EA038034B1

EA038034B1 - Коэкспрессия фактора viii и фактора фон виллебранда

Info

Publication number: EA038034B1
Application number: EA201591832A
Authority: EA
Inventors: Джон Хендерсон Маквей; Иэн Гарнер; Адель Дейл; Брюс Вернон
Original assignee: Профактор Фарма Лтд
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2021-06-25
Also published as: WO2014147386A1; GB201304973D0; CN105229143A; EP2976422B1; EA201591832A1; LT2976422T; ZA201507754B; CN105229143B; EP2976422A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к функциональной экспрессии рекомбинантного фактора VIII (rFVIII) в клетках и, конкретно, к его стабильной экспрессии и секреции из клеток в in vitro и/или in vivo применениях.

Description

Область техники

Уровень техники

Фактор VIII (FVIII) представляет собой крупный сложный гликопротеин. Он синтезируется в виде 330кДа-белка с доменной структурой А1-А2-В-А3-С1-С2, где оба домена, А и С, обладают гомологией внутренней последовательности, которая составляет приблизительно 40% идентичности последовательности с доменами А и С фактора V. В-домен, который составляет 38% суммарной последовательности, не имеет идентичности последовательности с другими известными белками, включая В-домен фактора V. Однако он сильно гликозилирован и содержит 19 из 26 аспарагин (N)-связанных сайтов гликозилирования цельной молекулы.

По существу, понимание биосинтеза FVIII происходит из анализа экспрессии в гетерологичных типах клеток с целью получения rFVIII для терапевтических целей. Кроме того, характеризация молекулярных дефектов, отвечающих за аутосомно-рецессивное расстройство свертываемости, ассоциированное с объединенным дефицитом факторов V и VIII, обнаружила важность внутриклеточного транспорта в биосинтезе FVIII (1, 2).

Ранние исследования rFVIII продемонстрировали, что В-домен мог делетироваться без потери прокоагулянтной активности FVIII (рассмотрено в 3). Экспрессирующие кассеты, кодирующие rFVIII с делетированным В-доменом, приводили к получению значительно более высокого уровня мРНК по сравнению с экспрессирующей кассетой с полноразмерным rFVIII, которая приводила к более высокому уровню синтеза белка rFVIII. Однако уровень rFVIII, секретированного в среду, не повышался пропорционально, что предполагает внутриклеточные взаимодействия, лимитирующие эффективную секрецию (4). rFVIII посредством котрансляционной транслокации попадает в полость ЭР, где он сворачивается и собирается в третичную структуру. Эти реакции облегчаются ферментами и молекулярными шаперонами, которые взаимодействуют со сворачивающимися интермедиатами rFVIII.

In vivo, сразу после его секреции в кровоток, FVIII взаимодействует с образованием плотного нековалентного комплекса, который защищает его от преждевременного клиренса или от инактивации протеолизом. FVIII связывается с фактором фон виллебранда (VWF) через два сайта в доменах A3 и С2. In vitro было представлено, что добавление VWF к культуральной среде или коэкспрессия посредством котрансфекции с использованием VWF-экспрессирующих кассет клеток, экспрессирующих rFVIII, приводит к повышенному накоплению rFVIII в среде путем повышения стабильности rFVIII в культуральной среде (6). Предположили, что VWF стимулирует диссоциацию rFVIII с клеточной поверхности, а также может стимулировать сборку тяжелой и легкой цепи rFVIII в двухцепочечный гетеродимер (14, 15), однако, как предполагается, исключительно с образованием нековалентного комплекса с FVIII после того, как он оказывается вне клетки.

Делеция цельного В-домена, которая приводила к 17-кратному повышению мРНК и первичного продукта трансляции, приводила в результате к повышению только на 30% уровня секретированного белка, предполагая что степень транспорта ЭР-Гольджи уменьшилась и уровень мРНК FVIII не ограничивает экспрессию (4). Введение множества N-связанных сайтов гликозилирования, которые, как известно, важны для ЭР-Гольджи-транспорта FVIII, повышало уровень секретированного FVIII, предполагая что степень ЭР-Гольджи-транспорта может представлять собой лимитирующую стадию (7). Однако значительное количество FVIII внутри ЭР никогда не переходит в компартмент аппарата Гольджи благодаря нарушению корректной сборки, и накопление некорректно свернутого FVIII в ЭР может приводить к окислительному нарушению и к апоптозу (5), предполагая, что сборка FVIII представляет собой лимитируюущую стадию в экспрессии FVIII.

В недавнем исследовании, которое было проведено для изучения эффекта экспрессирующих кассет FVIII, содержащих различные конструкты В-доменов, изучали также эффект оптимизации по кодонам этих последовательностей для экспрессии в Homo sapiens (8). Человеческие эмбриональные почечные клетки (НЕК293Т) транзиторно трансдуцировали и оценивали экспрессию FVIII через 72 ч. Неожиданно выяснили, что никакого значительного эффекта от включения участков В-доменов не наблюдалось, однако наблюдали 7-30-кратное повышение функциональной экспрессии FVIII в результате последовательностей, оптимизированных по кодонам. Хотя вторичная структура белка определяется в основном по аминокислотной последовательности, сборка белка внутри клетки подвергается влиянию ряда факторов: которые включают взаимодействие с другими белками (шапероны) и лигандами, транслокацию через ЭР-мембрану и окислительно-восстановительные условия. Скорость транслокации также может влиять на сборку белка, и предположили, что использование кодонов может быть механизмом для регуляции скорости транслокации и, таким образом, дает возможность последовательной сборки индивидуальных белковых доменов (9, 10). FVIII представляет собой комплексный мультидоменный белок, в котором непоследовательные сегменты зарождающейся полипептидной цепи могут взаимодействовать в трехмерной структуре. Остановка рибосомы в редких кодонах может, таким образом, приводить к альтернативным путям сборки с получением измененных конформаций и потенциально некорректно собранно- 1 038034 го белка. Потенциальное объяснение наблюдаемого эффекта оптимизированных по кодонам последовательностей может состоять в том, что они дают возможность эффективной трансляции и транспорта через ЭР-мембрану, что дает возможность зарождения полипептидной цепи FVIII для корректной сборки, которая приводит к повышенному уровню секретированного FVIII in vitro и in vivo.

Spencer et al. (16) раскрывают применение лентивирусной векторной платформы для экспрессии на очень высоком уровне рекомбинантного Фактора VIII, сконструированного с помощью биоинженерии. Однако это достигается путем создания химерной последовательности FVIII, которая включает 12% свиной последовательности, и такой FVIII не является фактически нативной или человеческой последовательностью. Это может вызывать регуляторные вопросы в отношении ее применения, поэтому это может быть не целесообразно, особенно в контексте человека.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение базируется на исследованиях, осуществленных авторами изобретения в отношении экспрессии rFVIII с делетированным В-доменом (BDD) rFVIII в клетках и, в особенности, rFVIII, оптимизированного по кодонам.

Изобретение базируется на работе, проведенной авторами настоящего изобретения по обеспечению высокопроизводительного получения вариантов млекопитающих, особенно человеческого FVIII, сконструированного для испытаний на животных и человеке, которые основаны на применении оптимизированных по кодонам химически синтезированных генов, которыми трансфицируют, например, клетки млекопитающего либо in vitro, либо in vivo.

Авторы изобретения наблюдали, что клетки млекопитающих, трансфицированные хомячьим рекомбинантным FVIII с делетированным В-доменом и который был оптимизирован по кодонам (BDDFVIII coop), не выживали в течение некоторого периода времени и что, таким образом, BDDFVIII coop не мог быть получен стабильно в приемлемых количествах. Однако с помощью коэкспрессии BDDFVIII coop вместе с хомячьим VWF с аналогичной оптимизацией кодонов можно было получить стабильно трансфицированные клетки, которые оставались жизнеспособными в течение значительного периода времени и в которых можно было наблюдать высокий уровень экспрессии BDDFVIII coop. Kaufman (6) предполагает, что коэкспрессия VWF вместе с rFVIII приводит к внеклеточной стабильности rFVIII, но при этом не было предположений о том, что коэкспрессия VWF вместе с BDDFVIII coop может помогать поддерживать клеточную жизнеспособность, а также функциональную жизнеспособность BDDFVIII coop.

В первом аспекте предлагается клетка млекопитающего, содержащая экзогенно введенную нуклеиновую кислоту, которая способна к рекомбинантной экспрессии FVIII, где нуклеиновая кислота или ее часть, которая кодирует указанный FVIII, была оптимизирована по кодонам для экспрессии с помощью клетки млекопитающего; и где клетка дополнительно коэкспрессирует Фактор фон Виллебранда (VWF).

В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота, которая экспрессирует VWF, вводится в клетку млекопитающего перед нуклеиновой кислотой, которая способна к рекомбинантной экспрессии FVIII.

В предпочтительном воплощении полинуклеотидная последовательность VWF также может быть оптимизирована по кодонам аналогично последовательности FVIII. Таким образом, хотя остаток специфичности относится к оптимизации кодонов и конкретно к экспрессии FVIII, это не следует рассматривать как ограничение и может рассматриваться аналогично в отношении VWF.

FVIII млекопитающего, о котором идет речь, предпочтительно представляет собой человеческий FVIII, но также это может быть FVIII из другого примата или из другого млекопитающего, такого как мышь, крыса, хомяк, кролик, лошадь, корова, свинья, овца, верблюд, кошка, морская свинка или тому подобные. FVIII может представлять собой модифицированный вариант, известный в данной области, например вариант с делетированным В-доменом, BDD FVIII.

Клетка-хозяин млекопитающего может представлять собой любую клетку, походящую для экспрессии оптимизированного по кодонам FVIII и может представлять собой, например, клетку с происхождением из человека, мыши, хомяка, крысы, обезьяны, кролика или собаки. Естественно, FVIII или его модифицированный вариант будет оптимизирован по кодонам так, как известно в данной области и как описано далее ниже, чтобы оптимизация кодонов подходила для экспрессии в выбранной клетке. Например, если клетка представляет собой клетку с происхождением из хомяка, то кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты FVIII будет оптимизирована по кодонам для экспрессии в клетках хомяка. Клеточные линии, которые могут быть подходящими для экспрессии, включают HEK293, СНО, 3T3, BHK, MICK, Varo, Junket, Hela, а также производные таких клеток, известные в данной области.

Хотя нуклеиновая кислота может быть оптимизирована по кодонам для экспрессии в конкретной клетке млекопитающего, аминокислотная последовательность может соответствовать FVIII из того же или из других видов. В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность FVIII соответствует последовательности человеческого FVIII или его фрагменту. Подходящие фрагменты человеческого FVIII или FVIII из других животных включают в предпочтительном воплощении последовательность FVIII, из которой был делетирован В-домен и необязательно заменен на короткий В-доменный спейсер, богатый аспарагин-связанными олигосахаридами. Предпочтительная аминокислотная последовательность FVIII с делетированным В-доменом представлена на фиг. 1. Такая последовательность с оп- 2 038034 тимизированными кодонами для экспрессии в клетках хомяка, таких как клетки СНО или ВНК, представлена на фиг. 2.

В некоторых воплощениях в настоящем изобретении предлагается или применяется выделенный полинуклеотид, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или на 99% идентичный последовательности, представленной на фиг. 2, и где фрагмент нуклеиновой кислоты кодирует или является вариантом оптимизированного по кодонам FVIII, такого как человеческий FVIII, представленный фиг. 1. Человеческая кодирующая последовательность с оптимизированными кодонами может быть оптимизирована с помощью методов, описанных в данном документе.

Как правило, нуклеиновая кислота конструируется внутри экспрессирующего вектора, который способен экспрессировать указанный рекомбинантный FVIII при подходящих условиях.

Стандартно, оптимизированная по кодонам последовательность нуклеиновой кислоты может быть исходно синтезирована химическими способами, а не клонироваться и подвергаться мутагенезу с целью получения необходимой оптимизации кодонов. Согласно настоящему изобретению возможно получение больших количеств рекомбинантного FVIII млекопитающих и его вариантов, что до сих пор было не возможно с использованием ранее описанных методов. Как правило, способы настоящего изобретения могут давать выход белка, составляющий по меньшей мере 0,5 мг рекомбинантного FVIII (или его вариантов) на 1 литр культуральной среды, как например, по меньшей мере 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг или 500 мг на 1 литр культуральной среды. Таким образом, понятно, что, следуя способам настоящего изобретения при использовании ферментеров промышленного масштаба, возможно получение сотен миллиграммов или граммов или даже килограммов количества рекомбинантного FVIII и его вариантов. Также понятно, что, следуя способам настоящего изобретения, возможно достижение выхода белка с продуктивностью, которая соответствует или выше, чем продуктивность клеточных линий промышленного производства для FVIII (т.е.>0,05 пг/на клетку/в день. Для этого может или нет требоваться использование методов генной амплификации, таких как DHFR/метотрексат).

В следующем аспекте в настоящем изобретении предлагается клеточная культура, содержащая клетку млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, которая способна экспрессировать FVIII в количестве >0,1 пг/на клетку/в день, как правило, >0,25 пг/на клетку/в день.

Клеточная культура может рассматриваться как стабильная в том, что она содержит один или несколько из следующих признаков:

1) Клеточная культура содержит по меньшей мере 5х 10⁶, 1 χ 10⁷ или 1х 108 клеток на мл;

2) Жизнеспособность клеток составляет по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 97%; и

3) Жизнеспособность клеток поддерживается в течение по меньшей мере 2 недель, 3 недель или даже 4 недель.

В следующем аспекте предлагается способ получения рекомбинантного FVIII млекопитающих, включающий получение клетки, как описано в данном документе, культивирование указанной клетки в подходящей культуральной среде, так что клетка экспрессирует и секретирует FVIII в культуральную среду, где указанный секретированный FVIII образует комплекс или по другому ассоциирован с VWF. Предпочтительно, для способа настоящего изобретения в некоторых воплощениях могут не требоваться методы генной амплификации, такие как методы амплификации с использованием DHFR/метотрексата, известные в данной области (см., например, Kaufman (17)). Авторы изобретения наблюдали, что метотрексат на уровне до 0,5 мкМ может использоваться для повышения продуктивности рекомбинантного FVIII, но более высокий уровень, как оказалось, имеет вредный эффект, который не ожидался.

Способ, описанный выше, может дополнительно включать очистку указанных белков или комплекса из клетки и/или культуральной среды, в которой клетка растет. Очистка может, как правило, включать в себя использование хроматографических методов, таких как методы жидкостной экспрессхроматографии белков или высоко-эффективной жидкостной хроматографии, известные в данной области. В последующей стадии очистки сырой материал может, например, загружаться на аффинную хроматогафическую колонку на основе сефарозы или агарозы, содержащей аффинный лиганд для VWF или FVIII, такой как моноклональное антитело или пептидный лиганд. В предпочтительном воплощении антитело к VWF (CaptureSelect VWF; Life Technologies) или к FVIII (FVIIISelect; GE Healthcare) применяется с целью связывания с указанным FVIII и/или VWF и элюируется с помощью применения градиента соли (например, 1-1,5 М NaCl или CaCl₂) из множества колоночных объемов; в следующей стадии FVIIIсодержащие фракции из предыдущих стадий могут быть загружены, например, на анионообменную и/или на HIC-колонку. Порядок таких стадий очистки может меняться для повышения выхода и/или чистоты rFVIII или его варианта.

Настоящее изобретение основано скорее не на стандартном генном клонировании и экспрессии, а на изначальном химическом синтезе ДНК-молекул с оптимизированными кодонами, кодирующих указанный FVIII (и его варианты), используя дизайн генов и методы синтеза, известные в данной области (например, Gene composer: программное обеспечение базы данных для дизайна белковых конструктов, конструкции кодов, и для синтеза генов, см. Lorimer (18). Аналогично, нуклеиновые кислоты с оптими- 3 038034 зированными кодонами синтезируют de novo перед клонированием в подходящий экспрессирующий вектор. Стандартные методы сайт-направленного мутагенеза, известные в данной области, для осуществления оптимизации кодонов гена FVIII будут неосуществимы с точки зрения временных затрат, если не невозможны из-за высокого риска введения дополнительных мутационных вариаций в процессе требуемых повторных раундов сайт-направленного мутагенеза. Однако сайт-направленный мутагенез может использоваться после клонирования синтетического FVIII с оптимизированными кодонами с целью осуществления одной или комбинации сайт-специфичных мутаций в продукте.

Оптимизация кодонов проводится с целью повышения уровня экспрессии FVIII млекопитающих и его вариантов в целевом организме-хозяине или в типе клеток, таких как хомяк или клетки хомяка. Указанная оптимизация включает в себя одно или несколько из следующего: адаптацию смещения кодонов для соответствия выбранному организму-хозяину или фактическому типу клеток; избегание участков высокого (>80%) или низкого (<30%) содержания GC; минимизация любых потенциальных внутренних ТАТА-боксов, chi-сайтов и сайтов связывания с рибосомой; минимизация АТ-богатых или GC-богатых протяженных последовательностей, избегание повторов и вторичных структур РНК, минимизация любых (скрытых) сайтов сплайсинга - донорных и акцепторных; и гарантия того, что любые целевые сайты эндонуклеаз рестрикции присутствуют только на краю 5'- и 3'-концов нуклеиновой кислоты для облегчения клонирования. Предпочтительно, все из вышеперечисленных факторов принимают во внимание при оптимизации последовательности нуклеиновой кислоты. Специалист способен сделать такие модификации в отношении исходной последовательности FVIII на основе знаний из предыдущего уровня техники в том, что касается смещения кодонов выбранного организма-хозяина и других методов (например, Codon bias and heterologous protein expression. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Trends Biotechnol 2004 22:346-53). Некоторые компании, такие как (Regensburg, Germany), GeneScript (Piscataway, New Jersey, USA) и DNA2.0 (Menlo Park, California, USA) обеспечивают услугу по оптимизации и синтезу последовательностей нуклеиновых кислот, которые приспособлены для экспрессии в конкретном организмехозяине.

Экспрессирующие векторы, применяемые в настоящем изобретении, включают векторы, полученные на основе хромосом, эписом и вирусов, например векторы, включающие бактериальные плазмиды, бактериофаги, дрожжевые эписомы, дрожжевые хромосомные элементы, вирусы, такие как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы-дефтерита птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные на основе их комбинаций, такие как космиды и фагмиды.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут вводиться в клетки-хозяева с использованием хорошо известных методов, таких как инфекция, трансдукция, трансфекция, трансвекция, электропорация и трансформация. Вектор может представлять собой, например, фаговый, плазмидный, вирусный или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут быть способными к репликации или дефектными по репликации. В последнем случае вирусное размножение, как правило, будет осуществляться только в комплементирующих клетках-хозяевах.

Нуклеиновая кислота, кодирующая FVIII, должна быть функционально связана с подходящим промотором. Подходящие эукариотические промоторы включают немедленно ранний промотор цитомегаловируса, промотор тимидин-киназы вируса простого герпеса, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных длинных концевых повторов (LTR), такие как из вируса саркомы Рауса, и промоторы металлотионеина, такие как промотор мышиного металлотионеина-I. Также подходят синтетические промоторы.

Экспрессирующие конструкты будут дополнительно содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, сайт связывания с рибосомой для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструктами, будет включать инициирующий трансляцию триплет AUG в начале и кодон терминации в соответствующем положении в конце транслируемой последовательности нуклеиновой кислоты. С использованием синтетических генов легко оптимизировать все из этих признаков вставки для максимизации уровня экспрессии гена и выхода рекомбинантного белка.

Как известно, экспрессирующие векторы будут предпочтительно включать по меньшей мере один маркер селекции. Такие маркеры включают, например, ген устойчивости к дегидрофолат редуктазе, или к неомицину, или к зеоцину для эукариотической клеточной культуры и, например гены устойчивости к тетрациклину или к ампициллину для культивирования в Е. coli и в других бактериях.

Как известно, введение конструкта в клетку-хозяин может подвергаться воздействию кальцийфосфатной трансфекции, DEAE-декстран-опосредованной трансфекции, трансфекции, опосредованной катионным липидом, электропорации, трансдукции, инфекции или других методов. Такие методы описаны во множестве стандартных лабораторных руководств, таких как Davis LGG et al. (21).

Как известно, транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, высшими эукариотами может повышаться путем вставки энхансерной последоваельности в вектор. Энхансеры представляют собой cis-действующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 примерно до 300 п.о., которые действуют для повышения транскрипционной активности промотора в данном типе клеток-хозяев.

- 4 038034

Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который находится в позднем сайте точки начала репликации на расстоянии 100-270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы в позднем сайте точки начала репликации и энхансеры аденовируса.

Из уровня техники известно, что последовательность аминокислотных остатков полипептида FVIII может селективно варьироваться, не вызывая значительного вредного эффекта в отношении структурной целостности функциональных свойств белка. Если предполагаются такие различия в последовательности, то следует помнить, что существуют области белка, которые являются критичными для его биологической активности. Кроме того, существуют остатки, которые критичны для сборки белка или для стабилизации его собранной структуры. Некоторые остатки служат в качестве сайтов гликозилирования, распознаваемых ферментами, которые ковалентно присоединяют гликаны, например, к аспарагину. Вообще, может быть возможно безопасно заменить остатки, которые вносят вклад прямо или косвенно в структуру или функцию с помощью других остатков, которые сходны по химической структуре (они известны как консервативные замены). В случае аминокислотных остатков, которые не вносят вклад ни в структурную целостность, ни в функциональные сайты, может быть возможно безопасно заменить такой остаток на аминокислотный остаток другой химической природы (неконсервативная замена).

Как правило, видно, что консервативные замены представляют собой замены одну на другую алифатических аминокислот Ala, Val, Leu и Ile; внутренние замены между гидроксильными остатками Ser и Thr; обмен кислотных остатков Asp и Glu; замена между аминокислотными остатками Asn и Gln; обмен между основными остатками Lys и Arg; и замены среди ароматических остатков Phe и Tyr. Неконсервативные замены могут включать замены как на природные кодируемые аминокислотные остатки, так и на синтетические кодируемые (не природные) аминокислотные остатки. Не природные аминокислотные остатки могут быть такими, которые служат в качестве сайт-специфичных сайтов присоединения для конъюгации с химическими компонентами (такими как полиэтиленгликоли (PEG) и другие полимеры), или с биохимическими группами (такими как гликаны), которые усиливают терапевтическую эффективность FVIII.

Как подробно указано выше, дополнительное руководство, касающееся каждой аминокислотной замены, вероятно являющийся фенотипически молчащей (т.е. вероятно не имеет значительных побочных эффектов в отношении функции), можно обнаружить в Bowie (19)

Термины нуклеиновая кислота или фрагмент нуклеиновой кислоты относятся к одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например ДНК- или РНК-фрагментам, присутствующим в полинуклеотиде или в конструкте. В то время как термин нуклеиновая кислота, при использовании в данном документе, как подразумевается, включает любую нуклеиновую кислоту сконструированного или синтетического кодирующего участка с оптимизированными кодонами, который кодирует полипептид, или его фрагмента, варианта или производного, который был оптимизирован соответственно применению кодонов в данном виде или типе клеток. При использовании в данном документе кодирующий участок представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или ТАА) не транслируются в аминокислоту, может предполагаться, что он может быть частью кодирующего участка, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания с рибосомой, терминаторы транскрипции и тому подобные, не являются частью кодирующего участка. Две или более нуклеиновые кислоты или фрагменты нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут присутствовать в одном полинуклеотидном конструкте, например, на одной плазмиде или в отдельных полинуклеотидных конструктах, например на отдельных плазмидах. Кроме того, нуклеиновая кислота или фрагмент нуклеиновой кислоты может кодировать один полипептид или может кодировать более чем один полипептид, например нуклеиновая кислота может кодировать два или более полипептида. Кроме того, нуклеиновая кислота может кодировать регуляторный элемент, такой как промотор или терминатор транскрипции, или может кодировать гетерологичные кодирующие участки, например специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или функциональный домен.

Термины фрагмент, вариант, производное и аналог в отношении FVIII-полипептидов по настоящему изобретению включают любые полипептиды, которые сохраняют функциональную биологическую активность соответствующего нативного полипептида. Фрагменты FVIII-полипептидов по настоящему изобретению включают протеолитические фрагменты, делеционные фрагменты и, конкретно, фрагменты FVIII-полипептидов, которые демонстрируют функциональную биологическую активность. Варианты FVIII-полипептидов по настоящему изобретению включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями, связанными с аминокислотными заменами, делециями или вставками. Варианты могут встречаться в природе, такие как аллельные варианты. Под аллельным вариантом подразумевают альтернативные формы гена, занимающего данный локус на хромосоме или в геноме организма или вируса. Genes II, Lewin, В., ed., John Wiley & Sons, New York (1985), включено в данный документ ссылкой. Полипептидные варианты могут содержать консервативные и неконсервативные аминокислотные замены, делеции или вставки. Производные FVIII-полипептидов по настоящему изобретению включают полипептиды, которые были изменены так, что они демонстрируют, например, дополнительные признаки, не обнаруженные в нативном полипепти- 5 038034 де. Примеры включают химерные белки. Аналог представляет собой другую форму FVIII-полипептвда по настоящему изобретению. Пример представляет собой про-белок, который может активироваться расщеплением про-белка с получением активного зрелого полипептида.

При использовании в данном документе, термин вектор относится к конструкту, сделанному из генетического материала (т.е. из нуклеиновых кислот). Как правило, вектор может представлять собой плазмиду, которая может содержать последовательность начала репликации, которая является функциональной в бактериальных клетках-хозяевах, например Eschericha coli, и маркеры селекции для детектирования бактериальных клеток-хозяев, содержащих плазмиду. Плазмиды по настоящему изобретению могут включать генетические элементы, как описано в данном документе, расположенные так, что вставленная кодирующая последовательность может транскрибироваться и транслироваться в эукариотических клетках. Кроме того, в то время как плазмида может включать последовательность из вирусной нуклеиновой кислоты, такие вирусные последовательности обычно не вызывают включения плазмиды в вирусную частицу, и плазмида, таким образом, не является вирусным вектором. В некоторых воплощениях, описанных в данном документе, плазмида представляет собой замкнутую циклическую ДНКмолекулу.

Термин экспрессия, как правило, относится к биологическому получению продукта, кодируемого кодирующей последовательностей. В большинстве случаев ДНК-последовательность, включающая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием матричной-РНК (мРНК). МатричнаяРНК транслируется с образованием полипептидного продукта, который обладает соответствующей биологической активностью. Кроме того, процесс экспрессии может включать дополнительные стадии процессирования до РНК-продукта транскрипции, такие как сплайсинг для удаления интронов, и/или посттрансляционный процессинг полипептидного продукта.

При использовании в данном документе подразумевается, что термин полипептид охватывает единственный полипептид, а также множество полипептидов и включает любую цепь или цепи из двух или более аминокислот. Таким образом, при использовании в данном документе, термины, включающие в частности пептид, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид может использоваться вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин дополнительно включает полипептиды, которые подвергались посттрансляционным модификациям, например, гликозилированию, ацетилированию, фосфорилированию, амидированию, модификации с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления или модификации с использованием синтетических аминокислот.

Также в виде полипептидов по настоящему изобретению включены фрагменты, производные, аналоги или варианты чужеродных полипептидов и любая их комбинация. Полипептиды и их фрагменты, производные, аналоги или варианты по настоящему изобретению могут представлять собой биологически функциональные полипептиды, родственные FVIII-полипептидам, которые используются для предотвращения или лечения, т.е. излечения, ослабления, уменьшения тяжести или предотвращения или уменьшения гемофилии А.

Оптимизация кодонов определяется как модификация последовательности нуклеиновых кислот для повышения экспрессии в клетках млекопитающего, представляющего интерес, например в клетках хомяка, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значительного количества кодонов нативной последовательности на кодоны, которые более часто или наиболее часто используются в генах данного млекопитающего или данного типа клеток. Различные виды и типы клеток могут демонстрировать конкретное смещение для некоторых кодонов конкретной аминокислоты.

Множество организмов демонстрируют смещение частоты использования конкретных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущей пептидной цепи. Предпочтение кодонов или смещение кодонов, различия в частоте использования кодонов между организмами предусмотрено вырожденностью генетического кода и хорошо описано для многих организмов. Смещение кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая в свою очередь, как считается, зависит, среди прочего, от свойств транслируемых кодонов и от способности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание селектированных тРНК в клетке, как правило, является отражением кодонов, используемых наиболее часто в пептидном синтезе. Соответственно, гены могут быть приспособлены для генной экспрессии в данном организме на основе оптимизации кодонов.

При условии большого количества генных последовательностей, доступных для широкого спектра вида животных, растений и микробов возможно рассчитать относительную частоту использования кодонов. Таблицы частоты использования кодонов легко доступны, например, в Базе Данных Применения Кодонов, доступной по адресу www.kazusa.or.jp/codon/ (посещали 19^-ого февраля, 2013), и эти таблицы могут быть адаптированы различными путями. См. Nakamura (20). Таблица частоты использования кодонов для человека, рассчитанной на основе данных GenBank, выпуск в виде простого файла 160.0 [Июнь 15 2007]. Эти таблицы используют номенклатуру мРНК и поэтому вместо тимина (Т), который присутствует в ДНК, в таблицах используется урацил (U), который присутствует в РНК. Таблицы были адаптированы так, что частоты рассчитаны для каждой аминокислоты, а не для всех 64 кодонов.

- 6 038034

При использовании этих похожих таблиц специалист в данной области может применять частоты к любой данной полипептидной последовательности и получать фрагмент нуклеиновой кислоты оптимизированного по кодонам кодирующего участка, который кодирует полипептид, но который использует кодоны, которые более оптимальны для данного вида. Кодирующие участки с оптимизированными кодонами могут быть сконструированы с помощью различных методов.

В одном методе, называемом единообразной оптимизацией, таблица частоты использования кодонов используется для обнаружения единственного наиболее частого кодона, используемого для любой данной аминокислоты, и этот кодон используется каждый раз, когда конкретная аминокислота появляется в полипептидной последовательности. В другом методе, называемом полная оптимизация, фактические частоты кодонов распределены случайно по кодирующему участку. Таким образом, используя метод для оптимизации, если гипотетическая полипептидная последовательность содержит 100 остатков лейцина, то в отношении частоты использования у людей примерно 7 или 7% кодонов лейцина будет представлять собой UUA, примерно 13, или 13% кодонов лейцина будет представлять собой UUG, примерно 13 или 13% кодонов лейцина будет представлять собой CUU, примерно 20 или 20% кодонов лейцина будет представлять собой CUC, примерно 7 или 7% кодонов лейцина будет представлять собой CUA, и примерно 41 или 41% кодонов лейцина будет представлять собой CUG. Эти частоты будут распределены случайно среди кодонов лейцина в кодирующем участке, который кодирует гипотетический полипептид. Специалистам в данной области будет понятно, что распределение кодонов в последовательности может варьироваться значительно при использовании данного метода, однако всегда будет кодироваться один и тот же полипептид.

В использовании метода полной оптимизации цельная полипептидная последовательность или ее фрагмент, вариант или производное оптимизированы по кодонам с помощью любого из методов, описанных в данном документе. Различные целевые фрагменты или производные конструируются, и каждый затем оптимизируется по кодонам индивидуально. Альтернативно, полноразмерная полипептидная последовательность оптимизируется по кодонам для данного вида, приводя в результате к получению оптимизированного по кодонам кодирующего участка, который кодирует цельный полипептид, и затем фрагменты нуклеиновой кислоты оптимизированного по кодонам участка, который кодирует фрагменты, варианты и производные полипептида, получают из исходного кодирующего участка с оптимизированными кодонами. Специалисту в данной области хорошо понятно, что если кодоны случайно подставлялись в полноразмерный кодирующий участок на основе их частоты использования в данном виде, то фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие фрагменты, варианты и производные, необязательно будут полностью оптимизированы по кодонам для данного вида. Однако такие последовательности все равно более близки к частоте использования кодонов целевых видов, чем нативная частота использования кодонов. Преимущество такого способа состоит в том, что синтез оптимизированных по кодонам фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих каждый фрагмент, вариант и производное данного полипептида, хотя и является стандартным, он будет затратным по времени и будет приводить к значительному удорожанию.

Также как для in vitro применения с целью получения промышленных количеств rFVIII и его вариантов, таких как варианты с делетированным В-доменом для использования в терапии, настоящее изобретение также может применяться для экспрессии rFVIII, как описано в данном документе in vivo для потенциального применения в генной терапии пациентов с гемофилией.

Подробное описание

Далее настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью примеров со ссылкой на чертежи, которые демонстрируют:

фиг. 1 (см., также SEQ ID NO: 3) демонстрирует предпочтительную аминокислотную последовательность FVIII с делетированным В-доменом для применения в настоящем изобретении;

фиг. 2 (см., также SEQ ID NO: 1) демонстрирует нуклеиновую последовательность с оптимизированными кодонами, кодирующую аминокислотную последовательность FVIII с делетированным Вдоменом, представленную на фиг. 1, для экспрессии в клетках хомяка; и фиг. 3: (a-f) демонстрирует результаты экспериментов, касающихся жизнеспособности клеток после экспрессии FVIII индивидуально или совместно с VWF. Клетки СНО DG44 трансфицировали указанными ДНК-конструктами. Продемонстрирован процент жизнеспособности трансфицированных клеток, а также продемонстрирован контроль без трансфекции ДНК. Селекцию (G418 или зеоцин) инициировали через 48 ч после трансфекции.

Примеры

Введение

Клеточная линия СНО DG44 представляет собой дефицитную по дигидрофолат редуктазе (DHFR) клеточную линию, адаптированную для роста в виде суспензионной культуры. p571_BDDFVIIIcoop представляет собой экспрессирующий вектор (11), содержащий экспрессирующие кассеты для гена Neo, придающего устойчивость к антибиотику женетецин (G418); DHFR, позволяющего DHFR-клеткам расти в отсутствии гипоксантина и тимидина; и BDDFVIIIcoop, позволяющий экспрессию человеческого FVIII с делетированным В-доменом. Ранее мы трансфицировали клетки СНО тем же вектором, содержащим не

- 7 038034 оптимизированные по кодонам последовательности hFVIII и hBDDFVIII, и повторно получали стабильно трансфицированные клональные клеточные линии, несмотря на плохие характеристики экспрессии (не опубликовано и 12, 13). pcDNA3.1Zeo_VWFcoop базируется на экспрессирующем векторе, содержащем кассету для гена Zeo, придающего устойчивость к антибиотику Зеоцин http://www.lifetechnologies.Com/1/1/10790-pcdna3-1-zeo-mammalian-expression-vector.html, и на VWFcoop, дающем возможность экспрессии человеческого VWF.

Материалы и методы

ДНК-конструкты

ДНК-последовательности с оптимизированными кодонами для экспрессии в клетках хомяка, кодирующие человеческий BDDFVIII и VWF, получали путем анализа кДНК-последовательности BDDFVIII SQ (Sanberg et al. (22)) и эталонной последовательности VWF (NP_000543.2), и адаптацию частоты использования кодонов к смещению Cricetulus griseus с использованием индекса адаптации кодонов осуществляли с помощью GeneArt (GeneArt AG) с использованием программного обеспечения GeneOptimizer их собственной разработки. Последовательность вариантов нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами человеческого BDD FVIII и VWF для экспрессии в клетках СНО идентифицировали в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Соответствующие аминокислотные последовательности для BDD FVIII и VWF продемонстрированы в SEQ ID NOS: 3 и 4, соответственно. Оптимизация также удаляла последовательности cis-действующих мотивов, включая внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты входа в рибосому, AT- или GC-богатые протяженные последовательности, AU-богатые элементы, ингибирующие и cis-действующие элементы последовательностей репрессоров, последовательности повторов, вторичные структуры РНК и все предполагаемые сайты сплайсинга. Оптимизированные гены BDDFVIIIcoop и VWFcoop синтезировали и клонировали в плазмиды р571 (pNeoIG502; Kemball-Cook et al. (11), соответственно. Каждый конструкт полностью секвенировали перед использованием (Source BioScience UK Ltd).

Трансфекция и селекция клеток СНО

Клетки СНО DG44 получали из Life Technologies. Клетки поддерживали в среде CD DG44 с добавлением 8 ммоль/Л глутамина и 0,1% плюроника F-68 (Life Technologies) при 37°С, 5% CO2 на круговом шейкере (120 об./мин.). Клетки СНО DG44 с жизнеспособностью >95% использовали во всех трансфекциях. 18 мкг линеаризованной плазмидной ДНК использовали в каждой трансфекции. Клетки трансфицировали с использованием реагента Freestyle MAX согласно инструкциям производителя (Life Technologies). Вкратце, 18 μл плазмидной ДНК и 15 μл реагента Freestyle MAX в среде OptiPRO SFM инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы дать возможность образования комплексов ДНК-липид. Комплекс затем переносили в 125-мл флакон, содержащий 30 мл клеток (0,5x106 клеток/мл) и инкубировали при 37°С, 5% CO2 в инкубаторе на круговом шейкере (120 об./мин.). Через 48 ч после трансфекции к культуре добавляли либо G418 (250 μг/мл), либо зеоцин (200 μг/мл) для селекции BDDFVIIIcoop или VWFcoop, соответственно. Подсчет клеток (всех и не жизнеспособных) осуществляли каждые 3-4 дня с использованием Nucleocounter согласно инструкциям производителя (Sartorius Stedim).

Анализ ПЦР

Клетки анализировали с помощью анализа ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для амплификации ампликонов, с получением перекрывающихся фрагментов по всей кодирующей последовательности и стыковкам вектора с кДНК. Вкратце, 100 μл клеток (2,97x105 клеток) собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в 75 μл реагента щелочного лизиса (25 мМ NaOH, 0,2 мМ EDTA рН 12), и инкубировали при 95°С в течение 30 мин перед добавлением 75 μл нейтрализующего реагента (40мМ TRIS рН 5). Реакции ПЦР осуществляли с использованием 1 μл экстрагированной ДНК в качестве матрицы, мастер-микса ПЦР (Promega), 1 μмоль/л 5'- и 3'олигонуклеотидных праймеров (Sigma Genosys) с использованием программы ПЦР: 95°С, 3 мин; 95°С, 30 с; 55°С, 30 с; 72°С 60 с с повторением в течением 30 циклов и в конце 72°С, 10 мин. Фрагменты ПЦР анализировали с помощью электрофореза на агарозном геле.

Измерение FVIII

Активность кофактора образцов среды оценивали с использованием Biophen FVIII:C Хромогенного анализа (Quadratech Diagnostics) согласно инструкциям производителя. Стандартную кривую строили с использованием последовательных разведений 1:2 плазма-калибратора (Biophen; Quadratech Diagnostics). Стандарты и образцы оценивали в дубликатах.

Результаты

Клетки СНО DG44 трансфицировали линеаризованной плазмидной ДНК каждой из (p571_BDDFVIIIcoop или pcDNA3.1Zeo_VWFcoop) и культивировали в течение 48 ч, после чего начинали селекцию стабильно трансфицированных клеток путем добавления подходящего антибиотика для селекции (G418 (женетецин) для BDDFVIIIcoop и зеоцин для VWFcoop). Подсчет клеток осуществляли каждые 3-4 дня для определения жизнеспособности клеток (фиг. 3А).

Клетки СНО DG44, не трансфицированные p571_BDDFVIIIcoop, были чувствительны к G418, и

- 8 038034 жизнеспособность клеток составляла ноль через 14 дней селекции, что прогнозировалось на основе результатов теста чувствительности к G418, который осуществляли на нетрансфицированных клетках СНО DG44. Большинство клеток в клеточной культуре, трансфицированной с использованием P571_BDDFVIIIcooP, также были чувствительны к G418, демонстрируя как нетрансфицированные клетки, так и клетки, в которых отсутствовала стабильная интеграция. По сравнению с нетрансфицированным контролем жизнеспособность клеток р571_BDDFVШcoop-трансфицированной культуры оставалась выше нуля, предполагая присутствие стабильно трансфицированных клеток. Однако на 41 день жизнеспособность падала до нуля (фиг. 3А). Данный эксперимент повторяли еще два раза и в обоих случаях наблюдали аналогичный профиль (фиг. 3В и 3С). В каждом из этих трех случаев не получали стабильных трансфектантов. ДНК, полученные из клеток через 38 дней после трансфекции, были положительными согласно ПЦР для последовательности p571_BDDFVIIIcoop. Следовательно, клетки СНО DG44 были успешно трансфицированы экспрессирующим вектором, что очевидно по устойчивости к G418 при концентрации, которая убивает нетрансфицированные клетки, и по положительному результату ПЦР для экспрессирующей кассеты. Неспособность получить стабильные жизнеспособные трансфектанты оказалась неожиданной, и может быть связана с высоким уровнем экспрессии BDDFVIIIcoop, приводящим к апоптозу.

Клетки СНО DG44, не трансфицированные p571_BDDFVIIIcoop, были чувствительны к Зеоцину, и жизнеспособность клеток составляла ноль через 14 дней селекции, что прогнозировалось на основе результатов теста чувствительности к Зеоцину, который осуществляли на нетрансфицированных клетках СНО DG44. Большинство клеток в клеточной культуре, трансфицированной с использованием pcDNA3.1Zeo_VWFcoop, также были чувствительны к Зеоцину, демонстрируя как нетрансфицированные клетки, так и клетки, в которых отсутствовала стабильная интеграция. По сравнению с нетрансфицированным контролем жизнеспособность клеток pcDNA3.1Zeo_VWFcoop-трансфицированной культуры оставалась выше нуля, предполагая присутствие стабильно трансфицированных клеток. Жизнеспособность клеток быстро восстанавливалась и через 23 дня после трансфекции 97% культуры было жизнеспособно (фиг. 3D). Жизнеспособные растущие культуры этих клеток были получены, и с помощью ПЦР продемонстрировали, что они содержат цельную VWFcoop-экспрессирующую кассету.

Клетки СНО DG44, стабильно трансфицированные pcDNA3.1Zeo_VWFcoop, затем трансфицировали p571_BDDFVIIIcoop. Клетки СНО DG44, не трансфицированные p571_BDDFVIIIcoop, были чувствительны к G418, и жизнеспособность клеток составляла ноль через 15-17 дней селекции, что прогнозировалось на основе результатов теста чувствительности к G418, который осуществляли на нетрансфицированных клетках СНО DG44. Большинство клеток в клеточной культуре, трансфицированной с использованием p571_BDDFVIIIcoop, также были чувствительны к G418, демонстрируя как нетрансфицированные клетки, так и клетки, в которых отсутствовала стабильная интеграция. По сравнению с нетрансфицированными контрольными клетками и ранее трансфицированными СНО DG44 с использованием p571_BDDFVIIIcoop, жизнеспособность культуры СНО DG44_pcDNA3.1Zeo_VWFcoop, трансфицированной p571_BDDFVIIIcoop, оставалась выше нуля, предполагая присутствие стабильно трансфицированных клеток. Жизнеспособность клеток быстро восстанавливалась, и через 27 дней после трансфекции >97% культуры было жизнеспособно (фиг. 3Е). Трансфекцию повторяли и получали аналогичные результаты (фиг. 3F). В обоих этих случаях растущие культуры этих клеток были получены, и с помощью ПЦР было продемонстрировано, что они содержат цельные экспрессирующие кассеты BDDFVIIIcoop и VWFCOOP. Эти поликлональные клеточные популяции затем оценивали на предмет экспрессию среднего уровня 0,003 пг/на клетку/в день перед амплификацией с метотрексатом. Уровень активности полученного материала также анализировали (с использованием хромогенного анализа FVIII:C и плазмакалибратора Biophen), обнаружив, что большинство полученного материала было биологически активно.

Эти поликлональные клетки затем подвергали процедуре клональной селекции, состоящей из: получения 30 мл культуры клеток до количества клеток 1х10⁶клеток/мл;

разведения клеток с помощью последовательного 10-кратного разведения до концентрации < 0,05 клеток/мл в среде OptiCHO (LifeTech);

высевания 0,2 мл этих клеток в стерильные 9б-луночные планшеты Edge Plate (Thermo Scientific Nunc).

Испарение среды из периметра лунок микропланшета является существенной проблемой, особенно когда клетки растут в течение >3 дней. По мере того, как среда испаряется с течением времени (даже в увлажняемой среде), концентрация компонентов среды изменяется, влияя на клеточный рост и производительность. Традиционный способ решения этой проблемы - это заполнить лунки стерильной водой или PBS. Альтернативой является применение Nunc Edge 96-луночных планшетов, которые имеют емкость, окружающую внешнюю область планшета, которая может быть заполнена стерильной водой, предотвращая испарение из внутренних лунок. В данном случае могут использоваться все 96 лунок.

Планшеты затем спокойно инкубировали в течение 10-14 дней в 37°С, 5% СО₂ инкубаторе без встряхивания.

Растущие клетки переносили из 96-луночных планшетов в 24-луночные планшеты с помощью пипетирования клеток вверх и вниз, перенося все содержимое одной лунки в единственную лунку 24- 9 038034 луночного планшета, содержащего 1 мл свежей полной среды OptiCHO.

Среду затем анализировали на FVШ-антиген и на активность с помощью стандартных процедур.

Тест на микоплазму проводили постоянно.

Эта процедура привела к выделению трех клеточных линий, экспрессирующих rhFVIII в количестве

0,03-4 пг/на клетку/в день.

Поликлональные популяции клеток, полученные в данном процессе, затем подвергали метотрексатной амплификаци (начиная от 0,2 μM МТХ и повышая на 0,1 μM на каждой стадии) для повышения количества копий rhFVШ-экспрессирующей кассеты. Продуктивность клеток оценивали постоянно с помощью вышеописанных способов. У клеток, амплифицированных до уровня 0,5 μM МТХ, повышалась продуктивность rhFVIII. За границей этого уровня МТХ продуктивность rhFVIII резко падала. Поликлональные клетки, полученные на данной стадии, экспрессировали rhFVIII в количестве >0,1 пг/на клетку/в день.

Эти поликлональные клетки могут подвергаться процедуре клональной селекции, как описано выше. Это приведет к выделению клеточных линий, экспрессирующих rhFVIII на повышенном уровне, возможно составляющем 0,3-0,4 пг/на клетку/в день.

Список литературы

1. Zhang et al Nat. Genet. (2003) 34: 220-225

2. Zhang et al J. Biol. Chem. (2005) 280: 25881-25886

3. Pipe, Haemophilia (2009) 15: 1187-1196

4. Pittman, et al Blood (1994) 84: 4214-4225

5. Malhotra et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008) 105:

18525-18530

6. Kaufman et al, J. Biol. Chem. (1988) 263: 6352-6362 and USJ, 198, 349

7. Miao et al, Blood (2004) 103: 3412-3419

8. Ward et al,,Blood (2011) 117:798-807

9. Marin, Biotechnol J. (2008) 3: 1047-1057

10. Tsai et al, J. Mol. Biol. (2008) 383: 281-291

11. Kemball-Cook et al, Gene (1994) 139: 275-279

12. David et a,1 J Thromb Haemost (2003) 1: 139-146

13. David et al, B.J. Haem. (2001)113;604-615

14. Wise et al, JBiolChem (1991)266, 21948-21955

15. Kolind et al, JBiotec (2011) 151, 357-362)

16. Spencer et al, Molecular Therapy (2011), 19/2, 302-309.

17. Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. (1982)159, 601-621)

18. Lorimer D, Raymond A, Walchli J, Mixon M, Barrow A, Wallace E, Grice R, Burgin A, Stewart L., BMC Biotechnol. 2009 9:36)

19. Bowie, et al., Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247:1306-1310 (1990) .

20. Nakamura, Y., et al. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).

21. Davis LGG et al., Basic Methods in Molecular Biology, (2^nd Ed., McGraw-Hill, 1995).

22. Sanberg et al (2001) Thromb Haemost 85, 93-100.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения стабильной рекомбинантной клетки млекопитающего, экспрессирующей VWF одновременно с FVIII или его вариантом FVIII с делетированным В-доменом in vitro, включающий обеспечение клетки млекопитающего, трансфекцию клетки вектором, способным рекомбинантно экспрессировать VWF, и затем последующую трансфекцию клеток, трансфицированных VWF, вектором, способным рекомбинантно экспрессировать FVIII или вариант FVIII с делетированным В-доменом, причем указанные векторы содержат конструкты нуклеиновых кислот, оптимизированные по кодонам.
2. Способ п.1, включающий добавление метотрексата к культуральной среде в концентрации до 0,5 мкМ.
3. Стабильная рекомбинантная клетка млекопитающего, получаемая способом по п.1 или 2, которая способна к экспрессии VWF одновременно с FVIII млекопитающего или его вариантом с делетированным В-доменом in vitro.
4. Клетка млекопитающего по п.3, где FVIII млекопитающего представляет собой человеческий FVIII или вариант человеческого FVIII с делетированным В-доменом.
5. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где клетка представляет собой клетку 293, СНО, 3T3, BHK, MICK, Varo, Junket или клетку HeLa, а также производные таких клеток, известные в данной области.
6. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где FVIII млекопитающего представляет собой человеческий FVIII или вариант человеческого FVIII с делетированным В-доменом, оптимизированные по кодонам для хомяка, и клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО или BHK.
7. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пп.4-6, где аминокислотная последовательность FVIII представляет собой последовательность FVIII, из которой был делетирован В-домен и необязательно замененный на короткий спейсерный В-домен, богатый аспарагин-связанными олигосахаридами.
8. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где аминокислотная последовательность FVIII представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.
9. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FVIII млекопитающего по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.
10. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где аминокислотная последовательность VWF представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
11. Клетка млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, где аминокислотная последовательность VWF представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.
12. Клеточная культура, содержащая клетку млекопитающего по любому из предыдущих пунктов, которая способна экспрессировать FVIII в количестве >0,1 пг/на клетку/в день.
13. Способ получения рекомбинантного FVIII млекопитающего или его варианта с делетированным В-доменом, либо комплекса, содержащего указанные FVIII и его вариант, причем способ включает культивирование клетки по любому из пп.-11, выделение и очистку указанных FVIII и его варианта из клетки и/или культуральной среды.