EA036081B1

EA036081B1 - Модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания бета-адренорецепторов на поверхности т-лимфоцитов человека

Info

Publication number: EA036081B1
Application number: EA201800542A
Authority: EA
Inventors: Кирилл Алексеевич Зыков; Екатерина Владимировна Смолякова; Юрий Самойлович Скоблов; Наталья Александровна Скоблова; Валерий Павлович Масенко; Лали Гурамовна Амбатьелло; Анна Валерьевна Рвачёва; Ирина Евгеньевна Чазова
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-09-23
Also published as: EA201800542A1

Abstract

Изобретение относится к области медицины и обеспечивает модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания -адренорецепторов (-АР) на поверхности Т-лимфоцитов человека, позволяющий достоверно определять специфическое связывание с 1- и 2-адренорецепторами при их малых концентрациях, на основе которого могут быть выполнены анализы для клинических исследований. Способ включает стадию предынкубации среды, содержащей Т-лимфоциты, с лигандом, специфическим по отношению к 1 и 2-АР, с последующим взаимодействием с [I]цианопиндололом. Техническим результатом является существенное повышение чувствительности анализа в отношении активности связывания 1-АР, а также возможность выявления характерных паттернов изменения характеристик -АР звена под влиянием предынкубации со специфическими лигандами.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины. Более конкретно, изобретение обеспечивает модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания βадренорецепторов (β-АР) на поверхности Т-лимфоцитов человека, позволяющий достоверно определять специфическое связывание с β1- и в2-адренорецепторами при их малых концентрациях, на основе которого могут быть выполнены анализы для клинических исследований.

Предшествующий уровень техники

В структуре неинфекционной патологии наибольшее значение имеют сердечно-сосудистая и бронхо-легочная патологии. Заболевания сердечно-сосудистой системы находятся на первом месте среди причин заболеваемости и смертности, как в России, так и в других странах мира [Чазова И.Е., Чучалин А.Г., Зыков К.А., Ратова Л.Г.//Системные гипертензии. 2013. 10 (1) с. 5-35].

Среди бронхо-легочных патологий особого внимания требуют бронхообструктивные заболевания. [Global Initiative for Asthma (GINA) (updated 2014); Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease (GOLD). Update 2014.] Многим пациентам, имеющим данные патологии, необходимо назначение препаратов, воздействующих на β-адренорецепторы.

Адренорецепторы по своей структуре относятся к группе рецепторов, соединенных с гуаниннуклеотид связывающими белками (G-белок). Анатомически β-адренорецепторы подразделяются на β1-, β2- и β3-aдренорецепторы, среди которых для диагностики и лечения сердечно-сосудистых и бронхолегочных заболеваний наиболее значимы следующие:

1) β1-aдренорецепторы, максимальное количество которых обнаруживают в правом предсердии;

2) β2-адренорецепторы, которые присутствуют преимущественно в легких [Sano М, Yoshimasa Т., Yagura Т., Yamamoto I. Life Sci. 1993. v.52 (12). P.1063-70].

При заболеваниях легких часто в основе терапии лежат β-адреномиметики, а при сердечнососудистых заболеваниях - β-адреноблокаторы, которые для соответствующих рецепторов являются лигандами. Изменения экспрессии и аффинности рецепторов, происходящие под воздействием соответствующих препаратов, часто приводят к снижению эффективности назначенной терапии и в ряде случаев к развитию серьезных побочных эффектов, таких как увеличение частоты сердечных сокращений, удлинение интервала QT, снижение уровня калия, бронхоспазм и др.

Взаимодействие лиганд-рецептор зависит от типа лиганда (агонист или обратный агонист) и проявляется в изменении клеточной активности. Агонисты, связываясь с рецептором, активируют G-белок и увеличивают внутриклеточное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Одновременно с возникновением клинического эффекта данные изменения в клетке также вызывают изменение активности рецептора. Зачастую назначение агонистов приводит к снижению чувствительности к лиганду и десенситизации рецепторов [Mickey J., Tate R., Lefkowitz R.J.J. Biol: Chem. 1975. №250. P. 5727-5729; Perkins J.P., Waldo G.L., Harden T.K. Federation Proc. 1982. V. 41. P. 1327], что в ряде случаев вызывает неблагоприятное изменение клинического течения заболевания в виде утяжеляющейся бронхиальной обструкции и отсутствии ответа на проводимую терапию. Применение антагонистов, напротив, приводит к повышению плотности β-адренорецепторов [Парфенова Е.Ф., Красникова Т.Л., Арипова Н.А. и др. Гер. Архив. 1993. 65 (4). с. 49-52] на поверхности клеток млекопитающих и может повлиять на их аффинность.

Изменения рецепторной активности отмечаются не только под воздействием фармакологических препаратов. Отмечено, что при заболеваниях сердечно-сосудистой и бронхо-легочной систем имеется уже исходно измененный фон активности рецепторов. У пациентов с наличием желудочковой экстрасистолии количество β2-aдренорецепторов на лимфоцитах периферической крови статистически выше, чем у группы нормы [Красникова Т.Л., Юркова В.Б., Кузьмина М.М. и др. Кардиология. 1989. №7. С.25-29].

У пациентов с артериальной гипертонией также отмечается статистически значимо повышенная экспрессия β2-aдренорецепторов по отношению к норме, которая, кроме того, коррелирует с тяжестью заболевания. При этом наличие у последних сердечной недостаточности приводит к снижению показателя максимального связывания β2-лигандов. [Qing F., Rahman S.U., Rhodes C.G. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. 155(3). P. 1130-1134].

При обследовании пациентов с обструктивной патологией легких отмечаются противоречивые данные: в одних источниках сообщается об исходно низкой плотности β2-рецепторов на поверхности клеток крови, тогда как другие не отмечают связи изменения плотности рецепторов на поверхности клеток крови с наличием бронхиальной астмы [P.G. Stanley, L. Duriseti, Sh. Underwood, S. Allred, P.A. Insel. J. Clin. Invest. 1980. V. 65 (3). P.577-585].

Для определения рецепторной активности в последние десятилетия разработан ряд как прямых, так и косвенных методов: оценка изменения аффинности, экспрессии рецепторов, а также их активности за счет изменения вторичных мессенджеров.

Методы связывания с радиоактивными лигандами позволяют дать оценку интересующих параметров рецепторов как исходно, так и на фоне применения препаратов, влияющих на β-адренорецеторы, а также позволяют определить их аффинность [Blankesteijn W. M, Graafsma S. J., Hectors M. P. Y. et al. Eur.

- 1 036081

J. Clin. Pharmacol. 1992. 42(6). P. 613-8]. Плотность поверхностных β-адренорецепторов определяют методом специфического связывания с использованием специфического лиганда, меченого радиоактивным изотопом ¹²⁵I или ³Н. Неспецифическое связывание определяют при добавлении значительного избытка немеченого лиганда. Специфическое связывание лиганда с рецептором рассчитывают по разности общего и неспецифического связывания, плотность рецепторов и константу диссоциации определяют в координатах Скэтчарда, используя коэффициент линейной регрессии. По кривым вытеснения меченого лиганда рассчитывают константу диссоциации рецептор-лиганд по формуле Ченга-Пруссова [Williams L. Т., Snyderman R., Lefkowitz R.J.J. Clin. Invest. 1976, v.57 (1). Pp. 149-55; Красникова Т.Л., Коричнева И.Л., Радюхин В.А. Биохимия. 1989. 54 (2), с. 235-243].

Однако описанный традиционный радиолигандный метод определения количества и аффинности βадренорецепторов является трудоемким, дорогостоящим и требует забора большого количества крови, особенно при исследовании влияния препаратов. Последнее наиболее существенно при оценке динамики влияния препаратов, воздействующих на β-адренорецепторы, что делает этот метод малоприменимым в условиях реальной клинической практики.

Наиболее близким, по сути, техническим решением является способ селективной количественной оценки активности связывания β-адренорецепторов на поверхности лейкоцитов человека, раскрытый в патентной публикации EA 026837 (опубл. 31.05.2017), при осуществлении которого для оценки активности связывания β1-адренорецеπторов по специфическому связыванию [ ²⁵1]цианопиндолола с клетками определяют разность связывания [¹²⁵1]цианопиндолола клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [ ²⁵1]цианопиндолола клетками в присутствии 0,20-0,28 мкМ β1специфического лиганда CGP-20712 (химическое название - дигидрохлорид [2-((3-карбамоил-4гидрокси)фенокси)этиламино] -3-[4-( 1 -метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси] -2-пропанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [¹²⁵1]цианопиндолола, фосфатный буферный раствор (PBS), раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или CGP-20712) и суспензию клеток инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют при тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β1-адренорецепторов по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн клеток.

Для количественной селективной оценки активности связывания β2-адренорецепторов определяют разность связывания [¹²⁵1]цианопиндолола клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [ ²⁵1]цианопиндолола клетками в присутствии 0,14-0,18 мкМ β2специфического лиганда ICI 118551 (химическое наименование гидрохлорид (±)-эритро-^*^*)-1-[2,3(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [¹²⁵1]цианопиндолола, фосфатный буферный раствор (PBS), раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или ICI 118551) и суспензию клеток инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют при тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β2-адренорецепторов по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн клеток.

Недостатком ближайшего аналога является низкая чувствительность в отношении β1адренорецепторов. Таким образом, существует потребность в разработке усовершенствованного метода радиолигандного анализа, который был бы, по существу, лишен недостатка решения, известного из уровня техники.

В соответствии с изобретением предложен способ радиолигандного определения активности связывания β1- и β2-адренорецепторов Т-лимфоцитов человека, для осуществления которого проводят

а) забор у объекта крови из периферической вены;

б) выделение Т-лимфоцитов общепринятым способом;

в) постановку четырех параллельных анализов с добавлением в каждом из них 100 мкл [¹²⁵I] цианопиндолола;

г) инкубацию в течение 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

д) остановку реакции добавлением холодной воды;

е) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 мин с отбрасыванием супернатанта;

- 2 036081

ж) суспендирование осадка в холодном (+4°С) буфере PBS с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;

з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) буфере PBS с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта;

и) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе и

м) вычисление активности связывания в1-адренорецепторов по разности общего связывания и βспецифического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток, отличающийся тем, что при постановке четырех параллельных анализов в первом из них к среде, содержащей Т-лимфоциты, добавляют воду, во втором в избытке добавляют холодный цианопиндолол, в третьем добавляют e1-AP лиганд CGP 20712, в четвертом добавляют в2-АР лиганд ICI 118551 и проводят предынкубацию каждого анализируемого образца в течении 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

н) вычисление активности связывания в2-адренорецепторов по разности общего связывания и бетаспецифического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток, отличающийся тем, что при постановке четырех параллельных анализов в первом из них к среде, содержащей Т-лимфоциты, добавляют воду, во втором в избытке добавляют холодный цианопиндолол, в третьем добавляют в1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом добавляют в2-АР лиганд ICI 118551 и проводят предынкубацию каждого анализируемого образца в течении 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин.

Перечень чертежей

На фиг. 1 представлены гистограммы активности связывания β-адренорецепторов Т-лимфоцитов здоровых добровольцев и добровольцев, страдающих заболеваниями.

На фиг. 2 представлен график зависимости процента связывания [^^цианопиндолола клетками ADL-7A в присутствии CGP-20712 от концентрации последнего.

На фиг. 3 представлен график зависимости процента связывания [^^цианопиндолола клетками A2R9 в присутствии ICI 118551 от концентрации последнего.

На фиг. 4 представлены гистограммы активности связывания e1-AP и в2-АР Т-лимфоцитов в случаях проведения предынкубации и без проведения предынкубации.

Сущность изобретения

В качестве ближайшего аналога авторами настоящего изобретения был предложен способ оценки активности связывания β-1- и β-2-адренорецепторов, основанный на вытеснении из клеточных рецепторов меченного иодом-125 цианопиндолола, неспецифически связывающегося с несколькими типами рецепторов, лигандами с высокой специфичностью к адренорецепторам: CGP-20712 и ICI 118551. Была отмечена взаимосвязь в2-АР с другими клиническими и лабораторными параметрами, имеющими доказанное клиническое значение. При этом активность связывания e1-AP лимфоцитов была на крайне низком уровне, примерно в 10-20 раз ниже активности связывания в2-АР этих же клеток. Поэтому ранее полученные результаты по активности связывания e1-AP T-лимфоцитов не были всесторонне проанализированы из-за их малой достоверности.

Однако в ходе продолжающихся исследований с Т-лимфоцитами лиц, страдающих сочетанной кардиореспираторной патологией, авторами было выявлено, что для некоторых типов кардиологических патологий характерна чрезвычайно высокая активность связывания в1-адренорецепторов Т-лимфоцитов. Это явилось основанием для повторного рассмотрения вопроса специфичности и достоверной селективности предложенного ранее способа анализа, а также обусловило необходимость разработки модифицированного способа с целью увеличения достоверности получаемых результатов по активности связывания в1-адренорецепторов Т-лимфоцитов.

В контексте настоящего изобретения активность связывания клеточных β-АР определяется как специфическое связывание меченого лиганда в определенных стандартизированных условиях. Так как для определения активности связывания основным измеряемым параметром является количество связанного с рецептором радиоактивного лиганда, считается, что для количественной оценки удобнее использовать величину имп/мин-млн клеток. Это позволяет проводить количественные сравнения изменений активности связывания как под действием различных внешних факторов, так и в динамике.

К сожалению, (^цианопиндолол не обладает высокой специфичностью в отношении различных β-АР. По некоторым данным константы связывания для β1- и в2-адренорецепторов из разных источников колеблются в диапазоне 7-40 пМ (Engel G., Ноуег D., Berthold R., Wagner H.//Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1981. Vol. 317(4). Pp. 277-285). Это привело к идее использовать для селективного определения β1- и в2-адренорецепторов специфические лиганды CGP-20712 и ICI 118551, впервые опубликованной в 1989 году (Tsuchihashi H., Nagatomo T, Imai S. // J. Pharmacobiodyn. 1989 Vol. 12(9). Pp. 509-516).

Однако такой подход сложно использовать для определения активности связывания e1-AP лимфоцитов. Количество βΤ-AP на поверхности лимфоцитов слишком мало, и специфический в1-лиганд CGP20712 не может специфически вытеснять [ ²д]цианопиндолол из e1-AP просто из-за их слишком незначительного количества. У здоровых добровольцев (фиг. 1А, образцы 1, 2, 3) активность связывания e1-AP

- 3 036081 весьма низкая и находится на уровне, не превышающем 0.1 фмоль (10-¹⁶ моль) рецепторов на 1 млн Тлимфоцитов, или примерно 60 рецепторов на клетку. У пациентов с бронхо-легочной патологией (фиг. 1А, образцы 4, 5, 6) этот уровень значимо выше. У пациентов с идиопатическими нарушениями сердечного ритма (фиг. 1Б) активность связывания в1-адренорецепторов существенно выше, на уровне 1-1,5 фмоль на 1 млн. клеток, и сопоставима с активностью связывания в2-АР. Этот факт обусловливает важность разработки высокочувствительного способа определения активности связывания в1-АР как клинического показателя.

Для подтверждения специфичности ранее предложенного метода были проведены эксперименты по вытеснению меченного ['^Ццианопиндолола из клеточных рецепторов линии ADL-7A лигандом CGP20712 в различных концентрациях (фиг. 2). Аналогичная серия экспериментов по вытеснению меченого [^Ццианопиндолола лигандом ICI 118551 в различных концентрациях была проведена для линии A2R9 (фиг. 3).

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что изменение порядка прибавления реагентов в инкубационную смесь резко увеличивает активность связывания β 1адренорецепторов, а также дает возможность выявления характерных паттернов изменения характеристик β-АР звена под влиянием предварительной инкубации со специфическими лигандами. В контексте настоящего изобретения такая процедура называется предынкубацией. Было предложено сначала инкубировать клетки со специфическими лигандами CGP-20712 или ICI 118551, а затем добавлять меченый ['^Ццианопиндолол. Результаты этих экспериментов на клетках ADL-7A и A2R9 представлены в табл. 1.

Таблица 1

Клетки	Количество связанной радиоактивности, имп/минмлн клеток	% связывания от максимального
Без лиганда	с CGP-20712	с ICI 118551
Без ПИ	ПИ	Без ПИ	ПИ	Без ПИ	ПИ
ADL-7A	53392	-	-	-	-	100	-
ADL-7A	-	17059	11846	-	-	32	22
ADL-7A	-	-	-	41335	52391	78	98
A2R9	55978	-	-	-	-	100	-
A2R9	-	54296	52391	-	-	97	92
A2R9	-	-	-	7293	12445	13	22

ПИ - предынкубация

Интересно, что предынкубация клеток с CGP-20712 (в1-специфический лиганд) активирует клеточные e1-AP, но в то же время предынкубация с ICI 118551 (в2-специфический лиганд) существенных изменений в активность связывания в2-АР не вносит.

Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что CGP-20712, даже в очень высокой концентрации (0,44 мкМ), практически не вытесняет [^Ццианопиндолол из клеточных в2-АР: вытеснение составляет около 3%. Это подтверждает специфичность предложенного модифицированного способа анализа, т.к. выбранная концентрация CGP-20712 будет оказывать минимальное влияние на активность связывания радиоактивного лиганда в2-АР Т-лимфоцитами. В то же время лиганд ICI 118551 в высокой концентрации на уровне 0,32 мкМ частично (около 20%) вытесняет [^Ццианопиндолол из клеточных лимфоцитарных в1-АР. Впрочем, для селективного определения активности связывания в1-АР T-лимфоцитов, это искажение количественной оценки не превысит 10% даже для лиц с чрезвычайно высокой активностью связывания β 1-АР Т-лимфоцитов, наблюдаемой при редких патологиях.

Таким образом, предложенный модифицированный способ определения активности связывания β1и в2-адренорецепторов Т-лимфоцитов человека позволяет неожиданным образом преодолеть недостаток известного уровня техники с достижением технического результата изобретения - существенного повышения чувствительности определения активности связывания β 1-АР.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Материалы.

Для анализа применяют специфические лиганды: CGP-20712 (β 1-адреноблокатор), ICI 118551 (β2адреноблокатор) и цианопиндолол, полученные от фирмы Sigma (США). Радиоактивный изотоп [¹²⁵I] в виде иодида натрия с молярной активностью более 2000 Ки/ммоль получен от фирмы В/О Изотоп (Российская Федерация). Остальные реактивы, использованные в исследованиях, были квалификации не ниже ч.д.а.

Характеристика пациентов.

Все включенные добровольцы перед включением в исследование подписывают информированное

- 4 036081 согласие в соответствии со всеми правилами этического положения Хельсинской декларации и Национальным стандартом Российской Федерации Надлежащая клиническая практика ГОСТ Р 52379-2005.

В исследование включены 11 добровольцев: 3 добровольца без сердечно-сосудистой и бронхолегочной патологий; 3 пациента с бронхиальной астмой средней степени тяжести контролируемого течения; 5 пациентов с нарушением ритма сердца (идиопатической аритмией).

Все добровольцы имеют возраст старше 18 лет и не принимают препараты, воздействующие на βадренорецепторы. Участвующие проходят врачебный осмотр, обследование с помощью стандартных методик оценки состояния сердечно-сосудистой и бронхо-легочной систем перед забором крови. Пациенты с бронхиальной астмой в течение 48 ч не принимают длительно действующие в2-агонисты и Мхолинолитические препараты, а короткодействующие - в течение 12 ч до исследования.

Исследование в1-адренорецепторов проводят у 3 здоровых добровольцев и 3 пациентов с бронхолегочной патологией. Определение активности связывания в2-адренорецепторов проводят у 5 добровольцев с сочетанной кардиореспираторной патологией.

Получение [¹²5[|цианопиндолола.

Введение радиоактивного изотопа ¹²⁵I в молекулу цианопиндолола проводят модифицированным способом, описанным в статье Greenwood F.C, Hunter W.M. The preparation of labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. J., 1963, 89(1). P. 114-123.

Реакционная смесь для радиоиодирования содержит 1 мкг цианопиндолола, 0,2М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), 1 мКи Na^l25I в объеме 50 мкл. Реакцию инициируют добавлением 10 мл раствора хлорамина Т (10 мг/мл). Длительность инкубации при комнатной температуре составляет 1 мин. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл тиосульфата натрия (20 мг/мл) и после 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 1 мкл раствора холодного йодида натрия (6 мг/мл).

Целевой продукт выделяют ВЭЖХ (хроматограф производства фирмы Gilson, Франция) на колонке Nucleosil 100 С-18 (5 мкм, 150 мм) в ион-парном режиме. Буфер А: 10% уксусная кислота, буфер Б: 100% ацетонитрил. Элюирование осуществляют градиентом концентрации ацетонитрила от 0 до 100% за 20 мин с расходом 0,5 мл/мин. Детектирование элюата производят по УФ-поглощению при 280 нм и по проточному детектору радиоактивности. Фракции, содержащие [¹²⁵1]цианопиндолол, объединяют, выпаривают досуха, растворяют в 70% этаноле и хранят при -20°С.

Забор крови и выделение клеток.

Кровь пациента из периферической вены забирают в 2 вакуумные пробирки S-Monovette EDTA КЕ (Sarstedt, Германия) объемом 9 мл. Кровь отстаивают 60 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов. Далее используют плазму, обогащенную лейкоцитами.

Плазму из двух пробирок (18 мл) отбирают и аккуратно наслаивают на 15 мл Histopaque-1077 (Sigma, США; кат. № Н8889), содержащегося в пробирке объемом 50 мл. Для работы используют стерильные пробирки, стерильные пипетки или пипетки с дозатором. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 25 мин на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки (лимфоциты) в чистые пробирки объемом 50 мл.

Суспензию лимфоцитов однократно отмывают 30 мл буфера PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,2, 2мМ ЭДТА; autoMACS Rinsing solurion, Miltenyi Biotec, Германия, кат. № 130-091-222) и центрифугируют 10 мин при 400 g. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 500 мкл буфера PBS и переносят в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки эппендорф, используя автоматическую пипетку и наконечники с фильтром. Центрифугируют 10 мин при 400 g при комнатной температуре. Надосадочную жидкость аккуратно удаляют.

Осадок из пробирок используют для выделения Т-лимфоцитов с помощью набора Pan T cell isolation kit (human) (Miltenyi Biotec, Германия, кат.№ 130-096-535), согласно инструкции к набору. Для этого осадок в пробирке ресуспендируют в 40 мкл буфера PBS-BSA и добавляют 10 мкл смеси антител (Pan T Cell Biotin Antibody Cocktail), хорошо перемешивают и инкубируют 7 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. В пробирку к полученной смеси добавляют 30 мкл буфера PBS-BSA и 20 мкл магнитных частиц (Pan T Cell MicroBeard Cocktail), аккуратно перемешивают и инкубируют 15 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. Далее в пробирку добавляют 500 мкл буфера PBS-BSA, перемешивают и пропускают полученные суспензии через магнитные колонки, заранее промытые буфером PBS-BSA. Магнитную сеперацию проводят с применением сепаратора OctoMACS (Miltenyi Biotec, Германия, кат. № 130-042-201) согласно инструкции производителя. Проходящий раствор (Т-клетки) собирают в пробирку.

500 мкл раствора из пробирки переносят в эппендорф, добавляют 500 мкл питательной среды 199, хорошо перемешивают. Из полученного объема (1 мл) отбирают 10 мкл в отдельный эппендорф для подсчета клеток (приблизительно 106 клеток/мл). Полученные клетки хранят в холодильнике при 4°С в течение не более 24 ч до использования в радиолигандном анализе.

Предынкубация со специфическими лигандами.

В четыре отдельно взятых эппендорфа помещают (1)10 мкл воды, (2) 10 мкл водного раствора холодного цианопиндолола с концентрацией в интервале 10^-6-10^-8М, содержащего избыток холодного

- 5 036081 цианопиндолола, (3) 10 мкл 0,20-0,28 мкМ βΐ-специфического лиганда CGP-20712 (химическое название дигидрохлорид [2-((3 -карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино] -3-[4-( 1 -метил-4-трифторметил-2имидазолил)фенокси]-2-пропанола) и (4) 10 мкл 0,14-0,18 мкМ в2-специфического лиганда ICI 118551 (химическое название - гидрохлорид (±)-эрито-(А*>*)-1-|2.3-(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси|-3[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола), фосфатный буферный раствор (PBS) и 100 мкл суспензии клеток с концентрацией 5-10 млн/мл. Смеси предынкубируют в течение 25-30 мин при 37°С и осторожном перемешивании на шейкере со скоростью 100 об/мин. Процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют в тех же условиях. Супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS, центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 мин и отбрасывают супернатант.

Радиолигандный анализ активности связывания β-адренорецепторов.

Для экспериментов с предынкубацией каждый из осадков (1)-(4) после центрифугирования разбавляют буфером PBS с 0,1% BSA до концентрации 10 млн/мл и 100 мкл клеточной суспензии инкубируют в течение 25-30 мин при 37°С и осторожном перемешивании на шейкере со скоростью 100 об/мин. Затем в реакционную смесь добавляют 100 мкл раствора [¹²⁵1]цианопиндолола в буфере PBS с концентрацией 1000 имп/мин-мкл и инкубируют еще 25-30 мин. Процесс останавливают добавлением в каждую пробу по 400 мкл ледяной воды (холодная вода со льдом). Для отмывки от не связавшейся радиоактивности клетки центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин, осадок трижды промывают суспендированием в 200 мкл холодного буфера PBS и центрифугированием в тех же условиях, после чего просчитывают на γсчетчике Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer, США). Вычисляют активность связывания β1- и β2адренорецепторов по разности общего связывания и бета-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн клеток.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ радиолигандного определения активности связывания в1-адренорецепторов Т-лимфоцитов человека, для осуществления которого проводят

а) забор у объекта крови из периферической вены;

б) выделение Т-лимфоцитов общепринятым способом;

в) постановку четырех параллельных анализов, при этом в первом из них к среде, содержащей Тлимфоциты, добавляют воду, во втором в избытке добавляют холодный цианопиндолол, в третьем добавляют β1-ΑΡ лиганд CGP 20712, в четвертом добавляют β2-ΑΡ лиганд ICI 118551;

г) инкубацию в течение 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;

д) добавление ко всем четырем предварительно инкубированным реакционным смесям по 100 мкл [¹²⁵I] цианопиндолола;

е) остановку реакции добавлением холодной воды;

ж) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 мин с отбрасыванием супернатанта;

з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) буфере PBS с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;

и) суспендирование осадка в холодном (+4°С) буфере PBS с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта;

к) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе и

л) вычисление активности связывания β1-αдренорецепторов по разности общего связывания и бетаспецифического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.