EA027597B1 - Композиция с пробиотической, гепатопротекторной, антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается композиции, улучшающей процессы жизнедеятельности организма в условиях воздействия различных агрессивных факторов за счет комплексного пробиотического, гепатопротекторного, антиоксидантного и иммуномодулирующего действия путем поддержания нормофлоры кишечника, улучшения функционального состояния печени, активизации системы антиоксидантной защиты организма и повышения иммунитета. Заявляемая композиция выполнена в твердой дозированной форме в виде капсул массой 500 мг и содержит ингредиенты, мг/капс.: стерилизованная лиофилизированная культуральная жидкость, содержащая биологически активные метаболиты бактерий Bacillus subtilis штамм ВКПМ № В-2335 - 4,0; экстракт листьев Филантуса амарус - 50,0; таурин - 250,0; цеолит - 196,0.

Description

(57) Изобретение относится к области медицины и касается композиции, улучшающей процессы жизнедеятельности организма в условиях воздействия различных агрессивных факторов за счет комплексного пробиотического, гепатопротекторного, антиоксидантного и иммуномодулирующего действия путем поддержания нормофлоры кишечника, улучшения функционального состояния печени, активизации системы антиоксидантной защиты организма и повышения иммунитета. Заявляемая композиция выполнена в твердой дозированной форме в виде капсул массой 500 мг и содержит ингредиенты, мг/капс.: стерилизованная лиофилизированная культуральная жидкость, содержащая биологически активные метаболиты бактерий ВасШик киЬйИк штамм ВКПМ № В-2335 - 4,0; экстракт листьев Филантуса амарус - 50,0; таурин - 250,0; цеолит - 196,0.

027597 Β1

027597 В1

Изобретение относится к области медицины и касается композиции, улучшающей процессы жизнедеятельности организма за счет обеспечения комплексного пробиотического, гепатопротекторного, антиоксидантного и иммуномодулирующего действия, которая может найти применение для дополнительной профилактической поддержки организма в условиях воздействия различных агрессивных факторов с целью поддержания нормофлоры кишечника, улучшения функционального состояния печени, активизации системы антиоксидантной защиты организма и повышения иммунитета.

Обеспечение улучшения процессов жизнедеятельности организма - важная задача, стоящая перед современным человеком вне зависимости от рода его занятий и характера профессиональной деятельности. Жизнедеятельность организма напрямую связана со здоровьем человека и, прежде всего, с состоянием желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), системы антиоксидантной защиты и иммунитета.

Проблема улучшения процессов жизнедеятельности человека приобретает особую значимость в условиях экологического неблагополучия в большинстве районов мира, проживания в мегаполисах и вблизи вредных производств, в сочетании с дисбиотическими нарушениями состава симбиотической микрофлоры ЖКТ, наблюдаемыми практически у 90% населения [1]. Восстановлению и поддержанию здоровой микрофлоры ЖКТ и наиболее сложного и важного ее биотопа - кишечника - в настоящее время уделяется самое пристальное внимание. Естественная физиологическая микрофлора кишечника может быть значительно нарушена вследствие неподходящего или несбалансированного питания, особенно в совокупности с употреблением алкоголя, смены климата или воды, при стрессах, развитии хронических заболеваний ЖКТ и других органов, в ходе комплексной терапии с использованием антибиотиков или облучения и ряде других ситуаций. Нормальная микрофлора кишечника имеет чрезвычайно важное значение для макроорганизма, так как составляет основу его микроэкологии и оказывает непосредственное и существенное влияние на его состояние, выполняя ряд жизненно важных функций. К наиболее значимым из них относят обменную и синтетическую функции, функцию детоксикации, участие в процессах пищеварения и формирования естественного иммунитета человека, а также обеспечение колонизационной резистентности. Изменение качественного и/или количественного состава кишечного микробиоценоза приводит к нарушению процессов усвоения нутриентов и минорных компонентов пищи и уменьшению поступления в организм человека целого ряда важных биологически активных веществ (БАВ), что проявляется ухудшением процессов его жизнедеятельности. В результате таких нарушений снижается эволюционно созданный барьер колонизационной резистентности макроорганизма и повышается его восприимчивость к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы.

В настоящее время к числу наиболее агрессивных факторов, воздействие которых, прежде всего, и вызывает возникновение нарушений нормальной микрофлоры кишечника, относится прием антибиотиков. Лечение с назначением антибиотиков зачастую является стандартным решением при самых различных заболеваниях, в том числе и таких распространенных, как ангина, бронхит, пневмония, острые кишечные инфекции, пищевые отравления и многие другие подобные патологические состояния. На использовании антибиотиков, причем широкого спектра действия [2-5], основаны известные базовые схемы экстренной профилактики и лечения ряда инфекционных заболеваний бактериальной природы.

При этом следует отметить, что для достижения адекватного уровня антибактериального эффекта подобные препараты, как правило, принимаются часто, длительно и в больших дозировках. Антибактериальные препараты, с одной стороны, позволяют эффективно ингибировать избыточный рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, но с другой, при обычно применяемых схемах их дозирования нередко становятся причиной развития целого ряда побочных явлений со стороны различных органов и систем организма. Прежде всего, они оказывают негативное влияние на состояние микробиоценоза кишечника человека ввиду отсутствия селективности действия антибиотиков на микроорганизмы. Под воздействием антибиотиков, как правило, нарушается баланс качественного и количественного состава микрофлоры, вследствие чего появляются симптомы дисбактериоза. Кроме того, антибактериальные препараты токсичны, обладают неспецифичным бактерицидным действием и могут спровоцировать появление патогенных микроорганизмов, устойчивых к действию используемых антибактериальных средств, вследствие чего антибиотикотерапия требует как минимум последующего восстановления микробиоценоза кишечника.

Для улучшения процессов жизнедеятельности организма человека в условиях воздействия разнообразных агрессивных факторов чрезвычайную важность приобретает также необходимость контроля и поддержания функционального состояния самой крупной железы ЖКТ и одного из самых сложных органов в организме - печени. Печень - один из жизненно важнейших внутренних органов, выполняющих многочисленные физиологические функции, основными из которых являются участие в обмене веществ и пищеварении, обеспечении барьерной или защитной функции. Прежде всего, печень - основной орган детоксикации организма, с помощью которого происходит обезвреживание токсических веществ, попадающих в организм из окружающей среды с воздухом, водой, пищей, а также образующихся в процессе обмена веществ в самом организме, путем превращения их в менее токсичные и легче удаляемые (аммиака, фенола, этанола, ацетона и кетоновых кислот) и удаление из организма избытка гормонов, медиаторов и витаминов. Печень исполняет роль преграды как для вредных продуктов распада, так и для токсичных веществ, попавших в организм с кровью (вирусы, микробы, различные токсины), частично пре- 1 027597 вращая их в безвредные соединения, частично разрушая с помощью химической модификации.

Таким образом, функциональное состояние печени, выполняющей роль биохимической лаборатории организма, оказывает значительное влияние на здоровье человека. Прежде всего, здоровая печень обеспечивает эффективную детоксикацию всего организма от экзо- и эндотоксинов, а любые расстройства ее функционального состояния, рано или поздно, негативно сказываются на состоянии всех органов и систем организма и существенно ухудшают процессы его жизнедеятельности.

При регулировании функций организма с целью улучшения процессов его жизнедеятельности в условиях воздействия разнообразных агрессивных факторов, обязательно следует учитывать, что одним из пусковых механизмов развития в нем различных нарушений является оксидативный стресс - состояние несоответствия уровня продукции свободных радикалов и емкости антиоксидантных систем, вследствие чего формируются предпосылки для избыточного окисления биосубстратов, модификации и необратимого изменения ферментных систем, нарушения структуры и проницаемости биологических мембран, энергетического дефицита и снижения жизнеспособности клеток [6-11]. Оксидативный стресс приводит к значительному увеличению содержания в тканях и в крови водо- и жирорастворимых прооксидантов, прежде всего, активных кислородных метаболитов, продуктов перекисного окисления липидов и оксида азота. Указанные вещества чрезвычайно реактогенны, в связи с чем, неконтролируемое увеличение их содержания в организме вызывает цитотоксические и генотоксические эффекты. При этом происходит как окисление полиненасыщенных жирных кислот мембран, так и изменение белков, часть из которых выполняет ферментативную функцию, а также ДНК, что проявляется в увеличении мутагенных эффектов.

В интактной клетке оксидативные процессы находятся под строгим контролем различных механизмов антиоксидантной защиты, обеспечивающих протекание свободнорадикальных реакций на стационарном уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности клетки. Важную роль в защите организма от активных кислородных радикалов играет система ферментативных (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионзависимые пероксидаза и трансфераза, церулоплазмин, глутатионредуктаза) [12-16] и неферментативных антиоксидантов (тиоловые соединения - глутатион, цистеин, таурин; витамины - аскорбиновая кислота, токоферол, β-каротин; биогенные амины - серотонин, гистамин, катехоламины; олигопептиды - карнитин, карнозин, ансерин, эндорфины, энкефалины; полифенолы; фосфолипиды; убихинон), обладающих способностью в определенных условиях подавлять процессы свободнорадикального окисления [17-21].

Воздействие на организм человека разнообразных агрессивных факторов, прежде всего, приводит к изменениям в состоянии антиоксидантной системы и если ресурсы данной защитной системы исчерпываются, возникает дисбаланс между антиокислительными и окислительными процессами, что имеет решающее значение в генезе различных форм патологии [18, 19]. Наступивший дисбаланс приводит к существенным нарушениям как ферментативного, так и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты.

Вследствие оксидативного стресса происходит повреждение мембран клеток печени - гепатоцитов. При этом изменяется проницаемость клетки и работа молекул-переносчиков, что приводит к нарушению баланса внутри клетки. Происходит разрушение фосфолипидного слоя клеточных мембран, окисляются белки и разрушается ДНК. В итоге, неконтролируемое прогрессирование оксидативного стресса приводит к некрозу и гибели клеток печени.

Не меньшую актуальность в настоящее время для улучшения процессов жизнедеятельности организма человека имеет и проблема нормализации дисфункциональных нарушений иммунной системы путем повышения общей неспецифической резистентности организма. Снижение иммунитета служит дополнительной и прямо сопряженной с воздействием различных агрессивных факторов причиной, приводящей к значительному росту инфекционных поражений печени, и в первую очередь вирусных гепатитов. Независимо от входных ворот вирус в конечном итоге попадает в печень, где оказывает прямое токсическое действие на ее клетки, которое сочетается с иммунно-опосредованным повреждением мембран клеток печени.

В связи с этим, особую актуальность в современной практической медицине приобретает необходимость использования высокоэффективных средств, обладающих расширенным спектром действия, способных обеспечить полифункциональную дополнительную поддержку организма и предотвратить возможности появления отмеченных нарушений в функциональном состоянии его органов и систем, приводящих к ухудшению процессов его жизнедеятельности.

С этой целью все активнее применяют иммунобиологические препараты, спектр которых в настоящее время достаточно широк. Так, при коррекции биоценоза кишечника большой интерес в клинической практике представляют биологические препараты из группы пробиотиков, включающие определенные виды непатогенных для человека микроорганизмов и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию и стабилизацию его микроэкологического статуса [6]. К их числу относятся, прежде всего, бифидо- и лактосодержащие средства для регулирования равновесия кишечной микрофлоры, так как бифидо- и лактобактерии играют важнейшую роль в

- 2 027597 обеспечении нормального функционирования кишечника. В случае возникновения дисбактериоза указанные анаэробные бактерии исчезают в первую очередь.

Для нормализации функционального состояния печени успешно используют препараты для защиты ее клеток (гепатоцитов) - гепатопротекторы. Предназначены гепатопротекторы для создания условий, способствующих восстановлению функционального состояния печени, активизации ее ферментной активности, и, самое важное, повышению сопротивляемости печени воздействию токсических факторов путем предотвращения повреждения ее клеток. Гепатопротекторы обладают избирательным защитным действием в отношении печени. Их системное действие направлено на восстановление гомеостаза в органе, повышение устойчивости гепатоцитов к воздействию агрессивных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени.

Большинство современных гепатопротекторных препаратов, применяемых в практической медицине, производят из растительного сырья. Лекарственные формы представлены либо водно-спиртовыми и сухими экстрактами соответствующих растений, либо извлечениями близких по свойствам компонентов экстракта (легалон, силибор, катерген, валилив, фламин, флакумин и другие). Действующим началом препаратов этой группы являются в основном флаво-ноиды, такие как рутин, кверцетин [24, 25], дигидрокверцетин [26, 27]. Основное неблагоприятное действие препаратов на основе флавоноидов связано с их высоким риском развития побочных эффектов и осложнений вследствие неблагоприятного влияния на ЖКТ, что проявляется, в основном, в виде тошноты, изжоги, диспепсии, рвоты. Указанное существенно ограничивает возможности широкого использования подобных препаратов в практической медицине. К недостаткам подобных препаратов необходимо отнести и их узкую направленность, так как их воздействие направлено преимущественно на печень, в то время как для улучшения процессов жизнедеятельности всего организма необходимо поддерживать и функции ЖКТ, сопротивляемость организма инфекциям. Следует также отметить, что в основной массе эти препараты отличаются высокой стоимостью и при необходимости курсового применения не доступны широким слоям населения.

В настоящее время из числа гепатопротекторов на растительной основе предпочтение отдают средствам, способным оказывать благоприятное воздействие и на измененную микрофлору кишечника, которая участвует в метаболизме желчных кислот, поскольку нарушения функционального состояния печени сопровождаются развитием дисбиотических нарушений в ЖКТ, и кишечная микрофлора не может выполнить присущие ей функции, что, в свою очередь, усугубляет нагрузку на печень. К их числу относится гепатопротекторный пробиотик [28], в состав которого входит экстракт из растений, обладающих гепатопротекторным действием (плоды расторопши пятнистой, или листья артишока полевого, или семена тыквы), антагонистически активные бактерии нормофлоры кишечника (штамм ВШбоЬасЮпит Ътйбит №1 или штамм ЬасФЪасШш ГсгтсШит 90Т-С4, или их смесь), сорбированные на носителе (природные или искусственные вещества, пригодные в качестве сорбентов для бактерий - активированный уголь или коллоидный диоксид кремния, или лигнин гидролизный), и стимулятор размножения бактерий (лактулоза, или лактоза, или лактит).

Входящие в состав средства компоненты в совокупности обеспечивают его способность восстанавливать функциональное состояние и обменные процессы печени, а также биоценоз ЖКТ, оказывать иммуномодулирующее воздействие и повышать неспецифическую резистентность организма в ходе комплексной терапии хронических заболеваний печени и гепатобилиарной системы.

Существенным недостатком указанного средства является использование штаммов бактерий ВтйбоЬаШспит Ътйбит или Ьас1оЪасШи8 ГсгтсШит. которые проявляют благоприятное действие, в основном, в просвете кишечника, вследствие чего эффективность их действия на клетки печени не высока. Кроме того, средство технологически выполнено в двух капсулах, составляющих вместе одноразовую дозу, когда одна капсула, содержащая сорбированные на носителе бактерии нормофлоры кишечника и стимулятор размножения бактерий, размещена внутри другой капсулы, содержащей экстракт из растений, обладающих гепатопротекторным действием. При приеме указанного лекарственного средства возникают затруднения вследствие раздражения слизистых ЖКТ.

Известна также фармакологическая композиция [29], в которой в качестве гепато-протектора применяют биомассу лактобактерий ЬасФЪасШик ааборШик и продуктов их метаболизма, полученную путем культивирования штаммов указанной культуры на обезжиренном молоке с последующим инактивированием и высушиванием их вместе со средой культивирования. Выполнена фармацевтическая композиция в виде таблеток, или драже, или иных дозированных форм и помимо биомассы лактобактерий и продуктов их метаболизма содержит микрокристаллическую целлюлозу, стеарат кальция или магния, аэросил и арабиногалактан при определенном соотношении компонентов.

Фармакологическая композиция обладает антитоксической активностью и способствует повышению устойчивости организма к воздействию бактериальных эндотоксинов, вследствие чего ее рекомендуют использовать для профилактики и лечения острых токсических поражений печени, включая алкогольную интоксикацию. Кроме того, применение фармакологической композиции позволяет активизировать деятельность иммунной системы, нормализовать функциональную активность ЖКТ и улучшить микрофлору кишечника.

К существенным недостаткам данной фармакологической композиции следует отнести низкий уро- 3 027597 вень антагонистической активности в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что связано с незначительным количеством и сравнительно невысоким уровнем активности продуцируемых бактериями БАВ и их недостаточно выраженным разнообразием. В результате указанная фармакологическая композиция не находит практического использования.

Определенный интерес представляет средство Гепатобиол, действующим началом которого служит биомасса живых пробиотических бактерий и продукты их метаболизма [30]. В качестве биомассы бактерий средство содержит бактериальные клетки ВасШиз зиЫШз штамм 3/28 (59Т) в количестве (1-3)-10⁹ кл-см^-3, а также содержит метаболиты бактериальных клеток ВасШиз зиЫШз штамм 3/28 (59Т), полученные путем стерилизующей фильтрации культуральной жидкости. Средство Гепатобиол по технической сущности наиболее близко к заявляемой композиции и принято в качестве прототипа.

Выполнено средство-прототип Гепатобиол в жидкой лекарственной форме для перорального применения и включает действующее начало и вспомогательные вещества (глицерин, пищевой ароматизатор и дистиллированную воду) при определенном соотношении компонентов, мас.%:

Бактериальные клетки ВасШиз зиЬййз 3/28 (59Т) метаболиты бактериальных клеток ВасШиз зиЫШз 3/28 (59Т) глицерин пищевой ароматизатор дистиллированная вода

3-5;

3-5;

10-15;

0,05-0,1;

остальное.

Согласно имеющейся информации, экспериментально установлено, что средство-прототип Гепатобиол не токсично и обеспечивает достаточный уровень гепатозащитных свойств.

Однако, помимо указанных благоприятных эффектов средству-прототипу Гепатобиол характерен ряд существенных недостатков, ограничивающих возможности его применения в клинической медицине. Прежде всего, средство-прототип Гепатобиол отсутствует на рынке и не доступно для населения.

Кроме того, входящие в состав средства-прототипа Гепатобиол бактерии не эквивалентны бактериям собственной эндогенной микрофлоры и, как правило, не способны размножаться в кишечнике. Индивидуальная биосовместимость микроорганизмов, вносимых в составе подобных средств, и микроорганизмов эндогенной микрофлоры кишечника, а также их приживаемость не гарантированы. Соответственно, низка вероятность выполнения указанными бактериями, внесенными в макроорганизм извне, своей основной функции и тем более за короткий промежуток времени.

К существенным недостаткам средства-прототипа Гепатобиол относится и то, что в его составе присутствуют живые клетки бактерий. Данное исключает возможность его использования в клинической медицине одновременно с широким спектром антибактериальных препаратов при рекомендуемых схемах их назначения. Как правило, часть бактерий при таком сочетанном назначении гибнет, а активность оставшихся существенно снижается. В имеющейся информации сведения о возможности сочетанного назначения средства-прототипа Гепатобиол с наиболее широко применяемыми антибактериальными препаратами отсутствуют.

Кроме того, в имеющейся информации отсутствуют данные, подтверждающие, что при использовании средства-прототипа Гепатобиол не снижается терапевтическая эффективность и не изменяются физико-химические свойства основного действующего начала под воздействием таких факторов внешней среды как кислород, влажность и т.п., не нарушаются физиологические функции слизистых, а также способность вызывать аллергические реакции, оказывать раздражающее и сенсибилизирующее действие на макроорганизм.

Устойчивость средства-прототипа Гепатобиол к возможному деструктивному действию входящих в ее состав микроорганизмов, способность сохранять жизнеспособность микробных клеток в составе композиции, препятствовать контаминации их посторонней микрофлорой и возможность продуцирования ими биологически активных веществ также не показаны.

Следует отметить технологическую сложность процесса получения средства-прототипа Гепатобиол, а также то, что аэробные споровые клетки пробиотического штамма бактерий ВасШиз зиЪйШз 3/28 (59Т), составляющие его основу, находятся официально на хранении в музейной коллекции учреждения Министерства обороны. Данное ставит под сомнение возможность беспроблемного получения средствапрототипа Гепатобиол в промышленных условиях.

В связи с отмеченным, необходимость разработки средств, обеспечивающих эффективное профилактическое или терапевтическое действие при нарушении функционального состояния жизненно важных органов и систем организма, по-прежнему не утратила своей актуальности.

Целью изобретения явилось расширение ассортимента средств, способствующих эффективному улучшению процессов жизнедеятельности организма человека в условиях воздействия различных агрессивных факторов за счет создания поликомпонентной композиции на основе сбалансированного комплекса биологически активных веществ, обеспечивающих поддержание нормальной микрофлоры кишечника и достаточный уровень специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, эффективное устранение патоморфологических измене- 4 027597 ний печени, возникших в результате токсического повреждения органа, активизацию системы антиоксидантной защиты и повышение неспецифической резистентности организма, не содержащих опасные для здоровья вещества, нетоксичных, не обладающих сенсибилизирующим действием, способностью к кумуляции, токсическим влиянием на репродуктивную функцию, мутагенным эффектом и отдаленными негативными последствиями, стабильных при хранении и доступных широким слоям населения.

Достижение поставленной цели возможно за счет создания поликомпонентной композиции, сбалансированный качественный и количественный состав которой позволит улучшить процессы жизнедеятельности организма в условиях воздействия различных агрессивных факторов за счет поддержания микробиоценоза кишечника, обеспечения достаточного уровня специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, активизации системы антиоксидантной защиты и повышения неспецифической резистентности организма для устранения дисфункциональных изменений в иммунной системе.

При формировании качественного состава заявляемой композиции исходили из того, что основные ее компоненты в совокупности должны:

оказывать эффективное благоприятное воздействие на микрофлору кишечника и обеспечивать достаточный уровень специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, с которыми, как правило, ассоциированы дисбиотические нарушения данного биотопа;

эффективно устранять патоморфологические признаки цитолиза, возникшие в результате токсического повреждения печени, путем нормализации биохимических и функциональных показателей;

активировать неферментативное звено системы антиоксидантной защиты организма; оказывать стимулирующее действие на механизмы неспецифической резистентности организма.

Для этого в состав заявляемой композиции включены: пробиотическая составляющая, представляющая собой метаболиты пробиотического штамма микроорганизмов, гепатопротектор растительного происхождения, антиоксидант и сорбент-носитель.

Существенное отличие заявляемой композиции от средства-прототипа Гепатобиол состоит в том, что в ее состав включен пробиотический штамм бактерий ВасШик киЫШк ВКПМ № В-2335, а точнее, метаболиты, продуцируемые в процессе культивирования бацилл. Используют указанный штамм бактерий в виде стерилизованной лиофилизированной культуральной жидкости (КЖ), так как именно в ней сконцентрирован уникальный набор БАВ, продуцируемых бациллами в процессе их выращивания. В заявляемой композиции пробиотическая составляющая служит лактогенным фактором, воздействие которого проявляется в селективной стимуляции роста и активности естественной составляющей микрофлоры кишечника - лактобацилл, что и обусловливает один из благоприятных эффектов заявляемой композиции, заключающийся в эффективном поддержании эндогенной микрофлоры кишечника.

Ценность заявляемой композиции состоит и в том, что воздействие БАВ, продуцируемых используемым штаммом ВасШик киЫШк, приводит к синтезу в организме и секреции в кровь ферментов лизоцима и миелопероксидазы. Данное свидетельствует о влиянии заявляемой композиции на факторы неспецифической резистентности организма и обусловливает ее способность стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Способность используемого штамма ВасШик киЫШк повышать фагоцитарную активность макрофагов и тем самым проявлять иммуномодулирующий эффект связана также с синтезом при их глубинном выращивании азотистых оснований и их производных (аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин), которые представляют отдельную группу иммуномодулирующих веществ и содержатся в КЖ в значительных количествах (табл. 1). Для заявляемой композиции это имеет большое значение, так как указанные БАВ способствуют восстановлению функциональной активности единой макрофагальной системы организма, угнетенной вследствие воздействия различных агрессивных факторов, и существенному повышению эффективности неспецифической защиты. Благодаря стимуляции иммунного ответа, заявляемая композиция усиливает защитные функции организма.

В составе заявляемой композиции используют гепатопротектор растительного происхождения, а именно растение Филантус амарус (РНу11ап1ик атагик) семейства молочаевых в виде концентрата его листьев. Листья растения содержат лигнаны, терпены, флавоноиды, танины, стероиды, витамин С, сапонины, полифенольные соединения. Имеются данные, свидетельствующие о проявлении Филантусом амарус:

антимикробной активности [31]; антиоксидантной активности [32];

гепатопротекторной активности при хроническом гепатите В [33] и при отравлении этанолом [34];

радиопротекторной активности [35];

гиполипидемического эффекта [36];

антигипергликемического эффекта [37];

противовоспалительного эффекта [38].

Однако имеющиеся публикации немногочисленны и посвящены изучению клинической эффективности Филантуса амарус при использовании его как моносредства и в основном при лечении вирусного

- 5 027597 гепатита |ТНуадага|ан е1 а1., Гансе! 1988, ТНуадага|ан с1 а1., Ьапсе! 1990, ТНуада-га|ан с1 а1., Ьапсе! 1998]. Сведения по изучению эффективности Филантуса амарус при сочетанном назначении в комплексе с другими препаратами отсутствуют.

В качестве антиоксиданта используют таурин - тиоловое соединение, представляющее 2аминоэтансульфоновую кислоту. Как известно, в организме человека таурин синтезируется в виде сульфокислоты из аминокислоты цистеина [39]. Однако, в организме человека происходит как синтез этого уникального элемента, так и потеря его в связи с чрезмерными нагрузками на уставшую нервную систему и стрессами.

В состав заявляемой композиции таурин введен для восполнения его дефицита в организме и для обеспечения благоприятного влияния, связанного с его выраженными антиоксидантными свойствами. Таурин как участник неферментативного звена антиоксидантной системы защиты организма оказывает существенное влияние на окислительные процессы в митохондриях, возникающие вследствие воздействия агрессивных факторов.

В качестве сорбента-носителя в составе заявляемой композиции используют натуральный микропористый силикатный минерал цеолит, основная функция которого связана с иммобилизацией метаболитов, продуцируемых ВасШиз зиЫШз в процессе культивирования и сконцентрированных в КЖ. Целесообразность использования цеолита в качестве компонента заявляемой композиции определена уникальным химическим строением его молекул, когда возникают оптимальные условия для выполнения функций сорбента и носителя метаболитов ВасШиз зиЫШз. Цеолит, не всасываясь в ЖКТ и проходя транзитом, выполняет транспортировку иммобилизованных на нем метаболитов по всему протяжению кишечника. Пролонгированное высвобождение метаболитов происходит в течение достаточно длительного промежутка времени (до 1 суток).

Немаловажно и то, что благодаря уникальному химическому строению молекул цеолит обладает выраженным свойством избирательной сорбции и обеспечивает селективное связывание и выведение из организма низкомолекулярных токсинов, супероксидных радикалов (Н, ОН, Н₂О₂ и т.д.), тяжелых металлов и радионуклидов, проявляя свойства антиоксиданта и внося вклад в защиту тканей и клеток организма от оксидативного стресса. При этом не происходит прямого взаимодействия с полезными нутриентами (витаминами, аминокислотами, белками и другими) и даже улучшается их биодоступность.

Кроме того, цеолит обладает ионообменными свойствами, так как основной скелет его кристаллической решетки состоит, прежде всего, из тетраэдр и имеет полости, в которых находятся ионы (натрия, калия, кальция), легко обменивающиеся между собой и с окружающим субстратом. Цеолит, проходя транзитом по всему протяжению ЖКТ, участвует в селективном ионообмене и служит дополнительным источником необходимых организму микроэлементов. Частицы используемого цеолита имеют размеры не более 500 мкм и овальную форму кристалла, что исключает образование микротравм в кишечнике и полностью безопасно.

Заявляемая композиция выполнена в твердой дозированной форме в виде капсул (или саше), а количество ингредиентов в одной капсуле массой 500 мг составляет, мг/капс.:

Стерилизованная лиофилизированная культуральная жидкость, содержащая биологически активные метаболиты бактерий ВасШиз зиЫШз штамм ВКПМ№ В-2335, 4,0;

экстракт листьев Филантуса амарус 50,0;

таурин 250,0;

цеолит 196,0.

Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1. Получение заявляемой композиции в твердой дозированной форме (капсул или саше) для перорального введения.

Выполнена заявляемая композиция в твердой дозированной форме (капсул или саше), что не только существенно упрощает ее использование при пероральном приеме, но и обеспечивает надежную защиту входящих в ее состав компонентов от воздействия факторов, которые могут вызвать их деградацию.

Получают заявляемую композицию вначале в виде порошка, для чего выполняют следующий алгоритм действий. Выращивают микроорганизмы ВасШиз зиЫШз ВКПМ № В-2335 методом глубинного культивирования в биологическом реакторе (ферментере). По окончании процесса культивирования КЖ с микроорганизмами подвергают центрифугированию для отделения и последующего удаления живых клеток микроорганизмов, а затем стерилизуют. Перед стерилизацией КЖ смешивают с цеолитом, предварительно измельченным до частиц размером не более 500 мкм. Полученную смесь подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных метаболитов продуцента на частицах цеолита. Далее в массу добавляют последовательно в необходимых количествах экстракт листьев Филантуса амарус и таурин, и помещают в резервуар установки для гранулирования с целью смешивания и досушивания. После выгрузки массу просеивают на вибросите и передают на стадию капсулирования или заполнения саше.

- 6 027597

В качестве сорбента-носителя используют цеолит природный - натуральный микропористый силикатный минерал Холинского месторождения (Бурятия) (ООО КРАФТ, Санкт-Петербург) [40-43].

Как видно, процесс получения заявляемой композиции в твердой дозированной форме для перорального введения (капсул или саше) достаточно прост, а используемые при этом ингредиенты выпускаются в промышленных условиях, доступны и недороги.

Пример 2. Оценка безопасности заявляемой композиции.

Безопасность заявляемой композиции оценивали по результатам санитарно-химического анализа, микробиологических исследований, а также путем определения ряда токсикологических и других характеристик: острой токсичности, хронической токсичности и способности к кумуляции, возможного местно-раздражающего действия на слизистую пищевода, раздражающего действия на кожу и глаза, ингаляционного воздействия пылью, сенсибилизирующего действия, возможных отдаленных последствий.

Санитарно-химический анализ.

Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-94 Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт. Свинец и кадмий определяли по ГОСТ 30178-96 Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт. Мышьяк определяли согласно ГОСТ 26930-86 Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка. Ртуть определяли согласно Методическим указаниям по обнаружению и определению содержания общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции (№ 5178-90).

Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли согласно Методическим указаниям по определению остаточных количеств хлорорганических пестицидов (№ 1766-77) и официальным методам анализа АОАС (ΟΙΤίείαΙ теШойк οί апа1у818 οί 1Пс АОАС, 1984, 141П ей., СЬар!ег 29, р. 537538).

Исследования проводили с использованием весов лабораторных ВЛР-500, газожидкостного хроматографа Карло Эрба (модель НКОС 5700), обменных клеток итальянской фирмы ТехпорйМ.

Результаты проведенных измерений представлены в табл. 2 и 3 и свидетельствуют, что в заявляемой композиции содержание токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДЦТ) и опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) не превышает допустимые уровни, установленные Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 О безопасности пищевой продукции (приложение 3, раздел 10) [44]. Такие же пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой композиции не обнаружены.

Микробиологические исследования.

Микробиологические исследования проводили в соответствии с требованиями методических указаний МУК 4.2.577-96 Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов и МУК 2.3.2.721-98 Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище, ГОСТ Р 52814-2007 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода 8а1топе11а, ГОСТ Р 52815-2007 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и §1арйу1ососси8 аигоик, ГОСТ Р 52816-2007 Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий), ГОСТ 10444.8-88 Продукты пищевые. Метод определения ВасШик сегеик, ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов, ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида ЕксйепсЫа сой.

Результаты оценки микробиологических показателей безопасности представлены в табл. 4 и свидетельствуют, что по микробиологическим показателям безопасности заявляемая композиция соответствует требованиям, установленным Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 О безопасности пищевой продукции (приложения 1 и 2, раздел 1.9).

Исследование острой токсичности.

Заявляемую композицию вводили здоровым беспородным белым крысам обоих полов массой тела 130-150 г и 180-200 г внутрижелудочно в виде водных суспензий через металлический атравматичный зонд, медленно погружая его до желудка. Исследования проводили с использованием пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону в модификации З. Рота [45]. В ходе эксперимента были сформированы две группы по 10 животных в каждой: опытная (вводили заявляемую композицию два раза в день в максимально переносимой дозе - 15 г/кг) и контрольная (вводили эквивалентные объемы дистиллированной воды). Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%).

Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 14 суток с регистрацией показателей: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, результаты ежедневного наблюдения общего состояния и поведения, взвешивания, результаты контроля потребления корма и воды, результаты вскрытия и макроскопического описания погибших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), результаты определения массовых коэффициентов внутренних органов.

- 7 027597

Введение заявляемой композиции в максимально переносимых дозах не вызывало гибели подопытных животных. Не отмечали и какие-либо другие признаки негативного действия заявляемой композиции. В частности, не отмечали какие-либо диспепсические явления. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению животные опытной и контрольной групп не отличались.

Результаты изучения динамики изменения массы тела подопытных животных, получавших заявляемую композицию, в течение 14 суток наблюдения за ними позволили установить, что динамика массы тела животных опытной и контрольной групп практически не различалась (табл. 5).

Вскрытие животных опытной группы, проведенное через день после острого введения заявляемой композиции, позволило установить, что листки плевры и органы грудной клетки не изменены. Легкие бледно-розовые, воздушные, без уплотнений на ощупь. Размеры сердца в пределах нормы. В полостях сердца содержится небольшое количество жидкой крови. Мышца сердца плотная, коричневой окраски. Желудок заполнен небольшим количеством плотной пищи. Слизистая оболочка блестящая, складчатая, слегка розоватой окраски.

Слизистая тонкого кишечника блестящая, гладкая, розоватой окраски. Размеры и форма печени не отличаются от контроля. Поверхность печени гладкая. Капсула тонкая, прозрачная. Рисунок печени на разрезе не изменен. Ткань печени умеренно полнокровна. Почки обычной величины и формы, коричневатого цвета, плотные, с отчетливыми корковым и мозговым веществом на разрезе. Щитовидная железа, надпочечники и поджелудочная железа по внешнему виду не отличаются от контроля. При осмотре гистологических препаратов желудка и паренхиматозных органов отличий в структуре между опытной и контрольной группами не обнаружено.

Сосуды легких были умеренно полнокровны. Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не представлял. Альвеолы были заполнены воздухом. Отека либо воспаления легочной ткани не наблюдалось. Миофибриллы левого желудочка сердца и межжелудочковой перегородки имели отчетливую поперечную исчерченность, ядра кардиомиоцитов были светлыми. Сосуды миокарда умеренно полнокровные. Дольчатое строение печени сохранялось. Границы гепатоцитов были четкими, цитоплазма гепатоцитов - слабобазофильной, зернистой. Ядра были с достаточным содержанием хроматина и тонкой ядерной мембраной.

Эпителий извитых канальцев почек изменений не представлял. Цитоплазма его была зернистой, оксифильной, ядра светлыми. Сосуды клубочков умеренно полнокровные.

Строение слизистой оболочки фундальной части желудка не отличалось от контроля. Ядра эпителия слизистой и желез были светлыми. В базальных отделах желез сохранилась зернистость в цитоплазме. Эпителий ворсинок и крипт слизистой тонкой кишки был сохранен, в криптах присутствовали митозы.

При окраске замороженных срезов печени Суданом IV признаков жировой дистрофии не наблюдалось.

Анализ величин массовых коэффициентов (МК) органов белых крыс позволил установить, что острое введение им заявляемой композиции в максимально переносимой дозе не вызывает какие-либо достоверные отличия по сравнению с контрольной группой животных, получавших дистиллированную воду (табл. 6).

Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за подопытными животными на протяжении 14 суток после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести заявляемую композицию к нетоксичным (относительно безвредным по С.Д. Заугольникову) и малоопасным (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007) веществам.

Исследование хронической токсичности и способности к кумуляции.

Исследования хронической токсичности проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г при введении заявляемой композиции внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в течение 30 дней при суточной дозе 1,5 г/кг. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в аналогичном объеме.

Измерение основных физиологических показателей осуществляли через 30 дней хронического ежедневного введения заявляемой композиции.

В течение всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдали. Общее состояние и поведение подопытных животных оставалось нормальным и не отличалось от контрольной группы в течение всего эксперимента.

Результаты изучения интегральных показателей общей токсичности, представленные в табл. 7 и 8, свидетельствуют, что ни по одному из анализируемых показателей не было выявлено статистически значимых различий с контрольной группой животных, получавших дистиллированную воду (р>0,05 при 95% уровне вероятности) или патологических отклонений за пределы варьирования физиологической нормы.

Вскрытие крыс, умерщвленных на следующий день после последнего введения заявляемой композиции, показало, что размеры, форма и окраска их внутренних органов не имели макроскопических изменений по сравнению с контрольной группой. Слизистая оболочка желудка и тонкого кишечника были блестящими, бледно-розовыми, без признаков раздражения или воспаления.

- 8 027597

Гистологическое исследование препаратов легких, миокарда, печени, почек и слизистой желудка подопытных животных, получавших заявляемую композицию, не выявило дистрофических, воспалительных или некробиотических изменений органов.

Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не имел, альвеолы были воздушными. Ателектазов либо отека легочной ткани не наблюдалось. Поперечная исчерченность миофибрилл миокарда была отчетливой. Строение печени нарушений не имело. Границы гепатоцитов были отчетливые, цитоплазма зернистая, слабобазофильная, ядра светлые с тонкой мембраной и отчетливыми ядрышками. Нефроэпителий с оксифильной зернистой цитоплазмой и светлыми четкими ядрами. Эпителий слизистой желудка сохранен, главные и обкладочные клетки желез желудка не изменены.

Следовательно, хроническое внутрижелудочное поступление заявляемой композиции в организм подопытных животных не вызывает дистрофических или деструктивных изменений паренхиматозных органов и не сопровождается раздражением слизистых оболочек ЖКТ. Таким образом, по интегральному показателю кумуляции и показателям общей нелетальной токсичности заявляемая композиция не обладает способностью к кумуляции и нетоксична.

Исследование возможного местно-раздражающего действия.

Местно-раздражающее действие заявляемой композиции оценивали на модели мерцательного эпителия пищевода лягушки. Цитотоксический эффект изучали на болотных лягушках Капа (строгала массой тела 25 г. После обездвиживания путем разрушения спинного мозга и фиксации животных на пробковом столе вскрывали грудную клетку, выделяли пищевод и рассекали в каудальном направлении. Над глоточной частью пищевода устанавливали две штанги. В ходе эксперимента регистрировали время прохождения пробковой крошкой участка пищевода длиной 10 мм, ограниченного штангами, до и после нанесения на слизистую оболочку пищевода дистиллированной воды или заявляемой композиции в виде порошка в количестве 50 мг. Продолжительность воздействия составляла 1 мин.

Экспериментально установлено, что нанесение на слизистую оболочку пищевода заявляемой композиции в виде порошка не влияет на двигательную функцию мерцательного эпителия пищевода лягушки (табл. 9). Таким образом, заявляемая композиция не оказывает местно-раздражающее действие.

Исследование действия на кожу и глаза.

Действие на кожу и кожно-резорбтивное действие изучалось на белых крысах-самках массой тела 130-150 г. После помещения животных в специальные домики их хвосты на 2/3 помещали на 4 ч в кашицу, которую получали, смешивая заявляемую композицию в виде порошка с холодной водой в количествах соответственно 90 и 10%. Через 1 и 16 ч после окончания однократной аппликации не отмечалось эритемы или отека кожи хвостов (величина отека оценивалась путем измерения толщины хвоста в средней части при помощи толщинометра типа ТР-1-10). Установлено, что 20-кратная аппликация не вызывала гибели подопытных животных и не выявляла раздражающего действия на кожу в течение последующего 5-дневного срока наблюдения.

Морфологически кожа хвостов в месте нанесения порошка изменений не имела. Эпидермис и придатки кожи также были без изменений. Слои эпидермиса были отчетливо выражены, базальная мембрана сохранена. Эпителиальные клетки наружных и внутренних корневых влагалищ волосяных фолликулов и соединительно-тканная сумка хорошо выражены.

Макроскопические и микроскопические изменения внутренних органов у подопытных животных отсутствовали.

Изучение морфологических, биохимических, гематологических и физиологических показателей белых крыс не выявило достоверных отличий от контрольной группы животных, хвосты которых помещали в воду.

Следовательно, заявляемая композиция не обладает раздражающим действием на кожу и кожнорезорбтивным действием, т.е. нетоксична при попадании на кожу или при контакте с ней.

Исследовали также раздражающее действие заявляемой композиции на слизистую оболочку глаза кролика. В ходе эксперимента установлено, что через 1 мин после однократного внесения заявляемой композиции в виде порошка в количестве 50 мг в конъюнктивальный мешок глаза кролика появились умеренная гиперемия и слезотечение, сопровождавшиеся непродолжительным блефароспазмом, что можно расценить как реакцию на индифферентное механическое инородное тело. Полнокровие сосудов сохранялось не более 20 мин, а через 40-45 мин все возникшие явления раздражения полностью прошли. Следовательно, заявляемая композиция обладает слабым раздражающим действием на слизистую оболочку глаза кролика, как любая механическая пыль.

Исследование ингаляционного воздействия пылью.

Однократное динамическое ингаляционное воздействие заявляемой композиции в виде порошка на белых крыс-самок массой тела 130-150 г производили в течение 2 ч в стандартных камерах Б.А. Курляндского объемом 200 л. Скорость подачи воздуха составляла 60 л/мин при температуре 20°С. Максимально возможные концентрации пыли, которые в ходе эксперимента определяли гравиметрическим методом, достигали с помощью пылевых распылителей. Пробы воздуха отбирали через каждые 30 мин. В ходе эксперимента средняя концентрация пыли составила 55,5±3,5 г/м³.

Как в ходе воздействий, так и после них у подопытных животных не наблюдалось летальных исхо- 9 027597 дов, а лишь признаки пылевого (механического) раздражения верхних дыхательных путей (чихание, груминг) и глаз (лакримация), а также беспокойство.

Вскрытие умерщвленных животных не выявило изменений, кроме умеренного полнокровия внутренних органов. В дыхательных путях определялись частички порошка заявляемой композиции.

Следовательно, острое ингаляционное воздействие пылью заявляемой композиции не представляет опасности, так как не вызывает признаков отравления, а лишь способна незначительно раздражать верхние дыхательные пути и глаза, как любая механическая пыль.

Исследование сенсибилизирующего действия.

Изучение сенсибилизирующего действия заявляемой композиции проводили на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха животных туберкулиновым шприцем вводили однократно 0,02 мл водного разведения заявляемой композиции в дозе 10 мг/кг, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2x2 см наносили и фиксировали заявляемую композицию в виде порошка из расчета 20 мг/см². Забор крови у животных осуществляли через 3 ч после постановки кожных проб.

Результаты оценки влияния заявляемой композиции на показатели сенсибилизирующего действия представлены в табл. 10 и свидетельствуют об отсутствии признаков сенсибилизации в периферической крови - эозинофилии или увеличения уровня лизиса в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) по сравнению с контролем. При осмотре кожи спины подопытных животных признаков раздражения не отмечалось. Следовательно, заявляемая композиция при эпикутанном контакте не обладает сенсибилизирующим действием, т.е. не провоцирует развитие аллергии.

Исследование возможных отдаленных последствий.

Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводили в соответствии с методическими рекомендациями по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [46,47]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [48, 49].

Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов заявляемой композиции при введении ее в течение 10 дней в дозе 1 г/кг, проведенного через 15 дней после окончания ее введения, свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности (табл. 11). Угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций также не наблюдалось.

Следовательно, заявляемая композиция не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о ее безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий у человека.

Пример 3. Оценка стабильности заявляемой БАД в процессе хранения.

Исследовали возможность сохранения качественного состава заявляемой композиции в виде порошка и ее безопасности и устанавливали гарантированный срок годности в случае хранения при различных температурах и без использования специального оборудования.

В ходе эксперимента порошок закладывали в 100 потребительских упаковок в виде двойных полиэтиленовых пакетов и хранили их в течение 2,5 лет при температурах 5±2, 10±3, 25±5, 35±6°С, закладывая 25 упаковок на каждый температурный режим. Через каждые 6 месяцев хранения отбирали по 5 упаковок от соответствующего температурного режима и определяли характеристики порошка: влажность, амилолитическую и протеолитическую активности, содержание таурина, адсорбционную активность по индикатору метиленовому синему, микробиологическую чистоту. Для оценки возможных изменений указанных характеристик при хранении определяли их значения в начале исследований.

Данные, представленные в табл. 12, свидетельствуют о том, что при выбранных для испытаний температурных режимах хранения (от 5 до 40°С) оцениваемые показатели практически не изменились при хранении в течение 2,5 лет. Средние значения показателей составили: массовая доля влаги 7,0±0,2%, амилолитическая активность - 1,8±0,3 ед. АА/г, протеолитическая активность - 0,4±0,09 ед. ПА/г, содержание таурина - 255,3 мг/г, адсорбционная активность по индикатору метиленовому синему 4,0 мг/г. Микробиологическая чистота заявляемой композиции, оцениваемая отсутствием в ней патогенных микроорганизмов (Ркеиботопак аегидшока, ЕтсгоЬас1спассас. §1арйу1ососсик аигеик и ВасШик сегеик), сохранялась в течение 2,5 лет, т.е. весь период исследований.

Таким образом, гарантированный срок хранения заявляемой композиции, выполненной в твердой форме в виде порошка, составляет не менее 2,5 лет при температуре не выше 40°С при условии соблюдения сохранности упаковки. Особые температурные условия хранения или использование специального оборудования при этом не требуются.

Пример 4. Исследование пробиотической активности заявляемой композиции.

Пробиатическую активность заявляемой композиции оценивали по влиянию метаболитов ВасШик киЫШк ВКПМ № В-2335 на рост и активность живых пробиотических лактобацилл Ьас1оЬасШик р1айагит 8К-А3, близких естественной составляющей эндогенной микрофлоры кишечника.

- 10 027597

В ходе эксперимента ίη νίίτο исследовали антагонистическую активность метаболитов ВасШик киЬ(Шк ВКПМ № В-2335 в отношении живых лактобацилл ЬасЮЬасШик р1ап1агиш 8К-Л3, а также их влияние на рост и активность указанных лактобацилл. При этом активность лактобацилл ЬасЮЬасШик р1ап1агиш

8К.-Л3 оценивалась по уровню их специфической антибактериальной активности в отношении ряда условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, эшерихий, псевдомонад).

Исследования проводили с использованием:

метода прямого антагонизма путем прямого нанесения стерильных метаболитов бактерий ВаеШик киЫШк ВКПМ № В-2335 или живых лактобацилл ЬасЮЬасШик р1ап1агиш 8К.-Л3 в лунки или на поверхность твердой питательной среды (агар МРС 4) сразу же после посева в нее лактобацилл ЬасЮЬасШик р1ап1агит 8К.-Л3 или индикаторных тест-культур с последующей инкубацией в течение 24 ч при температуре 37°С;

метода двухслойного агара [50], при котором в нижний слой твердой питательной среды (агар МРС 4) вносили суспензию метаболитов ВасШик κυόίίΐίκ ВКПМ № В-2335 или живые лактобациллы ЬасЮЬасШик р1ап1агит 8К-Л3, а в верхний слой засевали лактобациллы БасЮкасШик р1ап1агит 8К-Л3 или индикаторные тест-культуры.

Метаболиты ВасШик киЬИПк ВКПМ № В-2335 вводили в концентрациях 1 г или 0,1 г в 10 мл агара.

Лактобациллы засевали в различных количествах, составляющих 7 1д КОЕ/мл - 2 1д КОЕ/мл.

В качестве тест-культур условно-патогенных микроорганизмов использовали §1арйу1ососик аигеик 209, ЕксйепсЮа сой М15 и Ркеиботопак аегидшока.

С использованием методов прямого антагонизма и двухслойного агара установлено, что метаболиты ВасШик киЬОПк ВКПМ № В-2335 не оказывают ингибирующий эффект на рост лактобацилл ЬасЮЬасШик р1ап1агит 8К-Л3.

Также установлено, что метаболиты ВасШик киЬОПк ВКПМ № В-2335 как лактогенный фактор стимулируют рост пробиотических лактобацилл. В присутствии метаболитов ВасШик киЬОНк ВКПМ № В2335 вырастало большее количество (в четыре и более раз) лактобацилл ЬасЮЬасШик ркпИагит 8К-Л3 (табл. 13). Колонии лактобацилл при посеве 50 колоний на чашку Петри и росте в присутствии метаболитов ВасШик киЬийк ВКПМ № В-2335 в 2 раза крупнее, их диаметр увеличивался с 1 мм до 2 мм по сравнению с контролем (без добавления метаболитов ВасШик киЬйПк ВКПМ № В-2335).

В присутствии метаболитов ВасШик киЬОПк ВКПМ № В-2335 антибактериальные эффекты лактобацилл ЬасЮЬасШик ркпИагит 8К.-Л3, т.е. их специфическая антагонистическая активность, в отношении стафилококков, эшерихий и псевдомонад существенно возрастала (табл. 14-16).

Таким образом, экспериментально установлено, что метаболиты ВасШик киЬйПк ВКПМ № В-2335 в составе заявляемой композиции представляют лактогенный фактор и стимулируют рост лактобацилл и их специфическую антагонистическую активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов, чем и обусловлено благоприятное воздействие заявляемой композиции на естественную эндогенную микрофлору кишечника.

Пример 5. Исследование иммунотропных эффектов заявляемой композиции.

Исследования, предусматривающие оценку способности заявляемой композиции оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма, выполнены на белых беспородных мышах массой тела 18-23 г. В эксперименте использовали 80 животных, которые были распределены на две группы по 40 особей в каждой: контрольную (получали изотонический раствор хлорида натрия) и опытную (получали заявляемую композицию).

Заявляемую композицию вводили в течение 7 суток перорально 1 раз в сутки в дозе 150 мкг/мышь. Оценку эффекта воздействия осуществляли через 1, 3 и 7 суток. Для этого у животных контрольной и опытной групп проводили забор крови для исследования, причем забор крови проводили до начала исследований и затем спустя 1, 3 и 7 сут. На каждом этапе исследования забор материала проводили от 10 животных из группы, индивидуально от каждой мыши после ее декапитации.

Динамику изменений факторов неспецифической резистентности оценивали путем определения функционального состояния клеток фагоцитарной системы (переваривающей активности гранулярных лейкоцитов), а также концентрации в сыворотке крови ферментов лизоцима и миелопероксидазы, являющихся медиаторами межклеточного взаимодействия при развитии иммунного ответа на любое антигенное воздействие.

Переваривающую активность гранулярных лейкоцитов периферической крови подопытных животных оценивали по методу Зеленовой Е.Г. и Никифорова В.А. (1972). Сыворотку получали по стандартной методике, отделяя сгусток крови от жидкой фазы. Для оценки функционального состояния фагоцитирующих клеток кровь забирали в пробирки, предварительно обработанные силиконом (Зег\'а. Германия) и содержащие раствор гепарина из расчета 20 ЕД на 1 мл крови.

Фагоцитарный индекс (Фи), представляющий отношение выраженности поглотительной и переваривающей функций фагоцитирующих клеток, определяли через 15 и 30 мин инкубации с тест-объектом фагоцитоза, в качестве которого использовали тест-микроб (М. 1укобе1сйсик), выращенный на мясопептонном агаре в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч. В качестве оцениваемого показателя служил индекс переваривающей активности гранулярных лейкоцитов (ИП), представляющий отношение

- 11 027597 количества фагоцитирующих клеток в мазке через 30 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза к количеству фагоцитирующих клеток в мазке через 15 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза.

Значения ИП определяли по формуле:

ИП = В: А, (1) где А - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 15 мин инкубации;

В - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 30 мин инкубации.

Величину ИП выражали в условных единицах. Экспериментальные данные по оценке функционального состояния гранулярных лейкоцитов периферической крови мышей, получавших заявляемую композицию (фиг. 1), свидетельствуют, что применение заявляемой композиции способствует существенному повышению функциональной активности гранулярных лейкоцитов периферической крови, так как значения ИП значительно превышают уровень показателя контрольной группы (различия с группой контроль достоверны при р<0,05).

Концентрацию лизоцима в сыворотке крови определяли по методу Бухарина О.В. с соавт. (1974). Для этого кровь подопытного животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Затем 0,1 мл сыворотки крови переносили в бактериологическую пробирку и добавляли 0,9 мл физиологического раствора. Полученную смесь перемешивали и добавляли к ней 1,5 мл суспензии тест-микроба, которую предварительно стандартизовали на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М до экстинкции 0,66.

Готовую суспензию, содержащую тест-микроб и исследуемую сыворотку, перемешивали и помещали в термостат на 30 мин при температуре 37°С. По истечении времени инкубации пробирки вынимали из термостата и определяли экстинкцию материала. Полученные величины экстинкций с помощью специальных таблиц переводили в значения, характеризующие концентрацию лизоцима в сыворотке крови, и выражали в мкг/мл.

Уровень миелопероксидазы (МПО) в сыворотке крови определяли по методу, разработанному на основании общепринятых подходов к выявлению этого субстрата в сыворотке крови и иммунокомпетентных клетках (Се11 Ρ.Θ.Η. и др. (1968); Раде К.С. и др. (1978)). Для определения концентрации МПО в сыворотке крови в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций с плоским дном, начиная со второй лунки ряда А, разливали по 0,1 мл сывороток, взятых от подопытных животных. Затем в них добавляли по 0,1 мл реактива, представляющего собой смесь бензидина и 3% перекиси водорода. В первую лунку ряда А панели (контроль) вместо сыворотки наливали 0,1 мл физиологического раствора. После добавления реактива панели встряхивали, помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 60 мин. По прошествии времени инкубации панели вынимали из термостата и просматривали на вертикальном спектрофотометре Вупа1ееБ (Германия) при длине волны 495 нм. Концентрацию фермента в сыворотке крови получали в единицах экстинкций и выражали в условных единицах.

Как свидетельствуют представленные на фиг. 2, 3 данные по оценке концентраций лизоцима и миелопероксидазы в сыворотке крови мышей, получавших заявляемую композицию, иммунотропные эффекты заявляемой композиции проявляются на уровне клеток фагоцитарной системы крови и процессов, связанных с синтезом и секрецией в кровь указанных ферментов. Эффекты достоверного повышения функциональной активности факторов неспецифического иммунитета (различия с группой контроль достоверны при р<0,05) регистрировали уже через 1 сутки после введения заявляемой композиции и длились они как минимум 7 суток от момента введения. Стимулирующее действие заявляемой композиции на механизмы неспецифической резистентности организма имело место уже после однократного ее введения. Уровни концентраций лизоцима и миелопероксидазы в сыворотке крови животных, получавших заявляемую композицию, через 1 сутки выросли, соответственно, в 3,3 раза и 2,0 раза в сравнении с контрольной группой животных, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия.

Пример 6. Оценка антиоксидантной активности заявляемой композиции.

Эксперименты по оценке антиоксидантной активности выполняли на беспородных белых крысахсамцах массой тела 180-200 г и белых беспородных лабораторных мышах-самцах массой тела 18-23 г после внутрижелудочного (через зонд) введения заявляемой композиции путем изучения ее влияния на степень ишемических повреждений головного мозга при стенозе двух сонных артерий.

Необходимая доза введения заявляемой композиции составила 100 мг/кг (адаптированная для крыс профилактическая доза с учетом коэффициента межвидового переноса, равного 6, исходя из необходимости введения содержимого 2 капсул, составляющего 1000 мг в сутки для человека средней массой 6070 кг) или 150 мг/кг (адаптированная для мышей профилактическая доза с учетом коэффициента межвидового переноса, равного 10, исходя из необходимости введения содержимого 2 капсул, составляющего 1000 мг в сутки для человека средней массой 60-70 кг).

Исследовали эффективность заявляемой композиции на моделях ишемии головного мозга (ишемического инсульта) по показателям развития оксидативного стресса с регистрацией как его выраженности, так и исходов в виде накопления продуктов пероксидации. Из четырех сосудов, принимающих участие в кровоснабжении головного мозга крысы, одномоментно перевязывали 2 сонные артерии. Операцию вы- 12 027597 подняли под кетаминовым наркозом. Наблюдение за наркотизированными животными осуществляли в течение 2,5 ч после стенозирования, после чего их декапитировали и извлекали головной мозг для биохимического исследования. Активность каталазы эритроцитов оценивали по скорости распада перекиси водорода, введенной в среду в известном количестве. Антирадикальную емкость плазмы крови и гомогенатов головного мозга оценивали по восстановлению свободного радикала (дифенилпикрилгидразила). При этом более низкие показатели оптической плотности этого окрашенного продукта свидетельствовали о восстановлении радикала и об эффекте антиоксидантного воздействия заявляемой композиции. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот экстрагировали из крови и гомогенатов головного мозга изопропанолом и гептанолом для раздельного определения в фосфолипидной фракции мембран. Известно, что продукты пероксидации способны поглощать проходящий свет с длиной волны 232 нм, тогда как неокисленные двойные связи - при длине волны в 220 нм. Отношение показателей экстинции свидетельствует о доли продуктов пероксидации в общей липидной фракции. Определяли показатели оптической плотности с использованием спектрофотометра марки СФ-26.

Перед экспериментом животным опытной группы на протяжении четырех недель внутрижелудочно вводили заявляемую композицию в дозе 100 мг/кг, а животным контрольной группы - дистиллированную воду в объеме 0,2 мл. Выявлены существенные различия между показателями крови животных контрольной и опытной групп (табл. 17). Активность каталазы в крови у животных, получавших заявляемую композицию, остается на низком уровне, что свидетельствует об отсутствии субстрата для данного фермента, который образуется в ходе реакций оксидативного стресса. В сравнении с животными контрольной группы в гораздо меньшем количестве выявляли в крови крыс диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот.

Наряду с исследованием характеристик содержания продуктов перекисного окисления липидов в крови, проводили изучение процессов перекисного окисления непосредственно в очаге повреждения. Результаты спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга (табл. 18) показали, что в случае применения заявляемой композиции снижается содержание диеновых конъюгатов в экстрагируемой изопропанолом фосфолипидной мембранной фракции, чем обеспечивается защитный эффект на уровне клеток и тканей. Заявляемая композиция активирует неферментативное звено системы антиоксидантной защиты организма.

Таким образом, введение заявляемой композиции в течение четырех недель позволяет достичь адекватного цитопротективного эффекта, сопряженного с ограничением пероксидации липидов и активацией неферментативного звена антиоксидантной системы.

Пример 7. Исследование специфической гепатопротекторной активности заявляемой композиции.

Исследование специфической гепатопротекторной активности заявляемой композиции осуществляли на моделях острого токсического гепатита. Исследования проводили ίη νίνο, острый токсический гепатит вызывали внутрижелудочным (в/ж) введением 50% раствора четыреххлористого углерода (СС1₄) в оливковом масле в дозе 1 мл/кг в течение 6 дней [51, 52].

В качестве препарата сравнения использовали известный препарат Хофитол производства Лаборатории Роза-Фитофарма (Франция). Следует отметить, что достижение хорошего эффекта при применении препарата Хофитол возможно только при длительном его использовании, причем в значительных дозах (не менее 50 мг/кг). В настоящее время применение препарата в практической медицине широкими слоями населения лимитировано его высокой стоимостью.

В качестве подопытных животных использовали крыс-самцов линии ^181аг средней массой тела 160-180 г, которые до эксперимента содержались в стандартных условиях вивария. В ходе эксперимента из подопытных животных были сформированы четыре группы по 20 особей в каждой: интактная, контрольная и две опытные.

На 7 день у всех подопытных животных по морфологической картине печени подтверждалось наличие токсического гепатита. С этого времени на протяжении 10 дней подопытным животным вводили 1 раз в сутки в/ж сравниваемые средства в адаптированных для грызунов дозах.

Животные первой опытной группы получали заявляемую композицию в дозе 100 мг/кг на общую массу содержимого капсул (содержимое капсул разводили в 1% крахмальной взвеси и полученную взвесь вводили с помощью атравматичного зонда).

Животные второй опытной группы получали препарат сравнения Хофитол в дозе 1,5 мл/кг (эта доза является адаптированной для грызунов и получается умножением максимальной терапевтической дозы для человека (15 мл в сутки на 60 кг - 0,25 мл/кг) на коэффициент межвидового переноса доз, равного 6).

Животные контрольной группы получали ежедневно в/ж 1 мл 1% крахмальной взвеси.

Умерщвленных в СО₂-камере подопытных животных подвергали патологоанатомическому вскрытию и гистологическому исследованию. Крыс опытных и контрольной групп умерщвляли декапитацией. Материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Фиксированные замороженные срезы окрашивали Суданом III на жир (оранжевое окрашивание, на черно-белых снимках визуализируется как черное).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту-Фишеру.

Эффективность действия исследуемых средств оценивали по нескольким группам показателей:

- 13 027597 морфометрическим, биохимическим, функциональным.

Учитывали клиническую картину, динамику изменения массы тела, биохимические и функциональные показатели, а также гистологическую картину печени.

Массу тела крыс определяли на весах ВЛР-500. Печень подопытных животных взвешивали на электронных весах 1602 МР немецкой фирмы §атЮтш8.

Кровь для биохимических исследований получали после эвтаназии животных. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочную фосфотазу (ЩФ), кислую фосфотазу (КФ), лактатдегидрогеназу (ЛДГ), тимоловую пробу, содержание общего белка и липидов, общего холестерина, общего билирубина сыворотки крови определяли с помощью наборов ОльвексДиагностикум (Россия), содержание церулоплазмина - по Бабенко [53].

Прежде всего, наблюдали клиническую картину интоксикации. В контрольной группе крыс клиническая картина характеризовалась гиподинамией, заторможенностью, взъерошенностью шерсти и неопрятностью животных. Они хуже набирали вес, чем крысы остальных групп. В этой группе к 15 дню исследования погибло 80% животных.

В 1 и 2 опытных группах к началу назначения сравниваемых средств (7-й день) наблюдалась гибель 40% животных. К окончанию исследования (17-й день) гибель в опытных группах отсутствовала. В контрольной же группе отмечалась гибель еще 20% животных.

Экспериментально установлено, что применение как заявляемой композиции, так и препарата сравнения Хофитол уменьшало или практически полностью купировало проявления интоксикации, что подтверждалось результатами объективных анализов (табл. 19). Интоксикация четыреххлористым углеродом сопровождалась снижением массы тела и увеличением относительной массы печени. В результате воздействия заявляемой композиции или препарата сравнения Хофитол эти показатели нормализовались.

Указанное подтверждалось также данными гистологических исследований. В результате воздействия СС1₄ в печени опытных крыс наблюдались глубокие повреждения гепатоцитов в виде жировой и белковой дистрофии. Крупные капли жира заполняли целиком цитоплазму гепатоцитов. Крупнокапельная жировая дистрофия была диффузной. Не содержали жира лишь небольшое количество гепатоцитов, цитоплазма которых была гомогенной. На парафиновых препаратах на месте жировых включений были видны крупные вакуоли. Цитоплазма небольшой части гепатоцитов интенсивно закрашивалась эозином. У части крыс помимо этих изменений были видны мелкие очаги некробиоза. Гепатоциты в этих участках были бледными с неразличимыми клеточными границами, без ядер. Ядра большей части гепатоцитов были набухшими, просветленными, с гиперхроматозом ядерной мембраны.

У большинства крыс 1 и 2 опытных групп, получавших заявляемую композицию или препарат сравнения Хофитол, дистрофические изменения печени отсутствовали. Трабекулярное строение печени нарушений не представляло. Границы гепатоцитов были четкими. Ядра содержали достаточное количество хроматина. Реакция на жир с использованием судана III у большинства крыс была отрицательной.

Исследовали изменение показателей, характеризующих функциональное состояние печени подопытных животных, полученных в результате токсического поражения органа, а также после воздействия заявляемой композиции или препарата сравнения Хофитол. Для этого оценивали биохимические показатели сыворотки крови крыс: АлАТ, АсАТ, ЩФ, тимоловая проба, уровень общего белка, общие липиды сыворотки крови, КФ, ДДГ, церулоплазмин, общий холестерин и общий билирубин сыворотки крови.

Антитоксическую функцию печени оценивали также по продолжительности гексеналового сна (гексенал вводили в дозе 70 мг/кг массы тела) [54], т.е. путем изучения антагонизма с гексеналом (антинаркозное действие). Продолжительность гексеналового сна использовали в качестве функционального показателя.

Изменение биохимических и функциональных показателей, характеризующих функциональное состояние печени, представлено в табл. 20 и 21. Как видно, интоксикация, вызванная СС14, приводила к нарушению всех функций печени: белково-синтетической, детоксицирующей, липосинтезирующей, что сопровождалось биохимическими признаками цитолиза. В крови повышалась активность трансаминаз, фосфатаз, снижалось содержание в сыворотке крови общего белка, липидов, повышались уровни общего билирубина и церулоплазмина.

Поражение печени сопровождалось снижением ее функциональной активности, что выражалось в значительном увеличении длительности гексеналового сна.

Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемая композиция имеет высокий уровень гепатопротекторной активности, в результате чего наблюдалось практически полное восстановление всех анализируемых биохимических показателей сыворотки крови и функционального показателя, характеризующих состояние печени крыс с гепатитом, вызванным СС14. По ряду исследуемых показателей заявляемая композиция при токсическом поражении печени оказалась более эффективной, чем препарат сравнения Хофитол.

Использование заявляемой композиции способствует эффективной профилактике токсического поражения печени.

Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая композиция:

- 14 027597 стимулирует рост и активность пробиотических лактобацилл, что обусловливает эффективное благоприятное воздействие на естественную эндогенную микрофлору кишечника;

эффективно устраняет патоморфологические признаки цитолиза, возникшие в результате токсического повреждения печени, путем нормализации биохимических и функционального показателей;

обладает цитопротективным эффектом, сопряженным с ограничением пероксидации липидов и активацией неферментативного звена системы антиоксидантной зашиты организма;

проявляет иммунотропные эффекты и оказывает стимулирующее действие на механизмы неспецифической резистентности организма.

Важной особенностью заявляемой композиции является безопасность ее применения. Экспериментально установлено, что она:

нетоксична;

не содержит токсичные и опасные для здоровья компоненты в количествах, превышающих допустимые уровни, относится к малоопасным веществам;

не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию, не оказывает мутагенного эффекта и безопасна в плане развития отдаленных негативных последствий;

не обладает сенсибилизирующим действием и не провоцирует развитие аллергии; не обладает способностью к кумуляции;

хорошо переносится, так как не проявляет нежелательные побочные эффекты в виде кожнорезорбтивного и местно-раздражающего действия.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию новизна, так как впервые предложен состав композиции, компоненты которой подобраны таким образом, что обеспечивается широкий спектр физиологических эффектов за счет полифункционального пробиотического, гепатопротекторного, антиоксидантного и иммуномодулирующего действия, способствующих улучшению процессов жизнедеятельности организма путем стимулирования роста и активности лактобацилл естественной эндогенной микрофлоры кишечника, устранения патоморфологических признаков цитолиза, возникших в результате токсического повреждения печени, активации неферментативного звена системы антиоксидантной защиты и факторов общей неспецифической резистентности организма.

Заявляемое изобретение соответствует критерию изобретательский уровень, так как из доступной информации целесообразность использования в качестве пробиотической составляющей биологически активных метаболитов бактерий ВасШиз зиЬЬЬз ВКПМ № В-2335 и возможность обеспечения при этом лактогенного эффекта и благоприятного воздействия на рост и активность лактобацилл естественной эндогенной микрофлоры кишечника, а также целесообразность сочетания пробиотической составляющей с гепатопротектором растительного происхождения и антиоксидантом из числа тиоловых соединений не представляются очевидными.

Соответствие заявляемого изобретения критерию пригодность для применения подтверждается приведенными примерами, показавшими несложную технологию получения заявляемой композиции, выполненной в твердой дозированной форме для перорального введения, ингредиенты которой выпускаются в промышленных условиях, доступны и недороги, а также результатами многочисленных исследований, подтвердивших стойкость заявляемой композиции при хранении в течение 2,5 лет, безопасность ее применения и широкий спектр физиологических эффектов.

Список литературы.

1. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению/Под редакцией проф. Е.И. Ткаченко, проф. А.Н. Суворова. - СПб.: СпецЛит, 2007. - 238 с.

2. Кузьмин М.Н., Шунько А.Н., Макаров М.В. Экстренная и специфическая профилактика в системе мер по защите войск и населения от биологического оружия, перспективы развития. Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Мат. научной конф. ЦВТП БЗ НИИ Микробиологии МО РФ, Екатеринбург, 30 апреля-1 июня 1999. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - 1999. - С. 117-118.

3. Противодействие биологическому терроризму. Практическое руководство по противоэпидемическому обеспечению/Под ред. академика РАМН проф. Г.Г. Онищенко. - М., 2003. - С. 301.

4. Рациональная антимикробная фармакотерапия: руководство для практических врачей/Под ред. В.П. Яковлева, С.В. Яковлева. - М.: 2003. II: 1008.

5. КизЬак Ι.Μ., Ког1срс1сг М.С., Άίάίδ I.. ВоиДгеаи Е. Ехрепепсе ίη !Ье тсФса1 тападе-теп! о£ ро!епИа1 1аЬога!огу ехрозигез 1о адеп!з о£ Ыо1еггог1зт оп Шс Ьаз13 о£ пзк аззеззтеп! а! Шс ИпПеД 51а1ез Агту МеФса1 КезеагсЬ 1пзЙи1е о£ ТпЙеЬопз П1з1азез (υδΑΜΚΙΙΌ). I. Оссир Епуноп МеД. 2004: 46: 801-811.

6. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.Н. Человек и противоокислительные вещества. - Л.: Наука. Ленингр. отд. 1985. - 232 с.

7. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М., 1989. - 368 с.

8. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.А., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах//Итоги науки и техники. Сер. Биофизика./ВНИИТИ.-М. 1991.-Т. 29.-250 с.

9. Жуков А.А., Жирнов Г.Ф. Механизм оксигеназных реакций: основные, промежуточные и побоч- 15 027597 ные продукты оксигеназного цикла//Вестник АМН СССР. 1988. - № 1. - С. 33-43.

10. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей//Биохемилюминесценция. - М.: Наука. 1983. - С. 3-29.

11. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах//Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, № 3. - С. 286-296.

12. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов//Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, № 4. - С. 442-455.

13. Плужников Н.Н., Софронов Г.А. Фармакологическая коррекция состояния актиокси-дантной системы организма//Патофизиология экстремальных состояний: Избранные лекции и доклады./Под ред.

B. Ю.Шанина и В.И.Захарова. - СПб., 1993. - С. 108-113.

14. Вгуап С.Ь., СатрЪе11 Ο.Ό., Ьачгепсс К.А., Кпктзоп 8.0. О|рПозрПогу1 Ιίρίά-Ά рго1сс1з га1з Ггот 1ейа1 Ьурегохй//! ЬаЪ. СЬп. Меб. 1992. - Уо1. 161, № 2. - Р. 559-566.

15. Сабепаз Е., Вогспз А., СЬапзс В. .1о\\-1сус1 сЬстбиттсзсспсс оГ Ью1одюа1 зуз1стз//Егсс Кабюа1з ΐη Вю1оду. 1984. - Уо1. 6, - Р. 211-242.

16. Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство: Монография/Под ред. О.Г. Хурцилавы, Н.Н. Плужникова, Я.А. Накатиса. - СПб.: Издательство СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2012. C. 97-111.

17. РпбоуюП I. 8ирсгох1бс ШзтШазсз - апабар1абоп !о а рагатадпебс даз//Е Вю1. СЬет. 1989. - Уо1. 264, № 14. - Р. 7761-7764.

18. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты обигатные факторы питания//Вопр. мед. химии. 1992. - № 4. - С. 21.

19. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами. - М.: Наука, 1982. - 256 с.

20. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке//Биохимия. 1998, Т. 63, вып. 7. - С. 1007-1019.

21. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты - облигатные факторы питания//Вопр. мед. химии. 1992. № 4. - С. 21-26.

22. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия//Вопр. мед. химии. 1988. Т. 34, № 6. - С. 2-11.

23. РЬзз Н., Мепагб М. Ох1бай-шбиссб тоЫП/абоп оГ /тс Ггот тс1аПобйопст. Ыо1с//АгсЬ. ВюсЬст. ВюрЬуз. 1992. - Уо1. 293, № 1. - Р. 195-199.

24. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух томах. Изд. Новая волна, Москва, 1996, Т. 1, - С. 603.

25. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. Клюева М.А., Бабаяна Э.А.. М.:Медицина, 1979, - С. 61-65.

26. Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе дикверцитина. Томск: Изд. Томского университета. 2005, - 228 с.

27. Кугач В.В., Никулыпина Н.И., Ищенко В.И. Лекарственные формы флаваноидов. (Обзор). Химико-фармацевтический журнал. 1988, № 8, - С. 1018-1025.

28. КИ 2310463 С1, 20.11.2007.

29. КИ 2290941 С1, 10.01.2007.

30. ки 2429869 С 2, 27.09.2011.

31. Абедокс А.А., 1Ъсг1 Р.А., Акшрс1и Ό.Α., А1усдого О.А., МЪоЮ С. 81ибюз оп рНуЮсНс-ипса1 зсгсспшд апб апбтюгоЫа ро1спба1з оГ РЬу11айЬиз атагиз адатз! ти1Ьр1с апбЬюбс гсз1з1ап1 ЪасЮпа 1п1сгпабопа1 1оигпа1 оГ АррЬсб КсзсагсЬ ш Ыа1ига1 Ргобис!з. Уо1. 3 (3), р. 6-12, 8ср-Ос! 2010.

32. Кагипа К., §гсстуаза Кеббу 8., Вазкаг К., 8ага1акитап Ό. Апбо.х1бап1 ро1спба1 оГ асщеоиз с.х1гас1 оГ РПуПапбшз атагиз ш га!з. 1пб1ап I РЬагтасок - 2009. - Уо1. 41. - Р. 64-67.

33. \Уапд Хш-Ьиа, Ы СЬапд-српд. Оио Хшд-Ъо апб Ей Ьш-сЬип А сотрагабус з!ибу оГ рЬу11айЬиз атагиз сотроипб апб нИегГсгоп т !Ьс 1гса1тсп1 оГ сЬготс У1га1 ЬсраЬЬз В. 8оиб1саз1 Аз1ап Г Тгор Меб РиЪЬс НсаЬЬ. Уо1. 32 Νθ. 1, МагсЬ 2001. - Р. 140-142.

34. НсраЮргоЮсЦус асПуЬу оГ РЬу11айЬиз атагиз 8сЬит. с!. ТЬопп. с.х1гас1 ш с!Ьапо1 1гса1сб га!з: 1п νί1го апб ш νίνο зШбшз. Рогпрсп Ргатуо1Ып, СЬапоп Ндатбп, 8от1ак РоипдзЬотроо, СЬауо СЬаюЬапЬруибг I ЕбторЬагтасоП 2007 Νον 1; 114(2):169-73.

35. РгоЮсбус ЕГГес! оГ ап Е.х1ас1 оГ РЬу11ап1пз атаги адатз! Каб1абоп-тбиссб Эатадс ш Мюс. К.В. Нап Китаг, К. КиЬап. Е Каб1аГ Кез. - Уо1. 45. - Р. 133-139.

36. Оиа1Ьу суаЬшбоп оГ РЬуПапбшз атагиз (8сЬитасЬ) 1саусз с.х1гас1 Гог Ьз ЬуроЬр1бстю асб\Ьу. К.Р. ИтЪагс, О.8. Ма!с, И.У. ба^а1каг, 8.М. Раб1, 8.8. Иопдагс. Вю1оду апб Мебюте, Уо1. 1 (4): 28-33, 2009.

37. 8|уаргаказат с! а1., 1995, С1шюа1 суаЬшбоп оГ РЬуПапбшз атагиз 8сЬит & ТЬопп. ш 0|аЬс1сз Мс11Ьиз, 8ст1паг оп гсзсагсЬ ш Аупгусба апб 81ббЬа, ССКА8, №ν ОсПи, 20-22 МагсЬ, Р 17.

38. Кютег А.К. РЬуПапбшз атагиз Ьаз апб-тЛаттаЮгу ро1спба1 Ъу ЬПпЬПюп оГ ίΝΟ8, СОХ-2, апб суФкгпсз νίη 1Пс ΝΕ-карраВ рабтах. ί Нсра1о1. 2003 Маг; 38(3): 289-97.

39. Машковский М.Д. Лекарственные средства, изд. 14, - 2000, т. 2, - С. 77.

40. Авраменко В.А., Василевский В.А. Новые сорбенты на основе модифицированных цеолитов и

- 16 027597 их применение в экологии, сельском хозяйстве и медицине//Цеолиты Приморья. Тезисы докладов научно-практической конференции. Владивосток, 1994, - С. 16-19.

41. Паничев А.М., Гульков А.Н. Природные минералы и причинная медицина будущего. Владивосток: Издательство ДВГТУ, 2001, - 216 с.

42. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений РФ//Природные минералы на службе человека. Материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 1999, - С. 68-70.

43. ТУ 9197-001-56264254-11 Цеолит природный молотый - сырье для производства биологически активных добавок к пище.

44. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 О безопасности пищевой продукции (приложения 1 и 2, раздел 1.9, приложение 3, раздел 10). - 242 с.

45. Пылев Л.Н., Заключение Комиссии по канцерогенным факторам при МЗ РФ, 1998.

46. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию. Методические рекомендации. - М., 1969, - 25 с.

47. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации 1744-77. - М., 1978, - 35 с.

48. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации 28/10. - М., 1984, - 21 с.

49. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг. тр. и проф. забол. - М., 1985, - 15 с.

50. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл.//Журн. микробиол. эпидем., иммунобиол. 2004. - № 5. - С. 94-98.

51. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Соратиков А.С. Доклиническое изучение гепато-защитных средств. Методические рекомендации/Ведомости Фарм. Комитета, - 1999, № 2, - С. 9-12.

52. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническорму) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Ремедиум, 2000, - С. 228-231.

53. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В. Меньшикова. - М: Медицина, 1987, - 365 с.

54. Е11оик-АсНагй 8. с1 а1. Ех νίνο апй ίη νίΐτο тойек ίη асеЮтторНеп НераЮЮхюПу Λιιάία. Ве1аОопδΐιίρ ЬеЕусеп §1и1а1Ыопе йер1е11оп. охЛаОуе 51гс55 апй ФзШгЬапсез ίη са1сшт НотеоЧахЕ апй епегду те(аЬоПхт. АгсНгуез о! Тох1со1оду. 8нрр1етеп1. 1995, 17, 209-214.

- 17 027597

Таблица 1

Характеристики биологических и физико-химических свойств бесклеточной культуральной жидкости, полученной при глубинном культивировании штамма бактерий ВасШик киЫШк ВКПМ № В-2335

Наименование анализируемых показателей	Значения анализируемых показателей в ЮК бактерий ВасШиз зиЬйНз ВКПМ № В-2335
Остаточная концентрация микробапродуцента (клетки), КОЕ/мл	0
Содержание белка*, мкг · см4	545,1
Протеолитическая активность (ПА), ед. ПА-дм'3	7,6
Амилолитическая активность (АА), ед. АА-дм'3	35,7
рН, ед. рН	5,7
ОП, ед. ОП	0,32
СО, %	0,66
Суммарная концентрация общих аминокислот, мкг см’3	585,6
Суммарная концентрация свободных аминокислот, мкг см'3	63,2
Концентрация общих, мкг -см'3 - гексозаминов - глюкозаминов - диаминопимелиновой кислоты	105,7 96,3 20,1
Концентрация свободного глюкозамина, мкг см'3	6,7
Концентрация свободных / связанных азотистых оснований, мкг/см3 - аденина / Ха** - гуанина / Хг** - тимина / Хт** -урацила/Ху** - цитозина / Хц**	12,3/3,2 0/ 16,8 8,1/0 11,2/8,4 0/12,8
Примечания: * - содержание белка определяли по методу Лоури; ** - Ха, Хг, Хт, Ху, Хц - неидентифицированные производные, соответственно, аденина, гуанина, тимина, урацила и цитозина в пересчете на основное вещество

Таблица 2

Содержание в заявляемой композиции токсичных элементов

Исследуемые показатели	Содержание токсичных элементов и хлорорганических пестицидов, мг/кг
Норматив ТР ТС 021/2011 (приложение 3, раздел 10)	В заявляемой композиции
Токсичные элементы, мг/кг: - свинец	5,0	0,01
- кадмий	1,0	0,02
- ртуть	1,0	0,005
- мышьяк	3,0	0,03

Таблица 3

Содержание в заявляемой композиции хлорорганических пестицидов

Исследуемые показатели	Содержание токсичных элементов и хлорорганических пестицидов, мг/кг
Норматив ТР ТС 021/2011 (приложение 3, раздел 10)	В заявляемой композиции
Хлорорганические пестициды, мг/кг: - ГХЦГ (сумма α-, β- и χ-изомеров)	0,1	<0,01
- ДДТ и его метаболиты	0,1	<0,01
- Алдрин	не допускается (< 0,002)	< 0,001
- Гептахлор	не допускается (< 0,002)	< 0,001

- 18 027597

Таблица 4

Результаты оценки микробиологических показателей безопасности заявляемой композиции

Исследуемые показатели	Значения микробиологических показателей
Норматив ТР ТС 021 (приложения 1 и 2, раздел 1.9)	В заявляемой композиции
КМАФАМ, КОЕ/г, не более	5 · 10	ГЙЫ
БГКП (колиформы), масса продукта (г), в которой не допускаются	0,1	0,05
ЕзсНепсЫа сой, масса продукта (г), в которой не допускаются	1,0	0,1
Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, масса продукта (г), в которой не допускаются	10,0	1,0
Живые клетки ВасШиз зиЫШз, масса продукта (г), в которой не допускаются	0,1	Живые клетки бактерий ВасШиз зиЬйНз ВКПМ № В-2335 не обнаружены
Дрожжи, КОЕ/г, не более	100	1
Плесени, КОЕ/г, не более	Не обнаружены

Таблица 5

Динамика изменения массы тела крыс, получавших заявляемую композицию

Группа животных	Вид животных	Масса тела животных (г) через промежуток времени
фон	2 сут	7 сут	14 сут
Контрольная (получавшая дистиллированную воду)	крысы-самцы	190,6±4,8	187,0±3,7	194,9±4,3	202,56±4,2
крысы-самки	188,8±2,2	182,6±3,1	191,6±2,8	201,0±3,9
Опытная (получавшая заявляемую композицию)	крысы-самцы	185,НЗ,4	186,5±4,5	195,0±4,9	197,7±3,5
крысы-самки	179,6±2,6	180,6±2,7	195,0±2,8	209,4±2,8

Таблица 6

Массовые коэффициенты (МК) органов у белых крыс при остром введении заявляемой композиции

Анализируемый орган	Массовые коэффициенты органов (мг/100 г массы тела) групп животных
Контрольная (получавшая дистиллированную воду)	Опытная (получавшая заявляемую композицию)
крысы-самцы	крысы-самки	крысы-самцы	крысы-самки
Сердце	4,0±0,2	4,0±0,3	4,4±0,09	4,3±0,3
Легкие с трахеей	7,2±0,3	7,5±0,7	7,4±0,2	7,НОД
Тимус	1,35±0,13	1,32±0,06	1,29±0,09	1,33±0,11
Печень	37,4±1,6	36,5±1,8	32,0±1,9	35,5±1,3
Селезенка	4,НОД	4,34±0,2	3,8±0,2	3,7±0,4
Почка (левая)	4,4±0,1	4,5±0,3	5,НОД	4,6±0,09
Надпочечники	0,10±0,02	0,09±0,01	0,09±0,02	0,1 НО,02
Головной мозг	8,6±0,5	8,2±0,2	8,3±0,3	8,9±0,3
Яички или яичники	13,2±0,1	0,30±0,01	11,9±0,2	0,28±0,01

Таблица 7

Изменение показателей поведенческих реакций белых нелинейных крыс по методу открытого поля после хронического введения заявляемой композиции (регистрация в течение 5 мин), М±т

Группа животных	Показатели поведенческих реакций по методу «открытого поля»
Горизонтальная двигательная активность	Вертикальная двигательная активность	Норковый рефлекс	Болюсы	Интегральная активность
Контрольная (получавшая дистиллированную воду)	34±3	14±3	12±1	4±1	64±4
Опытная (получавшая заявляемую композицию)	35±5	16±2	13±1	5±2	69±5

- 19 027597

Таблица 8

Влияние хронического введения заявляемой композиции на показатели общей нелетальной токсичности белых нелинейных крыс, М±т

Показатель общей нелетальной токсичности	Значение показателя общей нелетальной токсичности
Контроль	После хронического введения заявляемой композиции
Масса тела, г	201 ±9	206±4
Массовые индексы органов, г/100 г массы тела:
- легкие	6,1±0,1	5,4±0,2
- печень	27,7±0,7	27,0±0,6
- почки	7,8±1,0	7,3±0,5
- селезенка	4,6±0,2	4,1±0,1
- сердце	2,5±0,2	2,3±0,1
Показатели мочи:
- белок мочи, мг %	3,4±0,5	3,3±0,4
- удельный вес мочи, г/мм3	0,14±0,36	0,12±0,24
Биохимические показатели крови:
- сахар крови, мг %	92±3	82±7
- белок сыворотки, г %	8,123±0,12	7,18±0,14
- липидный фосфор, ммоль/л	32,12±0,51	31,12±0,38
- АлАТ, мккат/л	0,83±0,7	0,85±0,9
- АсАТ, мккат/л	0,68±0,11	0,78±0,14
- ЩФ, мккат/л	0,76±0,08	0,77±0,18
- тимоловая проба, ед. помути.	0,82±0,15	0,84±0,9
Морфологические показатели крови:
- содержание лейкоцитов, тыс./мм3	9,21±0,10	8,63±0,48
- содержание эритроцитов, млн./мм’1	6,43±0,6	7,23±0,10
- содержание гемоглобина, г %	14,4±0,2	14,4±0,3
Физиологические показатели:
- СПП, В	13,2±0,6	14,1±0,4
- продолжительность гексеналового сна, мин	25,4±2,4	23,6±1,3

Таблица 9

Влияние заявляемой композиции на двигательную функцию мерцательного эпителия пищевода лягушки

Группа животных	Количество опытов	Время прохождения пробковой крошкой участка пищевода длиной 10 мм, с
Исходное	Через промежуток времени после нанесения
1-3 мин	7-10 мин
Контрольная (на слизистую оболочку пищевода наносилась дистиллированная вода)	10	22,4±1,34	27,1±2,6	24,4±1,7
Опытная (на слизистую оболочку пищевода наносилась заявляемая композиция)	10	20,2±1,3	19,6±1,1	22,9±1,0

Таблица 10

Показатели сенсибилизации периферической крови морских свинок после внутрикожного введения заявляемой композиции, М±т

Показатель сенсибилизирующего действия	Значение показателя сенсибилизирующего действия
Контроль	После введения заявляемой композиции
Лейкоциты, тыс./мм3	10,6±0,8	10,0±0,2
Эозинофилы, %	8±1	5±1
Лимфоциты, %	33±5	36±4
Моноциты, %	5±1	5±0
Нейтрофилы, %	52±3	51±5
РСЛЛ, % лизиса	10±2	9±0

- 20 027597

Таблица 11

Показатели гонадотоксичности и мутагенности заявляемой композиции, М±т

Показатель гонадотоксического и мутагенного эффектов	Значение показателя гонадотоксического и мутагенного эффектов
Контроль	После введения заявляемой композиции
Весовой коэффициент гонад крыс-самцов, г/100 г массы тела	5,10±0,34	7,00±0,46
Количество спермиев, 106/мл	152±25	179±37
Продолжительность движения спермиев, мин	96±11	100±4
Осмотическая резистентность, 1М№С1	1,46±0,8	2,45±0,10
Число проанализированных клеток костного мозга мышей	4144±100	4148±118
Частота клеток с микроядрами, %	0,35±0,04	0,35±0,02

Таблица 12

Исследование изменения характеристик заявляемой композиции при хранении в течение 2,5 лет

Наименование показателя	Значение показателя в заявляемой композиции
До хранения	После хранения
Внешний вид	Порошок в виде гранул	Порошок в виде гранул
Цвет	Бежевый с зеленоватым оттенком	Бежевый с зеленоватым оттенком
Запах	Специфический, свойственный данному продукту	Специфический, свойственный данному продукту
Влажность, %	6,9	7,0±0,2
Амилолитическая активность, ед. АА/г	2,0	1,8±0,3
Протеолетическая активность, ед. ПА/г	0,5	0,4±0,09
Содержание таурина, мг/г	258,0	255,3
Адсорбционная активность по индикатору метиленовому синему, мг/г	4,1	4,0
Микробиологическая чистота (наличие в 1 г препарата): - Рзеиаотопаз аегищпоза - Еп1егоЪас1епасеае - 81арЬу1ососсиз аигеиз - ВасШиз сегеиз	Отсутствуют Отсутствуют Отсутствуют Отсутствуют	Отсутствуют Отсутствуют Отсутствуют Отсутствуют

Таблица 13

Влияние метаболитов ВасШиз зиЫШз ВКПМ № В-2335 на рост пробиотических лактобацилл Ьас1оЪасШиз р1ап!агит 8К-А3

Концентрация метаболитов ВасШиз зиЫШз ВКПМ № В-2335	Десятикратные разведения ЬасЮЬасШиз р1ап1агит 8К.-АЗ, засеянных по 10 мкл***
1	2	3	4	5	6
Исходная концентрация*	газон	тысячи	тысячи	сотни	85****	10
Разведение 1 : 10**	газон	тысячи	тысячи	сотни	50	5
Контроль	газон	тысячи	тысячи	124	12	0
Примечания: * - 1 г на 10 мл питательной среды; ** - 0,1 г на 10 мл питательной среды; *** - разведения: 1 - 1:10; 2 - 1:100; 3 - 1:1000 и т.д.; **** - здесь и далее - число КОЕ (колониеобразующих единиц)

Таблица 14

Антибактериальная активность лактобацилл Ьас1оЪасШиз р1ап!агит 8К-А3 в отношении стафилококков

Исследуемый состав (кол-во)	Десятикратные разведения 81арЬу1ососиз аигеиз 209, засеянных по 10 мкл*
Без разведения	1	2	3	4	5
Лактобациллы ЬасЮЬасШиз р1ап1агит 8К-АЗ (0,1 г)	сотни	150**	15	2	0	0
Лактобациллы ЬасЮЬасШиз р1ап!агит 8К.-АЗ (0,1 г) + метаболиты ВасШиз зиЫШз ВКПМ Хе В-2335 (1 г)	сотни	117	10	1	0	0
Контроль	газон	газон	тысячи	сотни	14	2

Примечания: * -разведения: 1 - 1:10; 2 - 1:100; 3 - 1:1000 и т.д.

** - здесь и далее - число КОЕ (колониеобразующих единиц)

- 21 027597

Таблица 15

Антибактериальная активность лактобацилл Еас1оЪасШи§ р1ап!агит 8К-А3 отношении эшерихий

Исследуемый состав (кол-во)	Десятикратные разведения ЕзсЬепсЫа сой М15, засеянных по 10 мкл*
Без разведения	1	2	3	4	5
Лактобациллы ЬасЮЬасШиз р!апСагит 8К-АЗ (0,1 г)	сотни	120**	12	1	0	0
Лактобациллы ЬасЮЬасШиз р1ап1агит 8К-АЗ (0,1 г) + метаболиты ВасШиз зиЫШз ВКПМ № В-2335 (1 г)	сотни	80	7	0	0	0
Контроль	газон	газон	тысячи	сотни	24	2

Примечания; * - разведения: 1 - 1; 10; 2 - 1:100; 3-1:1 000 и т.д.

_** - здесь и далее - число КОЕ (колониеобразующих единиц)_

Таблица 16

Антибактериальная активность лактобацилл Еас1оЪасШи§ р1ап!агит 8К-А3 в отношении псевдомонад

Исследуемый состав (кол-во)	Десятикратные разведения Рзеийошопаз аегищпоза. засеянных по 10 мкл*
Без разведения	1	2	3	4	5
Лактобациллы ЬасШЪасШиз р1ап1агит 8К.-АЗ (0,1 г)	сотни	20**	3	0	0	0
Лактобациллы Ьас1оЬасШиз р1ап(агит 8К-АЗ (0,1 г) + метаболиты ВасШиз зиЬййз ВКПМ № В-2335 (1 г)	сотни	11	1	0	0	0
Контроль	газон	газон	тысячи	сотни	32	3

Примечания: * - разведения: 1 - 1:10; 2 - 1:100; 3 - 1:1000 и т.д.

_** - здесь и далее - число КОЕ (колониеобразующих единиц)_

Таблица 17

Влияние заявляемой композиции при четырехнедельном введении на показатели перекисного окисления липидов в крови крыс после двусторонней перевязки сонных артерий

Показатель крови	Уровень показателя для группы животных
Интактные (без перевязки)	Контрольная (получавшая дистиллированную воду)	Опытная (получавшая заявляемую композицию)
Активность каталазы	0,251±0,008	0,244±0,008	0,224±0,009*
Восстановление дифенилпикрилгидразила	0,566±0,022	0,564±0,026	0,474±0,018*
Диеновые конъюгаты изопропанольная фракция	0,205±0,022	0,235±0,022	0,161±0,023
Диеновые конъюгаты гептанольная фракция	0,845±0,032	0,853±0,035	0,731±0,031*
Примечание: * - различие с контрольной группой достоверно

Таблица 18

Влияние заявляемой композиции при четырехнедельном введении на показатели спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга крыс после двусторонней перевязки сонных артерий

Исследуемый показатель	Уровень показателя для группы животных
Интактные (без перевязки)	Контрольная (получавшая дистиллированную воду)	Опытная (получавшая заявляемую композицию)
Восстановление дифенилпикрилгидразила	0,085±0,017	0,102±0,028	0,051±0,009*
Диеновые конъюгаты изопропанольная фракция	0,183±0,018	0,169±0,019	0,146±0,015*
Диеновые конъюгаты гептанольная фракция	0,552±0,022	0,538±0,012	0,548±0,012
Примечание: * - различие с контрольной группой достоверно

- 22 027597

Таблица 19

Исследование влияния заявляемой композиции и препарата сравнения Хофитол на массу тела и относительную массу печени крыс с гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом, М±т

Исследуемый показатель	Уровень показателя для группы животных
Интактные животные	Контрольная группа (получавшая 1 % крахмальную взвесь)	1 опытная группа (получавшая заявляемую композицию)	2 опытная группа (получавшая Хофитол)
Масса тела, г	180±6	158±9*	179±8	178±9
Относительная масса печени, г/кг массы тела	29,80±1,42	42,50±1,15*	29,90±1,03	29,80±0,90

Примечание: * - различие с интактной группой животных достоверно при р<0,05

Таблица 20

Исследование влияния заявляемой композиции и препарата сравнения Хофитол на биохимические показатели сыворотки крови и функциональный показатель состояния печени крыс с гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом

Группа подопытных животных (п=20)	Биохимические показатели сыворотки крови и функциональный показатель
АлАТ, мкмоль/с-л	АсАТ, мкмоль/ с-л	ЩФ, нмоль/ с-л	Тимоловая проба, ед.	Общий белок, г/л	Продолжительность гексеналового сна, мин
Интактные животные	0,59±0,05	0,35±0,04	852±30,7	1,46±0,03	64,0±2,0	31,0±2,0
Контрольная группа	1,58±О,1О*	0,80±0,07*	1677±68,8*	5,99±0,35*	31,0±4,0*	59,0±4,0*
1 опытная группа (получали заявляемую композицию)	0,75±0,08	0,36±0,04	811±26,3	1,18±0,17	69,0±6,0	30,0±4,0
2 опытная группа (получали Хофитол)	0,86±0,06*	0,40±0,03	835±48,4	1,88±0,16*	5О,О±3,О	32,0±3,0

Примечание: * - различия с интактной группой достоверны при р<0,05

Таблица 21

Исследование влияния заявляемой композиции и препарата сравнения Хофитол на биохимические показатели сыворотки крови крыс с гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом

Группа подопытных животных (п=20)	Биохимические показатели сыворотки крови
Общие липиды, г/л	КФ, мккат/л	лдг, ммоль/ ч-л	Церулоплазмин, нмоль/ с-л	Общий холестерин, ммоль/л	Общий билирубин, ммоль/л
Интактные животные	3,5±0,03	0,76±0,11	4,94±0,32	417±12	1,77±0,24	3,2±0,4
Контрольная группа	2,5±0,3*	2,27±0,19*	8,48±0,36*	989±81*	1,32±0,20	7,4±0,3*
1 опытная группа (получали заявляемую композицию)	3,4±0,09	0,75±0,10	5,94±0,45	477±44	1,70±0,19	3,8±0,5
2 опытная группа (получали Хофитол)	2,9±0,2*	0,97±0,07	5,72±0,45	656±72*	3,80±0,50	4,0±0,2

Примечание: * - различия с интактной группой достоверны при р<0,05

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Композиция с пробиотической, гепатопротекторной, антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, включающая пробиотическую составляющую и гепатопротектор, которая в качестве пробиотической составляющей содержит биологически активные метаболиты пробиотического штамма бактерий рода ВасШик киЫШк, отличающаяся тем, что дополнительно включает антиоксидант и сорбентноситель, в качестве антиоксиданта содержит таурин, в качестве сорбента-носителя содержит цеолит, в качестве гепатопротектора содержит экстракт листьев Филантуса амарус, пробиотическая составляющая представлена стерилизованной лиофилизированной культуральной жидкостью, содержащей биологически активные метаболиты бактерий ВасШик киЫШк штамм ВКПМ № В-2335, которая иммобилизована на цеолите, выполнена при этом в твердой дозированной форме в виде капсул, а количество ингредиентов в одной капсуле массой 500 мг составляет, мг/капс.: стерилизованная лиофилизированная культуральная жидкость, содержащая биологически активные метаболиты бактерий ВасШик киЫШк штамм ВКПМ № В2335 - 4,0; экстракт листьев Филантуса амарус - 50,0; таурин - 250,0; цеолит - 196,0.