EA034753B1

EA034753B1 - Радиофармацевтическое средство на основе циклического октапептида и его применение для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы

Info

Publication number: EA034753B1
Application number: EA201500561A
Authority: EA
Inventors: Анна Борисовна НАЗАРЕНКО; Лев Васильевич ВОЛОЗНЕВ; Максим Геннадьевич ГРИНИН
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2020-03-17
Also published as: EA201500561A1; EP2949657A2; CN105263949A; EP2949657A4; RU2528414C1; WO2014116144A2; WO2014116144A3; RU2013103410A

Abstract

Изобретение относится к радиофармацевтическому средству, включающему комплекс радионуклидовIn,Y иLu с циклическим октапептидом, причем к α- или -аминогруппе N-концевого лизина (Lys) октапептида ковалентно присоединена хелатирующая группа DOTA. Заявленное радиофармацевтическое средство применимо для диагностики и лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.

Description

Область техники

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается фармацевтических, радиофармацевтических (далее - РФП) препаратов, на основе пептидных носителей с адресной доставкой.

Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, а конкретно к синтетическому октапептиду, регулирующему различные биологические процессы и используемому для получения различных лекарственных средств, радиофармацевтических препаратов для диагностики и лечения.

Пептиды - это семейство веществ, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединенных в цепь пептидными (амидными) связями.

Пептиды - это природные или синтетические соединения, содержащие десятки, сотни или тысячи мономерных звеньев - аминокислот. Полипептиды состоят из сотен аминокислот, олигопептиды состоят из небольшого числа аминокислот (не более 10-50), а простые пептиды содержат до 10 аминокислот.

Пептиды постоянно синтезируются во всех живых организмах для регулирования физиологических процессов. Свойства пептидов зависят, главным образом, от их первичной структуры - последовательности аминокислот, а также от строения молекулы и ее конфигурации в пространстве (вторичная структура).

Образование пептидов в организме происходит в течение нескольких минут, химический же синтез в условиях лаборатории - достаточно длительный процесс, который может занимать несколько дней, а разработка технологии синтеза несколько лет. Однако несмотря на это, существуют довольно весомые аргументы в пользу проведения работ по синтезу аналогов природных пептидов.

Во-первых, путем химической модификации пептидов возможно подтвердить гипотезу первичной структуры. Аминокислотные последовательности некоторых гормонов стали известны именно благодаря синтезу их аналогов в лаборатории.

Во-вторых, синтетические пептиды позволяют подробнее изучить связь между структурой аминокислотной последовательности и её активностью. Для выяснения связи между конкретной структурой пептида и его биологической активностью была проведена огромная работа по синтезу не одной тысячи аналогов. В результате удалось выяснить, что замена лишь одной аминокислоты в структуре пептида способна в несколько раз увеличить его биологическую активность или изменить её направленность. А изменение длины аминокислотной последовательности помогает определить расположение активных центров пептида и участка рецепторного взаимодействия.

В-третьих, благодаря модификации исходной аминокислотной последовательности появилась возможность получать фармакологические препараты. Создание аналогов природных пептидов позволяет выявить более эффективные конфигурации молекул, которые усиливают биологическое действие или делают его более продолжительным.

В-четвертых, химический синтез пептидов экономически выгоден. Большинство терапевтических препаратов стоили бы в десятки раз больше, если бы были сделаны на основе природного продукта.

Зачастую активные пептиды в природе обнаруживаются лишь в нанограммовых количествах. Плюс к этому методы очистки и выделения пептидов из природных источников не могут полностью разделить искомую аминокислотную последовательность с пептидами противоположного или же иного действия. А в случае специфических пептидов, синтезируемых организмом человека, получить их возможно лишь путем синтеза в лабораторных условиях.

Известен биологически активный октапептид ангиотензин II, образующийся из крупного белка плазмы крови ангиотензиногена в результате действия двух протеолитических ферментов.

Первый протеолитический фермент ренин отщепляет от ангиотензиногена с N-конца пептид, содержащий 10 аминокислот, называемый ангиотензином I. Второй протеолитический фермент карбоксидипептидилпептидаза отщепляет от С-конца ангиотензина I 2 аминокислоты, в результате чего образуется биологически активный ангиотензин II, участвующий в регуляции АД и водно-солевого обмена в организме.

Октапептид ангиотензин II имеет следующую аминокислотную последовательность:

Asp - Arg - Vai - Туг - Не - His - Pro - Phe

Функции пептидов зависят от их структуры. Ангиотензин I по структуре очень похож на ангиотензин II (имеет только две дополнительные аминокислоты с С-конца), но при этом не обладает биологической активностью.

Из уровня техники известен также другой октапептид - октреотид (циклический пептид), используемый в фармацевтической химии.

Октреотид является синтетическим аналогом соматостатина, который обладает сходным профилем фармакологической активности, но значительно превосходит природный пептид по силе и длительности действия. Подобно соматостатину он ингибирует секрецию соматотропин-рилизинг гормона в гипоталамусе и секрецию соматотропного и тиреотропного гормонов в передней доле гипофиза, а также подавляет секрецию различных гормонально активных пептидов (инсулина, глюкагона, гастрина, холецистокинина, вазоактивного интерстинального пептида, инсулиноподобного фактора роста -1) и серотонина, продуцируемых органами желудочно-кишечного тракта (желудок, кишечник, печень и поджелудочная

- 1 034753 железа).

Октреотид применяется как лекарственное средство для лечения акромегалии, опухолей гастропанкреатической эндокринной системы, а также используется как действенное средство профилактики осложнений в панкреатической хирургии.

Октреотид представляет собой циклический октапептид следующей структуры:

D - Phe - Cys - Phe - D - Trp - Lys - Thr - Cys - Thr - ol (I)

Особенностями его структуры являются наличие двух D-аминокислот;

наличие дисульфидного цикла;

восстановленный С-концевой остаток треонина (треонинол);

высокое содержание гидрофобных ароматических аминокислот.

Существенным с точки зрения химического синтеза является также наличие неустойчивого к действию окислителей и сильных кислот остатка триптофана. Синтез октреотида может быть осуществлен как твердофазным методом, так и классическими методами пептидного синтеза в растворе.

Основные проблемы синтеза октреотида твердофазным методом связаны с наличием в его молекуле С-концевого остатка треонинола. Треонинол не содержит карбоксильной группы, что не дает возможности использовать традиционные методы присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к полимерной матрице. В работе W.B. Edwards et. al. (J. Med. Chem. 1994, 373749) синтез осуществляли, начиная с предпоследнего остатка Cys(Acm), присоединенного к полимеру сложноэфирной связью. После сборки пептид окисляли до дисульфида на полимере, затем получали защищенный [D-Trp(Boc)⁴, Lys(Boc)⁵, Thr(Bu^t)⁶] - октреотид путем аминолиза пептидил-полимера избытком треонинона. Аминолиз протекал очень медленно, и общий выход защищенного пептида составил 14%.

Раскрытие изобретения

Задачей заявленного изобретения является получение новых радиофармацевтических препаратов с улучшенными свойствами и обеспечивающими терапию новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.

Таким образом, заявленное изобретение описывает группу изобретения, в которую входит радиофармацевтическое средство (РФП) на основе циклического октапептида и применение радиофармацевтического средства для радионуклидной терапии новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы. Циклический октапептид, используемый для получения радиофармацевтического средства (препарата), отвечает общей формуле (I)

Lys - Cys-Tyr-(D-Trp)-Lys-Thr-Cys-Thr-OH (I)

Указанный циклический октапептид отличается от известных пептидных аналогов октреотида общей формулы D-Phe¹-Tyr³ (октреотид) тем, что в нём D-Phe¹ заменен на Lys¹.

Циклический октапептид формулы I содержит концевую аминокислоту лизин (Lys), способную ковалентно присоединять хелатирующую группу ДОТА к α- или ε-аминогруппам N-концевого лизина (Lys) общей формулы

ДОТА- Lys-Cys-Tyr-(D-Trp)-Lys-Thr-Cys-Thr-OH (la) где - хелатирующий агент агент ДОТА (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триацетат).

Таким образом, циклический октапептид имеет структуру, содержащую вышеуказанную последовательность из аминокислот, содержит N-концевую аминокислоту лизин (Lys), способную ковалентно присоединять хелатирующую группу, например DOTA, и предназначен для получения радиофармацевтических препаратов с радионуклидами ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu.

Изобретение касается радиофармацевтического средства, включающего комплекс радионуклидов ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu с циклическим октапептидом, причем к α- или ε-аминогруппе N-концевого лизина (Lys) октапептида ковалентно присоединена хелатирующая группа DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан1,4,7-триацетат). Изобретение позволяет использовать РФП в качестве терапевтического радиофармацевтического средства для радионуклидной терапии - для лечения и диагностики новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы. Таким образом, изобретение также касается применения радиофармацевтического средства на основе комплекса октапептида формулы (Ia) с радионуклидами ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu для радионуклидной терапии новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепто ры, или их метастазов.

При этом при получении радиофармпрепарата по изобретению в виде комплекса октапептида формулы (Ia) с радионуклидами ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu используют хелатирующий агент ДОТА.

В данном изобретении, относящемся к получению радиофармацевтических и радиодиагностических препаратов на основе пептидных носителей с адресной доставкой, в качестве хелатирующего агента использован ДОТА (1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусной кислоты).

- 2 034753

Упомянутый ранее (ДОТА) - это 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триацетат.

Итак, поставленная задача достигается октапептидом, имеющим структуру (I), как производного октреотида, обладающего биологической активностью и представляющего интерес при создании фармацевтических средств, используемых при диагностике и лечении, в том числе и для создания с его использованием различных радиофармацевтических средств в виде комплексов их с различными радионуклидами.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется соответствующими примерами, не ограничивающими его.

Синтез октапептидов общей формулы I.

Список использованных сокращений.

DMF - диметилформамид,

DIPEA - N.N-диизопропилэтиламн.

HOBT - N-гидроксибензотиазол,

TBTU - тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония,

TFA - трифторуксусная кислота,

Fmoc - флуоренилоксикарбонил,

DCC - дициклогексилкарбодиимид,

Trt- тритил,

Boc - третбутилоксикарбонил,

But - третбутил,

Р - полимер.

В синтезе использованы защищенные производные фирмы Bachem Швейцария. Синтез аналогов октапептидов формулы (I) проводили твердофазным методом.

Пример 1. Осуществляют синтез Fmoc-гептапептидил-полимера

Cys(T rt)-Ty r-D-Trp-Lys-Thr-Cys(T rt)-Thr-P

Примечание: под символом Р обозначен полимер (матрица), на котором выращивают Fmocгептапептидил-полимер и который после этого отделяют и удаляют, в частности полимер Ванга фирмы Bachem.

Синтез пептидил-полимера - предшественника октапептидов с комплексообразующей группой DOTA проводят твердофазным способом исходя из 6,0 г Fmoc-Thr(But)-полимера Ванга фирмы Bachem с содержанием стартовой аминокислоты 0,61 ммоль/г. Реакции конденсации проводили дицикло гексилкарбодиимидным методом в присутствии N-гидроксибензотриазола (DCC/HOBT) в DMF с использованием двукратых избытков производных Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH. Для деблокирования аминогруппы использовали 20% пиперидин в диметилформамиде. Все операции проводили в соответствии со следующим протоколом (табл. 1).

Таблица 1

Протокол синтеза

№	Операция	Количество обработок (раз)	Время данной обработки (мин)
1	Активация 0.0074 моль Fmoc аминокислоты в присутствии 0.0074 моль DCC и 0.0074 моль НОВТ в 30 мл DMF	1	20
2	Промывка пептидил-полимера 50 мл DMF перед Деблокированием	3	1
3	Деблокирование 30 мл 20% пиперидина в DMF	1 1	5 15
4	Промывки 50 мл DMF	5	1
5	Конденсация	1	120
6	Промывки 50 мл DMF	3	1

По окончании синтеза пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3*80 мл), дихлорметаном (5*80 мл), сушили на воздухе. Полученные 10,36 г Fmoc-гептапептидил-полимера использовали на следующих стадиях.

Пример 2. Синтез

DOT A- Lys - Cys- Туг - (D- Trp)-Lys-Thr-Cys-Thr- ОН (I)

- 3 034753 отвечающего общей формуле октапептида формулы (Ia).

Соединение (I) получали путем наращивания пептидной цепи на последней стадии по протоколу, приведенному в табл. 1, с использованием на последней стадии синтеза Fmoc-Lys(Boc)-OH. 1,0 г (0,5 ммоль) защищенного октапептидил-полимера деблокировали 10 мл 20% пиперидина DMF и промывали DMF, как описано в пп.3 и 4 табл. 1. Пептидил-полимер суспензировали в 30 мл DMF, добавляли 0,47 г (1,0 ммоль) соответствующего производного лизина, 0,15 г (1,0 ммоль) НОВТ, 0,32 г (1,0 ммоль) TBTU и 0,5 мл DIPEA. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре, растворитель удаляли фильтрованием, Fmoc-пептидил-полимер промывали, деблокировали и опять промывали в соответствии с пп.3 и 4 табл. 1. Присоединяли DOTA(But)₃OH с использованием тех же реагентов, что и в случае производных лизина. Пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3*30 мл), дихлорметаном (5^30 мл), сушили на воздухе. 1,1 г пептидил-полимера суспендировали в 10,0 мл смеси TFA - тиоанизол триизобутилсилан -этандитиол - вода (8,5:0,5:0,5:0,25:0,25), перемешивали 4 ч при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2 раза по 0,5 мл). Прибавляли к фильтрату 50 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром (5*15 мл), этилацетаом (2*15 мл). Сырой продукт растворяли в 0,5 л воды, добавляли водный раствор аммиака до рН 9, оставляли на ночь при слабом перемешивании при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 1 мл 5% раствора Н₂О₂, перемешивали 15 мин. Полноту образования дисульфидной связи проверяли при помощи реактива Элмана. Реакционную смесь упаривали, предварительно добавив 1 мл уксусной кислоты (рН 4-5). Продукт вычищали методом ВЭЖХ на Диасорбе-130 (25*250 мм), элюция в градиенте от 0 до 20% за 10 мин и от 20 до 60% за 40 мин буфера Б в буфере А (А - 0,1% TFA и Б - 80% ацетонитрил в А), скорость потока 12 мл/мин, детекция при 226 нм. Фракции, соответствующие целевому веществу, объединяли и лиофилизовали. Выход соединения I - 0,108 г, что соответствует 15% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R_t = 13,32 мин (аналитическая ВЭЖХ на хроматографе Gilson, Франция, колонка Gromasil С18, 4,6*250 мм, градиент концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин, где А - 0,1% TFA и Б - 80% ацетонитрила в А, скорость потока 1 мл/мин).

Пример 3. Синтез соединения (Ib)

I ” I

H-Lys (DOTA)-Cys -Туг- (D-Trp)-Lys-Thr-Cys-Thr-OH отвечающего общей формуле октапептида формулы (I).

Соединение (Ib) получали аналогично (Ia) с тем отличием, что на последней стадии твердофазного синтеза использовали Boc-Lys(Fmoc)-OH. Выход (Ib) - 0,099 г, что соответствует 13% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R_t =13,37 мин в условиях, алогичных для соединения (I).

Ниже представлен пример получения радиофармацевтического средства в виде комплекса соедине111 9(А 177 177 ний формул (Ia) и (Ib) с радионуклидами In, Ύ, Lu на примере с радионуклидом Lu.

Нижеследующие примеры 4-6 иллюстрируют получение радиофармацевтического средства (препарата) по изобретению и его свойства.

Пример 4. Получение РФП на основе DOTA-коньюгированных пептидов (Ia) и (Ib), меченных радионуклидами ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, на примере ¹⁷⁷Lu.

Данная методика описывает проведение реакции мечения радионуклидом ¹⁷⁷Lu DOTAконъюгированных пептидов - аналогов октреотида (I) и (Ia), полученных в примерах 2 и 3.

Исходный пептид (в виде сухого вещества) растворяют в деионизованной воде (18 МОм), в концентрации 1 мг/мл. Полученный раствор пептида автоматическим дозатором фасуют по 50 мкл в полипропиленовые пробирки типа Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 мл).

Расфасованный раствор пептида хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С. Перед проведением реакции мечения раствор пептида размораживают при комнатной температуре в течение 1-2 мин. К размороженному пептиду в ту же пробирку дозатором добавляют ацетатный буфер 0,4М (так, чтобы кислотность (рН) реакционной среды составляла 4,0-5,0) и переносят за свинцовую защиту, где в пробирку добавляют раствор Lu (в 0,05N HCl) с активностью 5-100 мКи. Реакционную смесь инкубируют при температуре 80°С в течение 20 мин. По истечении 20 мин реакция мечения считается завершённой.

Пример 5. Определение радиохимической чистоты DOTA-конъюгированных пептидов (Ia) и (Ib), 111 177 177 меченных радионуклидами In, Y, Lu, на примере Lu.

Радиохимическую чистоту полученного продукта (РХЧ) определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

ВЭЖХ (UV-детектор, 220 нм; радиодетектор Radiomatic Flo-ONE/Beta, Packard) проводили с использованием колонки Acclaim; при скорости потока элюэнта 1 мл/мин; для градиентного элюирования использовали следующие элюэнты: А - ацетонитрил (ACN), В - 0,1% фторуксусная кислота (TFA).

Радиохимическая чистота составила более 98%. Хроматограмма представлена на чертеже.

Пример 6. Изучение накопления РФП на основе соединений (Ia) и (Ib), меченных радионуклидами ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, на примере ¹¹¹In у животных с перевитой опухолью (меланома), экспрессирующей рецеп

- 4 034753 торы соматостатина.

Эксперименты in vivo проводились на лабораторных самках мышей (гибриды F1 СВА*С57В1 весом 18-20 г). Животные были получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий РАМН Андреевка. Мышам перевивали пигментированную меланому В16. В асептических условиях подкожно вводили взвесь клеток меланомы В16. Рост опухоли отмечали визуально. Животных включали в эксперимент спустя 9-12 суток после имплантации, при достижении размера опухоли 8-12 мм в диаметре.

Во время экспериментов животных содержали в стандартных условиях (специальное помещение, рекомендованный рацион, свободный доступ к питьевой воде, естественное освещение).

Растворы соединений (I) и (Ia), меченые 'In. вводили в хвостовую вену, через 20 и 60 мин животных декапитировали, отбирали пробы крови, мышечной и опухолевой тканей, а также основные органы и ткни: печень, почки, наполненный мочевой пузырь, кровь, опухоль. Наполнение мочевого пузыря выполняли путем наложения лигатуры на наружное отверстие мочевыделительного канала. Радиоактивность в выбранных органах и тканях измеряли методом прямой радиометрии. На каждую временную точку использовали не менее 3-х животных. Полученные данные представлены в табл. 2.

Таблица 2 Распределение активности в организме мышей С57В1 с перевитой меланомой В16 (% от введенной дозы)

Орган/ткань	20 минут	60 минут
% от введенной дозы
Кровь	3,5	1,6
Печень	2,9	3,4
Почки	4,4	5,1
Мочевой пузырь	53,3	73,2
Мышцы, %/г	1,7	1,2
Опухоль, %/г	5,2	2,6
Опухоль/мышца	3,1	2,2
Опухоль/кровь	1,5	1,6

Как видно из приведенных данных, полученное соединение показывает тропность к опухоли меланома В16 in vivo. Согласно полученным данным препарат практически полностью выводится через почки, умеренно накапливается в печени и имеет достаточно высокое соотношение опухоль/мышца и опухоль/кровь.

Совокупность результатов мечения, биологического поведения in vivo позволяют считать целесообразным применение соединений (I) и (Ia), меченых ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y, а также другими радионуклидами, для радионуклидной терапии новообразований (опухолей), экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.

Claims

1. Радиофармацевтическое средство, включающее комплекс радионуклидов ¹¹¹In, ⁹⁰Y и ¹⁷⁷Lu с циклическим октапептидом, причем к α- или ε-аминогруппе N-концевого лизина (Lys) октапептида ковалентно присоединена хелатирующая группа DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триацетат)

II I

DOTA - Lys - Cys -Туг - (D-Trp) - Lys - Thr - Cys - Thr - OH

2. Применение радиофармацевтического средства по п.1 для диагностики и лечения опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы, или их метастазов.

- 5 034753

110 0 мН

1QOO

87 S

75 0

62 5

60 0

37,6

25 0

125

-100 ,3 мц

I

II

--.- .. ------ o'o ' ' 2,'o ' ' 4'0 ’ ' eb ' ' ’ a'o ' ' ’1S0 ’ ' ’ 12,0' ‘ ’τί,ο' ' 'ι% ' 'is o”¹ '

ItpCMM. MHH

№ Пик Время, мин Площадь, мВ*мин Высота, мВ Площадь % Высота % Счет 1 А 9,003 0,029 0,271 0,14 0,27 - 2 В 9,131 0,131 0,827 0,63 0,82 - 3 С 9,816 20,804 99,197 99,24 98,91 - Общее 20,964 100,295 100,00 100,00

Хроматограмма DOTA-конъюгированных пептидов, меченных радионуклидами ^1uIn, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, на примере ¹⁷⁷Lu