EA036889B1 - Биомаркеры ответа на ингибиторы ezh2 - Google Patents

Abstract

Описываемый в настоящем документе объект изобретения относится к применению одного или более биомаркеров для оценки вероятности того, что ингибитор EZH2 проявит противоопухолевое действие у индивидуума. Он основан, по меньшей мере частично, на открытии, что потеря ВАР1 приводит к возрастанию уровня экспрессии и активности EZH2. В конкретном неограничивающем варианте осуществления способ включает получение у индивидуума образца злокачественной опухоли и определение в образце уровня экспрессии биомаркера ВАР1, где, если биомаркер ВАР1 отсутствует или экспрессируется в злокачественной опухоли на более низком уровне по сравнению с эталонным контрольным уровнем, проводят введение терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 для получения противоопухолевого действия.

Description

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США с серийным номером 62/014594, зарегистрированной 19 июня 2014 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Информация о грантах

Настоящее изобретение сделано с поддержкой правительства США в виде гранта № F31CA18064201, выданного национальным институтом здравоохранения США. Правительство США обладает определенными правами на это изобретение.

Введение

Настоящее изобретение относится к биомаркерам, которые можно использовать для оценки вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия у индивидуума. По существу, эти биомаркеры можно использовать в способах лечения пациентов со злокачественными опухолями.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Ассоциированный с BRCA1 белок 1 (ВАР1) представляет собой карбоксиконцевую гидролазу убиквитина, которая вовлечена в удаление убиквитина из белков. ВАР1, связывается с белком чувствительности к раку молочной железы типа 1 (BRCA1) через домен RING цинковых пальцев BRCA1 и может действовать в качестве опухолевого супрессора. ВАР1 вовлечен в регуляцию транскрипции, регуляцию клеточного цикла и роста, ответ на повреждение ДНК и динамики хроматина. Исследования по секвенированию генома показали, что мутации ВАР1 в зародышевой линии могут быть ассоциированы с синдромом предрасположенности к опухолям (TPDS), который включает повышенный риск злокачественных опухолей, включая злокачественную мезотелиому, увеальную меланому и кожную меланому. Дополнительные исследования выявили мутации ВАР1 в зародышевой линии, ассоциированные с другими злокачественными опухолями, включая аденокарциному легких и почечноклеточную карциному. Для некоторых пациентов с мутациями ВАР1 прогноз является в значительной степени плохим с отсутствием установленного эффективного лечения, так как многие пациенты со злокачественной мезотелиомой умирают вследствие их заболевания. Мутации ВАР1 у пациентов с почечноклеточной карциномой определяют неблагоприятный прогноз, а мутации ВАР1 у пациентов с увеальной меланомой определяют группу высокого риска и метастазирование.

Энхансер гомолога zeste 2 (EZH2) является представителем семейства группы поликомб (PcG), представители которого вовлечены в регуляцию транскрипционного состояния генов посредством метилирования гистоновых белков. Разработаны лекарственные средства, которые специфически направлены к EZH2, и действие таких лекарственных средств у пациентов с рядом опухолей являлось активной областью исследований. В настоящее время ингибиторы EZH2 проходят клиническое тестирование у пациентов, страдающих лимфомой с активирующими EZH2 мутациями. Таким образом, в данной области существует необходимость в средствах лечения пациентов с мутациями ВАР1 и биомаркерах, которые пригодны для определения того, когда для лечения злокачественной опухоли следует применять ингибитор EZH2.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к использованию одного или более биомаркеров для оценки вероятности того, что ингибитор EZH2 проявит противоопухолевое действие у индивидуума. Оно, по меньшей мере частично, основано на открытии, что потеря активности ВАР1 приводит к повышению уровня экспрессии и активности EZH2.

Таким образом, в неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам и наборам для анализа для определения присутствия в образце, полученном у пациента, одного или более биомаркеров, например биомаркеров ВАР1, и к способам использования таких определений для выбора схемы лечения пациента со злокачественной опухолью, и к способам лечения пациентов со злокачественными опухолями.

Настоящее изобретение относится к способу определения возможности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия при злокачественной опухоли. В неограничивающем варианте осуществления способ включает определение экспрессии биомаркера ВАР1 в одной или более клетках злокачественной опухоли, где, если биомаркер ВАР1 в злокачественной опухоли отсутствует или экспрессирован на низких уровнях по сравнению с эталонным контрольным уровнем, для обеспечения противоопухолевого действия вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EZH2. В определенных неограничивающих вариантах осуществления экспрессию биомаркера ВАР1 можно определять посредством иммунофлуоресценции, вестерн-блоттинга, гибридизации in situ или полимеразной цепной реакции. В определенных вариантах осуществления способ может дополнительно включать определение в образце уровня экспрессии EZH2, SUZ12 и/или L3MBTL2.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения индивидуума со злокачественной опухолью. В определенных неограничивающих вариантах осуществления способ включает получение у индивидуума образца злокачественной опухоли и определение в образце уровня экспрессии биомаркера ВАР1 и/или уровня экспрессии EZH2 и/или SUZ12, где, если биомаркер ВАР1 отсутствует или экспрессирован на более низком уровне, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, и/или если экс

- 1 036889 прессия EZH2 и/или SUZ12 увеличена по сравнению с эталонными контрольными уровнями EZH2 и/или SUZ12, начинают лечение индивидуума терапевтически эффективным количеством ингибитора EZH2.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения вероятности проявления противоопухолевого действия ингибитором EZH2 в злокачественной опухоли. В неограничивающем варианте осуществления способ включает получение у индивидуума образца злокачественной опухоли и определение в образце уровня экспрессии биомаркера ВАР1, где, если биомаркер ВАР1 в злокачественной опухоли отсутствует или экспрессируется на более низком уровне по сравнению с эталонным контрольным уровнем, ингибитор EZH2 с большей вероятностью окажет противоопухолевое действие на злокачественную опухоль. В определенных вариантах осуществления биомаркер ВАР1 представляет собой биомаркер в виде белка ВАР1. В определенных вариантах осуществления биомаркер ВАР1 представляет собой биомаркер в виде нуклеиновой кислоты ВАР1.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу прогноза чувствительности злокачественной опухоли пациента к ингибитору EZH2. В неограничивающем варианте осуществления способ включает получение у пациента образца злокачественной опухоли и определение уровня экспрессии биомаркера белка ВАР1 в клетках, составляющих образец, где, если биомаркер ВАР1 отсутствует или обладает сниженным уровнем экспрессии по сравнению с эталонным контрольным уровнем, делают прогноз, что злокачественная опухоль чувствительна к ингибитору EZH2.

В определенных вариантах осуществления злокачественная опухоль может представлять собой злокачественную мезотелиому, увеальную меланому, почечноклеточную карциному, кожную меланому, рак легких, рак молочной железы, рак яичника, не являющийся меланомой рак кожи, менингиому, холангиокарциному, лейомиосаркому, нейроэндокринные опухоли, рак поджелудочной железы, параганглиому, злокачественные фиброзную гистиоцитому, меланоцитарные атипичные интрадермальные опухоли с мутантным ВАР1 (MBAIT), острый миелолейкоз, миелодиспластические синдромы или рак мочевого пузыря.

Настоящее изобретение относится к набору определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия при злокачественной опухоли. В неограничивающем варианте осуществления набор содержит средства определения биомаркера ВАР1. В определенных вариантах осуществления средства детекции биомаркера ВАР1 включают один или более комплектных праймеров, зондов, панелей/микропанелей, специфичные к биомаркерам антитела и/или гранулы. В определенных вариантах осуществления средства детекции биомаркера ВАР1 включают одно или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов для детекции биомаркера ВАР1. В определенных вариантах осуществления набор дополнительно содержит один или более праймеров, зондов, панели/микропанели, специфичные к биомаркерам антитела и/или гранулы для детекции экспрессии EZH2 и/или SUZ12.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - повышенная экспрессия гистона H3K27me3 при снижении ВАР1 in vitro.

Фиг. 2 - EZH2 сверхэкспрессирован в клетках мезотелиомы с мутантным ВАР1.

Фиг. 3 - повышение/снижение экспрессии ВАР1 приводило к измененной экспрессии субъединицы PRC2.

Фиг. 4 - ингибирование EZH2 уменьшало объем опухоли у ксенотрансплантатов мезотелиомы.

Фиг. 5a-l - характеристика условной делеции BAP1 в гемопоэтических клетках.

(а) Средняя экспрессия генов ВАР1, ASXL1, ASXL2 и ASXL3 при AML (острый миелолейкоз) по TCGA и (b) у пациентов с мезотелиомой, выражаемая в виде математического среднего со стандартной ошибкой количества нормализованных прочтений. (с) Экспрессия BAP1 при кПЦР-РВ в очищенных популяциях гемопоэтических клеток мышей С57/В6Н. LT-HSC, долгосрочные гемопоэтические стволовые клетки (HSC), (Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-); ST-HSC, краткосрочные HSC (Lin^-Sca-1⁺cKit⁺CD150⁺CD48⁺); MPP, плюрипотентный предшественник, (LrnSca-1⁺c-Kit⁺CD150^-CD48⁺); LSK, Lin Sca-1⁺c-Kit⁺; MP, миелоидные предшественники (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺), GMP, гранулоцитарномакрофагальные предшественники (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺ CD34'Fcy'); CMP, общие миелоидные предшественники (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺ CD34⁺Fcy¹°); МЕР; макрофагально-эритроидные предшественники (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺ CD34-FCY^-), MONO; моноциты (Mac1⁺Gr1^-), PMN; (полиморфноядерный нейтрофил, Mac1⁺Gr1⁺), Тклетки, CD3⁺ и В-клетки, В220+. (d) Схема направленного воздействия на BAP1 в эмбриональных стволовых клетках мышей, полученная из консорциума EUCOMM. После получения химер мышей скрещивали с трансгенными мышами FLPE для вырезания кассеты с преждевременным стоп-сигналом. Затем мышей скрещивали с трансгенными по Mx1-Cre мышами. Системы генотипирования, подтверждающие генотип и вырезание через 4 недели после обработки поли-1-поли-С (pIpC). (e) Подсчет лейкоцитов периферической крови у контрольных мышей и мышей с КО BAP1 после обработки (pIpC) с индукцией вырезания и (f) подсчет миелоидных клеток (Mac1⁺Gr1⁺) посредством проточной цитометрии. (g) Гематокрит в процентах в периферической крови и (h) подсчет предшественников эритроцитов (CD71⁺Ter119⁺) посредством проточной цитометрии в костном мозге контрольных мышей и мышей с КО BAP1 после индуцированного pIpC вырезания. (i) Относительные частоты популяций миелоидных предшественников в костном мозге контрольных мышей и мышей с КО BAP1 (Lin^-c-Kit⁺Sca1^-). Окна для

- 2 036889 клеток получали на живых линейно-негативных популяциях. (j) Относительный количественный анализ популяций предшественников миелоидных клеток костного мозга (GMP, СМР, МЕР) у контрольных мышей и мышей с КО BAP1. (k) Диаграммы проточной цитометрии для контрольных животных и животные с анализируемым костным мозгом из примера для демонстрации размножения предшественников и GMP. (l) Подсчет проходящих цикл клеток-предшественников (краситель Ki67/DAPI) посредством проточной цитометрии; для всех экспериментов n=5 для мышей CON (контрольных) и n=8 для мышей с КО BAP1.

Фиг. 6a-l. Делеция BAP1 приводит к активации отличного по сравнению с потерей Asxl1 метаболического пути и к увеличению H3K27me3. (а) Изображения селезенки через три недели после условной делеции BAP1 и подтверждение делеции BAP1 в костном мозге контрольных мышей (однопометные мыши BAP1f/f, CON) и мышей с нокаутом BAP1 (мыши BAP1f/f с Mx1-Cre, КО BAP1) посредством вестерн-блоттинга. (b) Диаграммы Венна со сравнением экспрессии генов миелоидных предшественников у мышей с КО BAP1 и Asxl1, р<0,05; сравнения включают перекрытие генов и гены, изменяющиеся в одном направлении. (с) Количественная кПЦР с детекцией в реальном времени (кПЦР-РВ) кластера HoxA в отсортированных гранулоцитарно-макрофагальные предшественниках (GMP; Lin^-c-Kit⁺Sca1^- CD34⁺ Fcy⁺) у мышей с КО BAP1 и у контрольных мышей (n=3). (d) Масс-спектроскопический анализ очищенных гистонов из обогащенных c-Kit⁺ клеток костного мозга мышей с КО BAP1 и контрольных мышей, нормализованных по общему количеству гистона H3. (е) Вестерн-блоттинг H3K27me3 и общего количества H3 для очищенных гистонов из костного мозга мышей с КО BAP1 и контрольных мышей. (f) Количество широких доменов H3K27me3, которые определяют в образцах CON и КО BAP1. Диаграмма Венна, демонстрирующая уникальный и перекрывающийся широкий домен. (g) Диаграмма размаха, демонстрирующая нормализованные прочтения H3K27me3 в обогащенных c-Kit клетках костного мозга (n=2). (h) Построение плотности широких доменов как функции от расстояния от домена H3K27me3, который определен в образцах CON и КО BAP1. (i) GSEA, демонстрирующий корреляции экспрессии генов с ингибированными генами. (j) Локальная диаграмма ChIP-seq H3K27me3 в локусе НОХА. (k) Определение пиков в ChIP-Seq H3K27me3 в отсортированных клетках GMP, представлено в виде вулканной диаграммы, представленной отношением (КО/CON) в зависимости от значения р. (l) Значимость профилей экспрессии указанных генов для генов, связанных с H3K27me3, и RNA-Seq. Статистику рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента; *р<0,05, **р<0,005; приведены значения ±SEM.

Фиг. 7а-с. Потери BAP1 и Asxl1 приводят к противоположно направленным изменениям экспрессии генов. (а) Данные RNA-Seq дифференциально экспрессируемых генов гранулоцитарномакрофагальных предшественников контрольных мышей в сравнении с мышами с КО BAP1 (GMPs; Lin c-Kit⁺Sca1^- CD34+ Fcy⁺); клетки, анализируемые с использованием DESeq2 (порог значения p р<0,05). На тепловой карте приведены гены с повышенной (красный) и сниженной (синий) экспрессией. (b) Количество позитивно и негативно обогащенных наборов генов после анализа GSEA КО BAP1 и КО Asxl1 с FDR<0,25 (сверху). Диаграмма Венна, на которой приведены наборы генов, разнонаправленно обогащенных в миелоидных предшественниках при КО BAP1 и КО Asxl1 по данным RNA-Seq (снизу). (с) GSEA разнонаправленно обогащенных и статистически значимых наборов генов кластера HoxA в клетках-предшественниках с КО Bap1 и КО Asxl1. Значения p и значения FDR указаны.

Фиг. 8а-с. Делеция BAP1 увеличивает активность PRC2. (а) ELISA H3K27me3, нормализованного на общее количество H3, для гистонов, очищенных из клеток костного мозга мышей КО BAP1 и контрольных мышей. (b) Процент широких доменов H3K27me3, выявляемых в отношении участка старта транскрипции гена (промотор, экзон, интрон, расположенная ниже последовательность (±2 т.п.н.), дистальная последовательность (2-5 т.п.н.) и межгенная последовательность (>50 т.п.н.)). (с) Опубликованное RNA-Seq отсортированных популяций костного мозга (Lara-Astiaso et al., 2014) анализировали и сравнивали с генами, которые дифференциально ингибированы и маркированы H3K27me3 после потери BAP1, анализировали с использованием GSEA. Гены, которые ингибированы и маркированы H3K27me3 только коррелировали с популяциями предшественников гемопоэза, полагая, что они могут являться подходящими популяциями-мишенями. Эти данные объясняют размножение предшественников, наблюдаемое в модели на мышах с КО BAP1.

Фиг. 9а-с. Изменения ВАР1 in vitro приводят к изменениям H3K27me3. (а) Вестерн-блоттинг клеток SET2, трансдуцированных двумя независимыми кшРНК ВАР1, выявляющими уровни H3K27me3 в очищенных гистонах и нокдаун ВАР1 из экстракта цельных клеток. (b) Анализ метилцеллюлозы с использованием клеток костного мозга контролей и КО BAP1. Конструкции кДНК ВАР1 обратно вводили в контрольные клетки и клетки с делецией BAP1. Проводили анализы ELISA гистонов на H3K27me3. Количественная кПЦР для оценки экспрессии конструкции ВАР1. (с) Обратное введение ВАР1 и мутанта деубиквитиназы ВАР1 С91А в клетки мышей с недостаточностью BAP1. Проводили вестерн-блоттинг гистонов на H3K27me3 и общий H3. Количественная кПЦР для демонстрации уровней экспрессии конструкций.

Фиг. 10a-d. Характеристика мышей с составным КО BAP1/Ezh2. (а) Патология костного мозга для различных генотипов BAP1/Ezh2. (b) Окрашивание на эритроидные клетки при проточной цитометрии

- 3 036889 для указанных генотипов (CD71, Ter119) и количественный анализ. (I-IV) являются указателями стадий эритроидной дифференцировки, где I являются наиболее незрелыми, а IV являются наиболее зрелыми. Количественное определение этих фенотипов справа от типичных диаграмм проточной цитометрии. (с) Размеры селезенки для указанных генотипов через 4 недели после pIpC. (d) Количества лейкоцитов для указанных генотипов через 4 недели после pIpC.

Фиг. Па-k. Пролиферация, индуцируемая делецией BAP1, снижается при потере Ezh2. (а) Вестернблоттинг уровней H3K27me3 в гистонах, очищенных из костного мозга мышей с КО BAP1, КО Ezh2, КО BAP1/Ezh2 и контрольных мышей. (b) Характерные изображения селезенки и (с) подсчет массы селезенки для указанных генотипов мышей, 3 недели после pIpC. (d) Количества периферических лейкоцитов и (е) гематокрит в процентах, как количественно определяют посредством Hemavet. (f) Подсчет посредством проточной цитометрии миелоидных предшественников (Lin^-c-Kit⁺Sea1) и (g) зрелых миелоидных клеток (Mac1⁺Gr1⁺). (h) Анализы клеточного цикла у миелоидных предшественников с использованием Ki67 и красителя DAPI (n=3/группа). (i) Вестерн-блоттинг на уровни H3K27me3 у мышей (n=5/группа), обработанных EPZ011989 дважды в сутки при 500 мг/кг в течение 16 суток. (j) Массы селезенок и (k) количества лейкоцитов после обработки. Если не указано иначе, n=5/CON, n=5/KO Ezh2, n=8/KO BAP1 и n=11/KO BAP1/Ezh2, статистику рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента; *р<0,05, **р<0,005; приведены значения ±SEM.

Фиг. 12а-с. Анализы гистонов у животных с КО BAP1. (a) Транскрипцию EZH2, как оценивали посредством кПЦР в клетках контроля и КО BAP1. Клетки подвергали транедукции пустым вектором или конструкцией со сверхэкспрессией ВАР1. (b) Масс-спектрометрия гистонов для обогащенных c-Kit клеток костного мозга у контрольных животных и животных с КО BAP1, n=2. (с) эксперименты ChIP-кПЦР с H4K20me1 в клетках 293Т со сверхэкспрессией меченых FLAG BAP1, ASXL1 и Bmi1.

Фиг. 13a-l. Удаление ВАР1 приводит к возрастанию экспрессии компонентов PRC2, увеличенному уровню H4K20me1 и деубиквитинированию L3MBTL2. (а) Коиммунопреципитация эндогенных EZH2 и ВАР1 в клетках SET2 с последующим анализом вестерн-блоттинга (проводимого в присутствие бензоназы для ингибирования взаимодействий, зависимых от ДНК). (b) Экспрессия BAP1, Ezh2 и Suz12 по кПЦР-РВ для отсортированных гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (GMP; Lin^-cKit⁺Sca1^-CD34⁺FcY⁺). (с) Анализ вестерн-блоттинга BAP1 и Ezh2 в клетках костного мозга мышей с КО BAP1 и контрольных мышей. (d) Количественный анализ H4K20me1 после масс-спектрометрических экспериментов с гистонами. (е) Жизнеспособность клеток по оценкам посредством анализа жизнеспособности CellTiter Glo и (f) анализов аннексина V для экспериментов по сверхэкспрессии SETD8 в линиях клеток с ВАР1 дикого типа (MSTO-211H, Meso10) и мутантных линий клеток Н226 с делецией; каталитическая мутация Н2452). (g) Количественная кПЦР SETD8 и EZH2 в мутантных по ВАР1 клетках со сверхэкспрессией SETD8. (h) Анализ вестерн-блоттинга SETD8 и EZH2 в линии клеток с ВАР1 дикого типа. (i) Анализ CellTiter Glo в клетках, обработанных DMSO или 5, 10, 20 мкМ BVT594. (j) Экспрессия L3MBTL2 и ВАР1 в линиях клеток ВАР1 дикого типа (Met5a, JMN) и мутантных линиях клеток мезотелиомы (Н226, Н2452, Н28). (k) Клетки 293Т, сверхэкспрессирующие меченный Myc-His убиквитин и кДНК L3MBTL2 и варьирующие уровни ВАР1 (0,5 мкг, 2,5 мкг, 1 мкг). Эксперименты по коиммунопреципитации проводили с использованием Ni-гранул и ряда отмывок в жестких условиях. (l) Модель, отражающая регуляцию ВАР1, приводящую к действию на хроматин и экспрессию генов. Статистику рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента; *р<0,05, **р<0,005; приведены значения ±SEM.

Фиг. 14а-b. Анализ связывания ВАР1, ASXL1, HCF-1 и OGT.

(а) Анализ кластеризации k-средних для ChIP-Seq BAP1, ASXL1, HCF-1 и OGT. (b) Анализ мотивов de novo Homer в связанных с ВАР1 кластерах.

Фиг. 15a-i. L3MBTL2 и ВАР1 совместно регулируют EZH2. (а) Экспрессия BAP1 и L3mblt2 в клетках костного мозга контроля и с КО BAP1. (b) Экспрессия L3mbtl2 посредством кПЦР в GMP. (с) Вестерн-блоттинг клеток Н226 и Н2452, обработанных 25 мкМ MG132. Нерастворимые фракции экстрагировали с использованием содержащего 2% SDS буфера для лизиса. (d) Экспрессия EZH2 в линиях клеток, сверхэкспрессирующих L3MBTL2. (е) Анализ активности промотора EZH2 с конструкцией, содержащей 1,9 п.н. промотора EZH2 и контрольный вектор Renilla, транзиторно трансфицированный в клетки 293Т с пустым вектором, а экспрессирующим ВАР1 или L3MBTL2 вектором. В каждом из этих условий активность люциферазы светляка нормализовали по активности Renilla. (f) Для нокдауна белка L3MBTL2 в клетках SET2 использовали две независимых шпильки. Анализы вестерн-блоттинга проводили для L3MBTL2, EZH2 и актина, включая короткое и длительное экспонирование. (g) ChIP L3MBTL2 с последующей кПЦР по локусам EZH2, SUZ12, E2F6 (положительный контроль), PHF20 (положительный контроль) и MORC3 (отрицательный контроль) в клетках 293Т. (h) ChIP с антителами к FLAG с последующей кПЦР по локусу EZH2 в клетках 293Т, сверхэкспрессирующих FLAG-L3MBTL2 или FLAGBAP1. JAM2 представляет собой положительный контроль. По сравнению с клетками 293Т без сверхэкспрессии FLAG. (i) Вестерн-блоттинг L3MBTL2 и ВАР1 с последующими соответствующими IP в клетках 293Т. Агарозный гель с ДНК включен для демонстрации расщепления ДНК.

Фиг. 16а-И. Линии клеток мезотелиома и модели на ксенотрансплантатах с мутантным ВАР1 чувст

- 4 036889 вительны к ингибированию EZH2. (а) Экспрессия транскриптов EZH2 у пациентов с мезотелиомой по TCGA по сравнению соответствующими нормальными донорами. (b) Анализы аннексина V в линиях клеток с ВАР1 дикого типа и линиях клеток с мутантным ВАР1, экспрессирующих пустой вектор или шпильки, направленные к EZH2. (с) Эксперименты по количественному определению аннексина V в линиях клеток мезотелиомы. (d) Размер опухоли линий клеток Meso10 и Н226, экспрессирующих шпильки EZH2, имплантируемых мышам NOD-SCID, п=6/группу. (е) Анализы жизнеспособности 2D CellTiter Glo через 2 недели обработки EPZ011989 с концентрацией 1,25 мкМ. (f) Анализы жизнеспособности 3D CellTiter Glo через 3 недели обработки EPZ011989 с концентрацией 1,25 мкМ. (g) Образование опухоли определенного размера из клеток с мутантным ВАР1 (Н226 и Н2452) или (h) клеток дикого типа (MSTO и Meso10), имплантированных мышам NOD-SCID и обрабатываемых носителем или 500 мг/кг EPZ011989 дважды в сутки. Опухоли измеряли 3 раза в неделю, n=6/группа. Ингибирование мишени оценивали посредством вестерн-блоттинга гистонов для извлеченных опухолей (представлено на соответствующих фигурах). Патология легких с клетками Н2452 с обработкой носителем и EPZ011989. Стрелки указывают основной объем метастазирующей опухоли. Статистику рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента; *р<0,05, **р<0,005; приведены значения ±SEM.

Фиг. 17. Экспрессия компонентов PRC2 в отсортированных популяциях и во всем костном мозге возрастала.

Фиг. 18. H3K27me3 локально и глобально увеличен у мышей с КО BAP1. Метилирование гистонов у животных с КО BAP1 оценивали, проводя кислотную экстракцию с последующим вестерн-блоттингом костного мозга контроля и КО BAP1. Секвенирования после иммунопреципитации хроматина (ChIP-Seq) также проводили на обогащенном cKit костном мозге. Перекрывание данных ChIP-Seq и секвенирования РНК показало, что гены, ингибируемые у мышей с КО BAP1 были в большей степени маркированы H3K27me3. У мышей с КО BAP1 наблюдали увеличение уровня H3K27me3 в генах-мишенях EZH2, таких как локус НОХА.

Фиг. 19. Повышение уровня H3K27me2/3 в клетках с КО BAP1 происходило при расходовании H3K27me0/1.

Фиг. 20a-d. Линии клеток с мутантным ВАР1 являются более чувствительными к ингибированию EZH2. (а) Линия клеток Meso10, сверхэкспрессирующая EZH2, в возрастающем объеме пролиферирующая после инъекции в бок мышей NOD-SCID. (b) EZH2 сверхэкспрессирован в линиях клеток MSTO211H и Meso10. Линии клеток при сверхэкспрессии EZH2 становились в большей степени чувствительными к EZP011989. (с) Клетки с мутантным ВАР1 при обработке ингибитором EZH2 GSK126 становились менее инвазивными. (d) Экспрессия Е-кадгерина в линии клеток Н226 после обработки GSK126 возрастала.

Фиг. 21а-с. Линии клеток мезотелиомы и модели на ксенотрансплантатах с мутантным ВАР1 более чувствительны к ингибированию EZH2. (а) Объем опухоли ксенотрансплантатов Н2452, обработанных GSK126 с концентрацией 150 мг/кг или носителем (n=10 мыши per группа). 5 мышей из каждой группы для оценки удаления H3K27me3 через 16 суток обработки подвергали эвтаназии. Оставшихся мышей обрабатывали в течение оставшегося срока эксперимента. (b) ELISA гистонов и анализ вестернблоттинга уровней H3K27me3 в опухолях обрабатываемых in vivo мышей через 16 суток обработки. (с) Окрашивание Н&Е, окрашивание Ki67 и окрашивание TUNEL опухолей, выделяемых у обработанных носителем и обработанных GSK126 мышей, увеличение 10х.

Подробное описание

Для ясности и не с целью ограничения подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы:

(i) биомаркеры ВАР1;

(ii) ингибиторы EZH2;

(iii) злокачественные опухоли-мишени;

(iv) детекция биомаркеров;

(v) способы применения и (vi) наборы.

Биомаркеры ВАР1

Как используют в настоящем документе, термин биомаркер включает нуклеиновые кислоты и белки, которые относятся к уровню активности у индивидуума ассоциированного с BRCA1 белка 1, обозначаемого в настоящем документе как ВАР1.

Пациент или индивидуум, как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, относится к человеку или к не являющемуся человеком индивидууму. Неограничивающие примеры не являющихся человеком индивидуумов включают не являющихся человеком приматов, собак, кошек, мышей, крыс, морских свинок, кроликов, свиней, домашнюю птицу, лошадей, коров, коз, овец, китообразных и т.д.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления описываемый биомаркер ВАР1 может представлять собой нуклеиновую кислоту. Например, но не в качестве ограничения, биомаркер может представлять собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК),

- 5 036889 например, иРНК.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления биомаркер нуклеиновая кислота ВАР1 может представлять собой нуклеиновую кислоту ВАР1 человека с последовательностью, указанной под номерами доступа базы данных NCBI NG_031859.1 или NM_004656, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка ВАР1 с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_004647.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления биомаркер нуклеиновая кислота ВАР1 может представлять собой нуклеиновую кислоту ВАР1 мыши с последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NM_027088, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка ВАР1 с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_081364.1.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления биомаркер нуклеиновая кислота ВАР1 может представлять собой нуклеиновую кислоту ВАР1 крысы с последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NM_001107292.1, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка ВАР1 с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_001100762.1.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления биомаркер ВАР1 может представлять собой белок.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления биомаркер белок ВАР1 может представлять собой белок ВАР1 человека с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_004647.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления биомаркер белок ВАР1 может представлять собой белок ВАР1 мыши с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_081364.1.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления биомаркер белок ВАР1 может представлять собой белок ВАР1 крысы с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_001100762.1.

В определенных вариантах осуществления уровень биомаркера ВАР1 сравнивают с эталонным контрольным уровнем. Эталонный контрольный уровень или эталонный контрольный уровень экспрессии ВАР1, как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, можно установить, например, с использованием эталонного контрольного образца. Неограничивающие примеры эталонных контрольных образцов включают нормальные и/или здоровые клетки с активностью ВАР1 дикого типа. В определенных вариантах осуществления эталонный контрольный уровень ВАР1 можно установить, например, с использованием нормальных клеток, например доброкачественных клеток, находящихся у пациента рядом с опухолью.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления изобретения уровень биомаркера ВАР1 можно оценивать, оценивая функцию ВАР1, где уровень экспрессии ВАР1 прямо пропорционален уровню функции ВАР1. В одном из неограничивающих примеров функцией ВАР1 может являться ингибирование экспрессии EZH2 (например, экспрессии белка или экспрессии нуклеиновой кислоты EZH2). Например, и не в качестве ограничения, уровень биомаркера ВАР1 можно определять, определяя уровень экспрессии EZH2 в злокачественных клетках индивидуума по сравнению с эталонным контрольным уровнем EZH2. В определенных вариантах осуществления эталонный контрольный уровень EZH2 можно определять с использованием нормальных и/или здоровых клеток с активностью дикого типа и/или нормальной активностью EZH2 и/или нормальной активностью ВАР1. В определенных неограничивающих вариантах осуществления EZH2 может представлять собой нуклеиновую кислоту EZH2 человека с последовательностью, указанной под номерами доступа базы данных NCBI NG_032043.1; NM_004456.4; NM_001203249.1; NM_152998.2; NM_001203247.1 и/или NM_001203248.1, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка EZH2 с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_001190176.1; NP_001190177.1; NP_001190178.1; NP_004447.2 и/или NP_694543.1. В конкретном неограничивающем варианте осуществления EZH2 может представлять собой белок EZH2 человека с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_001190176.1; NP_001190177.1; NP_001190178.1; NP_004447.2 и/или NP_694543.1.

В одном из неограничивающих примеров функция ВАР1 может представлять собой регуляцию экспрессии SUZ12 (например, экспрессии белка или экспрессии нуклеиновой кислоты SUZ12). В определенных неограничивающих вариантах осуществления уровень биомаркера ВАР1 можно определять, определяя уровень экспрессии SUZ12 в злокачественных клетках индивидуума по сравнению с эталонным контрольным уровнем SUZ12. В определенных вариантах осуществления эталонный контрольный уровень SUZ12 можно определять с использованием нормальных и/или здоровых клеток с активностью дикого типа, и/или нормальной активностью SUZ12, и/или нормальной активностью ВАР1. В определенных неограничивающих вариантах осуществления SUZ12 может представлять собой нуклеиновую кислоту SUZ12 человека с последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NM_015355.2, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу белка SUZ12 с аминокислотной после

- 6 036889 довательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_056170.2. В конкретном неограничивающем варианте осуществления SUZ12 может представлять собой белок SUZ12 человека с аминокислотной последовательностью, указанной под номером доступа базы данных NCBI NP_056170.2.

Когда в настоящем указаны сравнения с эталонными контрольными уровнями экспрессии, биомаркер оценивают относительно эталонного контрольного уровня экспрессии в пределах того же вида. Например, уровень экспрессии и/или присутствие биомаркера ВАР1 человека сравнивают с эталонным контрольным уровнем ВАР1 человека.

В конкретных неограничивающих вариантах осуществления отсутствие и/или сниженная экспрессия биомаркера ВАР1 означает детекцию менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30% экспрессии относительно эталонного контрольного уровня.

Ингибиторы EZH2

Неограничивающие примеры ингибиторов EZH2 включают соединения, молекулы, химические вещества, полипептиды, белки, которые ингибируют и/или снижают экспрессию и/или активность EZH2. Дополнительные неограничивающие примеры ингибиторов EZH2 включают низкомолекулярные ингибиторы, конкурирующие с S-аденозилметионином. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления ингибитор EZH2 получают из тетраметилпиперидинильных соединений. Дополнительные неограничивающие примеры включают UNC1999, 3-деазанепланоцин А (DZNep), EI1, EPZ-5676, EPZ6438, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 и GSK126.

Дополнительные неограничивающие примеры ингибиторов EZH2 описаны в Garapaty-Rao et al., Chemistry and Biology, 20: pp. 1-11 (2013), в патентных заявках PCT №№ WO 2013/138361, WO 2013/049770 и WO 2003/070887 и в патентных заявках США №№ US 2014/0275081, US 2012/0071418, US 2014/0128393 и US 2011/0251216, содержания которых, таким образом, полностью включены в качестве ссылки.

Дополнительные неограничивающие примеры ингибиторов EZH2 включают рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, молекулы кшРНК и молекулы миРНК, которые специфически ингибируют экспрессию или активность EZH2. Один из неограничивающих примеров ингибиторов EZH2 включает антисмысловую последовательность, последовательность кшРНК или миРНК нуклеиновой кислоты, гомологичную по меньшей мере части последовательности нуклеиновой кислоты EZH2, где гомология части относительно последовательности EZH2 составляет по меньшей мере приблизительно 75, или по меньшей мере приблизительно 80, или по меньшей мере приблизительно 85, или по меньшей мере приблизительно 90, или по меньшей мере приблизительно 95, или по меньшей мере приблизительно 98%, где процент гомологии можно определять, например, посредством программного обеспечения BLAST или FASTA. В определенных неограничивающих вариантах осуществления комплементарная часть может состоять по меньшей мере из 10 нуклеотидов, или по меньшей мере из 15 нуклеотидов, или по меньшей мере из 20 нуклеотидов, или по меньшей мере из 25 нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 нуклеотидов, а длина антисмысловой нуклеиновой кислоты, молекул кшРНК или миРНК может составлять до 15, или до 20, или до 25, или до 30, или до 35, или до 40, или до 45, или до 50, или до 75, или до 100 нуклеотидов. Антисмысловые молекулы, молекулы кшРНК или миРНК могут содержать ДНК или нестандартные или неприродные остатки, в качестве неограничивающих примеров, тиофосфатные остатки.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления ингибитор EZH2 можно использовать отдельно или в комбинации с одним или более средствами против злокачественных опухолей. Средство против злокачественных опухолей может представлять собой любую молекулу, химическое соединение или композицию, которые обладают противоопухолевым действием. Средства против злокачественных опухолей в качестве неограничивающих примеров включают химиотерапевтические средства, радиотерапевтические средства, цитокины, антиангиогенные средства, индуцирующие апоптоз средства или противоопухолевые иммунотоксины, такие как антитела. В комбинации с означает, что ингибитор EZH2 и одно или более средств против злокачественных опухолей вводят индивидууму в качестве части схемы или плана лечения. Эти термины не требуют того, чтобы ингибитор EZH2 и одно или более средств против злокачественных опухолей были физически скомбинированы до введения, а также того, чтобы их вводили в течение одного и того же временного интервала.

Злокачественные опухоли-мишени

Неограничивающие примеры злокачественных опухолей, которые могут представлять собой объекты для описываемого в настоящем описании объекта изобретения, включают злокачественные мезотелиомы, увеальные меланомы, почечноклеточную карциному, кожные меланомы, рак легких, рак молочной железы, рак яичника, не являющийся меланомой рак кожи, менингиому, холангиокарциному, лейомиосаркому, нейроэндокринные опухоли, рак поджелудочной железы, параганглиому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, миелодиспластические синдромы, острый миелолейкоз, меланоцитарные атипичные интрадермальные опухоли с мутантным ВАР1 (MBAIT) и рак мочевого пузыря.

- 7 036889

Детекция биомаркеров

Способы качественных и количественных детекции и/или определения уровня экспрессии биомаркера нуклеиновой кислоты ВАР1, нуклеиновой кислоты EZH2, нуклеиновой кислоты L3MBTL2 или нуклеиновой кислоты SUZ12 в качестве неограничивающих примеров включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), включая общепринятые кПЦР и цифровую ПЦР, гибридизацию in situ (в качестве неограничивающих примеров флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH)), электрофорез в геле, секвенирование и анализ последовательности, анализ микропанелей и другие способы, известные в данной области.

В определенных вариантах осуществления способ детекции может представлять собой ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ), количественную ПЦР, флуоресцентную ПЦР, RT-MSP (специфичная к метилированию полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени), детекцию ДНК PicoGreen™ (молекулярные зонды, Eugene, OR), радиоиммунологический анализ или прямое радиоактивное мечение ДНК. Например, но не в качестве ограничения, биомаркер нуклеиновую кислоту можно подвергать обратной транскрипции в кДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТПЦР); или для обоих этапов можно использовать один фермент, как описано в патенте США № 5322770, или биомаркер можно подвергать обратной транскрипции в кДНК с последующей ассиметричной лигазной цепной реакцией с пропусками (RT-AGLCR), как описано в R.L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994). Неограничивающие примеры праймеров для применения в описываемых способах представлены в табл. 1.

В определенных вариантах осуществления для оценки уровней биомаркерной иРНК используют количественную полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени (кПЦР-РВ). Уровни биомаркерной и контрольной иРНК можно количественно определять в тканях или клетках злокачественной опухоли и близлежащих доброкачественных тканях. В определенных вариантах осуществления в биологическом образце можно количественно определять уровни одного или более биомаркеров.

В неограничивающем варианте осуществления способ детекции по настоящему изобретению можно проводить без применения амплификации, например без получения какой-либо копии или удвоения последовательности-мишени, без привлечения какой-либо полимеразы или без необходимости в какойлибо термической циклической обработки. В определенных вариантах осуществления детекцию по настоящему изобретению можно проводить с использованием принципов, приведенных в способе QuantiGene™, описанном в заявке США с серийным № 11/471025, зарегистрированной 19 июня 2006 года и включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

В определенных вариантах осуществления можно использовать визуализацию гибридизации in situ, где радиоактивно меченый зонд антисмысловой РНК гибридизуют с тонким срезом биологического образца, например образца биопсии, отмывают, подвергают расщеплению РНКазой и экспонируют на чувствительную эмульсию для радиоавтографии. Образцы можно окрашивать гематоксилином для демонстрации гистологического состава образца, и проявленную эмульсию можно наблюдать в виде изображения в темном поле с подходящим световым фильтром. Также можно использовать нерадиоактивные метки, такие как дигоксигенин.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления оценку экспрессии биомаркера нуклеиновой кислоты можно проводить посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). FISH представляет собой способ, которым можно напрямую идентифицировать конкретную область ДНК или РНК в клетке и, таким образом, обеспечить визуальное определение экспрессии биомаркера в образцах тканей. Способ FISH обладает преимуществами более объективной системы регистрации и присутствия встроенного внутреннего контроля, состоящего из сигналов биомаркерных генов, присутствующих во всех неопухолевых клетках одного и того же образца. FISH представляет собой прямой способ in situ, который может быть относительно быстрым и чувствительным и который также можно автоматизировать. Когда уровень экспрессии биомаркера трудно определить одним FISH, со способом FISH можно комбинировать иммуногистохимию.

В определенных вариантах осуществления экспрессию биомаркера нуклеиновой кислоты можно детектировать на матрице, чипе или микропанели ДНК. Олигонуклеотиды, соответствующие биомаркеру(ам) иммобилизуют на чипе, который затем гибридизуют с мечеными нуклеиновыми кислотами биологического образца, например образца опухоли, полученного у индивидуума. С использованием образца, содержащего транскрипты биомаркеров, получают положительный сигнал гибридизации. Способы получения матриц ДНК и их использования хорошо известны в данной области, (см., например, патенты США №№ 66186796; 6379897; 6664377; 6451536; 548257; патентные заявки США №№ 20030157485 и Schena et al., 1995 Science 20:467-470; Gerhold et al., 1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173; и Lennon et al., 2000 Drug discovery Today 5: 59-65, которые полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки). Также можно проводить серийный анализ экспрессии генов (SAGE) (см., например, патентную заявку США № 20030215858).

В определенных вариантах осуществления для мониторинга биомаркера нуклеиновой кислоты, например иРНК, уровней экспрессии ВАР1 иРНК можно выделять из тестируемого биологического образца, подвергать обратной транскрипции и можно получать флуоресцентно-меченые зонды кДНК. Затем

- 8 036889 меченые зонды кДНК можно наносить на микропанели, способные к гибридизации с биомаркером, обеспечивая гибридизацию зонда с микропанелью, и сканировать стекла для измерения интенсивности флуоресценции. Эта интенсивность коррелирует с интенсивностью гибридизация и уровнями экспрессии биомаркера.

Типы зондов для детекции биомаркеров нуклеиновых кислот включают кДНК, рибонуклеиновые зонды, синтетические олигонуклеотиды и геномные зонды. Как правило, тип используемого зонда продиктован конкретной ситуацией, например рибонуклеиновые зонды используют для гибридизации in situ, a кДНК для нозерн-блоттинга. В определенных неограничивающих вариантах осуществления зонд направлен к нуклеотидным областям, уникальным для конкретной биомаркерной РНК. Зонды могут быть настолько короткими, как необходимо для дифференциального распознавания конкретных биомаркерных транскриптов иРНК, и может быть настолько коротким, как, например, 15 оснований. Также можно использовать зонды по меньшей мере из 17 оснований, 18 оснований и 20 оснований. В определенных вариантах осуществления праймеры и зонды специфически гибридизуются в жестких условия с фрагментом нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, соответствующей генумишени. Как используют в настоящем документе, термин жесткие условия означает гибридизацию, которая происходит, только если последовательности идентичны по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97%.

Форма мечения зондов может являться любой подходящей формой, такой как использование радиоактивных изотопов, например ³²Р и ³⁵S, или флуорофоров. Мечение радиоактивными изотопами можно осуществлять при химическом или биологическом синтезе зонда, используя подходящие меченые основания.

Способы детекции и/или определения уровня белкового биомаркера, например, биомаркера белка ВАР1, белка EZH2, белка L3MBTL2 или белка SUZ12, хорошо известны специалистам в данной области и в качестве неограничивающих примеров включают масс-спектрометрические способы, основанные на 1-D или 2-D геле системы анализа, хроматографию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммуногистохимию. В этих способах для детекции белка используют антитела или эквиваленты антител или используют биофизические способы. Также можно применять матрицы антител или белковые чипы, см., например, патентные заявки США №№ 2003/0013208; 2002/0155493, 2003/0017515 и патенты США №№ 6329209 и 6365418, полностью включенные в настоящий документ в качестве ссылки.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления способ детекции для определения экспрессии белкового биомаркера включает этапы: приведения биологического образца, например образца ткани, в контакт с антителом или его вариантом (например, фрагментом), которые селективно связываются с биомаркером, и детекции связывания антитела или его варианта с образцом. Дополнительно способ может включать приведение образца в контакт со вторым антителом, например меченым антителом. Дополнительно способ может включать один или более этапов отмывки, например для удаления одного или более реагентов.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления для детекции и количественного определения уровни экспрессии белкового биомаркера можно использовать вестерн-блоттинг. Клетки можно гомогенизировать в буфере для лизиса с получением лизата, а затем подвергать SDS-PAGE и блоттингу на мембрану, такую как нитроцеллюлозный фильтр. Затем в контакт с мембраной можно приводить антитела (немеченные) и оценивать посредством вторичного иммунологического реагента, такого как меченый белок А или антитело к иммуноглобулину (подходящие метки включают ¹²⁵I, пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу). Также можно использовать хроматографическую детекцию. В определенных вариантах осуществления иммунодетекцию можно проводить с использованием антитела к биомаркеру с использованием системы усиленной хемилюминесценции (например, из PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.). Затем мембрану можно разделять на полосы и подвергать повторному блоттингу с использованием контрольного антитела, специфичного к контрольному белку, например актину.

Для детекции экспрессии и/или присутствия биомаркера, например в образце биопсии, можно использовать иммуногистохимию. Подходящее антитело можно приводить в контакт, например, с тонким слоем клеток с последующей отмывкой для удаления несвязанного антитела, а затем приводить в контакт со вторичным, меченым, антителом. Мечение может представлять собой мечение флуоресцентными маркерами, ферментами, такими как пероксидаза, мечение авидином или мечение радиоактивными изотопами. Анализ можно оценивать визуально с использованием микроскопии, и результаты можно определять количественно, также для определения результатов иммуноокрашивания биомаркера можно использовать машинные способы или автоматизированные системы.

В данной области доступны различные автоматизированные системы обработки, сканирования и анализа образцов, пригодные для использования иммуногистохимии. Такие системы могут включать автоматическое окрашивание (см., например, the Benchmark system, Ventana Medical Systems, Inc.) и сканирование с использованием микроскопа, компьютеризированный анализ изображений, сравнение серийных срезов (с контролем на вариацию образцов по ориентации и размерам), формирование цифрового отчета и архивирование и отслеживание образцов (таких как предметные стекла, на которые помеща

- 9 036889 ют тканевые срезы). Коммерчески доступны системы визуализации клеток, в которых скомбинированы общепринятые оптические микроскопы с цифровыми системами обработки изображения для проведения количественного анализа в клетках и тканях, включая иммуноокрашенные образцы. См., например, систему CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.).

С целями визуализации, например для детекции присутствия биомаркера в клетках индивидуума, также можно использовать меченые антитела к биомаркерам. Подходящие метки включают радиоактивные изотопы, йод (¹²⁵I, ¹²¹I), углерод (¹⁴С), серу (³⁵S), тритий (³Н), индий (¹¹²In) и технеций (99mTc), флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин. Иммуноферментные взаимодействия можно визуализировать с использованием различных ферментов, таких как пероксидаза, щелочная фосфатаза, или различных хромогенов, таких как DAB, AEC или Fast Red. Меченые антитело или фрагмент антитела преимущественно накапливаются в положении клеток, содержащих биомаркер. Затем меченые антитело или его вариант, например фрагмент антитела, можно детектировать известными способами.

Антитела включают любое антитело, природное или синтетическое, полноразмерное или его фрагмент, моноклональное или поликлональное, которое достаточно сильно и специфически связывается с детектируемым биомаркером. K_d антитела может составлять максимум приблизительно 10^-6М, 10^-7М, 10⁸ М, 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 M и 10^-12 М. Фраза специфически связывается относится к связыванию, например, антитела с эпитопом или антигеном или антигенной детерминантой таким образом, что из связывания может вытеснять или за него может конкурировать второй препарат идентичного или сходного эпитопа, антигена или идентичной или сходной антигенной детерминанты.

Антитела и их производные, которые можно использовать, включают поликлональные или моноклональные антитела, синтетические и сконструированные антитела, химерные, принадлежащие человеку, гуманизированные, приматизированные (с привитыми CDR), винированные или одноцепочечные антитела, продуцируемые фагами антитела (например, из библиотек фагового дисплея), а также функциональные связывающие фрагменты антител. Например, можно использовать фрагменты антител, способные к связыванию с биомаркером, или их части, включая в качестве неограничивающих примеров фрагменты Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂. Такие фрагменты можно получать посредством ферментативного расщепления или рекомбинантными способами. Неограничивающие примеры коммерчески доступных антител к ВАР1 включают SC-8132, SC-48386, SC-13576, SC-28236, SC-8133 и SC-28383 из Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Ab167250 из Abcam (Cambridge, England) и НРА028814 из Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Неограничивающие примеры коммерчески доступных антител к EZH2 включают каталожные номера 39933, 39875 и 39901 из Active Motif (Carlsbad, CA), 07-689 из Millipore (Billerica, MA) и РА1-46476 и РА5-24594 из Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Неограничивающий пример коммерчески доступного антитела к SUZ12 включает Ab12073 из Abcam. Неограничивающий пример коммерчески доступного антитела к L3MBTL2 включает 39569 из Active Motif.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления используют специфически связывающиеся с полипептидом средства, отличные от антител, такие как пептиды. Специфически связывающиеся пептиды можно идентифицировать любыми средствами, известными в данной области, например пептидными библиотеками фагового дисплея. Как правило, можно использовать средство, способное к детекции полипептидного биомаркера так, что происходит детекция и/или количественное определение биомаркера. Как определено в настоящем документе, средство относится к веществу, обеспечивающему идентификацию или детекцию биомаркера в биологическом образце (например, идентифицирует или детектирует иРНК биомаркера, ДНК биомаркера, белок биомаркера).

Кроме того, биомаркер можно детектировать с использованием масс-спектрометрии, такой как MALDI/TOF (время-пролетная), SELDI/TOF, жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS), газовая хроматография-масс-спектрометрия (GC-MS), высокоэффективная жидкостная хроматографиямасс-спектрометрия (ВЭЖХ-MS), капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия, спектрометрия ядерного магнитного резонанса или тандемная масс-спектрометрия (например, MS/MS, MS/MS/MS, ESIMS/MS и т.д.). см., например, патентные заявки США №№ 2003/0199001, 2003/0134304, 2003/0077616, которые полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Способы масс-спектрометрии хорошо известны в данной области и их использовали для количественного определения и/или идентификации биомолекул, таких как белки (см., например, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; и Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Кроме того, разработаны масс-спектрометрические способы, которые обеспечивают, по меньшей мере, частичное секвенирование выделенных белков de novo. Chait et al., Science 262:8992 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); рассмотрено в Bergman, EXS 88:13344 (2000).

Как правило, детекция присутствия биомаркера или другого вещества включает детекцию интенсивности сигнала. В свою очередь это может отражать количество и характер полипептида, связанного с субстратом. Например, в определенных вариантах осуществления можно сравнивать силу сигнала пиковых значений из спектров первого образца и второго образца (например, визуально или посредством компьютерного анализа) с определением относительных количеств конкретного биомаркера. Для помощи в анализе масс-спектров можно использовать такие программы как Biomarker Wizard program (Ci

- 10 036889 phergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.).

Дополнительные способы определения экспрессии биомаркеров нуклеиновых кислота и/или белков в образцах описаны, например, в патенте США № 6271002; патенте США № 6218122; патенте США № 6218114 и патенте США № 6004755; и в Wang et al., J. Clin. Oncol., 22(9): 1564-1671 (2004) и Schena et al., Science, 270:467-470 (1995); которые все полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Способы применения

В определенных неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, включающим определение присутствия, отсутствия и/или уровня экспрессии биомаркера ВАР1, например биомаркера нуклеиновой кислоты и/или белка ВАР1. Способы определения присутствия, отсутствия и/или уровней экспрессии биомаркера ВАР1 указаны в разделе Детекция биомаркеров выше. Злокачественные опухоли, подходящие для лечения, описаны выше в разделе Злокачественные опухоли-мишени. Ингибиторы EZH2 описаны выше в разделе Ингибиторы EZH2.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании предоставлен способ обеспечения противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, включающий определение содержания в клетках злокачественной опухоли биомаркера ВАР1, где, если биомаркер ВАР1 в злокачественной опухоли отсутствует и/или экспрессирован на низких уровнях по сравнению с эталонным контрольным уровнем, проводят введение терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 для обеспечения противоопухолевого действия. Альтернативно, если выявлено, что биомаркер ВАР1 экспрессирован на том же или более высоких уровнях относительно эталонного контрольного уровня, проводят альтернативную терапию средством, которое не является ингибитором EZH2.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству, которое может осуществлять одно или более из противоопухолевого действия, продления длительности жизни и/или увеличения периода до рецидива.

Противоопухолевое действие относится к одному или более из уменьшения массы агрегированных злокачественных клеток, уменьшения скорости роста злокачественных клеток, снижения пролиферации злокачественных клеток, уменьшения массы опухоли, уменьшения объема опухоли, снижения пролиферации клеток опухоли, уменьшения скорости роста опухоли и/или снижение метастазирования опухоли. В определенных вариантах осуществления противоопухолевое действие может относиться к полному ответу, частичному ответу, стабильному заболеванию (без прогрессирования или рецидивов), ответу с поздним рецидивом или выживанию пациента с диагностированной злокачественной опухолью без прогрессирования.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, включающему определение уровня экспрессии биомаркера ВАР1 в одной или более клетках злокачественной опухоли, где, если биомаркер белок ВАР1 в клетках отсутствует и/или экспрессирован на низких уровнях по сравнению с эталонным контрольным уровнем, проводят введение терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 для получения противоопухолевого действия. В определенных вариантах осуществления эталонный контроль представляет собой уровень ВАР1 в нормальных клетках, например доброкачественных клетках, находящихся рядом со злокачественной опухолью.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления для обеспечения сравнения уровень ВАР1 в образце злокачественной опухоли и/или эталонном контрольном образце можно нормализировать относительно нуклеиновой кислоты и/или белка, присутствующих в обоих образцах, например стандартных белка или нуклеиновой кислоты, таких как ген и/или белок домашнего хозяйства. Например, и не в качестве ограничения, стандартные белок или нуклеиновая кислота могут представлять собой актин или тубулин.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу прогноза чувствительности злокачественной опухоли пациента к ингибитору EZH2, где способ включает получение у пациента образца злокачественной опухоли и определение уровня экспрессии биомаркера белка ВАР1 в клетках, составляющих образец, где, если биомаркер белок ВАР1 отсутствует или экспрессирован в меньшей степени по сравнению с эталонным контрольным уровнем, делают прогноз, что злокачественная опухоль чувствительна к ингибитору EZH2. В определенных вариантах осуществления, если сделан прогноз, что злокачественная опухоль пациента чувствительна к ингибитору EZH2, пациента затем можно лечить ингибитором EZH2. В определенных вариантах осуществления, если сделан прогноз, что злокачественная опухоль пациента нечувствительна к ингибитору EZH2, пациента можно лечить средством, которое не является ингибитором EZH2.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума со злокачественной опухолью. Например, и не в качестве ограничения, способ включает получение у индивидуума образца злокачественной опухоли и определение в образце уровня экспрессии биомаркера ВАР1, где, если биомаркер ВАР1 отсутствует или экспрессирован на более низком уровне, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, начинают лечение индивидуума терапевтически эффективным количеством ингибитора EZH2. Альтернативно, если выявлено, что биомаркер

- 11 036889

ВАР1 экспрессирован на том же или более высоком уровне относительно эталонного контрольного уровня, индивидуума можно лечить средством, которое не является ингибитором EZH2.

В определенных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать детекцию в образце уровня экспрессии EZH2, L3MBTL2 и/или SUZ12. Например, но не в качестве ограничения, можно детектировать уровни экспрессии иРНК и/или белка EZH2, L3MBTL2 и/или SUZ12. В определенных вариантах осуществления способ лечения индивидуума со злокачественной опухолью включает получение у индивидуума образца злокачественной опухоли и определение в образце уровня экспрессии биомаркера ВАР1 и уровня экспрессии EZH2, L3MBTL2 и/или SUZ12, где, если биомаркер ВАР1 отсутствует или экспрессирован на более низком уровне, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, а экспрессия EZH2 и/или SUZ12 увеличена по сравнению с эталонными контрольными уровнями EZH2 и/или SUZ12 (и/или снижена экспрессия L3MBTL2 по сравнению с эталонным контрольным уровнем L3MBTL2), начинают лечение индивидуума терапевтически эффективным количеством ингибитора EZH2. В определенных вариантах осуществления образец можно получать до и после лечения ингибитором EZH2 и можно сравнивать уровни экспрессии EZH2 в образцах.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления образец в качестве неограничивающих примеров включает клетки в культуре, супернатанты клеток, лизаты клеток, сыворотку, плазму крови, биологическую жидкость (например, кровь, плазму, сыворотку, стул, мочу, лимфу, асцит, смыв протоков, аспират из сосков, слюну, бронхоальвеолярный лаваж, слезы и цереброспинальную жидкость) и образцы тканей. Источник образца может представлять собой плотную ткань (например, из только полученного, замороженного и/или законсервированного органа или образца опухоли, образец ткани, биопсию или аспират), кровь или любые составляющие крови, биологические жидкости (такие как, например, моча, лимфа, цереброспинальная жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или межклеточная жидкость) или клетки индивидуума, включая циркулирующие опухолевые клетки. В определенных неограничивающих вариантах осуществления образец получают из опухоли. В определенных вариантах осуществления образец может представлять собой клинический образец, который представляет собой образец, получаемый у пациента.

Наборы

В определенных неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору для определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, где набор включает средства детекции биомаркера ВАР1, как указано в предыдущих разделах. Указанный набор может дополнительно содержать инструкции или документацию, где описано применение набора для определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия в злокачественной опухоли и/или приведена ссылка на веб-сайт или публикации, описывающие его.

Типы наборов в качестве неограничивающих примеров включают упакованные специфичный к биомаркеру зонд и наборы праймеров (например, наборы зондов/праймеров TaqMan), панели/микропанели, специфичные к биомаркерам антитела, специфичные к биомаркеру гранулы, которые дополнительно содержат один или более зонды, праймеры или другие реагенты для детекции одного или более биомаркеров по настоящему изобретению.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору для определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, содержащему средства для детекции присутствия биомаркера нуклеиновой кислоты ВАР1.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления набор может содержать пару олигонуклеотидных праймеров, подходящих для полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирования нуклеиновой кислоты, для детекции идентифицируемого биомаркера(ов) нуклеиновой кислоты. Пара праймеров может содержать нуклеотидные последовательности, комплементарные биомаркеру, указанному выше, и обладать достаточной длинной для селективной гибридизации с указанным биомаркером. Альтернативно комплементарные нуклеотиды могут селективно гибридизоваться с конкретной областью в достаточно тесной близости с 5'- и/или 3'-конца от положения биомаркера для проведения ПЦР и/или секвенирования. В набор можно включать несколько специфичных к биомаркеру праймеров для одновременной детекции более одного биомаркера. Также набор может содержать одну или более полимераз, обратную транскриптазу и нуклеотидные основания, где нуклеотидные основания могут быть дополнительно детектируемо мечеными.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления длина праймера может составлять по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов, или по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов, или по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, и/или приблизительно до 200 нуклеотидов, или приблизительно до 150 нуклеотидов, или приблизительно до 100 нуклеотидов, или приблизительно до 75 нуклеотидов, или приблизительно до 50 нуклеотидов. Неограничивающие примеры праймеров приведены в табл. 1. Например, но не в качестве ограничения, праймер по настоящему изобретению может содержать одну или более последовательностей, описываемых в табл. 1.

В дополнительном неограничивающем варианте осуществления олигонуклеотидные праймеры

- 12 036889 можно иммобилизовать на твердой поверхности, субстрате или подложке, например на микропанели нуклеиновых кислот, где положение каждого олигонуклеотидного праймера, связанного с твердой поверхностью или подложкой, известно и поддается идентификации. Олигонуклеотиды можно фиксировать на субстрате, таком как стекло, пластик, бумага, нейлон или другой тип мембраны, фильтра, чипа, гранулы или любая другая подходящая твердая подложка. Полинуклеотиды можно синтезировать непосредственно на субстрате или синтезировать отдельно от субстрата, а затем фиксировать на субстрате. Панели получают известными способами.

В конкретном неограничивающем варианте осуществления набор может содержать по меньшей мере один зонд из нуклеиновой кислоты, подходящий для гибридизации in situ или флуоресцентной гибридизации in situ, для детекции подлежащих идентификации биомаркера(ов). Как правило, такие наборы содержат один или более олигонуклеотидных зондов, которые специфичны для различных биомаркеров. В одном наборе необязательно могут содержаться средства для тестирования нескольких биомаркеров.

В определенных вариантах осуществления наборы могут содержать контейнеры (включая микролитровые планшеты, пригодные для использования в автоматизированных реализациях способа), каждый с одним или более из различных реагентов (как правило, в концентрированной форме), используемых в способах, включая, например, предварительно изготовленные микропанели, буферы, соответствующие нуклеотидтрифосфаты (например, dATP, dCTP, dGTP и dTTP, или rATP, rCTP, rGTP и UTP), обратную транскриптазу, ДНК-полимеразу, РНК-полимеразу и один или более зондов и праймеров по настоящему изобретению (например, поли(Т) подходящей длины или случайные праймеры, связанные с промотором, взаимодействующим с РНК-полимеразой).

В неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору для определения вероятности проявления ингибитором EZH2 противоопухолевого действия в злокачественной опухоли, содержащему средства для детекции уровней биомаркера белка ВАР1.

В неограничивающих вариантах осуществления набор может содержать по меньшей мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для иммунодетекции подлежащего идентификации биомаркера(ов). Антитела, поликлональные и моноклональные, специфичные к биомаркеру, можно получать общепринятыми способами иммунизации, как в основном известно специалистам в данной области. Реагенты для иммунодетекции набора могут включать детектируемые метки, которые ассоциированы или связаны с данным антителом или самим антигеном. Такие детектируемые метки включают, например, хемилюминесцентные или флуоресцентные молекулы (родамин, флуоресцеин, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу, Cy3, Cy5 или ROX), радиоактивные метки (³Н, ³⁵S, ³²P, ¹⁴С или ¹³¹I) или ферменты (щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена).

В дополнительном неограничивающем варианте осуществления одно или более специфичных к биомаркерам антител можно предоставлять связанными с твердой подложкой, такой как матрикс для колонки, панель или лунка планшета для микротитрования. Альтернативно подложку можно предоставлять как отдельный элемент набора.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления, где в средствах для измерения набора используют панель, набор биомаркеров, указанных выше, может составлять по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 70, или по меньшей мере 80% от видов биомаркеров, представленных на микропанели.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления набор по настоящему изобретению может содержать один или более зондов, праймеров, антител или других детектирующих реагентов для детекции уровня экспрессии EZH2 в образце. Например, набор может содержать антитело или его фрагмент для детекции уровня экспрессии белка EZH2 в биологическом образце.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления набор по настоящему изобретению может содержать один или более зондов, праймеров, антител или других детектирующих реагентов для детекции уровня экспрессии SUZ12 в образце. Например, набор может содержать антитело или его фрагмент для детекции уровня экспрессии белка SUZ12 в биологическом образце.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления набор по настоящему изобретению может содержать один или более зондов, праймеров, антител или других детектирующих реагентов для детекции уровня экспрессии L3MBTL2 в образце. Например, набор может содержать антитело или его фрагмент для детекции уровня экспрессии белка L3MBTL2 в биологическом образце.

Набор может дополнительно содержать средства для обеспечения сравнения уровня биомаркера в образце злокачественной опухоли и уровня биомаркера в эталонном контрольном образце. Например, но не в качестве ограничения, набор по настоящему изобретению может содержать один или более зондов, праймеров, антител или других детектирующих реагентов для детекции стандартных белка или иРНК, которые можно использовать для нормализации уровней экспрессии одного или более биомаркеров образцов для обеспечения сравнения. Неограничивающие примеры стандартных белков, например белков домашнего хозяйства, включают альфа- или бета-тубулин, актин, кофилин, винкулин и GADPH.

В определенных неограничивающих вариантах осуществления набор может дополнительно содержать инструкции по применению набора для детекции исследуемого биомаркера. Например, инструкции

- 13 036889 могут описывать, что отсутствие и/или сниженная экспрессия биомаркера ВАР1, указанного в настоящем документе, в образце злокачественной опухоли, получаемом у пациента, по сравнению с эталонным контрольным уровнем, является показателем увеличенной вероятности проявления противоопухолевого действия ингибитора EZH2 в злокачественной опухоли.

В определенных вариантах осуществления набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать один или более ингибиторов EZH2. Неограничивающие примеры ингибиторов EZH2 описаны в разделе Ингибиторы EZH2.

Приводимые далее примеры предложены для более полной иллюстрации изобретения, но их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.

Пример 1. Потеря ВАР1 приводит к увеличенной экспрессии EZH2 и его активности in vitro.

В этом примере проводили исследование in vitro механизма, по которому потеря активности ВАР1 приводит к состоянию болезни.

Результаты.

Клетки SET2 трансдуцировали кшРНК, направленной к ВАР1 со снижением экспрессии ВАР1 in vitro. Снижение экспрессии ВАР1, как подтверждается вестерн-блоттингом, приводило к возрастанию триметилирования гистона 3 по К27 (H3K27me3) (фиг. 1). Фиг. 9а: в клетках BaF3 была снижена экспрессия белка ВАР1 с подтверждением потери ВАР1 посредством вестерн-блоттинг, и проводили массспектрометрию гистонов. Нокдаун ВАР1 в клетках BaF3 выявил повышение H3K27me3 (фиг. 1).

Показано, что ВАР1 сильно мутирован в солидных опухолях (Carbone et al., 2012), таких как злокачественная мезотелиома и увеальная меланома. В клетках мезотелиомы, которые несут мутации в ВАР1, например мутацию гомозиготной делеции Н28, гомозиготную миссенс-мутацию Н2452 и мутацию делеции Н226, наблюдали повышение уровня экспрессии EZH2 по сравнению с клетками с активностью ВАР1 дикого типа (фиг. 2). Кроме того, сверхэкспрессия ВАР1 в клетках 293Т in vitro, приводила к снижению EZH2 и экспрессии SUZ12, тогда как потеря экспрессии ВАР1 приводила к повышению уровня экспрессия SUZ12 (фиг. 3).

Обсуждение.

Как описано выше, потеря экспрессии белка ВАР1 вызывала повышение уровня H3K27me3, репрессивного маркера хроматина, устанавливаемого EZH2, и повышение экспрессии EZH2 и SUZ12 в системах линий злокачественных клеток in vitro. Ингибиторы EZH2 в настоящее время проходят клиническое тестирование у пациентов с лимфомами с активирующими EZH2 мутациями. Таким образом, статус мутаций ВАР1 может помочь в идентификации пациентов, которые могут реагировать на лечение ингибиторами EZH2, что может быть эффективным для продления срока жизни у пациентов с мутантным ВАР1.

- 14 036889

Пример 2. Потеря ВАР1 приводит к повышенной экспрессии EZH2 и его активности in vivo. Способы и материалы Т аблица 1. Праймеры

Ген	Праймеры для генотипирования (мышь)
Bapl up	ACTGCAGCAATGTGGATCTG (SEQ ID NO :1)
Bapl down	GAAAAGGTCTGACCCAGATCA (SEQ ID NO :2)
Bapl flox F	GCGCAACGCAATTAATGATA (SEQ ID NO :3)
Bapl flox R	CAGTGTCCAGAATGGCTCAA (SEQ ID NO :4)
Ген	Праймеры для мутагенеза (человек)
BAP1 C91A смысловой	CCACCAGCTGATACCCAACTCTGCTGCAACTCATGC (SEQ ID NO: 5)
ΒΆΡ1 C91A антисмысловой	GCATGAGTTGCAGCAGAGTTGGGTATCAGCTGGTGG (SEQ ID NO: 6)
Ген	Праймеры для кПЦР у мыши
Ezh2 F	AGCACAAGTCATCCCGTTAAAG (SEQ ID NO :7)
Ezh2 R	AATTCTGTTGTAAGGGCGACC (SEQ ID NO :8)
Suzl2 F	GGCTGACCACGAGCTTTTC (SEQ ID NO :9)
Suzl2 R	TGGTGCGATAAGATTTCGAGTTC (SEQ ID NO:10)
Bapl F	GTTGGTGGATGACACGTCTG (SEQ ID NO:11)
Bapl R	CTCAGGACTGAAGCCTTTGG (SEQ ID NO:12)
Актин В F	GATCTGGCACCACACCTTCT (SEQ ID NO:13)
Актин В R	CCATCACAATGCCTGTGGTA (SEQ ID NO:14)
HoxA5 F	GCTCAGCCCCAGATCTACC (SEQ ID NO:15)
HoxA5 R	GGCATGAGCTATTTCGATCC (SEQ ID NO:16)
НохАб F	CCCTGTTTACCCCTGGATG (SEQ ID NO:17)
НохАб R	ACCGACCGGAAGTACACAAG (SEQ ID NO:18)
HoxA8 F	CTTCTCCAGTTCCAGCGTCT (SEQ ID NO:19)
HoxA8 R	AGGTAGCGGTTGAAATGGAA (SEQ ID NO:20)
HoxA9 F	ATGCTTGTGGTTCTCCTCCA (SEQ ID NO:21)
HoxA9 R	GTTCCAGCGTCTGGTGTTTT (SEQ ID NO :22)
Ген	Праймеры для кПЦР у человека
E-CAD F	GACCGGTGCAATCTTCAAA (SEQ ID NO:23)
E-CAD R	TTGACGCCGAGAGCTACAC (SEQ ID NO :24)
HPRT F	CATTATGCCGAGGATTTGG (SEQ ID NO:25)

- 15 036889

HPRT R	GCAAGTCTTTCAGTCCTGT (SEQ ID NO:26)
ΒΆΡ1 F	CGATCCATTTGAACAGGAAGA (SEQ ID NO :27)
ВАР1 R	CTCGTGGAAGATTTCGGTGT (SEQ ID NO :28)
Ген	Праймеры для кПЦР CHIP (человек)
EZH2-1 F	AGCTGACTCAAGCTGCTTGT (SEQ ID NO :29)
EZH2-1 R	CAGGAAACCTGAGATTTTCA (SEQ ID NO:30)
EZH2-2 F	CTCAGGACAG TTCTGTTTGG (SEQ ID NO:31)
EZH2-2 R	TCTGACTTAGTTGGAGAACT (SEQ ID NO :32)
SUZ12-1 R	TGAATACAGATGCAGTTATAAGAGAGA (SEQ ID NO:33)
MORC3 F	CATCTTCCCCAAGCTCCCAAT (SEQ ID NO:34)
MORC3 R	GAGCGAGCTACAAAGCCAGGA (SEQ ID NO:35)
E2F6 F	CCTGTTCCCTTCCTCTGGAA (SEQ ID NO:36)
E2F6 R	CGACGCAGACGGAAAAAGAG (SEQ ID NO :3 7)
PHF20 F	TGAGTGGGGACTTCGTGTTC (SEQ ID NO:38)
PHF20 R	GACCAACCGACAGAAGGACT (SEQ ID NO:39)
JAM2 F	TCCACCCCTAGGCTGAAAAG (SEQ ID NO :40)
JAM2 R	GATCGGCTTTGTGTCTGGTC (SEQ ID NO :41)

Животные: всех животных содержали в центре Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Все процедуры с животными проводили в соответствии с руководствами по уходу и использованию лабораторных животных, и они были одобрены комитетом по уходу и использованию животных института Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

Получение мышей с недостаточностью BAP1 и с недостаточностью BAP1/Ezh2: эмбриональные стволовые клетки с возможностью направленного воздействия на экзоны 6-12 BAP1 получали из European Conditional Mouse Consortium. Выше по последовательности была вставлена фланкированная Frt кассета с преждевременным стоп-сигналом, содержащая кассету lacZ и неомицина. Клоны ES клеток размножали и инъецировали в первичные бластоцисты. Полученных мышей скрещивали с зародышевой линией, удаляющей Flp (The Jackson Laboratory), для вырезания фланкированной Frt кассеты. Затем этих мышей скрещивали с трансгенными мышами с индуцируемым IFN-α Mx1-cre (The Jackson Laboratory) для оценки действия индуцируемой потери ВАР1 в системе гемопоэза. Однопометных мышей BAP1 fl/fl, BAP1 fl/+ и BAP1+/+ генотипировали посредством ПЦР с праймерами ВАР1up (actgcagcaatgtggatctg (SEQ ID NO: 1)),, ВАР1-down (gaaaaggtctgacccagatca (SEQ ID NO: 2) ) с использованием следующих параметров: 95°С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами 94°С в течение 10 с, 65°С в течение 40 с и 72°С в течение 1 мин, а затем 72°С в течение 5 мин. Аллель WT детектировали при 300 п.н., тогда как фланкированный аллель LoxP детектировали при 500 п.н. продукта ПЦР. Вырезание после индукции IFN-α подтверждали посредством ПЦР с праймерами для детекции полос фланкированных LoxP и полос с вырезанными последовательностями: BAP1-F (actgcagcaatgtggatctg (SEQ ID NO: 1)), BAP1-F2 (gcgcaacgcaattaatgata (SEQ ID NO:3)) и BAP1-R (cagtgtccagaatggctcaa (SEQ ID NO. 4) ) ,, с использованием таких же параметров ПЦР, как указано выше. Мышей с Mx1-Cre-BAP1 f/f скрещивали с мышами с Ezh2 f/f 12. Мышам Mx-cre BAP1f/f с возможностью условной делеции и контрольным мышам BAP1f/f проводили четыре интраперитонеальные инъекции поли 1:поли С по 200 мкл раствора 1 мг/мл. Через два недели после вырезания собирали периферическую кровь посредством ретроорбитального кровотечения с использованием гепаринизированных гематокритных капилляров (Thermo Fisher Scientific). Подтверждали вырезание, и количественные показатели периферической крови получали с использованием HemaVet по стандартным инструкциям производителя. Фиксированные в формалине, погруженные в парафин тканевые срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Делецию BAP1 подтверждали посредством ПЦР вырезания из генома и анализа вестерн-блоттинга. Хвосты посылали в сервис генотипирования Transnetyx (Cordova, TN) для генотипирования на основе кПЦР фланкированных LoxP и вырезанных аллелей Ezh2. Вырезание подтверждали посредством вестерн-блоттинга.

Ксенотрансплантаты и введение EPZ011989 In vivo: группам мышей NOD-SCID в возрасте 10 недель подкожно в бок инъецировали 6-10x106 клеток линий мезотелиомы (MSTO-211H, Meso10, H226 и Н2452) в смеси 1: 1 матригеля и среды. Когда опухоли достигали размера приблизительно 60-80 мм³, начинали обработку носителем (0,5% NaCMC+0,1% Tween-80 в воде) или EPZ011989. В течение экспери

- 16 036889 мента EPZ011989 или носитель вводили перорально дважды в сутки в концентрации 500 мг/кг. Объемы опухолей оценивали в трех измерениях с использованием циркуля. После обработки выделяли опухоли или ткань легких и использовали для вестерн-блоттинга для оценки ингибирования мишени. Разрабатывали предустановленные критерии для исключения мышей из экспериментов с ксенотрансплантатами, если после имплантации опухоли не формировались (на 75% меньше, чем среднее у животных с имплантацией из той же самой группы). Животные не исключали из испытаний лекарственного средства. Для всех исследований лекарственного средства на ксенотрансплантатах размер опухоли контролировали в течение 10 суток и после этого мышей случайно распределяли по размеру опухоли. Генетические испытания EPZ011989 при КО BAP1 проводили с рандомизацией с использованием анализа СВС через 3 недели после поли 1:поли С и подтверждали, что средние количества WBC были эквивалентны в обработанных носителем и средством группах. Пять животные в группе обрабатывали перорально носителем (описано выше) или 500 мг/кг EPZ011989 дважды в сутки в течение 16 суток. В этих экспериментах испытания не были слепыми.

Гистологические анализы: мышей умерщвляли и подвергали аутопсии, а затем выделенные образцы тканей фиксировали в течение 24 ч в 4% параформальдегиде, дегидратировали и заливали парафином. Парафиновые блоки нарезали по 4 мкм и окрашивали Н&Е, Ki67, на Е-кадгерин или TUNEL. Изображения получали с использованием микроскопа Axio Observer A1 (Carl Zeiss).

Культура клеток: клетки 293Т культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) и заменимыми аминокислотами. Линии клеток лейкоза человека (SET2) и линии клеток мезотелиомы человека (JMN, Met5a, MSTO-211H, Н2373, Н226, Н2452) культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS. MSTO-211H получали из АТСС, тогда как остальные линии мезотелиомы представляли собой щедрый подарок Prasad Adusumilli.

Выделение РНК, амплификация SMARTer, секвенирование и анализ транскриптома в Proton: клетки костного мозга сортировали в устройстве FACS на GMP (Lin^-c^-Kit⁺Sca1^-CD34+FcY⁺) с использованием FACS Aria. Выделяли тотальную РНК из 200-500К клеток с использованием реагентов для выделения РНК TRIzol (кат. № 15596-026, Life Technologies). До амплификации подтверждали качество РНК посредством анализа 20-50 пг каждого образца с использованием набора RNA 6000 pico и bioAnalyzer (Agilent). Затем 10 нг тотальной РНК высокого качества (RIN>8) амплифицировали с использованием набора для секвенирования малых количеств РНК SMARTER® Universal Low Input RNA Kit for Sequencing (Clonetech Laboratory, кат. № 634940) по инструкциям, предоставляемым производителем. Из амплифицированного материала получали библиотеку полного транскриптома по протоколу для набора Ion Total RNA-Seq Kit v2 (Life Technologies) с 16 циклами ПЦР. На образцы наносили штрих-код и получали содержащие матрицу частицы ION pi™ ION SPHERE™ (ISP) с использованием системы ion One Touch II и набора ION PI™ Template OT2 200kit v2 (Life Technologies). Обогащенные частицы подвергали секвенированию в системе секвенирования Proton с использованием химического состава для 200 п.н. версии 2. Получали в среднем от 70 до 80 млн прочтений на образец и 76 до 82% прочтений картировали на основания иРНК. ВАМ с сырым выходом обратно конвертировали в FASTQ с использованием PICARD Sam2Fastq. Затем прочтения сначала картировали на геном мыши с использованием rnaStar. Используемым геномом был ММ9 с соединениями из ENSEMBL (Mus_musculus.NCBIM37.67) и с выступом прочтений 49. Затем любые некартированные прочтения картировали на ММ9 с использованием BWA MEM (версии 0.7.5а). Затем два картированных ВАМ объединяли, сортировали и рассчитывали количества на уровне генов с использованием htseq-count (параметры -s y -m intersection-strict) и с теми же моделями генов (Mus musculus.NCBIM37.67). Сырые данные загрузили в базу данных GEO со следующим номером доступа: GSE61360.

Выделение гистонов, ELISA гистонов, вестерн-блоттинг гистонов и LC/MS гистонов: гистоны выделяли стандартными способами выделения или в течение ночи с использованием набора Active Motif Histone Extraction Minikit (40026). ELISA гистонов проводили с использованием набора для Elisa триметил-К27 (Active Motif, 53106), нормализуя по стандартной кривой H3K27me3 и общему белку H3. Вестерн-блоттинг гистонов проводили с 3-5 мкг гистонов. Для LC/MS гистонов лизировали 12 млн контрольных клеток и клеток с КО BAP1, выделяли ядра, гистоны выделяли с использованием 0,4 Н H2SO4 и химически дериватизировали с использованием пропионового ангидрида, как описано ранее 26. Затем гистоны расщепляли трипсином и разделяли посредством жидкостной нахроматографии (вн. диам. 75 мкм, длина 15 см, упаковка средой MagicC18aq, д.ф. 3 мкм) с выводом на масс-спектрометр TSQ Quantum Ultra. Данные анализировали с использованием Skyline 27 и проводили относительный количественный анализ по площадям пиков.

Получение и иммунопреципитация хроматина, получение и секвенирование библиотеки ChIP и анализ данных ChIP-Seq: клетки костного мозга обогащали клетками c-Kit⁺ с использованием набора для обогащения гемопоэтических клеток мыши EasySep Mouse Hematopoietic cell Enrichment Kit (Stem Cell Technologies, 19756). 5х10⁶ клеток фиксировали в 1% растворе формальдегида без метанола, а затем ресуспендировали в буфере для лизиса с SDS. Лизаты обрабатывали ультразвуком в фокусируемом ультразвуковом устройстве Е220 (Covaris) до желаемого распределения размера фрагментов 100-500 пар осно

- 17 036889 ваний. Реакции IP проводили с использованием антител к триметил-Н3К27 (Cell Signaling, 9733), антител к монометил-H4K20 (Abcam, 9051) и IgG (Santa Cruz, 2027), каждую приблизительно на 400000 клетках, как описано ранее (Krivtsov et al., 2008). Анализы ChIP обрабатывали в системе SX-8G IP-STAR Compact Automated System (Diagenode) с использованием протокола Direct ChIP, как описано в другом документе (O'Geen et al., 2011). Затем у элюированных фрагментов хроматина убирали сшивки и очищали фрагменты ДНК с использованием гранул Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter).

Из обогащенной ChIP и вводимой ДНК получали библиотеки со штрих-кодом с использованием набора готовой смеси NEBNext ChIP-Seq Library Prep Master Mix Set для Illumina (New England Biolabs) и адаптеров TruSeq (Illumina) по инструкциям производителя в устройстве SX-8G IP-STAR Compact Automated System (Diagenode). Для амплификации библиотек использовали высокоточную ДНК-полимеразу Phusion (New England Biolabs) и праймеры для ПЦР TruSeq (Illumina), после чего библиотеки очищали с удалением димеров адаптеров с использованием гранул AMPure XP и мультиплексировали на HiSeq 2000 (Illumina).

Прочтения корректировали по качеству и обрезали адаптере с использованием trim_galore с последующим выравниванием по сборке мыши mm9 посредством bowtie2 с использованием параметров по умолчанию. Перед последующим анализом выровненные прочтения с одним и тем же начальным положением и ориентацией сжимали в одно прочтение. Получали профили плотности посредством продления каждого прочтения до среднего размера фрагмента библиотеки, а затем подсчитывали плотность с использованием комплекта BEDTools. Обогащенные области выявляли с использованием MACS 1.4 с параметрами по умолчанию и индексировали по сравнению с соответствующими входными библиотеками. Все трэки геномного браузера и таблицы плотности прочтений нормализовали на глубину секвенирования. Для сравнения образцов ChIP-seq в условиях контроля и КО тестировали сигналы в трех повторениях на состояние с использованием U-критерия Манна-Уитни или t-критерия. Кластерный анализ проводили на нормализованных количественных данных в Matlab с использованием пакета кластерного анализа kmeans. Анализ мотивов проводили в Homer с использованием параметров по умолчанию программы findMotifsGenome.

Вестерн-блоттинг и иммунопреципитация: клетки для экспериментов вестерн-блоттинга и иммунопреципитации лизировали в следующем буфере: 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА, 1% Triton, протеазы arrest (EMD) и ингибиторов фосфатаза (Calbiochem). Для проведения иммунопреципитации в присутствии бензоназы клетки лизировали в буфере ВС-300: 20 мМ Tris (рН 7,4), 10% глицерин, 300 мМ KCl, 0,1% NP-40. Очищенный лизат обрабатывали MgCl₂ до 2,5 мМ и добавляли бензоназу в концентрации 1250 Ед/мл. Лизат инкубировали в течение 1 ч с центрифугированием и реакцию терминировали, добавляя 5 мМ ЭДТА. Расщепление ДНК подтверждали, запуская лизат до постановки эксперимента по иммунопреципитации на геле с бромистым этидием. Используемые антитела включали антитела к: ВАР1 (С-4; Santa Cruz sc-28383), EZH2 (Active Motif, 39933, Active Motif, 39901 или Millipore, 07-689), SUZ12 (Abcam, Ab12073), ASXL1 (N-13; Santa Cruz sc-85283), L3MBTL2 (Active Motif, 39569), Мус-Tag (Cell Signaling, 2276), тубулину (Sigma, T9026), H3K27me3 (Abcam, 6002 или Millipore, 07-449), H3 (Abcam, АЫ791) и H4K20me1 (Abcam, Ab9051).

Анализы и антитела для проточной цитометрии: окрашивание поверхностных маркеров живых клеток костного мозга и селезенки проводили посредством начального лизирования клеток буфером для лизиса с хлоридом аммония-бикарбонатом калия и отмывкой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS). Клетки окрашивали антителами в PBS в течение 20 мин на льду. Для окрашивания гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников клетки окрашивали смесью для линий, включающей CD4 (RM4-5), CD3 (17А2), В220 (ИАЗ-6В2), NK1.1 (РК136), Gr-1 (RB6-8C5), Cd11b (M1/70) и Ter119, обеспечивая исключение из анализа зрелых линий. Клетки также окрашивали антителами к c-Kit (2B8), Sca-1 (D7), FcyRII/III (2.4G2) и CD34 (RAM34). Для оценки состава зрелых мононуклеарных клеток использовали Mac1, Gr-1, B220 и CD4/CD3. Анализ клеточного цикла проводили посредством окрашивания клеток смесью для гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, описанной выше. Клетки фиксировали с использованием набора FIX and PERM (Invitrogen, кат. № GAS-003). Клетки после фиксации окрашивали Ki67, а затем окрашивали DAPI с последующим анализом на LSR Fortessa.

Плазмиды: полноразмерный клон кДНК FLAG-L3MBTL2 человека получали из Addgene (плазмида 28232). Меченная Myc-His конструкция убиквитина представляла собой щедрый подарок Xuejun Jiang. Полноразмерный клон кДНК НА-FLAG BAP1 человека получали из Addgene (плазмида 22539). Меченная 3Х FLAG конструкция ВАР1 представляла собой щедрый подарок Marc Ladanyi. Конструкции мутантной деубиквитиназы (С91А, C91S) получали с использованием наборов для сайт-специфического мутагенеза Agilent и подтверждали посредством секвенирования полноразмерной ДНК.

Короткошпилечную РНК получали из консорциума RNAi Consortium (TRC) в векторе pLKO.1пуромицин. Последовательности для коротких шпилек представляли собой следующее: ВАР1 человека (ID TRC Oligo: TRCN0000078702 и TRCN0000078698), ВАР1 мыши (TRCN0000030719 и TRCN0000030720), L3MBTL2 человека (TRCN0000021724 и TRCN0000021726) и контрольный вектор PLKO.I-пуромицин, кодирующий кшРНК для люциферазы (shLUC).

Анализы убиквитина: клетки НЕК293Т высевали в 10-см чашку и через 24 ч транедуцировали 4 мкг

- 18 036889 экспрессирующей конструкции Myc-His-Ubi и контролем, 1 мкг сверхэкспрессирующих конструкций L3MBTL2 и/или 1-10 мкг BAP1-GFP. Через 48 ч после трансфекции клетки лизировали в буфере для лизиса на основе гуанидина НС1: 6 М гуанидин, 0,1 М NaH₂PO₄, 10 мМ Tris, pH 8,0 и 10 мМ ВМЕ. Белки His-Ubi очищали посредством инкубации в 20 мкл Ni-NTA-агарозы (Qiagen) в течение 4 ч при комнатной температуре. Гранулы отмывали последовательно по 1 мл 4 отмывочными буферами: буфер А - 6 М гуанидин, 0,1 М NaH₂PO₄, 10 мМ Tris, pH 8,0, 10 мМ ВМЕ и 0,2% Triton-X; буфер В - 8 М мочевина, 0,1 М NaH₂PO₄, 10 мМ Tris, pH 8,0, 10 мМ ВМЕ и 0,2% Triton-X; буфер С - 0,1 М NaH₂PO₄, 10 мМ Tris, pH 6,3, 10 мМ ВМЕ и 0,2% Triton-X; буфер D - 0,1 М NaH₂PO₄, 10 мМ Tris, pH 6,3, 10 мМ ВМЕ и 0,1% Triton-X. Все буферы дополняли 15 мМ имидазолом. Меченные His белки очищали от гранул посредством кипячения с буфером Лэммли с 2х SDS, дополненным имидазолом. Затем белки анализировали посредством вестерн-блоттинга.

Анализы формирования колоний In vitro: клетки сортировали на клетки Lin^-c-Kit⁺Sca1⁺ с использованием FACSAria. 100 клеток в двух повторениях высевали в метилцеллюлозу (MethoCult GF M3434, Stem Cell Technologies). Через 14 суток после высевания подсчитывали колонии и колонии собирали посредством отмывки PBS. Затем клетки лизировали для выделения РНК и гистонов.

Транзиторная трансфекция: клетки 293Т трансфицировали указанными конструкциями с использованием реагента для трансфекции генов X-treme (Roche). Белок и/или гистоны выделяли через 48-72 ч после трансфекции.

Анализы инвазии: клетки мезотелиомы (MSTO-211H, Н2373, Н226 и Н2452) высевали в колбы Т75 (100000 клеток). Через 12 ч высеянные клетки обрабатывали GSK126 (0-2 мкМ) (Chemitek), a затем оставляли для пролиферации на 7 суток. Затем 250000 обработанных клеток помещали на верх инвазионной камеры Matrigel (BD Biosciences, каталожный номер 354480) в средах, не содержащих сыворотки, а нижняя камера содержала среды с сывороткой. Через 22 ч клетки на нижней стороне мембраны окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали с использованием Image J.

Анализы люциферазы: клетки 293Т в дополнение к конструкциям с EV, BAP1 и L3MBTL2 транзиторно трансфицировали репортерной конструкцией с промотором EZH2 pGL3 (щедрый подарок Naomi Goldfinger) и контрольной конструкцией Switchgear Renilla. Клетки оценивали на люциферазную активность с использованием системы анализа DualLuciferase Reporter Assay System (Promega). Клетки высевали в 24-луночные планшеты и совместно трансфицировали 200 нг конструкции pGL3-EZH2люцифераза, 200 нг контрольной конструкции люциферазы Renilla и 500 нг экспериментальных конструкций. После трансфекции клетки инкубировали 48 ч, лизировали в течение 15 мин при комнатной температуре и оценивали люциферазную активность на люминометре. Показатели люцифераза светляка нормализовали на контроль трансфекции Renilla.

Статистические анализы: для анализа статистической значимости, не учитывая того, что описано в тексте, использовали t-критерий Стьюдента с коррекцией Уэлша. Для статистических расчетов использовали программное обеспечение GraphPad Prizm. Ошибку рассчитывали с использованием SEM, *р<0,05, **р<0,005.

Результаты.

Геномные исследования идентифицировали соматические мутации в опухолевых супрессорах ASXL1 и ВАР1 при различных злокачественных новообразованиях. Гомолог Asx дрозофилы ASXL1 и гомолог Calypso BAP1 формируют комплекс, который удаляет H2AK119Ub (Scheuermann et al., 2010). Однако не показано, что комплекс BAP1-ASXL1 играет роль в трансформации мутанта ВАР1. Инактивирующие мутации в ASXL1 являются наиболее частыми в миелоидных злокачественных новообразованиях (Abdel-Wahab et al., 2011; Bejar et al., 2011; Gelsi-Boyer et al., 2009), тогда как повторяющиеся мутации ВАР1 часто наблюдают при мезотелиоме (Bott et al., 2011), почечноклеточной карциноме (Pena-Llopis et al., 2012) и метастатической увеальной меланоме (Harbour et al., 2010), что позволяет полагать, что ВАР1 и ASXL1 играют существенные роли в опухолевой супрессии. Эти профили мутаций нельзя объяснить дифференциальной тканеспецифической экспрессией ВАР1 и ASXL1 (фиг. 5а-с). Этот пример определяет механизмы, посредством которых потеря ВАР1 приводит к трансформации, независимо от ASXL1, и определяет терапевтические уязвимости в мутантных по ВАР1 злокачественных клетках.

Недавние исследования продемонстрировали, что соматическая потеря ВАР1 может способствовать гемопоэтической трансформации (Dey et al., 2012). Проведены исследования влияния условной делеции BAP1 на экспрессию генов и состояние хроматина в гемопоэтических клетках (фиг. 5а, b). Условную делецию BAP1 получали с использованием схемы, представленной на фиг. 5d. Использовали МХ-Cre, рекомбиназу, которая обуславливает делецию BAP1 в гемопоэтических тканях после индукции у взрослого животного. Потеря ВАР1 приводили к полностью пенетрантному миелопролиферативному заболеванию со спленомегалией (фиг. 6а), лейкоцитозом (фиг. 5e, f), анемией (фиг. 5g, h) и размножением гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (GMP) (фиг. 5i-k). Например, у мышей с нокаутом (КО) BAP1 наблюдали, что размер, например масса и длина селезенки, превышают размер у мышей с ВАР1 дикого типа (фиг. 6а, 10с и 11с). Также наблюдали усиление пролиферации и прохождения клеточного цикла у миелоидных предшественников с дефицитом BAP1 (фиг. 5L). Анализ последовательностей РНК выявил, что у большинства дифференциально экспрессируемых генов в GMP с дефицитом

- 19 036889

BAP1 была снижена экспрессия (р-корр<0,001) (фиг. 7а). Хотя наблюдали значимое перекрытие наборов дифференциально экспрессируемых генов в предшественниках с КО BAP1 и Asxl1, во многих случаях наблюдали парадоксальное обратное действие на экспрессию генов (фиг. 6В). Анализ представленности групп генов (GSEA) идентифицировал наборы генов с обратным воздействием, представленные в предшественниках с КО BAP1 и Asxl1 (Abdel-Wahab et al., 2013) (фиг. 7b). Сайленсинг ASXL1 приводит к повышению экспрессии генов кластера HoxA в соответствии с уменьшенной активностью PRC2 (AbdelWahab et al., 2012). В отличие от этого, в клетках с дефицитом BAP1 наблюдали сниженную экспрессию представителей генов HoxA (фиг. 6с) и сниженную экспрессию групп генов HoxA (фиг. 7с). Эти данные демонстрируют, что потеря Asxl1 и BAP1 оказывает противоположное действие на регуляцию генов.

ASXL1 напрямую взаимодействует с комплексом PRC2 и удаление ASXL1 уменьшает количество общего и сайт-специфического H3K27me3 (Abdel-Wahab et al., 2012). Принимая во внимание различное действие потери Asxl1 и ВАР1 на экспрессию генов, исследовали влияние делеции BAP1 на H3K27me3. При масс-спектрометрии (фиг. 6d), вестерн-блоттинге (фиг. 6е) и ELISA (фиг. 8а) гистонов наблюдали увеличение уровней H3K27me3 в клетках с КО BAP1. Секвенирование после иммунопреципитации хроматина (ChIP-Seq) с H3K27me3 выявило общее увеличение у мышей с КО BAP1 (фиг. 6f) с увеличением количества широких доменов H3K27me3 (Beguelin et al., 2013) (фиг. 6g) и увеличением распространенности широких доменов H3K27me3 в соседние локусы (фиг. 6h). Это увеличение количества и распространения H3K27me3 хорошо видно в локусе HoxA клеток с КО BAP1 (фиг. 6i). Участки, маркированные H3K27me3, в клетках с КО BAP1 преимущественно находятся в промоторных областях генов (фиг. 8b), и гены с захваченными H3K27me3 промоторами были обогащены по усиленной репрессии (FDR<0,001) (фиг. 6j). Подобные результаты наблюдали в очищенных GMP (фиг. 6k). Гены с нарушенной регуляцией посредством ассоциированного с КО BAP1 H3K27me3 и репрессии генов участвовали в зависимой от EZH2 регуляции, коммитировании/дифференцировке и пролиферации линий клеток (фиг. 6l, фиг. 8с). Сайленсинг ВАР1 увеличивал уровни H3K27me3 (фиг. 9а), а реэкспрессия ВАР1 в клетках с дефицитом BAP1 снижала уровни H3K27me3 (фиг. 9b). В отличие от этого, аллель ВАР1 с дефицитом деубиквитиназы не снижал уровень H3K27me3 (фиг. 9с), демонстрируя, что изменения уровня H3K27me3 происходят вследствие каталитической активности ВАР1.

Затем оценивали роль опосредуемого PRC2 H3K27me3 на зависимую от ВАР1 трансформацию, исследуя влияние потери Ezh2 (Su et al., 2003) на трансформацию in vivo. Делеция Ezh2 снижала уровни H3K27me3 у мышей с дефицитом BAP1/Ezh2 по сравнению с мышами с нокаутом BAP1 (фиг. 11а). Делеция Ezh2 устраняла миелоидные злокачественные новообразования, индуцируемые потерей ВАР1 (фиг. 10а), с ослабленными спленомегалией (фиг. 11b, с), лейкоцитозом (фиг. 11d) и анемией (фиг. 11е). Совместная потеря BAP1/Ezh2 уменьшала размножение миелоидных предшественников (фиг. 11f), уменьшала размножение миелоидных клеток Mac1⁺Gr1⁺ (фиг. 11g) и восстанавливала эритроидную дифференцировку (CD71⁺Ter119⁺) (фиг. 10b). Наблюдали сниженную пролиферацию предшественников с дефицитом BAP1/Ezh2 (фиг. 11h). Гаплонедостаточность Ezh2 снижала, но не устраняла, миелопролиферация при дефиците BAP1 (фиг. 10с, d) в соответствии с зависимой от дозы необходимостью Ezh2. В соответствии с генетическими данными обработка мышей с КО BAP1 низкомолекулярным ингибитором EPZ011989 (Campbell et al., 2015) уменьшала уровни H3K27me3, спленомегалию и количество лейкоцитов (фиг. 11i-k). Эти данные демонстрируют, что для миелоидной трансформации с дефицитом BAP1 необходимы PRC2 и специфическая активность EZH2.

Затем исследовали механизм, посредством которого делеция BAP1 повышала уровни H3K27me3. В отличие от описанных взаимодействий между ASXL1 и ВАР1 и между ASXL1 и PRC2, взаимодействие между ВАР1 и EZH2 посредством совместной IP не идентифицировано (фиг. 13а). Наблюдали повышение иРНК и экспрессии белка Ezh2 и Suz12 (фиг. 13b, с) в соответствии с ролью BAP1 в регуляции экспрессии PRC2. Кроме того, анализ отсортированных клеток Lin^-Sca'Kit' (популяция, содержащая гемопоэтические стволовые клетки) из всего костного мозга мышей с КО BAP1 продемонстрировал значимое повышение экспрессии РНК Suz12 и Ezh2 по сравнению с мышами с ВАР1 дикого типа (фиг. 17). Кроме того, вестерн-блоттинг всего костного мозга выявил повышение экспрессии белка EZH2 и SUZ12 в клетках с КО BAP1 по сравнению с контрольными клетками (фиг. 17). Реэкспрессия ВАР1 в клетках костного мозга с КО BAP1 снижала экспрессию иРНК Ezh2 до нормальных уровней (фиг. 12а). Предположено, что потеря ВАР1 может непосредственно изменять другие маркеры гистонов, которые затем могут изменять состояние хроматина по ключевым локусам-мишеням, включая EZH2. Масс-спектрометрия гистонов выявила заметное снижение уровней H4K20me1 в клетках с КО BAP1 (фиг. 13d) по сравнению с другими определяемыми маркерами гистонов (фиг. 12b). Экспрессия ВАР1, но не ASXL1 или BMI1, повышала уровни H4K20me1 в локусе EZH2 (фиг. 12с). Таким образом, предположено, что потеря маркера H4K20me1 может играть важную роль в зависимой от ВАР1 экспрессии генов. Единственной известной метилтрансферазой, формирующей H4K20me1, является SETD8 (Nishioka et al., 2002). Экспрессия SETD8 в клетках мезотелиомы с мутантным ВАР1 (Н226, Н2452) увеличивала апоптоз и снижала пролиферацию, тогда как клетки дикого типа (MSTO-211H и Meso10) оставались нетронутыми (фиг. 13e, f). Сверхэкспрессия SETD8 в клетках мезотелиомы снижала экспрессию иРНК и белка EZH2 (фиг. 13g, h). Линии клеток с ВАР1 дикого типа были более чувствительны к ингибитору SETD8 (Blum et al., 2014)

- 20 036889 (BVT594), чем линии клеток с мутантным ВАР1 (фиг. 13i).

Предположено, что ВАР1 деубиквитинизирует модулятор хроматина, которые регулирует H4K20me1. Анализ данных ChIP-Seq (Abdel-Wahab et al., 2013; Dey et al., 2012) идентифицировал кластер генов с захватом BAP1, но не связыванием с Asxl1 (клеатер 1) и были обогащены мотивом Е-бокс (фиг. 14а, b). Предыдущие исследования продемонстрировали, что атипичные белки группы поликомб L3MBTL1 и L3MBTL2 связывают мотивы Е-бокс, и могут связывать и поддерживать уровень H4K20me1 (Guo et al., 2009; Qin et al., 2012; Trojer et al., 2011; Trojer et al., 2007). Мыши с дефицитом L3mbtll не обладают выраженным фенотипом (Qin et al., 2010), тогда как у мышей с дефицитом L3mbtl2 наблюдают эмбриональную летальность сходную по времени с потерей ВАР1 (Dey et al., 2012; Qin et al., 2012). Таким образом, исследовали, приводит ли потеря ВАР1 к изменениям экспрессии L3mbtl2. Была снижена экспрессия белка, но не РНК, L3MBTL2 в гемопоэтических клетках с КО Bap1 (фиг. 15А,В) и в клетках мезотелиомы с мутантным ВАР1 по сравнению с клетками мезотелиомы с ВАР1 дикого типа (фиг. 13j). Было снижено убиквитинирование L3MBTL2 в клетках, экспрессирующих ВАР1 (фиг. 13k), а обработка ингибитором протеасом увеличивала стабильность L3MBTL2 в клетках с мутантным ВАР1 (фиг. 15с). Экспрессия L3MBTL2 снижает уровни белка EZH2 с коэкспрессией ВАР1 и без нее (фиг. 15d) и экспрессия ВАР1 или сверхэкспрессия L3MBTL2 снижали активность промотора EZH2 (фиг. 15е). В отличие от этого, сайленсинг L3MBTL2 повышал экспрессию EZH2 (фиг. 15f). В клетках, экспрессирующих L3MBTL2 и ВАР1, наблюдали обогащение L3MBTL2 и ВАР1 в локусе EZH2 (фиг. 15g, h). He будучи связанными с конкретной теорией, эти данные позволяют предполагать, что ВАР1 и L3MBTL2 взаимодействуют (фиг. 15i) и совместно оккупируют локус EZH2. Потеря ВАР1 приводит к снижению стабильности L3MBTL2 и повышению выхода транскрипции EZH2 (фиг. 13l).

Анализ данных TCGA выявил, что экспрессия иРНК EZH2 при мезотелиоме увеличена (фиг. 16а). Затем оценивали, может ли ингибирование EZH2 препятствовать выживанию линий клеток мезотелиомы с мутантным ВАР1. Сайленсинг EZH2 индуцировал апоптоз в линиях клеток с мутантным ВАР1, тогда как линии клеток дикого типа продолжали пролиферировать (фиг. 16b, с). Сайленсинг EZH2 устранял формирование опухоли in vivo у линий клеток с мутантным ВАР1, но не линий клеток дикого типа (фиг. 16d). Сверхэкспрессия EZH2 в линиях клеток с ВАР1 дикого типа увеличивала пролиферацию (фиг. 20а) и чувствительность к ингибированию EZH2 (фиг. 20b). Линии клеток с мутантным ВАР1 были более чувствительны к ингибированию EZH2 (EPZ011989) in vitro в 2d (фиг. 16е) и 3d культурах (фиг. 16f). Затем оценивали влияние ингибирования EZH2 in vivo. Ингибирование EZH2 значимо снижало размер опухоли с мутантным ВАР1 по сравнению с обработанными носителем мышами (фиг. 16g), тогда как опухоли дикого типа были менее чувствительными/нечувствительными к ингибированию EZH2 (фиг. 16h), несмотря на сходное действие на H3K27me3. Ингибирование EZH2 устраняло метастазирование в легкие у линий клеток мезотелиомы с метастатическим потенциалом с мутантным ВАР1 (фиг. 16g) в соответствии с ролью BAP1/EZH2 в метастазировании (Harbour et al., 2010). Ингибирование EZH2 снижало инвазию и повышала экспрессию Е-кадгерина in vitro (фиг. 20c-d). Затем оценивали влияние ингибирования EZH2 с использованием ингибитора ВАР1 GSK126. Клетки мезотелиомы с мутантным ВАР1 инъецировали в бок мышам NOD-SCID, а затем, после формирования опухоли, начинали обработку носителем или 150 мг/кг GSK126. Ингибирование EZH2 значимо снижало размер опухоли по сравнению с обработанными носителем мыши (фиг. 21а и фиг. 4). Обработка GSK126 значимо снижала H3K27me3 в клетках с мутантным ВАР1 in vivo (фиг. 21b). Патологический анализ выявил, что ингибирование EZH2 было ассоциировано со сниженным окрашиванием Ki67 и повышенным окрашиванием TUNEL (фиг. 21с). Эти данные означают, что EZH2 представляет потенциальную терапевтическую мишень в мутантных по ВАР1 злокачественных клетках.

Идентификация онкогенных мутаций EZH2 (Morin et al., 2010; Morin et al., 2011; Pasqualucci et al., 2011) привела к разработке специфичных для мутантов эпигенетических лечебных средств. Однако большинство мутаций в эпигенетических регуляторах приводят к потере функции так, что они не представляют собой легкие непосредственные терапевтические мишени. Ингибиторы EZH2 недавно начали тестировать в клинических испытаниях (McCabe et al., 2012), и описываемые данные позволяют предполагать, что потеря ВАР1 приводит к специфичной для мутаций зависимости PRC2, которую необходимо дополнительно исследовать в доклинических и клинических исследованиях. Эти данные перекликаются с недавними исследованиями, позволяющими предполагать наличие у ингибирования PRC2 роли в мутантных по SWI/SNF рабдоидных опухолях (Alimova et al., 2013; Knutson et al., 2013), и анализы продемонстрировали, что мутации ВАР1 являются взаимоисключающими с мутациями SWI/SNF (Wilson et al., 2010). Эти данные позволяют предполагать, что подробные исследования мутаций в эпигенетических регуляторах можно использовать для информирования разработчиков лечебных средств, которые обращают специфичное для мутантов действие на эпигенетическое состояние в различных случаях злокачественных опухолей.

Обсуждение

ВАР1 и ASXL1 взаимодействуют с формированием деубиквитиназного комплекса поликомб, который может устранять моноубиквитин лизина 119 гистона Н2А (H2AK119Ub). Однако ВАР1 и ASXL1 в различных типах злокачественных опухолей являются мутантными в соответствии с независимыми ро

- 21 036889 лями в регуляции эпигенетического состояния и в злокачественной трансформации. В этом примере продемонстрировано, что потеря ВАР1 приводит к повышенному уровню триметилированного лизина 27 гистона H3 (H3K27me3), повышенной экспрессии EZH2 и повышенной репрессии мишеней репрессивного комплекса поликомб 2 (PRC2). Эти результаты отличаются от снижения уровня H3K27me3, наблюдаемого при потере Asxl1. Условная делеция BAP1 и Ezh2 in vivo устраняет размножение миелоидных предшественников, индуцируемое потерей одного ВАР1. Потеря ВАР1 приводит к заметному снижению монометилирования H4K20 (H4K20me1). В соответствии с ролью H4K20me1 в регуляции транскрипции EZH2, экспрессия SETD8, метилтрансферазы H4K20me1, снижает экспрессию EZH2 и устраняет пролиферацию клеток с мутантным ВАР1. Кроме того, клетки мезотелиомы, в которых отсутствует ВАР1, чувствительны к фармакологическому ингибированию EZH2, позволяя предполагать новый подход к терапии злокачественных новообразований с мутантным ВАР1.

Ссылки.

Abdel-Wahab, О., Adil, М., LaFave, L.M., Gao, J., Hricik,

T., Shih, A.H., Pandey, S., Patel, J.P., Chung, Y.R., Koche, R., et al. (2012) . ASXL1 mutations promote myeloid transformation through loss of PRC2-mediated gene repression. Cancer Cell 22, 180-193.

Abdel-Wahab, 0., Gao, J., Adil, M., Dey, A., Trimarchi, T., Chung, Y.R., Kuscu, C., Hricik, T., Ndiaye-Lobry, D., Lafave, L.M., et al. (2013). Deletion of Asxll results in myelodysplasia and severe developmental defects in vivo. J Exp Med 210, 26412659.

Abdel-Wahab, 0., Pardanani, A., Patel, J., Wadleigh, M., Lasho, T., Heguy, A., Beran, M., Gilliland, D.G., Levine, R.L., and Tefferi, A. (2011) . Concomitant analysis of EZH2 and ASXL1 mutations in myelofibrosis, chronic myelomonocytic leukemia and blast-phase myeloproliferative neoplasms. Leukemia 25, 12001202.

Alimova, I., Birks, D.K., Harris, P.S., Knipstein, J.A., Venkataraman, S., Marquez, V.E., Foreman, N.K., and Vibhakar, R. (2013) . Inhibition of EZH2 suppresses self-renewal and induces radiation sensitivity in atypical rhabdoid teratoid tumor cells. Neuro Oncol 15, 149-160.

Beguelin, W., Popovic, R., Teater, M., Jiang, Y., Bunting, K.L., Rosen, M., Shen, H., Yang, S.N., Wang, L., Ezponda, T., et al. (2013) . EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell 23, 677-692.

Bejar, R., Stevenson, K., Abdel-Wahab, 0., Galili, N., Nilsson, B., Garcia-Manero, G., Kantarjian, H., Raza, A., Levine, R.L., Neuberg, D., et al. (2011). Clinical effect of point mutations in myelodysplastic syndromes. The New England journal of medicine 364, 2496-2506.

Blum, G., Ibanez, G., Rao, X., Shum, D., Radu, C., Djaballah, H., Rice, J.C., and Luo, M. (2014) . Small-molecule inhibitors of SETD8 with cellular activity. ACS Chem Biol 9, 2471-2478 .

Bott, M., Brevet, M., Taylor, B.S., Shimizu, S., Ito, T., Wang, L., Creaney, J., Lake, R.A., Zakowski, M.F., Reva, B., et al. (2011) . The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly

- 22 036889 inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature genetics 43, 668-672.

Campbell, J.E., Kuntz, K.W., Knutson, S.K., Warholic, N.M., Keilhack, H., Wigle, T.J., Raimondi, A., Klaus, C.R., Rioux, N., Yokoi, A., et al. (2015). EPZ011989, A Potent, Orally-Available EZH2 Inhibitor with Robust in Vivo Activity. ACS Med Chern Lett 6, 491-495.

Dey, A., Seshasayee, D., Noubade, R., French, D.M., Liu, J., Chaurushiya, M.S., Kirkpatrick, D.S., Pham, V.C., Lill, J.R., Bakalarski, C.E., et al. (2012). Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science 337, 1541-1546.

Garcia, B.A., Mollah, S., Ueberheide, B.M., Busby, S.A., Muratore, T.L., Shabanowitz, J., and Hunt, D.F. (2007). Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc 2, 933-938.

Gelsi-Boyer, V., Trouplin, V., Adelaide, J., Bonansea, J., Cervera, N., Carbuccia, N., Lagarde, A., Prebet, T., Nezri, M., Sainty, D., et al. (2009). Mutations of polycomb-associated gene ASXL1 in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocytic leukaemia. British journal of haematology 145, 788-800.

Guo, Y., Nady, N., Qi, C., Allali-Hassani, A., Zhu, H., Pan, P., Adams-Cioaba, M.A., Amaya, M.F., Dong, A., Vedadi, M., et al. (2009). Methylation-state-specific recognition of histones by the МВТ repeat protein L3MBTL2. Nucleic Acids Res 37, 2204-2210.

Harbour, J.W., Onken, M.D., Roberson, E.D., Duan, S., Cao, L., Worley, L.A., Council, M.L., Matatall, K.A., Helms, C., and Bowcock, A.M. (2010). Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science 330, 1410-1413.

Knutson, S.K., Warholic, N.M., Wigle, T.J., Klaus, C.R., Allain, C.J., Raimondi, A., Porter Scott, M., Chesworth, R., Moyer, M.P., Copeland, R.A., et al. (2013). Durable tumor regression in genetically altered malignant rhabdoid tumors by inhibition of methyltransferase EZH2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 7922-7927.

- 23 036889

Krivtsov, A.V. , Feng, Z., Lemieux, M.E., Faber, J., Vempati, S., Sinha, A.U., Xia, X., Jesneck, J., Bracken, A.P., Silverman, L.B., et al. (2008). H3K79 methylation profiles define murine and human MLL-AF4 leukemias. Cancer Cell 14, 355368 .

Lara-Astiaso, D., et al. Immunogenetics. Chromatin state dynamics during blood formation. Science 345, 943-949 (2014) .

Love, M.I., Huber, W., and Anders, S. (2014) . Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seg data with DESeg2. Genome biology 15, 550.

MacLean, B., Tomazela, D.M., Shulman, N., Chambers, M., Finney, G.L., Frewen, B., Kern, R., Tabb, D.L., Liebier, D.C., and MacCoss, M.J. (2010). Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26, 966-968.

McCabe, M.T., Ott, H.M., Ganji, G., Korenchuk, S., Thompson, C., Van Aller, G.S., Liu, Y., Graves, A.P., Della Pietra, A., 3rd, Diaz, E., et al. (2012). EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations. Nature 492, 108-112.

Morin, R.D., Johnson, N.A., Severson, T.M., Mungall, A. J., An, J., Goya, R., Paul, J.E., Boyle, M., Woolcock, B.W., Kuchenbauer, F., et al. (2010) . Somatic mutations altering EZH2 (Tyr641) in follicular and diffuse large В-cell lymphomas of germinal-center origin. Nature genetics 42, 181-185.

Morin, R.D., Mendez-Lago, M., Mungall, A.J., Goya, R., Mungall, K.L., Corbett, R.D., Johnson, N.A., Severson, T.M., Chiu, R., Field, M., et al. (2011). Freguent mutation of histone-modifying genes in non-Hodgkin lymphoma. Nature 476, 298-303.

Nishioka, K., Rice, J.C., Sarma, K., Erdjument-Bromage, H., Werner, J., Wang, Y., Chuikov, S., Valenzuela, P., Tempst, P., Steward, R., et al. (2002). PR-Set7 is a nucleosome-specific methyltransferase that modifies lysine 20 of histone H4 and is associated with silent chromatin. Mol Cell 9, 1201-1213.

- 24 036889

O'Geen, H., Echipare, L., and Farnham, P.J. (2011) . Using ChlP-seq technology to generate high-resolution profiles of histone modifications. Methods Mol Biol 791, 265-286.

Pasqualucci, L., Trifonov, V., Fabbri, G., Ma, J., Rossi, D., Chiarenza, A., Wells, V.A., Grunn, A., Messina, M., Elliot, 0., et al. (2011). Analysis of the coding genome of diffuse large В-cell lymphoma. Nat Genet 43, 830-837.

Pena-Llopis, S., Vega-Rubin-de-Celis, S., Liao, A., Leng, N., Pavia-Jimenez, A., Wang, S., Yamasaki, T., Zhrebker, L., Sivanand, S., Spence, P., et al. (2012). BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nat Genet 44, 751-759.

Phung, Y.T., Barbone, D., Broaddus, V.C., and Ho, M. (2011). Rapid generation of in vitro multicellular spheroids for the study of monoclonal antibody therapy. Journal of Cancer 2, 507-514.

Qin, J., Van Buren, D., Huang, H.S., Zhong, L., Mostoslavsky, R., Akbarian, S., and Hock, H. (2010). Chromatin protein L3MBTL1 is dispensable for development and tumor suppression in mice. J Biol Chern 285, 27767-27775.

Qin, J., Whyte, W.A., Anderssen, E., Apostolou, E., Chen, H.H., Akbarian, S., Bronson, R.T., Hochedlinger, K. , Ramaswamy, S., Young, R.A., et al. (2012). The polycomb group protein L3mbtl2 assembles an atypical PRCl-family complex that is essential in pluripotent stem cells and early development. Cell Stem Cell 11, 319-332.

Scheuermann, J.C., de Ayala Alonso, A.G., Oktaba, K. , LyHartig, N., McGinty, R.K., Fraterman, S., Wilm, M., Muir, T.W., and Muller, J. (2010). Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature 465, 243-247.

Skarnes, W.C., Rosen, B., West, A.P., Koutsourakis, M., Bushell, W., Iyer, V., Mujica, A.0., Thomas, M., Harrow, J., Cox, T., et al. (2011) . A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature 474, 337-342.

Su, I.H., Basavaraj, A., Krutchinsky, A.N., Hobert, 0., Ullrich, A., Chait, B.T., and Tarakhovsky, A. (2003) . Ezh2

- 25 036889 controls В cell development through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat Immunol 4, 124-131.

Suraokar, M.B., Nunez, M.I., Diao, L., Chow, C.W., Kim, D., Behrens, C., Lin, H., Lee, S., Raso, G., Moran, C., et al. (2014). Expression profiling stratifies mesothelioma tumors and signifies deregulation of spindle checkpoint pathway and microtubule network with therapeutic implications. Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO 25, 1184-1192.

Trojer, P., Cao, A.R., Gao, Z. , Li, Y., Zhang, J., Xu, X., Li, G., Losson, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., et al. (2011) . L3MBTL2 protein acts in concert with PcG proteinmediated monoubiquitination of H2A to establish a repressive chromatin structure. Mol Cell 42, 438-450.

Trojer, P., Li, G., Sims, R.J., 3rd, Vaquero, A., Kalakonda, N., Boccuni, P., Lee, D., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Nimer, S.D., et al. (2007). L3MBTL1, a histonemethylation-dependent chromatin lock. Cell 129, 915-928.

Wilson, B.G., Wang, X., Shen, X., McKenna, E.S., Lemieux, M.E., Cho, Y.J., Koellhoffer, E.C., Pomeroy, S.L., Orkin, S.H., and Roberts, C.W. (2010). Epigenetic antagonism between polycomb and SWI/SNF complexes during oncogenic transformation. Cancer Cell 18, 316-328.

В настоящем документе приведены различные ссылки, содержания которых, таким образом, полностью включены в качестве ссылки, в настоящем документе приведены различные номера доступа последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот, и, таким образом, полные последовательности, указанные под этими номерами доступа, полностью включены в качестве ссылки.

Claims (23)

1. Способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий определение уровня экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа, в одной или более клетках злокачественной опухоли, где, если уровень экспрессии указанного биомаркера ВАР1 дикого типа отсутствует или является более низким, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, тогда указанному индивидууму вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EZH2 для лечения злокачественной опухоли, где указанный эталонный контрольный уровень ВАР1 представляет собой уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа в эталонном контрольном образце, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной мезотелиомы, увеальной меланомы, почечноклеточной карциномы, кожной меланомы и рака легких, и где ингибитор EZH2 представляет собой низкомолекулярный ингибитор, конкурирующий с Sаденозилметионином, выбранный из группы, состоящей из EPZ011989, GSK126, EPZ-6438, GSK343, EI1, EPZ005687 и UNC1999.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий определение уровней экспрессии EZH2 и/или SUZ12 в одной или более клетках злокачественной опухоли, где, если уровень экспрессии указанного биомаркера ВАР1 дикого типа отсутствует или является более низким, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, и если уровень экспрессии EZH2 является более высоким, чем эталонный контрольный уровень EZH2, и/или уровень экспрессии SUZ12 является более высоким, чем эталонный контрольный уровень SUZ12, тогда указанному индивидууму вводят ингибитор EZH2.

3. Способ по п.1, где уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа определяют посредством иммунофлуоресценции.

4. Способ по п.1, где уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа определяют посредством вестерн-блоттинга.

5. Способ по п.1, где уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа определяют посредством гибридизации in situ.

6. Способ по п.1, где уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа определяют посредством полимеразной цепной реакции.

- 26 036889

7. Способ по п.1, где уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа определяют с применением реагента, специфически связывающегося с биомаркером ВАР1 дикого типа.

8. Способ по п.7, где реагент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

9. Способ по п.1, где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную мезотелиому.

10. Способ по п.1, где злокачественная опухоль представляет собой увеальную меланому.

11. Способ по п. 1, где злокачественная опухоль представляет собой почечноклеточную карциному.

12. Способ по п.1, где ингибитор EZH2 представляет собой EPZ-6438.

13. Способ определения того, окажет ли, вероятно, ингибитор EZH2 действие против злокачественной опухоли на злокачественную опухоль у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий получение у указанного индивидуума образца злокачественной опухоли;

определение уровня экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа в указанном образце, где, если уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа отсутствует или является более низким, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, вероятно, что указанный ингибитор EZH2 будет оказывать действие против злокачественной опухоли на указанную злокачественную опухоль, где указанный эталонный контрольный уровень ВАР1 представляет собой уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа в эталонном контрольном образце, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной мезотелиомы, увеальной меланомы, почечноклеточной карциномы, кожной меланомы и рака легких, и где ингибитор EZH2 представляет собой низкомолекулярный ингибитор, конкурирующий с Sаденозилметионином, выбранный из группы, состоящей из EPZ011989, GSK126, EPZ-6438, GSK343, EI1, EPZ005687 и UNC1999.

14. Способ по п.13, где биомаркер ВАР1 дикого типа представляет собой биомаркер белок ВАР1.

15. Способ по п.13, где биомаркер ВАР1 дикого типа представляет собой биомаркер нуклеиновую кислоту ВАР1.

16. Способ по п.13, где экспрессию биомаркера ВАР1 определяют посредством иммунофлуоресценции.

17. Способ по п.13, где экспрессию биомаркера ВАР1 определяют посредством вестерн-блоттинга.

18. Способ по п.1, где ингибитор EZH2 представляет собой EPZ-6438.

19. Применение набора для определения того, окажет ли вероятно ингибитор EZH2 действие против злокачественной опухоли на злокачественную опухоль у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный набор содержит средство для детекции биомаркера ВАР1 дикого типа, где указанное средство включает определение уровня экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа в одной или более клетках злокачественной опухоли, полученных от указанного индивидуума, где, если уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа отсутствует или является более низким, чем эталонный контрольный уровень ВАР1, тогда указанному индивидууму вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EZH2 для оказания действия против злокачественной опухоли, где указанный эталонный контрольный уровень ВАР1 представляет собой уровень экспрессии биомаркера ВАР1 дикого типа в эталонном контрольном образце, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной мезотелиомы, увеальной меланомы, почечноклеточной карциномы, кожной меланомы и рака легких, и где ингибитор EZH2 представляет собой низкомолекулярный ингибитор, конкурирующий с Sаденозилметионином, выбранный из группы, состоящей из EPZ011989, GSK126, EPZ-6438, GSK343, EI1, EPZ005687 и UNC1999.

20. Применение по п.19, где средство для детекции биомаркера ВАР1 дикого типа включает один или более упакованных праймеров, зонд, панели/микропанель, специфичное к биомаркеру антитело и/или гранулу.

21. Применение по п.19, где средство для детекции биомаркера ВАР1 включает одно или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов для детекции биомаркера ВАР1.

22. Применение по п.19, где набор дополнительно содержит один или более праймеров, зонд, панели/микропанель, специфичное к биомаркеру антитело и/или гранулу для детекции экспрессии EZH2, экспрессии L3MBTL2 и/или экспрессии SUZ12.

23. Применение по п.19, где ингибитор EZH2 представляет собой EPZ-6438.