EA029014B1 - Композиции и способы, предусматривающие последовательности, определяющие мужскую фертильность - Google Patents

Abstract

Представлены композиции и способы для модулирования мужской фертильности у растения. Композиции содержат нуклеотидные последовательности и их активные фрагменты и варианты, которые модулируют мужскую фертильность. Дополнительно представлены кассеты экспрессии, содержащие полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, или их активные фрагменты или варианты, функционально связанные с промотором, где экспрессия полинуклеотидов модулирует мужскую фертильность растения. Представлены различные способы, в которых осуществляют модулирование уровня и/или активности последовательностей, влияющих на мужскую фертильность, в растении или части растения.

Description

изобретение относится к области молекулярной биологии растений, более конкретно к воздействию на мужскую фертильность.

Ссылка на перечень последовательностей, отправляемый в электронном виде

Официальная копия перечня последовательностей отправляется в электронном виде через ΕΡδ-^еЬ как отформатированный под А8С11 перечень последовательностей в файле с названием 5282РСТ_8Т25.1х1, последнее изменение которого датировано 6 сентября 2013 г., и подается одновременно с описанием. Перечень последовательностей, содержащийся в данном отформатированном под А8С11 документе, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки изобретения

Развитие селекции гибридных растений сделало возможным значительный прогресс в качестве и количестве получаемых культур. Увеличение урожайности и сочетание желательных характеристик, таких как устойчивость к заболеваниям и насекомым, переносимость высоких температур и засухи, наряду с изменениями в составе растений, возможны благодаря методам гибридизации. Эти методы часто главным образом основаны на обеспечении отцовской особи, которая передает пыльцу материнской особи с получением в результате гибрида.

Полевые культуры скрещивают с помощью методик, в которых используется преимущество способа опыления растений. Растение является самоопыляемым, если пыльца с одного цветка переносится на тот же или другой цветок того же растения или генетически идентичного растения. Растение является перекрестно опыляемым, если пыльца поступает из цветка генетически отличного растения.

У некоторых видов, таких как Вга55юа сатре51п5. растение, как правило, является самостерильным и может опыляться только перекрестно. У самоопыляемых видов, таких как соя и хлопчатник, мужские и женские растения расположены рядом анатомически. Во время естественного опыления мужские репродуктивные органы данного цветка опыляют женские репродуктивные органы того же цветка.

Пшеница обыкновенная (ТгШсит ае5ЙУит) является гексаплоидным растением, у которого имеются три пары гомологичных хромосом, определяющих геномы А, В и Ό. Эндосперм зерна пшеницы содержит два гаплоидных хромосомных набора из материнской клетки и один - из отцовской клетки. Зародыш зерна пшеницы содержит по одному гаплоидному хромосомному набору из каждой из материнской и отцовской клеток. Гексаплоидия считалась большим препятствием для исследования и разработки полезных разновидностей пшеницы. Фактически, очень мало известно о том, как гомологичные гены пшеницы взаимодействуют, как регулируется их экспрессия и как действуют различные белки, вырабатываемые гомологичными генами, по отдельности или совместно.

Важным аспектом большой части работы, которая ведется в отношении генетических систем мужской стерильности, является идентификация генов, влияющих на мужскую фертильность. Такой ген можно применять в различных системах для контроля мужской фертильности, в том числе в тех, которые описаны в данном документе.

Краткое описание изобретения

Представлены композиции и способы для модулирования мужской фертильности у растения. Композиции содержат нуклеотидные последовательности и их активные фрагменты и варианты, которые модулируют мужскую фертильность. Дополнительно представлены кассеты экспрессии, содержащие один или несколько полинуклеотидов, определяющих мужскую фертильность, или их активных фрагментов или вариантов, функционально связанных с промотором, где экспрессия полинуклеотидов модулирует мужскую фертильность растения. Представлены различные способы, в которых осуществляют модулирование уровня и/или активности полинуклеотида, влияющего на мужскую фертильность, в растении или части растения.

Описание фигур

На фиг. 1 показано выравнивание генов пшеницы М826, геномов А (8ΕΟ ГО N0: 28), В (8Ε0 ГО N0: 29) и Ό (8Ε0 ГО N0: 30), во всем целевом сайте М826+ (8Ε0 ГО N0: 21) в сравнении с ортологическими генами М826 маиса (8Ε0 ГО N0: 31), сорго (8Ε0 ГО N0: 32) и риса (8Ε0 ГО N0: 33).

На фиг. 2 показано выравнивание вариантов с NΗΕ^-мутациями, индуцированными хомингэндонуклеазой М826+, описанной в данном документе.

Мутации были идентифицированы с помощью глубокого секвенирования. В эталонной последовательности показан немодифицированный локус с подчеркнутым геномным целевым сайтом. Предполагаемый сайт расщепления также обозначен. Делеции в результате дефектного ΜΠΕΙ показаны как Эталонная последовательность соответствует М826 пшеницы Не1бег (8Ε0 ГО N0: 34).

На фиг. 3 показаны типы NΗΕ^-мутаций, индуцированных хоминг-эндонуклеазой М826+, описанной в данном документе. Мутации были идентифицированы с помощью секвенирования субклонированных продуктов ПЦР в ДНК-векторах. Обозначение аллелей М826 1, 2 и 3, очевидно, относится к копиям генома пшеницы Ό, А и В соответственно.

На фиг. 4 показано выравнивание вариантов с NΗΕ^-мутациями, индуцированными

хоминг-эндонуклеазой М826+. Верхняя последовательность представляет собой целевой сайт М826

- 1 029014

(8Εφ ΙΌ N0: 21), сравниваемый с эталонной последовательностью (8Еф ГО N0: 45), в которой показан немодифицированный локус. Делеции в результате дефектного ΝΗΕ1 показаны как при этом гэп представляет собой вставку нуклеотида С в 8Е0 ГО N0: 50. Мутации были идентифицированы с помощью секвенирования субклонированных продуктов ПЦР в ДНК-векторах.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение теперь будет более подробно описано в данном документе со ссылкой на прилагаемые графические материалы, в которых показаны некоторые, но не все варианты осуществления настоящего изобретения. В действительности, настоящее изобретение можно осуществлять во многих различных формах, и его не следует рассматривать как ограниченное вариантами осуществления, изложенными в данном документе; скорее данные варианты осуществления представлены с тем, чтобы данное раскрытие удовлетворяло требованиям действующего законодательства. Одинаковые числа относятся к одинаковым элементам по всему документу.

Специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, придет на ум множество модификаций и других вариантов осуществления настоящего изобретения, изложенных в данном документе, при использовании идей, представленных в вышеприведенном описании и сопутствующих графических материалах. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не должно ограничиваться конкретными раскрытыми вариантами осуществления, и подразумевается, что в объем приложенной формулы изобретения включены модификации и другие варианты осуществления. Хотя в данном документе используются специальные выражения, они применяются только в общем и описательном смысле, а не в целях ограничения.

Ι. Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильностъ.

Композиции, раскрытые в данном документе, содержат полинуклеотиды и полипептиды, которые влияют на мужскую фертильность. В частности, представлены выделенные полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, приведенные в 8Е0 ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18, или их активные фрагменты или варианты. Дополнительно представлены полипептиды с аминокислотной последовательностью, кодируемой полинуклеотидом, описанным в данном документе, например полинуклеотидами, приведенными в 8Е0 ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, или их активные фрагменты или варианты.

У растений, размножающихся половым путем, развиваются специализированные ткани, специализирующиеся на образовании мужских и женских гамет. Успешное образование мужских гамет зависит от правильного формирования мужских репродуктивных тканей. Тычинка, которая представляет собой мужской репродуктивный орган растений, содержит клетки множества типов, в том числе, например, тычиночную нить, пыльник, тапетум и пыльцу. Как используется в данном документе, "мужская ткань" относится к специализированной ткани у растения, размножающегося половым путем, которая отвечает за образование мужских гамет. Мужские ткани включают, без ограничения, тычинку, тычиночную нить, пыльник, тапетум и пыльцу.

Процесс формирования зрелого пыльцевого зерна начинается с микроспорогенеза, при котором в спорогенной ткани пыльника формируются мейоциты. Далее следует микрогаметогенез, при котором микроспоры делятся митотически и развиваются в микрогаметофит, или пыльцевые зерна. Состояние "мужская фертильность" или "с мужской фертильностью" относится к растениям, образующим зрелое пыльцевое зерно, способное к оплодотворению женской гаметы с получением следующего поколения потомства. Выражение "влияет на мужскую фертильность" или "модулирует мужскую фертильность", используемое в данном документе, относится к любому повышению или снижению способности растения к образованию зрелого пыльцевого зерна по сравнению с соответствующим контролем. "Зрелое пыльцевое зерно" или "зрелая пыльца" относится к любому пыльцевому зерну, способному к оплодотворению женской гаметы с получением следующего поколения потомства. Аналогично, выражение "полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность" или "полипептид, определяющий мужскую фертильность" относится к полинуклеотиду или полипептиду, которые модулируют мужскую фертильность. Полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, может, например, кодировать полипептид, участвующий в процессе микроспорогенеза или микрогаметогенеза.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, включают в себя гомологи и ортологи полинуклеотидов, которые, как было показано, влияют на мужскую фертильность. Например, полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, и их активные фрагменты и варианты, раскрытые в данном документе, включают в себя гомологи и ортологи М822 (также называемые Мзеа1). Исследования мутагенеза М822 обеспечили в результате растения маиса с фенотипической мужской стерильностью с пыльниками, которые не выступают из метелки и в которых отсутствует спорогенная ткань. ХУсД апб А1Ъсп8сп (1985), М;й/с №\у51с11сг. 59:87; №и£Гст с! а1. (1977), Ми1ап15 оГ т;й/с. Со1б 8рттд НагЪог ЬаЪога1огу Ртсзз, Со1б 8рттд НагЪог,

У растений с дефицитом экспрессии М822 физиологические изменения проявляются на ранней стадии развития репродуктивной ткани. М822, как полагают, играет роль в развитии пыльника, которая проявляется раньше, чем таковая М845 или М826. Определенные гены мужской стерильности, такие как МАС1, ЕМ81 или ΟNΕ2 (8огсп5сп с! а1. (2002), Р1аи! 1. 29:581-594), препятствуют росту клеток на стадии

- 2 029014

тетрады. Мутации в гене δΡΟΚΌΟΥΤΕΕΕδδ/ΝΟΖΖΕΕ проявляются на ранней стадии развития, но оказывают влияние на формирование как пыльника, так и семязачатка таким образом, что растения характеризуются мужской и женской стерильностью. Ген δΡΟΚΌΟΥΤΕΕΕδδ ЛгаЫбор818 необходим для инициации спорогенеза и кодирует новый ядерный белок (Сепек Όβν. 1999 Аид 15;13(16):2108-17). Поскольку М822 является крайне важным для хода микроспорогенеза, сохранение мужской стерильности у мутантов по М822 является весьма надежным по сравнению с другими сконструированными мутантами с мужской стерильностью. Раскрытые в других частях данного документа полинуклеотиды М822 из пшеницы приведены под 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1, 3 и 5.

Дополнительные полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, включают полинуклеотид М826 и его гомологи и ортологи. Полипептиды М826, как сообщалось, характеризуются значительной гомологией по отношению к ферментам Р450, обнаруженным у дрожжей, растений и млекопитающих. Ферменты Р450 были широко изучены, и были выявлены характерные белковые домены. Белок М826 содержит несколько структурных мотивов, характерных для Р450 эукариот, в том числе гемсвязывающий домен РххСхКхСхС (домен Ό; 8Εφ ΙΌ ΝΟ: 19), домен А А/ССХИ/ΕΤΤ/δ (дикислородсвязывающий; 8Εφ ГО ΝΟ: 20), домен В (стероид-связывающий) и домен С.

Анализ филогенетического древа выявил, что М826 является наиболее близкородственным по отношению к Р450, участвующим в омега-гидроксилировании жирных кислот, обнаруженном у АгаЫДор818 ФаПапа и У1С1а каГОа. См., например, публикацию патента США № 2012/0005792, включенную в данный документ посредством ссылки. Раскрытые в других частях данного документа полинуклеотиды М826 из пшеницы приведены в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 7, 9 и 11.

Дополнительные полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, и их активные фрагменты и варианты, раскрытые в данном документе, могут также включать в себя гомологи и ортологи полинуклеотидов М845. Полинуклеотид М845 представляет собой полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, характерный для маиса. Мутации М845 могут привести в результате к нарушению микроспорогенеза во время вакуолизации микроспор, что приводит к мужской стерильности мутантных растений. Если клонированный полинуклеотид М845 маиса вводят в такие мутантные растения с мужской стерильностью, ген может дополнять мутацию и обеспечивать мужскую фертильность. Раскрытые в других частях данного документа полинуклеотиды М845 из пшеницы приведены в 8Εφ ГО ΝΟ: 13, 15 и 17.

Стратегии операций с экспрессией полинуклеотидов, определяющих мужскую фертильность, у пшеницы будут требовать учета уровня плоидии отдельного сорта пшеницы. Птйсит аекШит является гексаплоидом, содержащим три генома, обозначенных А, В и Ό (Ν=21); при этом каждый геном содержит семь пар негомологичных хромосом. Сорта пшеницы однозернянки являются диплоидными (Ν=7), а сорта пшеницы двузернянки являются тетраплоидными (Ν=14).

В данном документе раскрыты выделенные или практически очищенные молекулы нуклеиновых кислот или белковые композиции. "Выделенные" или "очищенные" молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или белок или их биологически активная часть практически или фактически свободны от компонентов, которые обычно сопутствуют полинуклеотиду или белку или взаимодействуют с ними, как обнаруживается в их природной среде. Таким образом, выделенный или очищенный полинуклеотид или белок практически свободны от другого клеточного материала или культуральной среды при получении с помощью методик рекомбинантных ДНК или практически свободны от химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. В оптимальном случае "выделенный" полинуклеотид свободен от последовательностей (в оптимальном случае последовательностей, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют полинуклеотид (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и З'-концах полинуклеотида) в геномной ДНК организма, из которого получен полинуклеотид. Например, в различных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность размером менее чем приблизительно 5 т.п.о., 4 т.п.о., 3 т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. или 0,1 т.п.о., которая в естественных условиях фланкирует полинуклеотид в геномной ДНК клетки, из которой получен полинуклеотид. Белок, который практически свободен от клеточного материала, включает в себя препараты белка, содержащие менее чем приблизительно 30, 20, 10, 5 или 1% (по сухому весу) загрязняющего белка. Если полипептиды, раскрытые в данном документе, или их биологически активная часть получены рекомбинантным путем, то в оптимальном случае в культуральной среде представлено менее чем приблизительно 30, 20, 10, 5 или 1% (по сухому весу) химических предшественников или химических веществ, не являющихся белком, представляющим интерес.

"Исследуемое растение" или "исследуемая растительная клетка" представляют собой растение или растительную клетку, в которых генетическое изменение, такое как трансформация, затронуло ген, представляющий интерес, или представляют собой растение или растительную клетку, которые происходят от растения или клетки, измененных таким образом, и которые содержат изменение. "Контроль", или "контрольное растение", или "контрольная растительная клетка" обеспечивают точку отсчета для измерения изменений в фенотипе исследуемых растения или растительной клетки.

Контрольное растение или растительная клетка могут включать, например, (а) растение или растительную клетку дикого типа, т.е. с тем же генотипом, что и у исходного материала для генетического изменения, которое дало в результате исследуемые растение или клетку; (Ь) растение или растительную

- 3 029014

клетку с тем же генотипом, что и у исходного материала, но которые были трансформированы нольконструкцией (т.е. конструкцией, которая не оказывает известный эффект на признак, представляющий интерес, такой как конструкция, содержащая маркерный ген); (с) растение или растительную клетку, которые являются нетрансформированными сегрегантами среди потомства исследуемых растения или растительной клетки; (6) растение или растительную клетку, генетически идентичные исследуемым растению или растительной клетке, но которые не были подвергнуты условиям или стимулам, которые индуцировали бы экспрессию гена, представляющего интерес, или (е) собственно исследуемые растение или растительную клетку в условиях, при которых ген, представляющий интерес, не экспрессируется.

А. Фрагменты и варианты последовательностей, определяющих мужскую фертильность.

Также представлены фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и белков, кодируемых ими. Под "фрагментом" подразумевается часть полинуклеотида или часть аминокислотной последовательности и, следовательно, белка, кодируемая ею. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность нативного белка и, следовательно, влияют на мужскую фертильность. В альтернативном случае, фрагменты полинуклеотида, которые можно применять в качестве гибридизационных зондов, как правило, не кодируют фрагменты белка, сохраняющие биологическую активность. Таким образом, фрагменты нуклеотидной последовательности могут иметь размер в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, приблизительно 50 нуклеотидов, приблизительно 100 нуклеотидов и вплоть до полной длины полинуклеотида, кодирующего полипептиды, раскрытые в данном документе.

Фрагмент полинуклеотида, который кодирует биологически активную часть полипептида, который влияет на мужскую фертильность, будет кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525 или 537 смежных аминокислот или вплоть до полного числа аминокислот, присутствующих в полипептиде полной длины, который влияет на мужскую фертильность (например, 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18 соответственно). Фрагменты полинуклеотида, кодирующего полипептид, который влияет на мужскую фертильность, которые можно применять в качестве гибридизационных зондов или ПЦР-праймеров, как правило, необязательно должны кодировать биологически активную часть полипептида, который влияет на мужскую фертильность.

Таким образом, фрагмент полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, раскрытого в данном документе, может кодировать биологически активную часть полипептида, определяющего мужскую фертильность, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера с помощью способов, раскрытых ниже. Биологически активная часть полипептида, определяющего мужскую фертильность, может быть получена путем выделения части одного из полинуклеотидов, определяющих мужскую фертильность, раскрытых в данном документе, экспрессирующих кодируемую часть белка, определяющего мужскую фертильность (например, с помощью рекомбинантной экспрессии ίη νίίτο), и оценки активности кодируемой части полипептида, определяющего мужскую фертильность. Полинуклеотиды, которые являются фрагментами полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, содержат по меньшей мере 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 или 1629 нуклеотидов или вплоть до такого числа нуклеотидов, которое представлено в полинуклеотиде полной длины, определяющем мужскую фертильность, раскрытом в данном документе (т.е. 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17 соответственно).

Подразумевается, что "варианты" означают практически аналогичные последовательности. Для полинуклеотидов вариант включает в себя делецию и/или добавление одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких внутренних сайтах в нативном полинуклеотиде и/или замену одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких сайтах нативного полинуклеотида. Как используется в данном документе, "нативный" или "дикого типа" полинуклеотид или полипептид содержит встречающуюся в природе нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно. Для полинуклеотидов консервативные варианты включают в себя те последовательности, которые из-за вырожденности генетического кода кодируют аминокислотную последовательность одного из полипептидов, определяющих мужскую фертильность, раскрытых в данном документе. Встречающиеся в природе аллельные варианты, такие как эти, можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, как, например, с помощью методик полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации, изложенных ниже. Варианты полинуклеотидов также включают в себя полинуклеотиды, полученные синтетически, такие как полученные, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, но которые по-прежнему кодируют полипептид, определяющий мужскую фертильность. В целом, варианты конкретных полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, будут характеризоваться по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности по отношению к этому конкретному полинуклеотиду (например, любому из 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17) при определении с помощью программ и параметров выравнивания последовательностей, описанных в других частях данного документа.

Варианты конкретного полинуклеотида, раскрытого в данном документе (т. е. эталонного полинуклеотида), также можно оценить путем сравнения процента идентичности последовательностей полипеп- 4 029014

тида, кодируемого вариантом полинуклеотида, и полипептида, кодируемого эталонным полинуклеотидом. Таким образом, например, раскрыт выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид с данным процентом идентичности последовательности по отношению к полипептиду с 8Еф ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Процент идентичности последовательностей любых двух полипептидов можно вычислить с помощью программ и параметров выравнивания последовательностей, описанных в других частях данного документа. При оценке любой заданной пары полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, путем сравнения процента идентичности последовательностей двух полипептидов, которые они кодируют, процент идентичности последовательностей двух кодируемых полипептидов составляет по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичности последовательности.

"Вариант" белка, как подразумевается, означает белок, полученный из нативного белка с помощью делеции или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких внутренних сайтах нативного белка и/или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах нативного белка. Варианты белков, раскрытых в данном документе, являются биологически активными, т.е. они по-прежнему обладают желаемой биологической активностью нативного белка, т.е. активностью, определяющей мужскую фертильность, описанной в данном документе. Такие варианты могут быть результатом, например, генетического полиморфизма или операции, осуществляемой человеком. Биологически активные варианты белка, определяющего мужскую фертильность, раскрытого в данном документе, будут характеризоваться по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности по отношению к аминокислотной последовательности нативного белка (например, любой из 8Еф ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18) при определении с помощью программ и параметров выравнивания последовательностей, описанных в других частях данного документа. Биологически активный вариант белка, раскрытого в данном документе, может отличаться от этого белка только лишь 1-15 аминокислотными остатками, только лишь 1-10, как, например, 6-10, только лишь 5, только лишь 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.

Белки, раскрытые в данном документе, могут быть изменены различными способами, включающими аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Способы осуществления таких операций, как правило, известны в данной области техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей и фрагменты полипептидов, определяющих мужскую фертильность, можно получить с помощью мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменений полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники. См., например, Кипке1 (1985), Ргос. №И. Асаб. 8εί. И8Л 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987), Мебюбк ίη Еп/уто1. 154:367-382; патент США № 4873192; \Уа1кег апб Оаакйа, ебк. (1983), Тескпищек ίη Мо1еси1аг Вю1о§у (МасМШап РиЪйкЫпд Сотрапу, Νονν Уотк) и ссылки, цитируемые в них. Руководство по соответствующим аминокислотным заменам, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели ОаукоГГ е! а1. (1978), Абак оГ Рто!ет 8едиепсе апб 81гис1иге (№п1. Вютеб. Кек. Роипб., ХУакЫпдЮп. Э.С.). включенной в данный документ посредством ссылки. Оптимальными могут быть консервативные замены, такие как замещение одной аминокислоты другой, имеющей аналогичные свойства.

Таким образом, гены и полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, включают в себя как встречающиеся в природе последовательности, так и варианты последовательностей ДНК, которые сохраняют функцию. Аналогично, полипептиды и белки, определяющие мужскую фертильность, охватывают как встречающиеся в природе полипептиды, так и их варианты и модифицированные формы. Такие варианты полинуклеотидов и полипептидов будут по-прежнему обладать желаемой активностью, определяющей мужскую фертильность. Мутации, которые будут осуществлены в ДНК, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и в оптимальном случае не будут создавать комплементарные участки, которые могут образовывать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент № 75444.

Ожидается, что делеции, вставки и замены белковых последовательностей, охватываемые данным документом, не произведут радикальных изменений в характеристиках белка. Однако, если трудно предсказать точный эффект замены, делеции и вставки перед ее осуществлением, специалист в данной области техники поймет, что данный эффект будет оценен посредством обычных скрининговых анализов. То есть активность можно оценивать посредством анализа активности, определяющей мужскую фертильность.

Повышение или снижение мужской фертильности можно анализировать различными способами. Специалист в данной области техники может без труда оценить активность варианта или фрагмента путем введения полинуклеотида в растение, гомозиготное по аллелям стабильной мужской стерильности в полинуклеотиде, и наблюдения за развитием мужской ткани у растения. Например, анализ активности, определяющей мужскую фертильность, М822 (т.е. 8Еф ГО N0: 1, 3 или 5) специалист в данной области техники может начать с конструирования растения, гомозиготного по мутации в нативном гене М822, приводящей в результате к мужской стерильности. Далее он может дополнить мутацию, обеспечивая полинуклеотид М822 или его активный фрагмент или вариант, и наблюдать, развиваются ли мужские

- 5 029014

ткани растения нормально и способны ли они образовывать зрелую пыльцу. Аналогично, такую же процедуру можно выполнить для анализа активности, определяющей мужскую фертильность, у вариантов или фрагментов М826 (т.е. 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11) или М845 (т.е. 8Е0 ГО N0: 13, 15 или 17), также раскрытых в данном документе.

Варианты функциональных полинуклеотидов и белков также охватывают последовательности и белки, полученные с помощью мутагенной или рекомбиногенной процедуры, такой как ДНК-шаффлинг. При помощи такой процедуры можно производить операции с одной или несколькими различными последовательностями, определяющими мужскую фертильность, для создания нового полипептида, определяющего мужскую фертильность, обладающего желаемыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из популяции родственных по последовательностям полинуклеотидов, содержащих участки последовательностей, которые обладают значительной идентичностью последовательностей и могут подвергаться гомологичной рекомбинации ίη νίίτο или ίη νίνο. Например, с помощью данного подхода мотивы последовательностей, кодирующие домен, представляющий интерес, можно подвергнуть шаффлингу между полинуклеотидами, определяющими мужскую фертильность, раскрытыми в данном документе, и другими известными полинуклеотидами, определяющими мужскую фертильность, с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес, таким как повышенная К_т в случае фермента. Стратегии такого ДНК-шаффлинга известны в данной области техники. См., например, 81еттег (1994), Ргос. №11. Асаб. 8οί. И8Л, 91:1074710751; 8!еттег (1994), №Цигс. 370:389-391; Статей е! а1. (1997), №1иге Вю!есй. 15:436-438; Мооге е! а1. (1997), 1. Мо1. Бю1. 272:336-347; /Папу е! а1. (1997) ,Ргос. №!1. Лсай. 8с1. И8Л, 94:4504-4509; Статей е! а1. (1998), №!иге, 391:288-291 и патенты США № 5605793 и 5837458.

II. Анализ последовательностей.

Как используется в данном документе, "идентичность последовательностей" или "идентичность" применительно к двум последовательностям полинуклеотидов или полипептидов относится к остаткам двух последовательностей, которые являются одинаковыми при выравнивании с нахождением максимального соответствия в указанном окне сравнения. Если процент идентичности последовательностей применяют в отношении белков, учитывают, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются по консервативным аминокислотным заменам, где аминокислотные остатки заменены на другие аминокислотные остатки с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность) и, таким образом, не изменяют функциональные свойства молекулы. Если последовательности отличаются по консервативным заменам, то процент идентичности последовательностей можно повысить с тем, чтобы внести поправку на консервативную природу замены. Говорят, что последовательности, которые отличаются по таким консервативными заменам, обладают "подобием последовательностей" или "подобием". Средства для осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. Как правило, это предусматривает оценку в баллах консервативной замены в качестве скорее частичного, чем полного несовпадения, что, таким образом, увеличивает процент идентичности последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается балл 1, а неконсервативной замене присваивается балл 0, то консервативной замене присваивается балл от 0 до 1. Оценку в баллах консервативных замен рассчитывают, например, как реализовано в программе РС/ΟΕΝΕ (1п!еШ§епейс8, Маунтин-Вью, Калифорния).

Как используется в данном документе, "процент идентичности последовательностей" означает значение, определяемое путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, где часть последовательности полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

Если не указано иное, значения идентичности/подобия последовательностей, приведенные в данном документе, относятся к значению, полученному с помощью ОЛР версии 10 с применением следующих параметров: % идентичности и % подобия для нуклеотидной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 50 и штрафа за продолжение гэпа 3 и матрицы замен пгедарйпа.стр; % идентичности и % подобия для аминокислотной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 8 и штрафа за продолжение гэпа 2, и матрицы замен ВЬ08ИМ62; или любой эквивалентной ей программы. Под "эквивалентной программой" подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, в которой для любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляют построение выравнивания с идентичными совпадениями нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичным процентом идентичности последовательностей по сравнению с соответствующим выравниванием, построение которого осуществляют с помощью ОЛР версии 10.

Применение выражения "полинуклеотид" не подразумевает ограничения настоящего раскрытия до полинуклеотидов, включающих в себя ДНК. Специалистам в данной области будет понятно, что поли- 6 029014

нуклеотиды могут содержать рибонуклеотиды и комбинации рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды включают в себя как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Раскрытые в данном документе полинуклеотиды также охватывают все формы последовательностей, в том числе, без ограничения, однонитевые формы, двухнитевые формы, шпильки, структуры "стебель-петля" и им подобные.

III. Кассеты экспрессии.

Можно обеспечить полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, в кассетах экспрессии для экспрессии в организме, представляющем интерес. Кассета может содержать 5'- и З'-регуляторные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, раскрытым в данном документе. Подразумевается, что термин "функционально связанный" означает функциональную связь между двумя или более элементами. Например, функциональная связь между полинуклеотидом, представляющим интерес, и регуляторной последовательностью (например, промотором) представляет собой функциональную связь, которая обеспечивает возможность экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес. Функционально связанные элементы могут быть смежными или несмежными. При использовании для обозначения соединения двух участков, кодирующих белок, под функционально связанным подразумевается, что кодирующие участки находятся в одной и той же рамке считывания.

Кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, в 5'-3' направлении по ходу транскрипции могут содержать участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), полинуклеотид, представляющий интерес, и участок терминации транскрипции и трансляции (т.е. участок терминации), функционирующие в клетке-хозяине (т.е. в растении). В кассетах экспрессии также обеспечивают множество сайтов рестрикции и/или сайтов рекомбинации для того, чтобы транскрипция вставки полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, регулировалась описанными в других частях данного документа регуляторными участками. Регуляторные участки (т.е. промоторы, участки регуляции транскрипции и участки терминации трансляции) и/или полинуклеотид, представляющий интерес, могут быть нативными/аналогичными по отношению к клетке-хозяину или друг к другу. Альтернативно, регуляторные участки и/или полинуклеотид, представляющий интерес, могут быть гетерологичными по отношению к клетке-хозяину или друг к другу. Как используется в данном документе, "гетерологичный" в отношении последовательности полинуклеотида или полипептида означает последовательность, которая происходит из чужеродного вида, или, если она происходит из того же вида, в значительной мере модифицирована по составу и/или местоположению в геноме по сравнению с ее нативной формой в результате преднамеренного вмешательства человека. Например, промотор, функционально связанный с гетерологичным полинуклеотидом, происходит из вида, отличного от вида, из которого происходит полинуклеотид, или, если он происходит из того же/аналогичного вида, то один или оба из них являются в значительной степени модифицированными по сравнению с их исходной формой и/или местоположением в геноме, или промотор не является нативным промотором по отношению к функционально связанному полинуклеотиду. Как используется в данном документе, химерный полинуклеотид содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным по отношению к кодирующей последовательности.

В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть пакетированы с любой комбинацией последовательностей полинуклеотидов, представляющих интерес, или кассетами экспрессии, раскрытыми в других частях данного документа. Например, полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, могут быть пакетированы с любыми другими полинуклеотидами, кодирующими полинуклеотиды или полипептиды, оказывающие повреждающее действие на мужские гаметы, цитотоксинами, маркерами или другими последовательностями, определяющими мужскую фертильность, раскрытыми в других частях данного документа. Пакетированные полинуклеотиды могут быть функционально связанными с тем же промотором, что и полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, или могут быть функционально связанными с отдельным полинуклеотидным промотором.

Как описано в других частях данного документа, кассеты экспрессии могут содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, представляющим интерес, а также соответствующий участок терминации. Участок терминации может быть нативным по отношению к участку инициации транскрипции, может быть нативным по отношению к функционально связанному полинуклеотиду, представляющему интерес, определяющему мужскую фертильность, или вместе с промоторными последовательностями, определяющими мужскую фертильность, может быть нативным по отношению к растению-хозяину или может быть получен из другого источника (т.е. чужеродного или гетерологичного). Подходящие участки терминации доступны из Τί-плазмиды А.ЩтсГасзсщ. такие как участки терминации генов октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Оиегтеаи е! а1. (1991), Мо1. Оеи. Сепе!. 262:141-144; РгоибГоо! (1991), Се11. 64:671-674; 8аиГасоп е! а1. (1991), Сепек Эеу. 5:141-149; Модеп е! а1. (1990), Р1ап! Се11. 2:1261-1272; Мипгое е! а1. (1990), Оепе, 91:151-158; Ва11ак е! а1. (1989), Ыискю Αάάδ Кек. 17:78917903 и 1окЫ е! а1. (1987), Ыискю Аабк Кек. 15:9627-9639.

- 7 029014

При необходимости полинуклеотиды, представляющие интерес, можно оптимизировать для повышения экспрессии в трансформированном растении. То есть полинуклеотиды можно синтезировать с помощью кодонов, предпочтительных для растения, для улучшения экспрессии. См., например, СатрЬе11 апД Со\уп (1990), Р1ап1 РЬу8ю1. 92:1-11 в отношении рассмотрения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. В данной области техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Миггау е! а1. (1989), Ыис1е1с АаДк Кек. 17:477-498, включенные в данный документ посредством ссылки.

Известны дополнительные модификации последовательностей для усиления экспрессии гена у клеточного хозяина. Они включают устранение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналов сайта сплайсинга экзонов и интронов, транспозоноподобных повторов и других подобных хорошо изученных последовательностей, которые могут оказывать пагубное влияние на экспрессию гена. Содержание О-С в последовательности можно скорректировать до уровней, средних для данного клеточного хозяина, что рассчитывается с учетом известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Если возможно, последовательность модифицируют для того, чтобы избежать образования предсказанных шпилечных вторичных структур мРНК.

Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности. Такие лидерные последовательности могут способствовать усилению трансляции. Способствующие трансляции лидерные последовательности известны в данной области и включают в себя лидерные последовательности пикорнавирусов, например, лидерную последовательность ЕМСУ (5'-некодирующий участок генома вируса энцефаломиокардита) (Е1гоу-81ет е! а1. (1989), Ргос. ЫаД. АсаД. δα. И8А 86:6126-6130); лидерные последовательности потивирусов, например, лидерную последовательность ТЕУ (вируса гравировки табака) (Оа1Ье е! а1. (1995), Оепе, 165(2):233-238), лидерную последовательность МОМУ (вируса карликовой мозаики кукурузы) (1оЬп8оп е! а1. (1986), Упо1оду, 154:9-20) и гена белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина человека (ΒίΡ) (Масе)ак е! а1. (1991), Ыа!иге, 353:90-94); нетранслируемую лидерную последовательность мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (РНК-4 АМУ) (1оЬЬп§ е! а1. (1987), Ыа!иге, 325:622-625); лидерную последовательность вируса мозаики табака (ТМУ) (ОаШе е! а1. (1989), Мо1еси1аг Вю1оду о! Ρ.ΝΛ. еД. СесН (Ы88, Ыете Уотк), р. 237-256) и лидерную последовательность вируса хлоротической пятнистости маиса (МСМУ) (Ьотше1 е! а1. (1991), У1то1о§у, 81:382-385). См. также ИеПа-Сюрра е! а1. (1987), Р1ап! РЬу8ю1. 84:965-968. Могут быть также использованы другие известные способы для усиления трансляции, например, применение интронов и подобное.

При получении кассеты экспрессии с различными фрагментами ДНК можно производить операции так, чтобы получить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, при необходимости, в надлежащей рамке считывания. С этой целью для соединения фрагментов ДНК можно использовать адаптеры или линкеры, или можно задействовать другие операции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаления избыточной ДНК, удаления сайтов рестрикции и т.п. С этой целью можно задействовать мутагенез ίη νίϋΌ, репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например транзиции и трансверсии.

А. Кассеты экспрессии, содержащие полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность.

В конкретных вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержат промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, или его активным фрагментом или вариантом, раскрытым в данном документе. В определенных вариантах осуществления промотор, определяющий мужскую фертильность, или его активный фрагмент или вариант функционально связан с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, раскрытым в данном документе, таким как полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, приведенный под δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, или его активный фрагмент или вариант.

В определенных вариантах осуществления растительные промоторы могут предпочтительно инициировать транскрипцию в определенных тканях, таких как тычинка, пыльник, тычиночная нить и пыльца, или на определенных стадиях роста и развития, таких как стадии спорогенной ткани, микроспор и микрогаметофита. Такие растительные промоторы называются "активными преимущественно в определенной ткани", "активными преимущественно в определенном типе клеток" или "активными преимущественно на определенной стадии роста". Промоторы, которые инициируют транскрипцию только в определенной ткани, называются "тканеспецифичными". Аналогично, промоторы, которые инициируют транскрипцию только на определенных стадиях роста, называют "специфичными для стадии роста". "Специфичный для типа клеток" промотор управляет экспрессией только в определенных типах клеток в одном или нескольких органах, например, в клетках тычинки или в отдельных типах клеток в тычинке, таких как клетки пыльника, тычиночной нити или пыльцы.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, и их активные фрагменты и варианты могут быть функционально связанными с промоторами, специфичными для мужской ткани или активными преимущественно в мужской ткани, в том числе, например, с промоторами, специфичными для тычинок или активными преимущественно в тычинках, промоторами, специфичными для пыльников или активными преимущественно в пыльниках, промоторами, специфичными для пыльцы или активными преимущественно в пыльце, промоторами, специфичными для тапетума,

- 8 029014

или промоторами, активными преимущественно в тапетуме, и т.п. Промоторы можно выбирать, исходя из желаемого результата. Например, полинуклеотиды, представляющие интерес, могут быть функционально связанными с конститутивными, активными преимущественно в определенной ткани, активными преимущественно на определенной стадии роста или другими промоторами для экспрессии в растениях.

В одном варианте осуществления промоторами могут быть промоторы, которые предпочтительно экспрессируют полинуклеотид, представляющий интерес, в мужских тканях растения. В способе не нужно применять какой-то конкретный промотор, определяющий мужскую фертильность, активный преимущественно в определенной ткани, а можно использовать любой из многих таких промоторов, известных специалисту в данной области. Одним из таких промоторов является промотор 5126, которых предпочтительно управляет экспрессией полинуклеотида, с которым он связан, в мужской ткани растений, описанный в патентах США № 5837851 и 5689051. Другие примеры включают в себя промотор М845 маиса, описанный в патенте США № 6037523; промотор 8Р3, описанный в патенте США № 6452069; промотор В892-7, описанный в МО 02/063021; регуляторный элемент 8СВ6, описанный в патенте США № 5470359; промотор ТА29 (КоНииоте, е! а1., (1990), Р1аи1 Се11. 2:1201-1224; Со1бЬег§, е! а1. (1993), Р1аи1 Се11. 5:1217-1229 и патент США № 6399856); промотор гена металлотионеин-подобного белка 2 типа (СйатЬопие1-Сатраа, е! а1., Сеие (2000), 254:199-208) и промотор Вса9 Вга881са (Ьее, е! а1. (2003), Р1ап! Се11 Кер. 22:268-273).

В некоторых вариантах осуществления кассеты экспрессии содержат промоторы, активные преимущественно в мужских гаметах, функционально связанные с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность. Промоторы, активные преимущественно в мужских гаметах, включают в себя промотор РС47 (И8 5412085; И8 5545546; Р1аи! 13(2):261-271 (1993)), а также промотор ΖΜ13 (НатШои, е! а1. (1998), Р1аи! Мо1. Вю1. 38:663-669); промоторы генов актин-деполимеризующих факторов (таких как ΖтаЬр1, ΖтаЬр2; см., например, Боре/, е! а1. (1996), Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. и8А, 93:7415-7420); промотор гена ΖтС5 пектинметилэстеразоподобного белка маиса (Маке1еу, е! а1. (1998), Р1аи! Мо1. Вю1. 37:187192); промотор гена профилина Ζтр^о1 (Коуаг, е! а1. (2000), Тйе Р1аи! Се11 12:583-598); промотор гена сульфатированного пентапептида фитосульфокина ΖтР8К1(^о^Ь^еске, е! а1. (2005), 1оита1 о! Ехрептеи!а1 Во!аиу, 56(417): 1805-1819); промотор гена кальмодулин-связывающего белка МрсЬр (Кеббу, е! а1. (2000), 1. Вю1. Сйет. 275(45):35457-70).

Как раскрыто в данном документе, конститутивные промоторы включают в себя, например, коровый промотор промотора К8уи7, и других конститутивных промоторов, раскрытых в МО 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор 358 СаМУ (Обе11 е! а1. (1985), Ыа!иге, 313:810-812); промотор гена актина риса (МсЕ1гоу е! а1. (1990), Р1аи! Се11. 2:163-171); промотор гена убиквитина (СЬг18!еи8еи е! а1. (1989), Р1аи! Мо1. Вю1. 12:619-632 и Сйп8!еи8еи е! а1. (1992), Р1аи! Мо1. Вю1. 18:675-689); рЕМи (Ьа8! е! а1. (1991), Тйеог. Арр1. Сеие!. 81:581-588); МА8 (Уе1!еи е! а1. (1984), ЕМВО 1. 3:2723-2730); промотор АЬ8 (патент США № 5659026) и т.п. Другие конститутивные промоторы включают, например, описанные в патентах США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611.

Промоторы, "активные преимущественно в семенах", включают в себя как промоторы, активные при развитии семян, такие как промоторы генов запасных белков семян, так и промоторы, активные при прорастании семян. См. Тйотр8ои е! а1. (1989), ВюЕ88ау8 10:108, включенный в данный документ посредством ссылки. Такие промоторы, активные преимущественно в семенах, включают в себя, без ограничения, С1т 1 (гена цитокинин-индуцируемого транскрипта); сΖ19В1 (гена зеина маиса на 19 кДа); тйр8 (гена миоинозитол-1-фосфатсинтазы) (см. МО 00/11177 и патент США № 6225529; включенные в данный документ посредством ссылки). Промотор гена гамма-зеина является промотором, специфичным для эндосперма. Промотор гена глобулина-1 (С1оЬ-1) является типичным промотором, специфичным для зародыша. У двудольных растений промоторы, специфичные для семян, включают в себя, без ограничения, промоторы генов β-фазеолина фасоли, напина, β-конглицинина, лектина сои, круцефина и т.п. У однодольных растений промоторы, специфичные для семян, включают в себя, без ограничения, промоторы генов зеина на 15 кДа, зеина на 22 кДа, зеина на 27 кДа, γ-зеина, \уаху. 8Й^иηкеи-1, 8141101^0-2. глобулина 1 маиса и т.д. См. также МО 00/12733, где раскрыты промоторы, активные преимущественно в семенах, генов еиб1 и еиб2; включенную в данный документ посредством ссылки. Дополнительные промоторы, специфичные для зародыша, раскрыты в 8а!о е! а1. (1996), Ргос. Νοΐ1. Асаб. 8сг 93:8117-8122; Ыака8е е! а1. (1997), Р1аи! 1. 12:235-46 и Ро8!та-Нааг8та е! а1. (1999), Р1аи!. Мо1. Вю1. 39:257-71. Дополнительные промоторы, специфичные для эндосперма, раскрыты в А1Ьаш е! а1. (1984), ЕМВО, 3:1405-15; А1Ьаш е! а1. (1999), Тйеог. Арр1. Сеи. 98:1253-62; А1Ьаш е! а1. (1993), Р1аи! 1. 4:343-55; Меиа е! а1. (1998), Тйе Р1аи! 1оигиа1, 116:53-62 и Ми е! а1. (1998), Р1аи! Се11 Рйу8ю1о§у, 39:885-889. Промоторы, активные преимущественно в делящихся клетках или в меристематической ткани, были раскрыты в 1!о е! а1. (1994), Р1аи! Мо1. Вю1. 24:863-878; Кеуаб е! а1. (1995), Мо. Сеи. Сеие!. 248:703-711; 8йаи1 е! а1. (1996), Ргос. Νί«1. Асаб. 8сг 93:4868-4872; 1!о е! а1. (1997), Р1аи! 1. 11:983-992 и ТгеЫи е! а1. (1997), Р1аи! Мо1. Вю1. 35:667672.

Промоторы, индуцируемые стрессом, включают в себя промоторы, индуцируемые солевым/водным стрессом, такие как Р5С8 (Ζ;οΐ8 е! а1. (1997), Р1аи! 8с1еисе8 129:81-89); промоторы, индуцируемые холо- 9 029014

дом, такие как сог15а (На)е1а е! а1. (1990), Р1аи1 РЬуз1о1. 93:1246-1252), сог15Ь (\ДЬе1т е! а1. (1993), Р1аи1 Мо1. Вю1. 23:1073-1077), мзс120 (Оие11е! е! а1. (1998), РЕВ8 Ье!!. 423-324-328), а7 (Кисй е! а1. (1997), Р1ап! Мо1 Βίο1. 33:897-909), с121Л (8сЬие1Дег е! а1. (1997), Р1ап! РЬу8ю1. 113:335-45); промоторы, индуцируемые засухой, такие как Тгд-31 (СЬаиДЬагу е! а1. (1996), Р1ап! Мо1. Вю1. 30:1247-57), гД29 (Казида е! а1. (1999), Ыа!иге В1о!есЬпо1оду, 18:287-291); промоторы, индуцируемые осмотическим стрессом, такие как КаЬ17 (УйагДеП е! а1. (1991), Р1ап! Мо1. Вю1. ί7:985-93), и промотор гена осмотина (Кадйо1йата е! а1. (1993), Р1ап! Мо1. Вю1. 23:1117-28) и промоторы, индуцируемые теплом, такие как промоторы генов белков теплового шока (Ваггоз е! а1. (1992), Р1ап! Мо1. 19:665-75; Маггз е! а1. (1993), Эеу. Оепе!. 14:27-41) и зтН8Р (\а!егз е! а1. (1996), 1. Ехрептеп!а1 Во!апу 47:325-338). Другие промоторы, индуцируемые стрессом, включают в себя пр2 (патент США № 5332808 и публикация патентного документа США № 2003/0217393) и гр29а (Уатадис1и-81ипо/ак1 е! а1. (1993) Мо1. Сеп. Сепейсз 236:331-340).

Как рассматривается в других частях данного документа, кассеты экспрессии, содержащие полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, могут быть пакетированы с другими полинуклеотидами, представляющими интерес. Любой полинуклеотид, представляющий интерес, может быть пакетирован с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, в том числе, например, с полинуклеотидами, оказывающими повреждающее действие на мужские гаметы, и маркерными полинуклеотидами.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, могут быть пакетированы в кассетах экспрессии, содержащих промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, который оказывает повреждающее действие на мужские гаметы; т.е. полинуклеотидом, который препятствует функционированию, формированию или распространению мужских гамет, или вместе с такими кассетами экспрессии. Полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, может действовать, предотвращая функционирование, формирование или распространение мужских гамет любым из множества способов. В качестве примера, но не ограничения, это может включать в себя применение полинуклеотидов, которые кодируют продукт гена, такой как ОАМ-метилазу или барназу (см., например, патент США № 5792853 или 5689049; РСТ/ЕР89/00495); кодируют продукт гена, который препятствует накоплению крахмала или влияет на осмотический баланс в пыльце (см., например, патенты США № 7875764; 8013218; 7696405); ингибируют образование продукта гена, важного для функционирования, формирования или распространения мужских гамет (см., например, патенты США № 5859341; 6297426); кодируют продукт гена, который в сочетании с другим продуктом гена предотвращает формирование или функционирование мужских гамет (см. патенты США № 6162964; 6013859; 6281348; 6399856; 6248935; 6750868; 5792853); которые являются антисмысловыми в отношении гена, являющегося крайне важным для функционирования, формирования или распространения мужских гамет, или вызывают косупрессию такового (см. патенты США № 6184439; 5728926; 6191343; 5728558; 5741684); которые препятствуют экспрессии полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, посредством использования шпилечных структур (§тйй е! а1. (2000), Ыа!иге, 407:319-320; АО 99/53050 и АО 98/53083) или подобных.

Полинуклеотиды, оказывающие повреждающее действие на мужские гаметы, включают в себя гены, имеющие доминантно-негативный эффект, такие как гены метилазы и гены, ингибирующие рост (см. патент США № 6399856). Гены, имеющие доминантно-негативный эффект, включают в себя ген А-цепи дифтерийного токсина (С’/ако апД Ап (1991), Р1ап! РЬузю1. 95 687-692; Сгеепйе1Д е! а1. (1983), РЫА8, 80:6853); мутантные гены цикла клеточного деления, такие как СЭС маиса (Со1азап!1 е! а1. (1991), РЫА8, 88: 3377-3381); ген АР (Рагтег е! а1. (1994), Мо1. Сепе!. 3:723-728) и Р68 (СЬеп е! а1. (1991), РЫА8, 88:315-319).

Дополнительные примеры полинуклеотидов, оказывающих повреждающее действие на мужские гаметы, включают, без ограничения, ген пектатлиазы ре1Е из Ег\уииа сЬгузап1йегт1 (Кепп е! а1. (1986), 1. Вас!епо1. 168:595); ген токсина Су!А из ВасШиз !Ьигшд1епз1з 1згае1епз1з (МсЬеап е! а1. (1987), 1. Вас!епо1. 169:1017 (1987), патент США № 4918006); гены ДНКаз, РНКаз, протеаз или полинуклеотиды, экспрессирующие антисмысловые РНК. Полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, может кодировать белок, участвующий в ингибировании взаимодействий пыльцы и рыльца, роста пыльцевых трубок, оплодотворения или их комбинации.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, могут быть пакетированы с раскрытыми в данном документе кассетами экспрессии, содержащими промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, представляющим интерес, кодирующим продукт репортера или маркера. Примеры подходящих полинуклеотидов-репортеров, известных из уровня техники, можно найти, например, в 1ейегзоп е! а1. (1991), в Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1, еД. СеМп е! а1. (К1имег АсаДетю РиЬйзйегз), р. 1-33; 1)еАе1 е! а1. Мо1. Се11. Вю1. 7:725-737 (1987); СоГГ е! а1. ЕМВО 1. 9:25172522 (1990); Каш е! а1. ВюТесйтдиез 19:650-655 (1995) и Сйш е! а1. Сштеп! Вю1оду 6:325-330 (1996). В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, содержит селектируемый репортер. Он может включать в себя полинуклеотиды, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам или устойчивость к гербицидам. Примеры подходящих селектируемых маркерных полинуклеотидов включают, без ограничения, гены, отвечающие за устойчивость к хлорамфениколу, метотрексату, гигромицину, стрептомицину, спектиномицину, блеомицину, сульфонамиду, бромоксинилу,

- 10 029014

глифосату и фосфинотрицину.

В некоторых вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержат полинуклеотид, представляющий интерес, кодирующий маркеры для подсчета трансформантов или скринируемые маркеры, при этом присутствующий полинуклеотид вырабатывает продукт, количество которого можно измерить. Примеры включают ген β-глюкуронидазы или шйА (СИЗ), который кодирует фермент, для которого известно множество хромогенных субстратов (например, из патентов США № 5268463 и 5599670); гены хлорамфениколацетилтрансферазы и щелочной фосфатазы. Другие скринируемые маркеры включают в себя полинуклеотиды, отвечающие за биосинтез антоцианов/флавоноидов, в том числе, например, полинуклеотид К-локуса, который кодирует продукт, регулирующий образование антоциановых пигментов (красного цвета) в тканях растений, гены, контролирующие биосинтез флавоноидных пигментов, такие как С1 и С2 маиса, ген В, ген р1 и гены локуса Ьгоп/с. среди прочего. Дополнительные примеры подходящих маркеров, кодируемых полинуклеотидами, представляющими интерес, включают в себя продукты гена голубого флуоресцентного белка (СУР), гена желтого флуоресцентного белка, гена 1их, кодирующего люциферазу, присутствие которой можно выявить при помощи, например, рентгеновской пленки, счета сцинтилляций, флуоресцентной спектрофотометрии, камер для съемки в условиях слабого освещения, камер для подсчета фотонов или многолуночного люминометра, зеленый флуоресцентный белок (СРР) и БкКей2, при этом растительные клетки, трансформированные маркерным геном, имеют красный цвет и, таким образом, могут быть отобраны визуально. Дополнительные примеры включают в себя ген β-лактамазы, кодирующий фермент, для которого известно множество хромогенных субстратов (например, РАБАС, хромогенный цефалоспорин), ген ху1Е, кодирующий катехолдиоксигеназу, которая может обеспечивать превращение хромогенных катехолов, ген α-амилазы и ген тирозиназы, кодирующий фермент, способный окислять тирозин до БОРА и допахинона, который, в свою очередь, конденсируется с образованием легко выявляемого соединения меланина.

Кассета экспрессии может также содержать селектируемый маркерный ген для отбора трансформированных клеток. Селектируемые маркерные гены используют для отбора трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают в себя гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (ΝΕΟ) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глюфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-Б). Дополнительные селектируемые маркеры включают в себя фенотипические маркеры, такие как β-галактозидаза и флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (СРР) (Зи е! а1. (2004), Вю!есЬпо1. Вюепд, 85:610-9 и Ре!!ег е! а1. (2004), Р1ап! Се11 16:215-28), голубой флуоресцентный белок (СУР) (Во1!е е! а1. (2004), 1. Се11 Зс1епсе, 117:943-54 и Ка!о е! а1. (2002), Р1ап! РЬу8ю1. 129:913-42) и желтый флуоресцентный белок (РЫУРР™ от Еугодеп, см. Во1!е е! а1. (2004), Се11 Зс1епсе, 117:943-54). О дополнительных селектируемых маркерах см. в общих чертах в УаггаШоп (1992), Сшт. Ορίη. Вю!есй. 3:506-511; СЬг1к!орЬегкоп е! а1. (1992), Ргос. №й1. Асай. Зсг ИЗА, 89:6314-6318; Уао е! а1. (1992), Се11. 71:63-72; Ке/шкоН' (1992), Мо1. МюгоЫю1. 6:24192422; Вагк1еу е! а1. (1980), в Т1е Орегоп, р. 177-220; Ни е! а1. (1987), Се11. 48:555-566; Вгоип е! а1. (1987), Се11. 49:603-612; Р1§де е! а1. (1988), Се11. 52:713-722; БеиксЫе е! а1. (1989), Ргос. №И. Асай. Зсг ИЗА, 86:5400-5404; Риегк! е! а1. (1989), Ргос. №!1. Асай. Зск ИЗА, 86:2549-2553; БеиксЫе е! а1. (1990), Зшепсе, 248:480-483; Соккеп (1993), Рй.Б. Тйек1к, ИЫуегкйу оГ Не1Йе1Ыег§; Кешек е! а1. (1993), Ргос. №п1. Асай. Зсг иЗА, 90:1917-1921; какой е! а1. (1990), Мо1. Се11. Вю1. 10:3343-3356; УатЫгеЫ е! а1. (1992), Ргос. №И. Асай. Зсг ИЗА, 89:3952-3956; Ват е! а1. (1991), Ргос. №И. Асай. 8с1. ИЗА, 88:5072-5076; \\'\Ыогкк1 е! а1. (1991), ШсЫс АсЫк Кек. 19:4647-4653; НШепапй-ХУйктап (1989), Торюк Мо1. З!гис. Вю1. 10:143-162; Бедепко1Ы е! а1. (1991), Ап!тюгоЫ. Адеп!к Сйето!йег. 35:1591-1595; К1ешксЬЫй! е! а1. (1988), ВюсйетЕйу, 27:1094-1104; Вотп (1993), Рй.Б. Тйек1к, ИЫуегкйу оГ НеЫеЫегд; Соккеп е! а1. (1992), Ргос. Ν!1. Асай. Зс1. ИЗА, 89:5547-5551; Ойуа е! а1. (1992), АШпЫсгоЬ. Адеп!к СйетоЫег. 36:913-919; Н1аука е! а1. (1985), НапйЫоок оГ Ехрептеп!а1 Рйагтасо1о§у, Уо1. 78 (Зргш§ег-Уег1ад, Вегйп); СШ е! а1. (1988), №!иге, 334:721-724. Такие раскрытия включены в данный документ посредством ссылки. Приведенный выше перечень селектируемых маркерных генов не предназначен быть ограничивающим. Любой селектируемый маркерный ген можно применять в композициях и способах, раскрытых в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержат первый полинуклеотид, представляющий интерес, включающий в себя полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, функционально связанный с первым полинуклеотидным промотором, пакетированный со вторым полинуклеотидом, представляющим интерес, кодирующим продукт гена, оказывающего повреждающее действие на мужские гаметы, функционально связанным с полинуклеотидным промотором, активным преимущественно в мужской ткани. В других вариантах осуществления кассеты экспрессии, описанные в данном документе, также могут быть пакетированы с третьим полинуклеотидом, представляющим интерес, включающим в себя маркерный полинуклеотид, функционально связанным с третьим полинуклеотидным промотором.

В конкретных вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержат первый полинуклеотид, представляющий интерес, содержащий ген пшеницы, определяющий

- 11 029014

мужскую фертильность, раскрытый в данном документе, такой как М822, М826 или М845, функционально связанный с конститутивным промотором, таким как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ). Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать второй полинуклеотид, представляющий интерес, кодирующий продукт гена, оказывающего повреждающее действие на мужские гаметы, функционально связанный с промотором, активным преимущественно в мужской ткани. В определенных вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, могут дополнительно содержать третий полинуклеотид, представляющий интерес, содержащий маркерный ген, такой как ген фосфинотрицинацетилтрансферазы (РАТ) из 81гсрЮтусс5 ушбосйтотадепек, функционально связанный с конститутивным промотором, таким как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ).

IV. Растения.

А. Растения с измененными уровнями/активностью полипептида, определяющего мужскую фертильность.

Дополнительно представлены растения с измененными уровнями и/или видами активности полипептида, определяющего мужскую фертильность, и/или измененными уровнями мужской фертильности. В некоторых вариантах осуществления растения, раскрытые в данном документе, содержат стабильно встроенный в их геномы гетерологичный полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, или его активные фрагменты или варианты, раскрытые в данном документе. Таким образом, представлены растения, растительные клетки, части растений и семена, которые содержат по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, приведенный под любым из 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, или любые его активные фрагменты или варианты, раскрытые в данном документе.

Дополнительно представлены растения, содержащие кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержащие полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, функционально связанный с промотором, активным в растении. В некоторых вариантах осуществления экспрессия полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, модулирует мужскую фертильность растения. В определенных вариантах осуществления экспрессия полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, повышает мужскую фертильность растения. Например, представлены растения, содержащие кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид М822, приведенный под 8Е0 ГО N0: 1, 3 или 5, или его активный фрагмент или вариант, функционально связанный с конститутивным промотором, таким как промотор 358 СаМУ. При экспрессии полинуклеотида М822 мужская фертильность растения повышается.

В определенных вариантах осуществления в растении с мужской стерильностью обеспечивают кассеты экспрессии, содержащие гетерологичный полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, раскрытый в данном документе, или его активный фрагмент или вариант, функционально связанный с промотором, активным в растении. При экспрессии гетерологичного полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, мужская фертильность растения восстанавливается. В конкретных вариантах осуществления растения, раскрытые в данном документе, содержат кассету экспрессии, содержащую гетерологичный полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, раскрытый в данном документе, или его активный фрагмент или вариант, функционально связанный с промотором, пакетированную с одной или несколькими кассетами экспрессии, содержащими полинуклеотид, представляющий интерес, функционально связанный с промотором, активным в растении. Например, пакетированный полинуклеотид, представляющий интерес, может включать в себя полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, и/или маркерный полинуклеотид.

Растения, раскрытые в данном документе, могут также содержать пакетированные кассеты экспрессии, описанные в данном документе, содержащие по меньшей мере два полинуклеотида, так что по меньшей мере два полинуклеотида наследуются совместно в более чем 50% случаев мейоза, т.е. неслучайным образом. Соответственно, если растение или растительная клетка, содержащие пакетированные кассеты экспрессии с двумя полинуклеотидами, претерпевают мейоз, два полинуклеотида при делении попадают в одну и ту же клетку-потомка (дочернюю). Таким образом, пакетированные полинуклеотиды, очевидно, будут экспрессироваться совместно в любой клетке, в которой они присутствуют. Например, растение может содержать кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, пакетированную с кассетой экспрессии, содержащей полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, так что полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, и полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, наследуются совместно. Более конкретно, растение с мужской стерильностью может содержать кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, раскрытый в данном документе, функционально связанный с конститутивным промотором, пакетированную с кассетой экспрессии, содержащей полинуклеотид, оказывающий повреждающее действие на мужские гаметы, функционально связанный с промотором, активным преимущественно в мужской ткани, так что растение образует зрелые пыльцевые зерна. Однако в таком растении развитие дочерних клеток пыльцы, содержащих полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, будет предотвращено экспрессией полинуклеотида, оказывающего повреждающее действие на мужские гаметы.

- 12 029014

В. Растения и способы введения.

Как используется в данном документе, выражение "растение" включает растительные клетки, протопласты растительных клеток, тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растение, растительные каллюсы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, семязачатки, семена, листья, цветки, ветви, плоды, ядра, колоски, початки, листовые обвертки, стебли, корни, кончики корней, пыльники, зерно и т.п. Как используется в данном документе, "зерно" предполагает зрелое семя, полученное коммерческими растениеводами для целей, отличных от выращивания или воспроизводства вида. Потомство, варианты и мутанты регенерированных растений также включены в объем настоящего раскрытия при условии, что эти части содержат введенные последовательности нуклеиновой кислоты.

Способы, раскрытые в данном документе, включают введение полипептида или полинуклеотида в растительную клетку. "Введение", как предполагается, означает включение в растение полинуклеотида или полипептида таким образом, что последовательность попадает внутрь клетки. Способы, раскрытые в данном документе, не зависят от конкретного способа введения последовательности в клетку-хозяина, за исключением того, что полинуклеотид или полипептиды должны попадать внутрь по меньшей мере одной клетки хозяина. Способы введения полинуклеотида или полипептидов в клетки-хозяева (т.е. в растения) известны в данной области техники и включают, без ограничения, способы стабильной трансформации, способы транзиентной трансформации и способы, опосредованные вирусами.

"Стабильная трансформация", как предполагается, означает, что нуклеотидная конструкция, введенная в хозяина (т. е. в растение), интегрируется в геном растения и способна наследоваться его потомством. "Транзиентная трансформация", как предполагается, означает, что полинуклеотид введен в хозяина (т.е. в растение) и экспрессируется временно или что полипептид введен в хозяина (т.е. в растение).

Протоколы трансформации, а также протоколы введения полипептидов или последовательностей полинуклеотидов в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольного или двудольного растения, намеченного для трансформации. Подходящие способы введения полипептидов и полинуклеотидов в растительные клетки включают микроинъекцию (Сто88^ау е! а1. (1986), Вю!есйшдие8 4:320-334), электропорацию (К1§§8 е! а1. (1986), Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. И8Л, 83:5602-5606, трансформацию, опосредованную А§гоЪас!етшт (То\уп8епб е! а1., патент США № 5563055; 2йао е! а1., патент США № 5981840), прямой перенос генов (Ра8/ко\У81б е! а1. (1984), ЕМВО 1. 3:27172722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, 8апГогб е! а1., патент США № 4945050; Тоте8 е! а1., патент США № 5879918; Тоте8 е! а1., патент США № 5886244; В1бпеу е! а1., патент США № 5932782; Тоте8 е! а1. (1995), "Эпес! ΌΝΑ Тгап8Гег ш!о 1п!ас! Р1ап! Се118 у1а М|сгорго)ес1йе ВотЪагбтеп!," в Р1ап! Се11, Т188ие, апб Огдап Си1!иге: Рипбатейа1 Ме!йоб8, еб. СатЪогд апб РЫШр8 (8ртшдег-Уег1ад, Вет1ш); МсСаЪе е! а1. (1988), Вю!есйпо1о§у, 6:923-926); а также трансформацию при помощи Ьес1 (\УО 00/28058). См. также ^е188ш§ет е! а1. (1988), Апп. Кеу. Сепе!. 22:421-477; 8апГогб е! а1. (1987), Рашси1а!е 8с1епсе апб Тесйпо1о§у, 5:27-37 (лук); Сйт18!ои е! а1. (1988), Р1ап! Рйу8ю1. 87:671-674 (соя); МсСаЪе е! а1. (1988), Вю/Тесйпо1о§у, 6:923-926 (соя); Ршет апб МсМи11еп (1991), 1п Уйто Се11 Эеу. Вю1. 27Р:175-182 (соя); 8ш§й е! а1. (1998), Тйеот. Арр1. Сепе!. 96:319-324 (соя); Пайа е! а1. (1990), Вю!есйпо1о§у 8:736-740 (рис); К1еш е! а1. (1988), Ргос. №й1. Асаб. 8сй И8А, 85:4305-4309 (маис); К1еш е! а1. (1988), Вю!есйпо1о§у, 6:559-563 (маис); Тоте8, патент США № 5240855; Вш8ш§ е! а1., патенты США № 5322783 и 5324646; Тоте8 е! а1. (1995), 'Юйес! ^NΑ Тгап8Гег ш!о 1п!ас! Р1ап! Се118 У1а М|сгорго)ес1бе ВотЪагбтеп!," в Р1ап! Се11, Т188ие, апб Огдап СиЙиге: Рипбатейа1 Ме1йоб8, еб. СатЪогд (8ргшдег-Уег1ад, Ветйп) (маис); К1еш е! а1. (1988), Р1ап! Рйу8ю1. 91:440-444 (маис); Ртотт е! а1. (1990), Вю!есйпо1о§у, 8:833-839 (маис); Нооукаа8-Уап 81од!егеп е! а1. (1984), ΝηΙιιΐΌ (Ьопбоп), 311:763-764; Во\теп е! а1., патент США № 5736369 (зерновые культуры); Ву!еЫет е! а1. (1987), Ргос. №й1. Асаб. 8сй И8А, 84:5345-5349 (ЬШасеае); Пе ^е! е! а1. (1985), в Тйе Ехрептейа1 Машри1а!юп оГ Оуи1е Т188ие8, еб. Сйартап е! а1. (Ьопдтап, №\у Уогк), р. 197-209 (пыльца); Каерр1ег е! а1. (1990), Р1ап! Се11 РерогК 9:415-418 и Каерр1ег е! а1. (1992) Тйеот. Арр1. Сепе!. 84:560-566 (трансформация, опосредованная нитевидными кристаллами); П'Найшп е! а1. (1992), Р1ап! Се11, 4:1495-1505 (электропорация); Ы е! а1. (1993), Р1ап! Се11 РерогК 12:250255 и Сйт18!ои апб Рогб (1995), Аппа18 оГ Во!апу, 75:407-413 (рис); О8.)оба е! а1. (1996), №ш.1ге Вю!есйпо1о§у, 14:745-750 (маис, при помощи А§гоЪас!етшт !итеГас1еп8); все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

В конкретных вариантах осуществления в растении могут быть обеспечены полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, или кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, с помощью различных способов транзиентной трансформации. Такие способы транзиентной трансформации включают, без ограничения, введение полипептида, определяющего мужскую фертильность, или его вариантов и фрагментов непосредственно в растение или введение транскрипта, определяющего мужскую фертильность, в растение. Такие способы включают, например, микроинъекцию или бомбардировку частицами. См., например, Сго88\уау е! а1. (1986), Мо1 Сеп. Сепе!. 202:179-185; Штига е! а1. (1986), Р1ап! 8сй 44:53-58; Нер1ег е! а1. (1994), Ргос. №И. Асаб. 8а. 91:2176-2180 и Ни8Й е! а1. (1994), Тйе 1оигпа1 оГ Се11 8с1епсе, 107:775-784, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Альтернативно, растение может быть подвергнуто транзиентной трансформации с помощью полинуклеотида, опреде- 13 029014

ляющего мужскую фертильность, или кассет экспрессии, раскрытых в данном документе, посредством методик, известных в данной области техники. Такие методики включают применение системы вирусного вектора и осаждение полинуклеотида таким способом, который исключает последующее высвобождение ДНК. Таким образом, может происходить транскрипция связанной с частицами ДНК, но частота, с которой она высвобождается с тем, чтобы интегрироваться в геном, значительно снижается. Такие способы включают применение частиц, покрытых полиэтиленимином (ΡΕΙ; № по кат. §1дта Р3143).

В других вариантах осуществления полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, или кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, могут быть введены в растения путем приведения растений в контакт с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. Как правило, такие способы включают встраивание нуклеотидной конструкции, раскрытой в данном документе, в молекулу вирусной ДНК или РНК. Понятно, что последовательность, определяющая мужскую фертильность, раскрытая в данном документе, может быть изначально синтезирована как часть вирусного полипротеина, которую затем можно подвергать процессингу путем протеолиза ίη νίνο или ίη νίίτο с получением желаемого рекомбинантного белка. Способы введения полинуклеотидов в растения, в том числе молекул вирусной ДНК или РНК, и экспрессии белка, кодируемого ими, известны в данной области техники. См., например, патенты США№ 5889191, 5889190, 5866785, 5589367, 5316931 и Ройа е1 а1. (1996), Мо1еси1аг Вю1есйпо1оду, 5:209-221; включенные в данный документ посредством ссылки.

В данной области техники известны способы нацеленной вставки полинуклеотида в конкретное месторасположение в геноме растения. В одном варианте осуществления вставку полинуклеотида в требуемое месторасположение в геноме выполняют с использованием системы сайт-специфической рекомбинации. См., например, \\'О 99/25821, \\'О 99/25854, \\'О 99/25840, \\'О 99/25855 и \\'О 99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Вкратце, полинуклеотид, раскрытый в данном документе, может содержаться в кассете для переноса, фланкированной двумя неидентичными сайтами рекомбинации. Кассету для переноса вводят в растение, имеющее стабильно встроенный в его геном целевой сайт, который фланкирован двумя неидентичными сайтами рекомбинации, которые соответствуют сайтам кассеты для переноса. Обеспечивают подходящую рекомбиназу, и кассета для переноса интегрируется в целевой сайт. Полинуклеотид, представляющий интерес, таким образом, интегрируют в конкретное хромосомное положение в геноме растения.

Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, МсСоттюк е1 а1. (1986), Р1ап1 Се11 Керой5, 5:81-84. Затем можно выращивать и опылять эти растения с помощью одного и того же трансформированного штамма или различных штаммов и идентифицировать полученное в результате потомство с желаемым проявлением желаемой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений, чтобы убедиться в том, что проявление желаемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что было достигнуто проявление требуемой фенотипической характеристики. Таким образом, в настоящем раскрытии представлены трансформированные семена (также называемые "трансгенными семенами"), содержащие полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, раскрытый в данном документе, например, кассету экспрессии, раскрытую в данном документе, стабильно встроенную в их геном. Семена, содержащие какую-либо кассету экспрессии, раскрытую в данном документе, можно подвергать сортировке на основе параметров размера, в том числе, без ограничения, длины семени, ширины семени, плотности семени или любой их комбинации.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, и кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, можно применять для трансформации любого вида растений, в том числе, без ограничения, однодольных и двудольных. Примеры видов растений, представляющих интерес, включают, без ограничения, кукурузу (2еа тауз), Вта881са 8р. (например, В.париз, В.гара, В.щпсеа). люцерну (Мейюадо 5а1Ка), рис (Оту/а 8а1ща), рожь (8еса1е сегеа1е), сорго (8отдйцт Ысо1от, 8отдйцт уи1даге), просо (например, пеннисетум рогозовидный (Репш5е1ит д1аисит), просо культурное (Рашсит тШасеит), щетинник итальянский (8е1апа йаПса), просо пальчатое (Е1еи5ше согасапа)), подсолнечник (НеНаййш аппии5), сафлор (Сат1йати5 Дпс1ойи5), пшеницу (Ттйюит ае51щит), сою (О1усше тах), табак (№сойапа 1аЬасит), картофель (8о1апцт 1иЬего5ит), разновидности арахиса (ЛгасЫ5 йуродаеа), хлопчатник (Оо55уршт ЬатЬайете, Оо55уршт Ыт5и1ит), сладкий картофель (1ротоеа Ьа1а1и5), маниок (Матйо! е5си1еп1а), кофейное дерево (СоЛЛеа 5рр.), кокосовую пальму (Сосо5 писЛега), ананас (Апапа5 сото5И5), цитрусовые деревья (Сйти5 5рр.), шоколадное дерево (ТйеоЬтота сасао), чайный куст (СатеШа 5теп515), банан (Ми5а 5рр.), авокадо (Рег5еа атепсапа), инжир (Рюи5 са5юа), гуаву (Р51Йшт дицата), манго (МапдЛега тйюа), маслину (О1еа еигораеа), папайю (Санса рарауа), кешью (Апасагйшт оссИеп1а1е), макадамию (Масайат1а ш1едйЛоНа), миндаль (Ргипи5 атудДа1и5), разновидности сахарной свеклы (Ве1а уЫдат), сахарный тростник (8ассЛатит 5рр.), разновидности овса, ячмень, овощи, декоративные растения, травянистые растения и хвойные растения.

В конкретных вариантах осуществления растения пшеницы применяют в способах и композициях, раскрытых в данном документе. Как используется в данном документе, выражение "пшеница" относится к любому виду рода Ттйюит, в том числе его предкам, а также его потомству, полученному посредством скрещивания с другим видом. Пшеница включает "гексаплоидную пшеницу" с организацией генома

- 14 029014

ΆΆΒΒΌΌ, содержащей 42 хромосомы, и "тетраплоидную пшеницу" с организацией генома ААВВ, содержащей 28 хромосом. Гексаплоидная пшеница включает Т.аезЦуцш, Т.зреПа, Т.тосйа, Т.сотрас!ит, Т.зрйаегососсит, Τ.νανίίονίί и гибриды, полученные при отдаленном скрещивании таковых. Тетраплоидная пшеница включает Т.йигит (также называемую твердой пшеницей или ТпИсит ЩгдМит подвида йигит). Т.йюоссокез, Т.йюоссит, Т. ро1отсит и гибриды, полученные при отдаленном скрещивании таковых. Кроме того, выражение "пшеница" включает возможных предков гексаплоидных или тетраплоидных ТпОсит 8р., таких как Т.цгайц, Т.топососсит или Т.Ьоеойсит для генома А, Аедйорз зреПокез для генома В и Т.1аизсЬи (также известный как Аедйорз зциаггоза или Аедйорз 1аизсЬй) для генома Ό. Культурный сорт пшеницы для применения в настоящем раскрытии может принадлежать, без ограничения, к любому из вышеперечисленных видов. Также охвачены растения, получаемые с помощью традиционных методик с использованием Тгйюит зр. в качестве родительского вида при половом скрещивании с видами, не принадлежащими к Тгйюит, такими как рожь §еса1е сегеа1е, в том числе, без ограничения, тритикале. В некоторых вариантах осуществления растение пшеницы, как, например, коммерческие сорта гексаплоидной пшеницы или твердой пшеницы, имеющие подходящие агрономические характеристики, известные специалистам в данной области, является подходящим для коммерческого получения зерна.

Овощи включают разновидности томата (Ъусорегзюоп езсикШит), латук (например, БасШса зайуа), разновидности зеленой фасоли (Р1азео1из уц1дапз), разновидности лимской фасоли (РЬазео1из йтепз1з), разновидности гороха (ЬаГОугиз зрр.) и представителей рода Сисит1з, таких как огурец (С.зайуцз), канталупа (С.сап1а1ирепз1з) и дыня мускусная (С.те1о). Декоративные растения включают азалию (Кйойойепйгоп зрр.), гортензию (Масгорйу11а йуйгапдеа), гибискус (ШЫзсиз гозазапепз1з), виды роз (Коза зрр.), виды тюльпанов (Тцйра зрр.), виды нарциссов (Ыагаззиз зрр.), разновидности петунии (РеЫша йуЬпйй), гвоздику (Шапйшз сагуорЬу11из), пуансетию (ЕирйогЫа рЫсйетшй) и хризантему.

Хвойные растения, которые можно использовать при практическом применении способов и композиций по настоящему изобретению, включают, например, виды сосны, такие как сосна ладанная (Ршиз 1аейй), сосна Эллиота (Ршиз е11ю1и), сосна желтая (Ршиз ропйегоза), сосна скрученная широкохвойная (Ршиз сопЮПа) и сосна лучистая (Ршиз гаЫа!а); псевдотсугу Мензиса (Рзеийо!зида тегШезн); тсугу канадскую (Тзида сапайепз1з); ель белую (Рюеа д1аиса); секвойю вечнозеленую (Бецио1а зешрегунепз); истинные пихты, такие как пихта миловидная (АЫез ашаЬШз) и пихта бальзамическая (АЫез Ьа1затеа), и виды туи, такие как туя гигантская (Тйи)а р1юа!а) и каллитропсис нутканский (СЬатаесурапз иоо1ка1епз1з). В конкретных вариантах осуществления растения, раскрытые в данном документе, являются сельскохозяйственными культурами (например, кукуруза, люцерна, подсолнечник, Вгаззюа, соя, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеница, просо, табак и т.д.). В других вариантах осуществления растения кукурузы и сои являются оптимальными, а еще в нескольких других вариантах осуществления оптимальными являются растения кукурузы.

Другие растения, представляющие интерес, включают зерновые растения, которые обеспечивают семена, представляющие интерес, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь и т.д. Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, Вгаззюа, маис, люцерну, пальму, кокосовую пальму и т.д. Бобовые растения включают бобы и разновидности гороха. Бобы включают гуар, рожковое дерево, пажитник, сою, разновидности обыкновенной фасоли, вигну китайскую, золотистую фасоль, лимскую фасоль, стручковую фасоль, разновидности чечевицы, турецкий горох и т.д.

Как правило, будут применять промежуточную клетку-хозяина при практическом применении способов и композиций, раскрытых в данном документе, для увеличения числа копий клонирующего вектора. С увеличенным числом копий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, можно выделить в значительных количествах для введения в желаемые растительные клетки. В одном варианте осуществления используют промоторы растений, которые не вызывают экспрессию полипептида у бактерий.

Прокариоты чаще всего представлены различными штаммами Е.соП; тем не менее, также можно применять другие штаммы микроорганизмов. Традиционно применяемые контрольные последовательности прокариот, которые определены в настоящем документе как включающие в себя промоторы для инициации транскрипции, в оптимальном случае с оператором, а также последовательности связывания рибосом, включают в себя такие широко применяемые промоторы, как системы β-лактамазного (пенициллиназного) и лактозного (1ас) промоторов (Сйапд, е! а1. (1977), Ыа1иге, 198:1056), система триптофанового (1гр) промотора (Соеййе1 е! а1. (1980), №ю1ею АсЫз Кез. 8:4057), а также промотор рЬ, полученный из фага лямбда, и сайт связывания рибосом Ν-гена (8Ыша1аке е! а1. (1981), Ыа1иге, 292:128). Включение маркеров селекции в ДНК-векторы, вводимые в Е.соП путем трансфекции, также является целесообразным. Примеры таких маркеров включают в себя гены, определяющие устойчивость к ампициллину, тетрациклину или хлорамфениколу.

Выбирают вектор, обеспечивающий введение в соответствующую клетку-хозяина. Бактериальные векторы, как правило, имеют плазмидное или фаговое происхождение. Подходящие бактериальные

- 15 029014

клетки инфицируют частицами фагового вектора или трансфицируют "голой" ДНК фагового вектора. Бактериальные клетки трансфицируют ДНК плазмидного вектора в случае применения плазмидного вектора. Системы экспрессии для экспрессии белка, раскрытого в данном документе, доступны при применении ВасШик 8р. и 8а1топе11а (Рака е1 а1. (1983), Сепе, 22:229-235); МокЬасЬ е1 а1. (1983), №-Ииге. 302:543-545).

В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии или полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, поддерживаются в гемизиготном состоянии в растении. Гемизиготность является генетическим состоянием, которое имеет место, если существует только одна копия гена (или набора генов) при отсутствии соответствующего аллельного набора в сестринской хромосоме. В определенных вариантах осуществления кассеты экспрессии, раскрытые в данном документе, содержат первый промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, который пакетирован с полинуклеотидом, оказывающим повреждающее действие на мужские гаметы, функционально связанным с промотором, активным преимущественно в мужской ткани, и такие кассеты экспрессии вводят в растение с мужской стерильностью в гемизиготном состоянии. Если полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, экспрессируется, растение способно успешно образовывать зрелые пыльцевые зерна, поскольку полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, восстанавливает фертильное состояние растения. С учетом гемизиготного состояния кассеты экспрессии только некоторые дочерние клетки унаследуют кассету экспрессии в процессе формирования пыльцевого зерна. Дочерние клетки, которые наследуют кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, не разовьются в зрелые пыльцевые зерна в связи с осуществляемой преимущественно в мужской ткани экспрессией продукта, кодируемого пакетированным геном, оказывающим повреждающее действие на мужские гаметы. Те пыльцевые зерна, которые не наследуют кассету экспрессии, продолжат развитие в зрелые пыльцевые зерна и будут функциональными, но не будут содержать полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, кассеты экспрессии и, следовательно, не будут передавать полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, потомству посредством пыльцы.

V. Модулирование концентрации и/или активности полипептидов, определяющих мужскую фертильность.

Представлен способ модулирования концентрации и/или активности полипептидов, определяющих мужскую фертильность, раскрытых в данном документе, в растении. Выражение "влияет" или "модулирует", используемое в данном документе по отношению к концентрации и/или активности полипептидов, определяющих мужскую фертильность, относится к любому повышению или снижению концентрации и/или активности полипептидов, определяющих мужскую фертильность, по сравнению с соответствующим контролем. В целом, концентрацию и/или активность полипептида, определяющего мужскую фертильность, раскрытого в данном документе, повышают или снижают по меньшей мере на 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению с нативными контрольным растением, частью растения или клеткой. Как раскрыто в данном документе, модулирование может происходить в процессе роста растения до достижения желаемой стадии развития и/или после этого. В конкретных вариантах осуществления полипептиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, модулируют в однодольных, в частности в пшенице.

Можно использовать множество способов для анализа модулирования концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность. Например, уровень экспрессии полипептида, определяющего мужскую фертильность, можно измерить напрямую, например, путем анализа уровня полипептида, определяющего мужскую фертильность, в растении (т.е. вестерн- или нозерн-блоттинга), или опосредованно, например путем анализа активности, определяющей мужскую фертильность, полипептида, определяющего мужскую фертильность, в растении. Способы измерения активности, определяющей мужскую фертильность, описаны в других частях данного документа. В конкретных вариантах осуществления модулирование концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность, включает в себя модулирование (т.е. повышение или снижение) уровня полипептида, определяющего мужскую фертильность, в растении. Способы измерения уровня и/или активности полипептидов, определяющих мужскую фертильность, известны в данной области техники и рассматриваются в других частях данного документа. В еще нескольких вариантах осуществления уровень и/или активность полипептида, определяющего мужскую фертильность, модулируют в вегетативной ткани, в репродуктивной ткани или как в вегетативной, так и в репродуктивной ткани.

В одном варианте осуществления активность и/или концентрацию полипептида, определяющего мужскую фертильность, повышают путем введения полипептида или соответствующего полинуклеотида, определяющего мужскую фертильность, в растение. После этого растение, содержащее введенную последовательность, определяющую мужскую фертильность, подвергают отбору с помощью способов, известных специалистам в данной области, таких как, без ограничения, Саузерн-блот-анализ, секвенирование ДНК, ПЦР-анализ или фенотипический анализ. В определенных вариантах осуществления маркерные полинуклеотиды вводят вместе с полинуклеотидом, определяющим мужскую фертильность, для содействия отбору растений, содержащих или не содержащих полинуклеотид, определяющий мужскую

- 16 029014

фертильность, раскрытый в данном документе. Растение или часть растения, измененные или модифицированные с помощью вышеуказанных вариантов осуществления, выращивают в условиях формирования растения на протяжении времени, достаточного для модулирования концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность, в растении. Условия формирования растения хорошо известны в данной области техники.

Как рассматривалось в других частях данного документа, в данной области техники известно множество способов обеспечения полипептида в растении, в том числе, без ограничения, прямое введение полипептида в растение или введение в растение (транзиентно или стабильно) полинуклеотидной конструкции, кодирующей полипептид, определяющий мужскую фертильность. Также признано, что в способах, раскрытых в данном документе, можно использовать полинуклеотид, который не способен управлять экспрессией белка или РНК в трансформированном растении. Таким образом, уровень и/или активность полипептида, определяющего мужскую фертильность, можно повышать посредством изменения гена, кодирующего полипептид, определяющий мужскую фертильность, или его промотора. См., например, Кт1ес, патент США № 5565350; Ζηιΐίηβ е1 а1., РСТ/И893/03868. Таким образом, представлены мутировавшие растения, которые несут мутации в генах, определяющих мужскую фертильность, при этом данные мутации повышают экспрессию гена, определяющего мужскую фертильность, или повышают активность кодируемого полипептида, определяющего мужскую фертильность.

В других вариантах осуществления концентрацию и/или активность полипептида, определяющего мужскую фертильность, повышают путем введения в растение кассеты экспрессии, содержащей полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность (например, 8Ε0 ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17), или его активный фрагмент или вариант, раскрытые в других частях данного документа. Полинуклеотид, определяющий мужскую фертильность, может быть функционально связан с промотором, который является гетерологичным по отношению к растению или нативным по отношению к растению. При повышении концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность, в растении мужская фертильность растения также повышается. Таким образом, мужскую фертильность растения можно повысить посредством повышения концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность. Например, у растения с мужской стерильностью можно восстановить мужскую фертильность посредством повышения концентрации и/или активности полипептида, определяющего мужскую фертильность.

Также признано, что уровень и/или активность полипептида можно модулировать путем использования полинуклеотида, который не способен управлять экспрессией белка или РНК в трансформированном растении. Например, полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, можно применять для конструирования полинуклеотидных конструкций, которые можно использовать в способах изменения или мутирования геномной нуклеотидной последовательности в организме. Такие полинуклеотидные конструкции включают, без ограничения, векторы РНК: ДНК, мутационные векторы РНК: ДНК, репарационные векторы РНК: ДНК, дуплексные смешанные олигонуклеотиды, самокомплементарные олигонуклеотиды РНК:ДНК и рекомбиногенные олигонуклеотидные основания. Такие нуклеотидные конструкции и способы применения известны из уровня техники. См. патенты США № 5565350; 5731181; 5756325; 5760012; 5795972 и 5871984; все из которых включены в данный документ посредством ссылки. См. также \Е0 98/49350, \Е0 99/07865, \Е0 99/25821 и ВееШат е1 а1. (1999), Ргос. ИаН. Асай. 8с1. И8А, 96:8774-8778; включенные в данный документ посредством ссылки. Таким образом, признано, что способы, раскрытые в данном документе, не зависят от встраивания полного полинуклеотида в геном, за исключением того, что растение или его клетка должны быть изменены в результате введения полинуклеотида в клетку.

В одном варианте осуществления геном может быть изменен после введения полинуклеотида в клетку. Например, в геном растения можно встроить полинуклеотид или любую его часть. Изменения в геноме, раскрытые в данном документе, включают в себя, без ограничения, добавления, делеции и замены нуклеотидов в геноме. Хотя способы, раскрытые в данном документе, не зависят от добавлений, делеций и замен любого конкретного числа нуклеотидов, признано, что такие добавления, делеции и замены охватывают по меньшей мере один нуклеотид.

- 17 029014

Таблица 1

Краткое описание 8ЕР II) N0

ЗЕЦГО:	Описание
1	Полинуклеотид Мз22 пшеницы (Т. игаПи, геном А)
2	Полипептид Мз22 пшеницы (Т. игаг1и, геном А)
3	Полинуклеотид Мз22 пшеницы (Ае. χρβίίοίάβχ, геном В)
4	Полипептид Мз22 пшеницы (Ае. χρβίίοίάβχ, геном В)
5	Полинуклеотид Мз22 пшеницы (Ае. 1аизс1гИ, геном ϋ)
6	Полипептид Мз22 пшеницы (Ае. 1аи8скп, геном О)
7	Полинуклеотид Мз26 пшеницы (Т. игаПи, геном А)
8	Полипептид Мз26 пшеницы (Т. игаПи, геном А)
9	Полинуклеотид Мз26 пшеницы (Ае. .чре1юи1еп геном В)
10	Полипептид Мз26 пшеницы (Ае. у)е1юи1е,ч, геном В)
11	Полинуклеотид Мз26 пшеницы (Ае. ΐαιπΜί, геном ϋ)
12	Полипептид Мз26 пшеницы (Ае. ПишАи, геном ϋ)
13	Полинуклеотид М$45 пшеницы (Т. игаПи, геном А)
14	Полипептид М$45 пшеницы (Т. игаПи, геном А)
15	Полинуклеотид М$45 пшеницы (Ае. ,чре1ю'и1еп геном В)
16	Полипептид М$45 пшеницы (Ае. у)е1юи1е,ч, геном В)
17	Полинуклеотид М$45 пшеницы (Ае. ΐαιπΜί, геном ϋ)
18	Полипептид М$45 пшеницы (Ае. ΐαιιζΜί, геном ϋ)
19	Гем-связывающий домен Мз26: РххОхКхСхО
20	Дикислород-связывающий домен А Мз26 А/ООХЛ/ЕТТ/8
21	Целевой сайт М826+
22-27	праймеры
28	Геном А пшеницы, фигура 1
29	Геном В пшеницы, фигура 1
30	Геном ϋ пшеницы, фигура 1
31	М826 маиса, фигура 1
32	М826 сорго, фигура 1
33	М826 риса, фигура 1
34-44	См. описание фигуры 2
45-52	См. описание фигуры 4

Форма единственного числа применяется в данном документе для обозначения одной или нескольких (т.е. по меньшей мере одной) грамматических единиц предмета. Например, "элемент" означает один или несколько элементов.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в описании, ориентированы на уровень специалиста в области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Все публикации и заявки на патенты включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы подразумевалось, что каждая отдельная публикация или заявка на патент конкретно и отдельно включена посредством ссылки.

Хотя в целях ясности понимания вышеприведенное изобретение было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примера, очевидно, что на практике можно осуществлять определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

- 18 029014

Экспериментальная часть

Пример 1. Идентификация полинуклеотидов, определяющих мужскую фертильность, у пшеницы.

Полинуклеотиды, определяющие мужскую фертильность, раскрытые в данном документе, могут быть идентифицированы с помощью биоинформатических подходов. Например, последовательности, предположительно представляющие собой гены, определяющие мужскую фертильность, у пшеницы изначально идентифицировали с помощью ίη δίΐίοο поиска в проприетарных базах данных, используя известные гены, определяющие фертильность, из других видов, таких как маис. Производили отбор ΕδΤ-кандидатов на основании гомологии на уровне белка по отношению к эталонным последовательностям и с учетом библиотеки, из которой последовательность-кандидат была получена, например, проявляющих экспрессию в мужской репродуктивной ткани.

На основе последовательностей-кандидатов Ε8Τ создавали праймеры и применяли их для скрининга проприетарной ВАС-библиотеки пшеницы. Осуществляли дополнительный скрининг идентифицированных суперпулов с помощью соответствующих праймеров для того, чтобы идентифицировать конкретные клоны ВАС, содержащие Ε8Τ.

Ступенчатую ПЦР можно было осуществлять (система для ПЦР ОепеЛшр® 9700, Аррйеб Вю8у81ет8) при использовании следующих параметров циклов: 94°С в течение 3 мин (один цикл), 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин 30 с (35 циклов), 72°С в течение 7 мин и завершение при 4°С. ДНК-полимераза для ПЦР с горячим стартом Р1и Шга™ (81га1адепе) могла быть предпочтительной в связи с ее весьма низким средним процентом ошибки (менее 0,5% на амплифицированный фрагмент из 500 п.о.).

Вставочную ДНК пшеницы, выделенную из клонов ВАС, расщепляли для подтверждения посредством Саузерн-блоттинга с использованием клона-кандидата Ε8Τ в качестве зонда. Фрагменты ВАС субклонировали в рВ1ие8спр1® (81га1адепе 1пс., Ла-Хойя, Калифорния). Белые колонии выращивали на ЬВ-среде и переносили на мембрану с помощью процедуры дот-блота. После денатурации на мембране производили зондирование с помощью клона-кандидата Ε8Τ. Положительные клоны идентифицировали и секвенировали.

Пример 2. Сравнение полинуклеотида пшеницы, определяющего мужскую фертильность, с известными последовательностями.

Таблица 2

Глобальная идентичность полинуклеотидов и полипептидов М822 пшеницы, маиса и риса

М822	Т игаПи Геном А	Ае хреНоМех Геном В	Ае (аиасНИ Геном й	тх22маиса	тх22 риса
Т.игаПи Геном А		97.6	99.0	79.9	81.0
Ае аре/юМех Геном В	98.5		98.1	79.6	81.0
Ае 1аи.чскИ Геном О	98.5	98.5		79.6	81.5
ш22 маиса	89.2	89.2	89.2		83.6
т$22 риса	86.2	86.2	81.9	78.0

(Результаты для полинуклеотидов приведены в затемненных ячейках; результаты для полипептидов приведены в незатемненных ячейках).

- 19 029014

Таблица 3

Глобальная идентичность полинуклеотидов и полипептидов М826 пшеницы, маиса и риса.

М526	Т игаПи Геном А	Ае хреНоМех Гепом В	Ае 1аи.чсЬИ Геном О	тп$26 маиса	тз26 риса
Т игаПи Геном А		97.7	97.9	82.1	81.8
Ае зрекоМез Геном В	99.1		97.9	82.2	82.3
Ае ишхсИи Геном I)	98.9	99.1		82.0	82.8
пк26 маиса	89.0	89.0	88.8		80.5
тя 2 6 риса	90.4	90.5	90.2	87.7

(Результаты для полинуклеотидов приведены в затемненных ячейках; результаты для полипептидов приведены в незатемненных ячейках).

Таблица 4

Глобальная идентичность полинуклеотидов и полипептидов М845 пшеницы, маиса и риса

М845	Т. игаПи Геном А	Ае хреНоиГез Геном В	Ае 1аихскИ Геном £>	тх45 маиса	т$45 риса
Т. игаПи Геном А		96.3	98.5	79.5	78.0
Ае хреГюМён Геном В	99.3		96.7	79.1	78.6
Ае юихсЬН Геном Ό	99.5	99.3		78.6	78.9
т.\45 маиса	81.6	81.8	81.1		76.9
тз45 риса	85.0	84.7	84.7	82.8

(Результаты для полинуклеотидов приведены в затемненных ячейках; результаты для полипептидов приведены в незатемненных ячейках).

Пример 3. Трансформация пшеницы.

Протоколы трансформации пшеницы доступны для специалиста в данной области. См., например, Не е! а1. (2010), I. Εxр. Во!апу, 61(6): 1567-1581; \\и е! а1. (2008), ГОапкеетс Кек. 17:425-436; \е1иа е! а1. (1994), Р1ап! I. 5(2):285-297; Каксо-Саип! е! а1. (2001), I. Εxр. Во!апу, 52(357):865-874; Каягая е! а1. (2011), Айтсап I. Вю!есй. 10(5):740-750.

Пример 4. Направленная модификация М826.

В данном примере описаны способы мутирования генов пшеницы с использованием технологий двухнитевого разрыва для обеспечения направленной модификации ДНК или вставки гена посредством гомологичной рекомбинации. Более конкретно, в данном примере описан способ, включающий, без ограничения, доставку специально разработанной хоминг-эндонуклеазы, М826+, для распознавания, расщепления и мутации хромосомной ДНК пшеницы посредством неточной репарации по типу негомологичного соединения концов (ΝΗΕΙ).

Векторы и трансформация.

Гены М826, определяющие мужскую фертильность, локализованные в геномах А, В и Ό пшеницы, содержат последовательность из 22 пар оснований (5’- ОАТООТОАСОТАСОТОСССТАС-3’; 8Е() ГО ΝΟ: 21), которая распознается хоминг-эндонуклеазой М826+ как субстрат для введения двухнитевого разрыва. Сайт распознавания М826 из 22 п.о. имеется в геномах А, В и Ό пшеницы и является консервативным для ортологических генов М826 маиса, сорго и риса (фиг. 1). Хоминг-эндонуклеаза М826+ вызывает мутации в растениях маиса, риса и сорго, как было показано в \ΥΟ 2013/066423, опубликованной 10 мая 2013 г. Для того чтобы вызвать мутации в геномных генах М826 в растениях пшеницы, РНР42063 вводили в пшеницу сорта ПеШег с помощью способов трансформации, опосредованных АдгоЬас!епит, сходных с описанными способами ^атак^уЕт! е! а1., Р1ап! Се11 Си1!игек Рго!осо1к Ме!йойк ш Мо1еси1аг Вю1оду, 877, 2012, 357-384; Не, е! а1., (2010), I. Εxр. Во!апу, 61(6):1567-1581; №и, е! а1. (2008), ГОапкеетс Кек. 17:425-436; \е1ла. е! а1. (1994), Р1ап! I. 5(2):285-297; Каксо-Саип!, е! а1. (2001), I. Εxр. Во!апу, 52(357):865-874; Ка//а₄. е! а1. (2011), Айтсап I. Вю!есй. 10(5):740-750).

- 20 029014

РНР42063 содержит одноцепочечную М526+, помещенную под транскрипционный контроль промотора СА51 маиса. Промотор СА51 может подвергаться транскрипционной индукции с помощью антидота сульфонилмочевины, 2-СВ5Е, либо повышенной температуры (заявка на патент США 13/896437, поданная 17 мая 2013 г.). РНР42063 также содержит ген синего флуоресцентного белка (СРР), регулируемый промотором /тН\1)2, который применяют в качестве визуального маркера для отбора клеток пшеницы по интеграции Т-ДНК. Кроме того, РНР42063 содержит копию гена красного флуоресцентного белка, регулируемого промотором гена гистона 2В маиса. Часть гена красного флуоресцентного белка в этой конструкции была дуплицирована в прямой ориентации и состояла из двух фрагментов гена КРР с перекрытием в 369 п. о. Эти два фрагмента разделены спейсером в 136 п. о., содержащим целевой сайт М526. Каллюсы с синей флуоресценцией отбирали и применяли для регенерации растений пшеницы, которые выращивали в теплице до зрелости и завязывания семян. Растения пшеницы, содержащие вставки Т-ДНК РНР42063, подтверждали путем анализа числа копий. Четыре независимых растения, трансформированных одной копией или низким количеством копий РНР42063, отбирали для дополнительных экспериментов. Незрелых зародышей с синей флуоресценцией собирали через 14-20 дней после опыления, стерилизовали, помещали на поддерживающую среду и инкубировали в темноте при 37°С в течение 24 ч. В конце этого периода зародышей, инкубируемых при повышенной температуре, переводили в условия комнатной температуры (<26°С), и зародышам предоставляли возможность расти в темноте. Примерно через 72 ч после начала обработки при повышенной температуре у зародышей, инкубируемых при 37°С, начинали проявляться сектора красной флуоресценции. Это наблюдение позволяет предположить, что индуцируемая теплом генная кассета СА51:М526+ приводила к двухнитевым разрывам в целевом сайте М526 между двумя перекрывающимися последовательностями репортера КР-РР, содействующим внутримолекулярной рекомбинации и получению функционального гена КРР, который выявляют по появлению клеток с красной флуоресценцией на фоне голубой флуоресценции. Каллюсные объекты с красной флуоресценцией отбирали для дополнительного молекулярного исследования и регенерации растения.

Идентификация мутаций в целевом сайте ТаМ526 в растительных тканях. Общую геномную ДНК экстрагировали из подвергнутого тепловой обработке и не подвергнутого тепловой обработке каллюса, трансформированного при помощи хоминг-эндонуклеазы М526+, и участок, окружающий геномный целевой сайт, подвергали ПЦР-амплификации при помощи мастер-микса для высокоточной ПЦР Р1ш§юп® (№да Епу1апй Вю1аЪ§, М05311) с добавлением последовательностей, необходимых для получения ампликон-специфичных "штрих-кодов" и секвенирования на 111итта с помощью праймеров с "хвостами" посредством двух циклов ПЦР. Праймеры, применяемые в первой ПЦР-реакции, показаны в табл. 5.

Таблица 5

Последовательности праймеров для ПЦР

Целевой сайт	Ориентация праймера	Последовательность праймера для первой ПЦР	5ЕОГО ΝΟ:
Хомингэндонуклеаза М526+	Прямая	СТАСАСТСТТТСССТАСАСОАСОСТСТТССОАТСТААССС ОСООАООАСОАСОТОСТС	22
Хомингэндонуклеаза М526+	Обратная	СААОСАОААОАСООСАТАСОАОСТСТТССОАТСТСОТСО ОООССССАОТТОТАС	23

Праймеры, применяемые во второй реакции ПЦР, представляли собой

ААТСАТАСООСОАССАССОАОАТСТАСАСТСТТТСССТАСАСО (прямой, 5Е(} ГО N0: 24) и

СААССАСААОАСООСАТА (обратный 5ЕО ГО N0: 25). ’

Геномная ДНК, экстрагированная из листьев ^трансформированных растений ЕТеГОег, служила в качестве отрицательного контроля.

Полученные в результате продукты ПЦР-амплификации концентрировали с помощью центрифужной колонки для очистки продуктов ПЦР (Дауеп МтЕ1и!е, подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле, и соответствующие продукты амплификации вырезали и очищали с помощью центрифужной колонки для экстракции из геля (Дауеп. Концентрацию очищенных из геля продуктов амплификации измеряли с помощью флуориметрического анализа на основе красителя Хехст, при этом они были объединены в эквимолярном соотношении, и осуществляли глубокое секвенирование одиночных прочтений длиной 100 нуклеотидов на анализаторе генома 11х от 111итта (ЕЫМ ВюрЕагтасеийсаИ, 1пс.) при известной концентрации контрольной РЫХ ν3 30-40% (об./об.) (111итта, РС-110-3001) для нивелирования смещения в последовательности. Только прочтения с инсерционно-делеционным полиморфизмом, затрагивающим >1 нуклеотида, возникшим в пределах окна из 6 нуклеотидов, расположенного по центру ожидаемого сайта расщепления, и не обнаруженным на аналогичном уровне в отрицательном контроле, были классифицированы как имеющие N 1Е.1-мутации. Общее число ΝΗΕΙ-мутаций затем применяли для

- 21 029014

расчета % мутантных прочтений, исходя из общего числа прочтений соответствующей длины, содержавших точное совпадение со "штрих-кодом" и прямым праймером.

Частота ΝΗΕΙ-мутаций, обнаруженных с помощью глубокого секвенирования для не подвергнутого тепловой обработке и подвергнутого тепловой обработке каллюса, трансформированного с помощью хоминг-эндонуклеазы М826+, по сравнению с отрицательным контролем показана в табл. 6. Десять наиболее широко распространенных типов ΝΗΕΙ-мутаций, обнаруженных в подвергнутом тепловой обработке каллюсе, показаны на фиг. 2. Эти данные позволяют предположить, что хоминг-эндонуклеаза М826+ эффективно внедряла ΝΗΕΙ-мутации и изменения в нативные гены М826 пшенипы.

Таблица 6

Процент (%) мутантных прочтений в целевом локусе хоминг-эндонуклеазы М826+ пшеницы

Система	Общее число мутантных прочтений	Общее число прочтений	% мутантных прочтений
Контрольная геномная ДНК нетрансформированной пшеницы	19	3989749	0,00%
Каллюс пшеницы, трансформированный с помощью хомингэндонуклеазы М826+ (без тепловой обработки)	304	4069593	0,007%
Каллюс пшеницы, трансформированный с помощью хомингэндонуклеазы М826+ (37°С в течение 24 часов)	64158	4055925	1,58%

Идентификация мутаций в целевом сайте ТаМ826 у регенерированных растений Каллюсные объекты с красной флуоресценцией отбирали для регенерации растений. Растения выращивали в теплице, и ДНК из листьев отдельных регенерированных растений пшеницы (п=122) подвергали скринингу в отношении мутаций в целевом сайте М826-1 посредством амплификации участка с помощью ПЦР с использованием пары праймеров υΝΙΜ826 5’-2 (ОАСОТООТОСТСААСТТСОТОАТ; $Εζ) ц} N0: 26) и υΝΙΜ826 31 (ОССАТООАОАООАТООТСАТСАТ; 3Εζ) ГО N0: 27) и расщепления амплифицированных продуктов с помощью фермента рестрикции ДНК, ΒδΐλΥΙ, который распознает последовательность 5-сстасс-з’

Продукты этих реакций подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле и подвергали скринингу в отношении полос, устойчивых к расщеплению с помощью Βδΐ^Ι, указывающих на мутации в целевом сайте М826-1.

Десять из 122 подвергнутых скринингу растений, регенерированных из трансформированных с помощью РНР42063 зародышей, подвергнутых тепловой обработке, содержали продукты ПЦР, устойчивые к расщеплению ферментом рестрикции Βδΐ^Ι, что указывало на мутации в целевом сайте М826. Субклонирование и анализ последовательностей ДНК этих продуктов ПЦР выявили различные мутации во всем целевом сайте М826 в диапазоне от вставки одного нуклеотида до делеций 4-98 нуклеотидов. Всего было идентифицировано семь неидентичных мутаций в этих регенерированных растениях пшеницы (фиг. 3). Обеспечивали возможность самоопыления растений, содержащих эти мутации. Осуществляли скрининг растений-потомков в отношении мейотического наследования вышеописанных мутаций посредством III (Р-ахп пификации для выявления полос, устойчивых к расщеплению с помощью Βδΐ^Ι, указывающих на мутации в целевом сайте М826-1 (как описано выше). Устойчивые к Βδΐ^Ι продукты ПЦРамплификации идентифицировали у растений-потомков, выращенных из полученных из самоопыленных семян родительских растений, которые содержали мутантные аллели М826, при этом анализ последовательностей ДНК этих продуктов подтвердил передачу исходной мутации следующему поколению половым путем.

В данном примере показана модификация генов пшеницы путем направленной доставки реагента, вызывающего двухнитевой разрыв, в данном случае специально разработанной эндонуклеазы генной конверсии, которая распознавала, расщепляла и подвергала мутации хромосомную ДНК пшеницы посредством репарации по типу соединения концов.

- 22 029014

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ПРЕДУСМАТРИВАЮЩИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ МУЖСКУЮ ФЕРТИЛЬНОСТЬ

<130> 5282-РСТ

<150> из 61/697590

<151> 2012-09-06

<160> 52

<170> Рабепб1п версия 3.5

<210> 1

<211> 414

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит. игагби

<400> 1

абдббдадда	бдсадсадса	ддбддадддс	дбддбдддсд	дсддсабсдб	ддссдаддсд	60
даддаддсдд	сддбдбасда	дсдддбддсб	сдсабддсса	дсддсаасдс	ддбддбсдбс	120
ббсадсдсст	дсддсбдсбд	сабдбдссас	дбсдбсаадс	дссбссбдсб	бддссбдддд	180
дбсддсссса	ссдбсбасда	дббддассад	абдддсддсд	ссдддсдада	дабссаддсд	240
дсдсбддсдс	адсбдсбдсс	ссссддассс	ддсдссддсс	ассассадса	дссдссадбд	300
сссдбддбдб	бсдбсддсдд	даддсбссбд	ддсддсдбдд	адааддбсаб	ддсдбдссас	360
абсаасддса	сдсбсдбссс	дсбссбсаад	дасдссддсд	сдсбсбддсб	сбда	414

<210> 2

<211> 137

<212> Белок

<213> Тг1б1сит. игагби

<220>

<221> другой_признак

<223> Хаа = любая аминокислота

<220>

<221> другой_признак

<222> (44)..(44)

<223> Хаа может быть любой встречающейся в природе аминокислотой

<400> 2

Меб Ьеи Агд Меб О1п О1п О1п Уа1 О1и О1у Уа1 Уа1 О1у О1у О1у 11е 1 5 10 15

Уа1 А1а О1и А1а О1и О1и А1а А1а Уа1 Туг О1и Агд Уа1 А1а Агд Меб 20 25 30

А1а Зег О1у Азп А1а Уа1 Уа1 Уа1 РНе Зег А1а Хаа О1у Суз Суз Меб

- 23 029014

35

40

45

Суз

Ηΐ3

Уа1

Уа1

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Рго

ТЬг

50

55

60

ναι

Туг

О1и

Ьеи

Азр

О1п

Меб

О1у

О1у

А1а

О1у

Агд

О1и

11е

О1п

А1а

65

70

75

80

А1а

Ьеи

А1а

О1п

Ьеи

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Рго

О1у

А1а

О1у

Η18

Η18

О1п

85

90

95

О1п

Рго

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

РЬе

Уа1

О1у

О1у

Агд

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

100

105

110

ναι

О1и

Ьуз

Уа1

Меб

А1а

Суз

Ηΐ3

11е

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

Рго

Ьеи

115

120

125

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Тгр

Ьеи

130

135

<210>	3
<211>	414
<212>	ДНК
<213>	АедПорз зре1боПез
<400>	3
абдббдадда бдсадсадса	ддбддадддс	дбддбдддсд	дсддсабсдб	ддсддаддсд	60
даддаддсдд ссдбдбасда	дсдддбддсб	сдсабддсса	дсддсаасдс	ддбддбсдбс	120
ббсадсдсса дсддсбдсбд	сабдбдссас	дбсдбсаадс	дссбссбдсб	бддссбддда	180
дбсддсссса ссдбдбасда	дббддассад	абдддсддсд	ссдддсддда	дабссаддсд	240
дсссбддсдс адсбдсбдсс	ссссддассс	ддсдссддсс	ассассадса	дссдссддбд	300
сссдбддбдб бсдбуддсдд	даддсбссбд	ддсддсдбдд	адааддбдаб	ддсдбдссас	360
абсаасддса сдсбсдбссс	дсбссбсаад	дасдссддсд	сдсбсбддсб	сбда	414
<210>	4
<211>	137
<212>	Белок
<213>	АедПорз зре1боПез
<220>
<221>	другой_признак
<223>	Хаа = любая аминокислота
<220>
<221>	другой_признак
<222>	(105)..(105)
<223>	Хаа может быть	любой встречающейся в	природе аминокислотой

- 24 029014

<400> 4

МеБ 1

Беи

Агд

МеБ

С1п 5

О1п О1п Уа1

О1и

О1у Уа1 10

Уа1

О1у

О1у

О1у 15

11е

ναι

А1а

О1и

А1а

О1и

О1и

А1а

А1а

Уа1

Туг

О1и

Агд

Уа1

А1а

Агд

МеБ

20

25

30

А1а

Бег

С1у

Азп

А1а

Уа1

Уа1

Уа1

РБе

Бег

А1а

Бег

О1у

Суз

Суз

МеБ

35

40

45

Суз

Ηΐ3

Уа1

Уа1

Буз

Агд

Беи

Беи

Беи

О1у

Беи

О1у

Уа1

О1у

Рго

ТБг

50

55

60

Уа1

Туг

О1и

Беи

Азр

О1п

МеБ

О1у

О1у

А1а

О1у

Агд

О1и

11е

О1п

А1а

65

70

75

80

А1а

Беи

А1а

С1п

Беи

Беи

Рго

Рго

О1у

Рго

О1у

А1а

О1у

Н1з

Н1з

О1п

85

90

95

О1п

Рго

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

РБе

Хаа

О1у

О1у

Агд

Беи

Беи

О1у

О1у

100

105

110

ναι

О1и

Буз

Уа1

МеБ

А1а

Суз

Н1з

11е

Азп

О1у

ТБг

Беи

Уа1

Рго

Беи

115

120

125

Беи

Буз

Азр

А1а

О1у

А1а

Беи

Тгр

Беи

130

135

<210> 5

<211> 414

<212> ДНК

<213> АедПорзт БаизсБП

<400> 5

аБдББдадда	Бдсадсадса	ддБддадддс	дБддБдддсд	дсддсаБсаБ	ддсддаддсд	60
даддаддсдд	сддБдБасда	дсдддБддсБ	сдсаБддсса	дсддсаасдс	ддБддБсдБс	120
ББсадсдсса	дсддсБдсБд	саБдБдссас	дБсдБсаадс	дссБссБдсБ	БддссБдддд	180
дБсддсссса	ссдБсБасда	дББддассад	аБдддсддсд	ссдддсдада	даБссаддсд	240
дсдсБддсдс	адсБдсБдсс	ссссддассс	ддсдссддсс	ассассадса	дссдссадБд	300
сссдБддБдБ	БсдБсддсдд	даддсБссБд	ддсддсдБдд	адааддБдаБ	ддсдБдссас	360
аБсаасддса	сдсБсдБссс	дсБссБсаад	дасдссддсд	сдсБсБддсБ	сБда	414

<210> 6

<211> 137

<212> Белок

<213> АедПорз БаизсБП

- 25 029014

<400> 6

МеЬ 1

Ьеи

Агд

МеЬ

О1п 5

О1п О1п Уа1

О1и

О1у Уа1 10

Уа1

О1у

О1у

О1у 15

11е

МеЬ

А1а

О1и

А1а

О1и

О1и

А1а

А1а

Уа1

Туг

О1и

Агд

Уа1

А1а

Агд

МеЬ

20

25

30

А1а

Зег

С1у

Азп

А1а

Уа1

Уа1

Уа1

РЬе

Зег

А1а

Зег

О1у

Суз

Суз

МеЬ

35

40

45

Суз

Ηίβ

Уа1

Уа1

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

О1у

Уа1

О1у

Рго

ТЬг

50

55

60

Уа1

Туг

О1и

Ьеи

Азр

О1п

МеЬ

О1у

О1у

А1а

О1у

Агд

О1и

11е

О1п

А1а

65

70

75

80

А1а

Ьеи

А1а

О1п

Ьеи

Ьеи

Рго

Рго

О1у

Рго

О1у

А1а

О1у

Ηί3

Ηί3

О1п

85

90

95

О1п

Рго

Рго

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

РЬе

Уа1

О1у

О1у

Агд

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

100

105

110

Уа1

О1и

Ьуз

Уа1

МеЬ

А1а

Суз

Ηί3

11е

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

Рго

Ьеи

115

120

125

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

О1у

А1а

Ьеи

Тгр

Ьеи

130

135

<210> 7 <211> 1934 <212> ДНК <213> ТгШсит игагЬи
<400> 7 аЬддаддаад	сЬсасддсдд	саЬдссдЬсд	асдасдасдд	сдЬЬсЬЬссс	дсЬддсаддд
сЬссасаадЬ	ЬсаЬддссаЬ	сЬЬссЬсдЬд	ЬЬссЬсЬсдЬ	ддаЬсЬЬддЬ	ссасЬддЬдд
адссЬдадда	адсадааддд	дссдаддЬса	ЬддссддЬса	Ьсддсдсдас	дсЬддадсад
сЬдаддаасЬ	асЬассддаЬ	дсасдасЬдд	сЬсдЬддадЬ	ассЬдЬссаа	дсассддасд
дЬсассдЬсд	асаЬдсссЬЬ	сассЬссЬас	ассЬасаЬсд	ссдассссдЬ	даасдЬсдад
саЬдЬдсЬса	адассааЬЬЬ	саасааЬЬас	сссааддЬда	аасааЬссЬс	дадаЬдЬсад
асааддЬЬса	дЬааЬсддЬа	сЬдасадЬдЬ	ЬасаааЬдЬс	ЬдаааЬсЬда	ааЬЬдЬаЬдЬ
сЬадддддад	дЬдЬасаддЬ	ссЬасаЬдда	сдЬдсЬдсЬс	ддсдасддса	ЬаЬЬсаасдс
сдасддсдад	сЬсЬддадда	адсададдаа	дасддсдадс	ЬЬсдадЬЬсд	сЬЬссаадаа

60

120

180

240

300

360

420

480

540

- 26 029014

ссбдададас	ббсадсасда	бсдбдббсад	ддадбасбсд	сбдаадсбдб	ссадсабссб	600
дадссаддсб	бдсааддссд	дсааадбсдб	ддасабдсад	дсаасбдаас	бсаббсссбб	660
ддбсабсбда	асдббдаббб	сббддасааа	абббсаадаб	бсбдасдсда	дсддасдааб	720
бсаддадсбд	басабдадда	бдасдсбдда	сбсдабсбдс	ааддбсдддб	бсддддбсда	780
дабсддсасд	сбдбсдссдд	адсбдссдда	даасадсббс	дсдсаддсдб	бсдасдссдс	840
саасабсабс	дбдасдсбдс	ддббсабсда	сссдсбдбдд	сдсдбдаада	адббссбдса	900
сдбсддсбсд	даддсдсбдс	бддадсадад	сабсаадсбс	дбсдасдадб	бсассбасад	960
сдбсабссдс	сддсдсаадд	ссдадабсдб	дсаддсссдд	дссадсддса	адсаддадаа	1020
ддбдсдбдсд	бдабсабсдб	саббсдбсаа	дсбссддабс	дсбддбббдб	дбадбаддбд	1080
ссаббдабса	сбдасасдбб	аасбдддбдс	дсадабсаад	сасдасабас	бдбсдсддбб	1140
сабсдадсбд	ддсдаддссд	дсддсдасда	сддсддсадс	сбдббсдддд	асдасааддд	1200
ссбссдсдас	дбддбдсбса	асббсдбдаб	сдссдддсдд	дасассасдд	ссасдасдсб	1260
дбссбддббс	ассбасабдд	ссабдасдса	сссддссдбд	дссдадаадс	бссдссдсда	1320
дсбддссдсс	ббсдаддсдд	абсдсдсссд	сдаддадддс	дбсдсбсбдд	бссссбдсад	1380
сдасддсдад	ддсдссдасд	аддссббсдс	сдсссдсдбд	дсдсадббсд	сддддсбссб	1440
дадсбасдас	дддсбсддда	адсбддбдба	ссбссасдсд	бдсдбдасдд	адасдсбдсд	1500
дсбдбасссд	дсддбдссдс	аддассссаа	дддсабсдсд	даддасдасд	бдсбсссдда	1560
сддсассаад	дбдсдсдссд	дсдддабддб	дасдбасдбд	сссбасбсса	бддддсддаб	1620
ддадбабаас	бддддссссд	асдссдссад	сббссддссд	дадсддбдда	бсддсдасда	1680
сддсдсдббс	сдсаасдсдб	сдссдббсаа	дббсасддсд	ббссаддсдд	ддссдсддаб	1740
сбдссбсддс	ааддасбсдд	сдбассбдса	дабдаадабд	дсдсбддсса	басбдбдсад	1800
дббсббсадд	ббсдадсбсд	бддадддсса	ссссдбсаад	бассдсабда	бдассабссб	1860
сбссабддсд	сасддссбса	аддбссдсдб	сбссадддсд	ссдсбсдссб	дабсббдабс	1920
бдддббссдд	сдад					1934

<210> 8

<211> 548

<212> Белок

<213> Тг1б1сит игагби

<400> 8

Меб О1и О1и А1а Н13 О1у О1у Меб Рго Бег ТЪг ТЪг ТЪг А1а РБе РБе

1 5 10 15

Рго Беи А1а О1у Беи Н13 Буз РБе Меб А1а 11е РБе Беи Уа1 РБе Беи

20 25 30

- 27 029014

Зег

Тгр

11е 35

Ьеи

Уа1

Ηΐ3

Тгр

Тгр 40

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

О1п 45

Ьуз

О1у

Рго

Агд

Зег

Тгр

Рго

Уа1

11е

О1у

А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

С1п

Ьеи

Агд

Азп

Туг

50

55

60

Туг

Агд

МеЬ

Ηΐ3

Азр

Тгр

Ьеи

Уа1

О1и

Туг

Ьеи

Зег

Ьуз

Η18

Агд

ТЬг

65

70

75

80

ναι

ТЬг

Уа1

Азр

МеЬ

Рго

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

ТЬг

Туг

11е

А1а

Азр

Рго

85

90

95

ναι

Азп

Уа1

О1и

Ηΐ3

Уа1

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Азп

РЬе

Азп

Азп

Туг

Рго

Ьуз

100

105

110

О1у

О1и

Уа1

Туг

Агд

Зег

Туг

МеЬ

Азр

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1у

Азр

О1у

11е

115

120

125

РЬе

Азп

А1а

Азр

О1у

О1и

Ьеи

Тгр

Агд

Ьуз

С1п

Агд

Ьуз

ТЬг

А1а

Зег

130

135

140

РЬе

О1и

РЬе

А1а

Зег

Ьуз

Азп

Ьеи

Агд

Азр

РЬе

Зег

ТЬг

11е

Уа1

РЬе

145

150

155

160

Агд

О1и

Туг

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

11е

Ьеи

Зег

О1п

А1а

Суз

Ьуз

165

170

175

А1а

О1у

Ьуз

Уа1

Уа1

Азр

МеЬ

С1п

О1и

Ьеи

Туг

МеЬ

Агд

МеЬ

ТЬг

Ьеи

180

185

190

Азр

Зег

11е

Суз

Ьуз

Уа1

О1у

РЬе

О1у

Уа1

О1и

11е

О1у

ТЬг

Ьеи

Зег

195

200

205

Рго

О1и

Ьеи

Рго

О1и

Азп

Зег

РЬе

А1а

С1п

А1а

РЬе

Азр

А1а

А1а

Азп

210

215

220

11е

11е

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд

РЬе

11е

Азр

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

Уа1

Ьуз

Ьуз

225

230

235

240

РЬе

Ьеи

Ηΐ3

Уа1

О1у

Зег

О1и

А1а

Ьеи

Ьеи

О1и

С1п

Зег

11е

Ьуз

Ьеи

245

250

255

ναι

Азр

О1и

РЬе

ТЬг

Туг

Зег

Уа1

11е

Агд

Агд

Агд

Ьуз

А1а

О1и

11е

260

265

270

ναι

О1п

А1а

Агд

А1а

Зег

О1у

Ьуз

С1п

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

Η18

Азр

11е

275

280

285

- 28 029014

Ьеи

Зег Агд 290

РИе

11е О1и Ьеи 295

О1у

О1и А1а О1у О1у Азр Азр О1у 300

О1у

Зег

Ьеи

РИе

О1у

Азр

Азр

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Азр

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

РИе

305

310

315

320

Уа1

11е

А1а

О1у

Агд

Азр

ТИг

ТИг

А1а

ТИг

ТИг

Ьеи

Зег

Тгр

РИе

ТИг

325

330

335

Туг

Меб

А1а

Меб

ТИг

Н1з

Рго

А1а

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

Агд

Агд

О1и

340

345

350

Ьеи

А1а

А1а

РИе

О1и

А1а

Азр

Агд

А1а

Агд

О1и

О1и

О1у

Уа1

А1а

Ьеи

355

360

365

Уа1

Рго

Суз

Зег

Азр

О1у

О1и

О1у

А1а

Азр

О1и

А1а

РИе

А1а

А1а

Агд

370

375

380

Уа1

А1а

О1п

РИе

А1а

О1у

Ьеи

Ьеи

Зег

Туг

Азр

О1у

Ьеи

О1у

Ьуз

Ьеи

385

390

395

400

Уа1

Туг

Ьеи

Н1з

А1а

Суз

Уа1

ТИг

О1и

ТИг

Ьеи

Агд

Ьеи

Туг

Рго

А1а

405

410

415

Уа1

Рго

О1п

Азр

Рго

Ьуз

О1у

11е

А1а

О1и

Азр

Азр

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

420

425

430

О1у

ТИг

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

О1у

О1у

Меб

Уа1

ТИг

Туг

Уа1

Рго

Туг

Зег

435

440

445

Меб

О1у

Агд

Меб

О1и

Туг

Азп

Тгр

О1у

Рго

Азр

А1а

А1а

Зег

РИе

Агд

450

455

460

Рго

О1и

Агд

Тгр

11е

О1у

Азр

Азр

О1у

А1а

РИе

Агд

Азп

А1а

Зег

Рго

465

470

475

480

РИе

Ьуз

РИе

ТИг

А1а

РИе

О1п

А1а

О1у

Рго

Агд

11е

Суз

Ьеи

О1у

Ьуз

485

490

495

Азр

Зег

А1а

Туг

Ьеи

О1п

Меб

Ьуз

Меб

А1а

Ьеи

А1а

11е

Ьеи

Суз

Агд

500

505

510

РИе

РИе

Агд

РИе

О1и

Ьеи

Уа1

О1и

О1у

Н1з

Рго

Уа1

Ьуз

Туг

Агд

Меб

515

520

525

Меб

ТИг

11е

Ьеи

Зег

Меб

А1а

Нтз

О1у

Ьеи

Ьуз

Уа1

Агд

Уа1

Зег

Агд

- 29 029014

530 535 540

А1а Рго Ьеи А1а

545

<210> 9 <211> 1929 <212> ДНК <213> АедИорз зре1йоШез <400> 9 айддаддаад сйсассййдд сайдссдйсд	асдасддссй	йсййсссдсй	ддсадддсйс	60
сасаадййса	йддссайсйй	ссйсдйдййс	сйсйсдйдда	йссйддйсса	сйддйддадс	120
сйдаддаадс	адааддддсс	даддйсайдд	ссддйсайсд	дсдссасдсй	ддадсадсйд	180
аддаасйасй	ассддайдса	сдасйддсйс	дйддадйасс	йдйссаадса	ссддасддйс	240
ассдйсдаса	йдсссййсас	сйссйасасс	йасайсдссд	асссддйдаа	сдйсдадсай	300
дйдсйсаада	ссаасййсаа	сааййасссс	ааддйдааас	аайссйсдад	айдйсадйса	360
аддййсддйа	йаайсддйас	йдасадйдйй	асааайдйсй	дааайсйдаа	аййдйдйдйд	420
йадддддадд	йдйасаддйс	сйасайддас	дйдсйдсйсд	дсдасддсай	аййсаасдсс	480
дасддсдадс	йсйддаддаа	дсададдаад	асддсдадсй	йсдадййсдс	ййссаадаас	540
сйдададасй	йсадсасдай	сдйдййссдд	дадйасйссс	йдаадсйдйс	садсайссйд	600
адссаддсйй	дсааддссдд	сааадййдйд	дасайдсадд	йаасйдаасй	сйййсссййд	660
дйсайсйдаа	сдййдайййс	ййддасаааа	йййсаадайй	дйдасдсдад	сдадссаайй	720
саддадсйдй	асайдаддай	дасдсйддас	йсдайсйдса	аддйддддйй	сддддйддад	780
айсддсасдс	йдйсдссдда	дсйдссддад	аасадсййсд	сдсаддссйй	сдасдссдсс	840
аасайсайсд	йдасдсйдсд	дййсайсдас	ссдсйдйддс	дсдйдаадаа	дййссйдсас	900
дйсддсйсдд	аддсдсйдсй	ддадсададс	айсаадсйсд	йсдасдадйй	сассйасадс	960
дйсайссдсс	ддсдсааддс	сдадайсдйд	саддсссддд	ссадсддсаа	дсаддадаад	1020
дйдсдйасдс	ддйсайсдйс	аййсдйсаад	сйсссдайсд	сйддйййдйд	садайдссай	1080
йдайсасйда	сасаййаасй	дддсдсдсад	айсаадсасд	асайасйдйс	дсддййсайс	1140
дадсйдддсд	аддссддсдд	сдасдасддс	ддсадссйдй	йсддддасда	саадддссйс	1200
сдсдасдйдд	йдсйсаасйй	сдйдайсдсс	дддсдддаса	ссасддссас	дасдсйсйсс	1260
йддййсассй	асайддссай	дасдсасссд	дасдйддссд	адаадсйссд	ссдсдадсйд	1320
дссдссййсд	адйссдадсд	сдсссдсдад	дадддсдйсд	сйсйддйссс	сйдсадсдас	1380
ддсдадддсй	ссдасдаддс	сййсдссдсс	сдсдйддсдс	адййсдсддд	дсйссйдадс	1440
йасдасдддс	йсдддаадсй	ддйдйассйс	сасдсдйдсд	йдасддадас	дсйдсдссйд	1500

- 30 029014

Ьасссддсдд	Ьдссдсадда	Ьсссаадддс	аЬсдсддадд	асдасдЬдсЬ	сссддасддс	1560
ассааддЬдс	дсдссддсдд	даЬддЬдасд	ЬасдЬдсссЬ	асЬссаЬддд	дсддаЬддад	1620
ЬасаасЬддд	дссссдасдс	сдссадсЬЬс	сддссддадс	ддЬддаЬсдд	сдасдаЬддс	1680
дссЬЬссдса	асдсдЬсдсс	дЬЬсаадЬЬс	асддсдЬЬсс	аддсддддсс	дсддаЬсЬдс	1740
сЬдддсаадд	асЬсддсдЬа	ссЬдсадаЬд	аадаЬддсдс	ЬддссаЬссЬ	дЬдсаддЬЬс	1800
ЬЬсаддЬЬсд	адсЬсдЬдда	дддссасссс	дЬсаадЬасс	дсаЬдаЬдас	саЬссЬсЬсс	1860
аЬддсдсасд	дссЬсааддЬ	ссдсдЬсЬсс	адддсдссдс	ЬсдссЬдаЬс	ЬЬдаЬсЬддЬ	1920

Ьссддсдад 1929

<210> 10

<211> 547

<212> Белок

<213> АедИорз зре1Ьо15.ез

<400> 10

МеЬ 1

О1и

О1и

А1а

Ηΐ3 5

Ьеи

О1у

МеЬ

Рго

Бег 10

ТЬг

ТЬг

А1а

РЬе

РЬе 15

Рго

Ьеи

А1а

О1у

Ьеи

Ηΐ3

Ьу3

РЬе

МеЬ

А1а

11е

РЬе

Ьеи

Уа1

РЬе

Ьеи

Бег

20

25

30

Тгр

11е

Ьеи

Уа1

Ηΐ3

Тгр

Тгр

Бег

Ьеи

Агд

Ьу3

О1п

Ьу3

О1у

Рго

Агд

35

40

45

Бег

Тгр

Рго

Уа1

11е

О1у

А1а

ТЬг

Ьеи

О1и

О1п

Ьеи

Агд

А3п

Туг

Туг

50

55

60

Агд

МеЬ

Ηΐ3

Азр

Тгр

Ьеи

Уа1

О1и

Туг

Ьеи

Бег

Ьу3

Ηΐ3

Агд

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

Уа1

Азр

МеЬ

Рго

РЬе

ТЬг

Бег

Туг

ТЬг

Туг

11е

А1а

А3р

Рго

Уа1

85

90

95

Азп

Уа1

О1и

Ηΐ3

Уа1

Ьеи

Ьу3

ТЬг

А3п

РЬе

А3п

А3п

Туг

Рго

Ьу3

О1у

100

105

110

О1и

Уа1

Туг

Агд

Бег

Туг

МеЬ

А3р

Уа1

Ьеи

Ьеи

О1у

А3р

О1у

11е

РЬе

115

120

125

Азп

А1а

Азр

О1у

О1и

Ьеи

Тгр

Агд

Ьу3

О1п

Агд

Ьу3

ТЬг

А1а

Бег

РЬе

130

135

140

О1и

РЬе

А1а

Бег

Ьу3

А3п

Ьеи

Агд

А3р

РЬе

Бег

ТЬг

11е

Уа1

РЬе

Агд

145

150

155

160

- 31 029014

О1и

Туг

Зег Ьеи

Ьуз 165

Ьеи

Зег

Зег

11е

Ьеи 170

Зег

О1п

А1а

Суз

Ьуз 175

А1а

О1у

Ьуз

Уа1

Уа1

Азр

МеЬ

О1п

О1и

Ьеи

Туг

МеЬ

Агд

МеЬ

ТЬг

Ьеи

Азр

180

185

190

Зег

11е

Суз

Ьуз

Уа1

О1у

РЬе

О1у

Уа1

О1и

11е

О1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Рго

195

200

205

О1и

Ьеи

Рго

О1и

Азп

Зег

РЬе

А1а

О1п

А1а

РЬе

Азр

А1а

А1а

Азп

11е

210

215

220

11е

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд

РЬе

11е

Азр

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

Уа1

Ьуз

Ьуз

РЬе

225

230

235

240

Ьеи

Ηΐ3

Уа1

О1у

Зег

О1и

А1а

Ьеи

Ьеи

О1и

О1п

Зег

11е

Ьуз

Ьеи

Уа1

245

250

255

Азр

О1и

РЬе

ТЬг

Туг

Зег

Уа1

11е

Агд

Агд

Агд

Ьуз

А1а

О1и

11е

Уа1

260

265

270

О1п

А1а

Агд

А1а

Зег

О1у

Ьуз

О1п

О1и

Ьуз

11е

Ьуз

Н1з

Азр

11е

Ьеи

275

280

285

Зег

Агд

РЬе

11е

О1и

Ьеи

О1у

О1и

А1а

С1у

О1у

Азр

Азр

О1у

О1у

Зег

290

295

300

Ьеи

РЬе

О1у

Азр

Азр

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Азр

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

РЬе

Уа1

305

310

315

320

11е

А1а

О1у

Агд

Азр

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Зег

Тгр

РЬе

ТЬг

Туг

325

330

335

МеЬ

А1а

МеЬ

ТЬг

Н1з

Рго

Азр

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

Агд

Агд

О1и

Ьеи

340

345

350

А1а

А1а

РЬе

О1и

Зег

О1и

Агд

А1а

Агд

О1и

О1и

О1у

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

355

360

365

Рго

Суз

Зег

Азр

О1у

О1и

О1у

Зег

Азр

О1и

А1а

РЬе

А1а

А1а

Агд

Уа1

370

375

380

А1а

О1п

РЬе

А1а

О1у

Ьеи

Ьеи

Зег

Туг

Азр

О1у

Ьеи

О1у

Ьуз

Ьеи

Уа1

385

390

395

400

Туг

Ьеи

Ηΐ3

А1а

Суз

Уа1

ТЬг

О1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

Туг

Рго

А1а

Уа1

405 410 415

- 32 029014

Рго

О1п

Азр

Рго 420

Ьуз

О1у

11е

А1а

О1и 425

Азр

Азр

Уа1

Ьеи

Рго 430

Азр

О1у

ТНг

Ьуз

Уа1 435

Агд

А1а

О1у

О1у

МеЬ 440

Уа1

ТНг

Туг

Уа1

Рго 445

Туг

Зег

МеЬ

О1у

Агд 450

МеЬ

О1и

Туг

Азп

Тгр 455

О1у

Рго

Азр

А1а

А1а 460

Зег

РНе

Агд

Рго

О1и 465

Агд

Тгр

11е

О1у

Азр 470

Азр

О1у

А1а

РНе

Агд 475

Азп

А1а

Зег

Рго

РНе 480

Ьуз

РНе

ТНг

А1а

РНе 485

О1п

А1а

О1у

Рго

Агд 490

11е

Суз

Ьеи

О1у

Ьуз 495

Азр

Зег

А1а

Туг

Ьеи 500

О1п

МеЬ

Ьуз

МеЬ

А1а 505

Ьеи

А1а

11е

Ьеи

Суз 510

Агд

РНе

РНе

Агд

РНе 515

О1и

Ьеи

Уа1

О1и

О1у 520

Н1з

Рго

Уа1

Ьуз

Туг 525

Агд

МеЬ

МеЬ

ТНг

11е

Ьеи

Зег

МеЬ

А1а

Нтз

О1у

Ьеи

Ьуз

Уа1

Агд

Уа1

Зег

Агд

А1а

530 535 540

Рго Ьеи А1а 545

<210> 11

<211> 1930

<212> ДНК

<213> АедИорз ЬаизсНИ

<400> 11 аЬддаддаад	сЬсасддсдд	саЬдссдЬсд	асдасддссЬ	ЬсЬЬсссдсЬ	ддсадддсЬс	60
сасаадЬЬса	ЬддссаЬсЬЬ	ссЬсдЬдЬЬс	сЬсЬсдЬдда	ЬсЬЬддЬсса	сЬддЬддадс	120
сЬдаддаадс	адааддддсс	даддЬсаЬдд	ссддЬсаЬсд	дсдсдасдсЬ	ддадсадсЬд	180
аддаасЬасЬ	ассддаЬдса	сдасЬддсЬс	дЬддадЬасс	ЬдЬссаадса	ссддасддЬд	240
ассдЬсдаса	ЬдсссЬЬсас	сЬссЬасасс	ЬасаЬсдссд	асссддЬдаа	сдЬсдадсаЬ	300
дЬдсЬсаада	ссаасЬЬсаа	сааЬЬасссс	ааддЬдааас	ааЬссЬсдад	аЬдЬсадЬаа	360
аддЬЬсадЬа	ЬааЬсддЬас	ЬдасадЬдЬЬ	асаааЬдЬсЬ	даааЬсЬдаа	аЬЬдЬаЬдЬд	420
Ьадддддадд	ЬдЬасаддЬс	сЬасаЬддас	дЬдсЬдсЬсд	дсдасддсаЬ	аЬЬсаасдсс	480
дасддсдадс	ЬсЬддаддаа	дсададдаад	асддсдадсЬ	ЬсдадЬЬсдс	ЬЬссаадаас	540
ЬЬдададасЬ	ЬсадсасдаЬ	сдЬдЬЬсадд	дадЬасЬссс	ЬдаадсЬдЬс	садсаЬасЬд	600

- 33 029014

адссаддсББ	дсааддссдд	сааадББдБд	дасаБдсадд	БаасБдаасБ	саББсссББд	660
дБсаБсБдаа	сдББдаБББс	ББддасаааа	БББсаадаББ	сБдасдсдад	сдадсдааББ	720
саддадсБдБ	аБаБдаддаБ	дасдсБддас	БсдаБсБдса	аадБддддББ	сддадБсдад	780
аБсддсасдс	БдБсдссдда	дсБдссддад	аасадсББсд	сдсаддсдББ	сдасдссдсс	840
аасаБсаБсд	БдасдсБдсд	дББсаБсдас	ссдсБдБддс	дсдБдаадаа	дББссБдсас	900
дБсддсБсдд	аддсдсБдсБ	ддадсададс	аБсаадсБсд	БсдасдадББ	сассБасадс	960
дБсаБссдсс	ддсдсааддс	сдадаБсдБд	саддсссддд	ссадсддсаа	дсаддадаад	1020
дБдсдБдсдБ	ддБсаБсдБс	аББсдБсаад	сБсссддБсд	сБддБББдБд	БадаБдссаБ	1080
ддаБсасБда	сасасБаасБ	дддсдсдсад	аБсаадсасд	асаБасБдБс	дсддББсаБс	1140
дадсБдддсд	аддссддсдд	сдасдасддс	ддсадБсБдБ	Бсддддасда	саадддссБс	1200
сдсдасдБдд	БдсБсаасББ	сдБдаБсдсс	дддсдддаса	ссасддссас	дасдсБдБсс	1260
БддББсассБ	асаБддссаБ	дасдсасссд	дасдБддссд	адаадсБссд	ссдсдадсБд	1320
дссдссББсд	аддсддадсд	сдсссдсдад	даБддсдБсд	сБсБддБссс	сБдсддсдас	1380
ддсдадддсБ	ссдасдаддс	сББсдсБдсс	сдсдБддсдс	адББсдсддд	дББссБдадс	1440
Басдасддсс	БсдддаадсБ	ддБдБассБс	сасдсдБдсд	Бдасддадас	дсБдсдссБд	1500
Басссддсдд	Бдссдсадда	ссссаадддс	аБсдсддадд	асдасдБдсБ	сссддасддс	1560
ассааддБдс	дсдссддсдд	даБддБдасд	БасдБдсссБ	асБссаБддд	дсддаБддад	1620
БасаасБддд	дссссдасдс	сдссадсББс	сддссддадс	ддБддаБсдд	сдасдасддс	1680
дссББссдса	асдсдБсдсс	дББсаадББс	асддсдББсс	аддсддддсс	дсддаБББдс	1740
сБсддсаадд	асБсддсдБа	ссБдсадаБд	аадаБддсдс	БддсааБссБ	дБдсаддББс	1800
ББсаддББсд	адсБсдБдда	дддссасссс	дБсаадБасс	дсаБдаБдас	саБссБсБсс	1860
аБддсдсасд	дссБсааддБ	ссдсдБсБсс	адддсдссдс	БсдссБдаБс	ББдаБсБддБ	1920

Бссддсдадд 1930

<210> 12

<211> 547

<212> Белок

<213> АедПорз БаизсБП

<400> 12

МеБ О1и О1и А1а Ηΐ3 О1у О1у МеБ Рго Бег ТЪг ТЪг А1а РБе РБе Рго

1 5 10 15

Беи А1а О1у Беи Ηΐ3 Буз РБе МеБ А1а 11е РБе Беи Ча1 РБе Беи Бег

20 25 30

- 34 029014

Тгр

11е

Ьеи 35

Уа1

Н1з

Тгр

Тгр

Бег 40

Ьеи

Агд

Буз

О1п

Буз 45

О1у

Рго

Агд

Бег

Тгр

Рго

Уа1

11е

О1у

А1а

ТБг

Беи

О1и

О1п

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

50

55

60

Агд

Меб

Н1з

Азр

Тгр

Ьеи

Уа1

О1и

Туг

Беи

Бег

Буз

Н1з

Агд

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

ТБг

Уа1

Азр

Меб

Рго

РЬе

ТБг

Бег

Туг

ТЬг

Туг

11е

А1а

Азр

Рго

Уа1

85

90

95

Азп

Уа1

О1и

Н1з

Уа1

Беи

Ьуз

ТБг

Азп

РЬе

Азп

Азп

Туг

Рго

Буз

О1у

100

105

110

О1и

Уа1

Туг

Агд

Бег

Туг

Меб

Азр

Уа1

Беи

Ьеи

О1у

Азр

О1у

11е

РЬе

115

120

125

Азп

А1а

Азр

О1у

О1и

Беи

Тгр

Агд

Буз

О1п

Агд

Буз

ТЬг

А1а

Бег

РЬе

130

135

140

О1и

РБе

А1а

Бег

Буз

Азп

Беи

Агд

Азр

РБе

Бег

ТБг

11е

Уа1

РЬе

Агд

145

150

155

160

О1и

Туг

Бег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Бег

Бег

11е

Ьеи

Бег

О1п

А1а

Суз

Буз

А1а

165

170

175

О1у

Ьуз

Уа1

Уа1

Азр

Меб

О1п

О1и

Ьеи

Туг

Меб

Агд

Меб

ТЬг

Ьеи

Азр

180

185

190

Бег

11е

Суз

Ьуз

Уа1

О1у

РЬе

О1у

Уа1

О1и

11е

О1у

ТЬг

Беи

Бег

Рго

195

200

205

О1и

Ьеи

Рго

О1и

Азп

Бег

РЬе

А1а

О1п

А1а

РБе

Азр

А1а

А1а

Азп

11е

210

215

220

11е

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агд

РБе

11е

Азр

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

Уа1

Ьуз

Ьуз

РЬе

225

230

235

240

Ьеи

Н1з

Уа1

О1у

Бег

О1и

А1а

Ьеи

Ьеи

О1и

О1п

Бег

11е

Ьуз

Беи

Уа1

245

250

255

Азр

О1и

РЬе

ТЬг

Туг

Бег

Уа1

11е

Агд

Агд

Агд

Ьуз

А1а

О1и

11е

Уа1

260

265

270

О1п

А1а

Агд

А1а

Бег

О1у

Буз

О1п

О1и

Буз

11е

Ьуз

Н1з

Азр

11е

Беи

275

280

285

- 35 029014

Зег Агд 290

РЬе

11е

О1и Ьеи

О1у О1и А1а О1у О1у Азр Азр

О1у

О1у

Зег

295

300

Ьеи

РЬе

О1у

Азр

Азр

Ьуз

О1у

Ьеи

Агд

Азр

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

РЬе

Уа1

305

310

315

320

11е

А1а

О1у

Агд

Азр

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Зег

Тгр

РЬе

ТЬг

Туг

325

330

335

МеЬ

А1а

МеЬ

ТЬг

Ηΐ3

Рго

Азр

Уа1

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

Агд

Агд

О1и

Ьеи

340

345

350

А1а

А1а

РЬе

О1и

А1а

О1и

Агд

А1а

Агд

О1и

Азр

О1у

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

355

360

365

Рго

Суз

О1у

Азр

О1у

О1и

О1у

Зег

Азр

О1и

А1а

РЬе

А1а

А1а

Агд

Уа1

370

375

380

А1а

О1п

РЬе

А1а

О1у

РЬе

Ьеи

Зег

Туг

Азр

О1у

Ьеи

О1у

Ьуз

Ьеи

Уа1

385

390

395

400

Туг

Ьеи

Ηΐ3

А1а

Суз

Уа1

ТЬг

О1и

ТЬг

Ьеи

Агд

Ьеи

Туг

Рго

А1а

Уа1

405

410

415

Рго

О1п

Азр

Рго

Ьуз

С1у

11е

А1а

О1и

Азр

Азр

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

О1у

420

425

430

ТЬг

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

С1у

О1у

МеЬ

Уа1

ТЬг

Туг

Уа1

Рго

Туг

Зег

МеЬ

435

440

445

О1у

Агд

МеЬ

О1и

Туг

Азп

Тгр

О1у

Рго

Азр

А1а

А1а

Зег

РЬе

Агд

Рго

450

455

460

О1и

Агд

Тгр

11е

О1у

Азр

Азр

О1у

А1а

РЬе

Агд

Азп

А1а

Зег

Рго

РЬе

465

470

475

480

Ьуз

РЬе

ТЬг

А1а

РЬе

О1п

А1а

О1у

Рго

Агд

11е

Суз

Ьеи

О1у

Ьуз

Азр

485

490

495

Зег

А1а

Туг

Ьеи

О1п

МеЬ

Ьуз

МеЬ

А1а

Ьеи

А1а

11е

Ьеи

Суз

Агд

РЬе

500

505

510

РЬе

Агд

РЬе

О1и

Ьеи

Уа1

О1и

О1у

Н1з

Рго

Уа1

Ьуз

Туг

Агд

МеЬ

МеЬ

515

520

525

ТЬг

11е

Ьеи

Зег

МеЬ

А1а

Нгз

О1у

Ьеи

Ьуз

Уа1

Агд

Уа1

Зег

Агд

А1а

530 535 540

- 36 029014

Рго Ьеи А1а 545

<210> 13 <211> 1581 <212> ДНК <213> Тг1б1сит игагби <400> 13 абддаадада адаадссдсд дсддсаддда	дссдсаддас	дсдабддсаб	сдбдсадбас	60
ссдсассбсб	бсабсдсддс	ссбддсдсбд	дсссбддбсс	бсабддассс	сббссассбс	120
ддсссдсбдд	ссдддабсда	сбассддссд	дбдаадсасд	адсбддсдсс	дбасадддад	180
дбсабдсадс	дсбддссдад	ддасаасддс	адссдссбса	ддсбсддсад	дсбсдадббс	240
дбсаасдадд	бдббсдддсс	ддадбссабс	дадббсдасс	дссадддссд	сдддсссбас	300
дссдддсбсд	ссдасддссд	сдбсдбдсдд	бддабддддд	асааддссдд	дбдддадасд	360
ббсдссдбса	бдаабссбда	сбддбаббдд	сббасбдсад	ааааассаба	дсббассбдб	420
дбдбдбдсаа	асбаааабад	бббсбббсдд	ааааааааад	дбсддадааа	дбббдбдсба	480
асддадбдда	дбсдасдасд	аадаадсадс	асдддаадда	даадбддбдс	ддссддссбс	540
бсдддсбдад	дббссасадд	дадассддсд	адсбсббсаб	сдссдасдсд	басбабдддс	600
бсабддссдб	бддсдааадс	ддсддсдбдд	сдассбсссб	ддсдадддад	дссддсдддд	660
асссддбсса	сббсдссаас	дассбсдаса	бссасабдаа	сддсбсдаба	ббсббсассд	720
асасдадсас	дадабасадс	адааадбдад	сддадбасбд	сбдссдабсб	ссбббббсбд	780
ббсббдадаб	ббдбдбббда	сааабдасбд	абсабдсадд	дассабббда	асаббббдсб	840
ддааддадаа	ддсасдддда	ддсбдсбдад	абабдассда	дааассддбд	ссдббсабдб	900
сдбдсбсаас	дддсбддбсб	бсссааасдд	сдбдсадабс	бсасаддасс	адсаабббсб	960
ссбсббсбсс	дадасаасаа	асбдсаддбд	адабааасбс	аддббббсад	бабдабссдд	1020
сбсдададаб	ссаддаасбд	абдасдссбб	баббаабсдд	сбсабдсабд	сасасбадда	1080
бсабдаддба	сбддсбддаа	ддбссаадад	сдддссаддб	ддаддбдббс	дсдаассбдс	1140
сддддббссс	сдасаасдбд	сдсббдааса	дсааддддса	дббсбдддбд	дсдабсдасб	1200
дсбдссддас	дссдасдсад	даддбдббсд	сдсддбддсс	дбддсбдсдд	ассдссбасб	1260
бсаадабссс	ддбдбсдабд	аадасдсбдд	ддаадабддб	дадсабдаад	абдбасасдс	1320
ббсбсдсдсб	ссбсдасддс	даддддаасд	бддбсдаддб	асбсдаддас	сддддсддсд	1380
аддбдабдаа	дсбддбдадс	даддбдаддд	аддбддассд	даддсбдбдд	абсдддассд	1440
ббдсдсасаа	ссасабсдсс	асдабсссбб	асссдббдда	сбададбдбд	бадбдбсбса	1500
бббдабббдс	бддббббаба	ббадсаадда	ддбдбабсад	бббабддббб	дсббдбббаб	1560

- 37 029014

ГдддГГсдГд ГдаГдаГсдГ д

1581

<210> 14

<211> 413

<212> Белок

<213> Тг1Г1сит игагГи

<400> 14

МеГ 1

О1и О1и

Буз

Буз 5

Рго

Агд

Агд

О1п

О1у А1а А1а О1у Агд Азр О1у

10

15

11е

Уа1

О1п

Туг

Рго

Н1з

Беи

РБе

11е

А1а

А1а

Беи

А1а

Беи

А1а

Беи

20

25

30

ναι

Беи

МеГ

Азр

Рго

РБе

Нгз

Беи

О1у

Рго

Беи

А1а

О1у

11е

Азр

Туг

35

40

45

Агд

Рго

Уа1

Буз

Н1з

О1и

Беи

А1а

Рго

Туг

Агд

О1и

Уа1

МеГ

О1п

Агд

50

55

60

Тгр

Рго

Агд

Азр

Азп

О1у

Бег

Агд

Беи

Агд

Беи

О1у

Агд

Беи

О1и

РБе

65

70

75

80

ναι

Азп

О1и

Уа1

РБе

О1у

Рго

О1и

Бег

11е

О1и

РБе

Азр

Агд

О1п

О1у

85

90

95

Агд

О1у

Рго

Туг

А1а

О1у

Беи

А1а

Азр

О1у

Агд

Уа1

Уа1

Агд

Тгр

МеГ

100

105

110

О1у

Азр

Буз

А1а

О1у

Тгр

О1и

ТБг

РБе

А1а

Уа1

МеГ

Азп

Рго

Азр

Тгр

115

120

125

Бег

О1и

Буз

Уа1

Суз

А1а

Азп

О1у

Уа1

О1и

Бег

ТБг

ТБг

Буз

Буз

О1п

130

135

140

Ηΐ3

О1у

Буз

О1и

Буз

Тгр

Суз

О1у

Агд

Рго

Беи

О1у

Беи

Агд

РБе

Нгз

145

150

155

160

Агд

О1и

ТБг

О1у

О1и

Беи

РБе

11е

А1а

Азр

А1а

Туг

Туг

О1у

Беи

МеГ

165

170

175

А1а

Уа1

О1у

О1и

Бег

О1у

О1у

Уа1

А1а

ТБг

Бег

Беи

А1а

Агд

О1и

А1а

180

185

190

О1у

О1у

Азр

Рго

Уа1

Нгз

РБе

А1а

Азп

Азр

Беи

Азр

11е

Нгз

МеГ

Азп

195

200

205

- 38 029014

О1у

Зег 210

11е

РНе

РНе

ТНг

Азр 215

ТНг

Зег

ТНг

Агд

Туг 220

Зег

Агд

Ьуз

Азр

Ηΐ3

Ьеи

Азп

11е

Ьеи

Ьеи

О1и

О1у

О1и

О1у

ТНг

О1у

Агд

Ьеи

Ьеи

Агд

225

230

235

240

Туг

Азр

Агд

О1и

ТНг

О1у

А1а

Уа1

Нбз

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

О1у

Ьеи

Уа1

245

250

255

РНе

Рго

Азп

О1у

Уа1

О1п

11е

Зег

О1п

Азр

О1п

О1п

РНе

Ьеи

Ьеи

РНе

260

265

270

Зег

О1и

ТНг

ТНг

Азп

Суз

Агд

11е

Меб

Агд

Туг

Тгр

Ьеи

О1и

О1у

Рго

275

280

285

Агд

А1а

О1у

О1п

Уа1

О1и

Уа1

РНе

А1а

Азп

Ьеи

Рго

О1у

РНе

Рго

Азр

290

295

300

Азп

Уа1

Агд

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

О1у

О1п

РНе

Тгр

Уа1

А1а

11е

Азр

Суз

305

310

315

320

Суз

Агд

ТНг

Рго

ТНг

О1п

О1и

Уа1

РНе

А1а

Агд

Тгр

Рго

Тгр

Ьеи

Агд

325

330

335

ТНг

А1а

Туг

РНе

Ьуз

11е

Рго

Уа1

Зег

Меб

Ьуз

ТНг

Ьеи

О1у

Ьуз

Меб

340

345

350

ναι

Зег

Меб

Ьуз

Меб

Туг

ТНг

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

О1у

О1и

О1у

355

360

365

Азп

Уа1

Уа1

О1и

Уа1

Ьеи

О1и

Азр

Агд

О1у

О1у

О1и

Уа1

Меб

Ьуз

Ьеи

370

375

380

ναι

Зег

О1и

Уа1

Агд

О1и

Уа1

Азр

Агд

Агд

Ьеи

Тгр

11е

О1у

ТНг

Уа1

385

390

395

400

А1а

Ηΐ3

Азп

Ηΐ3

11е

А1а

ТНг

11е

Рго

Туг

Рго

Ьеи

Азр

405

410

<210> 15

<211> 1536

<212> ДНК

<213> АедИорз зре1боШез

<400> 15

абддаадада	адаадссдсд	дсддсаддда	дссдсадбас	дсдабддсаб	сдбдсадбас	60
ссдсассбсб	бсабсдсддс	ссбддсдсбд	дсссбддбсд	бсабддассс	сббссассбс	120
ддсссдсбдд	ссдддабсда	сбассддссд	дбдаадсасд	адсбддсдсс	дбасадддад	180

- 39 029014

дбсабдсадс	дсбддссдад	ддасаасддс	адссддсбда	дасбсддсад	дсбсдадббс	240
дбсаасдадд	бдббсдддсс	ддадбссабс	дадббсдасс	дссадддссд	сдддсссбас	300
дссддссбсд	ссдасддссд	сдбсдбдсдд	бддабддддд	адааддссдд	дбдддадасд	360
ббсдссдбса	бдаабссбда	сбддбаббдд	сббасбдсад	абааабссаб	адсббассбд	420
бдбдбббдса	аасбаааабд	дбббсббдда	аааааааадд	бсддадааад	бббдбдсбаа	480
сддадбддад	бсаасдасда	адаадсадса	сдддааддад	аадбддбдсд	дссддссбсб	540
сдддсбдадд	ббссасаддд	адассддсда	дсбсббсабс	дссдасдсдб	асбабдддсб	600
сабддссдбс	ддсдааадсд	дсддсдбддс	дассбсссбд	дсаадддадд	ссддсдддда	660
сссддбссас	ббсдссаасд	ассббдасаб	ссасабдаас	ддсбсдабаб	бсббсассда	720
сасдадсасд	адабасадса	дааадбдадс	даасбдсбдс	сдсбдббсбс	сабббббдбб	780
аабдадабдб	бдбдбббдад	бдбсбдасас	сабдасбдаб	сабдсаддда	ссабббдаас	840
аббббдсбдд	ааддадаадд	сасддддадд	сбдсбдадаб	абдассдада	аассддбдсс	900
дббсабдбсд	бдсбсаасдд	дсбддбсббс	ссааасддсд	бдсадабббс	асаддассад	960
саабббсбсс	бсббсбссда	дасаасааас	бдсаддбдад	абааасбсад	аббббсадба	1020
бдабссддсб	сдададабсс	аддаасбдаб	дасддсбсаб	дсасдсасдс	баддабсабд	1080
аддбасбддс	бддааддбсс	аададсдддс	саддбддадд	бдббсдсдаа	ссбдссдддд	1140
ббссссдаса	асдбдсдссб	даасадсаад	дддсадббсб	дддбддсдаб	сдасбдсбдс	1200
сддасдссда	сдсаддаддб	дббсдсдсдд	бддссдбддс	бдсддассдс	сбасббсаад	1260
абсссддбдб	сдабдаадас	дсбддддаад	абддбдадса	бдаадабдба	сасдсббсбс	1320
дсдсбссбсд	асддсдаддд	даасдбсдбд	даддбдсбсд	аддассдддд	сддсдаддбд	1380
абдаадсбдд	бдадсдаддб	дадддаддбд	дассддаддс	бдбддабсдд	дассдббдсд	1440
сасаассаса	бсдссасдаб	сссббасссд	сбддасбада	дддадбдбдб	адбдбссабб	1500
бдсбддббба	баббадсаад	даддбдбабс	адббба			1536

<210> 16

<211> 413

<212> Белок

<213> АедИорз зре1боШез

<400> 16

Меб О1и О1и Буз Буз Рго Агд Агд О1п О1у А1а А1а Уа1 Агд Азр О1у

1 5 10 15

11е Уа1 О1п Туг Рго Ηΐ3 Беи РБе 11е А1а А1а Беи А1а Беи А1а Беи

20 25 30

- 40 029014

Уа1

Уа1

Меб 35

Азр

Рго

РЬе

Ηί.8

Ьеи 40

О1у

Рго

Ьеи

А1а

О1у 45

11е

Азр

Туг

Агд

Рго

Уа1

Ьуз

Ηί.8

О1и

Ьеи

А1а

Рго

Туг

Агд

О1и

Уа1

Меб

О1п

Агд

50

55

60

Тгр

Рго

Агд

Азр

Азп

О1у

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

О1у

Агд

Ьеи

О1и

РЬе

65

70

75

80

Уа1

Азп

О1и

Уа1

РЬе

О1у

Рго

О1и

Зег

11е

О1и

РЬе

Азр

Агд

О1п

О1у

85

90

95

Агд

О1у

Рго

Туг

А1а

О1у

Ьеи

А1а

Азр

О1у

Агд

Уа1

Уа1

Агд

Тгр

Меб

100

105

110

О1у

О1и

Ьуз

А1а

О1у

Тгр

О1и

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

Меб

Азп

Рго

Азр

Тгр

115

120

125

Зег

О1и

Ьуз

Уа1

Суз

А1а

Азп

О1у

Уа1

О1и

Зег

ТЬг

ТЬг

Ьуз

Ьуз

О1п

130

135

140

Ηί.5

О1у

Ьуз

О1и

Ьуз

Тгр

Суз

О1у

Агд

Рго

Ьеи

О1у

Ьеи

Агд

РЬе

Шз

145

150

155

160

Агд

О1и

ТЬг

О1у

О1и

Ьеи

РЬе

11е

А1а

Азр

А1а

Туг

Туг

О1у

Ьеи

Меб

165

170

175

А1а

Уа1

О1у

О1и

Зег

О1у

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

Агд

О1и

А1а

180

185

190

О1у

О1у

Азр

Рго

Уа1

Ηίδ

РЬе

А1а

Азп

Азр

Ьеи

Азр

11е

Шз

Меб

Азп

195

200

205

О1у

Зег

11е

РЬе

РЬе

ТЬг

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Агд

Ьуз

Азр

210

215

220

Ηί.5

Ьеи

Азп

11е

Ьеи

Ьеи

О1и

О1у

О1и

О1у

ТЬг

О1у

Агд

Ьеи

Ьеи

Агд

225

230

235

240

Туг

Азр

Агд

О1и

ТЬг

О1у

А1а

Уа1

Ηί.8

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

О1у

Ьеи

Уа1

245

250

255

Рйе

Рго

Азп

О1у

Уа1

О1п

11е

Зег

О1п

Азр

О1п

О1п

РЬе

Ьеи

Ьеи

РЬе

260

265

270

Зег

О1и

ТЬг

ТЬг

Азп

Суз

Агд

11е

Меб

Агд

Туг

Тгр

Ьеи

О1и

О1у

Рго

275

280

285

- 41 029014

Агд А1а 290

О1у О1п Уа1

О1и Уа1 295

РЬе

А1а Азп

Ьеи

Рго 300

О1у

РЬе

Рго

Азр

Азп

Уа1

Агд

Ьеи

Азп

Бег

Ьуз

О1у

О1п

РЬе

Тгр

Уа1

А1а

11е

Азр

Суз

305

310

315

320

Суз

Агд

ТЬг

Рго

ТЬг

О1п

О1и

Уа1

РЬе

А1а

Агд

Тгр

Рго

Тгр

Ьеи

Агд

325

330

335

ТЬг

А1а

Туг

РЬе

Ьуз

11е

Рго

Уа1

Бег

МеБ

Ьуз

ТЬг

Ьеи

О1у

Ьуз

МеБ

340

345

350

Уа1

Бег

МеБ

Ьуз

МеБ

Туг

ТЬг

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

О1у

О1и

О1у

355

360

365

Азп

Уа1

Уа1

О1и

Уа1

Ьеи

О1и

Азр

Агд

О1у

О1у

О1и

Уа1

МеБ

Ьуз

Ьеи

370

375

380

Уа1

Бег

О1и

Уа1

Агд

О1и

Уа1

Азр

Агд

Агд

Ьеи

Тгр

11е

О1у

ТЬг

Уа1

385

390

395

400

А1а

Нгз

Азп

Нгз

11е

А1а

ТЬг

11е

Рго

Туг

Рго

Ьеи

Азр

405

410

<210> 17 <211> 1573 <212> ДНК <213> АедПорз БаизсЬП <400> 17 аБддаадада адааассдсд дсддсаддда	дссдсадБас	дсдаБддсаБ	сдБдсадБас	60
ссдсассБсБ	БсаБсдсддс	ссБддсдсБд	дсссБддБсс	БсаБддассс	дББссассБс	120
ддсссдсБдд	ссдддаБсда	сБассдассд	дБдаадсасд	адсБддсдсс	дБасадддад	180
дБсаБдсадс	дсБддссдад	ддасаасддс	адссдссБса	ддсБсддсад	дсБсдадББс	240
дБсаасдадд	БдББсдддсс	ддадБссаБс	дадББсдасс	дссадддссд	сдддссББас	300
дссдддсБсд	ссдасддссд	сдБсдБдсдд	БддаБддддд	асааддссдд	дБдддадасд	360
ББсдссдБса	БдааБссБда	сБддБасБдд	сББасБдсад	ааааасссаБ	адсББассБд	420
БдБдБдБдса	дасБааааБа	дБББсБББса	Бааааааааа	ддБсддадаа	адБББдБдсБ	480
аасддадБдд	адБсдасдас	даадаадсад	сасдддаадд	адаадБддБд	сддссддссБ	540
сБсддссБда	ддББссасад	ддадассддс	дадсБсББса	Бсдссдасдс	дБасБаБддд	600
сБсаБддссд	Бсддсдааад	дддсддсдБд	дсдассБссс	Бддсдаддда	ддссддсддд	660
дасссддБсс	асББсдссаа	сдассББдас	аБссасаБда	асддсБсдаБ	аББсББсасс	720

- 42 029014

дасасдадса	сдадайасад	садааадйда	дсддадйасй	дсйдссдайс	йссйййййсй	780
дййсййдада	йййдйдйййд	асааайдасй	дайсайдсад	ддассайййд	аасаййййдс	840
йддааддада	аддсасдддд	аддсйдсйда	дайайдассд	адааассддй	дссдййсайд	900
йсдйдсйсаа	сдддсйддйс	ййсссааасд	дсдйдсадай	айсасаддас	садсаайййс	960
йссйсййсйс	сдадасааса	аасйдсаддй	дадайааасй	саддййййса	дйайдайссд	1020
дсйсдадада	йссаддаасй	дайдасддсй	сайдсайдса	сасйаддайс	айдаддйасй	1080
ддсйддаадд	йссаададсд	ддссаддйдд	аддйдййсдс	даассйдссд	дддййссссд	1140
асаайдйдсд	ссйдаасадс	ааддддсадй	йсйдддйддс	сайсдасйдс	йдссдйасдс	1200
сдасдсадда	ддйдййсдсд	сддйддссдй	ддсйдсддас	сдссйасййс	аадайсссдд	1260
йдйсдайдаа	дасдсйдддд	аадайддйда	дсайдаадай	дйасасдсйй	сйсдсдсйсс	1320
йсдасддсда	ддддаасдйс	дйддаддйдс	йсдаддассд	дддсддсдад	дйдайдаадс	1380
йддйдадсда	ддйдадддад	дйддассдда	ддсйдйддай	сдддассдйй	дсдсасаасс	1440
асайсдссас	дайсссййас	ссдсйддасй	ададддадйд	йдйадйдйсс	сайййдаййй	1500
дсйддййййа	йаййадсаад	даддйдйайс	адйййайддй	ййдсййдййс	аййдддййсд	1560
йдйдайдайс	дйд					1573

<210> 18

<211> 415

<212> Белок

<213> АедИорз йаизсЬИ

<400>

18

Мей

О1и

О1и

Ьуз

Ьуз

Рго

Агд

Агд

О1п

О1у

А1а

А1а

Уа1

Агд

Азр

О1у

1

5

10

15

11е

Уа1

О1п

Туг

Рго

Н1з

Ьеи

РЬе

11е

А1а

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

20

25

30

Уа1

Ьеи

Мей

Азр

Рго

РЬе

Н1з

Ьеи

О1у

Рго

Ьеи

А1а

О1у

11е

Азр

Туг

35

40

45

Агд

Рго

Уа1

Ьуз

Н1з

О1и

Ьеи

А1а

Рго

Туг

Агд

О1и

Уа1

Мей

О1п

Агд

50

55

60

Тгр

Рго

Агд

Азр

Азп

О1у

Бег

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

О1у

Агд

Ьеи

О1и

РЬе

65

70

75

80

Уа1

Азп

О1и

Уа1

РЬе

О1у

Рго

О1и

Бег

11е

О1и

РЬе

Азр

Агд

О1п

О1у

85

90

95

Агд

О1у

Рго

Туг

А1а

О1у

Ьеи

А1а

Азр

О1у

Агд

Уа1

Уа1

Агд

Тгр

Мей

- 43 029014

100

105

110

О1у

Азр

Ьуз

А1а

О1у

Тгр

О1и

ТЬг

РЬе

А1а

Уа1

МеЬ

Азп

Рго

Азр

Тгр

115

120

125

Туг

Тгр

Зег

О1и

Ьуз

Уа1

Суз

А1а

Азп

О1у

Уа1

О1и

Зег

ТЬг

ТЬг

Ьуз

130

135

140

Ьуз

О1п

Н18

О1у

Ьуз

О1и

Ьуз

Тгр

Суз

О1у

Агд

Рго

Ьеи

О1у

Ьеи

Агд

145

150

155

160

РЬе

Н18

Агд

О1и

ТЬг

О1у

О1и

Ьеи

РЬе

11е

А1а

Азр

А1а

Туг

Туг

О1у

165

170

175

Ьеи

МеЬ

А1а

Уа1

О1у

О1и

Агд

О1у

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Зег

Ьеи

А1а

Агд

180

185

190

О1и

А1а

О1у

О1у

Азр

Рго

Уа1

Н1з

РЬе

А1а

Азп

Азр

Ьеи

Азр

11е

Н1з

195

200

205

МеЬ

Азп

О1у

Зег

11е

РЬе

РЬе

ТЬг

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Агд

210

215

220

Ьуз

Азр

Ηί.8

Ьеи

Азп

11е

Ьеи

Ьеи

О1и

О1у

О1и

О1у

ТЬг

О1у

Агд

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

Агд

Туг

Азр

Агд

О1и

ТЬг

О1у

А1а

Уа1

Н1з

Уа1

Уа1

Ьеи

Азп

О1у

245

250

255

Ьеи

Уа1

РЬе

Рго

Азп

О1у

Уа1

О1п

11е

Зег

О1п

Азр

О1п

О1п

РЬе

Ьеи

260

265

270

Ьеи

РЬе

Зег

О1и

ТЬг

ТЬг

Азп

Суз

Агд

11е

МеЬ

Агд

Туг

Тгр

Ьеи

О1и

275

280

285

О1у

Рго

Агд

А1а

О1у

О1п

Уа1

О1и

Уа1

РЬе

А1а

Азп

Ьеи

Рго

О1у

РЬе

290

295

300

Рго

Азр

Азп

Уа1

Агд

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

О1у

О1п

РЬе

Тгр

Уа1

А1а

11е

305

310

315

320

Азр

Суз

Суз

Агд

ТЬг

Рго

ТЬг

О1п

О1и

Уа1

РЬе

А1а

Агд

Тгр

Рго

Тгр

325

330

335

Ьеи

Агд

ТЬг

А1а

Туг

РЬе

Ьуз

11е

Рго

Уа1

Зег

МеЬ

Ьуз

ТЬг

Ьеи

О1у

340

345

350

- 44 029014

Ьуз

Меб

Уа1 355

Зег

Меб

Ьуз

Меб

Туг 360

ТИг

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи 365

Ьеи

Азр

О1у

О1и

О1у

Азп

Уа1

Уа1

О1и

Уа1

Ьеи

О1и

Азр

Агд

О1у

О1у

О1и

Уа1

Меб

370

375

380

Ьуз Ьеи Уа1 Зег О1и Уа1 Агд О1и Уа1 Азр Агд Агд Ьеи Тгр 11е О1у 385 390 395 400

ТИг Уа1 А1а Нтз Азп Нтз 11е А1а ТИг 11е Рго	Туг Рго	Ьеи Азр 415
	405	410
<210>	19
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	гем-связывающий домен МЗ26
<220>
<221>	другой_признак
<223>	Хаа = любая аминокислота
<220>
<221>	другой_признак
<222>	(2)..(3)
<223>	Хаа может быть	любой встречающейся в	природе	аминокислотой
<220>
<221>	другой_признак
<222>	(5)..(5)
<223>	Хаа может быть	любой встречающейся в	природе	аминокислотой
<220>
<221>	другой_признак
<222>	(7)..(7)
<223>	Хаа может быть	любой встречающейся в	природе	аминокислотой
<220>
<221>	другой_признак
<222>	(9)..(9)
<223>	Хаа может быть	любой встречающейся в	природе	аминокислотой
<400>	19
РИе Хаа Хаа О1у Хаа Агд Хаа Суз Хаа О1у
1	5	10
<210>	20
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	дикислород-связывающий домен

- 45 029014

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(10)

<223> Хаа = любая аминокислота

<400> 20

А1а О1у О1у Хаа Азр О1и ТЪг ТЪг Зег 1 5

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит аезбяуит

<400> 21

дабддбдасд басдбдсссб ас

<210> 22

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> прямой праймер для первой ПЦР

<400> 22

сбасасбсбб бсссбасасд асдсбсббсс дабсбаассс дсддаддасд асдбдсбс

<210> 23

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> обратный праймер для первой ПЦР

<400> 23

саадсадаад асддсабасд адсбсббссд абсбсдбсдд ддссссадбб дбас

<210> 24

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> прямой праймер для второй ПЦР

<400> 24

аабдабасдд сдассассда дабсбасасб сбббсссбас асд

22

58

54

<210>	25
<211>	18
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>

43

- 46 029014

18

<223> обратный праймер для второй ПЦР

<400> 25

саадсадаад асддсаба

<210> <211> <212> <213>	26 23 ДНК Искусственная
<220> <223>	5'-2 праймер ΌΝΙΜ526
<400>	26
дасдбддбдс бсаасббсдб даб

23

<210> <211> <212> <213>	27 23 ДНК Искусственная
<220> <223>	3'-1 праймер υΝΙΜ526
<400>	27
дссабддада ддабддбсаб саб

23

<210> <211> <212> <213>	28 112 ДНК Тг1б1сит игагби
<400>	28
ддаддасдас дбдсбсссдд асддсассаа ддбдсдсдсс ддсдддабдд бдасдбасдб
дсссбасбсс абддддсдда бддадбабаа сбддддсссс дасдссдсса дс
<210>	29
<211>	112
<212>	ДНК
<213>	АедИорз зре1боШез
<400>	29
ддаддасдас дбдсбсссдд асддсассаа ддбдсдсдсс ддсдддабдд бдасдбасдб
дсссбасбсс абддддсдда бддадбасаа сбддддсссс дасдссдсса дс
<210>	30
<211>	112
<212>	ДНК
<213>	АедИорз баизсЬИ
<400>	30
ддаддасдас дбдсбсссдд асддсассаа ддбдсдсдсс ддсдддабдд бдасдбасдб
дсссбасбсс абддддсдда бддадбасаа сбддддсссс дасдссдсса дс

60

112

60

112

60

112

- 47 029014

<210> 31

<211> 112 <212> ДНК <213> Ьеа тауз

<400> 31

ддаддасдас дбдсбдссдд	асдддасдаа	ддбдадддсс	ддсдддабдд	бдасдбасдб	60
дсссбасбсд абддддсдда	бддадбасаа	сбддддсссс	дасдсддсда	дс	112
<210> 32 <211> 112 <212> ДНК <213> ЗогдЬит. Ысо1ог
<400> 32 ддаддасдас дбдсбдссдд	асдддасдаа	ддбдадддсс	ддсдддабдд	бдасдбасдб	60
дсссбасбсд абддддсдда	бддадбасаа	сбддддассс	дасдсддсда	дс	112
<210> 33 <211> 112 <212> ДНК <213> 0гу2а заб1Уа
<400> 33 ддаддасдас дбдсбссссд	асддсассаа	ддбдсдсдсс	ддсдддабдд	бдасдбасдб	60
дсссбасбсс абддддадда	бддадбасаа	сбддддсссс	дасдсддсда	дс	112
<210> 34 <211> 100 <212> ДНК <213> Тггбгсит. аезбгиит
<400> 34 сдсддаддас дасдбдсбсс	сддасддсас	сааддбдсдс	дссддсддда	бддбдасдба	60
сдбдсссбас бссабддддс	ддабддадба	саасбддддс			100
<210> 35 <211> 77 <212> ДНК <213> Тггбгсит аезбгиит
<400> 35 аасссдсдда ддасдасдбд	сбсссддасд	дсассааддб	дсссбасбсс	абддддсдда	60
бддадбасаа сбддддс					77
<210> 36 <211> 95 <212> ДНК <213> Тггбгсит. аезбгиит
<400> 36 аасссдсдда ддасдасдбд	сбсссддасд	дсассааддб	дсдсдссддс	дддабддбда	60

- 48 029014

сдЬасЬссаЬ ддддсддаЬд дадЬасаасЬ	ддддс	95
<210>	37
<211>	71
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит
<400>	37
аасссдсдда ддасдасдЬд сЬсссддасд	дсассааддЬ	дсдсдссддс	дддаЬддадЬ	60
асаасЬдддд с				71
<210>	38
<211>	100
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит
<400>	38
аасссдсдда ддасдасдЬд сЬсссддасд	дсассааддЬ	дсдсдссддс	дддаЬддЬда	60
сдЬдсссЬас ЬссаЬддддс ддаЬддадЬа	саасЬддддс			100
<210>	39
<211>	77
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит
<400>	39
аасссдсдда ддасдасдЬд сЬсссддасд	дсассаасдЬ	дсссЕасЕсс	аЬддддсдда	60
ЕддадЬасаа сЬддддс				77
<210>	40
<211>	94
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит
<400>	40
аасссдсдда ддасдасдЬд сЬсссддасд	дсассааддЬ	дсдсдссддс	дддаЬддЬда	60
сдЬасссаЬд дддсддаЬдд адЬасаасЬд	дддс			94
<210>	41
<211>	87
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит
<400>	41
аасссдсдда ддасдасдЬд сЬсссддасд	дсассааддЬ	дсдсдссддс	дддаЬасЬсс	60
аЬддддсдда ЬддадЬасаа сЬддддс				87
<210>	42
<211>	81
<212>	ДНК
<213>	Тг1Ё1сит ае351иит

- 49 029014

<400> 42

аасссдсдда ддасдасдбд сбсссддасд дсассааддб асдбдсссба сбссабдддд

сддабддадб асаасбдддд с

<210> 43

<211> 98

<212> ДНК

<213> Тггбгсит аезбтлгт.

<400> 43

аасссдсдда ддасдасдбд сбсссддасд дсассааддб дсдсдссддс дддабддбда

сдбасбасбс сабддддсдд абддадбаса асбддддс

<210> 44

<211> 76

<212> ДНК

<213> Тггбгсит аезбтлгт.

<400> 44

аасссдсдда ддасдасдбд сбсссддасд дсассааддб дсдсдссддс дддабдбсса

бддддсддаб ддадба

<210> 45

<211> 156

<212> ДНК

<213> Тггбгсит аезбглит.

60

81

60

98

60

76

<400> 45
сбдсдссбдб	асссддсддб	дссдсаддас	сссаадддса	бсдсддадда	сдасдбдсбс
ссддасддса	ссааддбдсд	сдссддсддд	абддбдасдб	асдбдсссба	сбссабдддд
сддабддадб	асаасбдддд	ссссдасдсс	дссадс

60

120

156

<210>	46
<211>	66
<212>	ДНК
<213>	Тггбгсит аезбтлгт.
<400>	46
сбдсдссбдб асдбдсссба сбссабдддд сддабддадб асаасбдддд ссссдасдсс
дссадс

60

66

<210> 47

<211> 60

<212> ДНК

<213> Тггбгсит аезбглит.

<400> 47

сбдсдссбдб асссддсддб дссдсаддас сссаадддса бсдсддадда сдасдбсддс

<210> 48

<211> 133

60

- 50 029014

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит аезбУлит

<400> 48

сбссдссбдб асссддсддб дссдсаддас сссаадддса бсдсддадда сдасдбдсбс

ссддасддса ссааддбасд бдсссбасбс сабддддсдд абддадбаса асбддддссс

сдасдссдсс адс

60

120

133

<210> 49

<211> 152

<212> ДНК

<213> Тгтбтсит аезбг^ит

<400> 49 сбдсдссбдб	асссддсддб	дссдсаддас	сссаадддса	бсдсддадда	сдасдбдсбс
ссддасддса	ссааддбдсд	сдссддсддд	абддбдасдб	дсссбасбсс	абддддсдда
бддадбасаа	сбддддсссс	дасдссдсса	дс

60

120

152

<210> 50

<211> 157

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит аезбУлит

<400> 50

сбссдссбдб асссддсддб дссдсаддас сссаадддса бсдсддадда сдасдбдсбс

ссддасддса ссааддбдсд сдссддсддд абддбдасдб ассдбдсссб асбссабддд

дсддабддад басаасбддд дссссдасдс сдссадс

<210> 51

<211> 75

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит аезбУллт

<400> 51

сбссдссбдб асссддсддб дссдсаддас сссаадддса бсдсддадда сдасдбдсбс

ссддасддса ссаад

<210> 52

<211> 147

<212> ДНК

<213> Тг1б1сит аезбУллт

<400> 52

сбссдссбдб асссддсддб дссдсаддас сссаадддса бсдсддадда сдасдбдсбс

ссддасддса ссааддбдсд сдссддсддд абддбдасдб асбссабддд дсддабддад

басаасбддд дссссдасдс сдссадс

60

120

157

60

75

60

120

147

- 51 029014

Claims (1)

1. <claim-text>ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ</claim-text> <claim-text>1. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из:</claim-text> <claim-text>(a) нуклеотидной последовательности, включающей 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11;</claim-text> <claim-text>(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, включающую 5&gt;Е0 ГО N0: 8, 10 или 12;</claim-text> <claim-text>(c) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, модулирующий мужскую фертильность;</claim-text> <claim-text>(й) нуклеотидной последовательности, содержащей по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов из 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, модулирующий мужскую фертильность;</claim-text> <claim-text>(е) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 85% идентичен 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12, где указанный полипептид модулирует мужскую фертильность.</claim-text> <claim-text>2. Кассета экспрессии, содержащая гетерологичный первый полинуклеотид по п.1, функционально связанный с первым гетерологичным промотором, который управляет экспрессией в растении.</claim-text> <claim-text>3. Кассета экспрессии по п.2, дополнительно содержащая второй полинуклеотид, функционально связанный со вторым промотором, который управляет экспрессией в растении, где указанный второй полинуклеотид кодирует полинуклеотид или полипептид, который препятствует функционированию, формированию или распространению мужских гамет.</claim-text> <claim-text>4. Кассета экспрессии по п.3, дополнительно содержащая третий полинуклеотид, функционально связанный с третьим промотором, где указанный третий полинуклеотид кодирует продукт маркерного гена.</claim-text> <claim-text>5. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из:</claim-text> <claim-text>(a) аминокислотной последовательности, включающей 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12;</claim-text> <claim-text>(b) аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12, где указанный полипептид модулирует мужскую фертильность;</claim-text> <claim-text>(c) аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере 50 последовательных аминокислот из 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12, где указанный полипептид модулирует мужскую фертильность; и</claim-text> <claim-text>(й) аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12.</claim-text> <claim-text>6. Растительная клетка, содержащая кассету экспрессии по любому из пп.2-4.</claim-text> <claim-text>7. Растение, содержащее растительную клетку по п.6, где указанным растением предпочтительно является маис, ячмень, просо, пшеница, рис, сорго, рожь, соя, канола, люцерна, подсолнечник, сафлор, сахарный тростник, табак, ЛгаЫйор818 или хлопчатник.</claim-text> <claim-text>8. Растение по п.7, где указанная кассета экспрессии модулирует мужскую фертильность указанного растения по сравнению с контрольным растением.</claim-text> <claim-text>9. Растение по п.8, где указанное растение характеризуется повышенной мужской фертильностью по сравнению с контрольным растением.</claim-text> <claim-text>10. Растение по любому из пп.7-9, где указанный гетерологичный первый полинуклеотид стабильно встроен в геном указанного растения.</claim-text> <claim-text>11. Семя растения по любому из пп.7-10, отличающееся тем, что указанное семя содержит указанный гетерологичный первый полинуклеотид.</claim-text> <claim-text>12. Способ повышения активности и/или уровня полипептида в растении, включающий введение в указанное растение полинуклеотида, функционально связанного с промотором, активным в указанном растении, при этом указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:</claim-text> <claim-text>(a) нуклеотидной последовательности, включающей 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11;</claim-text> <claim-text>(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, включающую 5&gt;Е0 ГО N0: 8, 10 или 12;</claim-text> <claim-text>(c) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, модулирующий мужскую фертильность;</claim-text> <claim-text>(й) нуклеотидной последовательности, содержащей по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов из 8Е0 ГО N0: 7, 9 или 11, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, модулирующий мужскую фертильность;</claim-text> <claim-text>(е) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 85% идентичен 8Е0 ГО N0: 8, 10 или 12, где указанный полипептид модулирует мужскую фертильность; и</claim-text> <claim-text>(Г) нуклеотидной последовательности, включающей в себя 8Е0 ГО N0: 7, 9 и 11.</claim-text> <claim-text>13. Способ по п.12, где экспрессия указанного полинуклеотида модулирует мужскую фертильность указанного растения по сравнению с контрольным растением.</claim-text> <claim-text>14. Способ по п.12 или 13, где экспрессия указанного полинуклеотида обеспечивает мужскую фер- 52 029014</claim-text> <claim-text>тильность растения с мужской стерильностью.</claim-text> <table border="1"> <tr><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text>1</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text>50</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 Т$</claim-text></td><td> <claim-text>5Е£</claim-text></td><td> <claim-text>21</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text>.....САТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном А пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>ЗЕО</claim-text></td><td> <claim-text>28</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>сстссссссс</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном В пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>5ΕΏ</claim-text></td><td> <claim-text>29</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>сстссссссс</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном ϋ пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>5Е0</claim-text></td><td> <claim-text>30</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>сстссссссс</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 маиса</claim-text></td><td> <claim-text>5ΕΩ</claim-text></td><td> <claim-text>31</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>ССТСАССССС</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 сорго</claim-text></td><td> <claim-text>5Е0</claim-text></td><td> <claim-text>32</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>ССТСАССССС</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 риса</claim-text></td><td> <claim-text>5Е0_</claim-text></td><td> <claim-text>_33</claim-text></td><td> <claim-text>ССАССАССАС</claim-text></td><td> <claim-text>СТССТССССС</claim-text></td><td> <claim-text>АССССАССАА</claim-text></td><td> <claim-text>ССТССССССС</claim-text></td><td> <claim-text>ССССССАТСС</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 Т5</claim-text></td><td> <claim-text>5Е0</claim-text></td><td> <claim-text>21</claim-text></td><td> <claim-text>51</claim-text> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАС...</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном А пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>5ЕС</claim-text></td><td> <claim-text>28</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АТСССССССА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном В пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>5Εβ</claim-text></td><td> <claim-text>29</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АтсеессесА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>Геном 0 пшеницы</claim-text></td><td> <claim-text>5Ε0</claim-text></td><td> <claim-text>30</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АТСССССССА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 маиса</claim-text></td><td> <claim-text>5Εβ</claim-text></td><td> <claim-text>31</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АтсеессесА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М826 сорго</claim-text></td><td> <claim-text>5ΕΏ</claim-text></td><td> <claim-text>32</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АТСССССССА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>М526 риса</claim-text></td><td> <claim-text>5Εβ</claim-text></td><td> <claim-text>33</claim-text></td><td> <claim-text>ТСАССТАССТ</claim-text></td><td> <claim-text>ССССТАСТСС</claim-text></td><td> <claim-text>АтееесАссА</claim-text></td><td> <claim-text>ТССАС</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td>