EA035485B1 - Электроперенос генов в клетки кожи - Google Patents
Электроперенос генов в клетки кожи Download PDFInfo
- Publication number
- EA035485B1 EA035485B1 EA201690892A EA201690892A EA035485B1 EA 035485 B1 EA035485 B1 EA 035485B1 EA 201690892 A EA201690892 A EA 201690892A EA 201690892 A EA201690892 A EA 201690892A EA 035485 B1 EA035485 B1 EA 035485B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- duration
- pulse
- nucleic acid
- cells
- dna
- Prior art date
Links
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims description 15
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 5
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 21
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 14
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 8
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 4
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000006390 HLA-B Antigens Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- LUTSRLYCMSCGCS-BWOMAWGNSA-N [(3s,8r,9s,10r,13s)-10,13-dimethyl-17-oxo-1,2,3,4,7,8,9,11,12,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] acetate Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)C(=O)CC=C3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)C)C1 LUTSRLYCMSCGCS-BWOMAWGNSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003994 anesthetic gas Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000013230 female C57BL/6J mice Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0047—Sonopheresis, i.e. ultrasonically-enhanced transdermal delivery, electroporation of a pharmacologically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001154—Enzymes
- A61K39/001157—Telomerase or TERT [telomerase reverse transcriptase]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/02—Details
- A61N1/04—Electrodes
- A61N1/0404—Electrodes for external use
- A61N1/0408—Use-related aspects
- A61N1/0428—Specially adapted for iontophoresis, e.g. AC, DC or including drug reservoirs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
- A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
- A61N1/327—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for enhancing the absorption properties of tissue, e.g. by electroporation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу предотвращения, подавления или уменьшения опухоли у субъекта in vivo, а также к способу противоопухолевой вакцинации или генной терапии субъекта in vivo, которые предусматривают введение нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген и индуцирующей клеточный иммунный ответ. Для наилучшей эффективности нуклеиновую кислоту вводят путем интрадермальной инъекции и электрической пермеабилизации клеток кожи с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в пределах от 1100 до 1400 В/см и длительностью от 10 до 1000 мкс и последующего единичного импульса электрического поля низкого напряжения в пределах от 100 до 200 В/см и длительностью от 300 до 800 мс.
Description
Настоящее изобретение относится к области электропермеабилизации клеток для переноса генов.
Сведения о предшествующем уровне техники
Электропермеабилизацию клеток, т.е. пермеабилизацию клеток посредством локальной доставки электрических импульсов (ЕР), все чаще используют для лечения и предупреждения разнообразных патологий у человека и животных, включая рак.
Клеточная мембрана определяет границы двух компартментов, цитоплазмы и внеклеточной среды, которые содержат различные концентрации ионов, создавая, тем самым, трансмембранную разность потенциалов. Приложение к клеткам электрического поля индуцирует трансмембранный потенциал, который накладывается на потенциал покоя (Mir et al., 2005). Выше порогового значения возникает временная пермеабилизация, которая приводит к обмену молекулами между цитоплазмой и внешней средой. Этот феномен, возникающий после приложения электрического импульса (ЕР) к клеткам и приводящий к потере проницаемости мембраны, называется электропермеабилизацией. Эту технологию используют на протяжении трех десятков лет для усиления поглощения клетками не поглощающихся иначе молекул.
Несмотря на то что конкретный механизм электропермеабилизации все еще остается объектом для обсуждения, эта технология указала путь для многих биомедицинских применений, в частности для терапий рака (Breton & Mir, 2011). Одна из терапий, называемая противоопухолевой электрохимиотерапией, заключается в сочетании электрического импульса (ЕР), прилагаемого непосредственно к участку опухоли, с введением блеомицина или цисплатина, которые спонтанно не диффундируют (или слабо диффундируют) через плазматическую мембрану (Mir et al., 1991; Mir, 2006). После вхождения в электропермеабилизованные клетки эти два лекарственных средства генерируют повреждения ДНК и запускают гибель клеток. Не только лекарственные средства, но также нуклеиновые кислоты, которые являются непроникающими молекулами (Satkauskas et al., 2002; Andre & Mir, 2010), можно подвергать электропереносу в клетки с использованием электропермеабилизации. ДНК была успешно перенесена в различные ткани живых животных, включая кожу, мышцы, печень, опухоль, роговую оболочку глаза, легкие, почки, головной мозг, мочевой пузырь и семенник (рассмотрено в работе Andre et al., 2008; Gothelf & Gehl, 2010). Одно из перспективных применений метода электропереноса генов относится к области вакцинации ДНК. Действительно, начиная с ранних 90-х годов вакцинация ДНК вызывала большой интерес. Впервые перенос ДНК в мышцы животного смог осуществить Wolff с сотрудниками. После трансфекции молекулы ДНК придали способность клеткам-мишеням продуцировать закодированный белок (Wolff et al., 1990). Tang et al. показал, что белок, закодированный ДНК, перенесенной в клетки кожи биолистическим методом, смог запустить иммунный ответ (Tang et al., 1992), и в работе Barry et al. показано, что генная вакцинация плазмидой, кодирующей белок патогена, защищала животных против заражения соответствующим патогеном (Barry et al., 1995). Эту технологию использовали в различных применениях, начиная с лабораторных инструментов и заканчивая лицензированными ветеринарными вакцинами (Anderson et al., 1996), и в настоящее время она находится в разработке в отношении лечения различных приобретенных патологий, таких как рак, малярия, гепатит В и С, или предупреждения некоторых вирусных инфекций, таких как грипп или вирус иммунодефицита человека (clinicaltrials.gov) (Bergman et al., 2003).
Таким образом, ДНК-вакцины обладают преимуществами с точки зрения изготовления, доступности и экономичности по сравнению с другими технологиями изготовления вакцин (Liu, 2011). Несмотря на тот факт, что ДНК-вакцины обеспечивают точную и гибкую стратегию для доставки антигенов в иммунные клетки и вызывают специфический иммунный ответ, вначале возникли трудности, связанные с переносом этой технологии с мелких грызунов на более крупных животных и, в конечном итоге, на пациентов (Rochard et al., 2011). Фактически, было обнаружено, что ДНК-вакцины являются слабо иммуногенными, отчасти из-за низкого поглощения молекул ДНК клетками в участке введения вакцины. Эту проблему решили путем использования электропереноса генов, который значительно улучшил характеристики ДНК-вакцин (Li et al., 2012; Gothelf & Gehl, 2012).
Однако для использования электропереноса, как предусматривается стратегиями вакцинации, требуется очень специфическая процедура. Электроперенос представляет собой многоступенчатый процесс, основанный на двух типах электрических импульсов (ЕР) (Andre & Mir, 2010; Satkauskas et al., 2005; Favard et al., 2007). Сначала ДНК приводят в непосредственную близость с окружением клеток-мишеней путем инъекции в предполагаемый участок введения вакцины (кожу, мышцы), затем одним или несколькими короткими (около 100 мкс) и интенсивными (около 1000 В/см) импульсами, называемыми импульсами высокого напряжения (HV), обратимо пермеабилизуют клеточную мембрану. Через определенный интервал времени прилагают один или несколько длинных (около нескольких сотен миллисекунд) и менее интенсивных (около сотни вольт на сантиметр) импульсов, называемых импульсами низкого напряжения (LV). Импульсы LV предназначены для электрофоретического перемещения ДНК через внеклеточный матрикс вплоть до контакта с электропермеабилизованной мембраной. Пока что не существует единого мнения относительно того, как молекулы ДНК пересекают плазматическую мембрану и доходят до ядра для того, чтобы их начал воспринимать механизм трансляции клеток (Escoffre et al., 2009).
Интересно, что после введения ДНК с последующим электропереносом ни у животных, ни у человека не было выявлено серьезных побочных эффектов (Fioretti et al., 2013). Исследование показало, что
- 1 035485 после введения ДНК-вакцина была в основном локализована вокруг участка инъекции, уровни ее локального обнаружения быстро падали с течением времени, она не интернализовалась гонадной тканью (очень низкий риск переноса в зародышевую линию) и вероятность интеграции была очень низкой, поскольку не был использован вирусный белок (Dolter et al., 2011). Более того, при использовании молекул ДНК для вакцинации в сочетании с методом электропереноса генов не возникало связанных с иммунитетом проблем до или после лечения в отличие от вирусных векторов, таких как аденовирусные векторы, обеспечивая, тем самым, возможность многократного введения (гомологичная прайм-буст вакцинация ДНК/ДНК или гетерологичная прайм-буст вакцинация ДНК/вектор или ДНК/белок) (Villemejane & Mir, 2009). Таким образом, в последние несколько лет привлекала интерес вакцинация ДНК в сочетании с электропереносом.
Что касается раковой патологии, ДНК-вакцины предназначены для запуска иммунного ответа против опухоль-специфических или опухоль-ассоциированных антигенов (Stevenson & Palucka, 2010). Действительно, раковые клетки обманывают иммунную систему, которая не всегда может эффективно инициировать иммунный ответ по причине множества сложных механизмов, таких как аутотолерантность (Bei & Scardino, 2010), различных механизмов иммуносупрессии, включающих регуляторные Т-клетки или супрессорные дендритные клетки миелоидного происхождения (moDC) (Lindau et al., 2013), молекул, таких как CTLA-4, экспрессирующихся на поверхности иммунных клеток (Kolar et al., 2009; Shevach, 2009), и взаимодействия PD-1/PD-1L (Keir et al., 2008).
Конечной целью эффективной ДНК-вакцины, доставляемой посредством технологии электропереноса, должно быть генерирование правильного вида иммунных ответов против антигена, закодированного представляющей интерес плазмидой. Хотя технология электропереноса достаточно полно описана в отношении внутримышечного пути введения (заявка на патент WO 2007/026236) (Mir et al., 2005; Andre & Mir, 2010), имеется мало информации о параметрах электропереноса в кожу в целях вакцинации. Иммунный ответ должен быть достаточно интенсивным и длительным для генерирования положительных терапевтических эффектов у пациентов с конкретной патологией. Следует отметить, что интенсивность иммунного ответа зависит, по меньшей мере отчасти, от уровня экспрессии антигена (Lee et al., 1997; Kirman & Seder, 2003), который сам тесно связан с эффективностью переноса генов. Что касается эффективности электропереноса генов в кожу, то она зависит от нескольких параметров, включая интенсивность электрических импульсов (ЕР) и тип электродов, используемых для их доставки (Gothelf & Gehl, 2010).
Краткое описание изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что эффективность электропереноса в кожу может быть улучшена путем использования специфической комбинации импульсов высокого и низкого напряжения.
Настоящее изобретение относится к способу предотвращения, подавления или уменьшения опухоли у субъекта in vivo с помощью введения нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген и индуцирующей клеточный иммунный ответ. В данном способе нуклеиновую кислоту вводят путем интрадермальной инъекции и электрической пермеабилизации клеток кожи с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в пределах от 1100 до 1400 В/см и длительностью от 10 до 1000 мкс;
последующего единичного импульса электрического поля низкого напряжения в пределах от 100 до 200 В/см и длительностью от 300 до 800 мс.
В одном из воплощений способа в нем используются неинвазивные пластинчатые электроды.
Также предусмотрено воплощение способа, где импульс высокого напряжения и импульс низкого напряжения отделены друг от друга интервалом времени. Продолжительность этого интервал времени может составлять от 300 до 3000 мс.
Еще одной целью настоящего изобретения является способ противоопухолевой вакцинации или генной терапии субъекта, включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген и индуцирующей клеточный иммунный ответ. В данном способе предусмотрено введение нуклеиновой кислоты путем интрадермальной инъекции и электрической пермеабилизации клеток кожи с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в пределах от 1100 до 1400 В/см и длительностью от 10 до 1000 мкс;
последующего единичного импульса электрического поля низкого напряжения в пределах от 100 до 200 В/см и длительностью от 300 до 800 мс.
Согласно одному варианту воплощения импульс высокого напряжения и импульс низкого напряжения разделены интервалом времени.
Клеточный ответ, индуцируемый способами по изобретению, может представлять собой ответ CD8 Т-клеток.
- 2 035485
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематическое изображение плазмидного ДНК-вектора INVAC-1. Основания 1-3478: вектор NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI (NTC); основания 3479-3484: сайт клонирования HindIII (NTC/Invectys); основания 3485-6967: трансген Ubi-теломераза (Invectys); основания 6968-6973: сайт клонирования XbaI (Invectys/NTC); основания 6974-7120: вектор NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI (NTC).
На фиг. 2А и В представлены графики, которые показывают, что электроперенос является предпочтительным для переноса генов и иммунизации. (А) Изображение интенсивностей биолюминесценции у мышей C57BL/6J после инъекции pCMV-luc с последующим электрическим импульсом (ЕР) или без последующего электрического импульса (ЕР), n=5 мышей только для ID инъекции pCMV-luc, n=10 (от 5 мышей, две обработки на мышь) для ID инъекции pCMV-luc + ЕР. (В) Частота hTERT-специфических INFy+ CD8 Т-клеток, обнаруженных у мышей C57BL/6J, вакцинированных INVAC-1 с последующим ЕР или без последующего ЕР, n=6-8 мышей. Столбцы представляют средние значения. * р<0,05, ** р<0,01, Тест Вилкоксона-Манна-Уитни.
На фиг. 3A и B представлены графики, которые показывают выбор лучших электродов. (А) Изображение интенсивностей биолюминесценции у мышей C57BL/6J после электропереноса pCMV-luc с использованием трех типов электродов, n=14 мышей только для ID инъекции pCMV-luc, n=8-10 (от 4 до 5 мышей, две обработки на мышь) для ID у мышей HLA-B7, вакцинированных INVAC-1 с использованием трех типов электродов, n=3 мышей для контрольной иммунизации PBS и n=4-9 мышей для INVAC-1-опосредованной иммунизации. Столбцы представляют средние значения. * р<0,05, *** р<0,001, тест Крускала-Уоллиса (Kruskal-Wallis) с критерием Данна (Dunn) для множественных сравнений.
На фиг. 4 представлен набор снимков, показывающих локализацию экспрессии гена люциферазы у мышей C57BL/6J после ID инъекции и электропереноса pCMV-luc с использованием пластинчатых электродов.
На фиг. 5 представлен график, который показывает определение оптимальной интенсивности импульсов HV у мышей C57BL/6J для электропереноса интрадермально введенного pCMV-luc с использованием пластинчатых электродов, n=24 мышей только для ID инъекции pCMV-luc, n=8 (от 4 мышей, две обработки на мышь) для ID инъекции pCMV-luc + ЕР. Столбцы представляют средние значения. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001, тест Крускала-Уоллиса (Kruskal-Wallis) с критерием Данна (Dunn) для множественных сравнений.
На фиг. 6А и В представлены графики, которые показывают выбор наилучшей комбинации импульсов HV-LV у мышей C57BL/6J. (А) Биолюминесценция, полученная после ID инъекции pCMV-luc при различных комбинациях импульсов HV-LV, n=30 мышей только для ID инъекции pCMV-luc и n=6 (от 3 мышей, две обработки на мышь) для ID инъекции pCMV-luc + ЕР. (В) Частота hTERTспецифических IFNy+ CD8 Т-клеток, обнаруженных у мышей C57BL/6J, вакцинированных INVAC-1 в соответствии с различными комбинациями импульсов HV-LV, n=8 мышей для контрольной иммунизации PBS, и n=5 мышей для INVAC-1-опосредованной иммунизации. Столбцы представляют средние значения. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001, тест Крускала-Уоллиса (Kruskal-Wallis) с критерием Данна (Dunn) для множественных сравнений.
Подробное описание изобретения Определения
Термин HV означает высокое напряжение, и термин LV означает низкое напряжение.
Используемый здесь термин кожа означает кожу животного, например человека или не относящегося к человеку млекопитающего, такого как грызун (например, мышь, кролик или крыса), собака, кошка или примат, лошадь, коза, свинья, овца, корова и т.д. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновую кислоту переносят в клетки дермы. Клетки кожи, в которые перенесена нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением, предпочтительно представляют собой дендритные клетки, но также могут включать кератиноциты, меланоциты, фибробласты или же миелоидные или лимфоидные клетки. Термин нуклеиновая кислота означает любую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в частности любую нуклеиновую кислоту, способную экспрессировать представляющий интерес белок. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК (например, антисмысловой или интерферирующей РНК). Предпочтительно это ДНК, предпочтительно двухцепочечная ДНК. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота представляет собой экспрессирующий ДНК вектор хорошо известного в данной области типа. Как правило, экспрессионный вектор содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует представляющий интерес белок.
Термин TERT относится к теломеразной обратной транскриптазе, которая является основной детерминантой активности теломеразы, включая теломеразу дикого типа или ее варианты.
Термин иммуногенный означает, что композиция или конструкция, к которой он относится, при введении способна вызывать иммунный ответ. Иммунный ответ у субъекта относится к развитию вро
- 3 035485 жденного и адаптивного иммунного ответа на антиген, включая гуморальный иммунный ответ, клеточный иммунный ответ или и тот и другой. Гуморальный иммунный ответ относится к ответу, опосредованному антителами. Клеточный иммунный ответ представляет собой ответ, опосредованный Т-лимфоцитами. Он включает выработку цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками, белыми клетками крови или и теми и другими. Иммунные ответы можно определить с использованием стандартных иммуноанализов и проб на нейтрализацию для детекции гуморального иммунного ответа, которые известны в данной области. В отношении противораковой вакцинации иммунный ответ предпочтительно охватывает стимуляцию или пролиферацию цитотоксических CD8 Т-клеток и/или CD4 Т-клеток и может быть определен с использованием иммуноанализов, таких как анализ ELISpot, анализ цитотоксичности in vivo или анализ связывания в отношении секреции цитокинов.
Используемый здесь термин лечение, или терапия, или иммунотерапия относится к любому из смягчения, ослабления и/или устранения, уменьшения и/или стабилизации (например, отсутствию прогрессирования в более поздние стадии) симптома, а также задержке прогрессирования заболевания или его симптома. В случае, если заболевание представляет собой рак, термин включает достижение эффективного противоопухолевого ответа, наблюдаемого у раковых пациентов.
Используемый здесь термин предупреждение или предотвращение относится к смягчению, ослаблению и/или устранению, уменьшению и/или стабилизации (например, отсутствию прогрессирования в более поздние стадии) признаков, предшествующих началу заболевания, т.е. любого изменения или симптома (или набора симптомов), которые могут указывать на начало заболевания до возникновения специфических симптомов.
Пациент или субъект обычно представляет собой субъекта, относящегося к млекопитающему, как указано выше, предпочтительно человеку любого возраста, пола или тяжести состояния.
Параметры электропереноса.
Нуклеиновая кислота предпочтительно предназначена для приведения в контакт с клетками кожи до применения единичного импульса LV и еще более предпочтительно до применения единичного импульса HV. Интервал времени между инъекцией нуклеиновой кислоты и электрическими импульсами, особенно между инъекцией и единичным импульсом HV не является важным. Обычно интервал времени (до приложения импульса HV) после приведения фармацевтической композиции в контакт с клетками кожи составляет от нескольких секунд до 10 мин, например от 30 с до 5 мин. Интервал времени до приложения импульса HV, составляющий от 5 до 10 мин, также является приемлемым. Нуклеиновую кислоту или фармацевтическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, приводят в контакт с клетками кожи (т.е. клетками дермы) путем интрадермальной инъекции.
В предпочтительном аспекте изобретения единичный импульс высокого напряжения предпочтительно имеет напряженность поля от 1100 до 1400 В/см, предпочтительно 1250 В/см.
Единичный импульс высокого напряжения может иметь длительность от 50 до 150 мкс, предпочтительно 100 мкс.
В предпочтительном аспекте изобретения единичный импульс низкого напряжения предпочтительно имеет напряженность поля от 100 до 200 В/см, предпочтительно 180 В/см.
Единичный импульс низкого напряжения может предпочтительно иметь продолжительность от 350 до 600 мс, более предпочтительно 400 мс.
В предпочтительном варианте осуществления единичный импульс высокого напряжения предпочтительно имеет напряженность поля от 1100 до 1400 В/см, предпочтительно 1250 В/см и длительность от 50 до 150 мкс, предпочтительно 100 мкс, и единичный импульс низкого напряжения имеет напряженность поля от 100 до 200 В/см, предпочтительно 180 В/см и длительность от 350 до 600 мс, более предпочтительно 400 мс.
В конкретном варианте осуществления, когда субъектом является человек, единичный импульс высокого напряжения может иметь напряженность поля 1250 В/см и предпочтительно длительность 100 мкс, и единичный импульс низкого напряжения может иметь напряженность поля 180 В/см и предпочтительно длительность 400 мс.
Импульс низкого напряжения (LV) может иметь такую же полярность или полярность, противоположную полярности импульса HV. Предпочтительно единичный импульс LV представляет собой квадратный импульс. Он также может быть трапецеидальным или периодическим. Предпочтительно единичный импульс HV представляет собой квадратный импульс.
Импульсы HV и LV могут быть разделены интервалом времени, и этот интервал времени предпочтительно составляет от 300 до 3000 мс, предпочтительно от 500 до 1200 мс, как правило, 1000 мс.
Целью изобретения является метод электропорации как таковой, включающий помещение электродов вблизи клеток дермы, содержащих интерстициально нуклеиновую кислоту, затем электрическую пермеабилизацию клеток дермы следующим образом:
сначала с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в диапазоне от 1000 до 1500 В/см и длительностью от 10 мкс до 1000 мкс;
- 4 035485 затем предпочтительно после определенного интервала времени с помощью единичного импульса электрического поля низкого напряжения в диапазоне от 50 до 250 В/см и длительностью от 300 до
800 мс, при этом в результате этих электрических импульсов происходит перенос нуклеиновой кислоты в клетки дермы.
Может быть использован программируемый генератор напряжения.
Можно использовать электроды, которые представляют собой инвазивные игольчатые электроды (такие как N-30-4B, IGEA), обычно состоящие из двух рядов по четыре длинные иглы, расположенные на расстоянии 4 мм друг от друга, или инвазивные пальцеобразные электроды (такие как F-05-OR, IGEA), обычно состоящие из двух рядов по три короткие иглы, расположенные на расстоянии 4 мм друг от друга, но предпочтительно представляют собой неинвазивные пластинчатые электроды (такие как Р30-8В, IGEA).
Электроды располагают в непосредственной близости от участка инъекции таким образом, чтобы электрическое поле между электродами проходило через участок или область инъекции, при этом инъецированная жидкость диффундирует после введения. Предпочтительно используют проводящий гель, известный специалисту в данной области.
В конкретном варианте осуществления электроды могут содержаться в устройстве, посредством которого можно осуществлять как введение, так электрическую стимуляцию.
Генетические конструкции, иммуногенные композиции.
Предпочтительно нуклеиновая кислота представляет собой генетическую конструкцию, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, и регуляторные последовательности (такие как подходящий промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы) и т.п.), обеспечивая экспрессию (например, транскрипцию и трансляцию) белкового продукта в клетке-хозяине или организме-хозяине.
Генетические конструкции согласно изобретению обычно находятся в форме, подходящей для трансформации заданных клеток-хозяина или организма-хозяина, в форме, подходящей для встраивания в геномную ДНК заданных клеток-хозяев, или в форме, подходящей для независимой репликации, поддержания и/или наследования в заданной клетке или организме. Например, генетические конструкции согласно изобретению могут находиться в форме вектора, такого как, например, плазмида, космида, YAC, вирусный вектор или транспозон. В частности, вектор может представлять собой экспрессионный вектор, т.е. вектор, который может обеспечить транскрипцию РНК и/или экспрессию белков in vivo, особенно в клетках дермы.
В предпочтительном, но не ограничивающем аспекте генетическая конструкция согласно изобретению содержит i) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, функционально связанную с ii) одним или несколькими регуляторными элементами, такими как промотор и необязательно подходящий терминатор, и необязательно также iii) один или несколько дополнительных элементов генетических конструкций, таких как 3'- или 5'-UTR последовательности, лидерные последовательности, маркеры селекции, маркеры экспрессии/репортерные гены, и/или элементы, которые могут содействовать или повышать (эффективность) трастформации или интеграции.
Следует понимать, что применение в соответствии с изобретением предусматривает случай, когда для изготовления фармацевтической композиции используют две или более нуклеиновых кислот, способных экспрессировать in vivo различные активные молекулы. Нуклеиновые кислоты выбирают таким образом, чтобы они были комплементарными и/или действовали синергически при лечении заболевания. В этом случае нуклеотидные последовательности, кодирующие различные молекулы, могут находиться под контролем одного и того же промотора или различных промоторов. Могут быть получены композиции, содержащие указанную нуклеиновую кислоту(ы) или вектор(ы). В одном варианте осуществления композиции являются иммуногенными. Они могут содержать носитель или вспомогательные вещества, которые являются подходящими для введения человеку или млекопитающим (т.е. нетоксичными). Такие вспомогательные вещества включают жидкие, полутвердые или твердые разбавители, которые служат в качестве фармацевтических носителей, изотонических агентов, стабилизаторов или любого адъюванта.
Некодирующие нуклеиновые кислоты.
В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота не кодирует ни один представляющий интерес белок, но ингибирует или ослабляет экспрессию целевого гена. Например, нуклеиновая кислота может представлять собой антисмысловую РНК или интерферирующую РНК. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой природные молекулы РНК нуклеиновой кислоты или аналоги нуклеиновой кислоты, такие как PLNA. В частности, нуклеиновая кислота может представлять собой малую интерферирующую РНК (миРНК), например, одноцепочечную или двухцепочечную РНК, такую как короткая одноцепочечная или двухцепочечная РНК длиной примерно от 17 до 29 нуклеотидов, предпочтительно длиной примерно от 19 до 25 нуклеотидов, которые направленно воздействуют на целевую мРНК. В случае двухцепочечной РНК, такая миРНК содержит смысловую цепь РНК и комплементарную антисмысловую цепь РНК, которые загибридизованы друг с другом.
- 5 035485
Вакцинация и/или генная терапия.
В конкретном варианте осуществления нуклеиновая кислота является полезной в генной терапии и/или вакцинации посредством экспрессии представляющего интерес белка. В предпочтительном варианте осуществления представляющий интерес белок обладает иммуностимулирующим действием, более предпочтительно вакцинным эффектом. Предпочтительно получают гуморальный иммунный ответ.
В предпочтительном аспекте нуклеиновая кислота содержит последовательности нуклеиновой кислоты, способные экспрессировать in vivo в трансфицированных клетках кожи одну или более чем одну терапевтически активную молекулу (молекулы), предпочтительно представляющий интерес белок или белки.
Эта активная молекула или представляющий интерес белок может действовать в самой коже и/или снаружи кожи в другом месте в пределах организма, например на опухоли, локализованной где-либо в организме, если экспрессирующаяся молекула является активной в качестве противоопухолевой вакцины, или инфекции, локализованной где-либо в пределах организма, если экспрессирующаяся молекула является активной в качестве противоинфекционной вакцины.
Примером представляющей интерес терапевтической молекулы является белок TERT, полезный в качестве противоопухолевой вакцины. Следует учесть, что не существует ограничения на вид молекул, которые могут экспрессироваться в соответствии с изобретением, и, следовательно, специалист в данной области сможет осуществить изобретение с использованием представляющей интерес молекулы, зная ее кодирующую последовательность, и обычных экспериментов для выбора наилучшей конструкции или экспрессионного вектора.
В одном интересном аспекте нуклеиновая кислота, как терапевтически активная молекула, кодирует один или несколько иммуногенов (или иммуногенных пептидов, полипептидов или белков, включая гликопротеины), которые способны вызывать иммунный ответ у хозяина. В одном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ для хозяина. В этом варианте осуществления изобретение относится к получению иммуногенной композиции или же профилактической или терапевтической вакцины, которая направлена против рака или против микроорганизмов, например, вирусов или бактерий.
В качестве только примера, нуклеиновая кислота кодирует один или несколько иммуногенов HIV, HBV, вируса Эпштейна-Барра, вируса псевдобешенства, синтиций-образующего вируса, онковируса, папилломавируса и т.д. Специалист в данной области имеет доступ к нуклеиновым кислотам, кодирующим представляющие наибольший интерес молекулы для выбранного применения, например, к наиболее эффективным иммуногенам или комбинациям иммуногенов для конкретного заболевания.
В другом варианте осуществления иммунный ответ приводит к выработке антител, особенно поликлональных антител, и эти антитела извлекают из полученной сыворотки и используют обычным путем.
В еще другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует антигенный пептид или белок, который при введении субъекту, например мышам, запускает выработку специфических антител.
Лечение опухолей.
В конкретном варианте осуществления описан способ предупреждения или лечения опухоли или нежелательной пролиферации клеток (например, дисплазии) у пациента, при этом способ включает введение эффективного количества нуклеиновой кислоты или иммуногенной композиции пациенту, нуждающемуся в этом, с использованием метода электропорации согласно изобретению. Указанную нуклеиновую кислоту или иммуногенную композицию вводят в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа у пациента.
Опухоль может представлять собой любую нежелательную пролиферацию клеток, в частности доброкачественную опухоль или злокачественную опухоль, в особенности рак.
Рак может находиться на любой стадии развития, включая метастатическую стадию.
Таким образом, нуклеиновая кислота предпочтительно экспрессирует одну или несколько активных молекул, выбранных таким образом, чтобы фармацевтическая композиция была эффективной в отношении уменьшения, супрессии или регрессии ангиогенеза опухоли, или уменьшения или супрессии роста опухоли, или ингибирования метастазирования. Например, можно использовать нуклеиновую кислоту, кодирующую опухолевый антиген (например, TERT).
В конкретном варианте осуществления опухоль представляет собой солидный рак, саркому или карциному. В частности, опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из меланомы, опухоли головного мозга, такой как глиобластома, нейробластома и астроцитома, а также карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, легких, особенно немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), поджелудочной железы, предстательной железы, рака головы и шеи или рака желудка.
В другом варианте осуществления опухоль может представлять собой жидкую опухоль, например гематопоэтическую опухоль, лимфому или лейкоз, такой как лимфоцитарный лейкоз, миелоидный лейкоз, лимфому, включая болезнь Ходжкина, множественную миелому, злокачественную миелому.
Хотя должно быть понятно, что количество необходимого материала будет зависеть от иммуногенности каждой отдельной конструкции и не может быть предсказано априори, процесс определения под- 6 035485 ходящей дозы для заданной конструкции является несложным. В частности, серии возрастающих доз, например начиная с около 5-30 мкг или предпочтительно 20-25 мкг, вплоть до около 500-1000 мкг, вводят соответствующим видам и наблюдают конечный иммунный ответ, например, путем детекции клеточного иммунного ответа с помощью ELISpot-IFNY-анализа (описанного в экспериментальном разделе), путем детекции ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) с использованием анализа лизиса in vivo, определяемого по стандартным тестам высвобождения хрома, или путем детекции ответа ТН (хелперных Т-клеток) с использованием анализа высвобождения цитокинов.
В предпочтительном варианте осуществления режимы вакцинации включают от одной до трех инъекций, предпочтительно повторяющихся через три или четыре недели. В конкретном варианте осуществления схема вакцинации может состоять из одной или двух инъекций и по меньшей мере одного последующего цикла через три или четыре недели, состоящего из трех-пяти инъекций. В другом варианте осуществления первая доза состоит из одной-трех инъекций с последующей, по меньшей мере, бустерной дозой, вводимой каждый год или каждые два или более лет. Это только примеры, и любой другой режим вакцинации охвачен настоящим изобретением.
Настоящее изобретение описано более подробно с помощью следующих неограничивающих экспериментов.
Примеры
Процедура электропереноса генов для противоопухолевой вакцинации.
В настоящем исследовании оптимизировали процедуру электропереноса генов в дерму в целях вакцинации против опухолевого антигена теломеразы. В первой оценке использовали репортерный ген люциферазы для оценки эффективности электропереноса генов в дерму как функцию используемых параметров. Во второй оценке эти параметры тестировали на их эффективность в отношении иммунизации мышей против эпитопов теломеразы. Использовали различные типы электродов, неинвазивных или инвазивных, а также ряд различных прилагаемых электрических полей.
Оценивали два важных параметра, первым из которых являлась интенсивность экспрессии люциферазы в участке электропереноса, и вторым являлась интенсивность специфических к вакцине, интерферон γ (Ш^)-положительных CD8 Т-клеток, которые представляют вид иммунного ответа, ожидаемый для противораковых вакцин (Vesely et al., 2011). Изучали три основных фактора электропереноса: типы электродов и воздействие импульсов HV и LV.
Материалы и методы.
Мыши.
Мыши HLA-B7 представляют собой трансгенных мышей, экспрессирующих молекулу класса I HLA-B*0702. Они являются нокаутными по молекулам класса I H2Db и H2Kb. Они были описаны ранее в работе Rohrlich et al., 2003 и получены в результате скрещивания (internal breeding) в Институте Пастера (The Pasteur Institute). Самок мышей C57BL/6J (в возрасте 6-8 недель) получали из лабораторий Janvier (Saint-Berthevin, Франция) или Harlan (Gannat, Франция).
Животных содержали в особых условиях, не содержащих патогенов, в лаборатории Института Пастера (Pasteur Institute) или Института Гюстава Русси (Gustave Roussy Institute). Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с этическим руководством Европейского Комитета (Directive 2010/63/EU), и манипуляции с животными проводились в строгом соответствии с положительной практикой обращения с животными.
Плазмиды.
pCMV-luc (PF461, Plasmid Factory, Bielefeld, Германия) представляет собой двухцепочечную плазмидную ДНК размером 6233 пар оснований, кодирующую репортерный ген люциферазы светлячка, помещенный под контроль промотора цитомегаловируса (pCMV).
INVAC-1 представляет собой двухцепочечную плазмидную ДНК размером 7120 пар оснований, кодирующую модифицированную последовательность белка теломеразы, слитую с белковой последовательностью убеквитина. Закодированный белок теломеразы является ферментативно неактивным, но все еще может вызывать иммунные ответы in vivo против эпитопов теломеразы. Вставку убиквитинтеломераза клонировали в экспрессионный вектор NTC8685-ERNA41H-HindIII-XbaI, разработанный фирмой Nature Technology Corporation (Lincoln, Nebraska). Присутствие убиквитина повышает перенос белка теломеразной обратной транскриптазы (TERT) в протеасому и увеличивает путь презентации пептидов, происходящих из TERT, МНС класса I (Rodriguez et al., 1997; Wang et al., 2012). Последовательность ДНК, кодирующая белок TERT, содержит делецию в 47 аминокислот в N-концевой области, которая включает сигнал ядрышковой локализации. Кроме того, три аминокислоты были удалены внутри каталитического сайта TERT (VDD) для устранения ферментативной активности белка. Плазмиду INVAC-1 хранили при -20°C в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) при концентрации 2 мг/мл до использования. На фиг. 1 представлена карта плазмиды INVAC-1.
Генератор ЕР и электроды.
Электроперенос генов выполняли с использованием Cliniporator® (IGEA, Carpi, Италия), доставляющего импульсы HV и импульсы LV. Величину напряжения устанавливали в соответствии с расстоя
- 7 035485 нием между двумя рядами электродов. Использовали различные типы электродов: (1) инвазивные игольчатые электроды (N-30-4B, IGEA), состоящие из двух рядов по четыре длинные иглы, которые отстоят друг от друга на расстоянии 4 мм, (2) инвазивные пальцеобразные электроды (F-05-OR, IGEA), состоящие из двух рядов по три короткие иглы, которые отстоят друг от друга на расстоянии 4 мм, (3) неинвазивные пластинчатые электроды (Р30-8В, IGEA), состоящие из двух металлических пластин толщиной 1 мм и отстоящие друг от друга на расстоянии 5 мм.
Электроперенос генов in vivo.
Мышей анестезировали перед интрадермальными (ID) инъекциями с использованием смеси газов для анестезии 2% изофлуран/кислород (Abbot, Suresnes, France) или смешанного раствора (интраперитонеальный способ) 2% ксилазина (Rompun, Bayer Sante, Loos, Франция) и 8% кетамина (Imalgen 1000, Merial, Lyon, Франция) в PBS в соответствии с индивидуальной массой тела животного. Интрадермальную (ID) инъекцию выполняли после бритья в нижнюю часть бока животного (билатеральные инъекции) с помощью инсулиновых специфических игл толщиной 29 G. Каждое животное мышиной линии HLA-B7 или C57BL/6J получало однократную дозу ДНК, соответствующую 100 мкг плазмиды INVAC-1 (50 мкг в 25 мкл PBS на бок) или 10 мкг плазмиды pCMV-luc (5 мкг в 25 мкл PBS на бок).
Сразу же после ID инъекции выполняли электроперенос генов с использованием импульса HV (длительностью 100 мкс) с последующим одним импульсом LV (длительностью 400 мс) через 1000 мс. Электроды помещали таким образом, чтобы они окружали волдырик, образовавшийся в результате инъекции плазмиды. Пальцеобразные или игольчатые электроды вдавливали в кожу на глубину около 5 мм. Для пластинчатых электродов использовали проводящий гель (Labo FH, gel de contact bleu, NM Medical, Франция) для улучшения контакта между металлическими пластинами и кожей.
Биолюминесцентная визуализация в условиях in vivo и локализация электропереноса.
Через два дня после электропереноса pCMV-luc мышам C57BL/6J инъецировали интраперитонеально 0,15 мг люциферина жука (Promega, Lyon, Франция) на 1 г массы тела. Через 20 мин после инъекции животных анестезировали с использованием смеси газов для анестезии 2% изофлуран/кислород и управляемую люциферазой биолюминесцентную реакцию детектировали с использованием системы визуализации In Vivo Imaging System IVIS 50 (Xenogen, Waltham, США). Для подтверждения электропереноса в кожу трех мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков через 20 мин после инъекции люциферина и у животных удаляли электропермеабилизованный участок кожи. Интенсивности биолюминесценции оценивали в кожном лоскуте и в подлежащих мышцах.
Приготовление спленоцитов.
Через 14 дней после ID инъекции INVAC-1 и электропереноса мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и извлекали селезенки. В стерильных условиях каждую селезенку продавливали через нейлоновую сетку с отверстиями 70 мкм (клеточный фильтр, BD Falcon Franklin Lakes, США) и промывали культуральной полной средой RPMI (Roswell Park Memorial Institute, среда, дополненная 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пирувата натрия, 1% пенициллинастрептомицина и 0,1% β-меркаптоэтанола). Все компоненты получали от фирмы Life technologies SAS (Saint-Aubin, Франция). Спленоциты очищали на градиенте плотности фиколла (Lymphocyte Separation Medium, Eurobio, Courtaboeuf, Франция), промывали и подсчитывали с использованием счетчика Cellometer® Auto T4 Plus counter (Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, Франция) и доводили до 2 миллионов клеток/мл в полной среде RPMI перед использованием в анализе IFNy ELISpot.
Пептиды, рестриктированные по HLA-B7 и Н2.
Пептиды TERT (hTERT) человека, рестриктированные по молекуле класса I HLA-B*0702, ранее были описаны (Adotevi et al., 2006; Cortez-Gonzalez et al., 2006). Другие пептиды были предсказаны с помощью предсказания эпитопов in-silico для связывания мышиных H2Kb, H2Db MHC класса I с использованием четырех алгоритмов, доступных в Интернете: Syfpeithi (http://www.syfpeithi.de/), Bimas (http://www-bimas.cit.nih.gov), NetMHCpan and SMM (http://tools.immuneepitope.org/main/). Все синтетические пептиды получали лиофилизированными (чистота >90%) от фирмы Proimmune (Oxford, UK). Лиофилизированные пептиды растворяли в стерильной воде при 2 мг/мл и хранили в аликвотах по 35 мкл при -20°C до использования. Подробная информация о пептидных последовательностях согласно рестрикции по В7 или Н2 представлена ниже.
Пептиды hTERT, рестриктированные по Н2:
H2Db: RPIVNMDYV (p660),
H2Kb: HAQCPYGVL (р429).
Пептиды hTERT, рестриктированные по HLA-B7:
HLA-B7: RPSLTGARRL (p351),
HLA-B7: RPAEEATSL (р277),
HLA-B7: LPSDFKTIL (p1123).
Анализ IFNy ELISpot.
Вкратце, микропланшеты из поливинилиденфторида (набор для анализа IFNy ELISpot, 10x96 тестов, Diaclone, Eurobio) покрывали в течение ночи захватывающим антителом (антимышиный
- 8 035485
IFNy) и блокировали стерильным 2% молоком в PBS в течение 2 ч. Планшеты ELISpot промывали и суспензии спленоцитов высевали в трех повторах при концентрации 2х105 клеток/лунку. Затем клетки стимулировали 5 мкг/мл соответствующих пептидов Н2 или В7 или 10 мкг/мл форбол-12-миристат-13ацетата (РМА)-иономицина или ложно стимулировали бессывороточной культуральной средой. Планшеты инкубировали при 37°C в атмосфере 5% СО2. Через 19 ч пятна выявляли с помощью антитела, конъюгированного с биотином, для детекции IFNy, затем использовали стрептавидин-щелочную фосфатазу и раствор субстрата 5-бром-4-хлор-3'-индолилфосфат п-толуидиновая соль/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT). Пятна подсчитывали с использованием счетчика Immunospot ELISpot counter и программного обеспечения (Cellular Technology Limited, Bonn, Германия).
Статистический анализ и обработка данных.
Программное обеспечение Prism-5 использовали для обработки данных, анализа и графического представления. Для статистических анализов биолюминесценции и ELISpot использовали тест МаннаУитни-Уилкоксона или тест Крускала-Уоллиса с критерием Данна для множественных сравнений в зависимости от эксперимента. Значимость устанавливали при р-величине <0,05.
Результаты.
Электроперенос обеспечил достижение оптимальной трансгенной экспрессии in vivo и индукцию антигенспецифических CD8 Т-клеток.
Плазмиды pCMV-luc или INVAC-1 интрадермально инъецировали в бритые бока мышей C57BL/6J с последующим применением или без последующего применения ЕР (1 импульс HV при 1000 В/см длительностью 100 мкс, с последующим импульсом LV при 140 В/см длительностью 400 мс через 1000 мс). Раздражения после бритья или во время и после процедуры электропереноса не наблюдалось. После электропереноса генов измеряли два параметра: экспрессию люциферазы после ID электропереноса pCMV-luc и частоту IFNY-секретирующих hTERT-специфических CD8 Т-клеток после ID электропереноса INVAC-1. Экспрессия люциферазы (фиг. 2А) и частота IFNY-секретирующих hTERTспецифических CD8 Т-клеток (фиг. 2В) значительно увеличились, когда ЕР прилагали непосредственно после инъекции ДНК (р<0,01 и р<0,05 соответственно) по сравнению с животными, которые получали инъекцию ДНК без электропереноса. Таким образом, электроперенос индуцирует значительные уровни hTERT-специфических CD8 Т-клеточных ответов после ID вакцинации INVAC-1 и значительные уровни экспрессии люциферазы после ID инъекции pCMV-luc.
Выбор наилучших электродов для оптимального переноса генов и генерирования интенсивных клеточных иммунных ответов.
Различные типы электродов могут быть использованы для электропереноса in vivo в кожу (Gothelf & Gehl, 2010). Таким образом, три различных типа электродов (пластинчатые электроды, пальцеобразные электроды и игольчатые электроды, описанные в разделе Материалы и методы) испытывали для определения, какой из них лучше всего подходит для эффективного переноса генов и генерирования интенсивных специфических клеточных иммунных ответов у мышей. Результаты показали, что три типа электродов значительно усиливали электроперенос плазмиды pCMV-luc у мышей C57BL/6J по сравнению с животными, которые получали плазмиду без ЕР (фиг. 3A). Однако наблюдалась более высокая однородность ответа для группы мышей, подвергнутых электропереносу с использованием пластинчатых электродов (р<0,001). Животные, подвергнутые электропереносу с использованием игольчатых электродов, также продемонстрировали, но в меньшей степени, значительные уровни экспрессии люциферазы (р<0,05).
Сходные результаты были получены в исследованиях иммуногенности у мышей HLA-B7. Когда мышей интрадермально вакцинировали INVAC-1 с последующим электропереносом в кожу, самую высокую среднюю частоту Ш^+-специфических CD8 Т-клеток детектировали при использовании пластинчатых электродов, и это различие было статистически значимым по сравнению с контрольной группой PBS (р<0,05) (фиг. 3B).
Таким образом, пластинчатые электроды показали самую высокую способность к электропереносу pCMV-luc и генерированию значительных уровней hTERT-специфических CD8 Т-клеток.
Локализация люциферазы после ID инъекции с последующим электропереносом генов
Известно, что электроперенос генов является очень эффективным в мышцах (Andre et al., 2008). Для гарантирования того, что после ID инъекции pCMV-luc ген люциферазы был подвергнут электропереносу только в кожу, лоскут кожи открывали на боку мышей C57BL/6J на участке обработки и биолюминесценцию лоскута кожи и подлежащих мышц измеряли через четыре дня после электропереноса генов. Для этого исследования электропереноса генов использовали пластинчатые электроды. Авторы подтвердили, что экспрессия трансгена происходила только в коже и не была обнаружена в подлежащих мышцах (фиг. 4).
Выбор импульса HV.
Первая оптимизация электрических параметров состояла в определении наиболее эффективной амплитуды импульса HV (длительностью 100 мкс) из следующих амплитуд полей: 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600 В/см. Интенсивность импульса LV (длительностью 400 мс) сохраняли постоянной при
- 9 035485
140 В/см и интервал между импульсами HV и LV устанавливали равным 1000 мс. Эту оценку выполняли с использованием репортерного гена люциферазы и мышей C57BL/6J.
Мыши C57BL/6J, подвергнутые электропереносу при 1200, 1400 и 1600 В/см, показали самое значительное усиление экспрессии люциферазы по сравнению с контрольными мышами (р<0,001) (фиг. 5). В частности, самая высокая средняя биолюминесценция была получена в группе, обработанной при 1400 В/см, и наблюдалась также более высокая однородность результатов для этой группы по сравнению с другими группами. Однако отсутствовало статистически значимое различие между ответами, полученными у этих трех групп, т.е. 1200, 1400 и 1600 В/см.
Выбор наилучшей комбинации импульсов HV-LV.
Влияние комбинаций HV-LV оценивали по электропереносу pCMV-luc и по индуцированным INVAC-1 специфическим клеточным иммунным ответам после ID инъекции в кожу мышей C57BL/6J. Что касается импульса HV, 1000 или 1400 В/см были выбраны для комбинирования с различными импульсами LV. Непосредственно после ID инъекции pCMV-luc или INVAC-1 прилагали один импульс HV (длительностью 100 мкс) при 1000 или 1400 В/см с последующим одним импульсом LV (длительностью 400 мс) при 60, 100, 140, 180 или 220 В/см. Десять комбинаций импульсов HV-LV назывались от Р1 до Р10 (см. таблицу).
Комбинации импульсов HV-LV, оцененные в анализах биолюминесценции и ELISpot
| (В/см) | LV = 60 | LV= 100 | LV= 140 | LV = 180 | LV = 220 |
| HV= 1000 | Pl | P2 | P3 | P4 | P5 |
| HV= 1400 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 |
Из-за технических ограничений Cliniporator® не мог доставлять постоянно 220 В/см в течение 400 мс. Таким образом, полученные при использовании условий Р5 и Р10 результаты оказались ненадежными и были исключены из анализа данных.
Три комбинации импульсов HV-LV, которые генерировали самые высокие средние значения интенсивности биолюминесценции, представляли собой Р4, Р8 и Р9 (фиг. 6А). Все из этих трех комбинаций показали высокие статистические различия по сравнению с инъекцией pCMV-luc без ЕР (р<0.001). В частности, Р9 показала наилучшую среднюю интенсивность биолюминесценции, самое высокое значение минимальной интенсивности биолюминесценции и самую низкую точку дисперсии.
Затем комбинации импульсов HV-LV Р4, Р8 и Р9 тестировали в отношении ID вакцинации INVAC1. Значения интенсивности hTERT-специфических CD8 Т-клеточных ответов у этих групп были сравнимыми с комбинацией P3, ранее описанной в отношении электропереноса ДНК в подкожные ткани (Andre et al., 2008). Анализ данных, полученных в результате анализа иммуногенности, показал, что наилучшими являются комбинации Р8 и Р9, которые обеспечили генерирование значительных частот №^+-специфических CD8 Т-клеток по сравнению с контрольными мышами (р<0,01 и р<0,001 соответственно) (фиг. 6В). Даже несмотря на то, что различие между группами Р8 и Р9 не было статистически значимым, Р9 показала более высокую среднюю частоту hTERT-специфических CD8 Т-клеток.
Учитываю данные анализов биолюминесценции и иммуногенности, лучшей комбинацией импульсов HV-LV оказалась комбинация Р9, т.е. один импульс HV (длительностью 100 мкс) при 1400 В/см с последующим импульсом LV (длительностью 400 мс) при 180 В/см.
Заключение.
В этом исследовании была оптимизирована процедура для электропереноса гена люциферазы in vivo в дерму и ID вакцинации, основанной на теломеразе. Неинвазивные пластинчатые электроды, доставляющие один импульс высокого напряжения длительностью 100 мкс с последующим одним импульсом низкого напряжения длительностью 400 мс, проявили самые высокие уровни экспрессии люциферазы и самое высокое число специфических к теломеразе CD8 Т-клеток. Результаты, полученные с использованием этой ДНК-вакцины на основе теломеразы, могут помочь разработать процедуру глобальной ДНК-вакцинации с использованием технологии электропереноса независимо от антигена, будь то опухолевый антиген или вирусный или бактериальный антиген.
- 10 035485
Список литературы
Adotevi О, Mollier К, Neuveut С, Cardinaud S, Boulanger E, et al. (2006) Immunogenic
HLA-B*0702-restricted epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase that elicit antitumor cytotoxic T-cell responses. Clin Cancer Res 12: 3158-3167.
Anderson ED, Mourich DV, Fahrenkrug SC, LaPatra S, Shepherd J, et al. (1996) Genetic immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) against infectious hematopoietic necrosis virus. Mol Mar Biol Biotechnol 5: 114-122.
Andre FM, Gehl J, Sersa G, Preat V, Hojman P, et al. (2008) Efficiency of high- and lowvoltage pulse combinations for gene electrotransfer in muscle, liver, tumor, and skin. Hum Gene Ther 19: 1261-1271.
Andre FM, Mir LM (2010) Nucleic Acids Electrotransfer In Vivo: Mechanisms and Practical Aspects. Current Gene Therapy 10: 267-280.
Barry MA, Lai WC, Johnston SA (1995) Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization. Nature 377: 632-635.
Bei R, Scardino A (2010) TAA poly epitope DNA-based vaccines: a potential tool for cancer therapy. J Biomed Biotechnol 2010: 102758.
Bergman PJ, McKnight J, Novosad A, Charney S, Farrelly J, et al. (2003) Long-term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA vaccination with xenogeneic human tyrosinase: a phase I trial. Clin Cancer Res 9: 1284-1290.
Breton M, Mir LM (2011) Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics.
Cortez-Gonzalez X, Sidney J, Adotevi O, Sette A, Millard F, et al. (2006) Immunogenic HLA-B7-restricted peptides ofhTRT. Int Immunol 18: 1707-1718.
Dolter KE, Evans CF, Ellefsen B, Song J, Boente-Carrera M, et al. (2011) Immunogenicity, safety, biodistribution and persistence of ADVAX, a prophylactic DNA vaccine for HIV-1, delivered by in vivo electroporation. Vaccine 29: 795-803.
Escoffre JM, Portet T, Wasungu L, Teissie J, Dean D, et al. (2009) What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Mol Biotechnol 41: 286-295.
Favard C, Dean DS, Rols MP (2007) Electrotransfer as a non viral method of gene delivery. Current Gene Therapy 7: 67-77.
Fioretti D, lurescia S, Fazio VM, Rinaldi M (2013) In vivo DNA electrotransfer for
- 11 035485 immunotherapy of cancer and neurodegenerative diseases. Curr Drug Metab 14: 279-290.
Gothelf A, Gehl J (2010) Gene electrotransfer to skin; review of existing literature and clinical perspectives. Curr Gene Ther 10: 287-299.
Gothelf A, Gehl J (2012) What you always needed to know about electroporation based
DNA vaccines. Hum Vaccin Immunother 8: 1694-1702.
Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH (2008) PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol 26: 677-704.
Kirman JR, Seder RA (2003) DNA vaccination: the answer to stable, protective T-cell memory? Curr Opin Immunol 15: 471-476.
Kolar P, Knieke K, Hegel JKE, Quandt D, Burmester GR, et al. (2009) CTLA-4 (CD 152) Controls Homeostasis and Suppressive Capacity of Regulatory T Cells in Mice. Arthritis and Rheumatism 60: 123-132.
Lee AH, Suh YS, Sung JH, Yang SH, Sung YC (1997) Comparison of various expression plasmids for the induction of immune response by DNA immunization. Mol Cells 7: 495-501.
Li L, Saade F, Petrovsky N (2012) The future of human DNA vaccines. J Biotechnol 162: 171-182.
Lindau D, Gielen P, Kroesen M, Wesseling P, Adema GJ (2013) The immunosuppressive tumour network: myeloid-derived suppressor cells, regulatory T cells and natural killer T cells. Immunology 138: 105-115.
Liu MA (2011) DNA vaccines: an historical perspective and view to the future. Immunol Rev 239: 62-84.
Mir LM, Belehradek M, Domenge C, Orlowski S, Poddevin B, et al. (1991) [Electrochemotherapy, a new antitumor treatment: first clinical trial], C R Acad Sci III 313: 613618.
Mir LM, Moller PH, Andre F, Gehl J (2005) Electric pulse-mediated gene delivery to various animal tissues. Adv Genet 54: 83-114.
Mir LM (2006) Bases and rationale of the electrochemotherapy. Ejc Supplements 4: 3844.
Rochard A, Scherman D, Bigey P (2011) Genetic immunization with plasmid DNA mediated by electrotransfer. Hum Gene Ther 22: 789-798.
Rodriguez F, Zhang J, Whitton JL (1997) DNA immunization: ubiquitination of a viral protein enhances cytotoxic T-lymphocyte induction and antiviral protection but abrogates antibody induction. J Virol 71: 8497-8503.
Rohrlich PS, Cardinaud S, Firat H, Lamari M, Briand P, et al. (2003) HLA-B*0702
- 12 035485 transgenic, H-2KbDb double-knockout mice: phenotypical and functional characterization in response to influenza virus. Int Immunol 15: 765-772.
Satkauskas S, Bureau MF, Puc M, Mahfoudi A, Scherman D, et al. (2002) Mechanisms of in vivo DNA electrotransfer: Respective contributions of cell electropermeabilization and
DNA electrophoresis. Molecular Therapy 5: 133-140.
Satkauskas S, Andre F, Bureau MF, Scherman D, Miklavcic D, et al. (2005) Electrophoretic component of electric pulses determines the efficacy of In Vivo DNA electrotransfer. Human Gene Therapy 16: 1194-1201.
Shevach EM (2009) Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression.
Immunity 30: 636-645.
Stevenson FK, Palucka К (2010) Understanding and activating immunity against human cancer. Curr Opin Immunol 22: 212-214.
Tang DC, DeVit M, Johnston SA (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152-154.
Villemejane J, Mir LM (2009) Physical methods of nucleic acid transfer: general concepts and applications. British Journal of Pharmacology 157: 207-219.
Vesely MD, Kershaw MH, Schreiber RD, Smyth MJ (2011) Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annu Rev Immunol 29: 235-271.
Wang Q, Lei C, Wan H, Liu Q (2012) Improved cellular immune response elicited by a ubiquitin-fused DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis. DNA Cell Biol 31: 489-495.
Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, et al. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247: 1465-1468.
Claims (15)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ предотвращения, подавления или уменьшения опухоли у субъекта in vivo, включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген и индуцирующей клеточный иммунный ответ, путем интрадермальной инъекции и электрической пермеабилизации клеток кожи с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в пределах от 1100 до 1400 В/см и длительностью от 10 до 1000 мкс;последующего единичного импульса электрического поля низкого напряжения в пределах от 100 до 200 В/см и длительностью от 300 до 800 мс.
- 2. Способ по п.1, где единичный импульс низкого напряжения имеет напряженность электрического поля 180 В/см.
- 3. Способ по любому из пп.1 или 2, где единичный импульс высокого напряжения имеет напряженность электрического поля 1250 В/см.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где единичный импульс низкого напряжения имеет длительность от 350 до 600 мс.
- 5. Способ по п.4, где единичный импульс низкого напряжения имеет длительность 400 мс.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, где единичный импульс высокого напряжения имеет длительность от 50 до 150 мкс.
- 7. Способ по п.6, где единичный импульс высокого напряжения имеет длительность 100 мкс.
- 8. Способ по любому из пп.1-7, где электроды, подлежащие использованию, представляют собой неинвазивные пластинчатые электроды.
- 9. Способ по любому из пп.1-8, где импульс высокого напряжения и импульс низкого напряжения отделены друг от друга интервалом времени, составляющим от 300 до 3000 мс.
- 10. Способ по п.9, где интервал времени составляет от 500 до 1200 мс.
- 11. Способ по п.10, где интервал времени составляет 1000 мс.
- 12. Способ по любому из пп.1-11, где нуклеиновая кислота кодирует белок TERT.
- 13. Способ противоопухолевой вакцинации или генной терапии субъекта in vivo, включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолевый антиген и индуцирующей клеточный иммунный ответ, путем интрадермальной инъекции и электрической пермеабилизации клеток кожи с помощью единичного импульса электрического поля высокого напряжения в пределах от 1100 до 1400 В/см и длительностью от 10 до 1000 мкс;- 13 035485 последующего единичного импульса электрического поля низкого напряжения в пределах от 100 до200 В/см и длительностью от 300 до 800 мс.
- 14. Способ по п.13, где импульс высокого напряжения и импульс низкого напряжения разделены интервалом времени, составляющим от 300 до 3000 мс.
- 15. Способ по любому из пп.1-14, где клеточный ответ - это ответ CD8 Т-клеток.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13190550 | 2013-10-28 | ||
| PCT/EP2014/073159 WO2015063112A1 (en) | 2013-10-28 | 2014-10-28 | Gene electrotransfer into skin cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201690892A1 EA201690892A1 (ru) | 2016-11-30 |
| EA035485B1 true EA035485B1 (ru) | 2020-06-24 |
Family
ID=49515222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201690892A EA035485B1 (ru) | 2013-10-28 | 2014-10-28 | Электроперенос генов в клетки кожи |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10493154B2 (ru) |
| EP (1) | EP3063280B1 (ru) |
| JP (1) | JP6601915B2 (ru) |
| AU (1) | AU2014343808B2 (ru) |
| BR (1) | BR112016008807B1 (ru) |
| CA (1) | CA2927539A1 (ru) |
| DK (1) | DK3063280T3 (ru) |
| EA (1) | EA035485B1 (ru) |
| ES (1) | ES2753412T3 (ru) |
| IL (1) | IL245166B (ru) |
| WO (1) | WO2015063112A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201603453B (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112018014109A2 (pt) | 2016-01-11 | 2018-12-11 | Verndari Inc | composições de microagulhas e métodos de uso das mesmas |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0458841T3 (da) | 1989-02-17 | 1995-11-20 | Chiron Mimotopes Pty Ltd | Fremgangsmåde til anvendelse og fremstilling af peptider |
| US5840839A (en) | 1996-02-09 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein |
| GB2321642B8 (en) | 1996-10-01 | 2006-08-22 | Geron Corp | Human telomerase reverse transcriptase promoter |
| AU2002363231A1 (en) | 2001-10-29 | 2003-05-12 | Baylor College Of Medicine | Human telomerase reverse transcriptase as a class-ii restricted tumor-associated antigen |
| AU2003249357A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-19 | Geron Corporation | Cancer vaccine containing cross-species epitopes of telomerase reverse transcriptase |
| EP1748067A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-01-31 | Institut Pasteur | Polynucleotides encoding MHC class I-restricted hTERT epitopes, analogues thereof or polyepitopes |
| EP1759714A1 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-07 | Bioalliance Pharma | Electrotransfer of nucleic acid into tissue cells |
| NZ576134A (en) | 2006-10-12 | 2011-09-30 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Telomerase reverse transcriptase fusion protein, nucleotides encoding it, and uses thereof |
| US20110318380A1 (en) | 2008-10-01 | 2011-12-29 | Dako Denmark A/S | MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring |
| CN102770156B (zh) * | 2009-12-16 | 2016-01-20 | 克洛恩泰克制药股份公司 | 密码子优化的乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag) |
| EP2978445B1 (en) | 2013-03-28 | 2018-07-04 | Invectys | A cancer vaccine for cats |
| AU2015209063C1 (en) | 2014-01-27 | 2020-06-25 | Molecular Templates, Inc. | MHC class I epitope delivering polypeptides |
-
2014
- 2014-10-28 DK DK14790591T patent/DK3063280T3/da active
- 2014-10-28 EA EA201690892A patent/EA035485B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-10-28 BR BR112016008807-7A patent/BR112016008807B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-10-28 JP JP2016526890A patent/JP6601915B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-10-28 AU AU2014343808A patent/AU2014343808B2/en not_active Ceased
- 2014-10-28 US US15/032,754 patent/US10493154B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-10-28 ES ES14790591T patent/ES2753412T3/es active Active
- 2014-10-28 CA CA2927539A patent/CA2927539A1/en not_active Abandoned
- 2014-10-28 EP EP14790591.3A patent/EP3063280B1/en active Active
- 2014-10-28 WO PCT/EP2014/073159 patent/WO2015063112A1/en active Application Filing
-
2016
- 2016-04-17 IL IL245166A patent/IL245166B/en active IP Right Grant
- 2016-05-20 ZA ZA2016/03453A patent/ZA201603453B/en unknown
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ANDRÉ F M, GEHL J, SERSA G, PRÉAT V, HOJMAN P, ERIKSEN J, GOLZIO M, CEMAZAR M, PAVSELJ N, ROLS M P, MIKLAVCIC D, NEUMANN E, TEISSI: "Efficiency of High- and Low-Voltage Pulse Combinations for Gene Electrotransfer in Muscle, Liver, Tumor, and Skin", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, GB, vol. 19, no. 11, 1 November 2008 (2008-11-01), GB, pages 1261 - 1271, XP002720283, ISSN: 1043-0342, DOI: 10.1089/hgt.2008.060 * |
| ANITA GOTHELF; FAISAL MAHMOOD; FREDERIK DAGNAES-HANSEN; JULIE GEHL;: "Efficacy of transgene expression in porcine skin as a function of electrode choice", BIOELECTROCHEMISTRY, ELESEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 82, no. 2, 1 June 2011 (2011-06-01), NL, pages 95 - 102, XP028391011, ISSN: 1567-5394, DOI: 10.1016/j.bioelechem.2011.06.001 * |
| BANGA AJAY K ET AL: "Iontophoresis and electroporation: Comparisons and contrasts.", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, ELSEVIER, NL, vol. 179, no. 1, 1 March 1999 (1999-03-01), NL, pages 1 - 19, XP002192323, ISSN: 0378-5173, DOI: 10.1016/S0378-5173(98)00360-3 * |
| PAVSELJ, N. ; PREAT, V.: "DNA electrotransfer into the skin using a combination of one high- and one low-voltage pulse", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 106, no. 3, 2 September 2005 (2005-09-02), AMSTERDAM, NL, pages 407 - 415, XP027664181, ISSN: 0168-3659 * |
| SATKAUSKAS S, ANDRÉ F, BUREAU M F, SCHERMAN D, MIKLAVCIC D, MIR L M: "Electrophoretic component of electric pulses determines the efficacy of in vivo DNA electrotransfer.", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, GB, vol. 16, no. 10, 1 October 2005 (2005-10-01), GB, pages 1194 - 1201, XP002709603, ISSN: 1043-0342, DOI: 10.1089/hum.2005.16.ft-128 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2014343808B2 (en) | 2020-03-05 |
| BR112016008807B1 (pt) | 2021-07-06 |
| BR112016008807A8 (pt) | 2020-03-24 |
| EP3063280A1 (en) | 2016-09-07 |
| ES2753412T3 (es) | 2020-04-08 |
| EA201690892A1 (ru) | 2016-11-30 |
| BR112016008807A2 (pt) | 2017-08-01 |
| US10493154B2 (en) | 2019-12-03 |
| DK3063280T3 (da) | 2019-11-11 |
| JP2016537973A (ja) | 2016-12-08 |
| WO2015063112A1 (en) | 2015-05-07 |
| ZA201603453B (en) | 2022-04-28 |
| IL245166B (en) | 2021-04-29 |
| AU2014343808A1 (en) | 2016-05-19 |
| EP3063280B1 (en) | 2019-08-14 |
| US20160279244A1 (en) | 2016-09-29 |
| CA2927539A1 (en) | 2015-05-07 |
| IL245166A0 (en) | 2016-06-30 |
| JP6601915B2 (ja) | 2019-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Heller et al. | Gene electrotransfer clinical trials | |
| AU2014228405B2 (en) | Cancer vaccines and methods of treatment using the same | |
| CN103314002A (zh) | 共有前列腺抗原、编码所述抗原的核酸分子以及包含所述核酸分子的疫苗及其用途 | |
| JP2019089813A (ja) | イヌ用がんワクチン | |
| BR112016009002B1 (pt) | Construção de ácido nucleico e usos de uma construção de ácido nucleico | |
| JP2021038225A (ja) | ネコ用がんワクチン | |
| KR20150130283A (ko) | 생체분자 보조제를 갖는 백신 | |
| Shirley et al. | Electroporation gene therapy | |
| Vandermeulen et al. | The site of administration influences both the type and the magnitude of the immune response induced by DNA vaccine electroporation | |
| Dobaño et al. | Enhancement of antibody and cellular immune responses to malaria DNA vaccines by in vivo electroporation | |
| Lamolinara et al. | Intradermal DNA electroporation induces cellular and humoral immune response and confers protection against HER2/neu tumor | |
| Colombani et al. | 704/DNA vaccines leverage cytoplasmic DNA stimulation to promote anti-HIV neutralizing antibody production in mice and strong immune response against alpha-fetoprotein in non-human primates | |
| AU2014343808B2 (en) | Gene electrotransfer into skin cells | |
| Vandermeulen et al. | Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation | |
| CN110167576A (zh) | 靶向成纤维细胞活化蛋白的优化的合成共有免疫原性组合物 | |
| Lin et al. | Selective modification of antigen-specific CD4+ T cells by retroviral-mediated gene transfer and in vitro sensitization with dendritic cells | |
| JP2012521265A (ja) | ポリヌクレオチドがんワクチンを哺乳動物の皮膚に送達する方法と装置 | |
| Ginsberg et al. | Improvement of DNA vaccines by electroporation | |
| AU2012321317B2 (en) | Novel clostridium difficile DNA vaccine | |
| JP2024150611A (ja) | Ｗｔ１ワクチン | |
| KR20160077194A (ko) | Hiv-1 env dna 백신과 단백질 부스터 | |
| Lamolinara et al. | Research Article Intradermal DNA Electroporation Induces Cellular and Humoral Immune Response and Confers Protection against HER2/neu Tumor | |
| US20070253969A1 (en) | Materials and methods relating to DNA vaccination | |
| Lambricht | Plasmids encoding viral structural proteins to enhance cancer DNA vaccine potency | |
| Gordy | EFFICACY IN A MOUSE MELANOMA MODEL OF A DENDRITIC CELL-TARGETING THERAPEUTIC DNA VACCINE AND ENHANCEMENT OF ITS ACTIVITY BY CO-TREATMENT WITH ANTIBODIES TO NEUTRALIZE INTERLEUKIN-10 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |