскад обеспечивает амплификацию и активацию больших количеств комплемента посредством относительно небольшого исходного сигнала. Термин имеющий КЗЦ-активность, используемый в данном документе в отношении полипептида или белка, означает, что полипептид или белок (например, содержащий шарнирную область иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина, содержащую домены СН2 и СН3, например, полученные из IgG (например, IgG1)) способен опосредовать комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) посредством связывания белка комплемента C1q и активации классической системы комплемента.

В контексте данного документа перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность и ПТКЦ относится к опосредованному Т-клетками процессу, в котором цитотоксическая Т-клетка привлекается к клетке-мишени с помощью мультиспецифического белка, который способен специфически связывать как цитотоксическую Т-клетку, так и клетку-мишень, и при этом возникает мишень-зависимый Тклеточный ответ против клетки-мишени. Описанные в данном документе полипептиды и белки, содержащие CD3-связывающие домены, и опухолевые антигенсвязывающие домены способны к ПТКЦ. В контексте данного документа термины лечение или уменьшение интенсивности относятся к терапевтическому лечению или к профилактическому/превентивному лечению. Лечение является терапевтическим, если происходит улучшение по меньшей мере одного симптома заболевания у индивида, проходящего лечение, или лечение может замедлить ухудшение прогрессирующего заболевания у индивида или предотвратить появление дополнительных связанных с основным заболеваний.

В контексте данного документа термин терапевтически эффективное количество (или доза) или эффективное количество (или доза) конкретной связывающей молекулы или соединения относится к количеству соединения, достаточному для снижения интенсивности одного или более симптомов заболевания, лечение которого проводят, статистически значимым образом или статистически значимого улучшения органной функции. Когда речь идет об индивидуальном активном ингредиенте, вводимом одном, терапевтически эффективная доза относится к одному этому ингредиенту. Когда речь идет о комбинации, терапевтически эффективная доза относится к комбинированным количествам активных ингредиентов, которые приводят к терапевтическому действию при введении последовательно или одновременно (в одном составе или параллельно в разных составах).

В контексте данного документа термины трансформация, трансфекция и трансдукция относятся к переносу нуклеиновой кислоты (т.е. нуклеотидного полимера) в клетку. В контексте данного документа термин генетическая трансформация относится к переносу и включению ДНК, в особенности рекомбинантной ДНК, в клетку. Перенесенная нуклеиновая кислота может быть внесена в клетку с помощью экспрессионного вектора.

В контексте данного документа термин вариант или варианты относится к нуклеиновой кислоте или полипептиду, отличающимся от стандартной нуклеиновой кислоты или полипептида, но сохраняющим их важные свойства. В общем случае варианты являются очень сходными и во многих областях идентичными со стандартной нуклеиновой кислотой или полипептидом. Например, вариант может демонстрировать по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичности последовательности по сравнению с активной частью полноразмерной стандартной нуклеиновой кислоты или полипептида.

- 15 042409

Термины вариабельная область легкой цепи (также называемая вариабельным доменом легкой цепи или VL или VL) и вариабельная область тяжелой цепи (также называемая вариабельным доменом тяжелой цепи или VH или VH) относятся к вариабельной связывающей области из легкой и тяжелой цепи антитела соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из дискретных, хорошо определенных подобластей, известных как определяющие комплементарность области (CDR) и каркасные области (FR), в общем случае расположенных в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4 от амино-конца к карбокси-концу. В одном варианте реализации FR гуманизированы. Термин CL относится к константной области легкой цепи иммуноглобулина или константной области легкой цепи, т.е. константной области из легкой цепи антитела. Термин СН относится к константной области тяжелой цепи иммуноглобулина или константной области тяжелой цепи, которая дополнительно делится, в зависимости от изотипа антитела, на домены СН1, СН2 и СН3 (IgA, IgD, IgG) или СН1, СН2, СН3 и СН4 (IgE, IgM). Fab (антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой часть антитела, которая связывается с антигенами и содержит вариабельную область и СН1-домен тяжелой цепи, связанные с легкой цепью с помощью межцепочечной дисульфидной связи.

В настоящем изобретении описаны связывающие домены, которые специфически связывают CD3 (например, человеческий CD3), а также полипептиды и белки, содержащие эти связывающие домены. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающие белки и полипептиды содержат второй связывающий домен, который может связываться с опухолевым антигеном (например, PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, гликопротеиновым антигеном А33 (gpA33) или СЕА). Полипептиды и белки, содержащие связывающие домены согласно данному изобретению, могут дополнительно содержать константные области иммуноглобулина, линкерные пептиды, шарнирные области, домены димеризации/гетеродимеризации иммуноглобулина, соединительные аминокислоты, метки и т.д. Эти компоненты раскрытых полипептидов и белков более подробно описаны ниже. Кроме того, CD3-связывающие белки и полипептиды, описанные в данном документе, могут находиться в форме антитела или слитого белка в любом из множества разных форматов (например, слитый белок может находиться в форме CD3связывающей биспецифической или мультиспецифической молекулы). Неограничивающие примеры биспецифических молекул включают молекулу scFv-Fc-scFv. Некоторые биспецифические молекулы, как правило, содержат или состоят из scFv противоопухолевого антигена, связанного с анти-CD3 scFv, и, как правило, не содержат другие последовательности, такие как константная область иммуноглобулина. В других вариантах реализации CD3-связывающий белок представляет собой диатело.

CD3-связывающий белок в соответствии с настоящим изобретением в общем случае содержит по меньшей мере одну CD3-связывающую полипептидную цепь, содержащую (а) CD3-связывающий домен, приведенный в данном документе. В определенных вариациях CD3-связывающий полипептид дополнительно содержит (b) шарнирную область, расположенную карбокси-терминально к CD3-связывающему домену, и (с) константную область иммуноглобулина. В дополнительных вариациях ROR1-связывающий полипептид дополнительно содержит (d) карбокси-концевой линкер, расположенный карбокситерминально к константной области иммуноглобулина, и (е) второй связывающий домен, расположенный карбокси-терминально к карбокси-концевому линкеру.

В других вариациях CD3-связывающий полипептид содержит (b) шарнирную область, расположенную амино-терминально к CD3-связывающему домену, и (с) подобласть иммуноглобулина, расположенную амино-терминально к шарнирной области. В некоторых вариациях CD3-связывающий полипептид содержит (b) шарнирную область, расположенную карбокси-терминально к CD3-связывающему домену, и (с) подобласть иммуноглобулина, расположенную карбокси-терминально к шарнирной области. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающие полипептиды способны к гомодимеризации, как правило, путем дисульфидного связывания, посредством константной области и/или шарнирной области иммуноглобулина (например, посредством константной области иммуноглобулина, содержащей домены СН2 и СН3 IgG и шарнирную область IgG). Таким образом, в определенных вариантах реализации настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных CD3-связывающих полипептида гомодимеризуются с образованием димерного CD3-связывающего белка. В других вариантах реализации CD3связывающий полипептид содержит домен гетеродимеризации, способный к гетеродимеризации с отличным доменом гетеродимеризации во второй, неидентичной полипептидной цепи. В определенных вариациях вторая полипептидная цепь для гетеродимеризации содержит второй связывающий домен. Соответственно, в определенных вариантах реализации настоящего изобретения две неидентичные полипептидные цепи, одна из которых содержит CD3-связывающий домен, а вторая необязательно содержит второй связывающий домен, димеризуются с образованием гетеродимерного CD3-связывающего белка. Примеры типов гетеродимеров включают описанные в US 2013/0095097 и US 2013/0129723.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий домен, белок или полипептид конъюгирован с лекарственным или токсическим соединением. CD3-связывающие полипептиды, белки и различные их компоненты, используемые в настоящем изобретении, дополнительно описаны ниже.

Как указано выше, данное изобретение относится к связывающим доменам, которые специфически связывают CD3 (например, человеческий CD3). CD3-связывающий домен может содержать аминокислотные последовательности, приведенные в табл. 14. В некоторых вариантах реализации CD3-связыва

- 16 042409 ющий полипептид или белок содержит сигнальную последовательность. Данное изобретение также включает CD3-связывающие домены и белки, содержащие или кодируемые любой из последовательностей, приведенных в табл. 14, за исключением сигнальных последовательностей, которые являются частью этих последовательностей. CD3-связывающие домены и полипептиды, их внутренние обозначения и их последовательности обобщены в табл. 15. В некоторых случаях CD3-связывающие домены согласно изобретению содержат аминокислотные замены. Например, TSC370 имеет аминокислотную последовательность TSC342, в которой остаток глицина в позиции 27 в соответствии с системой нумерации IMGT замещен тирозином. В определенных вариантах реализации данное изобретение относится к CD3связывающему домену, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина; при этом вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая (а) по меньшей мере на приблизительно 93% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 88; или (b) по меньшей мере на приблизительно 94% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 89; и при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 82% идентична, по меньшей мере на приблизительно 85% идентична, по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 86. CD3-связывающий домен может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 84. CD3-связывающий домен может содержать или состоять из SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 84. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична, по меньшей мере на приблизительно 99% идентична или на 100% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 60.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность LCDR1, которая отличается от SEQ ID NO: 94 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, аминокислотную последовательность LCDR2, которая отличается от SEQ ID NO: 95 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и аминокислотную последовательность LCDR3, которая отличается от SEQ ID NO: 96 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность HCDR1, которая отличается от SEQ ID NO: 91 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, аминокислотную последовательность HCDR2, которая отличается от SEQ ID NO: 92 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и аминокислотную последовательность HCDR3, которая отличается от SEQ ID NO: 93 по меньшей мере одной аминокислотной заменой. В других вариантах реализации CD3-связывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность LCDR1, которая отличается от SEQ ID NO: 202 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, аминокислотную последовательность LCDR2, которая отличается от SEQ ID NO: 203 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и аминокислотную последовательность LCDR3, которая отличается от SEQ ID NO: 204 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность HCDR1, которая отличается от SEQ ID NO: 199 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, аминокислотную последовательность HCDR2, которая отличается от SEQ ID NO: 200 по меньшей мере одной аминокислотной заменой, и аминокислотную последовательность HCDR3, которая отличается от SEQ ID NO: 201 по меньшей мере одной аминокислотной заменой. Аминокислотная последовательность CDR CD3связывающего домена может отличаться от указанной последовательности по меньшей мере одной аминокислотной заменой. По меньшей мере одна аминокислотная замена может быть консервативной или неконсервативной аминокислотной заменой. В некоторых вариантах реализации LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3 отличаются от вышеперечисленных последовательностей CDR

- 17 042409 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. В определенных вариантах реализации CDR согласно настоящему изобретению содержит приблизительно одной или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) вставок, приблизительно одной или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) делеций, приблизительно одной или более (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен или неконсервативных аминокислотных замен) или комбинацию вышеуказанных изменений по сравнению с последовательностью CDR известного моноклинального антитела.

При описании аминокислотных замен в данном изобретении позиция аминокислотного остатка в вариабельной области молекулы иммуноглобулина обычно пронумерована с использованием системы IMGT (Brocket X. et al., Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508). В некоторых вариантах реализации аминокислотный остаток в позиции 52 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3связывающего домена представляет собой аргинин и/или аминокислотный остаток в позиции 53 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой триптофан. Аминокислотный остаток в позиции 27 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CD3связывающего домена может представлять собой тирозин. В некоторых вариантах реализации CD3связывающий домен содержит одно или более из следующего: (а) аминокислотный остаток в позиции 9 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой пролин; (b) аминокислотный остаток в позиции 53 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой изолейцин; и (с) аминокислотный остаток в позиции 21 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой метионин. Аминокислотный остаток в позиции 87 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена может представлять собой тирозин. Аминокислотный остаток в позиции 86 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена может представлять собой аспарагиновую кислоту. В одном варианте реализации аминокислотный остаток в позиции 86 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой аспарагиновую кислоту, а аминокислотный остаток в позиции 87 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CD3-связывающего домена представляет собой тирозин. В определенных вариантах реализации CD3-связывающий домен содержит гуманизированные области VL и/или VH иммуноглобулина. Методы гуманизации областей VL и VH иммуноглобулина известны в данной области техники и обсуждаются, например, в публикации заявки на патент США № 2006/0153837. В определенных аспектах CD3-связывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которые содержат каркасные области, и по меньшей мере одна из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина и вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина может быть гуманизирована. В одном варианте реализации вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGKV3D-20*1. В другом варианте реализации вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGHV1-69*02. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGHV1-2*02 (H7), IGHV1-46*02 (Н8), IGHV1-3*01(H9) или IGHV1-69*02 (H10). Вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина может содержать каркасные области на основании аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии IGKV3-11*01 (L4), IGKV1-33*01 (L5), IGKV1-39*01 (L7) или IGKV3D-20*1 (L8).

Данное изобретение относится к CD3-связывающим доменам, которые имеют улучшенные свойства по сравнению с CD3-связывающим доменом DRA222. DRA222 имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. DRA222 описан в WO 2013/158856. В этом изобретении DRA222 иногда называют TSC311 или TSC312. Fc DRA222 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Данное изобретение включает CD3-связывающий домен (или белок, содержащий указанный домен), который имеет термостабильность, повышенную по меньшей мере на 10% по сравнению с термостабильностью CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Средняя точка термоперехода (Tm) CD3-связывающего домена (или белка, содержащего указанный домен) может быть повышена по меньшей мере на приблизительно 3°С, по меньшей мере на приблизительно 4°С, по меньшей мере на приблизительно 5°С или по меньшей мере на приблизительно 6°С и до приблизительно 20°С по сравнению с Tm CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Средняя точка термоперехода CD3-связывающего домена (или белка, содержащего указанный домен) может составлять по меньшей мере приблизительно 54°С, по меньшей мере приблизительно 55°С, по меньшей мере приблизительно 56°С или по меньшей мере приблизительно 57°С и до приблизительно 72°С. Термостабильность или среднюю точку термоперехода CD3-связывающего домена (или белка, содержащего указанный домен) можно определить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии или дифференциальной сканирующей флуориметрии.

- 18 042409

Описанный в данном документе CD3-связывающий домен (или белок, содержащий указанный домен) может характеризоваться стабильностью при хранении, повышенной по меньшей мере на приблизительно 5%, по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90% и до приблизительно 100% по сравнению со стабильностью при хранении CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Стабильность при хранении можно определить после хранения CD3связывающего домена (или белка, содержащего указанный домен) в ФСБ при приблизительно 25°С. В одном варианте реализации CD3-связывающий домен (или белок, содержащий указанный домен) стабилен при хранении в ФСБ при приблизительно 25°С в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, по меньшей мере приблизительно 10 суток или по меньшей мере приблизительно 13 суток и до приблизительно 90 суток.

В некоторых аспектах описанный в данном документе CD3-связывающий домен (или белок, содержащий указанный домен) имеет уровень высокомолекулярных агрегатов, образуемых во время рекомбинантной экспрессии, который по меньшей мере на приблизительно 5%, по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20% снижен, по меньшей мере приблизительно 30% снижен и до приблизительно 50% снижен по сравнению с уровнем высокомолекулярных агрегатов, образуемых во время рекомбинантной экспрессии CD3-связывающего домена, содержащего вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 90, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 87. Данное изобретение также относится к CD3-связывающему домену, который связывается с человеческим CD3 с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 10 нМ или меньше. CD3-связывающий домен согласно изобретению может специфически связываться как с человеческим CD3, так и с CD3 яванского макака. Например, CD3-связывающий домен может связываться с CD3 яванского макака с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 нМ или меньше. Связывание с CD3 яванского макака позволяет тестировать анти-CD3 терапевтические средства на отличных от человека приматах. Данное изобретение включает CD3-связывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, причем вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность LCDR1 согласно SEQ ID NO: 94, аминокислотную последовательность LCDR2 согласно SEQ ID NO: 95 и аминокислотную последовательность LCDR3 согласно SEQ ID NO: 96, а вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность HCDR1 согласно SEQ ID NO: 91, аминокислотную последовательность HCDR2 согласно SEQ ID NO: 92 и аминокислотную последовательность HCDR3 согласно SEQ ID NO: 93; и при этом CD3-связывающий домен имеет одно или более свойств, описанных в данном документе. Например, (i) средняя точка термоперехода CD3-связывающего домена (или белка, содержащего CD3-связывающий домен) составляет по меньшей мере приблизительно 54°С, по меньшей мере приблизительно 55°С, по меньшей мере приблизительно 56°С или по меньшей мере приблизительно 57°С и до приблизительно 72°С; (ii) CD3-связывающий домен (или белок, содержащий CD3-связывающий домен) стабилен при хранении в ФСБ при приблизительно 25°С в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, по меньшей мере приблизительно 10 суток или по меньшей мере приблизительно 13 суток и до приблизительно 90 суток; (iii) CD3связывающий домен (или белок, содержащий CD3-связывающий домен) связывается с человеческим CD3 с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 10 нМ или меньше; и (iv) CD3-связывающий домен (или белок, содержащий CD3-связывающий домен) связывается с CD3 яванского макака с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 нМ или меньше.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид при связывании с белком CD3 на Т-клетке не индуцирует или индуцирует минимальное выявляемое высвобождение цитокинов из указанной Т-клетки. В определенных аспектах CD3-связывающий белок или полипептид демонстрирует сниженное высвобождение цитокинов у пациента по сравнению с высвобождением цитокинов при введении пациенту анти-CD3 антитела ОКТЗ. CD3-связывающий полипептид может индуцировать активацию Т-клеток или пролиферацию Т-клеток.

В определенных вариантах реализации CD3-связывающий белок может содержать один или более дополнительных связывающих доменов (например, второй связывающий домен), которые связывают мишень, отличную от CD3. Эти другие связывающие домены могут содержать, например, конкретный цитокин или молекулу, которые нацеливают связывающий домен полипептида на конкретный тип клеток, токсин, дополнительный клеточный рецептор, антитело и т.д.

В определенных вариантах реализации CD3-связывающий полипептид, используемый с описанных в данном документе способах и композициях, представляет собой биспецифическую одноцепочечную молекулу, содержащую CD3-связывающий домен и второй связывающий домен. В некоторых вариантах реализации CD3- и/или второй связывающий домен получен из антитела и содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL). Эти связывающие домены и вариабельные цепи

- 19 042409 могут быть расположены в любом порядке, при котором сохраняется некоторая степень связывания с мишенью(ями). Например, вариабельные домены могут быть расположены в таком порядке, как VH ВСД-VL ВСД-VH CD3-VL CD3; VL ВСД-VH ВСД-VH CD3-VL CD3; VH ВСД-VL ВСД-VL CD3-VH CD3; VL ВСД-VH ВСД-VL CD3-VH CD3; VH CD3-VL CD3-VH ВСД-VL ВСД; VL CD3-VH CD3-VL ВСД-VH ВСД; VH CD3-VL CD3-VL ВСД-VH ВСД; или VL CD3-VH CD3-VH ВСД-VL ВСД (где ВСД относится ко второму связывающему домену). В определенных аспектах пары VH-областей и VLобластей в связывающем домене, связывающемся с CD3, представлены в формате одноцепочечного антитела (scFv). Области VH и VL могут быть расположены в порядке VH-VL или VL-VH. В определенных вариантах реализации scFv может более эффективно связываться с CD3 в ориентации VL-VH, чем в ориентации VH-VL, или наоборот. VH-область может размещаться N-терминально к линкерной последовательности. VL-область может размещаться С-терминально к линкерной последовательности. Расположение доменов в CD3-связывающем домене биспецифической одноцепочечной молекулы может представлять собой VH-VL, причем указанный CD3-связывающий домен расположен С-терминально ко второму связывающему домену. В некоторых случаях биспецифическая молекула может содержать scFv, связывающийся со вторым связывающим доменом, связанным с scFv, связывающимся с CD3. Эти scFv могут быть связаны коротким пептидом. В некоторых вариантах реализации биспецифические одноцепочечные молекулы не содержат шарнирной области или константной области (см., например, US 2013/0295121, US 2013/0129730, US 2011/0293619, US 7635472, WO 2010/037836, WO 2004/106381 и WO 2011/121110; в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки).

В некоторых вариантах реализации связывающий домен представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), который содержит области V_H и VL, специфические к представляющей интерес мишени. В определенных вариантах реализации области V_H и V_L являются человеческими или гуманизированными. В некоторых вариациях связывающий домен представляет собой одноцепочечный Fv (scFv), содержащий области V_H и V_L иммуноглобулина, соединенные пептидным линкером. Применение пептидных линкеров для соединения областей VH и VL хорошо известно в данной области техники, и в этой конкретной области существует большое количество публикаций. Линкер может иметь аминокислотную последовательность QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS (SEQ ID NO: 148). В некоторых вариантах реализации пептидный линкер представляет собой 15-мер, состоящий из трех повторов аминокислотной последовательности Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ((Gly₄Ser)₃) (SEQ ID NO: 193). Также использовали другие линкеры, а для расширения разнообразия и отбора соответствующих линкерных последовательностей использовали метод фагового дисплея, а также селективный инфекционный фаговый метод (Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998). В определенных вариантах реализации области VH и VL соединены пептидным линкером, имеющим аминокислотную последовательность с формулой (Gly₄Ser)_n, где n = 1-5 (SEQ ID NO: 194). В некоторых вариантах реализации последовательность Gly₄Ser может повторяться 6-10 раз. Другие подходящие линкеры можно получить, оптимизируя простой линкер (например, (Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 194)) посредством случайного мутагенеза. В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи scFv является амино-концевой относительно вариабельной области легкой цепи scFv. В других вариантах реализации вариабельная область легкой цепи scFv является амино-концевой относительно вариабельной области тяжелой цепи scFv.

В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий полипептид содержит, в порядке от аминоконца к карбокси-концу (или в порядке от карбокси-конца к амино-концу), (i) второй связывающий домен, (ii) шарнирную область, (iii) константную область иммуноглобулина, (iv) карбокси-концевой линкер (или амино-концевой линкер) и (v) CD3-связывающий домен. При использовании в данном документе в контексте полипептидной конструкции, содержащей первый связывающий домен и второй связывающий домен, шарнирная область или шарнир относится к полипептидной области между первым связывающим доменом и Fc-областью. Карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер относится к полипептидной области между Fc-областью и вторым связывающим доменом. В некоторых вариантах реализации карбокси-концевой (или амино-концевой) линкер содержит или состоит из SEQ ID NO: 196. В определенных вариантах реализации шарнирная область представляет собой шарнирную область человеческого иммуноглобулина дикого типа. В определенных других вариантах реализации в амино- или карбокси-конец шарнирной области человеческого иммуноглобулина дикого типа могут быть добавлены аминокислотные остатки в качестве части конструкции слитого белка. Например, дополнительные соединительные аминокислотные остатки в амино-конце шарнирной области могут представлять собой RT, RSS, TG или Т, или в карбокси-конце шарнирной области могут представлять собой SG, или делецию в шарнирной области можно комбинировать с добавлением, таким как АР с добавлением SG в карбокси-конце. В определенных вариантах реализации шарнирная область, карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер представляют собой измененную шарнирную область иммуноглобулина, в которой один или более остатков цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа замещены одним или более другими аминокислотными остатками (например, серином или аланином).

Типовые измененные шарнирные области иммуноглобулина, карбокси-концевые линкеры и аминоконцевые линкеры включают шарнирную область иммуноглобулина человеческого IgG1, в которой один, два или три остатка цистеина, присутствующих в шарнирной области человеческого IgG1 дикого

- 20 042409 типа, замещены одним, двумя или тремя отличными аминокислотными остатками (например, серином или аланином). В измененной шарнирной области иммуноглобулина может дополнительно присутствовать замена пролина другой аминокислотой (например, серином или аланином). Например, в вышеописанной измененной шарнирной области человеческого IgG1 может дополнительно присутствовать замена пролина, расположенного карбокси-терминально к трем цистеинам шарнирной области человеческого IgG1 дикого типа другим аминокислотным остатком (например, серином, аланином). В одном варианте реализации пролины в центральной части шарнирной области остаются незамещенными. В определенных вариантах реализации полипептид шарнирной области, карбокси-концевого линкера или аминоконцевого линкера содержит или представляет собой последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на

84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на

88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на

92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на

96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, например, шарнирной области человеческого IgG1 дикого типа, шарнирной области человеческого IgG2 дикого типа или шарнирной области человеческого IgG4 дикого типа.

В дополнительных вариантах реализации шарнирная область, карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер, присутствующие в CD3-связывающем полипептиде, могут представлять собой шарнирную область, в основе которой не лежит или которая не получена из шарнирной области иммуноглобулин (т.е. не является шарнирной областью иммуноглобулина дикого типа или измененной шарнирной областью). Примеры таких шарнирных областей и карбокси-концевых линкеров включают пептиды, состоящие из от приблизительно пяти до приблизительно 150 аминокислот, полученные из междоменной области трансмембранного белка или стволовой области лектина типа II С, например пептиды, состоящие из от приблизительно восьми до 25 аминокислот, и пептиды, состоящие из от приблизительно семи до 18 аминокислот.

В определенных вариантах реализации междоменные или полученные из стволовой области шарнирные области, карбокси-концевые линкеры и амино-концевые линкеры имеют от семи до 18 аминокислот и могут образовывать α-суперспиральную структуру. В определенных вариантах реализации междоменные или полученные из стволовой области шарнирные области карбокси-концевые линкеры или амино-концевые линкеры содержат 0, 1, 2, 3 или 4 цистеина. Типовые междоменные или полученные из стволовой области шарнирные области, карбокси-концевые линкеры и амино-концевые линкеры представляют собой пептидные фрагменты междоменных или стволовых областей, такие как 150аминокислотные фрагменты из стволовых областей CD69, CD72, CD94, NKG2A и NKG2D. Шарнирная область, карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер также могут представлять собой гибкую линкерную последовательность, содержащую повторы (Gly₄Ser). В некоторых вариантах реализации шарнирная область представляет собой 15-мер, состоящий из трех повторов аминокислотной последовательности Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ((Gly₄Ser)₃) (SEQ ID NO: 193). В определенных вариантах реализации шарнирная область имеет аминокислотную последовательность с формулой (Gly₄Ser)_n, где n = 1-5 (SEQ ID NO: 194). В некоторых вариантах реализации последовательность Gly₄Ser может повторяться 6-10 раз. Другие подходящие шарнирные области можно получить, оптимизируя простой линкер (например, (Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 194)) путем случайного мутагенеза.

В определенных вариантах реализации последовательности шарнирной области, карбокси-концевого линкера и амино-концевого линкера содержат приблизительно от 5 до 150 аминокислот, от 5 до 10 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот, от 20 до 30 аминокислот, от 30 до 40 аминокислот, от 40 до 50 аминокислот, от 50 до 60 аминокислот, от 5 до 60 аминокислот, от 5 до 40 аминокислот, от 8 до 20 аминокислот или 10 до 15 аминокислот. Шарнирная область или линкер могут быть преимущественно гибкими, но также могут обеспечивать более жесткие характеристики или могут содержать преимущественно α-спиральную структуру с минимумом β-складчатой структуры. Длины или последовательности шарнирных областей и линкеров могут влиять на аффинность связывания связывающих доменов, с которыми шарнирные области прямо или непрямо (посредством другой области или домена, например, домена гетеродимеризации) соединены, а также на один или более видов активности частей Fc-области, с которыми шарнирные области или линкеры прямо или непрямо соединены.

В определенных вариантах реализации последовательности шарнирной области, карбоксиконцевого линкера и амино-концевого линкера стабильны в плазме и сыворотке крови и устойчивы к протеолитическому расщеплению. Первый лизин в верхней шарнирной области IgG1 может быть мутирован, чтобы свести к минимуму протеолитическое расщепление, например лизин может быть замещен метионином, треонином, аланином или глицином, или удален.

В некоторых вариантах реализации изобретения CD3-связывающий белок способен образовывать гетеродимер со второй полипептидной цепью и содержит шарнирную область, (а) расположенную непосредственно амино-терминально к константной области иммуноглобулина (например, амино-терми

- 21 042409 нально к домену СН2, причем константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3, или амино-терминально к домену СН3, причем подобласти иммуноглобулина содержат домены СН3 и СН4), (b) вставленную между и соединяющую связывающий домен (например, scFv) и домен гетеродимеризации иммуноглобулина, (с) вставленную между и соединяющую домен гетеродимеризации иммуноглобулина и константную область иммуноглобулина (например, когда константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 или домены СН3 и СН4), (d) вставленную между и соединяющую константную область иммуноглобулина и связывающий домен, (е) в амино-конце полипептидной цепи или (f) в карбокси-конце полипептидной цепи. Полипептидная цепь, содержащая описанную в данном документе шарнирную область, способна связываться с другой полипептидной цепью с образованием предложенного в данном документе гетеродимерного белка, а образованный гетеродимер будет содержать связывающий домен, который сохраняет целевую специфичность или специфичную аффинность связывания мишени. В определенных вариантах реализации шарнирная область, присутствующая в полипептиде, который образует гетеродимер с другой полипептидной цепью, может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина, такую как шарнирная область иммуноглобулина дикого типа или измененная шарнирная область иммуноглобулина. В определенных вариантах реализации шарнирная область одной из полипептидных цепей гетеродимерного белка является идентичной соответствующей шарнирной области другой полипептидной цепи гетеродимера. В определенных других вариантах реализации шарнирная область одной из цепей отличается от шарнирной области другой цепи (по длине или последовательности). Разные шарнирные области в разных цепях позволяют осуществлять разные манипуляции с аффинностью связывания связывающих доменов, с которыми соединены шарнирные области, так, что гетеродимер становится способен предпочтительно связываться с мишенью одного связывающего домена по сравнению с мишенью другого связывающего домена. Например, в определенных вариантах реализации гетеродимерный белок содержит CD3-связывающий домен в одной цепи и второй связывающий домен в другой цепи. Наличие двух разных шарнирных областей в двух цепях может позволить гетеродимеру связываться сначала со второй мишенью, а затем с CD3-компонентом первой. Таким образом, гетеродимер может привлекать Т-клетки CD3+ к клеткам, экспрессирующим вторую мишень (например, опухолевым или раковым клеткам), а они, в свою очередь, могут повреждать или разрушать клетки, экспрессирующие вторую мишень.

Некоторые примеры последовательностей шарнирной области, карбокси-концевого линкера и амино-концевого линкера, подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением, приведены ниже в табл. 1 и 2. Дополнительные примеры шарнирных и линкерных областей приведены в SEQ ID NO: 241-244, 601, 78, 763-791, 228, 379-434, 618-749 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки).

- 22 042409

Таблица 1. Примеры шарнирных областей и линкеров

Шарнирная область	Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO
sss(s)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTSPPSS	SEQ ID NO:121
csc(s)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPCS	SEQ ID NO:122
ssc(s)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTSPPCS	SEQ ID NO:123
scc(s)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTCPPCS	SEQ ID NO:124
css(s)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPSS	SEQ ID NO:125
scs(s)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTCPPSS	SEQ ID NO:126
ccc(s)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPCS	SEQ ID NO:127
ccc(p)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPCP	SEQ ID NO:128
sss(p)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTSPPSP	SEQ ID NO:129
csc(p)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPCP	SEQ ID NO:130
ssc(p)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTSPPCP	SEQ ID NO:131
scc(p)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTCPPCP	SEQ ID NO:132
css(p)-hlgG1 шарнир	EPKSCDKTHTSPPSP	SEQ ID NO:133
scs(p)-hlgG1 шарнир	EPKSSDKTHTCPPSP	SEQ ID NO:134
Scppcp	SCPPCP	SEQ ID NO:135
STD1	NYGGGGSGGGGSGGGGSGNS	SEQ ID NO:136
STD2	NYGGGGSGGGGSGGGGSGNY GGGGSGGGGSGGGGSGNS	SEQ ID NO:137
Н1	NS	SEQ ID NO:138
Н2	GGGGSGNS	SEQ ID NO:139
НЗ	NYGGGGSGNS	SEQ ID NO:140
Н4	GGGGSGGGGSGNS	SEQ ID NO:141
Н5	NYGGGGSGGGGSGNS	SEQ ID NO:142
Н6	GGGGSGGGGSGGGGSGNS	SEQ ID NO:143
Н7	GCPPCPNS	SEQ ID NO:144
(G₄S)₃	GGGGSGGGGSGGGGS	SEQ ID NO:145
Н105	SGGGGSGGGGSGGGGS	SEQ ID NO:146
(G₄S)4	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	SEQ ID NO:147
Н75 (четырехкратный мутант NKG2A)	QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS	SEQ ID NO:148
Н83 (полученный из NKG2A)	SSLNTGTQMAGHSPNS	SEQ ID NO:149
Н106 (полученный из NKG2A)	QRHNNSSLNTGTQMAGHS	SEQ ID NO:150
Н81 (полученный из NKG2D)	EVQIPLTESYSPNS	SEQ ID NO:151
Н91 (полученный из NKG2D)	NSLANQEVQIPLTESYSPNS	SEQ ID NO:152
Н94	SGGGGSGGGGSGGGGSPNS	SEQ ID NO:153
Н111	SGGGGSGGGGSGGGGSPGS	SEQ ID NO:196

- 23 042409

Таблица 2. Примеры шарнирных областей и линкеров (полученных из шарнирной области Н7, стволовой области лектина типа II С или междоменной области трансмембранного белка типа I)

Шарнирная область	Аминокислотная последовательность	Исходная молекула и/или шарнирная область	SEQID NO:
Н16	LSVKADFLTPSIGNS	CD80	SEQ ID NO:154
Н17	LSVKADFLTPSISCPPCPNS	CD80 + Н7	SEQ ID NO:155
Н18	LSVLANFSQPEIGNS	CD86	SEQ ID NO:156
Н19	LSVLANFSQPEISCPPCPNS	CD86 + Н7	SEQ ID NO:157
Н20	LKIQERVSKPKISNS	CD2	SEQ ID NO:158
Н21	LKIQERVSKPKISCPPCPNS	CD2 + Н7	SEQ ID NO:159
Н22	LNVSERPFPPHIQNS	CD22	SEQ ID NO:160
Н23	LDVSERPFPPHIQSCPPCPNS	CD22 + Н7	SEQ ID NO:161
Н24	REQLAEVTLSLKANS	CD80	SEQ ID NO:162
Н25	REQLAEVTLSLKACPPCPNS	CD80 + Н7	SEQ ID NO:163
Н26	RIHQMNSELSVLANS	CD86	SEQ ID NO:164
Н27	RIHQMNSELSVLACPPCPNS	CD86 + Н7	SEQ ID NO:165
Н28	DTKGKNVLEKIFSNS	CD2	SEQ ID NO:166
НЗО	LPPETQESQEVTLNS	CD22	SEQ ID NO:167
Н32	RIHLNVSERPFPPNS	CD22	SEQ ID NO:168
НЗЗ	RIHLNVSERPFPPCPPCPNS	CD22 + Н7	SEQ ID NO:169
Н36	GCPPCPGGGGSNS	Н7	SEQ ID NO:170
Н40	GCPPCPANS	Н7	SEQ ID NO:171
Н41	GCPPCPANS	Н7	SEQ ID NO:172
Н42	GCPPCPNS	Н7	SEQ ID NO:173
Н44	GGGASCPPCPGNS	Н7	SEQ ID NO:174
Н45	GGGASCPPCAGNS	Н7	SEQ ID NO:175
Н46	GGGASCPPCANS	Н7	SEQ ID NO:176
Н47	LSVKADFLTPSIGNS	CD80	SEQ ID NO:177
Н48	ADFLTPSIGNS	CD80	SEQ ID NO:178
Н50	LSVLANFSQPEIGNS	CD86	SEQ ID NO:179
Н51	LSVLANFSQPEIGNS	CD86	SEQ ID NO:180
Н52	SQPEIVPISNS	CD86	SEQ ID NO:181
Н53	SQPEIVPISCPPCPNS	CD86 + Н7	SEQ ID NO:182
Н54	SVLANFSQPEISCPPCPNS	CD86 + Н7	SEQ ID NO:183
Н55	RIHQMNSELSVLANS	CD86	SEQ ID NO:184
Н56	QMNSELSVLANS	CD86	SEQ ID NO:185
Н57	VSERPFPPNS	CD22	SEQ ID NO:186
Н58	KPFFTCGSADTCPNS	CD72	SEQ ID NO:187
Н59	KPFFTCGSADTCPNS	CD72	SEQ ID NO:188
Н60	QYNCPGQYTFSMPNS	CD69	SEQ ID NO:189
Н61	EPAFTPGPNIELQKDSDCPNS	CD94	SEQ ID NO:190
Н62	QRHNNSSLNTRTQKARHCPNS	NKG2A	SEQ ID NO:191
Н63	NSLFNQEVQIPLTESYCPNS	NKG2D	SEQ ID NO:192

В определенных вариантах реализации CD3-связывающий полипептид или белок согласно изобретению может содержать домен димеризации иммуноглобулина или домен гетеродимеризации иммуноглобулина.

В контексте данного документа домен димеризации иммуноглобулина или домен гетеродимеризации иммуноглобулина относится к домену иммуноглобулина полипептидной цепи, который предпочтительно взаимодействует или связывается с отличным доменом иммуноглобулина другой полипептидной цепи, причем взаимодействие разных доменов гетеродимеризации иммуноглобулина обеспечивает существенный вклад или эффективно стимулирует гетеродимеризацию первой и второй полипептидных цепей (т.е. образование димера между двумя разными полипептидными цепями, который также называется гетеродимером или гетеродимерным белком). Взаимодействие между доменами гетеродимеризации иммуноглобулина обеспечивает существенный вклад или эффективно стимулирует гетеродимеризацию первой и второй полипептидных цепей, если наблюдается статистически значимое снижение

- 24 042409 димеризации между первой и второй полипептидными цепями в отсутствие домена гетеродимеризации иммуноглобулина первой полипептидной цепи и/или домена гетеродимеризации иммуноглобулина второй полипептидной цепи. В определенных вариантах реализации, если первая и вторая полипептидные цепи экспрессируются вместе, по меньшей мере 60%, от по меньшей мере приблизительно 60% до приблизительно 70%, от по меньшей мере приблизительно 70% до приблизительно 80%, от по меньшей мере приблизительно 80% до приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% первой и второй полипептидных цепей образуют гетеродимеры друг с другом. Типовые домены гетеродимеризации иммуноглобулина включают СН1-домен иммуноглобулина, CL1-домен иммуноглобулина (например, изотипы Ск и Сλ) или их производные, включая СН1- и CL-домены и измененные (или мутированные) СН1- и CL-домены иммуноглобулина такие, как предложенные в данном документе. Димеризацию/гетеродимеризацию можно использовать, если существует необходимость образования гетеродимеров из двух неидентичных полипептидных цепей, причем одна или обе полипептидные цепи содержат связывающий домен. В определенных вариантах реализации одна из полипептидных цепей определенных гетеродимеров, описанных в данном документе, не содержит связывающий домен. Как указано выше, гетеродимерный белок согласно настоящему изобретению содержит домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой полипептидной цепи. Домены гетеродимеризации иммуноглобулина полипептидных цепей гетеродимера отличаются друг от друга и, следовательно, могут быть по-разному модифицированы, чтобы облегчить гетеродимеризацию обеих цепей и свести к минимуму гомодимеризацию каждой цепи. Предложенные в данном документе домены гетеродимеризации иммуноглобулина обеспечивают эффективную гетеродимеризацию между разными полипептидами и облегчают очистку получаемого в результате гетеродимерного белка. Как предложено в данном документе, домены гетеродимеризации иммуноглобулина, применимые для стимуляции гетеродимеризации двух разных одноцепочечных полипептидов (например, одного короткого и одного длинного) в соответствии с настоящим изобретением содержат СН1- и CL-домены иммуноглобулина, например, человеческие СН1- и CL-домены. В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой СН1-домен дикого типа, такой как СН1-домен дикого типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В дополнительных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой СН1-домен дикого типа человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM, приведенный в SEQ ID NO: 114, 186-192 и 194 соответственно в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой СН1-домен дикого типа человеческого IgG1, приведенный в SEQ ID NO: 114 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки).

В дополнительных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный СН1-домен иммуноглобулина, такой как измененный СН1-домен IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный СН1-домен человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В дополнительных вариантах реализации остаток цистеина CH1-домена дикого типа (например, человеческого СН1), вовлеченный в образование дисульфидной связи с CLдоменом иммуноглобулина (например, человеческим CL), удален или замещен в измененном СН1домене иммуноглобулина так, что между измененным СН1-доменом и CL-доменом дикого типа не образуется дисульфидная связь. В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой CL-домен дикого типа, такой как Ск-домен дикого типа или Сλ-домен дикого типа. В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой человеческий Ск-домен дикого типа или человеческий Сλ-домен дикого типа, например, приведенный в SEQ ID NO: 112 и 113 соответственно в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). В дополнительных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный CL-домен иммуноглобулина, такой как измененный Ск- или Сλ-домен, например измененный человеческий Ск- или человеческий Сλдомен.

В определенных вариантах реализации остаток цистеина CL-домена дикого типа (например, человеческого CL), вовлеченный в образование дисульфидной связи с СН1-доменом иммуноглобулина дикого типа (например, человеческим СН1), удален или замещен в измененном CL-домене иммуноглобулина. Такие измененные CL-домены могут дополнительно содержать аминокислотную делецию в аминоконцах. Пример Ск-домена приведен в SEQ ID NO: 141 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), в которой удалены первый аргинин и последний цистеин человеческого Ск-домена дикого типа. В определенных вариантах реализации в измененном Ск-домене удален только последний цистеин человеческого Ск-домена дикого типа, так как первый аргинин, удаляемый из человеческого Ск-домена дикого типа, может обеспечиваться линкером, который содержит аргинин в карбокси-конце и связывает амино-конец измененного Ск-домена с другим доменом (например, подобластью иммуноглобулина, такой как подобласть, содержащая домены СН2 и СН3 им- 25 042409 муноглобулина) Пример Сλ-домена приведен в SEQ ID NO: 140 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), в которой удален первый аргинин человеческого Сλ-домена дикого типа, а цистеин, вовлеченный в образование дисульфидной связи с цистеином в СН1-домене, замещен серином.

В дополнительных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный Ск-домен, который содержит одну или более аминокислотных замен по сравнению с Ск-доменом дикого типа в позициях, которые могут быть вовлечены в образование межцепочечной сети водородных связей на поверхности раздела Ск-Ск. Например, в определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный человеческий Скдомен, в котором одна или более аминокислот в позициях N29, N30, Q52, V55, Т56, S68 или Т70 замещены другой аминокислотой. Нумерация аминокислот основана на их позициях в измененной человеческой Ск-последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 141 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина представляет собой измененный человеческий Ск-домен, содержащий одну, две, три или четыре аминокислотные замены в позициях N29, N30, V55 или Т70. Аминокислотой, используемой в качестве заместителя в вышеуказанных позициях, может быть аланин или аминокислотный остаток с объемной боковой цепью, такой как аргинин, триптофан, тирозин, глутамат, глутамин или лизин. Дополнительные аминокислотные остатки, которые можно использовать для замещения аминокислотных остатков человеческой Ск-последовательности дикого типа в вышеуказанных позициях (например, N30), включают аспартат, метионин, серин и фенилаланин. Примеры измененных человеческих Ск-доменов приведены в SEQ ID NO: 142-178 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). Измененные человеческие Ск-домены являются такими, которые облегчают гетеродимеризацию с СН1-доменом, но сводят к минимуму гомодимеризацию с другим Ск-доменом. Типовые измененные человеческие Ск-домены приведены в SEQ ID NO: 160 (N29WV55A Т70А), 161 (N29Y V55A Т70А), 202 (Т70Е N29A N30A V55A), 167 (N30R V55A Т70А), 168 (N30K V55A Т70А), 170 (N30E V55A Т70А), 172 (V55R N29A N30A), 175 (N29W N30Y V55A Т70Е), 176(N29Y N30Y V55A T70E), 177 (N30E V55A Т70Е), 178 (N30Y V55A Т70Е), 838 (N30D V55A Т70Е), 839 (N30M V55A Т70Е), 840 (N30S V55A Т70Е) и 841 (N30F V55A Т70Е) в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации в дополнение или в качестве альтернативы мутациям в Скдоменах, описанным в данном документе, оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина (т.е. домены СН1 и CL иммуноглобулина) полипептидного гетеродимера содержат такие мутации, чтобы получаемые в результате домены гетеродимеризации иммуноглобулина образовывали солевые мостики (т.е. ионные взаимодействия) между аминокислотными остатками в мутированных участках. Например, домены гетеродимеризации иммуноглобулина полипептидного гетеродимера могут представлять собой мутированный СН1-домен в комбинации с мутированным Ск-доменом. В мутированном СН1-домене валин в позиции 68 (V68) человеческого CH1-домена дикого типа замещен аминокислотным остатком, имеющим отрицательный заряд (например, аспартатом или глутаматом), тогда как лейцин в позиции 29 (L29) мутированного человеческого Ск-домена, в котором были удалены первый аргинин и последний цистеин, замещен аминокислотным остатком, имеющий положительный заряд (например, лизином, аргинином или гистидином). Заряд-зарядовое взаимодействие между аминокислотным остатком, имеющим отрицательный заряд полученного в результате мутированного СН1-домена, и аминокислотным остатком, имеющим положительный заряд полученного в результате мутированного Ск-домена, приводит к образованию солевого мостика, который стабилизирует гетеродимерную поверхность раздела между мутированными СН1- и Ск-доменами. В альтернативном варианте V68 СН1 дикого типа может быть замещен аминокислотным остатком, имеющим положительный заряд, тогда как L29 мутированного человеческого Ск-домена, в котором были удалены первый аргинин и последний цистеин, может быть замещен аминокислотным остатком, имеющим отрицательный заряд. Примеры мутированных последовательностей СН1, в которых V68 замещен аминокислотным остатком с отрицательным или положительным зарядом, приведены в SEQ ID NO: 844 и 845 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). Примеры мутированных последовательностей Ск, в которых L29 замещен аминокислотным остатком с отрицательным или положительным зарядом, приведены в SEQ ID NO: 842 и 843 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки).

Позиции, отличные от V68 человеческого СН1-домена и L29 человеческого Ск-домена, могут быть замещены аминокислотами, имеющими противоположные заряды, для обеспечения ионных взаимодействий между аминокислотами в дополнение или в качестве альтернативы мутациям в V68 СН1-домена и L29 Ск-домена. Такие позиции можно определить любым подходящим способом, включая случайный мутагенез, анализ кристаллической структуры пары СН1-Ск, для определения аминокислотных остатков на поверхности раздела СН1-Ск и дополнительного определения подходящих позиций среди аминокис- 26 042409 лотных остатков на поверхности раздела СН1-Ск с применением ряда критериев (например, предрасположенность к участию в ионных взаимодействиях, близость к потенциальному остатку-партнеру и т.д.).

В определенных вариантах реализации полипептидные гетеродимеры согласно настоящему изобретению содержат только одну пару доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например, первая цепь полипептидного гетеродимера может содержать СН1-домен в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, тогда как вторая цепь может содержать CL-домен (например, Ск или Сλ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина. В альтернативном варианте первая цепь может содержать CL-домен (например, Ск или Сλ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, тогда как вторая цепь может содержать СН1-домен в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина. Как указано в данном документе, домены гетеродимеризации иммуноглобулина первой и второй цепей способны связываться с образованием гетеродимерного белка согласно данному изобретению. В определенных других вариантах реализации гетеродимерные белки согласно настоящему изобретению могут содержать две пары доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например, первая цепь гетеродимера может содержать два СН1-домена, тогда как вторая цепь может содержать два CL-домена, которые связываются с двумя СН1-доменами в первой цепи. В альтернативном варианте первая цепь может содержать два CL-домена, тогда как вторая цепь может содержать два СН1-домена, которые связываются с двумя CL-доменами в первой цепи. В определенных вариантах реализации первая полипептидная цепь содержит СН1-домен и CL-домен, тогда как вторая полипептидная цепь содержит CL-домен и СН1домен, которые связываются с СН1-доменом и CL-доменом соответственно первой полипептидной цепи. В вариантах реализации, в которых гетеродимерный белок содержит только одну пару гетеродимеризации (т.е. один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи), домен гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи может быть расположен амино-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи. В альтернативном варианте домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может быть расположен карбокси-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи.

В вариантах реализации, в которых гетеродимерный белок содержит две пары гетеродимеризации (т.е. два домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи), оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут быть расположены амино-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи. В альтернативном варианте оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут быть расположены карбокси-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи. В дополнительных вариантах реализации один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может быть расположен амино-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи, тогда как другой домен гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи может быть расположен карбокси-терминально к константной области иммуноглобулина этой цепи. Другими словами, в этих вариантах реализации константная область иммуноглобулина расположена между двумя доменами гетеродимеризации иммуноглобулина каждой цепи. Как указано в данном документе, в определенных вариантах реализации CD3-связывающие полипептиды согласно настоящему изобретению содержат константную область иммуноглобулина (также называемую константной областью) в полипептидной цепи. Включение константной области иммуноглобулина замедляет выведение гомодимерных и гетеродимерных белков, образуемых двумя CD3-связывающими полипептидными цепями, из циркуляции после введения субъекту. Посредством мутаций или других изменений константная область иммуноглобулина дополнительно обеспечивает возможность относительно легкой модуляции эффекторных функций димерного полипептида (например, АЗКЦ, АЗКФ, КЗЦ, фиксации комплемента и связывания с Fc-рецепторами), которые можно как повышать, так и понижать в зависимости от заболевания, лечение которого проводят, как известно в данной области техники и описано в данном документе. В определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина одной или обеих полипептидных цепей полипептидных гомодимеров и гетеродимеров согласно настоящему изобретению способна опосредовать одну или более из этих эффекторных функций. В других вариантах реализации одна или более из этих эффекторных функций снижены или отсутствуют в константной области иммуноглобулина одной или обеих полипептидных цепей полипептидных гомодимеров и гетеродимеров согласно настоящему изобретению по сравнению с соответствующей константной областью иммуноглобулина дикого типа. Например, в случае димерных CD3-связывающих полипептидов, сконструированных для стимуляции ПТКЦ, например, посредством включения второго связывающего домена, константная область иммуноглобулина может иметь сниженную эффекторную функцию или не иметь ее по сравнению с соответствующей константной областью иммуноглобулина дикого типа.

Константная область иммуноглобулина, присутствующая в CD3-связывающих полипептидах согласно настоящему изобретению, может содержать или получена из части или всего из: СН2-домена, СН3-домена, СН4-домена или любой их комбинации. Например, константная область иммуноглобулина может содержать СН2-домен, СН3-домен, СН2- и СН3-домены, СН3- и СН4-домены, два СН3-домена, СН4-домен, два СН4-домена и СН2-домен и часть СН3-домена.

СН2-домен, который может образовывать константную область иммуноглобулина CD3-связы- 27 042409 вающего полипептида согласно настоящему изобретению, может представлять собой СН2-домен иммуноглобулина дикого типа или измененный СН2-домен иммуноглобулина из определенных классов и подклассов иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD) и от различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих).

В определенных вариантах реализации СН2-домен представляет собой СН2-домен человеческого иммуноглобулина дикого типа, такой как СН2-домены дикого типа человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD, приведенные в SEQ ID NO: 115, 199-201 и 195-197 соответственно в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации СН2-домен представляет собой СН2-домен дикого типа человеческого IgG1, приведенный в SEQ ID NO: 115 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации СН2-домен представляет собой измененную СН2-область иммуноглобулина (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1), которая содержит аминокислотную замену в аспарагине в позиции 297 (например, аспарагина на аланин). Такая аминокислотная замена снижает или устраняет гликозилирование в этом участке и подавляет эффективное связывание Fc с FcyR и C1q. Последовательность измененного СН2-домена человеческого IgG1 с заменой Asn на Ala в позиции 297 приведена в SEQ ID NO: 324 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации СН2-домен представляет собой измененную СН2-область иммуноглобулина (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1), которая содержит по меньшей мере одну замену или делецию в позициях от 234 до 238. Например, СН2-область иммуноглобулина может содержать замену в позиции 234, 235, 236, 237 или 238, позициях 234 и 235, позициях 234 и 236, позициях 234 и 237, позициях 234 и 238, позициях 234-236, позициях 234, 235 и 237, позициях 234, 236 и 238, позициях 234, 235, 237 и 238, позициях 236-238, или любой другой комбинации из двух, трех, четырех или пяти аминокислот в позициях 234-238. В дополнительном или альтернативном варианте измененная СН2-область может содержать одну или более (например, две, три, четыре или пять) аминокислотных делеций в позициях 234-238, например, в одной из позиции 236 или позиции 237, тогда как другая позиция замещена. Вышеуказанная(ые) мутация(ии) снижает(ют) или устраняет(ют) активность антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или способность связывать Fc-рецептор полипептидного гетеродимера, который содержит измененный СН2домен. В определенных вариантах реализации аминокислотные остатки в одной или более из позиций 234-238 были замещены одним или более остатками аланина. В дополнительных вариантах реализации только один из аминокислотных остатков в позициях 234-238 был удален, тогда как одна или более из оставшихся аминокислот в позициях 234-238 может быть замещена другой аминокислотой (например, аланином или серином).

В определенных других вариантах реализации СН2-домен представляет собой измененную СН2область иммуноглобулина (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1), которая содержит одну или более аминокислотных замен в позициях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, СН2-область иммуноглобулина может содержать замену в позиции 253, 310, 318, 320, 322 или 331, позициях 318 и 320, позициях 318 и 322, позициях 318, 320 и 322, или любой другой комбинации из двух, трех, четырех, пяти или шести аминокислот в позициях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Вышеуказанная(ые) мутация(ии) снижает(ют) или устраняет(ют) комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) полипептидного гетеродимера, который содержит измененный СН2-домен.

В определенных других вариантах реализации кроме аминокислотной замены в позиции 297 измененная СН2-область (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1) может дополнительно содержать одну или более (например, две, три, четыре или пять) дополнительных замен в позициях 234238. Например, СН2-область иммуноглобулина может содержать замену в позициях 234 и 297, позициях 234, 235, и 297, позициях 234, 236 и 297, позициях 234-236 и 297, позициях 234, 235, 237 и 297, позициях 234, 236, 238 и 297, позициях 234, 235, 237, 238 и 297, позициях 236-238 и 297, или любой другой комбинации из двух, трех, четырех или пяти аминокислот в позициях 234-238 в дополнение к позиции 297. В дополнительном или альтернативном варианте измененная СН2-область может содержать одну или более (например, две, три, четыре или пять) аминокислотных делеций в позициях 234-238, например, в позиции 236 или позиции 237. Дополнительная(ые) мутация(ии) снижает(ют) или устраняет(ют) активность антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или способность связывать Fcрецептор полипептидного гетеродимера, который содержит измененный СН2-домен. В определенных вариантах реализации аминокислотные остатки в одной или более из позиций 234-238 были замещены одним или более остатками аланина. В дополнительных вариантах реализации только один из аминокислотных остатков в позициях 234-238 был удален, тогда как одна или более из оставшихся аминокислот в позициях 234-238 может быть замещена другой аминокислотой (например, аланином или серином).

В определенных вариантах реализации в дополнение к одной или более (например, 2, 3, 4 или 5) аминокислотным заменам в позициях 234-238 мутированная СН2-область (например, измененный СН2домен человеческого IgG1) в слитом белке согласно настоящему изобретению может содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или 6) дополнительных аминокислотных замен (например, замен на аланин) в

- 28 042409 одной или более позициях, вовлеченных в фиксацию комплемента (например, в позициях I253, Н310,

Е318, K320, K322 или Р331). Примеры мутированных СН2-областей иммуноглобулина включают СН2области человеческого IgG1, IgG2, IgG4 и мышиного IgG2a с заменами на аланин в позициях 234, 235,

237 (в случае наличия), 318, 320 и 322.

Примером мутированной СН2-области иммуноглобулина является СН2-область мышиного IGHG2c с заменами на аланин в L234, L235, G237, Е318, K320 и K322. В дополнительных других вариантах реализации кроме аминокислотной замены в позиции 297 и дополнительной(ых) делеции(ий) или замены(ен) в позициях 234-238 измененная СН2-область (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1) может дополнительно содержать одну или более (например, две, три, четыре, пять или шесть) дополнительных замен в позициях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, СН2-область иммуноглобулина может содержать (1) замену в позиции 297, (2) одну или более замен или делеций или их комбинацию в позициях 234-238 и одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или 6) аминокислотных замен в позициях I253, Н310, Е318, K320, K322 и Р331, например одну, две, три замены в позициях Е318, K320 и K322. Аминокислоты в вышеуказанных позициях могут быть замещены аланином или серином. В определенных вариантах реализации СН2-область иммуноглобулина содержит: (i) аминокислотную замену в аспарагинах позиции 297 и одну аминокислотную замену в позиции 234, 235, 236 или 237; (ii) аминокислотную замену в аспарагине позиции 297 и аминокислотные замены в двух из позиций 234-237; (iii) аминокислотную замену в аспарагине позиции 297 и аминокислотные замены в трех из позиций 234-237; (iv) аминокислотную замену в аспарагине позиции 297, аминокислотные замены в позициях 234, 235 и 237, и аминокислотную делецию в позиции 236; (v) аминокислотные замены в трех из позиций 234-237 и аминокислотные замены в позициях 318, 320 и 322; или (vi) аминокислотные замены в трех из позиций 234-237, аминокислотную делецию в позиции 236, и аминокислотные замены в позициях 318, 320 и 322.

Примеры измененных СН2-областей иммуноглобулина с аминокислотными заменами в аспарагине позиции 297 включают: СН2-область человеческого IgG1 с заменами на аланин в L234, L235, G237 и N297 и делецией в G236 (SEQ ID NO: 325 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), СН2-область человеческого IgG2 с заменами на аланин в V234, G236, и N297 (SEQ ID NO: 326 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), СН2-область человеческого IgG4 с заменами на аланин в F234, L235, G237 и N297 и делецией G236 (SEQ ID NO: 322 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), СН2-область человеческого IgG4 с заменами на аланин в F234 и N297 (SEQ ID NO: 343 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), СН2-область человеческого IgG4 с заменами на аланин в L235 и N297 (SEQ ID NO: 344 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), СН2-область человеческого IgG4 с заменами на аланин в G236 и N297 (SEQ ID NO: 345 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки), и СН2-область человеческого IgG4 с заменами на аланин в G237 и N297 (SEQ ID NO: 346 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации в дополнение к аминокислотным заменам, описанным выше, измененная СН2-область (например, измененный СН2-домен человеческого IgG1) может содержать одну или более дополнительных аминокислотных замен в одной или более позиций, отличных от вышеуказанных позиций. Такие аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами. Например, в определенных вариантах реализации Р233 может быть изменен на Е233 в измененной СН2-области IgG2 (см., например, SEQ ID NO: 326 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки). В дополнительно или альтернативном варианте, в определенных вариантах реализации измененная СН2-область может содержать одну или более аминокислотных вставок, делеций или и то, и другое. Вставка(и), делеция(и) или замена(ы) может(гут) находиться в любом месте СН2-области иммуноглобулина, например, в N- или Сконце СН2-области иммуноглобулина дикого типа, что является результатом связывания СН2-области с другой областью (например, связывающим доменом домена гетеродимеризации иммуноглобулина) посредством шарнирной области.

В определенных вариантах реализации измененная СН2-область в полипептиде согласно настоящему изобретению содержит или представляет собой последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична СН2-области иммуноглобулина дикого типа, такой как СН2область дикого типа человеческого IgG1, IgG2 или IgG4 или мышиного IgG2a (например, IGHG2c).

Измененная СН2-область иммуноглобулина CD3-связывающего полипептида согласно настоящему изобретению может быть получена из СН2-области различных изотипов иммуноглобулина, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1, lgA2 и IgD, от различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). В определенных вариантах реализации измененная СН2-область иммуноглобулина в слитом белке согласно настоящему изобретению может быть получена из СН2-области человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, или мышиного IgG2a (например, IGHG2c), последовательности которых приведены

- 29 042409 в SEQ ID NO: 115, 199, 201 и 320 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации измененный СН2-домен представляет собой СН2-домен человеческого IgG1 с заменами на аланин в позициях 235, 318, 320 и 322 (т.е. СН2-домен человеческого IgG1 с заменами L235A, Е318А, К32ОА и К322А) (SEQ ID NO: 595 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки) и, необязательно, мутацией N297 (например, на аланин). В определенных других вариантах реализации измененный СН2-домен представляет собой СН2-домен человеческого IgG1 с заменами на аланин в позициях 234, 235, 237, 318, 320 и 322 (т.е. СН2-домен человеческого IgG1 с заменами L234A, L235A, G237A, Е318А, К32ОА и К322А) (SEQ ID NO: 596 в US 2013/0129723, указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки) и, необязательно, мутацией N297 (например, на аланин).

В определенных других вариантах реализации измененный СН2-домен представляет собой измененный СН2-домен человеческого IgG1 с мутациями, которые, как известно в данной области техники, усиливают иммунологическую активность, такую как АЗКЦ, АЗКФ, КЗЦ, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора или любая их комбинация.

СН3-домен, который может образовывать константную область иммуноглобулина CD3связывающего полипептида согласно настоящему изобретению, может представлять собой СН3-домен иммуноглобулина дикого типа или измененный СН3-домен иммуноглобулина из определенных классов или подклассов иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM) различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). В определенных вариантах реализации СН3-домен представляет собой СН3-домен человеческого иммуноглобулина дикого типа, такой как СН3-домены дикого типа человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM, приведенные в SEQ ID NO: 116, 208-210, 204-207 и 212 соответственно в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации СН3-домен представляет собой СН3-домен дикого типа человеческого IgG1, приведенный в SEQ ID NO: 116 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации СН3-домен представляет собой измененный СН3-домен человеческого иммуноглобулина, такой как измененный СН3-домен на основании или полученный из СН3-домена дикого типа человеческих IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM антител. Например, измененный СН3-домен может представлять собой СН3-домен человеческого IgG1 с одной или двумя мутациями в позициях Н433 и N434 (позиции пронумерованы в соответствии с нумерацией EU). Мутации в таких позициях могут быть вовлечены в фиксацию комплемента. В определенных других вариантах реализации измененный СН3-домен может представлять собой СН3-домен человеческого IgG1, но с одной или двумя аминокислотными заменами в позиции F405 или Y407. Аминокислоты в этих позициях вовлечены во взаимодействие с другим СН3-доменом. В определенных вариантах реализации измененный СН3-домен может представлять собой измененный СН3-домен человеческого IgG1 с удаленным последним лизином. Последовательность измененного СН3-домена приведена в SEQ ID NO: 761 в US 2013/0129723 (указанная последовательность включена в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации CD3-связывающие полипептиды, образующие полипептидный гетеродимер, содержат пару СН3, содержащую так называемые мутации выступ-во-впадину (см. Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966). Если говорить более конкретно, мутации могут быть внесены в каждый из двух СН3-доменов каждой полипептидной цепи так, чтобы необходимость стерической комплементарности для связывания СН3/СН3 вынуждала эти два СН3-домена связываться друг с другом. Например, СН3-домен в одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию T366W (мутация выступа, которая замещает небольшую аминокислоту более крупной), а СН3-домен в другом одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию Y407A (мутация впадины, которая замещает крупную аминокислоту меньшей). Другие примеры мутаций выступ-во-впадину включают (1) мутацию T366Y в одном СН3-домене и Y407T в другом СН3-домене, и (2) мутацию T366W в одном СН3-домене и мутации T366S, L368A и Y407V в другом СН3-домене.

СН4-домен, который может образовывать константную область иммуноглобулина CD3связывающих полипептидов согласно настоящему изобретению, может представлять собой СН4-домен иммуноглобулина дикого типа или измененный СН4-домен иммуноглобулина из молекул IgE или IgM. В определенных вариантах реализации СН4-домен представляет собой СН4-домен человеческого иммуноглобулина дикого типа, такой как СН4-домены дикого типа молекул человеческого IgE или IgM, приведенные в SEQ ID NO: 213 и 214 соответственно в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки). В определенных вариантах реализации СН4-домен представляет собой измененный СН4-домен человеческого иммуноглобулина, такой как измененный СН4-домен на основании или полученный из СН4-домена молекул человеческого IgE или IgM, которые имеют мутации, повышающие или снижающие иммунологическую активность, связанную с Fc-областью IgE или IgM. В определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина CD3связывающих полипептидов согласно настоящему изобретению содержит комбинацию доменов СН2,

- 30 042409

СН3 или СН4 (т.е. более чем один домен константной области выбран из СН2, СН3 и СН4). Например, константная область иммуноглобулина может содержать домены СН2 и СН3 или домены СН3 и СН4. В определенных других вариантах реализации константная область иммуноглобулина может содержать два домена СН3 и не содержать домены СН2 или СН4 (т.е. только два или более СН3).

Несколько доменов константной области, которые образуют константную область иммуноглобулина, могут иметь основу в виде или быть получены из одной и той же молекулы иммуноглобулина или одного и того же класса или подкласса молекул иммуноглобулина. В определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина представляет собой IgG CH2CH3 (например, IgG1 CH2CH3, IgG2 СН2СН3 и IgG4 CH2CH3) и может быть человеческой (например, принадлежащей человеческому IgG1, IgG2 и IgG4) CH2CH3. Например, в определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина содержит (1) домены СН2 и СН3 дикого типа человеческого IgG1, (2) СН2 человеческого IgG1 с заменой N297A (т.е. CH2(N297A)) и СН3 дикого типа человеческого IgG1 или (3) CH2(N297A) человеческого IgG1 и измененный СН3 человеческого IgG1 с удалением последнего лизина. В альтернативном варианте Несколько доменов константной области могут иметь основу в виде или быть получены из разных молекул иммуноглобулина или разных классов или подклассов молекул иммуноглобулина. Например, в определенных вариантах реализации константная область иммуноглобулина содержит как домен СН3 человеческого IgM, так и домен СН3 человеческого IgG1. Несколько доменов константной области, которые образуют константную область иммуноглобулина, могут быть напрямую связаны вместе или могут быть связаны друг с другом посредством одной или более (например, приблизительно 210) аминокислот.

Примеры константных областей иммуноглобулина приведены в SEQ ID NO: 305-309, 321, 323, 341, 342 и 762 в US 2013/0129723 (указанные последовательности включены в данный документ посредством ссылки).

В определенных вариантах реализации константные области иммуноглобулина обоих CD3связывающих полипептидов полипептидного гомодимера или гетеродимера идентичны друг с другом. В определенных других вариантах реализации константная область иммуноглобулина одной полипептидной цепи гетеродимерного белка отличается от константной области иммуноглобулина другой полипептидной цепи гетеродимера. Например, одна константная область иммуноглобулина гетеродимерного белка может содержать СН3-домен с мутацией узла, тогда как другая константная область иммуноглобулина гетеродимерного белка может содержать СН3-домен с мутацией впадины.

Данное изобретение относится к CD3-связывающим белкам и полипептидам, которые могут содержать любую из последовательностей, приведенных в табл. 14. Аминокислотные последовательности для полипептидных конструкций могут содержать или не содержать сигнальные последовательности. CD3связывающие белки могут содержать любые CD3-связывающие домены, описанные выше. В некоторых аспектах CD3-связывающие белки содержат гуманизированные аминокислотные последовательности V_Hили V_L или их обе.

Примеры биспецифических CD3-связывающих полипептидов приведены в табл. 12 и 13. Такие примеры включают анти-PSMA х анти-CD3 связывающие молекулы (SEQ ID NO: 62, 64, 66 и 68), антиCD37 х анти-CD3 связывающие молекулы (SEQ ID NO: 72, 74, 76, 78, 80 и 82), анти-ROR1 х анти-CD3 связывающие молекулы (SEQ ID NO: 100, 104, 108, 112, 116 и 120) и анти-CD123 х анти-CD3 связывающие молекулы (SEQ ID NO:197 и 198).

CD3-связывающие молекулы можно получить, используя подложки, как в общем случае описано в US 2013/0129723 и US 2013/0095097, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. CD3-связывающие белки могут содержать две неидентичные полипептидные цепи, при этом каждая полипептидная цепь содержит домен гетеродимеризации иммуноглобулина. Стыкующиеся домены гетеродимеризации иммуноглобулина являются разными. В одном варианте реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит СН1-домен или его производное. В другом варианте реализации домен гетеродимеризации иммуноглобулина содержит CL-домен или его производное. В одном варианте реализации CL-домен представлен изотипами Ск или Сλ или их производными.

Данное изобретение также включает нуклеиновые кислоты (например, ДНК или РНК), кодирующие CD3-связывающие домены, белки или полипептиды, описанные в данном документе, или одну или более полипептидных цепей гомодимерного или гетеродимерного CD3-связывающего белка, описанного в данном документе. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению включают нуклеиновые кислоты, содержащие область, которая по существу идентична полинуклеотиду, приведенному в табл. 14, выше. В определенных вариантах реализации нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением имеет по меньшей мере приблизительно 80%, как правило, по меньшей мере приблизительно 90% и еще чаще по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 98% идентичности с кодирующим полипептид полинуклеотидом, приведенным в табл. 14. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению также включают комплементарные нуклеиновые кислоты. В некоторых случаях последовательности становятся полностью комплементарными (без несовпадений) при выравнивании. В других случаях в последовательностях может быть до приблизительно 20% несовпадения. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие, как первую, так и вторую

- 31 042409 цепи гетеродимерного CD3-связывающего белка согласно изобретению. Предложенные в данном документе нуклеиновые кислоты можно получать, используя оптимизацию кодонов, вырождение последовательностей, молчащие мутации и другие ДНК-технологии для оптимизации экспрессии в конкретном хозяине, а настоящее изобретение включает такие модификации последовательностей.

Данное изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CD3связывающие домены, белки и полипептиды (или их части), описанные в данном документе, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 или 59. Полинуклеотидные молекулы, содержащие необходимую полинуклеотидную последовательность, размножают, помещая молекулу в вектор. Используют вирусные и невирусные векторы, включая плазмиды. Выбор плазмиды зависит от типа клетки, в которой необходимо размножение, и цели размножения. Некоторые векторы применяют для амплификации и получения больших количеств необходимой последовательности ДНК. Другие векторы подходят для экспрессии в клетках в культуре. Другие векторы подходят для переноса и экспрессии в клетках в организме животного или человека. Выбор соответствующего вектора входит в компетенцию специалиста в данной области техники. Многие такие векторы доступны на коммерческой основе. Частичный или полноразмерный полинуклеотид вставляют в вектор, как правило, посредством присоединения ДНК-лигазы к расщепляемому рестрикционными ферментами участку в векторе. В альтернативном варианте необходимую нуклеотидную последовательность можно вставить путем гомологичной рекомбинации in vivo. Как правило, это осуществляют путем присоединения областей гомологии к вектору по бокам необходимой нуклеотидной последовательности. Области гомологии добавляют, например, посредством лигирования олигонуклеотидов или посредством полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, содержащих как область гомологии, так и часть необходимой нуклеотидной последовательности.

Для экспрессии можно использовать экспрессионную кассету или систему. Чтобы экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный в данном документе полипептид, кодирующую полипептид молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с регуляторными последовательностями, которые регулируют транскрипционную экспрессию в экспрессионном векторе, вносят в клеткухозяина. Кроме транскрипционных регуляторных последовательностей, таких как промоторы и энхансеры, экспрессионные векторы могут содержать трансляционные регуляторные последовательности и маркерный ген, который удобен для отбора клеток, несущих экспрессионный вектор. Генный продукт, кодируемый полинуклеотидом согласно изобретению, экспрессируют в любой удобной экспрессионной системе, включая, например, системы бактерий, дрожжей, насекомых, амфибий и млекопитающих. В экспрессионном векторе кодирующий полипептид полинуклеотид соответствующим образом связан с регуляторной последовательностью, чтобы получить необходимые экспрессионные свойства. Эти последовательности включают промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Промоторы могут быть регулируемыми (например, промотор из индуцируемого стероидами вектора pIND (Invitrogen)) или конститутивными (например, промоторы из ЦМВ, SV40, фактора элонгации или последовательностей ДКП). Они связаны с необходимой нуклеотидной последовательностью с помощью описанных выше методов связывания с векторами. Можно использовать любые известные в данной области техники методы. Соответственно, в общем случае экспрессионный вектор будет обеспечивать область инициации транскрипции и трансляции, которая может быть индуцибельной или конститутивной, причем кодирующая область функционально связана под транскрипционным управлением со стороны области инициации транскрипции и области терминации транскрипции и трансляции.

Экспрессионную кассету (экспрессионную единицу) можно вносить во множество векторов, например, плазмиду, ВАС, YAC, бактериофаг, такой как лямбда, Р1, М13, и т.д., растительные или животные вирусные векторы (например, векторы на основе ретровирусов, аденовирусные векторы) и тому подобные, причем векторы обычно характеризуются способностью обеспечивать отбор клеток, содержащих экспрессионные векторы. Векторы могут обеспечивать внехромосомную поддержку, в частности в случае плазмид или вирусов, или интеграцию в хромосому хозяина. В случае необходимости внехромосомной поддержки обеспечивают исходную последовательность для репликации плазмиды, которая может характеризоваться низким или высоким количеством копий. Для проведения отбора доступен широкий спектр маркеров, в частности тех, которые защищают от токсинов, более конкретно, от антибиотиков. Конкретный выбранный маркер выбирают в соответствии с природой организма-хозяина, при этом в некоторых случаях может использоваться комплементация с ауксотрофными хозяевами. При внесении ДНК-конструкции можно использовать любой удобный способ, включая, например, конъюгацию, бактериальную трансформацию, осаждение ДНК кальцием, электропорацию, слияние, трансфекцию, инфицирование вирусными векторами, биолистику и тому подобное. Данное изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему сегмент нуклеиновой кислоты, причем указанный сегмент нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 или 59.

Соответственно, белки для применения в рамках настоящего изобретения можно получать в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с традиционными методиками. Подходя- 32 042409 щими клетками-хозяевами, являются те типы клеток, которые можно трансформировать или трансфицировать экзогенной ДНК и выращивать в культуре, и включают бактерии, клетки грибов и культивируемые клетки высших эукариотов (включая культивируемые клетки многоклеточных организмов), в частности культивируемые клетки млекопитающих. Методики для проведения манипуляций с клонированными молекулами ДНК и внесения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяев описаны в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001) и Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons, 1999). Например, для рекомбинантной экспрессии гомодимерного CD3-связывающего белка, содержащего два идентичных CD3-связывающих полипептида, описанного в данном документе, экспрессионный вектор в общем случае будет содержать сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий CD3-связывающий полипептид, функционально связанный с промотором. Для рекомбинантной экспрессии гетеродимерного CD3связывающего белка, содержащего разные первую и вторую полипептидные цепи, первая и вторая полипептидные цепи могут совместно экспрессироваться с двух отдельных векторов в клетке-хозяине для экспрессии целого гетеродимерного белка. В альтернативном варианте для экспрессии гетеродимерных CD3-связывающих белков первая и вторая полипептидные цепи совместно экспрессируются с разных экспрессионных единиц в одном векторе в клетке-хозяине для экспрессии целого гетеродимерного белка. Экспрессионный(ые) вектор(ы) вносят в клетку-хозяина традиционными методами, а затем культивируют трансфицированные клетки традиционными методами, чтобы получить кодируемый(ые) полипептид(ы) для получения соответствующего CD3-связывающего белка.

Для направления рекомбинантного белка в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессионном векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть последовательностью нативной формы рекомбинантного белка или может быть получена из другого секретируемого белка или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность функционально связана с кодирующей полипептид последовательностью ДНК, т.е. две последовательности связаны в правильной рамке считывания и расположены так, чтобы направлять только что синтезированный белок в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' относительно последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут располагаться в другом месте представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, Welch et al., патент США № 5037743; Holland et al., патент США № 5143830). В определенных вариациях секреторная сигнальная последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением имеет аминокислотную последовательность MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 195).

Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами для получения рекомбинантных белков для применения в рамках настоящего изобретения.

Способы внесения экзогенной ДНК в клетки-хозяев млекопитающих включают опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (Ausubel et al., выше) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, в Levinson et al., патент США № 4713339; Hagen et al., патент США № 4784950; Palmiter et al., патент США № 4579821; и Ringold, патент США № 4656134. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки Африканской зеленой мартышки (Vero; ATCC CRL 1587), клетки первичной почки человека (293-HEK; ATCC CRL 1573), клетки почки новорожденного хомяка (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), клетки почки собаки (MDCK; ATCC CCL 34), клетки яичника китайского хомяка (Сно-Κι; ATCC CCL61; СНО DG44; СНО DXB11 (Hyclone, Logan, UT); также смотрите, например, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), питуициты крысы (GH1; ATCC CCL82), клетки HeLa S3 (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крыс (Н-4-П-Е; ATCC CRL 1548) SV40-трансформированные клетки почки обезьяны (COS-1; ATCC CRL 1650) и клетки эмбриона мыши (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Дополнительные подходящие линии клеток известны в данной области техники и доступны из общедоступных депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур, Манассас, Виргиния. Можно использовать сильные транскрипционные промоторы, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловируса. Смотрите, например, патент США № 4956288. Другие подходящие промоторы включают промоторы из генов металлотионеина (патенты США № 4579821 и 4601978) и аденовирусный основной поздний промотор.

Отбор по чувствительности к лекарственному препарату в общем случае используют для отбора культивируемых клеток млекопитающих, в которые была внесена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называются трансфектантами. Клетки, которые культивировали в присутствии селективного агента и которые способы передавать представляющий интерес ген своему потомству, называются стабильными трансфектантами. Примеры селективных маркеров включают ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину, который позволяет проводить отбор в присутствии неомицинового лекарственно

- 33 042409 го препарата, такого как G-418 или ему подобного; ген gpt для ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы, которая обеспечивает рост клеток-хозяев в присутствии микофеноловой кислоты/ксантина; и маркеры, которые обеспечивают устойчивость к зеоцину, блеомицину, бластоцидину и гигромицину (см., например, Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990). Селекционные системы также можно использовать для повышения уровня экспрессии представляющего интерес гена, что называется амплификацией. Амплификацию осуществляют, культивируя трансфектанты в присутствии низкого уровня селективного агента, а затем повышая количество селективного агента, чтобы отобрать клетки, которые вырабатывают высокие уровни продуктов внесенных генов. Примером амплифицируемого селективного маркера является дигидрофолатредуктаза, которая обеспечивает устойчивость к метотрексату. Также можно использовать другие гены устойчивости к лекарственным препаратам (например, устойчивости к гигромицину, множественной лекарственной резистентности, пуромицин ацетилтрансферазы).

В качестве хозяев также можно использовать клетки других высших эукариотов, включая клетки насекомых, клетки растений и клетки птиц. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений было описано в Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаны в Guarino et al., US 5162222 и WO 94/06463.

Клетки насекомых можно инфицировать рекомбинантным бакуловирусом, обычно получаемым из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Смотрите King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994); и Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Рекомбинантный бакуловирус также можно получать, используя систему на основе транспозонов, описанную в Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Эта система, в которой используются векторы переноса, доступна на коммерческой основе в форме набора (набор ВАС-ТО-ВАС; Life Technologies, Gaithersburg, MD). Вектор переноса (например, PFASTBAC1; Life Technologies) содержит транспозон Tn7 для перемещения ДНК, кодирующей представляющий интерес белок, в геном бакуловируса, находящийся в Е.coli в виде большой плазмиды, называемой бакмидой. См. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Кроме того, векторы переноса могут включать находящееся в рамке слияние с ДНК, кодирующей продление полипептида или аффинную метку, как описано выше. Используя известные в данной области техники методики, вектор переноса, содержащий кодирующую белок последовательность ДНК, трансформируют в клетки-хозяев Е.coli и проводят скрининг клеток в отношении бакмид, которые содержат прерывисты ген lacZ, свидетельствующий о наличии рекомбинантного бакуловируса. ДНК бакмиды, содержащую геном рекомбинантного бакуловируса, выделяют, используя общепринятые методики, и используют, чтобы трансфицировать клетки Spodoptera frugiperda, такие как клетки Sf9. После этого вырабатывается рекомбинантный вирус, экспрессирующий представляющий интерес белок. Запасы рекомбинантных вирусов CD3 дают способами, обычно используемыми в данной области техники.

В случае получения белка рекомбинантный вирус используют, чтобы инфицировать клетки-хозяев, как правило, линию клеток, полученную от травяной совки, Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf9 или Sf21) или Trichoplusia ni (например, клетки HIGH FIVE; Invitrogen, Carlsbad, CA). В общем случае смотрите Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994). См. также патент США № 5300435. Для выращивания и поддержания клеток используют бессывороточные среды. Подходящие составы сред известны в данной области техники и могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Клетки выращивают, начиная с плотности инокуляции, составляющей приблизительно 2-5x105 клеток, до плотности, составляющей 1-2x106 клеток, и в этот момент времени добавляют запас рекомбинантного вируса при множественности заражения (MOI), составляющей от 0,1 до 10, более обычно приблизительно 3. Используемые процедуры в общем случае описаны в доступных лабораторных руководствах (см., например, King and Possee, выше; O'Reilly et al., выше; Richardson, выше).

В рамках настоящего изобретения также можно использовать клетки грибов, включая клетки дрожжей. В этом отношении клетки дрожжей включают, например, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S.cerevisiae экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, в Kawasaki, патент США № 4599311; Kawasaki et al., патент США № 4931373; Brake, патент США № 4870008; Welch et al., патент США № 5037743; и Murray et al., патент США № 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селективным маркером, обычно устойчивости к лекарственным препаратам или способности к росту в отсутствие конкретного питательного вещества (например, лейцина). Примером векторной системы для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОТ1, описанная в Kawasaki et al. (патент США № 4931373), которая позволяет проводить отбор трансформированных клеток путем выращивания в среде, содержащей глюкозу. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают полученные из генов гликолитических ферментов (см., например, Kawasaki, патент

- 34 042409

США № 4599311; Kingsman et al., патент США № 4615974; и Bitter, патент США № 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. Смотрите также патенты США № 4990446; 5063154; 5139936; и 4661454.

Трансформационные системы для других дрожжей, включая Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica,

Pichia guillermondii и Candida maltosa, известны в данной области техники.

См., например, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, патент США № 4882279; и Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Клетки Aspergillus можно использовать в соответствии со способами согласно McKnight et al., патент США № 4935349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны в Sumino et al., патент США № 5162228. Способы трансформации Neurospora описаны в Lambowitz, патент США № 4486533. Получение рекомбинантных белков в Pichia methanolica описано в патентах США № 5716808; 5736383; 5854039; и 5888768.

Прокариотические клетки-хозяева, включая штаммы бактерий Eschehchia coli, Bacillus и других родов, также являются подходящими клетками-хозяевами в рамках настоящего изобретения. Методы трансформации этих хозяев и экспрессии чужеродных последовательностей ДНК, клонированных в них, хорошо известны в данной области техники (см., например, Sambrook and Russell, выше). При экспрессии рекомбинантного белка в бактериях, таких как Е.coli, белок может удерживаться в цитоплазме, как правило, в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной последовательностью секреции. В первом случае клетки лизируют, а гранулы восстанавливают и денатурируют, используя, например, изотиоцианат гуанидина или мочевину. Затем можно провести повторное сворачивание и димеризацию денатурированного белка путем разведения денатуранта, например, с помощью диализа против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против солевого буферного раствора. В альтернативном варианте белок можно восстановить из цитоплазмы в растворимой форме и выделить без применения денатурантов. Белок восстанавливают из клетки в виде водного экстракта, например, в фосфатно-солевом буфере. Чтобы произвести захват представляющего интерес белка, экстракт применяют непосредственно к хроматографической среде, такой как колонка с иммобилизованным антителом или гепариномсефарозой. Секретируемые белки можно восстановить из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (посредством, например, обработки ультразвуком или применения осмотического шока) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и восстановления белка, тем самым устраняя необходимость в денатурации и повторном сворачивании. Антитела, включая одноцепочечные антитела, можно получать в бактериальных клеткаххозяевах в соответствии с известными способами. См., например, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; и Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991.

Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяев культивируют в соответствии с традиционными процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. В данной области техники известно множество подходящих сред, включая определенные среды и комплексные среды, которые обычно содержат источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Среды также могут содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, в случае необходимости. В общем случае среда для роста обеспечивает отбор клеток, содержащих добавленную экзогенным образом ДНК, например, путем отбора по чувствительности к лекарственному препарату или создания недостатка незаменимого питательного вещества, что дополняется селективным маркером, который несет экспрессионный вектор, или который совместно трансфицирован в клетку-хозяина. CD3-связывающие белки можно очищать традиционными способами белковой очистки, как правило, посредством комбинации хроматографических методов. В общем случае смотрите Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994). Белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина можно очищать посредством аффинной хроматографии на иммобилизованном протеине А или протеине G. Дополнительные этапы очистки, такие как гель-фильтрация, можно использовать, чтобы получить необходимый уровень очистки или чтобы обеспечить обессоливание, замену буфера и тому подобное.

Описанные в данном документе CD3-связывающие молекулы можно использовать в способе лечения субъекта (например, человека или отличного от человека примата) или для производства медикамента для лечения субъекта. В общем случае такие способы включают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, описанного в данном документе CD3-связывающего белка. Описанные в данном документе CD3-связывающие молекулы можно использовать в способе лечения субъекта (например, человека или отличного от человека примата) или для производства медикамента для лечения субъекта. В общем случае такие способы включают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, описанного в данном документе CD3-связывающего белка. В некоторых вариантах реализации CD3-связывающий белок имеет по меньшей мере одну эффекторную функцию, выбранную из антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), так, что CD3-связывающий белок индуцирует АЗКЦ и/или КЗЦ против CD3-экспрессирующих клеток в организ- 35 042409 ме субъекта. В некоторых аспектах в настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта с нарушением, характеризуемым сверхэкспрессией CD3. В одном случае моноспецифический CD3связывающий полипептид вводят пациенту, страдающему от аутоиммунного заболевания (например, ревматоидного артрита). В определенных вариациях предложенный в данном документе CD3связывающий белок можно применять для модуляции функции и поведения Т-клеток, обеспечивая, таким образом, терапевтическое лечение опосредованного Т-клетками заболевания, включая аутоиммунные или воспалительные заболевания, в которых Т-клетки играют существенную роль. Так как CD3связывающие белки согласно настоящему изобретению не активируют Т-клетки и/или не индуцируют высвобождение цитокинов, они имеют преимущество по сравнению с другими молекулами, направленными против комплекса ТКР (например, анти-CD3 антителами) в отношении того, что для них не характерны или характерны сниженные побочные явления, такие как синдром высвобождения цитокинов и острая токсичность. В другом случае CD3-связывающий полипептид вводят субъекту перед проведением трансплантации органа.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения нарушения, характеризуемого сверхэкспрессией опухолевого антигена, такого как рак. Примеры опухолевых антигенов, которые могут распознаваться биспецифическими CD3-связывающими белками, включают PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, гликопротеиновый антиген А33 (gpA33) и СЕА. В общем случае такие способы включают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества CD3-связывающего белка, содержащего второй связывающий домен, который связывает опухолевый антиген, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации CD3связывающий белок индуцирует перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (ПТКЦ) против клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, у субъекта. Примеры видов рака, которые поддаются лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, рак простаты, колоректальный рак, почечноклеточную карциному, рак мочевого пузыря, рак слюнной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), рак надпочечников, мантийноклеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому, острый миелоцитарный лейкоз (ОМЛ), В-лимфоидный лейкоз, бластное новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток (БНПДК) и лейкоз ворсистых клеток.

В изобретении также предложены способы лечения рака или аутоиммунного нарушения, включающие введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества композиций или CD3-связывающих полипептидов, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах реализации в изобретении предложен способ лечения пациента с раком, включающий введение пациенту CD3-связывающего полипептида, содержащего CD3-связывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD3 и содержит вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина; причем вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая (а) по меньшей мере на приблизительно 93% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 88; или (b) по меньшей мере на приблизительно 94% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 89; а вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 82% идентична, по меньшей мере на приблизительно 85% идентична, по меньшей мере на приблизительно 87% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична, по меньшей мере на приблизительно 92% идентична, по меньшей мере на приблизительно 95% идентична, по меньшей мере на приблизительно 97% идентична, по меньшей мере на приблизительно 98% идентична или по меньшей мере на приблизительно 99% идентична аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах реализации для осуществления способов лечения и применений, описанных в данном документе, CD3связывающий белок доставляют способом, согласующимся с традиционными методиками, связанными с ведением заболевания или нарушения, для которого предусмотрено лечение. В соответствии с описанным в данном документе изобретением терапевтически эффективное количество CD3-связывающего белка вводят нуждающемуся в таком лечении субъекту в течение времени и в условиях, достаточных для предотвращения или лечения заболевания или нарушения.

Субъекты для введения описанных в данном документе CD3-связывающих белков включают пациентов с высоким риском развития конкретного нарушения, а также пациентов, у которых присутствует такое нарушение. Как правило, субъекту был поставлен диагноз нарушения, для которого предусмотрено лечение. Кроме того, во время курса лечения можно проводить наблюдение субъектов в отношении какого-либо изменения в нарушении (например, в отношении увеличения или уменьшения клинических симптомов нарушения). Также в некоторых вариациях субъект не страдает от другого нарушения, тре

- 36 042409 бующего лечение, которое включает нацеливание на CD3-экспрессирующие клетки.

При профилактическом применении фармацевтические композиции или медикаменты вводят пациенту, восприимчивому или каким-либо другим образом подверженному риску появления конкретного нарушения, в количестве, достаточном для устранения или снижения риска или замедления начала нарушения. При терапевтическом применении композиции или медикаменты вводят пациенту с подозрением или уже страдающему от такого нарушения в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичного подавления, симптомов нарушения и его осложнений. Количество, необходимое для этого, называется в данном документе терапевтически эффективной дозой или количеством. Как в профилактическом, так и в терапевтическом режимах агенты обычно вводят в нескольких дозировках, пока не будет достигнут достаточный ответ. Как правило, этот ответ отслеживают и применяют повторные дозы при ослаблении необходимого ответа.

Для выявления пациентов для лечения в соответствии со способами согласно изобретению можно применять общепринятые методы исследований для определения факторов риска, связанных с конкретными нарушениями, или для определения статуса существующего нарушения, выявленного у субъекта. Такие способы могут включать, например, определение того, есть ли у индивида родственники, у которых было диагностировано конкретное нарушение. Методы исследований также могут включать, например, традиционные исследования для определения семейного статуса в отношении конкретного нарушения, имеющего компонент наследственности. Например, также известно, что различные типы рака имеют определенные ненаследуемые компоненты. Ненаследуемые компоненты рака включают, например, мутации в некотором количестве генов, которые являются трансформирующими (например, Ras, Raf, EGFR, cMet и другие), присутствие или отсутствие определенных молекул HLA и рецепторов подавления цитотоксичности (KIR) или механизмы, посредством которых раковые клетки способны модулировать иммунную супрессию клеток наподобие NK-клеток и Т-клеток, как прямым, так и непрямым образом (см., например, Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). С этой целью обычно можно использовать нуклеотидные зонды, чтобы выявить индивидов, несущих генетические маркеры, связанные с конкретным представляющим интерес нарушением. Кроме того, в данной области техники известен широкий спектр иммунологических методов, применимых для выявления маркеров конкретного нарушения. Например, в данной области техники доступны и хорошо известны различные методы иммуноанализа ELISA, в которых используются зонды моноклональных антител для выявления антигенов, связанных с конкретными опухолями. скрининг можно осуществлять согласно показаниям при известной симптоматике, возрастных факторах, связанных факторах риска для пациента и т.д. Эти способы позволяют лечащему врачу без проблем отобрать для лечения пациентов, нуждающихся в способах, описанных в данном документе. В соответствии с этими способами нацеливание на патологические, экспрессирующие опухолевый антиген клетки, можно осуществлять в качестве независимой программы лечения или в качестве сопутствующего, вспомогательного или координированного режима лечения наряду с другими вариантами лечения.

Для введения CD3-связывающий белок может быть получен в составе фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать: (i) CD3-связывающий полипептид; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Фармацевтическую композицию, содержащую CD3-связывающий белок, можно составлять в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически применимых композиций, в которых терапевтическая молекула находится в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. Говорят, что носитель является фармацевтически приемлемым носителем, если его введение переносимо принимающим его пациентом. Одним примером фармацевтически приемлемого носителя является стерильный фосфатно-буферный солевой раствор. Другие подходящие носители, разбавители или вспомогательные вещества хорошо известны специалистам в данной области техники. (Смотрите, например, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995).) Составы могут дополнительно включать одно или более вспомогательных веществ, консервантов, солюбилизаторов, буферных агентов, альбумин для предотвращения потерь белка на поверхностях флаконов и т.д.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в дозированной форме, выбранной из группы, состоящей из: пероральной единичной дозированной формы, внутривенной единичной дозированной формы, интраназальной единичной дозированной формы, единичной дозированной формы в виде суппозитория, интрадермальной единичной дозированной формы, внутримышечной единичной дозированной формы, внутрибрюшинной единичной дозированной формы, подкожной единичной дозированной формы, эпидуральной единичной дозированной формы, подъязычной единичной дозированной формы и интрацеребральной единичной дозированной формы. Пероральная единичная дозированная форма может быть выбрана из группы, состоящей из: таблеток, пилюль, пластинок, капсул, порошков, леденцов, гранул, растворов, суспензий, эмульсий, сиропов, эликсиров, составов с замедленным высвобождением, аэрозолей и спреев.

Фармацевтическую композицию, содержащую терапевтическое средство на основе CD3-связывающего белка, можно вводить субъекту в терапевтически эффективном количестве. В соответствии со спо

- 37 042409 собами согласно настоящему изобретению CD3-связывающий белок можно вводить субъектам посредством различных путей введения, включая, например, внутримышечный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутрисуставной, парентеральный, интраназальный, внутрилегочный, трансдермальный, интраплевральный, интратекальный и пероральный пути введения. В целях предотвращения и лечения антагонист можно вводить субъекту в виде одной болюсной доставки, посредством непрерывной доставки (например, непрерывной трансдермальной доставки) в течение длительного периода времени или согласно протоколу повторного введения (например, на ежечасном, ежедневном, еженедельном или ежемесячном базисе).

В этом контексте определение эффективных дозировок, как правило, основано на исследованиях на животных моделях с последующими клиническими исследованиями на людях и руководствуется определением эффективных дозировок и протоколов введения, которые существенно снижают появление или тяжесть заболевания субъекта у модельных субъектов. Эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению варьируются в зависимости от множества разных факторов, включая средства введения, целевой участок, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые медикаменты, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также специфическую активность самой композиции и ее способность вызывать необходимый ответ у индивида. Обычно пациент является человеком, но в случае некоторых заболеваний пациент может быть отличным от человека млекопитающим. Как правило, схемы дозирования корректируют так, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ, т.е. оптимизировать безопасность и эффективность. Соответственно, терапевтически эффективное количество также является таким, при котором любые нежелательные побочные явления перевешиваются благоприятным действием введения описанного в данном документе CD3-связывающего белка. Для введения CD3-связывающего белка дозировка может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мкг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг, и более обычно от 10 мкг до 5 мг/кг массы тела субъекта. В более конкретных вариантах реализации эффективное количество агента составляет от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг. Дозировки в пределах этого диапазона могут быть достигнуты посредством одного или некоторого количества введений, включая, например, некоторое количество введений в сутки или ежесуточное, еженедельное, раз в две недели или ежемесячное введение. Например, в определенных вариациях схема состоит из начального введения, за которым следует некоторое количество последовательных введений с недельными или двухнедельными интервалами. Другая схема состоит из начального введения, за которым следует некоторое количество последовательных введений с месячными или двухмесячными интервалами. В альтернативном варианте введение может осуществляться на нерегулярном базисе согласно показаниям на основании наблюдаемых клинических симптомов нарушений.

Дозировка фармацевтической композиции может варьироваться лечащим врачом для поддержания необходимой концентрации в целевом участке. Например, при выборе внутривенного способа введения локальная концентрация агента в кровотоке в целевой ткани может составлять приблизительно 0,01-50 наномолей композиции на литр, иногда от приблизительно 1,0 наномоля на литр до 10, 15 или 25 наномолей на литр, в зависимости от статуса субъекта и предполагаемого измеряемого ответа. Более высокие или низкие концентрации можно выбирать на основании способа доставки, например, трансэпидермальной доставки и доставки через поверхность слизистой оболочки. Дозировку также следует корректировать на основании скорости высвобождения вводимого состава, например, назального спрея и порошка, пероральных или инъекционных частиц с замедленным высвобождением, трансдермальных составов и т. д. Для достижения одинакового уровня сывороточной концентрации, например, частицы с медленным высвобождением со скоростью высвобождения 5 наномолей (в стандартных условиях) надо было бы вводить в дозировке, приблизительно в два раза большей, чем частицы со скоростью высвобождения 10 наномолей.

Ahtu-CD3 терапевтическое средство (например, CD3-связывающий белок) также можно вводить в суточной дозировке, составляющей от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 миллиграммов (мг) на килограмм (мг/кг) массы тела, предпочтительно применять в виде одной суточной дозы или разделенных доз от двух до шести раз в сутки. При введении взрослому пациенту-человеку терапевтически эффективное количество можно вводить в дозах в диапазоне от 0,2 мг до 800 мг на дозу, включая, но не ограничиваясь этим, 0,2 мг на дозу, 0,5 мг на дозу, 1 мг на дозу, 5 мг на дозу, 10 мг на дозу, 25 мг на дозу, 100 мг на дозу, 200 мг на дозу и 400 мг на дозу, а множественные, обычно последовательные суточные дозы можно вводить в течение курса лечения. Ahtu-CD3 терапевтическое средство можно вводить в разное время суток. В одном варианте реализации оптимальную терапевтическую дозу можно вводить вечером. В другом варианте реализации оптимальную терапевтическую дозу можно вводить утром. Общая суточная дозировка анти-CD3 терапевтического средства может в одном варианте реализации находиться в диапазоне от приблизительно 1 мг до приблизительно 2 г и часто находится в диапазоне от приблизительно 100 мг до приблизительно 1,5 г, и наиболее часто находится в диапазоне от приблизительно 200 мг до приблизительно 1200 мг. В случае типичного 70 кг взрослого человека общая суточная доза анти-CD3 терапевтического средства может находиться в диапазоне от приблизительно 2 мг до приблизительно 1200 мг и часто нахо- 38 042409 дится в диапазоне, как указано выше, от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 800 мг.

Что касается конкретно лечения солидных опухолей, протоколы для оценки конечных показателей и противоопухолевой активности хорошо известны в данной области техники. Хотя оценка опухолевого ответа может по-разному определяться в каждом протоколе, на сегодняшний день критерии RECIST (критерии оценки ответа при солидных опухолях - от англ. Response evaluation Criteria in solid tumors) считаются рекомендованным руководством для оценки опухолевого ответа Национальным институтом рака (см. Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). В соответствии с критериями RECIST опухолевый ответ означает снижение или устранение всех определяемых поражений или метастазов. В общем случае заболевание считается определяемым, если оно включает поражения, для которых можно провести точные измерения по меньшей мере в одном измерении с результатом > 20 мм в случае традиционных методов или > 10 мм в случае спирального КТ-сканирования, с краями, четко определяемыми методом медицинской фотографии или рентгенографии, компьютерной аксиальной томографии (КТ), магнито-резонансной томографии (МРТ) или клинического обследования (в случае внешних поражений). Неопределяемое заболевание означает, что заболевание состоит из поражений < 20 мм в случае традиционных методов или < 10 мм в случае спирального КТ-сканирования и действительно неизмеряемых поражений (слишком мелких для точного измерения). Неопределяемое заболевание включает плевральные выпоты, перитонеальные выпоты и заболевание, подтверждаемое непрямыми свидетельствами.

Для протоколов для оценки ответа солидных опухолей необходимы критерии объективного статуса. Типовые критерии включают следующие: (1) полный ответ (ПО), определяемый как полное исчезновение определяемого заболевания; отсутствие новых поражений; отсутствие связанных с заболеванием симптомов; отсутствие свидетельств неопределяемого заболевания; (2) частичный ответ (ЧО), определяемый как 30% суммарное снижение наибольшего диаметра целевых поражений; (3) прогрессирующее заболевание (ПЗ), определяемое как 20% суммарное увеличение наибольшего диаметра целевых поражений или появление любых новых поражений; (4) стабильное заболевание или отсутствие ответа, определяемое как не попадающее под определение ПО, ЧО или прогрессирующего заболевания. (См. Therasse et al., выше.) Дополнительные конечные показатели, принятые в области техники онкологии, включают общую выживаемость (ОВ), выживаемость без признаков заболевания (ВБПЗ), частоту объективного ответа (ЧОО), время до прогрессирования (ВДП) и выживаемость без прогрессирования (ВВП) (см. Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologies, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD.)

Фармацевтические композиции могут поставляться в виде набора, содержащего контейнер, который содержит описанную в данном документе фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция может быть находиться, например, в форме инъекционного раствора для одной или нескольких доз или в виде стерильного порошка, которые восстанавливают перед инъекцией. В альтернативном варианте такой набор может включать распылитель сухого порошка, жидкий аэрозольный генератор или небулайзер для введения фармацевтической композиции. Такой набор может дополнительно содержать письменную информацию о показаниях и применении фармацевтической композиции.

Данное изобретение станет более понятным с помощью следующих примеров, которые исключительно иллюстрируют, но никоим образом не ограничивают изобретение.

Примеры

Пример 1. Создание стабилизированных CD3-связывающих молекул.

Для улучшения термостабильности CD3-связывающей молекулы DRA222, сконструированного варианта гуманизированного антитела Cris7, вариабельные домены Cris7 повторно гуманизировали, используя альтернативные каркасные последовательности человеческой зародышевой линии. Вариабельный домен тяжелой цепи DRA222 соответствует SEQ ID NO: 87, а вариабельный домен легкой цепи DRA222 соответствует SEQ ID NO: 90. Fc DRA222 иногда называется TSC311 или TSC312 (аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность соответствует SEQ ID NO: 1). См., Reinherz E.L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986) в отношении описания родительского антитела Cris7. Также были сделаны дополнительные изменения для улучшения аффинности и термостабильности.

Способы.

Для получения результатов, приведенных в этом примере, применяли следующие способы.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

Термограммы для рекомбинантных белков, очищенных стандартными методами очистки, получали на приборе GE VP-Capillary DSC, оборудованном автосэмплером. Приблизительно 550 мкл каждого образца (как правило, 0,5 мг/мл) в ФСБ вводили в образец капиллярным способом, используя ФСБ в качестве контроля во втором капилляре. Анализ проводили при температурах от 25°С до 130°С со скоростью нагрева 1°С в минуту. Обратная связь была установлена на низком уровне, а применяемое время отбора проб составляло 8 мс. Анализ данных проводили, используя Origin. Термограмму образца корректировали в отношении теплоемкости буфера, вычитая предыдущий скан буфер/буфер, используя базовый раствор для состава, и нормализовали на основании концентрации образца и проводили корректировку на фон.

- 39 042409

Дифференциальная сканирующая флуориметрия (ДСФ).

Термограммы для рекомбинантных белков, очищенных стандартными методами очистки, также получали в высокопроизводительном формате путем проведения анализа ДСФ на устройстве для ПЦР в режиме реального времени (Bio-Rad iCycler iQ5). Приблизительно 40 мкл каждого образца в концентрации 0,8 мг/мл в ФСБ смешивали с 5 мкл предварительно разведенного оранжевого красителя SYPRO (Каталог # S-6650, Life Technologies). Установленный протокол получения кривой плавления соответствовал повышению температуры от 25 до 90°С, с шагом 0,2°С. Флуоресцентные сигналы регистрировали с помощью набора фильтров для флуоресцентного красителя Техасского красного, который состоит из 575/30Х фильтра возбуждения и 620/30М эмиссионного фильтра. Полученные данные по интенсивности флуоресценции экспортировали в программное обеспечение для анализа данных Prism 6 (GraphPad Software, Inc.). Тепловое значение Tm для белка рассчитывали как температуру, когда вторая производная от интенсивности флуоресценции по температуре -d(RUF)/dT2=0.

Проточная цитометрия для человеческих Т-клеток Jurkat.

Исследования связывания проводили с помощью стандартных процедур окрашивания на основе проточной цитометрии, используя линию Т-клеток CD3⁺ Jurkat. Все процедуры мечения и промывки проводили в 96-луночных планшетах с U-образным дном в солевом буфере с 3% БСА и 2 мМ ЭДТА. Клетки Jurkat высевали с плотностью 200 000 клеток на лунку и инкубировали с рядом концентраций исследуемых молекул от 0,1 до 200 нМ в 50 мкл объеме/лунку в течение 30 мин на льду. Клетки три раза промывали, а затем инкубировали еще в течение 30 мин на льду с флуоресцентно-меченым минимально перекрестно-реагирующим вторичным поликлональным антителом, F(ab')² козьим античеловеческим IgG, (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и красителем для оценки жизнеспособности 7-AAD. Затем клетки дважды промывали и анализировали образцы на проточном цитометре BD LSRII. Файлы образцов анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo; среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) живой популяции клеток Jurkat в каждой лунке рассчитывали после проведения гейтинга на живых клетках (прямое и боковое рассеяние, затем клетки 7-AAD^-).

Моделирование гомологии, анализ подверженности пространственной агрегации.

В программе Accelrys Discovery Studio 4.0 конструировали модели гомологии для вариабельных доменов, используя протоколы Annotate Antibody Sequence (аннотировать последовательность антитела), Identify Framework Templates (определить каркасные матрицы), Model Antibody Framework (смоделировать каркас антитела) и Model Antibody Loops (смоделировать петли антитела). Анализ подверженности пространственной агрегации также проводили в программе Accelrys Discovery Studio 4.0, используя протокол Calculate Aggregation Scores (рассчитать показатели агрегации).

Анализ высвобождения хрома для человеческих Т-клеток.

Целевые положительные опухолевые линии клеток (линии клеток MDA-MB-231, Kasumi-2, C4-2B и Ramos) культивировали в соответствии с предоставленными протоколами. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из человеческой крови, используя стандартный градиент фиколла. Выделенные клетки промывали в солевом буфере. Т-клетки дополнительно выделяли, используя набор для выделения Т-клеток Pan T-cell Isolation Kit (каталог #130-096-535, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), следуя протоколу производителя. Выделенные Т-клетки аликвотировали и длительное время хранили в жидком азоте. Предварительно подготовленные Т-клетки размораживали за день до анализа в теплой среде RPMI с 10% человеческой сывороткой. Во время анализа к предварительно подготовленным Т-клеткам (приблизительно 100 000 на лунку) добавляли концентрации биспецифических молекул с конечной концентрацией в диапазоне от 200 до 0,01 пМ. Контроль общего лизиса обеспечивали, включая 0,04% NP-40 в качестве обработки. Приблизительно 2,5x106 клеток-мишеней обрабатывали 0,125 мКи ⁵¹Cr и инкубировали в течение 90 мин при 37°С, во влажном инкубаторе с 5% СО₂. После инкубации клетки 4 раза промывали разведенной аналитической средой (RPMI с 1% человеческой сывороткой) и ресуспендировали в 12,5 мл полной аналитической среды (RPMI с 10% человеческой сывороткой). Из этой суспензии распределяли по 50 мкл на лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (приблизительно 10000 клеток на лунку) для получения общего объема 200 мл на лунку и соотношения между Т-клетками и клетками-мишенями 10:1. Нулевой контроль лизиса обеспечивался только клетками-мишенями, исключая Т-клетки.

Планшеты инкубировали в течение 4 ч (и случайно также в течение 24 ч) при 37°С, 5% СО₂ во влажном инкубаторе, после чего их центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин и переносили по 25 мкл супернатанта из каждой лунки в соответствующую лунку 96-луночного планшета для образцов Luma. Образцы оставляли сохнуть на воздухе в химическом шкафу в течение 18 ч, а затем считывали радиоактивность с помощью микропланшетного сцинцилляционного счетчика TopCount (PerkinElmer), используя стандартный протокол.

Процент специфического лизиса рассчитывали, используя формулу:

((сигнал в обработанном лекарственным препаратом образце - фоновый сигнал из образцов, содержащих только клетки-мишени)/(сигнал в лунках для оценки общего лизиса - фоновый сигнал из образцов, содержащих только клетки-мишени))х100.

- 40 042409

Проточная цитометрия для Т-клеток яванского макака.

Периферическую кровь яванского макака, собранную в гепариновые пробирки, перевозили в течение ночи от поставщика (Charles River laboratories). После получения клетки периферической крови (МКПК) выделяли, используя пробирки для разделения по градиенту плотности (пробирки СРТ, Beckton Dickinson). Кровь разводили 1 к 1,5 в солевом буфере перед перенесением в пробирки СРТ. Пробирки СРТ центрифугировали, а разделенную популяцию МКПК собирали и промывали солевым буфером, содержащим 0,2% БСА и 5 нМ ЭДТА. Оставшиеся в препарате красные кровяные тельца лизировали, используя лизисный буфер на основе хлорида аммония и калия для красных кровяных телец. Клетки промывали в течение дополнительного времени, чтобы удалить оставшиеся тромбоциты. Этапы мечения и промывки МКПК проводили в 96-луночных планшетах с U-образным дном в солевом буфере с 0,2% БСА и 2 мМ ЭДТА. МКПК высевали с плотностью 200000 клеток на лунку и инкубировали с рядом концентраций исследуемых молекул от 0,1 до 300 нМ в 50 мкл объеме/лунку в течение 30 мин на льду. Клетки три раза промывали, а затем инкубировали еще в течение 30 мин на льду с флуоресцентномечеными антителами к CD2 и CD16 отличных от человека приматов (Biolegend), антиидиотипическими антителами к анти-PSMA или анти-CD37 связывающим доменам и красителем для оценки жизнеспособности 7-AAD. Образцы дважды промывали, фиксировали в течение 20 мин на льду 1% раствором формальдегида в солевом растворе, снова промывали и анализировали на проточном цитометре BD LSRII. Файлы образцов анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo; среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) связывания исследуемых молекул на Т-клетках в каждой лунке рассчитывали после проведения гейтинга на живых Т-клетках (прямое и боковое рассеяние, клетки 7-AAD^-, CD2⁺ CD16^-).

Анализ высвобождения хрома для МКПК яванского макака.

Линии клеток С4-2В и Ramos культивировали в соответствии с предоставленными протоколами. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из периферической крови яванского макака, используя пробирки для препаратов крови BD VACUTAINER® СРТ™ с гепарином натрия (Кат. #362753). Выделенные клетки промывали в солевом буфере. К выделенным МКПК (приблизительно 100 000) добавляли концентрации биспецифических молекул с конечной концентрацией в диапазоне от 10000 до 0,0128 пМ. Контроль общего лизиса обеспечивали, включая 0,04% NP-40 в качестве обработки. Приблизительно 5x106 клеток-мишеней С4-2В или клеток Ramos обрабатывали 0,25 мКи ⁵¹Cr и инкубировали в течение 75 мин при 37°С. После инкубации клетки 4 раза промывали клеточной культуральной средой (RPMI с 10% ФБС, 1% заменимых аминокислот, 1% пируватом натрия, глутамином Na и 20 мМ ГЭПЭС) и ресуспендировали в 25 мл среды. Из этой суспензии распределяли по 50 мкл на лунку в 96луночные планшеты с U-образным дном (приблизительно 10000 клеток/лунка) для получения соотношения между Т-клетками и клетками-мишенями 10:1. Планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% СО₂ во влажном инкубаторе, после чего их центрифугировали при 225 об/мин в течение 3 мин и переносили по 25 мкл супернатанта из каждой лунки в соответствующую лунку 96-луночного планшета для образцов Luma. Образцы оставляли сохнуть на воздухе в химическом шкафу в течение 18 ч, а затем считывали радиоактивность с помощью сцинцилляционного счетчика TopCount, используя стандартный протокол.

Результаты.

Этап 1.

CD3 дание исходных гуманизированных CD3-связывающих конструкций.

Вариабельные домены Cris7 повторно гуманизировали, используя четыре человеческие вариабельные тяжелые последовательности зародышевой линии (IGHV1-2*02 (Н7), IGHV1-46*02 (H8), IGHV13*01(H9) и IGHV1-69*02 (H10)) и 2 человеческие вариабельные легкие последовательности зародышевой линии (IGKV3-11*01 (L4) и IGKV1-33*01 (L5)), на основании гомологии последовательностей. Всего было создано 12 конструкций одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) в формате Fc антиCD3 scFv с применением линкера Н75 (QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS; SEQ ID NO: 148) (табл. 3). Последовательности 12 конструкций и контрольная молекула Fc DRA222 (TSC311 или TSC312) приведены в табл. 14.

Таблица 3. Композиция вариабельного домена исходных конструкций

Тяжелая цепь	Легкая цепь
L1 (оригинальная легкая цепь)	L4	L5
Н7	H7L1 (TSC313)	H7L4 (TSC314)	H7L5 (TSC315)
Н8	H8L1 (TSC316)	H8L4 (TSC317)	H8L5 (TSC318)
Н9	H9L1 (TSC319)	H9L4 (TSC320)	H9L5 (TSC321)
НЮ	H10L1 (TSC322)	H10L4 (TSC323)	H10L5 (TSC324)

Все 12 конструкций временно экспрессировали в клетках HEK293, очищали и исследовали в отношении связывания с Т-клетками Jurkat и оценивали в отношении термостабильности. Конструкции, со- 41 042409 держащие легкую цепь L4 или тяжелую цепь Н9, имели более низкие уровни экспрессии белка (см. колонку с конечным выходом в табл. 4) и/или более высокие уровни высокомолекулярных агрегатов (см. колонку аналитической ЭХ в табл. 4) и были исключены на последующем этапе оптимизации. Хотя большинство других конструкций демонстрировали некоторое улучшение термостабильности scFv по сравнению с оригинальными гуманизированными доменами (TSC312) согласно результатам измерений средней точки термической денатурации (Tm) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (табл. 5), уровень насыщения связывания, наблюдаемый для Т-клеток Jurkat, был снижен до разных уровней (фиг. 1). Наиболее стабильная конструкция, TSC324, демонстрировала приблизительно 50% снижение наблюдаемой медианной интенсивности флуоресценции при насыщении и двукратное увеличение ЕС₅₀ связывания (3,6 нМ) по сравнению с оригинальной гуманизированной конструкцией (TSC312, также известной как DRA222).

Таблица 4. Экспрессия и степень очистки временно экспрессируемого материала

Молекула	Название в базе	Титр на 1-ом	Конечный	Аналитическая	Аналитическая
	данных	этапе	выход (мг)	ЭХ-основной	ЭХ-
		(мкг/мл)		пик (%)	восстановление
					(%)

Fc DRA222	TSC312	43,8	4,12	92,6	100,3
FCH7L1	TSC313	35,2	2,66	95,3	90,2
Fc H7L4	TSC314	57,8	5,78	58,8	96,0
Fc H7L5	TSC315	52,6	6,99	90,6	93,3
FcH8Ll	TSC316	39,9	3,73	93,4	99,5
Fc H8L4	TSC317	52,9	4,95	66,5	97,6
Fc H8L5	TSC318	48,1	4,83	92,1	96,2
Fc DRA222	TSC312	16,1	1,41	95,4	97,8
FcH9Ll	TSC319	8,0	0,71	80,0	85,8
Fc H9L4	TSC320	43,1	3,60	69,3	102,5
Fc H9L5	TSC321	31,1	2,66	92,6	98,6
Fc H10L1	TSC322	45,6	3,94	73,2	56,7
Fc H10L4	TSC323	50,6	4,58	67,3	106,7
Fc H10L5	TSC324	33,1	2,85	90,7	104,0

Таблица 5. Термостабильность, определенная методом дифференциальной сканирующей калориметрии

Молекулы	Tm анти-СОЗ scFv (°C)	Улучшение в Tm (по сравнению c DRA222)
TSC312(DRA222)	53,02
TSC313(H7L1)	54,47	1,45
TSC315(H7L5)	54,99	1,97
TSC316(H8L1)	53,70	0,68
TSC318 (H8L5)	55,16	2,14
TSC312(H7L1)	52,88	-0,14
TSC321 (H9L5)	53,10	0,08
TSC324(H10L5)	55,83	2,81

Этап 2.

Исходная оптимизация для восстановления связывания с CD3.

Целью следующего этапа было улучшение связывания с CD3 с сохранением улучшенной термостабильности по сравнению с DRA222. На этом этапе были внесены три дополнительные последовательности легкой цепи. В основе первой легкой цепи лежала последовательность L5, содержащая две аминокислоты, замененные обратно на родительские мышиные остатки, в позициях 52 и 53 (LL на RW), и эта легкая цепь была названа L6. Также использовали две дополнительные легкие цепи зародышевой линии (IGKV1-39*01 (L7) и IGKV3D-20*1 (L8), содержащие такие же две обратно замененные аминокислоты в позициях 52 и 53. 3 новые легкие цепи (L6, L7 и L8) комбинировали с 3 тяжелыми цепями (Н7, Н8 и Н10) в формате Fc анти-CD3 scFv для получения следующих комбинаций scFv (табл. 6).

- 42 042409

Таблица 6. Композиция вариабельного домена исходных конструкций

Тяжелая цепь	Легкая цепь
L6	L7	L8
Н7	H7L6 (TSC334)	H7L7 (TSC335)	H7L8 (TSC336)
Н8	H8L6 (TSC337)	H8L7 (TSC338)	H8L8 (TSC339)
НЮ	H10L6 (TSC340)	H10L7 (TSC341)	H10L8 (TSC342)

Эти 9 конструкций временно экспрессировали в клетках HEK293 и исследовали в отношении качества, экспрессии, связывания и термостабильности белка. Последовательности этих 9 конструкций приведены в табл. 14. Серия молекул Н10 (TSC340, TSC341, TSC342) демонстрировала наилучшее связывание среди всех новых конструкций (фиг. 2) и достигала сравнимых с TSC312 уровней насыщения связывания на Т-клетках Jurkat. Однако измеренная ЕС50 связывания все еще была в два раза выше, чем у оригинальной молекулы TSC312. Серия молекул Н10 также демонстрировала существенное улучшение термостабильности согласно измеренному повышению Tm по сравнению CTSC312 с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (фиг. 3). Из этих трех молекул в качестве лидирующей молекулы для проведения дополнительной оптимизации был выбран TSC342 благодаря улучшенной термостабильности.

Затем проводили исследования родительской мышиной последовательности в отношении потенциальных горячих точек для введения мутаций для улучшения связывания. Три остатка были выбраны для проведения обратной замены и независимо мутированы обратно: G27Y(TSC370), M53I(TSC371) и I21M(TSC372). Исследования связывания этих трех конструкций на Т-клетках Jurkat выявило, что мутация G27Y в тяжелой цепи восстанавливала связывание с CD3 до сравнимых с оригинальной конструкцией TSC312 уровней (фиг. 4). Стабильность этих трех конструкций также оценивали методом ДСК. Хотя мутация G27Y не улучшала Tm, неожиданно обе оставшиеся мутации, M53I в тяжелой цепи и 121м в легкой цепи, независимо улучшали Tm на 3-4°С (табл. 7).

Таблица 7. Термостабильность мутантов, сконструированных для улучшения связывания

Мутации	Конструкции	Tm (°C)	ATm (°C)
Без мутации	TSC312	52,8	-
TSC342 G27Y	TSC370	53,6	0,8
TSC342 M53I	TSC371	55,97	3,17
TSC342 I21M	TSC372	56,55	3,75

Этап 3.

Этап конечной оптимизации для улучшения термостабильности Модель гомологии TSC370 исследовали, используя подверженность пространственной агрегации, для выявления горячих точек для потенциальной агрегации. Было выявлено, что одна мутация, А9Р в тяжелой цепи, уменьшает потенциальную горячую точку агрегации в модели гомологии. Эту мутацию вносили в каркас TSC370 для получения TSC390. Одна эта мутация оказывала слабое действие на улучшение Tm (0,25°С). Мутацию А9Р комбинировали с описанными выше мутациями M53I и I21M для создания следующих конструкций Fc анти-CDS (табл. 8):

Таблица 8. Обоснование для группы мутаций в конструкциях четвертого раунда

Конструкции G27Y А9Р M53I I21M (улучшение (улучшение (улучшение (улучшение аффинности) стабильности) стабильности) стабильности)
TSC390	X	X
TSC391	X	X	X
TSC392	X	X		X
TSC393	X		X	X
TSC394	X	X	X	X

Таблица 9. Термостабильность конструкций четвертого раунда согласно оценке методом ДСК

Мутации Название Tm ЛТт

Без мутации TSC312 52,8

- 43 042409

TSC370_A9P	TSC390	53,05	0,25
TSC370_A9P_ M53I	TSC391	56,57	3,77
TSC370_A9P_ I21M	TSC392	59,15	6,35
TSC370_ M53l_ I21M	TSC393	58,29	5,49
TSC370_A9P_ M53l_ I21M	TSC394	59,3	6,5

Комбинирование двух или более этих мутаций, видимо, оказывало благоприятное действие на термостабильность, на что указывает существенное повышение Tm согласно анализу ДСК (табл. 9). Неожиданно мутация А9Р также оказалась синергичной с другими мутациями, обеспечивая приблизительно от 1 до 2,6 С повышение стабильности по сравнению с соответствующими конструкциями без мутации А9Р. Что более важно, стабилизирующие мутации не оказывали негативное влияние на связывание с CD3 (фиг. 5).

Также были созданы биспецифические молекулы, нацеленные на PSMA и CD3 с использованием этих новых анти-CD3 scFv молекул для исследования действия, в случае его наличия, изменений в антиCD3 scFv на активность перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (ПТКЦ). Оригинальная гуманизированная конструкция (DRA222) является очень эффективной в отношении перенаправления Тклеточной цитотоксичности (см., например, US 2014/0161800). Новые конструкции исследовали в отношении их способности демонстрировать аналогичную активность. Были созданы четыре разные антиPSMA х анти-CD3 конструкции с использованием TSC391, TSC392, TSC393 и TSC394, которые назвали TSC408, TSC409, TSC410 и TSC411 соответственно. Все четыре конструкции имели сходную активность ПТКЦ с молекулой, созданной с родительским DRA222 scFv (TSC249) (фиг. 6), подтверждая, что цитотоксическая активность, а также связывание были сравнимы с человеческими Т-клетками.

Этап 4.

Этап оптимизации для восстановления перекрестной реактивности и активности для яванских макаков.

Ранее было показано, что оригинальная гуманизированная конструкция (DRA222) также связывает Т-клетки яванского макака и перенаправляет их цитотоксическую активность на клетки-мишени в случае применения биспецифического формата. TSC408, TSC409, TSC410 и TSC411 оценивали в отношении связывания и цитотоксической активности с Т-клетками яванского макака. Неожиданно TSC408, TSC409, TSC410 и TSC411 продемонстрировали сниженное связывание с Т-клетками яванского макака (фиг. 7А и 7В) и существенное снижение активности ПТКЦ с применением Т-клеток яванского макака в качестве эффекторных клеток по сравнению с анти-PSMA х анти-CD3 биспецифической молекулой, содержащей DRA222 (фиг. 8А и 8В). Это оказалось непредвиденным, так как связывание и активность с человеческими Т-клетками были непосредственно сравнимы с конструкциями, содержащими DRA222. В попытке восстановить связывание с CD3 яванского макака использовали два подхода. Один подход состоял в комбинировании легкой цепи из TSC394 с тяжелой цепью из DRA222 или в комбинировании тяжелой цепи из TSC394 с легкой цепью из DRA222, чтобы посмотреть, вносят ли остатки каркасной области, специфические в отношении одной каркасной области, свой вклад в связывание. Второй подход состоял в проведении обратных мутаций остатков в позициях 86 и 87 в легкой цепи TSC394. Остатки в этих двух позициях взаимодействуют с CDR легкой цепи, что может влиять на связывание с CD3 яванского макака. Эти варианты были внесены в анти-CD37 х анти-CD3 биспецифические молекулы (табл. 10). Некоторые из этих вариантов, в особенности TSC455, TSC456 и TSC452, демонстрировали улучшенное связывание с Т-клетками яванского макака по сравнению с анти-CD37 х TSC394 (TSC445), что отображается более высокими уровнями связывания при насыщающих концентрациях (фиг. 9). Также проводили анализ ПТКЦ яванского макака, который показал, что TSC456 и TSC452 имели активность, сравнимую с CAS105 (фиг. 10). Кроме того, эти молекулы имели превосходящую термостабильность по сравнению с CAS105 (табл. 11), на что показывает более высокое значение Tm1 в анализе ДСК. Выравнивание DRA222 scFv, TSC455 scFv и TSC456 scFv показано На фиг. 13.

- 44 042409

Таблица 10. Пятый раунд оптимизированных конструкций

Анти-СОЗ конструкции Описание анти-СО37 X анти-СОЗ биспецифических молекул

CAS105	анти-СО37 х DRA222
TSC445	анти-СО37 х TSC394
TSC452	анти-СО37 х (TSC394VL+ DRA222 VH)
TSC453	анти-СО37 х (TSC394VH + DRA222 VL)
TSC454	анти-СО37 xTSC394 E86D
TSC455	анти-СО37 х TSC394 F87Y
TSC456	анти-СО37 х TSC394 E86D F87Y

Таблица 11. Стабильность биспецифических конструкций

Анти-СОЗ конструкции	Описание анти-СО37 X анти-СОЗ биспецифических молекул	Tm 1
CAS105	анти-СО37х DRA222	53,04
TSC445	анти-СО37 х TSC394	55,45
TSC452	анти-СО37 х (TSC394VL+ DRA222 VH)	55,37
TSC453	анти-СО37 х (TSC394VH + DRA222 VL)	56,54
TSC454	анти-СО37 х TSC394 E86D	57,94
TSC455	анти-СО37 х TSC394 F87Y	56,73
TSC456	анти-СО37х TSC394 E86D F87Y	55,45

Пример 2. Влияние улучшенной термостабильности на стабильность при хранении.

В принципе, белки с улучшенной термодинамической стабильностью также должны быть более устойчивыми к агрегации после хранения и должны иметь повышенную стабильность при хранении по сравнению с менее стабильными белками. Чтобы определить, коррелирует или нет повышение, наблюдаемое для Tm, с улучшением стабильности при хранении, белки, приведенные в табл. 10, оценивали в отношении стабильности при хранении в ФСБ при 25°С в течение двух недель. В каждом белке проводили замену буфера на ФСБ, используя препаративную эксклюзионную хроматографию, а концентрацию белка доводили до 1 мг/мл. Для каждого предназначенного для оценки белка готовили четыре флакона, содержащие каждый приблизительно 120 мкл. Использовали по одному флакону в каждый момент времени оценки стабильности. Чистоту определяли, анализируя 25 мкл (или 25 мкг) на колонке для аналитической эксклюзионной ВЭЖХ, уравновешенной в ФСБ, и измеряя поглощение на 280 нм. Для каждой конструкции в каждый момент времени проводили по три повторных ввода. После завершения процедуры ЭХ хроматограмму интегрировали, используя программное обеспечение Agilent ChemStation. Процент чистоты каждого белка рассчитывали, деля площадь пика для интактной молекулы на общую площадь пика, а затем умножая на 100.

(Площадь пика для интактной молекулы) / (общая площадь пика) х 100 =% чистоты

Представленная чистота является усредненной по значениям, полученным по трем вводам из одного флакона. Чистоту, как правило, определяли при Т=0, 3, 7 и 14 суток. Значения чистоты наносили на график в виде функции от времени и проводили линейный регрессионный анализ. Наклон линии регрессии представлял скорость снижения чистоты для каждого белка, скорость снижения чистоты использовали для оценки числа суток хранения, которые приводили к 2% снижению в чистоте. Стабильность разных вариантов сравнивали, упорядочивая их от наибольшего к наименьшему числу суток, приводящих, согласно оценке, к 2% снижению. Чтобы уменьшить межаналитическую вариабельность, не проводили сравнение значений стабильности при хранении для разных экспериментов, ранжирование проводили только для конструкций в рамках одной экспериментальной группы.

Все новые молекулы демонстрировали превосходящую стабильность в растворе в ФСБ при 25°С по сравнению с CAS105 (фиг. 11). Также для каждой конструкции рассчитывали время образования агрегатов (табл. 12).

- 45 042409

Таблица 12. Относительная стабильность при хранении при 25°С
Анти-СОЗ	Описание анти-СО37 X анти-	# дней до
конструкция	CD3 биспецифических	2%
	молекул	снижения
CAS105	AHTM-CD37 х DRA222	4
TSC445	AHTM-CD37 х TSC394	8
TSC450	AHTM-CD37 х TSC313	12
TSC451	AHTM-CD37 х TSC316	12
TSC452	AHTM-CD37 х (TSC394VL+H4)	7
TSC453	AHTM-CD37 х (TSC394VH+L1)	8
TSC454	AHTM-CD37 х TSC394 E462D	7
TSC455	AHTM-CD37 х TSC394 F463Y	10
TSC456	AHTM-CD37 х TSC394 DY	10

Эти данные показывают, что почти все конструкции имели двукратное или большее повышение в стабильности при хранении при 25°С по сравнению с конструкцией, содержащей оригинальный антиCD3 scFv (DRA222).

Пример 3. Влияние улучшенной термостабильности на сывороточную стабильность.

Аналогично со стабильностью при хранении молекулы с более высоко термодинамической стабильностью также часто более устойчивы к протеолизу, что может улучшить стабильность в человеческой сыворотке. Это, в свою очередь, может улучшить общую сывороточную фармакокинетику и общее воздействие терапевтического средства.

Чтобы исследовать, повлияло ли улучшение термодинамической стабильности на общую сывороточную стабильность, одну из стабилизированных анти-CD3 scFv молекул (TSC394 F463Y) оценивали в отношении сывороточной стабильности в контексте анти-ROR1 х анти-CD3 биспецифической молекулы (ROR193). Также одновременно оценивали сходную биспецифическую молекулу, которая содержала оригинальный анти-CD3 scFv, DRA222 (ROR133). Родительское кроличье анти-ROR1 антитело R11, используемое для создания RORi-связывающих доменов, описано, например, в публикации заявки на патент США № 2013/0251642 и Yang et al., PLoS ONE 6(6): e21018 (2011). Человеческую сыворотку, полученную от случайного здорового донора, собирали в Red/Grey Vacutanor (BD# 367988) и готовили в соответствии с предложенным поставщиком протоколом. Исследуемые препараты вносили в 50 мкл сыворотки в концентрации 1 мкМ в стерильных пробирках для ПЦР и инкубировали во влажном инкубаторе для тканевого культивирования при 37°С в течение до 21 суток. Выбранные моменты времени составляли 21, 14, 7, 3 и 0 сутки. Образцы инкубировали в обратном хронологическом порядке, начиная с 21 суток проведения анализа, и при этом оценку всех образцов проводили одновременно, используя анализ ПТКЦ на основе высвобождения хрома в конце инкубации на 0 сутки проведения эксперимента, следуя протоколу, приведенному выше в примере 1. Значения ЕС₅₀ аппроксимировали с кривых титрования, которое проводили для образцов для каждого момента времени, и нормализовали относительно значения ЕС₅₀, определенного для каждой конструкции на 0 сутки.

Построенные графики зависимости значений ЕС₅₀ от времени показали огромную разницу для наблюдаемой сывороточной стабильности ROR133 по сравнению ROR193 (фиг. 12) с 2,5-кратным снижением наблюдаемой ЕС₅₀ в течение 21 суток для ROR133, но минимальным изменением ЕС₅₀ для ROR193. Это демонстрирует, что умеренное изменение термодинамической стабильности может иметь заметное влияние на сывороточную стабильность.

Пример 4. Влияние улучшенной термодинамической стабильности на экспрессию и качество белка.

Ранее также было показано, что улучшение термодинамической стабильности может приводить к улучшению экспрессии белка и общего качества белка согласно результатам определения образования высокомолекулярных агрегатов во время получения белка.

Чтобы исследовать, привела или нет улучшенная термодинамическая стабильность новых антиCD3 scFv областей к улучшению экспрессии белка или качества белка, один из анти-CD3 доменов (TSC394DY) сравнивали с DRA222 в контексте пяти разных пар анти-ROR1 х анти-CD3 биспецифических молекул, каждая из которых содержала одинаковый анти-ROR1 scFv (табл. 13).

- 46 042409

Таблица 13. Относительная экспрессия и качество белка %

Пара сд	ID конструкции	CD3связывающи й домен	Экспресси я (мкг/мл)	% улучшения	ЭХ (постпроА)	% вм агрегатов	снижени я агрегатов
А	ROR134	DRA222	26		78	22
	ROR189	TSC394DY	37	42%	89	11	50%
В	ROR154	DRA222	16		91	9
	ROR185	TSC394DY	26	63%	94	6	33%
С	ROR179	DRA222	14		83	17
	ROR186	TSC394DY	27	93%	88	12	29%
D	R0R181	DRA222	25		81	19
	R0R191	TSC394DY	33	32%	90	10	47%
Е	ROR182	DRA222	16		90	10
	ROR192	TSC394DY	21	31%	92	8	20%

Для каждой пары молекул наблюдали более высокий титр общей экспрессии белка - на от 31% до 93% более высокий - в случае конструкции, содержащей стабилизированный анти-CD3 scFv (TSC394DY). Также, в рамках каждой пары молекул, конструкция, содержащая стабилизированный анtu-CD3 scFv имела более низкий уровень высокомолекулярных агрегатов после очистки с протеином А (приблизительно от 20 до 50% снижения уровней агрегатов). Это подтверждает, что включение стабилизированного анти-CD3 scFv может привести к улучшению экспрессии белка и улучшению качества белка по сравнению с оригинальным анти-CD3 scFv.

Пример 5. Влияние стабилизированных анти-CD3 связывающих доменов на стабильность и фармакокинетику анти-PSMA Х анти-CD3 связывающих молекул.

Чтобы исследовать влияние стабилизированного анти-CD3 scFv на стабильность и фармакокинетику биспецифической связывающей молекулы, PSMA-связывающий домен TSC266 (анти-PSMA Х антиCD3 биспецифическая молекула, содержащая DRA222 CD3-связывающий домен) переносили в биспецифическую молекулу, используя TSC456 анти-CD3 scFv. Эту новую биспецифическую молекулу назвали TSC471. Мышей BALB/c внутривенно дозировали TSC266 и TSC471 приблизительно при 10 мг/кг. TSC266 разводили в ФСБ, тогда как TSC471 разводили в буфере для состава, который использовали для всех разведений (5 мМ сукцината, 6,5% сахарозы, 0,02% Твин 80, рН 4,8). Сыворотку получали от 3 животных для 10 моментов времени (всего n = 30). Моменты времени соответствовали 15 мин и 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 336, и 504 ч после введения биспецифических молекул. Терминальный забор крови использовали, чтобы собрать больший объем. Сывороточные концентрации определяли, используя методы ELISA с захватом анти-PSMA связывающего домена и выявлением анти-CD3 связывающего домена. Сывороточные концентрации в динамике по времени использовали для определения оценочных фармакокинетических (ФК) параметров с помощью некомпартментного анализа (НКА) и компартментного анализа. Образцы сыворотки для поздних моментов времени также исследовали в отношении антител к лекарственному препарату, используя стандартный метод ELISA с образованием мостиков с соответствующими биспецифическими молекулами +/- биотин. Если говорить конкретнее, применяли следующие методы ELISA. Концентрации анти-PSMA Х анти-CD3 биспецифических молекул определяли, используя 96луночные планшеты, покрытые мышиным моноклональным антителом (mAb 1H5) для захвата антиPSMA части каждой конструкции. Другие концы конструкций выявляли, используя конъюгированное с биотином мышиное моноклональное антитело, нацеленное на анти-CD3-связывающий домен (mAb 5H5), таким образом с помощью этого метода ELISA можно определять только интактный белок. Для количественной оценки связанных иммунных комплексов из образцов сыворотки и аналитических контрольных образцов использовали полимеризованную пероксидазу хрена (поли-ПХ) и флуорогенный субстрат пероксидазы, а результаты получали с помощью флуоресцентного планшет-ридера. Стандартные кривые, используемые для расчета сывороточных концентраций, состояли из различных известных концентраций соответствующей биспецифической конструкции PSMA, внесенной в разбавитель ELISA. Программное обеспечение SOFTMAX® Pro использовали для расчета сывороточных концентраций с использованием 4-параметрического логистического уравнения, а также точности и достоверности для стандартных и исследуемых образцов.

Результаты этих исследований приведены на фиг. 14 и 15. Согласно данным некомпартментного анализа (НКА), выполненного с помощью программного обеспечения Phoenix-64 WinNonLin, TSC471 имел приблизительно 2-кратное улучшение времени полужизни, наряду с 3-4-кратным снижением параметра выведения по сравнению с TSC266. Fc TSC471 сохранял функциональные характеристики TSC266

- 47 042409 (отсутствие активности АЗКЦ или КЗЦ, эквивалентное связывание FcRn) с улучшением стабильности. Fc TSC471 содержит улучшенную в отношении стабильности версию СН2-домена. Мутации аналогичны мутациям в 234-236 области молекулы в Fc TSC266, но Fc TSC471 содержит меньшее число мутаций в области CDC, сохраняя только мутацию К322А, вместо всех трех в нулевом Fc CH2. Ahtu-CD3 scFv TSC471 сохранял связывание и активность в отношении Т-клеток человека и яванского макака. Линкер, используемый в TSC471, имел повышенную устойчивость к протеазам СНО и другим РТМ и не содержал участок N-связанного гликозилирования.

Пример 6. Влияние стабилизированных анти-CD3 связывающих доменов на фармакокинетику антиROR1 Х анти-CD3 связывающих молекул.

Проводили сравнение фармакокинетики анти-ROR1 х анти-CD3 биспецифических молекул, содержащих менее стабильный DRA222 CD3 связывающий домен или более стабильный TSC456 CD3 связывающий домен. Оценивали следующие конструкции. Последовательности конструкций приведены в табл. 14.

Таблица 14

Конструкция	Анти-RORI	Анти-СОЗ
ROR206 (Линия CHO: ROR206a)	Связывающий домен А	DRA222
ROR207 (Линия CHO: ROR207a)	Связывающий домен А	TSC456
ROR208 (Линия CHO: ROR208a)	Связывающий домен В	DRA222
ROR209 (Линия CHO: ROR209a)	Связывающий домен В	TSC456

Мышей NSG внутривенно дозировали анти-ROR1 Х анти-CD3 биспецифическими антителами приблизительно при 10 мг/кг. Все биспецифические антитела разводили в ФСБ. Сыворотку получали от 3 животных для 10 моментов времени (n = 30 для каждой конструкции) после введения, а также в один момент времени перед дозированием. Моменты времени соответствовали 15 мин и 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 336, и 504 ч после введения биспецифических молекул. Терминальный забор крови использовали, чтобы собрать больший объем. Сывороточные концентрации определяли методами ELISA для выявления интактной молекулы. Сывороточные концентрации в динамике по времени использовали для определения оценочных ФК-параметров с помощью некомпартментного анализа (НКА) и компартментного анализа.

Если говорить конкретнее, применяли следующие методы ELISA. Концентрации анти-ROR1 Х анtu-CD3 биспецифических молекул определяли, используя 96-луночные планшеты, покрытые ROR1 ECD-AFH (ROR177) для захвата анти-ROR1 части каждой конструкции. Другие концы конструкций ROR выявляли, используя конъюгированное с биотином мышиное моноклональное антитело, нацеленное на анти-CD3-связывающий домен (mAb 5H5), таким образом, с помощью этого метода ELISA можно определять только интактный белок. Для количественной оценки связанных иммунных комплексов из образцов сыворотки и аналитических контрольных образцов использовали полимеризованную пероксидазу хрена (поли-ПХ) и флуорогенный субстрат пероксидазы, а результаты получали с помощью флуоресцентного планшет-ридера. Стандартные кривые, используемые для расчета сывороточных концентраций, состояли из различных известных концентраций соответствующей биспецифической конструкции ROR, внесенной в разбавитель ELISA. Программное обеспечение SOFTMAX® Pro использовали для расчета сывороточных концентраций с использованием 4-параметрического логистического уравнения, а также точности и достоверности для стандартных и исследуемых образцов.

Результаты этих исследований приведены на фиг. 16, 17А и 17В. Согласно данным НКА и компартментного анализа ROR209a имел наибольшее время полужизни. ROR207a характеризовался самым низким выведением и оценочным объемом по данным обоих видов анализа. Обе анти-ROR1 биспецифические молекулы с DRA222 CD3 связывающим доменом имели более короткое время полужизни и более быстрые параметры выведения. Стоит отметить, что конструкции с улучшенным анти-CD3 связывающим доменом (TSC456) имели лучшую фармакокинетику, чем конструкции с менее стабильным антиCD3 связывающим доменом (DRA222).

Пример 7. Влияние стабилизированных анти-CD3 связывающих доменов на In Vivo эффективность анти-ROR1 Х анти-CD3 связывающих молекул.

Клетки MDA-MB-231 смешивали вместе с донорскими Т-клетками и матригелем и имплантировали в бок мышей NOD/SCID на 0 сутки исследования. Каждая группа содержала N = 5 животных с Тклетками от одного донора. На фиг. 18 показан типовой график, который демонстрирует минимальное влияние Т-клеток на рост опухоли со стороны донорских Т-клеток. Животных обрабатывали ФСБ или 30 мкг или 3 мкг ROR208 (анти-CD3 связывающий домен DRA222) или ROR209 (анти-CD3 связывающий

- 48 042409 домен TSC456). Дозу вводили на 0, 4 и 8 сутки. Рост опухоли измеряли калиперами на протяжении исследования.

Существенное ингибирование роста опухоли наблюдали после обработки обеими биспецифическими молекулами ROR. Не наблюдали никакой существенной разницы в росте опухоли при применении Тклеток от донора (фиг. 18) по сравнению с опухолью без обработки. Не наблюдалось существенной разницы между животными, обработанными ROR208, по сравнению с обработанными ROR209 при любом уровне дозирования, что свидетельствует о том, что анти-CD3 связывающий домен с улучшенной стабильностью имел такую же эффективность, что и нестабильный анти-CD3 связывающий домен. Пример 8. Влияние стабилизированных анти-CD3 связывающих доменов на In Vivo эффективность анти-ROR1 Х анти-CD3 связывающих молекул Клетки Kasumi-2 смешивали вместе с донорскими Т-клетками и матригелем и имплантировали в бок мышей NOD/SCID на 0 сутки исследования. Каждая группа содержала N = 10 животных с Т-клетками от одного донора. Животных обрабатывали ФСБ или 30, 3 или 0,3 мкг ROR243 (анти-CD3 связывающий домен TSC456), как показано На фиг. 19. Дозу вводили на 0, 4 и 8 сутки. Способом введения был внутривенный (В/В) за исключением одной группы, в которой дозу вводили подкожно (П/К). На фиг. 19 показаны результаты анализа. Рост опухоли измеряли калиперами на протяжении исследования.

Ингибирование роста опухоли не наблюдали в присутствии Т-клеток в отсутствие ROR243 или с обработкой ROR243 в отсутствие Т-клеток. Существенное ингибирование роста опухоли наблюдали при применении дозы 0,3 мкг с дозозависимым титрованием.

Разницу между путями введения не наблюдали.

- 49 042409

Таблица 14. Последовательности и компоненты связывающего домена и полипептида

Последовательность ДНК для Fc DRA222 (TSC311 или TSC312):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt ggagtctggg840 ggcggagtgg tgcagcctgg gcggtcactg aggctgtcct gcaaggcttc tggctacacc900 tttactagat ctacgatgca ctgggtaagg caggcccctg gacaaggtct ggaatggatt960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacaggttc1020 acaatcagcg cagacaaatc caagagcaca gccttcctgc agatggacag cctgaggccc1080 gaggacaccg gcgtctattt ctgtgcacgg ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaagggac tcccgtcact gtctctagcg gtggcggagg gtctgggggt1200 ggcggatccg gaggtggtgg ctctgcacaa gacatccaga tgacccagtc tccaagcagc1260 ctgtctgcaa gcgtggggga cagggtcacc atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt1320 tacatgaact ggtaccagca gaagccgggc aaggccccca aaagatggat ttatgactca1380 tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gaccgactat1440 accctcacaa tcagcagcct gcagcccgaa gatttcgcca cttattactg ccagcagtgg1500 agtcgtaacc cacccacgtt cggagggggg accaagctac aaattacatc ctccagctaa1560 (SEQ ID NO: 1)

Сигнальная последовательность представлена остатками от 1 до 60. Fc-область представлена остатками 61-753. Линкер представлен остатками от 754 до 816. Анти-СВЗ scFv представлен остатками от 817 до 1560.

Последовательность зрелого белка для Fc DRA222 (TSC311 или TSC312)

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVESG GGWQPGRSL RLSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWI300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRF TISADKSKST AFLQMDSLRP EDTGVYFCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTPVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSAQ DIQMTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSSVS420

- 50 042409

YMNWYQQKPG KAPKRWIYDS SKLASGVPAR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW480

SRNPPTFGGG TKLQITSSS499 (SEQ ID NO:2)

Последовательность ДНК для Fc H7L1 (TSC313):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccaagcagcc tgtctgcaag cgtgggggac agggtcacca tgacctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcccccaa aagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg1440 accgactata ccctcacaat cagcagcctg cagcccgaag atttcgccac ttattactgc1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccacgttc ggagggggga ccaagctaca aattacatcc1560 tccagctaa1569 (SEQ ID NO:3)

Сигнальная последовательность представлена остатками от 1 до 60. Fc-область представлена остатками 61-753. Линкер представлен остатками от 754 до 816. Анти-СВЗ scFv представлен остатками от 817 до 1569.

Последовательность Зрелого белка для Fc H7L1 (TSC313):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

- 51 042409

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PARFSGSGSG TDYTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKLQITS SS502 (SEQ ID NO:4)

Последовательность ДНК для Fc H7L4 (TSC314):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacacagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:5)

Сигнальная последовательность представлена остатками от 1 до 60

Последовательность Зрелого белка для Fc H7L4 (TSC314):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGQAPRLLI YDSSKLASGI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC480

- 52 042409

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:6)

Последовательность ДНК для Fc H7L5 (TSC315):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:7)

Последовательность Зрелого белка для Fc H7L5 (TSC315):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKLLI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503

- 53 042409 (SEQ ID NO:8)

Последовательность ДНК для Fc H8L1 (TSC316):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccaagcagcc tgtctgcaag cgtgggggac agggtcacca tgacctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcccccaa aagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg1440 accgactata ccctcacaat cagcagcctg cagcccgaag atttcgccac ttattactgc1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccacgttc ggagggggga ccaagctaca aattacatcc1560 tccagctaa1569 (SEQ ID NO:9)

Последовательность Зрелого белка для Fc H8L1 (TSC316):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PARFSGSGSG TDYTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKLQITS S3502 (SEQIDNO:10)

- 54 042409

Последовательность ДНК для Fc H8L4 (TSC317):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacacagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:11)

Последовательность зрелого белка для Fc H8L4 (TSC317):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGQAPRLLI YDSSKLASGI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQIDNO:12)

- 55 042409

Последовательность ДНК для Fc H8L5 (TSC318):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:13)

Последовательность зрелого белка для Fc H8L5 (TSC318):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT12 0

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKLLI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQIDNO:14)

- 56 042409

Последовательность ДНК для Fc H9L1 (TSC319):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagcttgt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcttc tggctacacc900 tttactagat ctacgatgca ttgggtgcgc caggcccccg gacaaaggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accattacca gggacacatc cgcgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaagacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccaagcagcc tgtctgcaag cgtgggggac agggtcacca tgacctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcccccaa aagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg1440 accgactata ccctcacaat cagcagcctg cagcccgaag atttcgccac ttattactgc1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccacgttc ggagggggga ccaagctaca aattacatcc1560 tccagctaa1569 (SEQ ID NO: 15)

Последовательность Зрелого белка для Fc H9L1 (TSC319):

EPKSSDKTHT	CPPCPAPEAA	GAPSVFLFPP	KPKDTLMISR	TPEVTCVWD	VSHEDPEVKF	60
NWYVDGVEVH	NAKTKPREEQ	YNSTYRWSV	LTVLHQDWLN	GKAYACAVSN	KALPAPIEKT	120
ISKAKGQPRE	PQVYTLPPSR	DELTKNQVSL	TCLVKGFYPS	DIAVEWESNG	QPENNYKTTP	180
PVLDSDGSFF	LYSKLTVDKS	RWQQGNVFSC	SVMHEALHNH	YTQKSLSLSP	GQRHNNSSLN	240
TGTQMAGHSP	NSQVQLVQSG	AEVKKPGASV	KVSCKASGYT	FTRSTMHWVR	QAPGQRLEWM	300
GYINPSSAYT	NYNQKFKDRV	TITRDTSAST	AYMELSSLRS	EDTAVYYCAR	PQVHYDYNGF	360
PYWGQGTLVT	VSSGGGGSGG	GGSGGGGSGG	GGSDIQMTQS	PSSLSASVGD	RVTMTCSASS	420
SVSYMNWYQQ	KPGKAPKRWI	YDSSKLASGV	PARFSGSGSG	TDYTLTISSL	QPEDFATYYC	480
QQWSRNPPTF	GGGTKLQITS	SS				502

(SEQ ID NO: 16)

- 57 042409

Последовательность ДНК для Fc H9L4 (TSC320):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagcttgt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcttc tggctacacc900 tttactagat ctacgatgca ttgggtgcgc caggcccccg gacaaaggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accattacca gggacacatc cgcgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaagacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacacagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO: 17)

Последовательность Зрелого белка для Fc H9L4 (TSC320):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQRLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITRDTSAST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGQAPRLLI YDSSKLASGI PARFSGSGSG TDFTLTISSL EPEDFAVYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQIDNO:18)

- 58 042409

Последовательность ДНК для Fc H9L5 (TSC321):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagcttgt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcttc tggctacacc900 tttactagat ctacgatgca ttgggtgcgc caggcccccg gacaaaggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accattacca gggacacatc cgcgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaagacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO: 19)

Последовательность Зрелого белка для Fc H9L5 (TSC321):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQRLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITRDTSAST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKLLI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:20)

Последовательность ДНК для Fc H10L1 (TSC322):

- 59 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccaagcagcc tgtctgcaag cgtgggggac agggtcacca tgacctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcccccaa aagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg1440 accgactata ccctcacaat cagcagcctg cagcccgaag atttcgccac ttattactgc1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccacgttc ggagggggga ccaagctaca aattacatcc1560 tccagctaa1569 (SEQ ID NO:21)

Последовательность Зрелого белка для FC H10L1 (TSC322):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PARFSGSGSG TDYTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKLQITS S3502 (SEQ ID NO:22)

Последовательность ДНК для Fc H10L4 (TSC323)

- 60 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacacagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccaacag aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagccta gagcctgaag attttgcagt ttattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:23)

Последовательность Зрелого белка для Fc H10L4 (TSC323)

EPKSSDKTHT	CPPCPAPEAA	GAPSVFLFPP	KPKDTLMISR	TPEVTCVWD	VSHEDPEVKF	60
NWYVDGVEVH	NAKTKPREEQ	YNSTYRWSV	LTVLHQDWLN	GKAYACAVSN	KALPAPIEKT	120
ISKAKGQPRE	PQVYTLPPSR	DELTKNQVSL	TCLVKGFYPS	DIAVEWESNG	QPENNYKTTP	180
PVLDSDGSFF	LYSKLTVDKS	RWQQGNVFSC	SVMHEALHNH	YTQKSLSLSP	GQRHNNSSLN	240
TGTQMAGHSP	NSQVQLVQSG	AEVKKPGSSV	KVSCKASGGT	FSRSTMHWVR	QAPGQGLEWM	300
GYINPSSAYT	NYNQKFKDRV	TITADKSTST	AYMELSSLRS	EDTAVYYCAR	PQVHYDYNGF	360
PYWGQGTLVT	VSSGGGGSGG	GGSGGGGSGG	GGSEIVLTQS	PATLSLSPGE	RATLSCSASS	420
SVSYMNWYQQ	KPGQAPRLLI	YDSSKLASGI	PARFSGSGSG	TDFTLTISSL	EPEDFAVYYC	480
QQWSRNPPTF	GGGTKVEIKR	SSS				503

(SEQ ID NO:24)

- 61 042409

Последовательность ДНК для Fc H10L5 (TSC324):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcgtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:25)

Последовательность Зрелого белка для Fc H10L5 (TSC324):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKLLI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:26)

Последовательность ДНК для Fc H7L6 (TSC334):

- 62 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:27)

Последовательность Зрелого белка для Fc H7L6 (TSC334):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS*504 (SEQ ID NO:28)

Последовательность ДНК для Fc H7L7 (TSC335):

- 63 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacgcagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aaacctggcc tggcgcccag gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagactg gagcctgaag attttgcagt gtattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:29)

Последовательность Зрелого белка для Fc H7L7 (TSC335):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGLAPRRWI YDSSKLASGI PDRFSGSGSG TDFTLTISRL EPEDFAVYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS504 (SEQ ID Νθ:30)

Последовательность ДНК для Fc H7L8 (TSC336):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60

- 64 042409 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagggtc1020 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct1080 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:31)

Последовательность зрелого белка для Fc H7L8 (TSC336):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSIST AYMELSRLRS DDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS*504 (SEQ ID NO:32)

Последовательность ДНК для Fc H8L6 (TSC337)

- 65 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:33)

Последовательность зрелого белка для Fc H8L6 (TSC337):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS*504 (SEQ ID NO:34)

Последовательность ДНК для Fc H8L7 (TSC338):

- 66 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacgcagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aaacctggcc tggcgcccag gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagactg gagcctgaag attttgcagt gtattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:35)

Последовательность Зрелого белка для Fc H8L7 (TSC338):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGLAPRRWI YDSSKLASGI PDRFSGSGSG TDFTLTISRL EPEDFAVYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:36)

- 67 042409

Последовательность ДНК для Fc H8L8 (TSC339):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg840 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtttcct gcaaggcatc tggatacacc900 ttcaccagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 accatgacca gggacacgtc cacgagcaca gtctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:37)

Последовательность Зрелого белка для Fc H8L8 (TSC339):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGASV KVSCKASGYT FTRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TMTRDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS504 (SEQ ID NO:38)

- 68 042409

Последовательность ДНК для Fc H10L6 (TSC340):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg1440 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:39)

Последовательность Зрелого белка для Fc H10L6 (TSC340):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:40)

Последовательность ДНК для Fc H10L7 (TSC341):

- 69 042409 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg aaattgtgtt gacgcagtct1260 ccagccaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aaacctggcc tggcgcccag gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggcatc ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg1440 acagacttca ctctcaccat cagcagactg gagcctgaag attttgcagt gtattactgt1500 cagcagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:41)

Последовательность Зрелого белка для Fc H10L7 (TSC341):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PATLSLSPGE RATLSCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGLAPRRWI YDSSKLASGI PDRFSGSGSG TDFTLTISRL EPEDFAVYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:42)

- 70 042409

Последовательность ДНК для Fc H10L8 (TSC342):

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:43)

Последовательность Зрелого белка для Fc H10L8 (TSC342):

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:44)

- 71 042409

Последовательность ДНК для TSC370:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:45)

Последовательность Зрелого белка для TSC370:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:46)

- 72 042409

Последовательность ДНК для TSC371:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggata960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:47)

Последовательность Зрелого белка для TSC371:

EPKSSDKTHT	СРРСРАРЕАА	GAPSVFLFPP	KPKDTLMISR	TPEVTCVWD	VSHEDPEVKF	60
NWYVDGVEVH	NAKTKPREEQ	YNSTYRWSV	LTVLHQDWLN	GKAYACAVSN	KALPAPIEKT	120
ISKAKGQPRE	PQVYTLPPSR	DELTKNQVSL	TCLVKGFYPS	DIAVEWESNG	QPENNYKTTP	180
PVLDSDGSFF	LYSKLTVDKS	RWQQGNVFSC	SVMHEALHNH	YTQKSLSLSP	GQRHNNSSLN	240
TGTQMAGHSP	NSQVQLVQSG	AEVKKPGSSV	KVSCKASGGT	FSRSTMHWVR	QAPGQGLEWI	300
GYINPSSAYT	NYNQKFKDRV	TITADKSTST	AYMELSSLRS	EDTAVYYCAR	PQVHYDYNGF	360
PYWGQGTLVT	VSSGGGGSGG	GGSGGGGSGG	GGSDIQMTQS	PSTLSASVGD	RVTITCSASS	420
SVSYMNWYQQ	KPGKAPKRWI	YDSSKLASGV	PSRFSGSGSG	TEFTLTISSL	QPDDFATYYC	480
QQWSRNPPTF	GGGTKVEIKR	SSS				503

- 73 042409 (SEQ ID NO:48)

Последовательность ДНК для TSC372:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tgacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagaattca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:49)

Последовательность Зрелого белка для TSC372:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGGT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503

- 74 042409 (SEQ ID NO:50)

Последовательность ДНК для TSC390:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 cctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagagttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:51)

Последовательность Зрелого белка для TSC390:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG PEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503

- 75 042409 (SEQ ID NO:52)

Последовательность ДНК для TSC391:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 cctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggata960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagagttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:53)

Последовательность Зрелого белка для TSC391:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG PEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWI300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTITCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503

- 76 042409 (SEQ ID NO:54)

Последовательность ДНК для TSC392:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 cctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tgacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagagttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:55)

Последовательность Зрелого белка для TSC392:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG PEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWM300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

- 77 042409

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:56)

Последовательность ДНК для TSC393:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggata960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tgacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagagttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:57)

Последовательность Зрелого белка для TSC393:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG AEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWI300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

- 78 042409

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:58)

Последовательность ДНК для TSC394:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg120 ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat360 ggcaaggcat acgcatgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtcagaggc acaacaattc ttccctgaat780 acaggaactc agatggcagg tcattctccg aattctcagg tccagctggt gcaatctggg840 cctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatatacc900 ttcagcagat ctacgatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggata960 ggatacatta atcctagcag tgcttatact aattacaatc agaaattcaa ggacagagtc1020 acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct1080 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ccccaagtcc actatgatta caacgggttt1140 ccttactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga1200 ggtggatccg gcggtggcgg atcgggtggc ggcggatctg acatccagat gacccagtct1260 ccttccaccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tgacttgcag tgccagctca1320 agtgtaagtt acatgaactg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gagatggatt1380 tatgactcat ccaaactggc ttctggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg1440 acagagttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc1500 caacagtgga gtcgtaaccc acccactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg1560 tcctccagct aa1572 (SEQ ID NO:59)

Последовательность Зрелого белка для TSC394:

EPKSSDKTHT СРРСРАРЕАА GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF60

NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKAYACAVSN KALPAPIEKT120

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP180

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GQRHNNSSLN240

TGTQMAGHSP NSQVQLVQSG PEVKKPGSSV KVSCKASGYT FSRSTMHWVR QAPGQGLEWI300

GYINPSSAYT NYNQKFKDRV TITADKSTST AYMELSSLRS EDTAVYYCAR PQVHYDYNGF360

PYWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSTLSASVGD RVTMTCSASS420

SVSYMNWYQQ KPGKAPKRWI YDSSKLASGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPDDFATYYC480

- 79 042409

QQWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS503 (SEQ ID NO:60)

Последовательность ДНК для TSC408:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc120 atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca180 gggaaagttc ctaagctccg catccattct ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct240 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct300 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt420 ggtggctctc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcttca480 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actactacat gcactgggtg540 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat600 actagatacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac gtctatcagc660 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca720 agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc780 tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct840 gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg900 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag960 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg1020 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac1080 tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc1140 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc1200 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc1260 tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag1320 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg1380 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg1440 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtcagaggca caacaattct1500 tccctgaata caggaactca gatggcaggt cattctccga attctcaggt ccagctggtg1560 caatctgggc ctgaggtgaa gaagcctggg tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct1620 ggatatacct tcagcagatc tacgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt1680 gagtggatag gatacattaa tcctagcagt gcttatacta attacaatca gaaattcaag1740 gacagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc1800 ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcgagac cccaagtcca ctatgattac1860 aacgggtttc cttactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt1920 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgggtggcg gcggatctga catccagatg1980 acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgcagt2040 gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag2100 agatggattt atgactcatc caaactggct tctggggtcc catcaaggtt cagcggcagt2160 ggatctggga cagagttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgatga ttttgcaact2220 tattactgcc aacagtggag tcgtaaccca cccactttcg gcggagggac caaggtggag2280 atcaaacggt cctccagcta a2301 (SEQ ID NO:61)

- 80 042409

Последовательность Зрелого белка для TSC408:

DIQMTQSPSA RFSGSGSGTE GGSQVQLVQS TRYAQKFQGR SSSEPKSSDK VKFNWYVDGV EKTISKAKGQ TTPPVLDSDG SLNTGTQMAG EWIGYINPSS NGFPYWGQGT ASSSVSYMNW

MSASVGDRVT FTLTISSLQP GAEVKKPGAS VTMTRDTSIS ТНТСРРСРАР EVHNAKTKPR PREPQVYTLP SFFLYSKLTV HSPNSQVQLV AYTNYNQKFK LVTVSSGGGG YQQKPGKAPK

ITCRASKSIS EDFATYYCQQ VKVSCKASGY TAYMELSSLR EAAGAPSVFL EEQYNSTYRV PSRDELTKNQ DKSRWQQGNV QSGPEVKKPG DRVTITADKS SGGGGSGGGG RWIYDSSKLA

KYLAWFQQKP

HIEYPWTFGQ

TFTDYYMHWV

SDDTAVYYCA

FPPKPKDTLM

VSVLTVLHQD

VSLTCLVKGF

FSCSVMHEAL

SSVKVSCKAS

TSTAYMELSS

SGGGGSDIQM

SGVPSRFSGS

GKVPKLRIHS GTKVEIKRGG RQAPGQGLEW RSDGYYDAMD ISRTPEVTCV WLNGKAYACA YPSDIAVEWE HNHYTQKSLS GYTFSRSTMH LRSEDTAVYY TQSPSTLSAS GSGTEFTLTI

GSTLQSGVPS GGSGGGGSGG MGYFNPYNDY YWGQGTTVTV WDVSHEDPE VSNKALPAPI SNGQPENNYK LSPGQRHNNS WVRQAPGQGL CARPQVHYDY VGDRVTITCS SSLQPDDFAT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

YYCQQWSRNP PTFGGGTKVE IKRSSS (SEQ ID NO:62)

Последовательность ДНК для TSC409:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca gggaaagttc ctaagctccg catccattct ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt ggtggctctc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcttca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actactacat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat actagatacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac gtctatcagc acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg

746

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

- 81 042409 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtcagaggca caacaattct1500 tccctgaata caggaactca gatggcaggt cattctccga attctcaggt ccagctggtg1560 caatctgggc ctgaggtgaa gaagcctggg tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct1620 ggatatacct tcagcagatc tacgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt1680 gagtggatgg gatacattaa tcctagcagt gcttatacta attacaatca gaaattcaag1740 gacagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc1800 ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcgagac cccaagtcca ctatgattac1860 aacgggtttc cttactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt1920 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgggtggcg gcggatctga catccagatg1980 acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat gacttgcagt2040 gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag2100 agatggattt atgactcatc caaactggct tctggggtcc catcaaggtt cagcggcagt2160 ggatctggga cagagttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgatga ttttgcaact2220 tattactgcc aacagtggag tcgtaaccca cccactttcg gcggagggac caaggtggag2280 atcaaacggt cctccagcta a2301 (SEQ ID NO:63)

Последовательность Зрелого белка для TSC409:

DIQMTQSPSA RFSGSGSGTE GGSQVQLVQS TRYAQKFQGR SSSEPKSSDK VKFNWYVDGV EKTISKAKGQ TTPPVLDSDG SLNTGTQMAG EWMGYINPSS NGFPYWGQGT ASSSVSYMNW YYCQQWSRNP

MSASVGDRVT FTLTISSLQP GAEVKKPGAS VTMTRDTSIS ТНТСРРСРАР EVHNAKTKPR PREPQVYTLP SFFLYSKLTV HSPNSQVQLV AYTNYNQKFK LVTVSSGGGG YQQKPGKAPK PTFGGGTKVE

ITCRASKSIS EDFATYYCQQ VKVSCKASGY TAYMELSSLR EAAGAPSVFL EEQYNSTYRV PSRDELTKNQ DKSRWQQGNV QSGPEVKKPG DRVTITADKS SGGGGSGGGG RWIYDSSKLA IKRSSS

KYLAWFQQKP

HIEYPWTFGQ

TFTDYYMHWV

SDDTAVYYCA

FPPKPKDTLM

VSVLTVLHQD

VSLTCLVKGF

FSCSVMHEAL

SSVKVSCKAS

TSTAYMELSS

SGGGGSDIQM

SGVPSRFSGS

GSTLQSGVPS GGSGGGGSGG MGYFNPYNDY YWGQGTTVTV WDVSHEDPE VSNKALPAPI SNGQPENNYK LSPGQRHNNS WVRQAPGQGL CARPQVHYDY VGDRVTMTCS SSLQPDDFAT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

746 (SEQ ID NO:64)

Последовательность ДНК для TSC410:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc gggaaagttc ctaagctccg catccattct cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa gaagattttg caacttatta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggtggctctc aggtccagct ggtacagtct gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac ctgctactct ggctcccaga taccaccggt atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct tttactctca ccatcagcag cctgcagcct catattgaat acccgtggac gttcggccaa ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt ggggctgagg tgaagaagcc tggggcttca acattcactg actactacat gcactgggtg

120

180

240

300

360

420

480

540

- 82 042409 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat600 actagatacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac gtctatcagc660 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca720 agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc780 tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct840 gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg900 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag960 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg1020 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac1080 tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc1140 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc1200 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc1260 tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag1320 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg1380 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg1440 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtcagaggca caacaattct1500 tccctgaata caggaactca gatggcaggt cattctccga attctcaggt ccagctggtg1560 caatctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct1620 ggatatacct tcagcagatc tacgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt1680 gagtggatag gatacattaa tcctagcagt gcttatacta attacaatca gaaattcaag1740 gacagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc1800 ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcgagac cccaagtcca ctatgattac1860 aacgggtttc cttactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt1920 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgggtggcg gcggatctga catccagatg1980 acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat gacttgcagt2040 gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag2100 agatggattt atgactcatc caaactggct tctggggtcc catcaaggtt cagcggcagt2160 ggatctggga cagagttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgatga ttttgcaact2220 tattactgcc aacagtggag tcgtaaccca cccactttcg gcggagggac caaggtggag2280 atcaaacggt cctccagcta a2301 (SEQ ID NO:65)

Последовательность Зрелого белка для TSC410:

DIQMTQSPSA MSASVGDRVT ITCRASKSIS KYLAWFQQKP GKVPKLRIHS GSTLQSGVPS60

RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HIEYPWTFGQ GTKVEIKRGG GGSGGGGSGG120

GGSQVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKASGY TFTDYYMHWV RQAPGQGLEW MGYFNPYNDY180

TRYAQKFQGR VTMTRDTSIS TAYMELSSLR SDDTAVYYCA RSDGYYDAMD YWGQGTTVTV240

SSSEPKSSDK ТНТСРРСРАР EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE300

VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKAYACA VSNKALPAPI360

EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK420

TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGQRHNNS480

SLNTGTQMAG HSPNSQVQLV QSGAEVKKPG SSVKVSCKAS GYTFSRSTMH WVRQAPGQGL540

EWIGYINPSS AYTNYNQKFK DRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARPQVHYDY600

NGFPYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSDIQM TQSPSTLSAS VGDRVTMTCS660

- 83 042409

ASSSVSYMNW YQQKPGKAPK RWIYDSSKLA SGVPSRFSGS GSGTEFTLTI SSLQPDDFAT720

YYCQQWSRNP PTFGGGTKVE IKRSSS746 (SEQ ID NO:66)

Последовательность ДНК для TSC411:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc120 atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca180 gggaaagttc ctaagctccg catccattct ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct240 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct300 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt420 ggtggctctc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcttca480 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actactacat gcactgggtg540 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat600 actagatacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac gtctatcagc660 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca720 agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc780 tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct840 gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg900 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag960 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg1020 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac1080 tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc1140 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc1200 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc1260 tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag1320 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg1380 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg1440 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtcagaggca caacaattct1500 tccctgaata caggaactca gatggcaggt cattctccga attctcaggt ccagctggtg1560 caatctgggc ctgaggtgaa gaagcctggg tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct1620 ggatatacct tcagcagatc tacgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt1680 gagtggatag gatacattaa tcctagcagt gcttatacta attacaatca gaaattcaag1740 gacagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc1800 ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcgagac cccaagtcca ctatgattac1860 aacgggtttc cttactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt1920 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgggtggcg gcggatctga catccagatg1980 acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat gacttgcagt2040 gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag2100 agatggattt atgactcatc caaactggct tctggggtcc catcaaggtt cagcggcagt2160 ggatctggga cagagttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgatga ttttgcaact2220 tattactgcc aacagtggag tcgtaaccca cccactttcg gcggagggac caaggtggag2280 atcaaacggt cctccagcta a2301 (SEQ ID NO:67)

- 84 042409

Последовательность Зрелого белка для TSC411:

DIQMTQSPSA RFSGSGSGTE GGSQVQLVQS TRYAQKFQGR SSSEPKSSDK VKFNWYVDGV EKTISKAKGQ TTPPVLDSDG SLNTGTQMAG EWIGYINPSS NGFPYWGQGT ASSSVSYMNW YYCQQWSRNP

KYLAWFQQKP

HIEYPWTFGQ

TFTDYYMHWV

SDDTAVYYCA

FPPKPKDTLM

VSVLTVLHQD

VSLTCLVKGF

FSCSVMHEAL

SSVKVSCKAS

TSTAYMELSS

SGGGGSDIQM

SGVPSRFSGS

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

746 (SEQ ID NO:68)

Последовательность ДНК для CAS105:

atggaagcac gaggtgcagc tcctgtaagg cccgggaaag aaccggaagt ctgcaatgga ggccctttcg tctggtggcg tctgaaattg accctctcct cctggccagg gccaggttca cctgaagatt caagggacca acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtcaga cagcgcagct tggtgcagtc gctccggtta gcctggagtg tcaagggcca gcagcctgaa actcctgggg gtggctctgg tgttgacaca gccgagcaag ctcctaggct gtggcagtgg ttgcagttta aggtggaaat cgtgcccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ggcacaacaa tctcttcctc tggagcagag ctcattcact gatgggcaat ggtcactatc ggcctcggac ccagggcacc cggaggtgga gtctccagcc tgaaaatgtt cctcatctat ctccgggaca ttactgtcaa caaatcctcg acctgaagcc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatcca caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ttcttccctg ctgctactct gtgaaaaagc ggctacaata attgatcctt tccgccgaca accgccatgt ctggtcactg tccggtggcg accctgtctt tacagctact tttgcaaaaa gacttcactc catcattccg agtgagccca gcgggtgcac cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc aatacaggaa ggctcccaga ccggagagtc tgaactgggt attatggtgg agtccatcag attactgtgc tctcctctgg gcggatctgg tgtctccagg tagcctggta ccttagcaga tcaccatcag ataatccgtg aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg catacgcgtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ctcagatggc taccaccggt tctgaagatt gcgccagatg tactacctac caccgcctac acgctcagtc gggtggaggc cgggggtggc cgaaagagcc ccaacagaaa aggtattcca cagcctagag gacattcggc caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc cgcggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct aggtcattct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

- 85 042409 ccgaattctc aggtccagct ggtggagtct gggggcggag tggtgcagcc tgggcggtca1620 ctgaggctgt cctgcaaggc ttctggctac acctttacta gatctacgat gcactgggta1680 aggcaggccc ctggacaagg tctggaatgg attggataca ttaatcctag cagtgcttat1740 actaattaca atcagaaatt caaggacagg ttcacaatca gcgcagacaa atccaagagc1800 acagccttcc tgcagatgga cagcctgagg cccgaggaca ccggcgtcta tttctgtgca1860 cggccccaag tccactatga ttacaacggg tttccttact ggggccaagg gactcccgtc1920 actgtctcta gcggtggcgg agggtctggg ggtggcggat ccggaggtgg tggctctgca1980 caagacatcc agatgaccca gtctccaagc agcctgtctg caagcgtggg ggacagggtc2040 accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatga actggtacca gcagaagccg2100 ggcaaggccc ccaaaagatg gatttatgac tcatccaaac tggcttctgg agtccctgct2160 cgcttcagtg gcagtgggtc tgggaccgac tataccctca caatcagcag cctgcagccc2220 gaagatttcg ccacttatta ctgccagcag tggagtcgta acccacccac gttcggaggg2280 gggaccaagc tacaaattac atcctccagc taa2313 (SEQ ID NO:69)

Последовательность Зрелого белка для CAS105:

EVQLVQSGAE NRKFKGQVTI SGGGGSGGGG PGQAPRLLIY QGTKVEIKSS DVSHEDPEVK NKALPAPIEK GQPENNYKTT PGQRHNNSSL RQAPGQGLEW RPQVHYDYNG TMTCSASSSV

VKKPGESLKI SADKSISTAY SGGGGSGGGG FAKTLAEGIP SEPKSSDKTH FNWYVDGVEV TISKAKGQPR PPVLDSDGSF NTGTQMAGHS IGYINPSSAY FPYWGQGTPV SYMNWYQQKP

SCKGSGYSFT LQWSSLKASD SEIVLTQSPA ARFSGSGSGT ТСРРСРАРЕА HNAKTKPREE EPQVYTLPPS FLYSKLTVDK PNSQVQLVES TNYNQKFKDR TVSSGGGGSG GKAPKRWIYD

GYNMNWVRQM TAMYYCARSV TLSLSPGERA DFTLTISSLE AGAPSVFLFP QYNSTYRWS RDELTKNQVS SRWQQGNVFS GGGWQPGRS FTISADKSKS GGGSGGGGSA SSKLASGVPA

PGKGLEWMGN GPFDSWGQGT TLSCRASENV PEDFAVYYCQ PKPKDTLMIS VLTVLHQDWL LTCLVKGFYP CSVMHEALHN LRLSCKASGY TAFLQMDSLR QDIQMTQSPS RFSGSGSGTD

IDPYYGGTTY

LVTVSSGGGG

YSYLAWYQQK

HHSDNPWTFG

RTPEVTCVW

NGKAYACAVS

SDIAVEWESN

HYTQKSLSLS

TFTRSTMHWV

PEDTGVYFCA

SLSASVGDRV

YTLTISSLQP

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

EDFATYYCQQ WSRNPPTFGG GTKLQITSSS

750 (SEQ ID NO:70)

Последовательность ДНК для анти-СП37 X TSC445:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggagagtc tctgaagatt tcctgtaagg gctccggtta ctcattcact ggctacaata tgaactgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatgggcaat attgatcctt attatggtgg tactacctac aaccggaagt tcaagggcca ggtcactatc tccgccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcaatgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc acgctcagtc ggccctttcg actcctgggg ccagggcacc ctggtcactg tctcctctgg gggtggaggc tctggtggcg gtggctctgg cggaggtgga tccggtggcg gcggatctgg cgggggtggc tctgaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg cgaaagagcc

120

180

240

300

360

420

480

540

- 86 042409 accctctcct gccgagcaag tgaaaatgtt tacagctact tagcctggta ccaacagaaa600 cctggccagg ctcctaggct cctcatctat tttgcaaaaa ccttagcaga aggtattcca660 gccaggttca gtggcagtgg ctccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctagag720 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcaa catcattccg ataatccgtg gacattcggc780 caagggacca aggtggaaat caaatcctcg agtgagccca aatcttctga caaaactcac840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcgggtgcac cgtcagtctt cctcttcccc900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg catacgcgtg cgcggtctcc1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc1260 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1500 ccgggtcaga ggcacaacaa ttcttccctg aatacaggaa ctcagatggc aggtcattct1560 ccgaattctc aggtccagct ggtgcaatct gggcctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg1620 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatat accttcagca gatctacgat gcactgggtg1680 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg ataggataca ttaatcctag cagtgcttat1740 actaattaca atcagaaatt caaggacaga gtcacgatta ccgcggacaa atccacgagc1800 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg1860 agaccccaag tccactatga ttacaacggg tttccttact ggggccaagg aaccctggtc1920 accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggat ccggcggtgg cggatcgggt1980 ggcggcggat ctgacatcca gatgacccag tctccttcca ccctgtctgc atctgtagga2040 gacagagtca ccatgacttg cagtgccagc tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtatcag2100 cagaaaccag ggaaagcccc taagagatgg atttatgact catccaaact ggcttctggg2160 gtcccatcaa ggttcagcgg cagtggatct gggacagagt tcactctcac catcagcagc2220 ctgcagcctg atgattttgc aacttattac tgccaacagt ggagtcgtaa cccacccact2280 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa cggtcctcca gctaa2325 (SEQ ID NO:71)

Последовательность Зрелого белка для анти-СВ37 X TSC445:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS480

PGQRHNNSSL NTGTQMAGHS PNSQVQLVQS GPEVKKPGSS VKVSCKASGY TFSRSTMHWV540

RQAPGQGLEW IGYINPSSAY TNYNQKFKDR VTITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA600

RPQVHYDYNG FPYWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSTLSASVG660

- 87 042409

DRVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKPGKAPKRW IYDSSKLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS

720

LQPDDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKVEIK RSSS

754 (SEQ ID NO:72)

Последовательность ДНК для анти-СП37 X TSC452:

atggaagcac gaggtgcagc tcctgtaagg cccgggaaag aaccggaagt ctgcaatgga ggccctttcg tctggtggcg tctgaaattg accctctcct cctggccagg gccaggttca cctgaagatt caagggacca acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtcaga ccgaattctc ctgaggctgt aggcaggccc actaattaca acagccttcc cggccccaag actgtctcta ggcggcggat gacagagtca cagaaaccag gtcccatcaa ctgcagcctg ttcggcggag cagcgcagct tggtgcagtc gctccggtta gcctggagtg tcaagggcca gcagcctgaa actcctgggg gtggctctgg tgttgacaca gccgagcaag ctcctaggct gtggcagtgg ttgcagttta aggtggaaat cgtgcccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ggcacaacaa aggtccagct cctgcaaggc ctggacaagg atcagaaatt tgcagatgga tccactatga gcggtggcgg ctgacatcca ccatgacttg ggaaagcccc ggttcagcgg atgattttgc ggaccaaggt tctcttcctc tggagcagag ctcattcact gatgggcaat ggtcactatc ggcctcggac ccagggcacc cggaggtgga gtctccagcc tgaaaatgtt cctcatctat ctccgggaca ttactgtcaa caaatcctcg acctgaagcc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatcca caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ttcttccctg ggtggagtct ttctggctac tctggaatgg caaggacagg cagcctgagg ttacaacggg agggtctggg gatgacccag cagtgccagc taagagatgg cagtggatct aacttattac ggagatcaaa ctgctactct gtgaaaaagc ggctacaata attgatcctt tccgccgaca accgccatgt ctggtcactg tccggtggcg accctgtctt tacagctact tttgcaaaaa gacttcactc catcattccg agtgagccca gcgggtgcac cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc aatacaggaa gggggcggag acctttacta attggataca ttcacaatca cccgaggaca tttccttact ggtggcggat tctccttcca tcaagtgtaa atttatgact gggacagagt tgccaacagt cggtcctcca ggctcccaga ccggagagtc tgaactgggt attatggtgg agtccatcag attactgtgc tctcctctgg gcggatctgg tgtctccagg tagcctggta ccttagcaga tcaccatcag ataatccgtg aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg catacgcgtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ctcagatggc tggtgcagcc gatctacgat ttaatcctag gcgcagacaa ccggcgtcta ggggccaagg ccggcggtgg ccctgtctgc gttacatgaa catccaaact tcactctcac ggagtcgtaa gctaa taccaccggt tctgaagatt gcgccagatg tactacctac caccgcctac acgctcagtc gggtggaggc cgggggtggc cgaaagagcc ccaacagaaa aggtattcca cagcctagag gacattcggc caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc cgcggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct aggtcattct tgggcggtca gcactgggta cagtgcttat atccaagagc tttctgtgca gactcccgtc cggatcgggt atctgtagga ctggtatcag ggcttctggg catcagcagc cccacccact

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2325

- 88 042409 (SEQ ID NO:73)

Последовательность Зрелого белка для анти-СВ37 X TSC452:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS480

PGQRHNNSSL NTGTQMAGHS PNSQVQLVES GGGWQPGRS LRLSCKASGY TFTRSTMHWV540

RQAPGQGLEW IGYINPSSAY TNYNQKFKDR FTISADKSKS TAFLQMDSLR PEDTGVYFCA600

RPQVHYDYNG FPYWGQGTPV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSTLSASVG660

DRVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKPGKAPKRW IYDSSKLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS720

LQPDDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKVEIK RSSS754 (SEQ ID NO:74)

Последовательность ДНК для анти-СП37 X TSC453:

atggaagcac gaggtgcagc tcctgtaagg cccgggaaag aaccggaagt ctgcaatgga ggccctttcg tctggtggcg tctgaaattg accctctcct cctggccagg gccaggttca cctgaagatt caagggacca acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg cagcgcagct tggtgcagtc gctccggtta gcctggagtg tcaagggcca gcagcctgaa actcctgggg gtggctctgg tgttgacaca gccgagcaag ctcctaggct gtggcagtgg ttgcagttta aggtggaaat cgtgcccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta tctcttcctc tggagcagag ctcattcact gatgggcaat ggtcactatc ggcctcggac ccagggcacc cggaggtgga gtctccagcc tgaaaatgtt cctcatctat ctccgggaca ttactgtcaa caaatcctcg acctgaagcc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatcca caagaccacg ctgctactct gtgaaaaagc ggctacaata attgatcctt tccgccgaca accgccatgt ctggtcactg tccggtggcg accctgtctt tacagctact tttgcaaaaa gacttcactc catcattccg agtgagccca gcgggtgcac cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc ggctcccaga ccggagagtc tgaactgggt attatggtgg agtccatcag attactgtgc tctcctctgg gcggatctgg tgtctccagg tagcctggta ccttagcaga tcaccatcag ataatccgtg aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg catacgcgtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga taccaccggt tctgaagatt gcgccagatg tactacctac caccgcctac acgctcagtc gggtggaggc cgggggtggc cgaaagagcc ccaacagaaa aggtattcca cagcctagag gacattcggc caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc cgcggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

- 89 042409

ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1440
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1500
ccgggtcaga	ggcacaacaa	ttcttccctg	aatacaggaa	ctcagatggc	aggtcattct	1560
ccgaattctc	aggtccagct	ggtgcaatct	gggcctgagg	tgaagaagcc	tgggtcctcg	1620
gtgaaggtct	cctgcaaggc	ttctggatat	accttcagca	gatctacgat	gcactgggtg	1680
cgacaggccc	ctggacaagg	gcttgagtgg	ataggataca	ttaatcctag	cagtgcttat	1740
actaattaca	atcagaaatt	caaggacaga	gtcacgatta	ccgcggacaa	atccacgagc	1800
acagcctaca	tggagctgag	cagcctgaga	tctgaggaca	cggccgtgta	ttactgtgcg	1860
agaccccaag	tccactatga	ttacaacggg	tttccttact	ggggccaagg	aaccctggtc	1920
accgtctcct	caggtggagg	cggttcaggc	ggaggtggat	ccggaggtgg	tggctctggt	1980
ggcggcggat	ctgacatcca	gatgacccag	tctccaagca	gcctgtctgc	aagcgtgggg	2040
gacagggtca	ccatgacctg	cagtgccagc	tcaagtgtaa	gttacatgaa	ctggtaccag	2100
cagaagccgg	gcaaggcccc	caaaagatgg	atttatgact	catccaaact	ggcttctgga	2160
gtccctgctc	gcttcagtgg	cagtgggtct	gggaccgact	ataccctcac	aatcagcagc	2220
ctgcagcccg	aagatttcgc	cacttattac	tgccagcagt	ggagtcgtaa	cccacccacg	2280
ttcggagggg	ggaccaagct	acaaattaca	tcctccagct	aa		2322

(SEQ ID NO:75)

Последовательность Зрелого белка для анти-СВ37 X TSC453:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS480

PGQRHNNSSL NTGTQMAGHS PNSQVQLVQS GPEVKKPGSS VKVSCKASGY TFSRSTMHWV540

RQAPGQGLEW IGYINPSSAY TNYNQKFKDR VTITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA600

RPQVHYDYNG FPYWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG660

DRVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKPGKAPKRW IYDSSKLASG VPARFSGSGS GTDYTLTISS720

LQPEDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKLQIT SSS753 (SEQ ID NO:76)

Последовательность ДНК для анти-СП37 X TSC454:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag tcctgtaagg gctccggtta ctcattcact cccgggaaag gcctggagtg gatgggcaat aaccggaagt tcaagggcca ggtcactatc ctgcaatgga gcagcctgaa ggcctcggac ctgctactct ggctcccaga taccaccggt gtgaaaaagc ccggagagtc tctgaagatt ggctacaata tgaactgggt gcgccagatg attgatcctt attatggtgg tactacctac tccgccgaca agtccatcag caccgcctac accgccatgt attactgtgc acgctcagtc

120

180

240

300

360

- 90 042409 ggccctttcg actcctgggg ccagggcacc ctggtcactg tctcctctgg gggtggaggc420 tctggtggcg gtggctctgg cggaggtgga tccggtggcg gcggatctgg cgggggtggc480 tctgaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg cgaaagagcc540 accctctcct gccgagcaag tgaaaatgtt tacagctact tagcctggta ccaacagaaa600 cctggccagg ctcctaggct cctcatctat tttgcaaaaa ccttagcaga aggtattcca660 gccaggttca gtggcagtgg ctccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctagag720 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcaa catcattccg ataatccgtg gacattcggc780 caagggacca aggtggaaat caaatcctcg agtgagccca aatcttctga caaaactcac840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcgggtgcac cgtcagtctt cctcttcccc900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg catacgcgtg cgcggtctcc1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc1260 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1500 ccgggtcaga ggcacaacaa ttcttccctg aatacaggaa ctcagatggc aggtcattct1560 ccgaattctc aggtccagct ggtgcaatct gggcctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg1620 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatat accttcagca gatctacgat gcactgggtg1680 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg ataggataca ttaatcctag cagtgcttat1740 actaattaca atcagaaatt caaggacaga gtcacgatta ccgcggacaa atccacgagc1800 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg1860 agaccccaag tccactatga ttacaacggg tttccttact ggggccaagg aaccctggtc1920 accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggat ccggcggtgg cggatcgggt1980 ggcggcggat ctgacatcca gatgacccag tctccttcca ccctgtctgc atctgtagga2040 gacagagtca ccatgacttg cagtgccagc tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtatcag2100 cagaaaccag ggaaagcccc taagagatgg atttatgact catccaaact ggcttctggg2160 gtcccatcaa ggttcagcgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagc2220 ctgcagcctg atgattttgc aacttattac tgccaacagt ggagtcgtaa cccacccact2280 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa cggtcctcca gctaa2325 (SEQ ID NO:77)

Последовательность Зрелого белка для анти-СВ37 X TSC454:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

- 91 042409

GQPENNYKTT

PGQRHNNSSL

RQAPGQGLEW

RPQVHYDYNG

DRVTMTCSAS

PPVLDSDGSF

NTGTQMAGHS

IGYINPSSAY

FPYWGQGTLV

SSVSYMNWYQ

FLYSKLTVDK

PNSQVQLVQS

TNYNQKFKDR

TVSSGGGGSG

QKPGKAPKRW

SRWQQGNVFS

GPEVKKPGSS

VTITADKSTS

GGGSGGGGSG

IYDSSKLASG

CSVMHEALHN

VKVSCKASGY

TAYMELSSLR

GGGSDIQMTQ

VPSRFSGSGS

HYTQKSLSLS

TFSRSTMHWV

SEDTAVYYCA

SPSTLSASVG

GTDFTLTISS

480

540

600

660

720

LQPDDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKVEIK RSSS

754 (SEQ ID NO:78)

Последовательность ДНК для анти-СП37 X TSC455:

atggaagcac gaggtgcagc tcctgtaagg cccgggaaag aaccggaagt ctgcaatgga ggccctttcg tctggtggcg tctgaaattg accctctcct cctggccagg gccaggttca cctgaagatt caagggacca acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtcaga ccgaattctc gtgaaggtct cgacaggccc actaattaca acagcctaca agaccccaag accgtctcct ggcggcggat gacagagtca cagaaaccag cagcgcagct tggtgcagtc gctccggtta gcctggagtg tcaagggcca gcagcctgaa actcctgggg gtggctctgg tgttgacaca gccgagcaag ctcctaggct gtggcagtgg ttgcagttta aggtggaaat cgtgcccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ggcacaacaa aggtccagct cctgcaaggc ctggacaagg atcagaaatt tggagctgag tccactatga caggtggagg ctgacatcca ccatgacttg ggaaagcccc tctcttcctc tggagcagag ctcattcact gatgggcaat ggtcactatc ggcctcggac ccagggcacc cggaggtgga gtctccagcc tgaaaatgtt cctcatctat ctccgggaca ttactgtcaa caaatcctcg acctgaagcc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatcca caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ttcttccctg ggtgcaatct ttctggatat gcttgagtgg caaggacaga cagcctgaga ttacaacggg cggttcaggc gatgacccag cagtgccagc taagagatgg ctgctactct gtgaaaaagc ggctacaata attgatcctt tccgccgaca accgccatgt ctggtcactg tccggtggcg accctgtctt tacagctact tttgcaaaaa gacttcactc catcattccg agtgagccca gcgggtgcac cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc aatacaggaa gggcctgagg accttcagca ataggataca gtcacgatta tctgaggaca tttccttact ggaggtggat tctccttcca tcaagtgtaa atttatgact ggctcccaga ccggagagtc tgaactgggt attatggtgg agtccatcag attactgtgc tctcctctgg gcggatctgg tgtctccagg tagcctggta ccttagcaga tcaccatcag ataatccgtg aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg catacgcgtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ctcagatggc tgaagaagcc gatctacgat ttaatcctag ccgcggacaa cggccgtgta ggggccaagg ccggcggtgg ccctgtctgc gttacatgaa catccaaact taccaccggt tctgaagatt gcgccagatg tactacctac caccgcctac acgctcagtc gggtggaggc cgggggtggc cgaaagagcc ccaacagaaa aggtattcca cagcctagag gacattcggc caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc cgcggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct aggtcattct tgggtcctcg gcactgggtg cagtgcttat atccacgagc ttactgtgcg aaccctggtc cggatcgggt atctgtagga ctggtatcag ggcttctggg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

- 92 042409

gtcccatcaa	ggttcagcgg	cagtggatct	gggacagagt	atactctcac	catcagcagc	2220
ctgcagcctg	atgattttgc	aacttattac	tgccaacagt	ggagtcgtaa	cccacccact	2280
ttcggcggag	ggaccaaggt	ggagatcaaa	cggtcctcca	gctaa		2325

(SEQ ID NO:79)

Последовательность Зрелого белка для анти-СВ37 X TSC455:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS480

PGQRHNNSSL NTGTQMAGHS PNSQVQLVQS GPEVKKPGSS VKVSCKASGY TFSRSTMHWV540

RQAPGQGLEW IGYINPSSAY TNYNQKFKDR VTITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA600

RPQVHYDYNG FPYWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSTLSASVG660

DRVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKPGKAPKRW IYDSSKLASG VPSRFSGSGS GTEYTLTISS720

LQPDDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKVEIK RSSS754 (SEQ ID NO:80)

Последовательность ДНК для анти-СО37 X TSC456:

atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt60 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggagagtc tctgaagatt120 tcctgtaagg gctccggtta ctcattcact ggctacaata tgaactgggt gcgccagatg180 cccgggaaag gcctggagtg gatgggcaat attgatcctt attatggtgg tactacctac240 aaccggaagt tcaagggcca ggtcactatc tccgccgaca agtccatcag caccgcctac300 ctgcaatgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc acgctcagtc360 ggccctttcg actcctgggg ccagggcacc ctggtcactg tctcctctgg gggtggaggc420 tctggtggcg gtggctctgg cggaggtgga tccggtggcg gcggatctgg cgggggtggc480 tctgaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg cgaaagagcc540 accctctcct gccgagcaag tgaaaatgtt tacagctact tagcctggta ccaacagaaa600 cctggccagg ctcctaggct cctcatctat tttgcaaaaa ccttagcaga aggtattcca660 gccaggttca gtggcagtgg ctccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctagag720 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcaa catcattccg ataatccgtg gacattcggc780 caagggacca aggtggaaat caaatcctcg agtgagccca aatcttctga caaaactcac840 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcgggtgcac cgtcagtctt cctcttcccc900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg catacgcgtg cgcggtctcc1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc1260

- 93 042409 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1380 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca1440 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1500 ccgggtcaga ggcacaacaa ttcttccctg aatacaggaa ctcagatggc aggtcattct1560 ccgaattctc aggtccagct ggtgcaatct gggcctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg1620 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatat accttcagca gatctacgat gcactgggtg1680 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg ataggataca ttaatcctag cagtgcttat1740 actaattaca atcagaaatt caaggacaga gtcacgatta ccgcggacaa atccacgagc1800 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg1860 agaccccaag tccactatga ttacaacggg tttccttact ggggccaagg aaccctggtc1920 accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggat ccggcggtgg cggatcgggt1980 ggcggcggat ctgacatcca gatgacccag tctccttcca ccctgtctgc atctgtagga2040 gacagagtca ccatgacttg cagtgccagc tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtatcag2100 cagaaaccag ggaaagcccc taagagatgg atttatgact catccaaact ggcttctggg2160 gtcccatcaa ggttcagcgg cagtggatct gggacagatt atactctcac catcagcagc2220 ctgcagcctg atgattttgc aacttattac tgccaacagt ggagtcgtaa cccacccact2280 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa cggtcctcca gctaa2325 (SEQ ID NO:81)

Последовательность зрелого белка для анти-СО37 X TSC456:

EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT GYNMNWVRQM PGKGLEWMGN IDPYYGGTTY60

NRKFKGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARSV GPFDSWGQGT LVTVSSGGGG120

SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SEIVLTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASENV YSYLAWYQQK180

PGQAPRLLIY FAKTLAEGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ HHSDNPWTFG240

QGTKVEIKSS SEPKSSDKTH ТСРРСРАРЕА AGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW300

DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKAYACAVS360

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN420

GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS480

PGQRHNNSSL NTGTQMAGHS PNSQVQLVQS GPEVKKPGSS VKVSCKASGY TFSRSTMHWV540

RQAPGQGLEW IGYINPSSAY TNYNQKFKDR VTITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA600

RPQVHYDYNG FPYWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSTLSASVG660

DRVTMTCSAS SSVSYMNWYQ QKPGKAPKRW IYDSSKLASG VPSRFSGSGS GTDYTLTISS720

LQPDDFATYY CQQWSRNPPT FGGGTKVEIK RSSS754 (SEQ ID NO:82)

Белковая последовательность для TSC455 анти-СОЗ scFv

QVQLVQSGPEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVTITADK STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQS PSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDD FAT YYCQQWSRNPPT FGGGT KVEIKRS S S

- 94 042409 (SEQ ID NO:83)

Белковая последовательность для TSC456 анти-СОЗ scFv

QVQLVQSGPEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVTITADK STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQS PSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDD FAT YYCQQWSRNPPT FGGGT KVEIKRS S S (SEQ ID NO:84)

Белковая последовательность для DRA222 анти-СБЗ scFv

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCKASGYTFTRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRFTISADK SKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARPQVHYDYNGFPYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAQDIQMTQSPSS LSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAT YYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITSSS (SEQ ID NO:85)

Белковая последовательность для вариабельного тяжелого домена TSC455 и TSC456

QVQLVQSGPEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVTITADK STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:86)

Белковая последовательность для вариабельного тяжелого домена DRA222

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCKASGYTFTRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRFTISADK SKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARPQVHYDYNGFPYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO:87)

Белковая последовательность для вариабельного легкого домена TSC455

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTI SSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIKRS (SEQ ID NO:88)

Белковая последовательность для вариабельного легкого домена TSC456

- 95 042409

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTI SSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIKRS (SEQ ID NO:89)

Белковая последовательность для вариабельного легкого домена DRA222

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTI SSLQPEDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITS (SEQ ID NO:90)

Cris7 и DRA222 VH CDR1 (Kabat) RSTMH (SEQ ID NO:91)

Cris7 и DRA222 VH CDR2 (Kabat) YINPSSAYTNYNQKFK (SEQ ID NO:92)

Cris7 и DRA222 VH CDR3 (Kabat) QVHYDYNGFPY (SEQ ID NO:93)

Cris7 и DRA222 VL CDR1 (Kabat) SASSSVSYMN (SEQ ID NO:94)

Cris7 и DRA222 VL CDR2 (Kabat) DSSKLAS (SEQ ID NO:95)

Cris7 и DRA222 VL CDR3 (Kabat) QQWSRNPPT (SEQ ID NO:96)

Cris7 и DRA222 VH CDR1 (IMGT) GYTFTRST (SEQ ID NO: 199)

Cris7 и DRA222 VH CDR2 (IMGT) INPSSAYT (SEQ ID N0:200)

Cris7 и DRA222 VH CDR3 (IMGT) ARPQVHYDYNGFPY (SEQ ID NO:201)

Cris7 и DRA222 VL CDR1 (IMGT) ASSSVSY (SEQ ID NO:202)

Cris7 и DRA222 VL CDR2 (IMGT) DSS (SEQ ID NO:203)

Cris7 и DRA222 VL CDR3 (IMGT) QQWSRNPPT (SEQ ID NO:204)

Последовательность ДНК для ROR133:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactacggcgacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca

- 96 042409 aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO:97)

Последовательность зрелого белка для ROR133:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyygdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytf trstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO:98)

Последовательность ДНК для ROR193:

- 97 042409 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactacggcgacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagagtatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO:99)

Последовательность зрелого белка для ROR193:

Diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyygdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgy

- 98 042409 tfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqg tlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvp srfsgsgsgteytltisslqpddfatyycqqwsmpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 100)

Последовательность ДНК для ROR134:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggcggctccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gccgactcggtgaagggccggttcaccatctcccggcactcctccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggac accgccgtgtacttctgcgcccggggctactccacctactacggcgacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO: 101)

- 99 042409

Последовательность зрелого белка для ROR134:

Diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctasgsdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyadsvkgrftisrhsskntlylqmnslraedtavyfcargystyygdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytft rstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO: 102)

Последовательность ДНК для ROR189:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggcggctccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gccgactcggtgaagggccggttcaccatctcccggcactcctccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggac accgccgtgtacttctgcgcccggggctactccacctactacggcgacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat

- 100 042409 acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO: 103)

Последовательность зрелого белка для ROR189:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctasgsdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyadsvkgrftisrhsskntlylqmnslraedtavyfcargystyygdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgyt fsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqgt Ivtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvps rfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsmpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 104)

Последовательность ДНК для ROR154:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg

- 101 042409 tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO: 105)

Последовательность зрелого белка для ROR154:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytf trstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO: 106)

Последовательность ДНК для ROR185:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct

- 102 042409 gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO: 107)

Последовательность зрелого белка для ROR185:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgy tfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqg tlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvp srfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 108)

- 103 042409

Последовательность ДНК для ROR179:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctactggacctccttcgg cggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatctg aggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatcaac gactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtacgc ctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggacac cgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcgagt gagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaa aacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgt cctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO: 109)

Последовательность зрелого белка для ROR179:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsywtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytf trstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO: 110)

- 104 042409

Последовательность ДНК для ROR186:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctactggacctccttcgg cggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatctg aggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatcaac gactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtacgc ctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggacac cgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcgagt gagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaa aacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgt cctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO:111)

Последовательность зрелого белка для ROR186:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsywtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgkglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly

- 105 042409 skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgy tfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqg tlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvp srfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 112)

Последовательность ДНК для ROR181:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggcggctccctgcggctgtcctgcaccgtgtccggcaccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gccgactcggtgaagggccggttcaccatctcccggcactcctccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggac accgccgtgtacttctgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO: 113)

- 106 042409

Последовательность зрелого белка для ROR181:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgtdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyadsvkgrftisrhsskntlylqmnslraedtavyfcargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytft rstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytlti s si qpedfatyy c qqwsmpptfgggtkl qi ts ss (SEQ ID NO: 114)

Последовательность ДНК для ROR191:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggcggctccctgcggctgtcctgcaccgtgtccggcaccgacatca acgactaccccatctcctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gccgactcggtgaagggccggttcaccatctcccggcactcctccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggac accgccgtgtacttctgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg

- 107 042409 ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO: 115)

Последовательность зрелого белка для ROR191:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgkppklliyrasnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvsgtdindypiswvrqapgkglewi gfinsggstwyadsvkgrftisrhsskntlylqmnslraedtavyfcargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgyt fsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqgt Ivtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvps rfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsmpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 116)

Последовательность ДНК для ROR182:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc cagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgcccgaccggttctccggctccggctccggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttc ggcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatc tgaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa

- 108 042409 ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagctaa (SEQ ID NO: 117)

Последовательность зрелого белка для ROR182:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgqppklliyrasnlasgvpdrfsgsgsgtdftltissleaedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgqglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytf trstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO: 118)

Последовательность ДНК для ROR192:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc cagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgcccgaccggttctccggctccggctccggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttc ggcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatc

- 109 042409 tgaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagctaa (SEQ ID NO: 119)

Последовательность зрелого белка для ROR192:

diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgqppklliyrasnlasgvpdrfsgsgsgtdftltissleaedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgqglewi gfinsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgy tfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqg tlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvp srfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 120)

- 110 042409

Химерное биспецифическое анти-СП123 (VLVH) х анти-СПЗ (TSC456) scFv-Fc-scFv Dimmsqspsslavsvgekftmtckssqslffgstqknylawyqqkpgqspklliywastresgvpdrftgsgsgtdftlaissvmped lavyycqqyynypwtfgggtkleikggggsggggsggggsggggsvqlqesgpglvkpsqslsltcsvtdysitsgyywnwirqfp gnklewmgyisydgsnnynpslknrisitrdtsknqfflklssvttedtatyycsrgegfyfdswgqgttltvsssepkssdkthtcppcp apeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlng keykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsff lyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckas gytfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywg qgtlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasg vpsrfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 197)

Химерное биспецифическое анти-СП123 (VHVL) x анти-СОЗ (TSC456) scFv-Fc-scFv Vqlqesgpglvkpsqslsltcsvtdysitsgyywnwirqfpgnklewmgyisydgsnnynpslknrisitrdtsknqfflklssvttedt atyycsrgegfyfdswgqgttltvssggggsggggsggggsggggsdimmsqspsslavsvgekftmtckssqslffgstqknylaw yqqkpgqspklliywastresgvpdrftgsgsgtdftlaissvmpedlavyycqqyynypwtfgggtkleiksssepkssdkthtcppc papeaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwln gkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspgsqvqlvqsgpevkkpgssvkvscka sgytfsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpyw gqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklas gvpsrfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrsss (SEQ ID NO: 198)

Последовательность ДНК для TSC471:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgatatccagatgacccagtctccatccgccatg tctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtaagagcattagcaaatatttagcctggtttcagcagaaaccagggaa agttcctaagctccgcatccattctggatctactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagaatttactctca ccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcatattgaatacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg gaaatcaaacgaggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctcaggtccagctggtacagtctggggctgagg tgaagaagcctggggcttcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacacattcactgactactacatgcactgggtgcgacaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatattttaatccttataatgattatactagatacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagg gacacgtctatcagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcaagatcggatggttacta cgatgctatggactactggggtcaaggaaccacagtcaccgtctcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgt gcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaga caaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga

- 111 042409 atacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcg ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctaca gcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc agaagagcctctccctgtctccgggttccggaggtggcggttcgggaggtggcgggtcaggaggtgggggctctccttcacaggtgcag ctggtgcagtctggtcctgaggtgaaaaagcctggctccagcgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggatacacctttagccggtccacca tgcattgggtgaggcaggctcctggacagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagcagcgcttataccaactacaatcagaagtt taaggaccgggtgaccatcaccgccgataagtccaccagcaccgcctacatggagctgtccagcctgaggagcgaggataccgccgtgt actattgcgcccggccccaggtccattacgactacaacggcttcccctattggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagcggtggcg gtggcagcggcggcggcggctctggcggaggtggcagcggcggagggggctccgacattcagatgacccagtccccctccaccctgt ccgctagcgtgggcgatcgggtgaccatgacctgcagcgccagcagctccgtgtcctacatgaactggtaccagcagaagcccggcaag gctcccaagaggtggatttacgactccagcaagctggcctctggtgtccccagcaggttctctggtagcggcagcggcacagactacacc ctgaccatctcctccctgcagcccgacgatttcgccacctactattgccagcagtggtcccggaatccccctacctttggcggcggcaccaa ggtggagatcaagaggagctaa (SEQ ID NO :205)

Последовательность зрелого белка для TSC471:

Diqmtqspsamsasvgdrvtitcrasksiskylawfqqkpgkvpklrihsgstlqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqh ieypwtfgqgtkveikrggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyymhwvrqapgqglewmgyf npyndytryaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsslrsddtavyycarsdgyydamdywgqgttvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgytf srstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqgtl vtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvpsr fsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsrnpptfgggtkveikrs (SEQ ID NO:206)

Последовательность ДНК для ROR243:

atggaggctcccgctcagctgctgttcctcctgctgctctggctgcccgacaccacaggcgacatccagatgacccagtccccttcctccct gtccgctagcgtgggcgatagggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccattgactccaatctggcctggttccagcagaagcccgg acagccccccaagctgctgatttacagggcctccaacctggcttccggcgtgcctgacaggttctccggatccggcagcggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggatgtcgccacctactactgtctgggcggcgtgggcgctgtgagctatcggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggaggctccggcggcggcggc agcgaggtgcagctggtggaaagcggaggaggcctggtgcagcctggaaggtccctgaggctgtcctgcacagccagcggctccgac atcaacgactaccccatcacctgggtgaggcaggctcctggccagggcctggaatggatcggctttatcaacagcggcggcagcacctg

- 112 042409 gtatgcttcctgggtgaagggccggttcaccattagcagggacgactccaagtccattgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgag gacaccgccgtgtactactgcgccaggggctacagcacctattaccgggactttaacatctggggccagggcacactggtcaccgtgtcct cgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccc cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtca agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccag gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaa gaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttccggaggagggggttcag gtgggggaggttctggcggcgggggaagcccttcacaggtgcaactggtgcagagtggacccgaggttaaaaaaccagggtcctccgtt aaggttagctgcaaagcctctggctacacattttccaggagtacaatgcactgggtgaggcaggctcctggacagggactcgagtggatcg ggtatatcaacccatctagcgcctataccaattacaaccaaaagtttaaggaccgagttaccattaccgctgacaaatccaccagtacagctta tatggagctgtcatctcttaggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcactatgactataatggttttccctactggggt cagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtggaggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtggcagtggcggcggaggctctg atattcagatgactcagtctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtcttacat gaattggtatcagcagaagcccgggaaagcacctaagcgctggatctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccctcacggttctctg gctcaggttctggtactgactatactttgactatctcctccctccagcccgatgatttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaacccac ccactttcggaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtcatga (SEQ ID NO:207)

Последовательность зрелого белка для ROR243:

Diqmtqspsslsasvgdrvtincqasqsidsnlawfqqkpgqppklliyrasnlasgvpdrfsgsgsgtdftltissleaedvatyyclgg vgavsyrtsfgggtkveikggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpgrslrlsctasgsdindypitwvrqapgqglewi gfmsggstwyaswvkgrftisrddsksiaylqmnslktedtavyycargystyyrdfniwgqgtlvtvsssepkssdkthtcppcpap eaagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngke ykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffly skltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgsggggsggggsggggspsqvqlvqsgpevkkpgssvkvsckasgyt fsrstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarpqvhydyngfpywgqgt Ivtvssggggsggggsggggsggggsdiqmtqspstlsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvps rfsgsgsgtdytltisslqpddfatyycqqwsmpptfgggtkveikrs (SEQ ID NO:208)

Последовательность ДНК для TSC266:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgatatccagatgacccagtctccatccgccatg tctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtaagagcattagcaaatatttagcctggtttcagcagaaaccagggaa agttcctaagctccgcatccattctggatctactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagaatttactctca

- 113 042409 ccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcatattgaatacccgtggacgttcggccaagggaccaaggtg gaaatcaaacgaggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctcaggtccagctggtacagtctggggctgagg tgaagaagcctggggcttcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacacattcactgactactacatgcactgggtgcgacaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatattttaatccttataatgattatactagatacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagg gacacgtctatcagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcaagatcggatggttacta cgatgctatggactactggggtcaaggaaccacagtcaccgtctcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgt gcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaga caaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggc gtacgcgtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcg ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctaca gcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc agaagagcctctccctgtctccgggtcagaggcacaacaattcttccctgaatacaggaactcagatggcaggtcattctccgaattctcagg tccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactgaggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatct acgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattggatacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaa ttcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttcctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgt ctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactggggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcgg agggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatccagatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgg gggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaaga tggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagc ctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacccacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacat cctccagctaa (SEQ ID NO:209)

Белковая последовательность для TSC266:

Diqmtqspsamsasvgdrvtitcrasksiskylawfqqkpgkvpklrihsgstlqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqh ieypwtfgqgtkveikrggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyymhwvrqapgqglewmgyf npyndytryaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsslrsddtavyycarsdgyydamdywgqgttvtvsssepkssdkthtcppcpape aagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkay acavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgqrhnnsslntgtqmaghspnsqvqlvesgggvvqpgrslrlsckasgytf trstmhwvrqapgqglewigyinpssaytnynqkfkdrftisadkskstaflqmdslrpedtgvyfcarpqvhydyngfpywgqgtp vtvssggggsggggsggggsaqdiqmtqspsslsasvgdrvtmtcsasssvsymnwyqqkpgkapkrwiydssklasgvparfsg sgsgtdytltisslqpedfatyycqqwsmpptfgggtklqitsss (SEQ ID NO:210)

- 114 042409

Последовательность ДНК для ROR206:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagc (SEQ ID NO:211)

Белковая последовательность для ROR206:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSmSNLAWFQQKP GKPPKLLIYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGVGAVSYRTSF GGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI NDYPITWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCPAPEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY

- 115 042409

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVESGGGV VQPGRSLRLSCKASGYTFTRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRFTI SADKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARPQVHYDYNGFPYWGQGTPVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWI YDSSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITS SS (SEQ ID NO:212)

Последовательность ДНК для ROR207:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc aagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgccctcccggttctccggctccggctccggcaccgacttca ccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggcaagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc

- 116 042409 agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagc (SEQ ID NO:213)

Белковая последовательность для ROR207:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIDSNLAWFQQKP GKPPKLLIYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGVGAVSYRTSF GGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI NDYPITWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCPAPEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVQSGPEV KKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAP KRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKV EIKRSSS (SEQ ID NO:214)

Последовательность ДНК для ROR208:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc cagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgcccgaccggttctccggctccggctccggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttc ggcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatc tgaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca

- 117 042409 cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtggagtctgggggcggagtggtgcagcctgggcggtcactga ggctgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagatctacgatgcactgggtaaggcaggcccctggacaaggtctggaatggattgga tacattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacaggttcacaatcagcgcagacaaatccaagagcacagccttc ctgcagatggacagcctgaggcccgaggacaccggcgtctatttctgtgcacggccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactg gggccaagggactcccgtcactgtctctagcggtggcggagggtctgggggtggcggatccggaggtggtggctctgcacaagacatcc agatgacccagtctccaagcagcctgtctgcaagcgtgggggacagggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatga actggtaccagcagaagccgggcaaggcccccaaaagatggatttatgactcatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtgg cagtgggtctgggaccgactataccctcacaatcagcagcctgcagcccgaagatttcgccacttattactgccagcagtggagtcgtaacc cacccacgttcggaggggggaccaagctacaaattacatcctccagc (SEQ ID NO:215)

Белковая последовательность для ROR208:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIDSNLAWFQQKP GQPPKLLIYRASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDVATYYCLGGVGAVSYRTS FGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI NDYPITWVRQAPGQGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCPAPEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVESGGGV VQPGRSLRLSCKASGYTFTRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRFTI SADKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARPQVHYDYNGFPYWGQGTPVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWI YDSSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITS SS (SEQ ID NO:216)

Последовательность ДНК для ROR209:

atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggtgacatccagatgacccagtccccctcctccctg tccgcctccgtgggcgaccgggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccatcgactccaacctggcctggttccagcagaagcccggc cagccccccaagctgctgatctaccgggcctccaacctggcctccggcgtgcccgaccggttctccggctccggctccggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggacgtggccacctactactgcctgggcggcgtgggcgccgtgtcctaccggacctccttc ggcggcggcaccaaggtggagatcaagggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccggtggcggcggatc tgaggtgcagctggtggagtccggcggcggcctggtgcagcccggccggtccctgcggctgtcctgcaccgcctccggctccgacatca

- 118 042409 acgactaccccatcacctgggtgcggcaggcccccggccagggcctggagtggatcggcttcatcaactccggcggctccacctggtac gcctcctgggtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgaggac accgccgtgtactattgcgcccggggctactccacctactaccgggacttcaacatctggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccca aaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttctggtggaggcggttcaggcgga ggtggctccggcggtggcggatcgccgggctctcaggtccagctggtgcaatctgggcctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaa ggtctcctgcaaggcttctggatataccttcagcagatctacgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggat acattaatcctagcagtgcttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctaca tggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaccccaagtccactatgattacaacgggtttccttactgg ggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcgggtggcggcgga tctgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatgacttgcagtgccagctcaagtgtaagtt acatgaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagagatggatttatgactcatccaaactggcttctggggtcccatcaaggttc agcggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtggagtcgt aacccacccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggtcctccagc (SEQ ID NO:217)

Белковая последовательность для ROR209:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIDSNLAWFQQKP GQPPKLLIYRASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDVATYYCLGGVGAVSYRTS FGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI NDYPITWVRQAPGQGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCP APEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVQSGPEV KKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQ SPSTLS AS VGDRVTMTC S AS S S VS YMNWYQQKPGKAP

- 119 042409

KRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKV EIKRSSS (SEQ ID NO:218)

Последовательность ДНК для ROR231:

atggaggcacccgcccagctgctgttcttgttgctgctgtggctccctgataccaccggagacatccagatgacccaatccccttctagtctct ccgctagcgtcggagaccgcgtgaccatcaattgtcaagcatctcagagtattgacagcaatctcgcctggtttcagcagaagccaggaaa gccacccaagctcctgatttatagggctagcaacctggcttctggtgtccctagtaggttcagcggctctgggagtggcacagacttcaccct gaccattagtagtctgcagcccgaagatgtcgctacctattactgcctcggaggagtgggtgccgtttcttatcgcacctcatttggaggtggc accaaagtggagatcaaaggtggtggcggctccgggggtggcgggtcaggggggggagggtctggaggcggcggatcagaagttca gctggtggaatctggaggaggtctggtgcagccaggcaggtccctccggctgagctgcactgcatccggctctgacattaatgactaccct atcacctgggtgaggcaggcccccggtaaaggcctggagtggatcgggttcatcaattctggtggatctacttggtacgcaagctgggtga aaggacgcttcacaattagtagagacgactctaagtctatcgcatatctgcagatgaatagcttgaagacagaggacaccgccgtgtactatt gtgcaagaggatactccacttactaccgcgatttcaatatctggggccagggaaccctggtgacagtgtcctcgagtgagcccaaatcttctg acaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacg gcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcac caggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgg actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttccggaggcggcggctccggcggcggcggcagcggc ggcggcggcagccccggatcccaggtgcagctggtgcagtctggtcctgaggtgaaaaagcctggctccagcgtgaaggtgtcctgcaa ggccagcggatacacctttagccggtccaccatgcattgggtgaggcaggctcctggacagggcctggagtggatcggctacatcaaccc cagcagcgcttataccaactacaatcagaagtttaaggaccgggtgaccatcaccgccgataagtccaccagcaccgcctacatggagct gtccagcctgaggagcgaggataccgccgtgtactattgcgcccggccccaggtccattacgactacaacggcttcccctattggggcca gggaaccctggtgaccgtgtccagcggaggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggaggaggcagcggcggaggaggctc cgacattcagatgacccagtccccctccaccctgtccgctagcgtgggcgatcgggtgaccatgacctgcagcgccagcagctccgtgtc ctacatgaactggtaccagcagaagcccggcaaggctcccaagaggtggatttacgactccagcaagctggcctctggtgtccccagcag gttctctggtagcggcagcggcacagactacaccctgaccatctcctccctgcagcccgacgatttcgccacctactattgccagcagtggt cccggaatccccctacctttggcggcggcaccaaggtggagatcaagaggagctccagc (SEQ ID NO:219)

Белковая последовательность для ROR231:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIDSNLAWFQQKP GKPPKLLIYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGVGAVSYRTSF GGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI

- 120 042409

NDYPITWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCPAPEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVQSGPEV KKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQ SPSTLS AS VGDRVTMTC S AS S S VS YMNWYQQKPGKAP KRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKV EIKRSSS (SEQ ID NO:220)

Последовательность ДНК для ROR233:

atggaggctcccgctcagctgctgttcctcctgctgctctggctgcccgacaccacaggcgacatccagatgacccagtccccttcctccct gtccgctagcgtgggcgatagggtgaccatcaactgccaggcctcccagtccattgactccaatctggcctggttccagcagaagcccgg acagccccccaagctgctgatttacagggcctccaacctggcttccggcgtgcctgacaggttctccggatccggcagcggcaccgacttc accctgaccatctcctccctggaggccgaggatgtcgccacctactactgtctgggcggcgtgggcgctgtgagctatcggacctccttcg gcggcggcaccaaggtggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggaggctccggcggcggcggc agcgaggtgcagctggtggaaagcggaggaggcctggtgcagcctggaaggtccctgaggctgtcctgcacagccagcggctccgac atcaacgactaccccatcacctgggtgaggcaggctcctggccagggcctggaatggatcggctttatcaacagcggcggcagcacctg gtatgcttcctgggtgaagggccggttcaccattagcagggacgactccaagtccattgcctacctgcagatgaactccctgaagaccgag gacaccgccgtgtactactgcgccaggggctacagcacctattaccgggactttaacatctggggccagggcacactggtcaccgtgtcct cgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccc cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtca agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccag gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaa gaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggttccggaggcggcggctcc ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccccggatcccaggtgcagctggtgcagtctggtcctgaggtgaaaaagcctggctcc agcgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggatacacctttagccggtccaccatgcattgggtgaggcaggctcctggacagggcctgga gtggatcggctacatcaaccccagcagcgcttataccaactacaatcagaagtttaaggaccgggtgaccatcaccgccgataagtccacc agcaccgcctacatggagctgtccagcctgaggagcgaggataccgccgtgtactattgcgcccggccccaggtccattacgactacaac ggcttcccctattggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagcggaggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggaggagg

- 121 042409 cagcggcggaggaggctccgacattcagatgacccagtccccctccaccctgtccgctagcgtgggcgatcgggtgaccatgacctgca gcgccagcagctccgtgtcctacatgaactggtaccagcagaagcccggcaaggctcccaagaggtggatttacgactccagcaagctg gcctctggtgtccccagcaggttctctggtagcggcagcggcacagactacaccctgaccatctcctccctgcagcccgacgatttcgcca cctactattgccagcagtggtcccggaatccccctacctttggcggcggcaccaaggtggagatcaagaggagctccagc (SEQ ID NO:221)

Белковая последовательность для ROR233:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIDSNLAWFQQKP GQPPKLLIYRASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEAEDVATYYCLGGVGAVSYRTS FGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGSDI NDYPITWVRQAPGQGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTE DTAVYYC ARGYSTYYRDFNIWGQGTLVT VS S SEPKS SDKTHTCPPCP APEAAGAPS VFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSPGSQVQLVQSGPEV KKPGSSVKVSCKASGYTFSRSTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQ SPSTLS AS VGDRVTMTC S AS S S VS YMNWYQQKPGKAP KRWIYDSSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDDFATYYCQQWSRNPPTFGGGTKV EIKRSSS (SEQ ID NO:222)

- 122 042409

Таблица 15. Обобщенные данные по последовательностям SEQ ID NO

Назначение	Описание	ДНК SEQ ID NO	Белковая SEQ ID NO
TSC311или TSC312	Fc DRA222	1	2
TSC313	Fc H7L1	3	4
TSC314	Fc H7L4	5	6
TSC315	Fc H7L5	7	8
TSC316	Fc H8L1	9	10
TSC317	Fc H8L4	11	12
TSC318	Fc H8L5	13	14
TSC319	Fc H9L1	15	16
TSC320	Fc H9L4	17	18
TSC321	Fc H9L5	19	20
TSC322	Fc H10L1	21	22
TSC323	Fc H10L4	23	24
TSC324	Fc H10L5	25	26
TSC334	Fc H7L6	27	28
TSC335	Fc H7L7	29	30
TSC336	Fc H7L8	31	32
TSC337	Fc H8L6	33	34
TSC338	Fc H8L7	35	36
TSC339	Fc H8L8	37	38
TSC340	Fc H10L6	39	40
TSC341	Fc H10L7	41	42
TSC342	Fc H10L8	43	44
TSC370	TSC342 G27Y	45	46
TSC371	TSC342 M53I	47	48
TSC372	TSC342 I21M	49	50
TSC390	TSC370 A9P	51	52
TSC391	TSC370 A9P M53I	53	54
TSC392	TSC370 A9P I21M	55	56
TSC393	TSC370 M53I I21M	57	58
TSC394	TSC370 A9P M53I I21M	59	60
TSC408	Анти-PSMA XTSC391	61	62

- 123 042409

TSC409	Анти-PSMA XTSC392	63	64
TSC410	Анти-PSMA XTSC393	65	66
TSC411	Анти-PSMA XTSC394	67	68
TSC471	Анти-PSMA XTSC456	205	206
TSC266	Анти-PSMA X DRA222 (huVL-VH 1071A4 scFv-Fc-DRA222 scFv)	209	210
CAS105	Ahth-CD37 X DRA222	69	70
Ahth-CD37 X TSC445	Ahth-CD37 X TSC394	71	72
Ahth-CD37 X TSC452	Ahth-CD37 X (TSC394 VL + DRA222 VH)	73	74
Ahth-CD37 X TSC453	Ahth-CD37 X (TSC394 VH + DRA222 VL)	75	76
Ahth-CD37 X TSC454	Ahth-CD37 X TSC394 E86D	77	78
Ahth-CD37 X TSC455	Ahth-CD37 X TSC394 F87Y	79	80
Ahth-CD37 X TSC456	Ahth-CD37 X TSC394 E86D F87Y	81	82
TSC455	TSC394 F87Y scFv (анти-СОЗ scFv)		83
TSC456	TSC394 E86D F87Y scFv (анти-СОЗ scFv)		84
DRA222	Ahth-CD3 scFv		85
TSC455 и TSC456 VH	Вариабельный тяжелый домен TSC455 и TSC456		86
DRA222 VH	Вариабельный тяжелый домен DRA222		87
TSC455 VL	Вариабельный легкий домен TSC455		88
TSC456 VL	Вариабельный легкий домен TSC456		89
DRA222 VL	Вариабельный легкий домен DRA222		90
Cris7 и DRA222 VH CDR1 (Kabat)	Анти-СОЗ VH CDR1		91
Cris7 и DRA222 VH CDR2 (Kabat)	Анти-СОЗ VH CDR2		92

- 124 042409

Cris7 и DRA222 VH CDR3 (Kabat)	Ahtm-CD3 VH CDR3		93
Cris7 и DRA222 VL CDR1 (Kabat)	Ahtm-CD3 VLCDR1		94
Cris7 и DRA222 VL CDR2 (Kabat)	Ahtm-CD3 VLCDR2		95
Cris7 и DRA222 VL CDR3 (Kabat)	Ahtm-CD3 VLCDR3		96
Cris7 и DRA222 VH CDR1 (IMGT)	Ahtm-CD3 VH CDR1		199
Cris7 и DRA222 VH CDR2 (IMGT)	Ahtm-CD3 VH CDR2		200
Cris7 и DRA222 VH CDR3 (IMGT)	Ahtm-CD3 VH CDR3		201
Cris7 и DRA222 VL CDR1 (IMGT)	Ahtm-CD3 VLCDR1		202
Cris7 и DRA222 VL CDR2 (IMGT)	Ahtm-CD3 VLCDR2		203
Cris7 и DRA222 VL CDR3 (IMGT)	Ahtm-CD3 VLCDR3		204
ROR133	Анти-RORl (Rll L7H15) X DRA222	97	98
ROR193	Анти-RORl (Rll L7H15) X TSC394 F87Y	99	100
ROR134	Анти-RORl (Rll L7H10) X DRA222	101	102
ROR189	Анти-RORl (Rll L7H10) X TSC394 E86D F87Y	103	104
ROR154	Анти-RORl (Rll L7H16) X DRA222	105	106
ROR185	Анти-RORl (Rll L7H15) X TSC394 E86D F87Y	107	108
ROR179	Анти-RORl (Rll L8H16) X DRA222	109	110
ROR186	Анти-RORl (Rll L8H16) X TSC394 E86D F87Y	111	112
ROR181	Анти-RORl (Rll L7H17) X DRA222	113	114
ROR191	Анти-RORl (Rll L7H17) X TSC394 E86D F87Y	115	116
ROR182	Анти-RORl (Rll L9H18) X DRA222	117	118

- 125 -

Claims

ROR192 Анти-RORl (Rll L9H18) X TSC394 E86D F87Y 119 120

ROR243 Гуманизированное, кодоноптимизированное анти-RORl X анти-СОЗ (родительская анти-RORl молекула представляет собой ROR192) scFv-Fc-scFv 207 208

ROR206 ROR133 S40T G113R х DRA222 Fc ADCC- К322А-Н111 в рЕЕ12.4 211 212

ROR207 ROR133 S40T G113R х TSC456 Fc ADCC- К322А-Н111 в рЕЕ12.4 213 214

ROR208 ROR174 S40T G113R х DRA222 Fc ADCC- К322А-Н111 в рЕЕ12.4 215 216

ROR209 ROR174 S40T G113R х TSC456 Fc ADCC- К322А-Н111 в рЕЕ12.4 217 218

ROR231 Анти-RORl X анти-СОЗ 219 220

ROR233 Анти-RORl X анти-СОЗ 221 222

Химерное биспецифическое антиCD123 (VLVH) х анти-СОЗ (TSC456) scFv-Fc-scFv 197

Химерное биспецифическое антиCD123 (VHVL) х анти-СОЗ (TSC456) scFv-Fc-scFv 198

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. CD3-связывающий полипептид, содержащий CD3-связывающий домен, который специфически связывается с человеческим CD3 и который содержит гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, причем вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 94, аминокислотную последовательность LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 95, и аминокислотную последовательность LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 96, и при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 91, аминокислотную последовательность HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 92, и аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 93;

при этом аминокислотный остаток в положении 9 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой пролин; и при этом аминокислотный остаток в положении 21 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой метионин; и при этом аминокислотный остаток в положении 87 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой тирозин.
2. CD3-связывающий полипептид по п.1, отличающийся тем, что:

(a) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную SEQ ID NO: 88, и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную SEQ ID NO: 86; или (b) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную SEQ ID NO: 89, и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную SEQ ID NO:86.
3. CD3-связывающий полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что:

(a) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 88 и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 86; или

- 126 042409 (b) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 89 и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит SEQ ID NO: 86.
4. CD3-связывающий полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотный остаток в позиции 52 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой аргинин и/или аминокислотный остаток в позиции 53 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой триптофан.
5. CD3-связывающий полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотный остаток в позиции 27 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой тирозин.
6. CD3-связывающий полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотный остаток в позиции 53 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой изолейцин.
7. CD3-связывающий полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотный остаток в позиции 86 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой аспарагиновую кислоту.
8. CD3-связывающий полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что CD3-связывающий домен содержит SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 84.
9. CD3-связывающий полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что CD3-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
10. CD3-связывающий полипептид по п.9, отличающийся тем, что указанный scFv содержит линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи указанного scFv, и при этом указанный линкер содержит аминокислотную последовательность QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS (SEQ ID NO: 148).
11. CD3-связывающий полипептид по п.9 или 10, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи указанного scFv является амино-концевой по отношению к вариабельной области легкой цепи указанного scFv.
12. CD3-связывающий полипептид, содержащий:

(i) первый связывающий домен, который представляет собой CD3-связывающий домен, который специфично связывается c CD3 человека и содержит гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 94, аминокислотную последовательность LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 95, и аминокислотную последовательность LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 96, и при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 91, аминокислотную последовательность HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 92, и аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 93;

при этом аминокислотный остаток в положении 9 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой пролин; и при этом аминокислотный остаток в положении 21 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой метионин; и при этом аминокислотный остаток в положении 87 в соответствии с системой нумерации IMGT вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой тирозин; и (ii) второй связывающий домен.
13. CD3-связывающий полипептид по п.12, отличающийся тем, что указанный CD3-связывающий полипептид содержит в порядке от амино-конца к карбокси-концу: (i) второй связывающий домен, (ii) шарнирную область, (iii) константную область иммуноглобулина, (iv) карбокси-концевой линкер и (v) CD3-связывающий домен.
14. CD3-связывающий полипептид по п.13, отличающийся тем, что указанная константная область иммуноглобулина содержит домен СН2 человеческого IgG1, содержащий замены L234A, L235A, G237A и К322А согласно системе нумерации EU.
15. CD3-связывающий полипептид по п.12 или 14, отличающийся тем, что:

(i) CD3-связывающий домен содержит: (а) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (b) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3; и (ii) второй связывающий домен содержит: (а) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и (b) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3.
16. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что шарнирная область получена из шарнирной области иммуноглобулина.
17. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.13-16, отличающийся тем, что карбоксиконцевой линкер содержит или состоит из SEQ ID NO: 196.

- 127 042409
18. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.13-17, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3 иммуноглобулина из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1,

IgA2 или IgD.
19. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.12-18, отличающийся тем, что CD3связывающий полипептид индуцирует перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность (ПТКЦ).
20. CD3-связывающий полипептид по п.19, отличающийся тем, что CD3-связывающий полипептид индуцирует ПТКЦ с ЕС₅₀, составляющей приблизительно 30 пМ или меньше.
21. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.12-20, отличающийся тем, что второй связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
22. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.12-21, отличающийся тем, что второй связывающий домен связывается или взаимодействует с опухолеассоциированным антигеном.
23. CD3-связывающий полипептид по п.22, отличающийся тем, что указанный CD3-связывающий полипептид индуцирует зависимый от Т-клеток лизис клеток, экспрессирующих опухолеассоциированный антиген.
24. CD3-связывающий полипептид по п.22 или 23, отличающийся тем, что опухолеассоциированный антиген выбран из группы, состоящей из PSMA, CD19, CD20, CD37, CD38, CD123, Her2, ROR1, RON, гликопротеинового антигена А33 (gpA33) и СЕА.
25. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CD3-связывающий полипептид по любому из пп.1-24 или часть указанного CD3-связывающего полипептида, которая содержит гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина.
26. Экспрессионный вектор, содержащий сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий CD3связывающий полипептид по любому из пп.1-24, причем сегмент нуклеиновой кислоты функционально связан с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии сегмента нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
27. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.26.
28. Способ получения CD3-связывающего полипептида, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор по п.26, в условиях, в которых происходит экспрессия сегмента нуклеиновой кислоты и, таким образом, получение CD3-связывающего полипептида.
29. Способ по п.28, дополнительно включающий выделение CD3-связывающего полипептида.
30. Фармацевтическая композиция для ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, содержащая CD3-связывающий полипептид по любому из пп.1-24 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
31. Способ индукции перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (ПТКЦ) против клетки, экспрессирующей опухолеассоциированный антиген, включающий приведение указанной экспрессирующей опухолеассоциированный антиген клетки в контакт с CD3-связывающим полипептидом по любому из пп.1-24, причем указанное приведение в контакт происходит в условиях, в которых индуцируется ПТКЦ против экспрессирующей опухолеассоциированный антиген клетки.
32. Способ ингибирования роста опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества CD3-связывающего полипептида по любому из пп.1-24 или композиции по п.30.
33. Способ лечения рака или аутоиммунного нарушения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества CD3-связывающего полипептида по любому из пп.1-24 или композиции по п.30.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что рак представляет собой рак простаты, колоректальный рак, почечноклеточную карциному, рак мочевого пузыря, рак слюнной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, меланому, рак надпочечников, мантийноклеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому, острый миелоцитарный лейкоз (ОМЛ), В-лимфоидный лейкоз, бластное новообразование из плазмацитоидных дендритных клеток (БНПДК) или лейкоз ворсистых клеток.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы.
36. CD3-связывающий белок, который представляет собой димер из двух идентичных полипептидов, причем каждый полипептид представляет собой CD3-связывающий полипептид по любому из пп.1-24.
37. CD3-связывающий полипептид по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что CD3связывающий полипептид не демонстрирует или демонстрирует минимальную активность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или активность комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ).

- 128 -