EA025417B1 - Vaccines with enhanced immunogenicity and methods for the production thereof - Google Patents
Vaccines with enhanced immunogenicity and methods for the production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA025417B1 EA025417B1 EA201300488A EA201300488A EA025417B1 EA 025417 B1 EA025417 B1 EA 025417B1 EA 201300488 A EA201300488 A EA 201300488A EA 201300488 A EA201300488 A EA 201300488A EA 025417 B1 EA025417 B1 EA 025417B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vaccine
- antigen
- microbial
- vaccine antigen
- increased immunogenicity
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 93
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 32
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims description 31
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000011369 resultant mixture Substances 0.000 abstract 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical group ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 3
- 101100324465 Caenorhabditis elegans arr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101710123026 High molecular weight antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N Phthalic anhydride Chemical group C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001079625 Proteides Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- VXLCKSFMONBCLQ-UHFFFAOYSA-N [Na]CC[Na] Chemical group [Na]CC[Na] VXLCKSFMONBCLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N butyl 2,2-difluorocyclopropane-1-carboxylate Chemical group CCCCOC(=O)C1CC1(F)F JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960005097 diphtheria vaccines Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000012899 standard injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005992 succinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно, к вакцинологии и фармации и предназначено для профилактики и лечения инфекционных и других заболеваний человека и животных, где применяется вакцинация.The invention relates to veterinary medicine and, in particular, to vaccinology and pharmacy and is intended for the prevention and treatment of infectious and other diseases of humans and animals where vaccination is used.
Предшествующий уровень техникиState of the art
В современном мире вакцинация является одним из основных методов предотвращения эпидемий. Существуют две основных группы инфекционных заболеваний: группа инфекций, контролируемых вакцинами (применение которых предотвращает эпидемию) - входящих в схемы обязательной вакцинации и вторая группа инфекции, вакцинопрофилактика которых малоэффективна или неэффективна вовсе (1]. К первой группе инфекций относятся консервативные микроорганизмы и вирусы, антигенный состав которых неизменен и вакцина индуцирует высокие уровни защитных антител в крови. Это такие инфекции, как дифтерия, коклюш, корь, краснуха и др. Ко второй группе инфекционных заболеваний, при которых вакцинация неэффективна, относят грипп, герпесвирусные инфекции, ВИЧ/СПИД и некоторые другие [2’3’4]. Неэффективность вакцин в профилактике этой группы инфекций обусловлена целым рядом причин. Например, вирус гриппа представляет собой полиморфный (вирусная частица не имеет четкой структуры и формы) вирус с фрагментированным изменчивым геномом.In the modern world, vaccination is one of the main methods of preventing epidemics. There are two main groups of infectious diseases: a group of infections controlled by vaccines (the use of which prevents an epidemic) - included in mandatory vaccination schemes, and a second group of infections whose vaccine prophylaxis is ineffective or ineffective at all ( 1 ]. The first group of infections includes conservative microorganisms and viruses, antigenic the composition of which is unchanged and the vaccine induces high levels of protective antibodies in the blood, such as infections such as diphtheria, pertussis, measles, rubella, and others. tional diseases for which vaccination is ineffective, include influenza, herpes infection, HIV / AIDS and some other [2 '3' 4]. vaccine ineffective in preventing this group of infections caused by a variety of reasons. For example, the influenza virus is a polymorphic (virus particle does not have a clear structure and form) a virus with a fragmented variable genome.
Вирус гриппа очень изменчив и способен к персистенции (пожизненному нахождению в организме человека) [5]. В организме человека и животных (в т.ч. птицы [6]) этот вирус размножается в несколько стадий - в острую продуктивную фазу инфицированная клетка выделяет вирусные частицы, способные заражать соседние клетки [7]. В фазу персистенции (латентную фазу) этот вирус пережидает внутри клетки, при этом утрачивая часть фрагментированного генома или захватывая куски человеческой РНК в цитоплазме [8]. Согласно статистике антигенный состав вируса гриппа в месяц меняется на 5% [9]. Соответственно, применение стандартных подходов к разработке антигриппозных вакцин является бесперспективным. Даже применение рекомбинантных белков и новых видов генных вакцин не избавляет такие препараты от быстрого устаревания. Наличие в одной ампуле нескольких консервативных белков (например, гемагглютининов и нейраминидаз для вируса гриппа) не позволяет защитить организм от вирусной агрессии через индукцию выработки специфичных антител. Эти антитела будут иметь совершенно не ту моноклональную специфичность, которая будет необходима при таком уровне мутации вирусов. Изменение подхода к проектированию вакцин должно сопровождаться включением в состав вакцин таких антигенов, которые еще не появились в результате мутации вирусов [10]. Так называемое предиктивное включение антигенов возможно двумя путями: классическим с применением методов эпидемиологического прогнозирования антигенного дрейфа и путем частичной модификации антигенов с получением неограниченного количества комбинаций антигена в одной ампуле антигена [11]. Первое направление себя оправдало лишь частично: ни в одном случае прогноз антигенного дрейфа не совпал с реальными мутационными изменениями нейраминидазы и гемагглютинина гриппа [12,13]. Если использовать технологию частичной модификации белкового компонента вакцинного антигена, например, нейраминидазы 1 типа, в процессе приготовления вакцины, то в одной дозе вакцины вместо одного белка с одним антигенным профилем появится более миллиона белков с одной первичной и вторичной структурой, но разными сайтами замещения и разным антигенным профилем.Influenza virus is very variable and capable of persistence (lifetime in the human body) [ 5 ]. In humans and animals (including birds [ 6 ]), this virus multiplies in several stages - in the acute productive phase, an infected cell releases virus particles that can infect neighboring cells [ 7 ]. In the persistence phase (latent phase), this virus waits inside the cell, while losing part of the fragmented genome or capturing pieces of human RNA in the cytoplasm [ 8 ]. According to statistics, the antigenic composition of the influenza virus per month changes by 5% [ 9 ]. Accordingly, the application of standard approaches to the development of influenza vaccines is unpromising. Even the use of recombinant proteins and new types of gene vaccines does not save such drugs from rapid obsolescence. The presence of several conservative proteins in one ampoule (for example, hemagglutinins and neuraminidases for the influenza virus) does not protect the body from viral aggression by inducing the production of specific antibodies. These antibodies will have completely the wrong monoclonal specificity, which will be necessary at this level of virus mutation. A change in the approach to vaccine design should be accompanied by the inclusion of such antigens in the vaccines that have not yet appeared as a result of virus mutations [ 10 ]. The so-called predictive inclusion of antigens is possible in two ways: the classical one using the methods of epidemiological forecasting of antigenic drift and by partially modifying the antigens to produce an unlimited number of antigen combinations in one antigen ampoule [ 11 ]. The first direction justified itself only partially: in no case did the prognosis of antigenic drift coincide with real mutational changes in neuraminidase and influenza hemagglutinin [ 12 , 13 ]. If we use the technology of partial modification of the protein component of the vaccine antigen, for example, type 1 neuraminidase, during the preparation of the vaccine, then in a single dose of the vaccine instead of a single protein with one antigenic profile, more than a million proteins with one primary and secondary structure, but different substitution sites and different antigenic profile.
Индуцированные этим белком антитела будут перекрывать все возможные комбинации сайтов присоединения. Соответственно количество индуцированных моноклонов будет на порядок выше, хотя белок останется тот же самый. При этом любой будущий эпитоп структуры нейраминидазы будет перекрыт уже синтезированными антителами.The antibodies induced by this protein will block all possible combinations of attachment sites. Accordingly, the number of induced monoclones will be an order of magnitude higher, although the protein will remain the same. Moreover, any future epitope of the structure of neuraminidase will be blocked by already synthesized antibodies.
Такой подход позволяет резко сократить количество антигена для вакцинации, защищать организм от вирусов с фрагментированным геномом и высокоизменчивых микроорганизмов небольшим количеством антител, но со значительно большим спектром моноклональной специфичности. Грубо говоря, вакцина будет содержать набор даже тех антигенов нейраминидазы, которые еще не существуют. При этом в крови вакцинированных ранее животных уже будет находиться необходимый пулл антител к будущему штамму вируса. Применение такой вакцины позволит успешно защищать организм от высокоизменчивых персистирующих, а также низкоиммуногенных вирусов и микроорганизмов.This approach can drastically reduce the amount of antigen for vaccination, protect the body from viruses with a fragmented genome and highly variable microorganisms by a small amount of antibodies, but with a significantly larger spectrum of monoclonal specificity. Roughly speaking, the vaccine will contain a set of even those neuraminidase antigens that do not yet exist. At the same time, the necessary pool of antibodies to the future strain of the virus will already be in the blood of previously vaccinated animals. The use of such a vaccine will successfully protect the body from highly variable persistent, as well as low immunogenic viruses and microorganisms.
Всемирная организация здравоохранения определила приоритетным направление исследований по замене парентеральных вакцин на пероральные [14]. Непарентеральные способы вакцинации базируются на способности антигенов проникать через слизистые оболочки главным образом кишечного тракта. Применение пероральных вакцин позволяет обеспечить непрерывность антигенного стимула, который является обязательным условием поддерживания на высоком уровне коллективного иммунитета против инфекций, управляемых средствами специфической профилактики. К тому же такой способ иммунизации является самым простым, физиологически адекватным и психологически привлекательным.The World Health Organization has prioritized research on replacing parenteral vaccines with oral vaccines [ 14 ]. Non-parenteral methods of vaccination are based on the ability of antigens to penetrate through the mucous membranes of the mainly intestinal tract. The use of oral vaccines ensures the continuity of the antigenic stimulus, which is a prerequisite for maintaining a high level of collective immunity against infections controlled by specific prophylaxis. In addition, this method of immunization is the simplest, physiologically adequate and psychologically attractive.
Известен способ [15] повышения иммуногенности путем экспрессии холерного токсинного антигена в химерный белок растений. Известный способ повышения иммуногенности нуклеопротеинов вируса гепатита В путем ковалентного связывания аминогрупп этого белка с микробным гаптеном. Такая конъюгация позволила поднять иммуногенность вакцины и вызывать индукцию титра антител до уровня 1:128 (при вакцинации животных нативным белком титр антител не превышал 1:32). Эта технология неA known method [ 15 ] of increasing immunogenicity by expressing a cholera toxin antigen in a plant chimeric protein. A known method of increasing the immunogenicity of hepatitis B virus nucleoproteins by covalent binding of the amino groups of this protein to microbial haptens. Such conjugation made it possible to increase the immunogenicity of the vaccine and induce the induction of an antibody titer to a level of 1: 128 (when vaccinating animals with a native protein, the antibody titer did not exceed 1:32). This technology is not
- 1 025417 может быть использована для повышения иммуногенности других вакцин (микробных и вирусных), потому что рассчитанна исключительно на белок, который индуктируется в ядре клетки вирусом гепатита В. Кроме того, пероральное использование такой вакцины невозможно, потому что кишечные ферменты разрушают антиген. Недостаточно эффективным представляется и сам метод конъюгации, поскольку титры антител к модифицированному антигену возрастали лишь в 4 раза. Ближайшим к патентуемому средству является способ получения водорастворимого адъюванта [16]. Этот адъювант содержит фрагменты пептидогликана и полисахарида с ацетилглюкозамином и ацилмурамовой кислотой. Последняя вместо ацетиловой группы была модифицирована янтарным или фталевым ангидридом. Пептидогликан изымали из клеточной стенки микроорганизмов рода ЫосагФа и ацилировали 30-50% за массой пептидогликана. Применение такого способа дало возможность повысить иммуногенность микробного антигена на 25-30% против стандартной инъекционной вакцины. Титры специфических антител росли до 1:256-1:512 через два недели после вакцинации. Получение чистого пептидогликана является важной процедурой, так как она связана с многостадийной очисткой. Кроме того, такие вакцины были полностью неэффективными при пероральном применении, потому что разрушались кишечными ферментами; в связи с тем, что адъювант не имел ковалентных связей с антигеном, наблюдалась значительная разница между титром антител к адъюванту (1:400) и титром антител к микробному антигену (1:100). К отличиям обоих изобретений следует отнести, в первую очередь, применение указанного ангидрида для модификации разных за химической природой антигенных комплексов: пептидогликана - в аналоге, белковой субстанции - в предлагаемом изобретении. Кроме того, в известном изобретении ацилированию поддается антигенный комплекс, который применяется в качестве адъюванта, а в заявленной модели остатки органических кислот в структуре модифицированного антигену сами выступают адъювантными соединениями.- 1,025417 can be used to increase the immunogenicity of other vaccines (microbial and viral), because it is designed exclusively for the protein that is induced in the cell nucleus by hepatitis B. In addition, oral use of such a vaccine is impossible, because intestinal enzymes destroy the antigen. The conjugation method itself also seems to be insufficiently effective, since the titers of antibodies to the modified antigen increased only 4 times. The closest to the patented tool is a method of obtaining a water-soluble adjuvant [ 16 ]. This adjuvant contains fragments of peptidoglycan and polysaccharide with acetylglucosamine and acylmuramic acid. The latter, instead of the acetyl group, was modified with succinic or phthalic anhydride. Peptidoglycan was removed from the cell wall of microorganisms of the genus YosagFa and acylated 30-50% by weight of peptidoglycan. The use of this method made it possible to increase the immunogenicity of the microbial antigen by 25-30% against a standard injection vaccine. Specific antibody titers grew to 1: 256-1: 512 two weeks after vaccination. Obtaining pure peptidoglycan is an important procedure, since it is associated with multi-stage purification. In addition, such vaccines were completely ineffective when taken orally because they were destroyed by intestinal enzymes; due to the fact that the adjuvant had no covalent bonds with the antigen, a significant difference was observed between the titer of antibodies to the adjuvant (1: 400) and the titer of antibodies to the microbial antigen (1: 100). The differences between the two inventions include, first of all, the use of the indicated anhydride for modification of antigenic complexes different in chemical nature: peptidoglycan - in the analogue, protein substance - in the present invention. In addition, in the known invention, an antigenic complex that is used as an adjuvant is susceptible to acylation, and in the claimed model, the residues of organic acids in the structure of the modified antigen themselves are adjuvant compounds.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является разработать вакцины с повышенной иммуногенностью и эффективностью, в том числе при пероральном применении, и способ их получения.The objective of the invention is to develop vaccines with increased immunogenicity and effectiveness, including when administered orally, and a method for their preparation.
Поставленная задача решается путем разработки вакцин с повышенной иммуногенностью и способа их получения, отличающегося тем, что в качестве специфического иммуногенного компонента используют нарезанный на олигомерные фрагменты вакцинный антиген - полисахарид, белок, липополисахарид либо цельный антиген - бактерию, вирус, смесь белков бактерии или вируса, а полученная смесь (ансамбль) олигомерных фрагментов модифицирована путем изменения заряда на противоположный путем ацилирования янтарным ангидридом или алкилированием монохлоруксусной кислотой; также в качестве специфического иммуногенного компонента используют вакцинный антиген с частично измененным на противоположный зарядом молекулы, изменение заряда которого проводят ацилированием или алкилированием с образованием смеси (ансамбля) вакцинных антигенов с разным зарядом молекул. Нами использован ансамбль из нарезанных на олигомерные фрагменты вакцинных антигенов, являющихся специфическими иммуногенными компонентами с измененными на противоположные зарядами молекул. Супрамолекулярный ансамбль или ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии - супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т.е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [17,18].The problem is solved by developing vaccines with increased immunogenicity and a method for their preparation, characterized in that a vaccine antigen cut into oligomeric fragments, a polysaccharide, a protein, a lipopolysaccharide or a whole antigen, is used as a bacterium, a virus, a mixture of bacteria or virus proteins, and the resulting mixture (ensemble) of oligomeric fragments is modified by reversing the charge by acylation with succinic anhydride or monochlorax alkylation hydrochloric acid; Also, as a specific immunogenic component, a vaccine antigen with a partially reversed molecular charge is used, the charge change of which is carried out by acylation or alkylation to form a mixture (ensemble) of vaccine antigens with different molecular charges. We used an ensemble of vaccine antigens cut into oligomeric fragments, which are specific immunogenic components with molecules reversed to opposite charges. Supramolecular ensemble or ensemble is a term from supramolecular chemistry. The objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, i.e. having geometrical and chemical correspondence of fragments, similar to spontaneous assembly of complex spatial structures in a living cell [ 17 , 18 ].
Эта технология может быть использована для создания других вакцин: для профилактики таких инфекций, как грипп, гепатиты, вирусы герпеса, кори, краснухи, ВИЧ/СПИД, вирусных инфекций животных: болезни Нью-Касла, инфекционной бурсальной болезни птицы, классической чумы свиней, африканской чумы свиней и любых других заболеваний. В связи с частичной модификацией структуры в процессе реакции модификации образуется огромное количество разнообразных производных вакцинного антигена с разной иммуногенностью и структурой и соответственно иммунная система индуцирует синтез большего количества моноклонов в ответ на эти новые антигенные детерминанты. Кроме того, такое разнообразие новых эпитопов (сотни тысяч или даже миллионы) позволяет предиктивно защищать организм от еще несуществующих будущих штаммов гриппа и мутантных вирусов ВИЧ/СПИД.This technology can be used to create other vaccines: for the prevention of infections such as influenza, hepatitis, herpes viruses, measles, rubella, HIV / AIDS, animal viral infections: New Castle disease, infectious bursal disease of the bird, classical swine fever, African swine fever and any other diseases. Due to the partial modification of the structure during the modification reaction, a huge number of various vaccine antigen derivatives with different immunogenicity and structure are formed and, accordingly, the immune system induces the synthesis of more monoclones in response to these new antigenic determinants. In addition, such a variety of new epitopes (hundreds of thousands or even millions) allows us to predictively protect the body from future nonexistent strains of the flu and mutant HIV / AIDS viruses.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг. 1 - зависимость между титром индуцируемых специфических антител и степенью ацилирования корпускулярного синегнойного антигена;FIG. 1 - the relationship between the titer of specific antibodies induced and the degree of acylation of the corpuscular pseudomonas antigen;
фиг. 2 - зависимость между титром индуцируемых специфических антител и степенью ацилирования растворимого высокомолекулярного синегнойного антигена.FIG. 2 - the relationship between the titer of specific antibodies induced and the degree of acylation of soluble high molecular weight Pseudomonas antigen.
Лучший вариант осуществления изобретенияThe best embodiment of the invention
Пример 1. Получение синегнойной вакцины на основе композиции вакцинных антигенов с измененным зарядом молекулExample 1. Obtaining a Pseudomonas vaccine based on a composition of vaccine antigens with a modified charge of molecules
Синегнойную палочку культивировали на твердой питательной среде (МПБ с добавлением 1% глюкозы). Через трое суток поверхность питательной среды всплошную была покрыта синегнойной палочкой. Из поверхности среды в чашке Петри делали смыв 0,9% раствором натрия хлорида, а полученную суспензию трехкратно отмывали и центрифугировали. После повторного суспендирования суспензию микроорганизмов прогревали в термостате в течение 140 мин при 80°С, а затем опять засевали на ПМА сPseudomonas aeruginosa was cultured on solid nutrient medium (BCH with the addition of 1% glucose). After three days, the surface of the nutrient medium was completely covered with Pseudomonas aeruginosa. Washings were made from the surface of the medium in a Petri dish with a 0.9% sodium chloride solution, and the resulting suspension was washed three times and centrifuged. After repeated suspension, the suspension of microorganisms was heated in a thermostat for 140 min at 80 ° C, and then again sown on PMA with
- 2 025417 целью контроля инактивации. По количеству микробных тел полученная суспензия отвечала 10 млрд. клеток/мл; затем 0,1 мл суспензии разводили в 100 раз 0,9% раствором натрия хлорида и устанавливали концентрацию поверхностных белков с помощью Биуретового метода и в реакции комплексообразования с бромфеноловым голубым методом Флореса [3]. В пересчете на белок проводили реакцию ацилирования раствором янтарного ангидрида, как было показано в примере 1 [6]. Получили 8 образцов с разными степенями ацилирования: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15%. Превышение 15% полностью лишает иммуногенности сукцинилированные белки, потому производные со степенями модификации, большими за 15% не считали целесообразным получать и использовать в дальнейшем. Корпускулярный антиген с разной степенью ацилирования дальше использовали для установления его иммуногенности. Другую часть антигена центрифугировали 40 мин при 3 тыс. об./мин. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость пропускали через колонку с сефадексом 0-75. Первую, самую тяжелую фракцию собирали и использовали дальше для установления концентрации белка и степени химической модификации. Полученный антиген представлял собой однородную фракцию (одно полимерное вещество) и имел молекулярную массу 1,5 мДа и заряд - 186000. Получали растворимый гликопротеидный антиген с такими степенями ацилирования: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15%.- 2 025417 to control inactivation. According to the number of microbial bodies, the resulting suspension corresponded to 10 billion cells / ml; then 0.1 ml of the suspension was diluted 100 times with 0.9% sodium chloride solution and the surface protein concentration was determined using the Biuret method and in the complexation reaction with the bromophenol blue Flores method [3]. In terms of protein, the acylation reaction of succinic anhydride was carried out, as was shown in example 1 [6]. Received 8 samples with different degrees of acylation: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15%. Exceeding 15% completely deprives immunogenicity of succinylated proteins; therefore, derivatives with degrees of modification greater than 15% were not considered advisable to receive and use in the future. Corpuscular antigen with varying degrees of acylation was further used to establish its immunogenicity. The other part of the antigen was centrifuged for 40 min at 3 thousand rpm. The precipitate was discarded, and the supernatant was passed through a Sephadex 0-75 column. The first, heaviest fraction was collected and used further to establish the protein concentration and degree of chemical modification. The resulting antigen was a homogeneous fraction (one polymer substance) and had a molecular weight of 1.5 mDa and a charge of 186000. A soluble glycoprotein antigen was obtained with such degrees of acylation: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15%.
Общеизвестно, что при использовании фильтрации геля распределение белков проходить по размерам белковой глобулы. Гель-фильтрацию [7] проводили на колонках, заполненных гелем сефадекс 0-75. Общий объем столбика геля определяли VI. В течение элюирования крупные молекулы, которые не проникают в гранулы геля, двигаются с большой скоростью совместно с межгранульным растворителем и появляются в виде узкой полосы. Объем элюента, который соответствует появлению этой зоны, определяли как νο (свободный объем). Менее крупные молекулы проходили колонку медленно, проникали в гранулы геля, а выход их из колонки был весьма долговременным. В связи с тем, что степень диффузии в гранулы геля зависит от размера молекул, вещества выделяются из колонки в порядке уменьшения их молекулярной массы. Молекулярная масса М опытного протеида устанавливалась путем сравнения объема элюирования νο с аналогичным параметром белков-маркеров.It is well known that when using gel filtration, the distribution of proteins proceeds according to the size of the protein globule. Gel filtration [7] was performed on columns filled with Sephadex 0-75 gel. The total volume of the gel column was determined VI. During elution, large molecules that do not penetrate into the granules of the gel move with high speed together with the intergranular solvent and appear in the form of a narrow strip. The volume of eluent, which corresponds to the appearance of this zone, was determined as νο (free volume). Smaller molecules passed the column slowly, penetrated into the gel granules, and their exit from the column was very long-term. Due to the fact that the degree of diffusion into the granules of the gel depends on the size of the molecules, substances are released from the column in order of decreasing molecular weight. The molecular mass M of the experimental proteid was established by comparing the elution volume νο with a similar parameter of marker proteins.
Для выделения антигена использовали колонку диаметром 25 мм и длиной 1000 мм. Гель сефадекс 0-75 и 0-25 предварительно готовили таким образом: к буферному раствору (0,1М ТРИС -НС1 и 0,1 М ЫаС1, рН=8,0) медленно добавляли гранулы геля, удерживали в термостате 72 ч при I = 37°С. Потом гель диаэрировали (постепенно и осторожно перемешивали в избыточном количестве буферного раствора для удаления газовых пузырей) на шейкере на протяжении часа. На дно колонки клали фильтровальную бумагу. К колонке медленно добавляли немного буферного раствора, потом по стенке переносили небольшое количество (5 г) суспензии набухнувших гранул геля сефадекс 0-25. После формирования столбика геля через колонку пропускали не менее двух объемов рабочего буферного раствора. Затем наносили микропипеткой 100 мкл раствора образца. Постоянную скорость элюирования задавали благодаря установлению над колонкой капельницы с буферным раствором и роликом регулировали скорости элюирования. Элюат собирали в пробирки по 0,5 мл и анализировали на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 280 нм за методикой [4].A column with a diameter of 25 mm and a length of 1000 mm was used to isolate the antigen. Gel Sephadex 0-75 and 0-25 were preliminarily prepared in this way: gel granules were slowly added to the buffer solution (0.1 M TRIS-HCl and 0.1 M NaCl, pH = 8.0), kept in a thermostat for 72 h at I = 37 ° C. Then the gel was diaererified (gradually and carefully mixed in excess buffer solution to remove gas bubbles) on a shaker for an hour. Filter paper was placed at the bottom of the column. A little buffer solution was slowly added to the column, then a small amount (5 g) of a suspension of swollen Sephadex 0-25 gel pellets was transferred along the wall. After the gel column was formed, at least two volumes of the working buffer solution were passed through the column. Then, 100 μl of the sample solution was micropipeted. A constant elution rate was set due to the establishment of a dropper with a buffer solution over the column, and the elution rate was controlled by a roller. The eluate was collected in 0.5 ml tubes and analyzed on an SF-56 spectrophotometer at a wavelength of 280 nm following the procedure [4].
Антисинегнойная сыворотка для диагностических целей с титром специфических антисинегнойных антител (1:1000) была получена по стандартной схеме иммунизации мышей, по схеме [1] термически инактивированной корпускулярной синегнойной вакциной с концентрацией частиц 10 млрд./мл., которую вводили на 3; 5 и 7 сутки в дозе 0,2 мл внутримышечно. Для получения контрольной сыворотки использовали 20 мышей.Anti-Pseudomonas serum for diagnostic purposes with a titer of specific anti-Pseudomonas antibodies (1: 1000) was obtained according to the standard immunization scheme for mice, according to the scheme [1] of a thermally inactivated corpuscular Pseudomonas vaccine with a particle concentration of 10 billion / ml, which was administered at 3; 5 and 7 days at a dose of 0.2 ml intramuscularly. To obtain control serum, 20 mice were used.
Для иммунизации животных в опыт взяты ацилированные образцы как корпускулярного антигена (по 10 животных в группе на один образец, 8 групп), так и ацилированного растворимого антигена (8 образцов по 10 животных на образец). Первой группе животных вводили 8 образцов антигена (по 10 животных на каждый образец перорально по 0,2 мл) по схеме Пастера (в 1; 3 и 7 дни), второй группе - по схеме профессора Бабича Е.М. (через день по 0,2 мл перорально в течение 15 дней) [1]. Уровень антител устанавливали двумя методами: реакцией гемаглютинации и методом флуоресцирующих антител. По 3 животных из каждой группы оставляли живыми до 15 суток, убивали эфиром и получали сыворотку, где также устанавливали уровень специфических антител вышеприведенными методами. Для реализации указанного готовили тест-систему для реакции прямой гемагглютинации, которую проводили в 96луночных круглодонных иммунологических планшетах, куда добавляли по 0,02 мл 0,1% суспензии термостатированных эритроцитов барана и по 0,02 мл суспензии термоинактивированных клеток синегнойной палочки в концентрации 10 млрд. клеток/мл. Уровень антител устанавливали последовательными десятикратными (но двукратными) разведениями сывороток крови мышей, которые добавляли в количестве 0,02 мл к лункам планшетов. Наличие агглютинатов свидетельствовало об образовании иммунных комплексов. Как контрольные использовали нормальный человеческий иммуноглобулин (титр антисинегнойных антител составлял от 0 к (1:10) согласно АНД) и сыворотку крови невакцинированных мышей (титр от 0 до 1:10).For immunization of animals, acylated samples of both corpuscular antigen (10 animals per group per sample, 8 groups) and acylated soluble antigen (8 samples, 10 animals per sample) were tested. The first group of animals was injected with 8 samples of antigen (10 animals per oral sample of 0.2 ml) according to the Pasteur scheme (on days 1, 3 and 7), the second group - according to the scheme of Professor Babich E.M. (every other day, 0.2 ml orally for 15 days) [1]. The level of antibodies was established by two methods: a hemagglutination reaction and a method of fluorescent antibodies. Three animals from each group were left alive for up to 15 days, killed with ether and serum was obtained, where the level of specific antibodies was also established by the above methods. To implement this, a test system for the direct hemagglutination reaction was prepared, which was carried out in 96-well round-bottom immunological plates, to which 0.02 ml of a 0.1% suspension of thermostated ram red blood cells and 0.02 ml of a suspension of thermally inactivated Pseudomonas aeruginosa cells were added at a concentration of 10 billion cells / ml Antibody levels were determined by serial ten-fold (but twofold) dilutions of the blood sera of mice, which were added in an amount of 0.02 ml to the wells of the plates. The presence of agglutinates testified to the formation of immune complexes. As controls, we used normal human immunoglobulin (the titer of anti-pseudomonas antibodies ranged from 0 to (1:10) according to the AED) and the blood serum of unvaccinated mice (titer from 0 to 1:10).
Первым образцом была модель корпускулярной вакцины на основе инактивированной пастеризацией синегнойной палочки. Ацилировали только поверхностные антигены. Степень ацилирования колебалась от 1 до 15% с шагом в 2%. Всего исследовано по 8 образцов модифицированного растворимогоThe first sample was a corpuscular vaccine model based on inactivated pasteurization of Pseudomonas aeruginosa. Only surface antigens were acylated. The degree of acylation ranged from 1 to 15% in increments of 2%. A total of 8 samples of modified soluble were studied.
- 3 025417 антигена и по 8 корпускулярного антигена. Результаты исследования иммуногенности полученных образцов иллюстрируют данные фиг. 1.- 3 025417 antigens and 8 corpuscular antigens. The results of the immunogenicity study of the obtained samples are illustrated in FIG. one.
Как видно из фиг. 1, на 15 сутки после инъекционного введения нативного вакцинного препарата средний титр антител у вакцинированных животных составлял (1:640). При этом пероральное использование нативного корпускулярного антигена не вызывало индукцию синтеза специфических антител.As can be seen from FIG. 1, on the 15th day after the injection of the native vaccine, the average antibody titer in vaccinated animals was (1: 640). At the same time, oral use of the native corpuscular antigen did not induce the synthesis of specific antibodies.
Химически модифицированный антиген из степенью модификации в 1 % от концентрации в нем белка индуцировал синтез такого же уровня антител, как и нативный антиген (1:640). Модификация поверхностных антигенов на 3 % приводила к индукции антител на уровне (1:320) для перорального варианта и на уровне (1:2560) для инъекционного варианта.A chemically modified antigen with a degree of modification of 1% of the protein concentration in it induced the synthesis of the same level of antibodies as the native antigen (1: 640). Modification of surface antigens by 3% led to the induction of antibodies at the level of (1: 320) for the oral variant and at the level of (1: 2560) for the injection variant.
Для производных антигенов с другими степенями ацилирования при их пероральном применении не наблюдалось индукции синтеза специфических антисинегнойных антител. При этом, инъекционный вариант был эффективным даже к производному с 15% степенью ацилирования. Так, производное со степенью ацилирования 5% индуцировало синтез антител на уровне (1:1280), производное с 7% степенью ацилирования антигена - на уровне (1: 320), производное из 9% - на уровне (1:40), другие варианты (с 11 и 15% степенью модификации) - на уровне (1:20).For derivatives of antigens with other degrees of acylation during their oral administration, the synthesis of specific anti-Pseudomonas antibodies was not observed. Moreover, the injection option was effective even to the derivative with a 15% degree of acylation. Thus, a derivative with an acylation degree of 5% induced the synthesis of antibodies at the level of (1: 1280), a derivative with a 7% degree of acylation of the antigen at the level of (1: 320), a derivative of 9% at the level of (1:40), other variants (with 11 and 15% degree of modification) - at the level of (1:20).
Таким образом, наиболее эффективным оказалось производное со степенью ацилирования 3%, которое индуцировало синтез специфических антител как при использовании классической схемы вакцинации Л. Пастера при инъекционном применении, так и при использовании схемы вакцинации Е. Бабича при пероральном применении вакцины.Thus, the derivative with an acylation degree of 3% turned out to be the most effective, which induced the synthesis of specific antibodies both when using the classical L. Pasteur vaccination regimen for injection and when using the E. Babich vaccination regimen for oral administration of the vaccine.
На следующей фиг. 2 приведена зависимость между уровнем индуцируемых специфических антител и степенью ацилирования растворимого модифицированного антигена (первая фракция).In the following FIG. Figure 2 shows the relationship between the level of specific antibodies induced and the degree of acylation of soluble modified antigen (first fraction).
Этот вариант антигена-кандидата представляет собой химическую монокомпонентную вакцину на основе гликопротеидного модифицированного высокомолекулярного антигена с массой 1,5 мДа и зарядом молекулы 186000. Именно наибольшая молекулярная масса или первая фракция, которая выходит из колонки при разделе фракций, оказывалась наиболее иммуногенной. При исследовании структуры полученного антигена была подтверждена корреляция между изменением заряда и массы антигена, который подтверждает состояние завершения химической реакции модификации структуры антигена. Следует обратить внимание на интересный факт, обнаруженный во время инъекционной вакцинации мышей: введение немодифицированной вакцины (на седьмой день - третий раз) вызывало у части животных проявления аллергической реакции в виде тремора, падения двигательной активности и отказа от употребления пищи на протяжении суток.This variant of the candidate antigen is a chemical monocomponent vaccine based on a glycoprotein modified high molecular weight antigen with a mass of 1.5 mDa and a molecular charge of 186,000. It was the largest molecular weight or the first fraction that comes out of the column when the fractions are divided that turned out to be the most immunogenic. When studying the structure of the obtained antigen, a correlation between the change in charge and mass of the antigen was confirmed, which confirms the state of completion of the chemical reaction of the modification of the structure of the antigen. Attention should be paid to an interesting fact discovered during injection vaccination of mice: the introduction of an unmodified vaccine (on the seventh day - the third time) caused an allergic reaction in some animals in the form of tremor, decreased motor activity and refusal to eat during the day.
При этом, введение всех модифицированных вариантов вакцины не вызывало побочных явлений у животных. Ацилированный вариант растворимого антигена со степенью ацилирования 1%, как и неацилированный антиген вызывал индукцию синтеза одинакового количества антител в титре (1:1280). Пероральное применение растворимого антигена и антигена со степенью ацилирования в 1% не приводило к существенной индукции синтеза специфических антисинегнойных антител. Производное растворимого антигена со степенью ацилирования 3% активировало синтез антител на уровне (1:5120) в инъекционном варианте и (1:1280) при пероральном использовании.Moreover, the introduction of all modified variants of the vaccine did not cause side effects in animals. An acylated variant of a soluble antigen with an acylation degree of 1%, as well as an un-acylated antigen, induced the synthesis of the same amount of antibodies in the titer (1: 1280). Oral administration of soluble antigen and antigen with an acylation degree of 1% did not lead to a significant induction of the synthesis of specific anti-Pseudomonas antibodies. A soluble antigen derivative with an acylation degree of 3% activated the synthesis of antibodies at the level of (1: 5120) in the injection version and (1: 1280) when taken orally.
Ацилированное на 5% производное индуцировало синтез специфических антител на уровне (1: 640) для пероральной формы применения и на уровне (1:2560) - для инъекционной формы. Производное со степенью ацилирования 7% индуктировало синтез специфических антител на уровне (1:640) - для пероральной формы и (1:1280) для инъекционной. Для растворимого антигена со степенью ацилирования 11% соответствующий уровень индуцируемых специфических антител составлял (1:320) для оральной формы вакцины и (1:640) - для инъекционной формы. Уровни синтеза антител уравнялись у вакцинированных животных при пероральном и инъекционном применении лишь при использовании вакцинного препарата с уровнем ацилирования 13% и равнялись 1:40, а при степени ацилирования в 15% иммуногенной была только инъекционная форма вакцины - кандидата, она индуктировала синтез антител на уровне (1:20).A 5% acylated derivative induced the synthesis of specific antibodies at the level (1: 640) for the oral form of administration and at the level (1: 2560) for the injectable form. The derivative with an acylation degree of 7% induced the synthesis of specific antibodies at the level of (1: 640) for the oral form and (1: 1280) for the injectable. For a soluble antigen with an acylation degree of 11%, the corresponding level of specific antibodies induced was (1: 320) for the oral form of the vaccine and (1: 640) for the injectable form. The levels of antibody synthesis were equalized in vaccinated animals when administered orally and injected only when using a vaccine preparation with an acylation level of 13% and equal 1:40, and when the degree of acylation was 15%, only the injection form of the candidate vaccine was immunogenic, it induced antibody synthesis at the level of (1:20).
Таким образом, характерным отличием растворимого высокомолекулярного антигена оказалась индукция синтеза антител не только производным со степенью ацилирования 3%, но производными со степенями ацилирования 5, 7, 11, 13% при пероральном применении по выше отмеченной схеме Бабича Е.М. В четыре раза большим был титр антител при инъекционном применении самого эффективного производного со степенью ацилирования 3%, чем при его же пероральном применении. В сравнении с корпускулярным модифицированным антигеном ацилированное на 3% производное растворимого антигена было вдвое эффективнее по иммуногенности при инъекционном и в четыре раза более эффективным - при пероральном его применении. Невзирая на значительно большую антигенную нагрузку, чем при инъекционном использовании, пероральное применение частично ацилированного растворимого антигена оказалось эффективным и индуцировало уровень антител, который в перспективе в состоянии долговременно (год и больше) защищать организм от синтегнойной инфекции. Использование пероральной вакцинации несомненно является перспективным направлением усовершенствования иммунобиологических средств.Thus, the characteristic difference between the soluble high molecular weight antigen was the induction of antibody synthesis, not only derivatives with an acylation degree of 3%, but derivatives with acylation degrees of 5, 7, 11, 13% when administered orally according to the above scheme of Babich E.M. The antibody titer was four times greater when injected with the most effective derivative with an acylation degree of 3% than with oral administration. Compared with the modified particulate antigen, the 3% acylated derivative of the soluble antigen was twice as effective in immunogenicity when injected and four times as effective in oral administration. Despite the significantly greater antigenic load than with injectable use, the oral administration of a partially acylated soluble antigen was effective and induced an antibody level that, in the long term, is able to protect the body from synth integral infection for a long time (a year or more). The use of oral vaccination is undoubtedly a promising area for improving immunobiological agents.
Среди полученных вариантов ацилированных антигенов выбран сукцинилированный на 3 мас.%Among the obtained variants of acylated antigens, succinylated by 3 wt.% Was selected.
- 4 025417 белка растворимый гликопротеидный антиген, который при пероральном применении на 15 сутки вызывал индукцию синтеза специфических антител в титре (1:1280) и титра (1:5120) - при его же инъекционном применении.- 4,025417 proteins are a soluble glycoprotein antigen, which, when administered orally for 15 days, induced the synthesis of specific antibodies in titer (1: 1280) and titer (1: 5120) - when injected.
Пример 2. Получение антидифтерийной вакцины на основе композиции вакцинных антигенов с измененным зарядом молекулExample 2. Obtaining an anti-diphtheria vaccine based on a composition of vaccine antigens with a modified charge of molecules
Микробную массу получают из производственного штамма Ρν - 8 вариант Вейсензее путем культивирования бактерий С. ШрЫНепае на бульоне Лингуда с добавлением 0,3% глюкозы или мальтозы. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 36 ч, после чего микробную массу отделяют от токсина с помощью центрифугирования (6000 об/хв. в течение 30 мин). Полученный осадок (п-грамм сырой массы) заливают этанолом (концентрация 96°) в объеме (2-4) п мл, выдерживают в холодильнике при температуре 4°С 24 ч и центрифугуют в отмеченном режиме. Микробный осадок заливают (2-10) п мл физ. раствором, доводят рН до 7,2-7,4, охлаждают до 4-6°С, оставляют на 3-4 ч, дальше центрифугуют (6000 об./мин. в течение 30 мин). К полученному осадку постепенно добавляют 0,8% раствор этилендиаминтетраацетата динатриевой соли (ЕДТА-Ыа2), одновременно растирают в фарфоровой ступке до получения белой, тягучей массы. Выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С 18 ч. Экстракт центрифугируют при 6000 об./мин в течение 30 мин, после чего проводят диализ против дистиллированной воды при рН 7,2-7,5 и сгущают полиэтиленгликолем с молекулярной массой 15000 Да или сефадексом С 200 §ирегйпе 1 к объему п мл. Экстракт ЕДТА переосаждают при рН 7,0. В состав выделенных антигенных комплексов входят белки (75,3±3,4)%, липиды (23,3±4,1)% и углеводы (1,4±0,4)%. Готовят водную суспензию соматических антигенов, ориентируясь на получение необходимой их концентрации для проведения пероральной прививки (5,0 мг/л), доводят рН до 8,5-9,0 с помощью 1,0% раствора гидроокиси натрия или 1,0% уксусной кислоты, устанавливают на спектрофотометре (длина волны 230 нм) точное содержимое белковой субстанции. Соматический комплекс модифицируют янтарным ангидридом по отношению к содержимому белку. Иммуногенные свойства полученных комплексов определяют на кролях породы шиншилла весом 3,0-3,5 кг. Создание грундиммунитета у животных проводят по схеме двукратного введения антигена в дозе 5,0 мг через час до кормления с суточным интервалом в течение пяти дней. Серологическое обследование выполняют через 7, 14 и 21 день после последней прививки с помощью стандартного дифтерийного эритроцитарного диагностикума с титром 1:3200 (см. таблицу).The microbial mass is obtained from the production strain Ρν - the 8 variant of Weissensee by cultivating the bacteria C. Schrynepae in Linguud broth with the addition of 0.3% glucose or maltose. The cultivation is carried out at a temperature of 37 ° C for 36 hours, after which the microbial mass is separated from the toxin by centrifugation (6000 rpm for 30 minutes). The resulting precipitate (p-gram of wet weight) is poured with ethanol (concentration 96 °) in a volume of (2-4) p ml, kept in a refrigerator at 4 ° C for 24 hours and centrifuged in the marked mode. Microbial sediment is poured (2-10) p ml of physical. solution, adjust the pH to 7.2-7.4, cool to 4-6 ° C, leave for 3-4 hours, then centrifuged (6000 rpm. for 30 minutes). To the precipitate obtained, a 0.8% solution of disodium salt ethylene diamine tetraacetate (EDTA-Na 2 ) is gradually added, and triturated in a porcelain mortar until a white, viscous mass is obtained. It is kept in the refrigerator at a temperature of 4-6 ° C for 18 hours. The extract is centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes, after which it is dialyzed against distilled water at a pH of 7.2-7.5 and concentrated with polyethylene glycol with a molecular weight of 15,000 Da or Sephadex C 200 § 1 unit to the volume of p ml. EDTA extract was reprecipitated at pH 7.0. The selected antigenic complexes include proteins (75.3 ± 3.4)%, lipids (23.3 ± 4.1)% and carbohydrates (1.4 ± 0.4)%. An aqueous suspension of somatic antigens is prepared, focusing on obtaining the necessary concentration for oral vaccination (5.0 mg / l), adjust the pH to 8.5-9.0 with a 1.0% sodium hydroxide solution or 1.0% acetic acid acid, set on a spectrophotometer (wavelength 230 nm) the exact contents of the protein substance. The somatic complex is modified with succinic anhydride in relation to the protein content. The immunogenic properties of the obtained complexes are determined on chinchilla rabbits weighing 3.0-3.5 kg. The creation of grossimmunity in animals is carried out according to the scheme of double administration of antigen in a dose of 5.0 mg one hour before feeding with a daily interval for five days. Serological examination is performed 7, 14 and 21 days after the last vaccination using a standard diphtheria erythrocyte diagnosticum with a titer of 1: 3200 (see table).
Титры антидифтерийных антител в сыворотках крови кролей после вакцинацииAntidiphtheria antibody titers in rabbit serum after vaccination
Полученные результаты свидетельствуют, что модифицированные антигены имеют разную способность влиять на гуморальный иммунитет. Применение модификатора в количестве 1,0% и меньше, а также 5,0% и больше по отношению к массе белкового компонента не приводило к индукции титров антитела у животных, тогда как ацилирование 2,0-4,0 мас.% белка приводило к индукции защитных титров в крови перорально вакцинированных кролей к титру 1:2560 с сохранением его до 21 суток.The results obtained indicate that modified antigens have different ability to influence humoral immunity. The use of a modifier in an amount of 1.0% or less, as well as 5.0% or more with respect to the weight of the protein component did not lead to the induction of antibody titers in animals, while acylation of 2.0-4.0 wt.% Protein led to the induction of protective titers in the blood of orally vaccinated rabbits to a titer of 1: 2560 with preservation of it up to 21 days.
- 5 025417- 5,025417
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а конкретно к вакцинологии, и может быть использовано для создания средств специфической профилактики инфекционных, онкологических и других. заболеваний. Способ позволяет осуществить модификацию существующих вакцинных антигенов прямо на фармацевтическом предприятии, на доступном оборудовании, значительно сократить стоимость полученных вакцин, уменьшить их побочные эффекты, создавать пероральные формы вакцин. Уникальное оборудование для осуществления изобретения не требуется.The invention relates to medicine and veterinary medicine, and specifically to vaccinology, and can be used to create means of specific prophylaxis of infectious, oncological and others. diseases. The method allows to modify existing vaccine antigens directly at a pharmaceutical enterprise, using affordable equipment, significantly reduce the cost of vaccines received, reduce their side effects, create oral forms of vaccines. Unique equipment for carrying out the invention is not required.
Использованные источники информацииInformation Sources Used
1) КоЬЫпз I. В., К. 8сйпеегзоп апб 8. С. δζυ. 1995. Регзресйуе: йуроГйез1з: зегит 1дС апйЬобу ίδ зиГЛС1сп1!о сопГег ргоГесйоп адатз! ЫГесйоиз б1зеазе Ьу 1пасЛуабпд !йе шоси1иш. 1. 1пГес!. Όίδ. 171:1378-1398.1) KoBiPz I.V., K. 8.Speypezop apb 8.C. δζυ. 1995. Regress: yurogoz1z: zegit 1dS apyobu ίδ ziGLS1sp1! About sopGeg rgoGesyop adatz! Liguiois bazzeu lu pasLuabpd! Ye shosi1ish. 1.1pGes !. Όίδ. 171: 1378-1398.
2) Эе1 Уа1, Μ., Η. 1. 8сйИсйГ, Н. Уо1кшег, М. Меззег1е, Μ. 1. Кеббейазе апб и. Н. Козζ^по№зк^. 1991. РгоГесбоп адатз! 1е1йа1 суГотеда1оу1гиз тГесйоп Ьу а гесотЬшапГ уассте сопГштпд а зшд1е попатепс Тсе11 ерйоре. 1. У1го1. 65:3641-3646.2) Ee1 Ba1, Μ., Η. 1. 8syIsyG, N. Uo1ksheg, M. Mezzeg1e, Μ. 1. Kebbeyase apb and. N. Kozζ ^ by number ^. 1991. RgoGesbop Adatz! 1e1a1 suGoteda1o1giz tGesyop uy and gesotshapG uasste soprstpd and zsd1e popateps Tse11 yereyore. 1. U1go1. 65: 3641-3646.
3) Ьагзеп Ό. Ь., А. Кагазш апб С. О1зеп. 2001. йптш^айоп оГ р1дз адатз! тЛиег^а уйиз 1пГесбоп3) Lagzep Ό. B., A. Kagazsh apb S. O1zep. 2001. tlieg ^ a uyiz 1nGesbop
Ьу ΌΝΑ уассше рпттд Го11о\уеб Ьу кШеб-У1гиз уассте ЬоозЛпд. Уассше 19: 2842-2853.У ΌΝΑ асс асс ше т т Г Г 11 11 11 11 11 11 оз оз оз оз Л Л Л. Wassche 19: 2842-2853.
4) Сют-8ат Ь., Вгипе ВиЫс I., .Топрс 8., [^ζίΓκ^λΈΐα и. Н. (2003). УассшаЛоп оГ Мюе \\йй Вас!епа Саггутд а С1опеб Негрезуйиз Сепоте КесопзЫиГеб 1п У1уо. 1. Уйо1. 77: 8249-8255.4) Syut-8at b., In Hype ViS I., Topres 8., [^ ζίΓκ ^ λΈΐα and. N. (2003). WasslaLop oG Mueh \\ yy! Ene Saggutd a C1opeb Negrezuyiz Sepote KesopsyuGeb 1n U1uo. 1. Uyo1. 77: 8249-8255.
5) Ьеуш 8.А., ЭизйоГГ 1., Р1о1кш ТВ. ЕуоЫйоп апб регазГепсе оГ тЛиег^а А апб о!йег б1зеазез. Ма!й ВюзсГ 2004 Маг-Арг; 188:17-28.5) Leush 8.A., EizioGG 1., P1o1ksh TV. EyUyyop apb regazGepse oG tlieg ^ a And apb o! May! VyuzsG 2004 Mag-Arg; 188: 17-28.
6) Теггедшо С., ТоГГап А., ВеаГо М.8., Эе №γ6ι К., Игадо А., Сариа 1.СопуепЛопа1 Η5Ν9 уассте зирргеззез зйеббшд ш зресГЛс-раГйодеп-Ггее Ыгбз сйа11епдеб \\йй НРА1 Η5Ν1 А/с1йскеп/Уатадис1и/7/2004. Ау1ап И1з. 2007, Маг; 51(1 8ирр1): 495-7.6) Teghedsho S., ToGGap A., BeaGo M.8., Ee No. γ6ι K., Igado A., Saria 1. SopuepLopa 1 Η5 у9 wasste sirrgezzez ziebbshd shresGLs-raGyodep-Ggee гgbz syyepsep1 \\ / Huatadis 1i / 7/2004. Au1ap I1z. 2007, Mage; 51 (1 8irr1): 495-7.
7) Мебуебеуа М.К, РеГгоу ΝΑ, Уазбепко 8.К., 81тапоузка1а У.К., Со1иЬеу И.В. Тйе сйагас!епзйсз оГ !йе йетаддЫЛпЫ Ггот регз1з1еп1 уапапГз оГ !йе тЛиег^а У1гиз А/Ую!опа/35/72 (Н3№). Уорг Уйизо1. 1990 8ер-Ос!;35(5): 374-6.7) Mebuebueua M.K., ReGgow ΝΑ, Uazbeppko 8.K., 81stouzka1a U.K., So1ieBeu I.V. Thye siagas! Épézs oG! Ei étaddyLGY Ggot regz1z1ep1 uapapGz oG! Ee tLieg ^ a U1giz A / Uyu! Opa / 35/72 (Н3№). Worg Uyiso 1. 1990 8er-Os!; 35 (5): 374-6.
8) Агопззоп Р., КоЬейзоп В., Ципддгеп Н.С., КпзГепззоп К. 1пуазюп апб регз1з1епсе оГ !йе пеигоабарГеб тЛиег^а уйиз А/\У8№33 щ !йе тоизе о1Гас!огу зузГет. Уйа1 1ттипо1. 2003;16(3): 415-23.8) Agopzzop R., Kojesop V., Tsipdgep N.S., KpzGepzzop K. 1poysup apb regz1z1epse oh! Uya1 1ttypo1. 2003; 16 (3): 415-23.
9) Сох ММ. Уасстез ш беуе1ортеп! адатз! ау1ап тЛиег^а. Мтегуа Меб. 2007 Арг; 98(2): 145-53.9) Sokh MM. Waststez W Beue1ortep! adatz! ay1ap tlieg ^ a. Megteua Meb. 2007 Arg; 98 (2): 145-53.
10) Сгопуа11 С.К., Вопо Ь.Ь. Кетоушд Ьатегз !о д1оЬа1 рапбеппс тЛиег^а уасстайоп. Вюзесиг ВюГеггог. 2006; 4(2): 168-75.10) Sgopua11 S.K., Vopo L.B. Ketooshd Lutz! O DlOaa1 rapbepps tilieus ausstap. Vyuzesig Vyuggogog. 2006; 4 (2): 168-75.
11) Мабупоу А.У., ВаЬусй Е.М., 8те1уапзкауа М.У. 1псгеазе оГ уасстез аб.щуапбсйу Ьу зиссшу1абоп оГ уассше апбдеп//Ке.)иуепабоп Кезеагсй.- Аид 2005, уо1. 8, №. 1 :Р. 14-17 (РозГег оГ СопГгетсе).11) Mabupou A.U., Baussy E.M., 8te1uapzkaua M.U. Psegease OG Waststez Ab. Schuapbsyu Zisschu1abop OG Wassche Apbdep // Ke.) Iuepabop Kezeagsy.- Hades 2005, wo1. 8, no. 1: p. 14-17 (RoseGeg oG SopGgetse).
12) ТаиЬепЬегдег ЕК., Могепз И.М., Раит А.8. Тйе пех! шЛиета рапбеппс: сап ίΐ Ье ргебюГеб? ГАМА. 2007 Мау 9; 297(18): 2025-7.12) Tayebbegdeg EK., Mogepz I.M., Rait A. 8. You foot! SHlieta rapbepps: sap ίΐ b rgebygeb? GAMA. 2007 Mau 9; 297 (18): 2025-7.
13) Уагбауаз К, ВгеЬап К, В1о\\ег 8. Сап тЛиег^а ер1бетюз Ье ргеуепГеб Ьу уо1ип1агу уастпайоп? РЬо8 Сотри! Вю1. 2007 Мау 4;3(5): е85.13) Ouagbauaz K, BrGeap K, B1o \\ er 8. What is the source of the game? Po8 Erase! Vu1. 2007 Mau 4; 3 (5): e85.
14 Научные исследования и разработки в области вакцин//Материалы 87-й Сессии исполнительного комитета Всемирной организации здравоохранения 21 ноября 1990 г., -11 с. 14 Research and development in the field of vaccines // Materials of the 87th Session of the Executive Committee of the World Health Organization on November 21, 1990, -11 p.
15 Ипйеб 81а!ез РаГепГ 6395964, Мау 28, 2002 Ο12Ν 005/04; Ο12Ν 015/82; Ο2Ν 015/87; А01Н 005/00. Ога1 1ттщ^а0оп \\йй Ггапздетс р1ап!з/АгаРеп; Сйаг1ез I.; Мазоп; Нидй 8.; Тагир Над А.; С1етеп!з; 1ойп Ό. Тйе Техаз А&М Итуегзйу 8уз!ет (Со11еде 8!айоп. ТХ); Тйе АбтГтзГгаГогз оГ Гйе Ти1апе Рипб (№те Ог1еапз, ЬА) Арр1 №.: 817906, АидизГ 4, 1997. 15 Ipieb 81a! Without RaGepG 6395964, Mau 28, 2002 Ο12Ν 005/04; Ο12Ν 015/82; Ο2Ν 015/87; A01H 005/00. Og1, 1, m ^ ^ a0op \\ y Ggapzdets p1ap! S / AgaRep; Syagles I .; Mazop; Nyed 8 .; Tagir Nad A .; С1етеп! З; 1oyp Ό. Thieu Tehaz A & M Itueju 8uz! Et (Soedee 8! Ayop. TX); Thieu AbtGtzGgaGogz oG Guy Ti1ape Ripb (Note Og1eapz, bA) Arr1 No .: 817906, AidizG 4, 1997.
16 Ипйеб 81а!ез РаГепГ 4094971 .Типе 13, 1978. А61К 039/02. 1ттипо1одюа1 аб.)иуап! адеп!з асйуе ш асщеоиз зоЫОоп Сйеб1б; Ьошз А.; АибЫей; Ргапсо1зе Магдиегйе Адепсе Иайопа1е бе Уа1опзайоп бе 1а Кесйегсйе Арр1. №.: 717509 АцдцзГ 25, 1976. 16 Ipieb 81a! Without RaGepG 4094971. Type 13, 1978. AK61 039/02. 1ttypo1odua1 ab.) Iwap! adep! z asyue sh ascheoiz zoYOop Syeb1b; Bosh A.; AIBY; Rgapso1ze Magdiegye Adeps Iyope1e beaaopzaiop bea 1a Kesyegsye Arr1. No .: 717509 AjjsG 25, 1976.
17 ййр: //бю. асабетю. гц/бю. пзГ/ги\\йй/79240. 17 yr: // bu. asabetu. Hz / bc. pzG / gi \\ yy / 79240.
18 Нап-Мапе Ьейп. 8иргато1еси1аг СйетГзйу. СопсерГз апб Регзресйуез.- ХУетйейт №\у Уогк; Вазе1; Сатйпбде; Токуо: УСН Уег1адздезе11зсйаГ! тЬН, 1995.-Р. 103 (СйарГег 7). 18 Nap-Mape Lap. 8irgato1esi1ag Sjet Gzju. SopserGz apb Regsresyuez.- HUeteyate No. \ u Wagk; Vase1; Satypbde; Tokuo: USN Ueg1adzdeze11zsyaG! Thn, 1995.-R. 103 (SjarGeg 7).
Claims (34)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/RU2010/000700 WO2012070974A1 (en) | 2010-11-22 | 2010-11-22 | Vaccines with enhanced immunogenicity and methods for the production thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201300488A1 EA201300488A1 (en) | 2013-11-29 |
EA025417B1 true EA025417B1 (en) | 2016-12-30 |
Family
ID=46146103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201300488A EA025417B1 (en) | 2010-11-22 | 2010-11-22 | Vaccines with enhanced immunogenicity and methods for the production thereof |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA025417B1 (en) |
WO (1) | WO2012070974A1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019212378A1 (en) * | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Farber Boris Slavinovich | Vaccines with enhanced immunogenicity, low allergenicity and reactogenicity |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1557712A (en) * | 1975-08-29 | 1979-12-12 | Anvar | Immunological agents |
WO1997027311A1 (en) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | St. Jude Children's Research Hospital | Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv |
WO2004000351A1 (en) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use |
-
2010
- 2010-11-22 EA EA201300488A patent/EA025417B1/en not_active IP Right Cessation
- 2010-11-22 WO PCT/RU2010/000700 patent/WO2012070974A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1557712A (en) * | 1975-08-29 | 1979-12-12 | Anvar | Immunological agents |
WO1997027311A1 (en) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | St. Jude Children's Research Hospital | Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv |
WO2004000351A1 (en) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MARTYNOV A.V. et al., "New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (method of precision partial modification)", Annals of Mechnikov Institute, 2007, N. 4, p. 5-15 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019212378A1 (en) * | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Farber Boris Slavinovich | Vaccines with enhanced immunogenicity, low allergenicity and reactogenicity |
US11213579B2 (en) | 2018-05-04 | 2022-01-04 | Boris Farber | Vaccines with enhanced immunogenicity, low allergenicity and reactogenicity |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA201300488A1 (en) | 2013-11-29 |
WO2012070974A1 (en) | 2012-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2265148T3 (en) | EFFECTIVE MUTANT ENTEROTOXINE AS A NON-TOXIC ORAL ASSISTANT. | |
JP4509554B2 (en) | Vaccine containing aluminum adjuvant and histidine | |
KR100287424B1 (en) | Urease-Based Vaccine Against Helicobacter Infection | |
JP5327873B2 (en) | Recombinant Helicobacter pylori oral vaccine and preparation method thereof | |
KR100642877B1 (en) | antigen formulation useful in immunisation | |
Lockner et al. | Flagellin as carrier and adjuvant in cocaine vaccine development | |
AU8441991A (en) | Improved vaccine compositions | |
KR19990022748A (en) | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccine | |
ES2446984T3 (en) | Enterohemorrhagic Escherichia coli vaccine | |
JPS61200924A (en) | Synthetic immunogen | |
JPH10500958A (en) | Treatment and prevention of Helicobacter infections | |
CN104507496B (en) | Including the immunogenic compound with the HIV GP41 peptides of CRM197 carrier protein couplets | |
US4567041A (en) | Mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent | |
Piccioli et al. | GMMA as a ‘plug and play’technology to tackle infectious disease to improve global health: Context and perspectives for the future | |
US20070031447A1 (en) | Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides | |
CZ174293A3 (en) | Process for preparing a composite vaccine against intestinal infection caused by enterotoxigenic escherichia coli bacteria | |
JP4236215B2 (en) | Purified Amorphous Haemophilus Influenza P5 Protein as a Vaccine for Amorphous Haemophilus influenzae Strain | |
EA025417B1 (en) | Vaccines with enhanced immunogenicity and methods for the production thereof | |
JP4530317B2 (en) | Vaccine formulation containing attenuated toxin | |
US20130203980A1 (en) | Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same | |
US20120195925A1 (en) | Vaccines with increased immunogenicity and methods for obtaining them | |
WO2000015257A1 (en) | Vaccine preparations containing saponins | |
US11213579B2 (en) | Vaccines with enhanced immunogenicity, low allergenicity and reactogenicity | |
US8951538B2 (en) | Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same | |
EP0646377A1 (en) | Albumin-conjugated tumour cell-free extracts, antigenic compositions comprising the same, related antibodies, and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM BY KG MD TJ TM |