EA034652B1 - Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью - Google Patents
Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью Download PDFInfo
- Publication number
- EA034652B1 EA034652B1 EA201900245A EA201900245A EA034652B1 EA 034652 B1 EA034652 B1 EA 034652B1 EA 201900245 A EA201900245 A EA 201900245A EA 201900245 A EA201900245 A EA 201900245A EA 034652 B1 EA034652 B1 EA 034652B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- naproxen
- formula
- compound
- inflammatory
- dose
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/4415—Pyridoxine, i.e. Vitamin B6
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
- C07D213/63—One oxygen atom
- C07D213/65—One oxygen atom attached in position 3 or 5
- C07D213/66—One oxygen atom attached in position 3 or 5 having in position 3 an oxygen atom and in each of the positions 4 and 5 a carbon atom bound to an oxygen, sulphur, or nitrogen atom, e.g. pyridoxal
- C07D213/67—2-Methyl-3-hydroxy-4,5-bis(hydroxy-methyl)pyridine, i.e. pyridoxine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к новому производному напроксена, 3-((S)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)-4,5-бис-(((S)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)метил)-2-метилпиридиний (S)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноату, обладающему высокой противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активностью, а также низкой острой токсичностью и гастротоксичностью, которое может найти применение в фармацевтической промышленности, медицине и ветеринарии.
Description
Изобретение относится к новому производному напроксена формулы I, обладающему высокой противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активностью, а также низкой острой токсичностью и гастротоксичностью, которое может найти применение в фармацевтической промышленности, медицине и ветеринарии.
о
σ
I
Основными показаниями для назначения нестероидных противовоспалительных средств (далее НПВС) являются воспалительные процессы различной природы и локализации, боль, лихорадка. НИВС являются одной из наиболее широко применяемых групп лекарственных средств. Например, НИВС назначают примерно 20% стационарных больных с различными заболеваниями внутренних органов [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].
Главным элементом механизма действия НИВС является угнетение синтеза воспалительных медиаторов - простагландинов. В процессе альтерации (первой стадии воспаления) из клеточной мембраны высвобождаются фосфолипиды, которые под действием фермента фосфолипазы А2 метаболизируются до арахидоновой кислоты. Арахидоновая кислота, в свою очередь, метаболизируется двумя путями: циклооксигеназным (ЦОГ) и липооксигеназным (ЛОГ). НИВС подавляют только ЦОГ, поэтому они блокируют развитие только второй стадии воспаления [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].
Существует 2 изофермента ЦОГ: ЦОГ-1 (конститутивный, существующий в норме) - контролирует выработку простаноидов, регулирующих физиологические функции желудка, сосудов и почек; ЦОГ-2 (индуцированный) - участвует в синтезе простагландинов при воспалении. ЦОГ-2 в норме отсутствует и образуется под действием тканевых факторов, индуцирующих воспалительную реакцию (цитокины и др.). Считается, что противовоспалительное действие НИВС обусловлено ингибированием ЦОГ-2, а побочные эффекты возникают в результате ингибирования ЦОГ-1 [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. 944 с.].
Наиболее известными НИВС являются кетопрофен (3-бензоил-альфа-метилбензолуксусная кислота), ибупрофен ((К8)-2-(4-изобутилфенил)пропионовая кислота), диклофенак (2-[(2,6дихлорфенил)амино]бензолуксусная кислота), индометацин (1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Ниндол-3-уксусная кислота) и напроксен ((8)-6-метокси-а-метил-2-нафталинуксусная кислота). В настоящее время напроксен занимает одну из лидирующих позиций в группе НИВС, поскольку оказывает более продолжительное действие, чем другие НИВС, и хорошо переносится [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая Волна, с. 2012-1216].
Недостатком известных на сегодняшний день НИВС, а именно неселективных ингибиторов циклооксигеназы, является их выраженная гастротоксичность [Handa, О. The impact of non-steroidal antiinflammatory drags on the small intestinal epithelium/O. Handa, Y. Naito, A. Fukui, T. Omatsu, T. Yoshikawa//J. Clin. Biochem. Nutr. - 2014. - V. 54, N. 1. - P. 2-6]. Селективные ингибиторы ЦОГ-2 менее гастротоксичны, однако известно их негативное влияние на сердечно-сосудистую систему [Singh, B.K. Assessment of nonsteroidal anti-inflammatory drag-induced cardiotoxicity/B.K. Singh, S.E. Haque, K.K. Pillai //Expert. Opin. Drag Metab. Toxicol. - 2014. - V. 10, N. 2. - P. 143-156.]. Таким образом, на дату представления заявочных материалов проблема снижения побочных эффектов НИВС обоих типов - селективных и неселективных ингибиторов циклооксигеназы остается неразрешенной.
Таким образом, разработка безопасных и эффективных НИВС является одной из важнейших задач фармакотерапии и здравоохранения в целом.
Ио мнению заявителя, основанному на анализе уровня техники, наиболее перспективным направлением разработки противовоспалительных средств является поиск неселективных НИВС. Ири этом, как отмечено выше, перед разработчиками стоит задача снижения побочных эффектов, основным из которых является гастротоксичность.
Защита карбоксильной группы неселективных ингибиторов ЦОГ является одним из основных спо
- 1 034652 собов снижения токсичности этой группы НПВС. Наиболее часто для этого применяют сложноэфирную защиту [Liu, W. Synthesis and biological evaluation of curcumin derivatives containing NSAIDs for their antiinflammatory activity [Text]/W. Liu, Y. Li, Y. Yue, et al.//Bioorg. Med. Ghem. Lett. - 2015. - V. 25, N. 15. - P. 3044-3051]. Сложные эфиры НПВС являются типичными пролекарствами, которые в желудочнокишечном тракте (далее ЖКТ) подвергаются ферментативному гидролизу с постепенным высвобождением НПВС, обеспечивающим пролонгированный эффект лекарственного препарата. Помимо этого, пролекарства на основе сложных эфиров лучше проникают через цитоплазматические мембраны клеток, благодаря чему оказывают меньшее раздражающее действие на слизистую оболочку ЖКТ. Известны эфиры аскорбиновой кислоты с НПВС, являющимися производными арилуксусной или арилпропионовой кислоты, такими как ибупрофен, кетопрофен, напроксен и их соли [EP 2431361, опубл. 21.03.2012]. Для лечения артритов, болей и воспалительных процессов предложен 2-метансульфонатэтиловый эфир напроксена совместно с антагонистом H2 рецепторов [WO 200810106441, опубл. 21.08.2008]. Такая модификация НПВС приводит к снижению гастротоксичности, однако при этом значительно уменьшается и терапевтический эффект. По этой причине соединения такого рода не вошли в клиническую практику.
Наиболее близким по совокупности совпадающих признаков и достигаемому техническому результату к заявленному изобретению является техническое решение, описанное в изобретении по патенту RU 2513089 Нестероидные противовоспалительные средства на основе производных пиридоксина, сущностью которого являются производные пиридоксина общей формулы (I)
(!) где при R2+R3 =-C(CH3)2- или -CH(CH)-;
при R1=H; R3=H; R2 -
, обладающие противовоспалительной активностью.
Вариант прототипа, содержащий три фрагмента напроксена, является эффективным противовоспалительным соединением. В частности, он обладает выраженным противовоспалительным эффектом на модели подострого (формалинового) отека in vivo.
Однако на модели острого (каррагенинового) отека in vivo этот прототип оказался недостаточно эффективным. Важно отметить, что прототип не обладает одновременно совокупностью свойств, присущих заявленному техническому решению, а именно высокой противовоспалительной (на модели острого (каррагенинового) отека in vivo), обезболивающей и жаропонижающей активностью в сочетании с низкой токсичностью, в том числе гастротоксичностью. По этой причине заявителем данный прототип не рассматривается в качестве препарата сравнения, вместо него с этой целью используется современное нестероидное противовоспалительное средство напроксен и его аналоги (табл. 3).
Заявленное техническое решение в отношении заявленного состава отличается от описанного в прототипе наличием дополнительного фрагмента напроксена, который, по мнению заявителя, обоснованному экспериментально, обуславливает появление фармакологически значимых положительных эффектов. Так сочетание в заявленной молекуле расщепляемых в физиологических условиях ковалентных сложноэфирных связей и нековалентной ионной связи, связывающих фрагменты напроксена и пиридоксина, обуславливает возникновение неочевидных для специалиста синергетических эффектов. Эти эффекты выражаются в повышенной противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активности, а также существенно пониженной гастротоксичности и острой токсичности. В частности, заявленное соединение формулы I на фоне пониженной гастротоксичности и острой токсичности обеспечивает быстрое наступление ярко выраженного противовоспалительного эффекта на модели как острого, так и подострого отека in vivo, в силу чего заявителю удалость разрешить, казалось бы, непреодолимую проблему, характерную как для прототипа, так и для многих других НПВС, включая напроксен (последний также является прототипом заявленного технического решения).
Задача заявленного технического решения состоит в создании фармацевтического средства на основе напроксена, обладающего высокой противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активностью в сочетании с низкой токсичностью, в том числе гастротоксичностью, значительно расши ряющего арсенал известных средств указанного назначения.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является новое нестероидное противовоспа лительное средство на основе пиридоксина и напроксена, проявляющее высокую противовоспалительную, обезболивающую и жаропонижающую активность на фоне значительно меньшей токсичности, в том числе гастротоксичности, по сравнению с известными НПВС, в том числе с прототипом.
- 2 034652
Поставленная задача решается, и заявленный технический результат достигается путем синтеза соединения формулы I и применением его в качестве противовоспалительного, обезболивающего и жаропонижающего средства с пониженной гастротоксичностью
Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими материалами:
схема - химическая схема синтеза соединения формулы I;
табл. 1 - параметры режима градиентного элюирования при аналитической ВЭЖХ;
табл. 2 - острая токсичность соединения формулы I при внутрижелудочном введении;
табл. 3 - сравнительные характеристики соединения формулы I и некоторых известных НПВС; табл. 4 - гастротоксичность соединения формулы I при однократном введении в дозе 2000 мг/кг; табл. 5 - влияние соединения формулы I на острое экссудативное воспаление при внутрижелудочном введении;
табл. 6 - обезболивающий эффект соединения формулы I на крысах;
табл. 7 - жаропонижающий эффект соединения формулы I на крысах.
Сведения, подтверждающие состав и структуру заявленного соединения, приведены в примерах конкретного выполнения. Структура полученного соединения подтверждена методами 1Н- и 13С ЯМРспектроскопии, УФ-спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии.
Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker AVANCE-400. Химический сдвиг определяли относительно сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей (1H и 13С). Температуры плавления продуктов определяли с помощью прибора Stanford Research Systems MPA-100 OptiMelt при скорости нагрева 1°С/мин. Для изучения спектральных характеристик растворов соединения формулы I был использован УФ-спектрофотометр Evolution 300 (Thermo scientific). Удельное вращение определяли на поляриметре автоматическом ADP440+ (B&S) (Англия) при использовании кварцевой калибровочной кюветы 100°Z. Масс-спектры высокого разрешения (МСВР) регистрировали с использованием массспектрометра TripleTOF 5600, АВ Sciex (Германия) из раствора в метаноле методом ионизации - турбоионный спрей (TIS) - при энергии столкновения с молекулами азота 10 эВ.
Определение чистоты соединения формулы I проводили методом обращенно-фазной ВЭЖХ с использованием значений режима градиентного элюирования по табл. 1, при этом использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф LCMS-2010EV, Shimadzu (Япония), снабженный диодноматричным детектором на колонке XBridge С18, (размер 4.6x50 мм, 3.5 мкм). Температура термостата колонки плюс 40°С, скорость потока 1 мл/мин, объем вводимой пробы 1 мг/мл. УФ-детектирование осуществляли при аналитической длине волны 220 нм, а также 254 и 330 нм для определения примесей. В качестве подвижной фазы использовали: канал А - 0.1% по объему муравьиная кислота в воде, канал В - ацетонитрил. Режим работы насоса - градиентное элюирование, время анализа 22 мин.
Таблица 1
Параметры режима градиентного элюирования при аналитической ВЭЖХ
Время, мин
0.01
10.00
25.00
Объемная доля компонента канала В, %
Примеры конкретного выполнения заявленного технического решения.
Получение заявленного соединения формулы I, содержащего фрагменты пиридоксина (витамина B6) и напроксена, осуществляют в две стадии с использованием коммерчески доступных субстратов, реагентов и растворителей по нижеприведенной схеме.
- 3 034652
(28,2'8)-(5-((8)-2-(6-метоксинафт-2-ил) пропаноилокси)-6-метилпиридин-3,4-диил) бис(метилен)бис(2-(6-метоксинафт-2ил)пропаноат)
3-((8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)-4,5-бис (((8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)метил)2-метилпиридиниум (8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноат
М.в. 1036.17
Пример 1. Получение (2S, 2'8)-(5-((8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)-6-метилпиридин-3,4диил)бис-(метилен)бис(2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноата) (соединение IV).
В круглодонную колбу загружают 28.35 г пиридоксина гидрохлорида II, 95.23 г напроксена III, 50.52 г 4-^№диметиламинопиридина и 123.73 г дициклогексилкарбодиимида в 5 л ацетона. Перемешивают реакционную смесь до прекращения образования осадка дициклогексилмочевины, после чего осадок отфильтровывают, промывают его 200 мл ацетона, а объединенный фильтрат упаривают в вакууме. Продукт очищают при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент этилацетатпетролейный эфир 1:1). Получают продукт IV в виде белого кристаллического вещества (выход 82.0 г, 74%). Более детально получение указанного соединения и его свойства описаны в изобретении по патенту RU 2513098.
Пример 2. Получение 3-(^)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)-4,5-бис-((^)-2-(6-метоксинафт2-ил)пропаноилокси)метил)-2-метилпиридиний ^)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноата (соединение I).
Помещают 82.0 г соединения IV в круглодонную колбу, добавляют 1 л ацетона и перемешивают смесь в течение 10 мин. К полученному раствору добавляют 18.22 г ^)-2-(6-метокси-2нафтил)пропионовой кислоты (напроксена) III и перемешивают до полного растворения осадка. Ацетон удаляют в вакууме на роторном испарителе (90 об/мин, остаточное давление 10 мбар, температура 40°С). Осадок собирают и сушат в вакууме на роторном испарителе (90 об/мин, остаточное давление 10 мбар, температура 80°С). Выход заявленного соединения 1100.1 г (99,9%).
Т. пл. 145°С. [a]24D=+22.8° (с=3.01, CH2Cl2). Спектры поглощения растворов соединения формулы I снимают в ацетонитриле и метиленхлориде в диапазоне длин волн от 200 до 450 нм, при этом они содержат максимумы поглощения при 262, 272, 317 и 332 нм. Отклонения положения максимумов составляют ±2 нм. Концентрация растворов 40 мкг/мл. В спектре ЯМР 1Н наблюдаются следующие сигналы (400 МГц, CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 1.33 (уш д, 3 Н, СН3,31=3.7); 1.40 (д, 3Н, СН3,31=7.1); 1.50 (д, 6Н, 2СН3, 3J=7.1); 1.90 (уш с, 3 Н, СН3); 3.47 (уш с, 1 Н,); 3.65 (к, 1Н, СН, 3J=7.1); 3.74-3.87 (м, 13Н); 4.50 (уш с, 1Н); 4.80 (уш с, 1Н); 4.95 и 5.04 (АВ, 2Н, СН2, 3J=-12.8); 6.95-7.66 (м, 20Н), 8.19 (с, 1Н, СН). В спектре ЯМР 13С наблюдаются следующие сигналы (100 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 17.96; 18.42; 18.52; 18.92; 45.02; 45.34; 45.38; 55.40; 57.13; 61.65; 105.66; 105.73; 119.09; 119.13; 119.18; 119.38; 125.96; 126.09; 126.16; 126.20; 126.38; 126.57; 127.30; 127.36; 127.49; 128.96; 129.01; 129.39; 129.64; 133.78; 133.81; 133.86; 134.05; 134.13; 135.18; 135.21; 135.42; 136.16; 144.78; 147.16; 152.75; 157.74; 157.79; 157.96; 171.95; 174.02;
- 4 034652
179.30.
Целевое вещество I представляет собой соль соединения IV с напроксеном. В связи с этим в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ (табл. 1) оно проявляется на хроматограмме в виде двух пиков, соответствующих соединению IV и напроксену, масс-спектры которых соответствуют расчетным и литературным данным (806.3324 и 229.0870 соответственно).
Исследование острой токсичности соединения формулы I.
Эксперимент проводили по методу фиксированной дозы на крысах линии Wistar обоего пола, по 6 голов в группе. Начальная доза для исследования при внутрижелудочном введении составляла 5000 мг/кг. В качестве растворителя использовали 0.5%-ный раствор Твин-80 (Твин 80 - полиоксиэтилен, производное сорбитана и олеиновой кислоты, коммерчески доступный полимер), который готовили растворением 0.5 г Твин-80 в 100 мл дистиллированной воды.
Для приготовления дозы 5000 мг/кг взвешивали навеску 25 г исследуемого соединения в полистирольных лодочках на весах Vibra (Shinko Denshi, Япония, кат. № AF225DRCE), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин80, и суспензию препарата размешивали при помощи диспергатора SilentCrusher (Heidolph, Германия, P/N 595-06000-00-3) до однородной консистенции.
Введение осуществляли животным, лишенным корма (на промежуток времени не менее 8 ч) со свободным доступом к воде. Объем введения рассчитывали индивидуально для каждого животного, основываясь на массе тела, зарегистрированной непосредственно перед введением вещества. Доступ к корму возобновляли через час после введения. Животных наблюдали индивидуально после введения на протяжении 30 мин, затем не реже раза в час на протяжении 4 ч, далее ежедневно 1 раз в день в течение 14 дней. Массу тела регистрировали непосредственно перед введением препарата для расчета объема введения, далее 1 раз в два дня. Если животное умирало в течение исследования, устанавливали и документировали время гибели с максимально возможной точностью. Животное взвешивали и вскрывали, как можно раньше. Умирающих животных взвешивали, подвергали эвтаназии и вскрывали. Животных подвергали эвтаназии методом ингаляции углекислым газом. Расчет токсических доз ЛД10, ЛД16, ЛД50 и ЛД84 производили с использованием пробит-анализа в программном обеспечении IBM SPSS Statistics.
При внутрижелудочном введении в дозе 5000 мг/кг наблюдалось небольшое угнетение активности животного. Через 20-30 мин данный симптом исчезал. Через 1.5-2 ч животные начинали принимать корм и воду. Через трое суток пала 1 крыса (самка). Далее на протяжении исследования падежа не наблюдалось.
На протяжении всего эксперимента все основные показатели жизнедеятельности у подопытных животных соответствовали норме и не отличались от контрольных. У животных отмечался хороший аппетит, блестящая шерсть, видимые слизистые оболочки были бледно-розового цвета, поведение соответствовало данному виду животного, никаких отклонений при наблюдении выявлено не было. Масса тела крыс через 2 и 4 дня после начала эксперимента увеличивалась на (1-4)% и (2-6)% соответственно, что приблизительно соответствует приросту массы у крыс контрольной группы. На восьмые сутки исследования масса животных увеличивалась на (2-8)%. На конец эксперимента повышение массы составило (513)%. Параметры острой токсичности представлены в табл. 2.
Таблица 2 Острая токсичность соединения формулы I при внутрижелудочном введении
| Вид животного | Пол | Доза, мг/кг | Число животных в группе/ число погибших животных | ЛДю | ЛД16 | ЛД50 | ЛД84 |
| крыса | самцы | 5000 | 6/0 | >5000 | >5000 | >5000 | >5000 |
| самки | 5000 | 6/1 | >5000 | >5000 | >5000 | >5000 |
В конце эксперимента проводили эвтаназию и патоморфологическое вскрытие контрольных и подопытных животных. При вскрытии крыс никаких изменений не наблюдалось. Трупы животных правильного телосложения, средней или выше средней упитанности. Естественные отверстия: рот закрыт, язык находится в ротовой полости, слизистые оболочки губ, десен бледно-розовые гладкие, блестящие. Носовые отверстия - слизистая бледно-розовая, сухая, истечений нет, проходимость хорошая. Ушные раковины без изменений, наружный слуховой проход чистый. Анус закрыт, слизистая оболочка бледно-розовая. Шерсть удерживается хорошо, шерстный покров блестящий. Кожа эластичная, подкожная клетчатка хорошо выражена, желтоватого цвета, эластичная. Мышцы красноватого цвета, хорошо развиты, сухожилия и связки белого цвета, эластичные, прочные. Конфигурация костей и суставов не нарушена. Положение органов грудной и брюшной полостей анатомически правильное. Жидкости в грудной и брюшной полостях нет. Проходимость глотки и пищевода не нарушена. Сердце в объеме не изменено. В полостях сердца содержится незначительное количество несвернувшейся крови, эндокард гладкий, блестящий. Легкие бледно-розового цвета, равномерно окрашенные, без признаков отечности, дольчатость выражена хорошо. Селезенка не увеличена в объеме, края острые, продолговатой формы, упругой консистенции, красно-коричневого цвета. Печень не увеличена в размере, края острые, форма не изменена, консистен
- 5 034652 ция плотная, цвет красно-коричневый. Желудок содержит кормовую массу серого цвета однородной консистенции. Слизистая оболочка желудка бледно-серого цвета. Слизистая оболочка тонкого и толстого отделов кишечника бледно-розового или бледно-серого цвета. Почки бобовидной формы, темнокоричневого цвета, в околопочечной клетчатке содержится умеренное количество жира, капсула отделяется легко, граница между корковой и мозговой зонами выражена. Мочевой пузырь пустой или переполнен мочой светло-желтого цвета, слизистая оболочка бледно-розового цвета. Половые органы без отклонений. У самцов семенники упругой консистенции, находятся в полости мошонки, имеют эллиптическую форму. У самок яичники и матка в норме. Головной мозг не отечен, мозговое вещество упругой консистенции, без кровоизлияний.
Таким образом, проведенные исследования показали, что заявленное соединение формулы I при внутрижелудочном введении относится к 4 классу опасности, т.е. к малоопасным веществам (ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности) и по безопасности, выраженной значением летальной дозы ЛД50, превосходит большинство известных на сегодняшний день НПВС (табл. 3). Например, заявленное соединение в 8 раз менее токсично в сравнении с напроксеном.
Таблица 3
Сравнительные характеристики соединения формулы I и некоторых известных НПВС*
| Препарат | ЭД50 (мг/кг) острое воспаление | УД50 (мг/кг) | ЛД50 (мг/кг) | УД50/ЭД50 (индекс безопасности) | ЛД5о/ ЭД50 (терапевтический индекс) |
| Соединение формулы I | 19 | >2000 | >5000 | >105 | >263 |
| Ибупрофен | 48 | 310 | 750 | 6.45 | 16 |
| Диклофенак натрий | 8 | 48 | 370 | 6 | 46 |
| Напроксен | 15 | 49 | 620 | 3.2 | 42 |
| Пироксикам | 20 | 36 | 290 | 1.8 | 15 |
| Фенилбутазон | 56 | 120 | 430 | 2.1 | 7.7 |
| Ацетилсалициловая кислота | 98 | 240 | 1600 | 2.45 | 16 |
| Индометацин | 10 | 10 | 47 | 1 | 4.7 |
* - Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
Гастротоксичность соединения формулы I.
При исследовании гастротоксичности использовали самок и самцов крыс линии Wistar в возрасте 67 недель с массой тела 180-220 г. Количество животных в каждой группе составляло 10 голов.
Соединение формулы I вводили однократно внутрижелудочно крысам, лишенным пищи за 16 ч до исследования. Через 3 ч после введения суспензии исследуемого вещества в дозе 2000 мг/кг (в 0.5%-ном водном растворе Твин-80) животных подвергали эвтаназии, извлекали желудки, рассекали их по малой кривизне и промывали в физиологическом растворе для удаления содержимого.
Оценку гастротоксичности проводили по 4-балльной шкале:
- отсутствие повреждений;
0.5 - гиперемия;
- единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния);
- множественные повреждения (эрозии, точечные кровоизлияния);
- значительные и множественные повреждения слизистой (эрозии, кровоизлияния);
- грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации).
По результатам оценки определяли УД50 - дозу исследуемого вещества, вызывающую гастротоксический (ульцерогенный) эффект, соответствующий 2 баллам.
Для приготовления дозы 2000 мг/кг взвешивают навеску 32.0 г соединения формулы I в полистирольных лодочках на весах Vibra (Shinko Denshi, Япония, кат. № AF225DRCE), переносят в мерную колбу объемом 400 мл класса точности А, доводят до метки 400 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80 и суспензию препарата размешивают при помощи диспергатора SilentCrusher (Heidolph, Германия, P/N 595-06000-00-3) до однородной консистенции. Введение крысам осуществляют в объеме не более 5 мл/200 г.
Животные подвергались эвтаназии методом ингаляции углекислым газом.
При однократном введении соединения формулы I в дозе 2000 мг/кг гастротоксическое действие соответствовало в среднем 0.6 баллам у самцов крыс и 0.4 баллам у самок (табл. 4).
Таблица 4
Г астротоксичность соединения , формулы I при однократном введении в дозе 2000 мг/кг
| Группа | Количество животных | Доза, мг/кг | Г астротоксическое действие (усредненное), баллы | УД50, мг/кг | ||
| самцы | самки | самцы | самки | |||
| Соединение формулы I | 10/10 | 2000 | 0.6 | 0.4 | >2000 | >2000 |
Таким образом, для соединения формулы I значение УД50>2000 мг/кг, что превосходит аналогич- 6 034652 ный параметр для большинства НПВС (табл. 3). Например, заявленное соединение в 40 раз менее гастротоксично в сравнении с напроксеном.
Противовоспалительная активность соединения формулы I in vitro.
Структурный фермент циклооксигеназа 1 (ЦОГ 1) экспрессируется в различных типах клеток и участвует в обеспечении их нормальной (физиологической) функциональной активности. Циклооксигеназа 2 (ЦОГ 2) ответственна за синтез простагландинов в условиях сильного воспаления.
Анализ активности ЦОГ заключался в измерении пероксидазной активности циклооксигеназы. В ходе реакции PGG2 (простагландин G2) с ADHP (10-ацетил-3,7-дигидрофеноксазин), представленном в используемом наборе (Cyclooxygenase (СОХ) Activity Assay Kit (Fluorometric) (Biovision, кат № К 549100) в виде СОХ probe, образуется флуоресцентный компонент резоруфин, длина волны поглощения которого составляет 530-540 нм, длина волны испускания - 585-595 нм. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна остаточной активности ЦОГ в образце. В качестве источника фермента циклооксигеназы были выбраны клетки фибробластов кожи (HSF). Было показано, что клеточный лизат фибробластов обладает активностью ЦОГ, равной 2.131 pU/mg.
Приготовление клеточного лизата.
Клетки фибробласты кожи (2-6x106) промывают единожды 10 мл фосфатного буфера. Ресуспендируют в 5 мл буфера и переносят клетки в 15 мл пробирку. Центрифугируют при 1500g в течение 4 мин. Далее сливают супернатант, ресуспендируют клеточный осадок в 0.5-1 мл холодного лизирующего буфера с протеазным коктейлем (примерно 0.4 мл буфера на 100 мкл клеточного осадка), и центрифугируют при 4°С в течение 15 мин при 10000g. Отделяют супернатант и используют его в качестве источника ЦОГ.
Приготовление реагентов.
Растворяют СОХ кофакторы в 200 раз, добавляя 2 мкл кофакторов к 398 мкл буфера сразу перед использованием. Смешивают 65 мкл арахидоновой кислоты и 65 мкл NaOH, затем разбавляют в 10 раз, добавив 1170 мкл дистиллированной воды. Раствор стабилен в течение 1 ч.
Готовят реакционную смесь (для 2-х параллельных лунок), смешав следующие реагенты, указанные ниже:
СОХ probe - 2 мкл;
растворенный кофактор - 4 мкл (стабилен в течение 1 ч);
клеточный лизат - 20 мкл;
с помощью СОХ буфера доводят объем до 172 мкл.
Приготовление тестируемых веществ.
Используют стоковые растворы напроксена и вещества формулы I в диметилсульфоксиде (ДМСО) концентрацией 1000 мкМ для приготовления предварительных разведений с шагом в 2 раза. Получают соответственно 5 концентраций от 62.5 до 1000 мкМ.
Используя мультиканальную пипетку, добавляют реагенты в соответствующие лунки планшета: сначала реакционную смесь, затем растворы тестируемых веществ в ДМСО в ряду концентраций и контрольных веществ (ингибитор ЦОГ 1 SC560 и ингибитор ЦОГ 2 Celecoxib), чистый растворитель ДМСО (для лунок с высшей активностью). Используют две повторности. Инкубируют в течение 5 мин.
Инициирование реакции.
До начала реакции проводят однократное измерение флуоресценции во всех лунках планшета для учета собственного сигнала тестируемых и контрольных веществ. Затем во все лунки планшета с помощью мультиканальной пипетки добавляют 10 мкл раствора арахидоновой кислоты для инициирования реакции. После добавления арахидоновой кислоты немедленно начинают измерять флуоресценцию (Ex/Em=535/587нм) в кинетическом режиме каждые 15 с в течение 30 мин.
Параметр флуоресценции образов с контрольными и тестируемыми веществами вычисляют по формуле
Average Net RFU = Average RFU - Average Blank RFU Процент ингибирования ЦОГ вычисляют по формуле
Average Net Inhibitor RFU (1--—---т------rm—ί) х 100
Average Net RFU for non — inhibited
Далее по имеющимся точкам данных для исследуемого вещества и вещества сравнения (напроксена) строят наиболее подходящую сигмоидную кривую ингибирования. Исходя из этой кривой вычисляют IC50 тест-препарата для ЦОГ.
Согласно рекомендациям производителя используемого набора ингибитор ЦОГ-1 SC560 и ингибитор ЦОГ-2 целекоксиб добавляют в реакционную смесь в объеме по 2 мкл (этого количества достаточно для полного ингибирования соответствующей изоформы). Остаточная активность ЦОГ, содержащейся в клеточном лизате после обработки SC560 и целекоксибом, составляет соответственно 72.8 и 32.0%.
При исследовании ингибирующей активности концентрация напроксена и исследуемого вещества в лунке составляет от 1.25 до 20 мкМ.
Для определения доли ингибирования препаратом каждой из изоформ тестируют исследуемые ве
- 7 034652 щества в раскладке концентраций в присутствии селективного ингибитора ЦОГ 1 SC560, а также в присутствии селективного ингибитора ЦОГ 2 целекоксиб. Ингибитор добавляют в количестве, достаточном для полного ингибирования соответствующей изоформы фермента, при этом другая изоформа сохраняет активность.
Условно приняв активность в присутствие только тестового препарата за 100%, рассчитывают остаточную активность ЦОГ 1 и ЦОГ 2 и процент ингибирования каждой изоформы препаратом. Соединение формулы I проявляет преимущественную ингибирующую активность по отношению к изоформе ЦОГ-2.
Таким образом, IC50 напроксена (прототип) составляет 9.56 мкМ, что в 1.25 раз больше IC50 соединения формулы I, равной 7.7 мкМ. Из вышесказанного можно сделать вывод, что заявленное соединение формулы I более эффективно в качестве ингибитора циклооксигеназы, поскольку действует при более низкой концентрации.
Противовоспалительная активность соединения формулы I in vivo.
Эксперимент проводили с использованием самок и самцов крыс линии Wistar в возрасте 6-7 недель с массой тела 180-220 г. Количество животных в каждой группе составляет 10 голов.
Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0.1 мл 1%-ного раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха). Выраженность воспалительной реакции оценивали через 3 ч после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрически). Вещество формулы I вводили зондом в желудок за 1 ч до введения 1%-ного раствора каррагенина. В качестве негативного контроля использовали 0.5%-й раствор Твин-80. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах к контролю. По результатам действия четырех доз исследуемого вещества проводили расчет ЭД50.
Для приготовления дозы 50 мг/кг взвешивали навеску 1000 мг соединения формулы I в полистирольных лодочках на весах Vibra (Shinko Denshi, Япония, кат. № AF225DRCE), переносили в мерную колбу объемом 200 мл класса точности А, доводили до метки 200 мл 0.5%-ным водным раствором Твин80, и суспензию препарата размешивали при помощи диспергатора SilentCrusher (Heidolph, Германия, P/N 595-06000-00-3) до однородной консистенции. Введение крысам осуществляли в объеме не более 1 мл/100 г. Концентрация полученного раствора 5 мг/мл.
Для приготовления дозы 20 мг/кг брали 40 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию препарата размешивали при помощи диспергатора до однородной консистенции.
Для приготовления дозы 10 мг/кг брали 20 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию препарата размешивали при помощи магнитной мешалки MR HeiStandard (Heidolph, Германия) до однородной консистенции.
Для приготовления дозы 5 мг/кг брали 4 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию препарата размешивали при помощи магнитной мешалки до однородной консистенции.
Животных наблюдали индивидуально после введения на протяжении 30 мин, затем не реже раза в час на протяжении 4 ч. Массу тела регистрировали непосредственно перед введением препарата для расчета объема введения.
Животных подвергали эвтаназии методом ингаляции углекислым газом.
При введении дозы 50, 20, 10 и 5 мг/кг соединения формулы I самцам крыс наблюдалось снижение воспалительного отека на 62.34, 51.25, 23.57 и 12.39% соответственно в отличие от контрольной группы. У самок крыс при введении дозы 50, 20, 10 и 5 мг/кг соединения формулы I отек снижался на 65.47, 67.89, 38.64 и 13.37% соответственно. Результаты представлены в табл. 5.
- 8 034652
Таблица 5
Влияние соединения формулы I на острое экссудативное воспаление при внутрижелудочном введении
| Группа | Доза, мг/кг | Объем лапы | Противовоспалительный эффект, % | |
| о.............1 | Зч | |||
| Самцы крыс | ||||
| Соединение формулы I | 50 мг/кг | 1.04 ±0.20 | 1.54 ±0.45 | 37.66 ± 19.16 |
| 20 мг/кг | 0.93 ± 0.05 | 1.51 ±0.16 | 48.75± 16.39 | |
| 10 мг/кг | 0.93 ± 0.06 | 1.84 ±0.23 | 76.43 ± 22.74 | |
| 5 мг/кг | 0.89 ± 0.07 | 1.87 ±0.21 | 87.61 ± 19.75 | |
| Контроль (Твин-80) | - | 0.98 ±0.09 | 2.23 ±0.31 | 100.00 ± 16.92 |
| Самки крыс | ||||
| Соединение формулы I | 50 мг/кг | 0.91 ±0.05 | 1.26 ±0.23 | 34.53 ± 18.52 |
| 20 мг/кг | 0.91 ±0.09 | 1.23 ±0.20 | 32.11 ± 15.06 | |
| 10 мг/кг | 0.96 ± 0.06 | 1.60 ±0.16 | 61.36± 17.12 | |
| 5 мг/кг | 1.00 ±0.03 | 1.94 ±0.20 | 86.63 ± 17.71 | |
| Контроль (Твин-80) | - | 0.86 ±0.10 | 1.80 ±0.28 | 100.00 ± 19.39 |
По результатам статистической обработки полученных данных ЭД50 соединения формулы I на самцах составляет 23 мг/кг, на самках 14 мг/кг. Среднее значение ЭД50 без деления на пол составляет 18.5 (~19) мг/кг.
Согласно литературным данным ЭД50 напроксена составляет 15 мг/кг, ибупрофена - 48 мг/кг, диклофенака натрия - 8 мг/кг, пироксикама - 20 мг/кг, фенилбутазона - 56 мг/кг, индометацина - 10 мг/кг, ацетилсалициловой кислоты - 98 мг/кг [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. Таким образом, заявителем экспериментально доказано наличие высокой противовоспалительной активности соединения формулы I, которая по своему значению превосходит (в четырех случаях из семи) или сопоставима с противовоспалительной активностью современных НПВС.
Обезболивающее действие соединения формулы I.
При исследовании обезболивающих свойств соединения формулы I использовали самок и самцов крыс линии Wistar в возрасте 6-7 недель с массой тела 180-220 г. Количество животных в каждой группе составляло 10 голов.
Хроническое иммунное воспаление моделировали у крыс субплантарным введением в правую заднюю лапу 0.1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха). Вещество вводили внутрижелудочно с применением желудочного зонда. В качестве препарата сравнения использовали напроксен, в качестве негативного контроля использовали 0.5%-ный раствор Твин-80. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах по отношению к контролю; по результатам действия четырех доз исследуемого вещества проводили расчет ЭД50.
Воспалительную гиперальгезию (повышенную болевую чувствительность воспаленных тканей у крысы) вызывали каррагенином и оценивали по снижению порога болевой чувствительности - ПБЧ (по разности ПБЧ) на механическое раздражение (сдавливание) тканей лапы животного до введения каррагенина и через 3 ч после него. Измерение проводили на воспаленной лапе. Используемый анальгезиметр Ugo Basile S.R.L. (Италия) обеспечивает плавное увеличение нагрузки на воспаленную лапу крысы до появления болевой реакции (оцениваемой по писку животного или отдергиванию лапы). Исследуемые вещества вводили через 2 ч после введения каррагенина. Обезболивающий эффект с определением ЭД50 оценивали по снижению гиперальгезии через 1 ч после внутрижелудочного введения испытуемых веществ. Увеличение порога болевой реакции под влиянием исследуемых веществ выражался в повышении силы сдавливания конечности и характеризовал выраженность обезболивающего действия препарата. После эксперимента животные подвергались эвтаназии методом ингаляции углекислым газом.
Для приготовления дозы 50 мг/кг взвешивали навеску 1000 мг соединения формулы I в полистирольных лодочках на весах Vibra (Shinko Denshi, Япония, кат. № AF225DRCE), переносили в мерную колбу объемом 200 мл класса точности А, доводили до метки 200 мл 0.5%-ным водным раствором Твин80, и суспензию диспергировали при помощи диспергатора SilentCrusher (Heidolph, Германия, P/N 59506000-00-3) до однородной консистенции. Введение крысам осуществляли в объеме не более 1 мл/ 100 г. Концентрация полученного раствора составляла 5 мг/мл.
Для приготовления дозы 20 мг/кг брали 40 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию диспергировали при помощи диспергатора до однородной консистенции.
- 9 034652
Для приготовления дозы 10 мг/кг брали 20 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию перемешивали при помощи магнитной мешалки MR Hei-Standard (Heidolph, Г ермания) до однородной консистенции.
Для приготовления дозы 5 мг/кг брали 4 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл (50 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию перемешивали при помощи магнитной мешалки до однородной консистенции.
Результаты эксперимента представлены в табл. 6.
Таблица 6
Обезболивающий эффект соединения формулы I на крысах
| Группа | Пол | Доза, мг/кг | Объем лапы | Обезболивающий эффект, % | Обезболивающий эффект, всего/ обезболивающий эффект | |
| 0 часов | 3 часа | |||||
| Соединение формулы I | самцы | 50 | 3.4±2.3 | 10.6±6.3 | 367.9±220.1 | 10/8 |
| самки | 8.9±5.7 | 12.4±6.5 | 484.4±251.8 | 10/7 | ||
| самцы | 20 | 6.4±5.7 | 12.0±6.2 | 418.1±215.7 | 10/9 | |
| самки | 4.6±3.3 | 9.1±7.4 | 353.5±289.7 | 10/9 | ||
| самцы | 10 | 4.2±2.4 | 12.0±4.6 | 453.7±159.9 | 10/10 | |
| самки | 4.3±2.2 | 10.5±7.2 | 408.2±279.3 | 10/8 | ||
| самцы | 5 | 4.4±2.7 | 5.5±2.5 | 259.9±229.7 | 10/7 | |
| самки | 3.9±1.4 | 7.2±3.2 | 282.0±125.9 | 10/9 | ||
| Контроль | самцы | 0 | 5.7±2.0 | 2.9±0.9 | 100.0±30.0 | 10/10 |
| самки | 4.7±1.5 | 2.6±1.4 | 100.0±52.6 | 10/9 | ||
| Напроксен | самцы | 15 | 5.0±2.9 | 6.7±4.6 | 234.5±160.2 | 10/7 |
| самки | 5.0±6.2 | 5.0±3.2 | 195.3±125.3 | 10/7 |
Из представленных результатов следует, что заявленное соединение формулы I проявляет выраженный обезболивающий эффект уже в дозе 5 мг/кг, в то время как напроксен (прототип) оказывает аналогичное воздействие лишь в дозе 15 мг/кг, что является доказательным фактом его более высокой эффективности. Таким образом, терапевтический индекс (ЛД50/ЭД50) заявленного соединения в плане его обезболивающей активности составляет более 1000 против 42 у напроксена, а индекс безопасности (УД50/ЭД50) - более 400 против 3.2 у напроксена.
Жаропонижающий эффект соединения формулы I на крысах.
При исследовании жаропонижающих свойств соединения формулы I использовали самок и самцов крыс линии Wistar в возрасте 6-7 недель с массой тела 180-220 г. Количество животных в каждой группе составляло 10 голов.
Лихорадочную реакцию вызывали подкожным введением 20%-й суспензии пекарских дрожжей. Ректальную температуру измеряли электротермометром до введения дрожжей и через 18 ч после него (разница этих измерений представляет собой оцениваемую гипертермическую реакцию). Препарат вводили животным на пике гипертермии однократно (через 18 ч). Жаропонижающее действие оценивали по уменьшению гипертермии через 2 ч после введения исследуемого вещества, далее регистрацию динамики эффекта проводили через часовые промежутки в течение 7 ч.
Для приготовления дозы 75 мг/кг взвешивали навеску 1500 мг соединения формулы I в полистирольных лодочках на весах Vibra (Shinko Denshi, Япония, кат. № AF225DRCE), переносили в мерную колбу объемом 200 мл класса точности А, доводили до метки 200 мл 0.5%-ным водным раствором Твин80, и суспензию препарата размешивали при помощи диспергатора SilentCrusher M (Heidolph, Г ермания) до однородной консистенции. Введение крысам осуществляли в объеме не более 1 мл/100 г. Концентрация полученного раствора 7.5 мг/мл.
Для приготовления дозы 50 мг/кг брали 66.7 мл раствора с концентрацией 7.5 мг/мл (75 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5%-ным водным раствором Твин-80, и суспензию препарата размешивали при помощи диспергатора до однородной консистенции.
Для приготовления дозы 20 мг/кг брали 26.7 мл раствора с концентрацией 7.5 мг/мл (75 мг/кг), переносили в мерную колбу объемом 100 мл класса точности А, доводили до метки 100 мл 0.5 %-ным водным раствором Твин-80, и суспензию препарата размешивали при помощи магнитной мешалки MR HeiStandard (Heidolph, Г ермания) до однородной консистенции. За параметр снижения гипертермии принимали разницу температуры после введения препарата и температуры после 18-часовой индукции дрожжами.
Животные наблюдались индивидуально после введения на всем протяжении исследования. Масса тела регистрировалась непосредственно перед введением препарата для расчета объема введения. Для всех данных применялась описательная статистика: подсчитывали среднее значение и стандартную ошибку среднего, которые представляли в итоговой табл. 7. Для статистического сравнения экспериментальных групп между собой использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Различия определяли при 0.05 уровне значимости. Статистический анализ проводился с использованием программы R
- 10 034652 studio. Результаты исследования жаропонижающего действия различных доз соединения формулы I представлены в табл. 7.
Таблица 7
Жаропонижающая активность соединения формулы I
| Группа | Доза, мг/кг | Пол животных | Δ t через 2 часа, (M±SD) | Δ t через 3 часа, (M±SD) | Δ t через 4 часа, (M±SD) | Δ t через 5 часов, (M±SD) | At через 6 часов, (M±SD) | At через 7 часов, (M±SD) |
| Соединение формулы I | 20 | Самцы | 0.13 ± 0.31 | 0.24 ± 0.37 | 0.02 ± 0.25 | 0.1 ± 0.26 | -0.21 ± 0.22 | 0.04 ± 0.28 |
| Самки | -0.07 ± 0.17 | -0.27 ± 0.17 | -0.35 ± 0.16 | 0.34 ± 0.18 | -0.01 ± 0.22 | -0.08 ± 0.19 | ||
| 50 | Самцы | 0.22 ± 0.16 | 0.36 ± 0.17* | 0.39 ± 0.11* | 0.25 ± 0.2 | 0.11 ± 0.19 | 0.09 ± 0.18 | |
| Самки | 0.87 ± 0.09* | 0.91 ± 0.14* | 0.66 ± 0.12* | 0.53 ± 0.14* | 0.61 ± 0.22* | 0.5 ± 0.15* | ||
| 75 | Самцы | 0.76 ± 0.15* | 1.15 ± 0.18* | 1.38 ± 0.14* | 1.31 ± 0.25* | 0.96 ± 0.16* | 0.92 ± 0.19* | |
| Самки | 0.97 ± 0.19* | 0.96 ± 0.15* | 1.39 ± 0.09* | 1.52 ± 0.22* | 1.51 ± 0.17* | 1.17 ± 0.2* | ||
| Напроксен | 15 | Самцы | 1.39 ± 0.25* | 1.49 ± 0.21* | 1.6 ± 0.19* | 1.51 ± 0.25* | 1.53 ± 0.19* | 1.44 ± 0.24* |
| 15 | Самки | 1.64 ± 0.23* | 1.35 ± 0.15* | 1.58± 0.21* | 1.21 ± 0.18* | 1.09 ± 0.25* | 0.74 ± 0.14* | |
| Контроль 0.5 % Твин 80 | - | Самцы | 0.08 ± 0.18 | -0.49 ± 0.13 | -0.46 ± 0.2 | -0.68 ± 0.16 | -0.28 ± 0.2 | 0.19 ± 0.21 |
| - | Самки | -0.31 ± 0.14 | -0.36 ± 0.16 | -0.42 ± 0.18 | -0.65 ± 0.2 | -0.25 ± 0.18 | -0.47 ± 0.21 |
* - р<0.05 в сравнении с напроксеном.
Через 18 ч после подкожного введения суспензии пекарских дрожжей в группах животных наблюдалось достоверное повышение ректальной температуры в среднем на 1.5°С. В течение всего срока наблюдения (до 7 ч после введения препаратов) в контрольной группе животных снижения температуры не наблюдалось. При введении соединения формулы I и самцам, и самкам в дозе 20 мг/кг жаропонижающего действия не наблюдалось. При повышении дозы до 50 мг/кг отчетливое снижение температуры наблюдалось в группе самок - так через 2 и 3 ч после введения вещества температура была ниже чем до введения на 0.9°С, через 4, 5, 6 и 7 ч после введения уменьшение составило 0.5-0.7°С.
При введении соединения формулы I в дозе 50 мг/кг ощутимое уменьшение температуры наблюдалось через 3-4 ч после введения. Уровень снижения был равен 0.34-0.97°С
Наибольший эффект наблюдался в группах животных, которым вводили соединение формулы I в дозе 75 мг/кг. Так при введении вещества в дозе 75 мг/кг на протяжении всего эксперимента температура значительно снижалась и была меньше, чем до введения, на 0.76-1.5°С.
При введении напроксена в дозе 15 мг/кг (или 65 мкмоль/кг) температура также снижалась значительно. Уровень снижения температуры составил 0.74-1.6°С.
Обобщая полученные результаты, следует заключить, что в дозе 75 мг/кг заявленное соединение обладает жаропонижающими свойствами на уровне напроксена в дозе 15 мг/кг. Особо следует отметить, что в мольном выражении эти дозы практически не отличаются, поскольку молярная масса напроксена значительно ниже молярной массы соединения формулы I и составляет 230 г/моль против 1036 г/моль заявленного соединения. Терапевтический индекс (ЛД50/ЭД50) заявленного соединения в плане его жаропонижающей активности составляет более 67 против 42 у напроксена, а индекс безопасности (УД50/ЭД50) - более 27 против 3.2 у напроксена.
Таким образом, из вышеописанного следует, что заявителем получено новое соединение на основе пиридоксина и напроксена - 3-((8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)-4,5-бис-(((8)-2-(6метоксинафт-2-ил)пропаноилокси)метил)-2-метилпиридиний (8)-2-(6-метоксинафт-2-ил)пропаноат, которое обладает одновременно высокими противовоспалительными, обезболивающими и жаропонижающими свойствами, превосходящими или сопоставимыми с аналогичными свойствами напроксена (прототипа), сохраняя при этом крайне низкую токсичность (в том числе гастротоксичность).
В целом, заявленное соединение в 8 раз менее токсично и в 40 раз менее гастротоксично в сравнении с напроксеном (прототипом).
Заявленное техническое решение соответствует критерию новизна, предъявляемому к изобретениям, т.к. из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, совпадающие с заявленным по существенным признакам, приводящим к реализации заявленных технических результатов,
- 11 034652 которыми являются новые производные пиридоксина и напроксена, обладающие низкой токсичностью, в том числе гастротоксичностью. Заявленное химическое соединение расширяет ассортимент средств для лечения ревматических заболеваний, а также заболеваний, сопровождающихся воспалением, болью и лихорадкой, при этом является принципиально новым, не имеющим аналогов в мире по достигнутой эффективности и безопасности применения.
Заявленное техническое решение соответствует критерию изобретательский уровень, предъявляемому к изобретениям, т.к. не является очевидным для специалистов в данной области техники, а именно из исследованного уровня техники не выявлены противовоспалительные, обезболивающие и жаропонижающие препараты заявленной структуры.
Заявленное техническое решение соответствует критерию промышленная применимость, т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий. Заявителем в условиях лаборатории получен целевой продукт - нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена с заявленными техническими результатами и достигнуты все заявленные цели.
Claims (1)
- Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена формулы (I) обладающее противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активностью, а также пониженной острой токсичностью и гастротоксичностью.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016143071A RU2629367C1 (ru) | 2016-11-02 | 2016-11-02 | Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью |
| PCT/RU2017/000808 WO2018084748A1 (ru) | 2016-11-02 | 2017-10-31 | Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201900245A1 EA201900245A1 (ru) | 2019-09-30 |
| EA034652B1 true EA034652B1 (ru) | 2020-03-03 |
Family
ID=59797861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201900245A EA034652B1 (ru) | 2016-11-02 | 2017-10-31 | Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10507202B2 (ru) |
| EP (1) | EP3517525B1 (ru) |
| JP (1) | JP6757858B2 (ru) |
| CN (1) | CN109923103B (ru) |
| EA (1) | EA034652B1 (ru) |
| RU (1) | RU2629367C1 (ru) |
| WO (1) | WO2018084748A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112034074B (zh) * | 2020-09-22 | 2022-07-26 | 杭州市食品药品检验研究院(杭州市医疗器械检验研究院、杭州市药品与医疗器械不良反应监测中心) | 测定禽畜肉中的七种非选择性环氧化酶抑制药物残留的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4260613A (en) * | 1978-07-31 | 1981-04-07 | Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. | Pyridoxine derivatives |
| RU2513089C1 (ru) * | 2012-09-13 | 2014-04-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Нестероидные противовоспалительные средства на основе производных пиридоксина |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6051587A (en) * | 1998-04-16 | 2000-04-18 | Medicure, Inc. | Treatment of iatrogenic and age-related hypertension and pharmaceutical compositions useful therein |
| US20100221337A1 (en) | 2007-02-14 | 2010-09-02 | Logical Therapeutics, Inc. | Method of treating arthritis, pain or inflammation with naproxen 2(methanesulfonyl)ethyl ester and an h2 receptor antagonist |
| CN101550119B (zh) | 2009-05-11 | 2012-05-30 | 无锡宏瑞生物医药科技有限公司 | 芳基(乙)丙酸抗坏血酸酯,其制备方法及含有它们的药物 |
-
2016
- 2016-11-02 RU RU2016143071A patent/RU2629367C1/ru active
-
2017
- 2017-10-31 EA EA201900245A patent/EA034652B1/ru unknown
- 2017-10-31 EP EP17866960.2A patent/EP3517525B1/en active Active
- 2017-10-31 JP JP2019545236A patent/JP6757858B2/ja active Active
- 2017-10-31 CN CN201780067702.3A patent/CN109923103B/zh active Active
- 2017-10-31 WO PCT/RU2017/000808 patent/WO2018084748A1/ru unknown
-
2019
- 2019-04-30 US US16/399,590 patent/US10507202B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2019-12-16 US US16/715,976 patent/US10688084B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4260613A (en) * | 1978-07-31 | 1981-04-07 | Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. | Pyridoxine derivatives |
| RU2513089C1 (ru) * | 2012-09-13 | 2014-04-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Нестероидные противовоспалительные средства на основе производных пиридоксина |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109923103B (zh) | 2022-08-30 |
| CN109923103A (zh) | 2019-06-21 |
| US10507202B2 (en) | 2019-12-17 |
| WO2018084748A1 (ru) | 2018-05-11 |
| EP3517525B1 (en) | 2020-08-19 |
| JP2019537627A (ja) | 2019-12-26 |
| JP6757858B2 (ja) | 2020-09-23 |
| EP3517525A1 (en) | 2019-07-31 |
| US20190255030A1 (en) | 2019-08-22 |
| EP3517525A4 (en) | 2019-11-06 |
| US20200147067A1 (en) | 2020-05-14 |
| RU2629367C1 (ru) | 2017-08-29 |
| US10688084B2 (en) | 2020-06-23 |
| EA201900245A1 (ru) | 2019-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tozkoparan et al. | Preparation of 5-aryl-3-alkylthio-l, 2, 4-triazoles and corresponding sulfones with antiinflammatory–analgesic activity | |
| Li et al. | Anti-inflammatory and gastrointestinal effects of a novel diclofenac derivative | |
| Huang et al. | Ethanesulfohydroxamic acid ester prodrugs of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs): synthesis, nitric oxide and nitroxyl release, cyclooxygenase inhibition, anti-inflammatory, and ulcerogenicity index studies | |
| Lai et al. | Synthesis and biological evaluation of 3-[4-(amino/methylsulfonyl) phenyl] methylene-indolin-2-one derivatives as novel COX-1/2 and 5-LOX inhibitors | |
| TWI286474B (en) | Novel esters that are derived from indolealkanols and novel amides that are derived from indolealkylamines and the esters and the amides are selective COX-2 inhibitors | |
| Labib et al. | Design, synthesis of novel isoindoline hybrids as COX-2 inhibitors: Anti-inflammatory, analgesic activities and docking study | |
| Özadalı et al. | Synthesis and biological evaluation of isoxazolo [4, 5-d] pyridazin-4-(5H)-one analogues as potent anti-inflammatory agents | |
| JP2007509842A (ja) | 心血管障害の処置のためにＡｐｏＡ１の発現を誘導するための、一酸化窒素部分を含む化合物 | |
| Abdellatif et al. | Synthesis, cyclooxygenase inhibition, anti-inflammatory evaluation and ulcerogenic liability of novel triarylpyrazoline derivatives as selective COX-2 inhibitors | |
| Abdellatif et al. | 1-(4-Methane (amino) sulfonylphenyl)-3-(4-substituted-phenyl)-5-(4-trifluoromethylphenyl)-1H-2-pyrazolines/pyrazoles as potential anti-inflammatory agents | |
| Bala et al. | Design, characterization, computational studies, and pharmacological evaluation of substituted-N′-[(1E) substituted-phenylmethylidene] benzohydrazide analogs | |
| Hu et al. | Discovery of 2-phenyl-3-sulfonylphenyl-indole derivatives as a new class of selective COX-2 inhibitors | |
| Zhang et al. | Discovery of chalcone analogues as novel NLRP3 inflammasome inhibitors with potent anti-inflammation activities | |
| El-Nagar et al. | Novel N-substituted 5-aminosalicylamides as dual inhibitors of cyclooxygenase and 5-lipoxygenase enzymes: Synthesis, biological evaluation and docking study | |
| Abdellatif et al. | Design, synthesis, cyclooxygenase inhibition and biological evaluation of new 1, 3, 5-triaryl-4, 5-dihydro-1H-pyrazole derivatives possessing amino/methanesulfonyl pharmacophore | |
| Abdellatif et al. | Design, synthesis of celecoxib-tolmetin drug hybrids as selective and potent COX-2 inhibitors | |
| González-Trujano et al. | Synthesis and antinociceptive evaluation of bioisosteres and hybrids of naproxen, ibuprofen and paracetamol | |
| CA2827887A1 (en) | No- and h2s-releasing compounds | |
| RU2629367C1 (ru) | Нестероидное противовоспалительное средство на основе напроксена, обладающее низкой гастротоксичностью | |
| Ushiyama et al. | Preclinical pharmacology profile of CS-706, a novel cyclooxygenase-2 selective inhibitor, with potent antinociceptive and anti-inflammatory effects | |
| WO2012112670A1 (en) | Novel lipogenic inhibitors and uses thereof | |
| Abdellatif et al. | A diazen-1-ium-1, 2-diolated nitric oxide donor ester prodrug of 3-(4-hydroxymethylphenyl)-4-(4-methanesulfonylphenyl)-5H-furan-2-one: Synthesis, biological evaluation and nitric oxide release studies | |
| AU772705B2 (en) | Converting cox inhibition compounds that are not cox-2 selective inhibitors to derivatives that are cox-2 selective inhibitors | |
| Koca et al. | Synthesis of new ester derivatives of salicylic acid and evaluation of their COX inhibitory potential | |
| Aslanian et al. | Pulmonary-Allergy, Dermatological, Gastrointestinal and Arthritis: Cyclooxygenase-2: a novel target for therapeutic intervention |