EA022923B1 - Антигенсвязывающие фрагменты антитела и их применение для лечения или диагностики глазных болезней - Google Patents
Антигенсвязывающие фрагменты антитела и их применение для лечения или диагностики глазных болезней Download PDFInfo
- Publication number
- EA022923B1 EA022923B1 EA201171352A EA201171352A EA022923B1 EA 022923 B1 EA022923 B1 EA 022923B1 EA 201171352 A EA201171352 A EA 201171352A EA 201171352 A EA201171352 A EA 201171352A EA 022923 B1 EA022923 B1 EA 022923B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- eye
- cornea
- binding fragment
- treatment
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 7
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 7
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 5
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 4
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001479 Hydroxyethyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims description 3
- 208000010217 blepharitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005668 blepharoconjunctivitis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims description 3
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940071826 hydroxyethyl cellulose Drugs 0.000 claims description 3
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims description 3
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical group [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 claims description 3
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 claims description 2
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 abstract 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 abstract 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 84
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 82
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 48
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 48
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 36
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 23
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 21
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 20
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 210000003060 endolymph Anatomy 0.000 description 16
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 14
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 4
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 4
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 210000003901 trigeminal nerve Anatomy 0.000 description 4
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 4
- 208000005100 Herpetic Keratitis Diseases 0.000 description 3
- 206010073938 Ophthalmic herpes simplex Diseases 0.000 description 3
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 3
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000007717 corneal ulcer Diseases 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 201000010884 herpes simplex virus keratitis Diseases 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N trifluridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(F)(F)F)=C1 VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VIBDVOOELVZGDU-UHFFFAOYSA-N 4-(1h-indol-2-yl)benzene-1,3-dicarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 VIBDVOOELVZGDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000025887 endotheliitis Diseases 0.000 description 2
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000001127 pigmented epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003962 trifluridine Drugs 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101100452002 Arabidopsis thaliana IAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 206010011026 Corneal lesion Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150080661 Ear1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 102100026045 Exosome complex component RRP42 Human genes 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010015958 Eye pain Diseases 0.000 description 1
- 208000022555 Genital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000915428 Homo sapiens Death domain-associated protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001055992 Homo sapiens Exosome complex component RRP42 Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 101000599816 Homo sapiens Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Proteins 0.000 description 1
- 101001087372 Homo sapiens Securin Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010051602 Laziness Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101150081376 NR1D1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023170 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010062519 Poor quality sleep Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000003046 cornea plana Diseases 0.000 description 1
- -1 corneal epithelium Substances 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 231100000040 eye damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025846 infectious epithelial keratitis Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 206010023365 keratopathy Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013490 limbo Nutrition 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000000327 mueller cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000025889 stromal keratitis Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940099269 viroptic Drugs 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940107931 zovirax Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
- C07K16/087—Herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к применению полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении. Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции для местного введения в глаз, предназначенной для лечения или диагностики глазной болезни, которая включает полностью человеческий антигенсвязывающий фрагмент антитела. Указанное антитело, в частности, нейтрализует HSV1 и HSV2.
Description
Настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающих фрагментов антитела для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении.
Уровень техники
Вирус простого герпеса (Н8У) является ДНК-вирусом, обычно поражающим людей. Инфицирование происходит в результате прямого контактирования кожи или слизистой оболочки с содержащими вирус поражениями или выделениями. Н8У 1-го типа (Н8У-1) инфицирует главным образом рот, лицо и глаза, в то время как Н8У 2-го типа (Н8У-2) обычно передается половым путем и вызывает заболевания половых органов. Н8У-2 может инфицировать глаз при контактировании рта и лица с поражениями в области половых органов и иногда передается новорожденным при прохождении по родовому каналу матери, у которой половые органы инфицированы Н8У-2.
Н8У-1 инфицирует главным образом кожу и слизистую оболочку вдоль тройничного нерва. Данное заболевание часто является бессимптомным, но может проявляться в виде неспецифического инфекционного заболевания верхних дыхательных путей. После первичного инфицирования вирус проникает из пораженных эпителиальных клеток в ближайшие чувствительные нервные окончания и переносится по аксону в клеточное тело, расположенное в ганглии тройничного нерва. Там геном вируса проникает в ядро нейрона, где пребывает в латентном состоянии. Первичное инфицирование глазного, верхнечелюстного или нижнечелюстного ответвления черепного нерва У может вызвать латентное поражение нервных клеток в ганглии тройничного нерва. Распространение Н8У по нейронам ганглия вызывает у субъектов последующую глазную болезнь даже без первичного инфицирования глаза вирусом простого герпеса.
Традиционно считается, что рецидив глазной болезни, вызванной вирусом простого герпеса, представляет собой повторную активацию вируса в ганглии тройничного нерва, который перемещается по аксону, вызывая литическое инфицирование глазной ткани. Полученные данные позволяют предположить, что указанный вирус также может латентно находиться в ткани роговицы, являясь другим потенциальным источником рецидива болезни, возникающей в результате трансплантации роговицы донора, инфицированного вирусом простого герпеса.
Инфицирование Н8У является повсеместным, при этом одна треть населения во всем мире поражена рецидивирующими инфекционными болезнями. Только в США ежегодно регистрируется примерно 20000 новых случаев поражения глаз вирусом простого герпеса и более 28000 рецидивов болезней.
Инфекционные болезни глаза, вызываемые вирусом простого герпеса, являются главной причиной слепоты в развивающихся странах.
Инфекционные болезни глаза, вызываемые вирусом простого герпеса, можно, в частности, классифицировать в 4 категории: инфекционный эпителиальный кератит, нейротропная кератопатия, стромальный кератит и эндотелиит.
Глазные болезни обычно диагностируют на основании характерных признаков поражения роговицы и путем исключения. Лабораторные исследования позволяют подтвердить диагноз в случае отсутствия типичных признаков, но выполнение таких исследований в большинстве клиник обычно связано с определенными трудностями. Соскоб эпителия с окрашиванием красителем О1ет8а позволяет увидеть многоядерные гигантские клетки, образующиеся в результате слияния инфицированных эпителиальных клеток роговицы и внутриядерных вирусных включений. Однако отрицательные результаты цитологического анализа не исключают инфицирования Н8У. Культуры вирусов характеризуются хорошей чувствительностью, но требуют нескольких дней для получения результата. Анализы по обнаружению антигена Н8У, такие как система, индуцируемая вирусом, связанным с ферментом (ЕЬУГЗ), являются специфическими, но их применение ограничено из-за более низкой чувствительности. Поэтому в любом случае рекомендуется использовать культуру клеток для подтверждения Н8У, когда анализ ЕЬУ1§ дает отрицательный результат, что снова требует дополнительной затраты времени. При помощи полимеразной цепной реакции с использованием образцов слезной жидкости, эпителия роговицы, жидкости из передней камеры глазного яблока или узелков роговицы можно обнаружить ДНК вируса в случае герпетического кератита или кератоувеита. Однако данный метод не позволяет выявить различия между латентными или активными инфекциями Н8У. Диагностика особенно затруднена в случае дисковидного эндотелиита или стромального заболевания, так как вирусные частицы часто невозможно обнаружить в биопсийных образцах стромы и поэтому нельзя получить культуры.
Что касается лечения, то несмотря на наличие антивирусной терапии данная болезнь по-прежнему остается значительной проблемой здравоохранения. В Европе для лечения глазных инфекций применяется мазь зовиракс (ацикловир) (хотя появление штаммов, устойчивых к данному лекарственному средству, вызывает озабоченность). Однако ацикловир не предотвращает поражения роговицы. В США единственным утвержденным средством для лечения указанных инфекций является вироптик (1% водный раствор трифтортимидина). Как ацикловир, так и трифтортимидин недостаточно эффективно воздействуют на рецидивирующую болезнь, которая является обычно причиной помутнения роговицы, вызывающего слепоту. При использовании обоих препаратов могут возникать значительные побочные эффекты, связанные с непереносимостью субъектом. Очевидно, что необходимы более совершенные мето- 1 022923 ды лечения или диагностики глазных болезней, вызываемых вирусом простого герпеса (Н§У).
Антитела все шире используются при диагностике и лечении разных болезней. Использование антител является чрезвычайно эффективным при диагностике и лечении вышеописанных болезней в тех случаях, когда альтернативное лечение оказывается неудовлетворительным.
Антитела можно вводить системно, хотя они могут вызывать серьезные системные побочные эффекты при достижении в терапевтических концентрациях места поражения инфекцией.
Местное введение антител для модуляции иммунопатологических состояний роговицы или переднего отдела глазного яблока позволяет избежать указанных побочных эффектов, но такое введение является неэффективным, так как полные антитела являются слишком большими для быстрого проникновения в роговицу (Абапзтбб М., бе Катик А., Маштсе Б. Тбе бупаш1С8 оГ 1дС ίη 1Нс согпеа. Ιηνβδΐ 0рб1ба1то1. νΐδ. 8с1. 1979; 18:947-55).
Объектом настоящего изобретения является использование полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела, имеющего последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична 5>ЕО 1Б N0: 3 и/или 8Е0 1Б N0: 4, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении.
Другим объектом настоящего изобретения является использование полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела, имеющего последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична 8Е0 1Б N0: 1 и 8Е0 1Б N0: 2, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для местного введения в глаз с целью лечения и/или диагностики глазной болезни, включающая полностью человеческий антигенсвязывающий фрагмент антитела, которая отличается тем, что указанный полностью человеческий антигенсвязывающий фрагмент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична 8Е0 1Б N0: 3 и/или 8Е0 1Б N0: 4, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична 8Е0 1Б N0: 1 и 8Е0 1Б N0: 2.
Указанное антитело, в частности, нейтрализует Ηδν1 и Ηδν2.
Определения терминов
За исключением особо оговоренных случаев, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании изобретения, имеют общепринятые значения, известные специалистам в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что при осуществлении настоящего изобретения могут быть использованы многие методы и материалы, ниже описаны предпочтительные методы и материалы. За исключением особо оговоренных случаев, методы, рассмотренные в настоящем описании изобретения и предназначенные для использования с данным изобретением, представляют собой стандартные методы, хорошо известные специалистам в данной области.
Термин РаЪ-фрагмент или антигенсвязывающий фрагмент означает любой фрагмент антитела, сохраняющий способность связываться с антигеном и включающий по меньшей мере одну вариабельную область легкой или тяжелой цепи.
Термин глазная болезнь означает любую инфекционную болезнь (первичную или вторичную), такую как, например, глазной кератит (эпителиальный и стромальный), блефарит, конъюнктивит, блефароконъюнктивит, язвы.
Термин усилитель ретенции означает любое вещество или композицию, продлевающие время пребывания продукта в больном глазу, такие как гиалуронат натрия, гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксиэтилметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, ксантановая камедь, геллановая камедь, хитозан, полимолочная кислота и их производные.
Термин фармацевтическая композиция означает любую терапевтически приемлемую смесь или комбинацию веществ.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено несколько снимков иммуногистохимического анализа роговицы (а-б, 1-п) и цилиарного тела (ί-к, о-ц). полученных через 1 ч после 5 инстилляций АС-8, выполняемых в течение 4 дней, и одной инстилляции АС-8, выполненной в последний день (а-к), или через 1 ч после 5 инстилляций РВ8 (наполнитель), выполненных в течение 4 дней, и одной инстилляции, выполненной в последний день (1-д). Символами б и б отмечены увеличенные изображения белых квадратов, в которых соответственно изображены (б) меченная флуоресцентным красителем А1еха дендритная субэпителиальная клетка и (б) меченый эпителий роговицы. Размер = 100 мкм.
На фиг. 2 представлены снимки иммуногистохимического анализа центральной (а-б) и периферической части роговицы (е-_|) через 24 ч после 5 инстилляций АС-8, на которых показано проникновение РаЪ-фрагмента через склеру. На фиг. 2а в белом квадрате показана реэпителизированная область ранее имевшейся язвы. На фиг. 2б и 2ί соответственно показаны увеличенные изображения белых квадратов на фиг. 2с и 2б: субэпителиальные стромальные клетки, положительно меченные в отношении АС-8. На фиг. 2д и 2_) показаны увеличенные изображения белых квадратов на фиг. 21 и 2б, на которых представлен эпителий, положительно меченный в отношении АС-8. На фиг. 2к-т показан иммуногистохимический анализ (1НС) контрольной роговицы, на которую воздействовали наполнителем. Ербб = эпителий,
- 2 022923
ΕηάοΙίι = эндотелий. Размер = 200 мкм.
На фиг. 3 изображена диаграмма, показывающая воздействие АС-8 на титры слезной пленки после инфицирования вирусом глаза мыши, которая свидетельствует о нейтрализации вируса простого герпеса лекарственным средством АС-8 ίη νίνο в зависимости от времени.
На фиг. 4 изображена гистограмма, показывающая концентрацию АС-8 во внутриглазной жидкости и эндолимфе мышей с нормальной роговицей через 1 и 6 ч после 5 инстилляций 5 мкг АС-8.
На фиг. 5 изображена гистограмма, показывающая концентрацию АС-8 во внутриглазной жидкости и эндолимфе мышей с деэпителизированной роговицей через 1 и 24 ч после 5 инстилляций 5 мкг АС-8.
На фиг. 6 изображена диаграмма, показывающая нейтрализацию Ηδν-1 при выполнении анализа уменьшения бляшкообразования в зависимости от увеличения концентрации 8сΡν-фрагмента АС-8.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к полностью человеческому антигенсвязывающему фрагменту антитела, имеющему последовательность δΕβ ΙΌ N0: 1 и δΕβ ΙΌ N0: 2, который использован для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении.
Следует отметить, что константные области тяжелой цепи (δΕβ ΙΌ N0: 1) и легкой цепи (δΕβ ΙΌ N0:2) могут быть заменены любой приемлемой константной областью иммуноглобулина человека при сохранении полученной молекулой способности связываться с антигеном.
Таким образом, в альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения 8сΡν-фрагмент, имеющий δΕβ ΙΌ N0: 3 или δΕβ ΙΌ N0: 4, может быть использован для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или диагностики глазной болезни при местном введении.
В частности, антитело по настоящему изобретению нейтрализует Ηδν1 и Ηδν2. Антиген вирусной поверхности представляет собой §Ό.
Лекарственное средство по настоящему изобретению предпочтительно получают с использованием усилителя ретенции антигенсвязывающего фрагмента в глазу. Усилители ретенции, используемые в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, состоящей из гиалуроната натрия, гидроксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксиэтилметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилового спирта, ксантановой камеди, геллановой камеди, хитозана, полимолочной кислоты и их производных.
Лекарственное средство по настоящему изобретению предпочтительно получают в форме глазных капель, мази, геля, глазного крема.
Глазная болезнь представляет собой глазной кератит, блефарит, конъюнктивит, блефароконъюнктивит, язвы.
Полностью человеческие антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть использованы в методах диагностики, включающих контактирование части глаза с антигенсвязывающими фрагментами, специфичными для данной болезни, и обнаружение наличия комплекса, включающего антигенсвязывающий фрагмент и антиген. Указанный комплекс может быть обнаружен любым методом, известным в данной области, таким как использование антигенсвязывающего фрагмента, связанного с детектируемой меткой, которая может быть обнаружена при выполнении иммуноанализов ίη νίίτο и ίη νίνο. Примерами анализов ίη νίίτο являются твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΕΙδΑ) (непрямой анализ, сэндвич-анализ, конкурентный анализ) и радиоиммуноанализ (ΚΙΑ).
Метка может быть прямо или опосредованно связана с антигенсвязывающим фрагментом или присоединена к последующему продукту реакции антигенсвязывающей молекулы. Метка может быть выбрана из группы, включающей хромоген, катализатор, фермент, фторохром, хемилюминесцентную молекулу, радиоактивный изотоп и краситель.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для местного введения в глаз с целью лечения или диагностики глазной болезни, которая включает полностью человеческий антигенсвязывающий фрагмент антитела, включающий δΕβ ΙΌ N0: 1, δΕβ ΙΌ N0: 2, δΕβ ΙΌ N0: 3 или δΕΟ ΙΌ N0: 4.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, например, может состоять из 15% Н2О, 15% белого минерального масла, 70% аквафора® (мазь) и 1 мг/мл РаЬ-фрагмента по настоящему изобретению.
Антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены разными методами, известными в данной области, например, путем ферментативного расщепления папаином экстрагированных Ι§0 или рекомбинантного продуцирования (временного или постоянного) в эукариотических или прокариотических экспрессирующих системах с последующей очисткой при помощи аффинной хроматографии.
Основным преимуществом композиций по настоящему изобретению является то, что РаЬфрагменты являются полностью человеческими, то есть кодированы полинуклеотидной последовательностью человека. Использование РаЬ-фрагментов ίη νίνο для диагностики или лечения болезней, вызываемых вирусом простого герпеса, позволяет уменьшить вредные эффекты, возникающие вследствие иммунного ответа хозяина на пассивно введенные антитела, что является существенной проблемой при
- 3 022923 использовании моноклональных антител ксеногенного или химерного происхождения.
Кроме того, РаЪ-фрагменты являются более предпочтительными по сравнению с полными 1§О, так как они не подвержены воздействию Ре-рецепторов клеток и не осаждают антиген, благодаря чему РаЪфрагменты характеризуются меньшей иммуногенностью и являются менее чувствительными к фагоцитозу. РаЪ-фрагменты быстрее выводятся из ткани, чем полные молекулы 1дС.
РаЪ-фрагменты также легче получить по сравнению с антителами 1§О с точки зрения технологического процесса, затрат и времени, так как они могут быть продуцированы в экспрессирующих системах Е. сой.
РаЪ-фрагменты являются устойчивыми и растворимыми (нерастворимость является признаком, способным усиливать иммуногенность). Указанные особенности позволяют достигать высоких уровней экспрессии и оптимальной устойчивости вещества, используемого для получения лекарственного средства, и самого лекарственного средства. Устойчивость РаЪ-фрагментов позволяет значительно увеличить время полужизни антитела в кровотоке.
Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения также относится к одноцепочечным Ру-фрагментам (ксРу).
Как показано на фиг. 6, лекарственное средство АС-8, содержащее 8сРу-фрагмент, эффективно нейтрализует инфективность Н8У при выполнении анализа уменьшения бляшкообразования.
Вирусные титры, измеренные в образцах слезной пленки, полученных у мышей, которым вводили АС-8, свидетельствовали об эффективной нейтрализации Н8У1 по сравнению с использованием неспецифического РаЪ-фрагмента.
В результате местной инстилляции АС-8 проникает в интактный глаз и может быть обнаружен во внутриглазной жидкости и эндолимфе при помощи иммуногистохимического анализа и анализа ЕЬ18А, выполняемых через один час после инстилляции. После деэпителизации роговицы проникновение во внутриглазную жидкость и эндолимфу увеличивается. АС-8 можно визуализировать в клетках интактной роговицы, при этом можно предположить, что АС-8 проникает в глаза главным образом через склеру. После инъекции в субконъюнктиву АС-8 проникает в глаз так же, как после инстилляции в деэпителизированную роговицу. Однако инъекция в субконъюнктиву глаза после деэпителизации роговицы вызывает 5-кратное увеличение проникновения АС-8 в глаз.
Иммуногистохимический анализ показывает, что АС-8, по-видимому, накапливается в дендритных субэпителиальных клетках, что указывает на его проникновение в роговицу. После местной инстилляции АС-8 был обнаружен в глазу в эффективной антивирусной концентрации.
Примеры
Пример 1.
Вирусные титры, измеренные в образцах слезной пленки, полученных у мышей, которым вводили АС-8, свидетельствуют об эффективной нейтрализации Н8У1 по сравнению с неспецифическим РаЪфрагментом.
В инфицированный глаз (правый) вводили 3 мкл каждого лекарственного средства в виде глазных капель. Введение (1 мг/мл АС-8 или неспецифического РаЪ-фрагмента) начинали в 8:00 часов, 10:00 часов, 12:00 часов, 14:00 часов, 16:00 часов, 18:00 часов, 20:00 часов, 22:00 часа на следующее утро после инфицирования (2-й день) и продолжали в течение 7 дней. Лечение в группах продолжали каждый день в указанном порядке и заканчивали в то же время, в которое было начато лечение. При каждой инстилляции мышей анестезировали изофлуораном (3-5%) или аналогичным средством.
Вирусный штамм. Использовали глазной изолят 0394, который вызывает кератит средней степени тяжести при незначительной смертности или отсутствии смертности. Животным инфицировали правый глаз, используя 1x105 бляшкообразующих единиц (РРИ).
Процедура инфицирования. Инфицируемых мышей ВАЬВ/С анестезировали кетамином/ксилазином. Скарифицировали правую часть роговицы рядом с границей лимба, оставляя интактной центральную часть роговицы. На правую часть роговицы наносили 5 мкл каплю ИМЕМ, содержащую инокулят, и дважды закрывали веко над роговицей, после чего животных возвращали в свои клетки.
Вирусные титры. Образцы слезной пленки для титрования вируса в правом глазу брали в 1-й, 3-й, 5-й, 7-й, 9-й, 11-й и 13-й день после инфицирования. Мышей кратковременно анестезировали для взятия образцов и возвращали в свои клетки. Образцы получали до начала лечения в указанные дни, для чего 10 мкл культуральной среды клеток наносили на роговицу, жидкость промывали 2-3 раза с помощью пипетки и переносили в 190 мкл среды для доставки в вирусологическую лабораторию. Затем образцы последовательно разводили и титровали на монослоях клеток Уего. Мышей анестезировали изофлуораном или аналогичным средством (3-5%) для взятия образцов слезной пленки.
Результаты показаны на фиг. 3.
Пример 2.
АС-8 проникает в интактный глаз и может быть обнаружен во внутриглазной жидкости и эндолимфе при помощи иммуногистохимического анализа через один час после инстилляции.
Данную серию экспериментов выполняли для оценки проникновения РаЪ-фрагмента АС-8 при местном введении. В частности, указанный эксперимент выполняли для оценки биораспределения РаЪ- 4 022923 фрагмента при местном введении в нормальную роговицу крыс.
Исследуемым веществом был РаЬ-фрагмент с концентрацией 10 мкг/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РВ8). Указанное вещество вводили путем инстилляции или инъекции в субконъюнктиву обоих глаз. Испытуемое вещество вводили в следующем объеме:
мкл на одну инсталляцию при помощи пипетки, мкл на одну инъекцию в субконъюнктиву при помощи инсулинового шприца.
В качестве экспериментальных животных были использованы крысы альбиносы Левиса (6-8 недель, 120-150 г, СЬат1е8 Кйег). Животных содержали в условиях, которые были одобрены и утверждены комитетом по вопросам этики Парижского университета и в документе АКУО, относящемся к использованию животных в экспериментальной офтальмологии. Крыс умерщвляли в конце экспериментов ίη νίνο при помощи летальной инъекции пентобарбитала.
При введении испытуемых средств крыс не анестезировали, но осторожно физически ограничивали подвижность в течение нескольких секунд для увеличения времени контактирования с роговицей. Каждая группа состояла из 3 крыс (6 глаз). Животным вводили испытуемое вещество следующим образом:
| Групппы (п=3) | Код группы | Вводимое вещество | Способ введения | День 0 | День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | Умерщв- ление |
| 1 | Н1 | РаЬ АС-8 | Инстилля- ция | 1 | 0-й день, через 1 час после инстилля- ции | ||||
| 2 | Н6 | РаЬ АС-8 | Инстилля- ция | 5(1/ час) | 0-й день, через 1 час после 5-й инстилля- ции | ||||
| 3 | гм | РаЬ АС-8 | Инстилля- ция | 5 | 5 | 5 | 5 | 1 | 4-й день, через 1 час после инстилля- ции |
| 4 | 501 | РаЬ АС-8 | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день, через 1 час после инъекции | ||||
| 5 | 506 | РаЬ АС-8 | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день, через 6 часов после инъекции | ||||
| 6 | ГМ РВ5 | Наполни’ гель | Инстилля- ция | 5 | 5 | 5 | 5 | 1 | 4-й день, через 1 час после инстилля- ции |
| 7 | 50 РВ5 | Наполни- тель | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день, через 1 час после инъекции |
Примечание 1: группе 2 вводили повышенную дозу одна капля в час не соответствует схеме введения.
Примечание 2: группе 3 закапывали указанное вещество 5 раз в день в течение всего периода бодрствования, что соответствует схеме лечения.
Взятие проб суммировано в следующей таблице:
- 5 022923
| Группы 1-7 | ΙΡ^ крыса | 2РП<|1* крыса | ЗР1<|Г крыса | Общее число образцов | Анализы |
| Внутриглазная жидкость | 2 обработанных глаза | 2 обработанных глаза | 28 | ЕЫ8А | |
| Эндолимфа | 2 обработанных глаза | 2 обработанных глаза | 28 | ЕП5А | |
| Роговица | 2 обработанных глаза | 2 обработанных глаза | 28 | 1НС | |
| Весь глаз | 2 обработанных глаза | 14 | 1НС | ||
| Сыворотка Орупиы 4, 5, 7) | 1-2 мл | 1-2 мл | 1-2 мл | У | ЕЫ8А |
У двух крыс (4 глаза) в каждой группе (1-7) иссекали роговицу для исследования в виде плоского слоя на предметных стеклах. Г лаза препарировали на льду. Было иссечено в общей сложности 28 роговиц, которые поместили в виде плоского слоя на 24-луночные планшеты и хранили при -80°С.
Оба глаза третьей крысы в каждой группе (1-7, всего 14 образцов) помещали в ОСТ (соединение, Т188ие-Тек, находящееся при оптимальной температуре иссечения) при -80°С. Все правые глаза использовали для получения криосрезов, все левые глаза хранили при -80°С для последующего использования в случае необходимости.
Криосрезы использовали для иммуногистохимических (1НС) анализов с мечеными антителами для определения распределения РаЬ-фрагмента АС-8 в слоях роговицы и глазном яблоке.
Замороженные криосрезы (10 мкм) обрабатывали следующим образом:
фиксировали в течение 15 мин в 4% параформальдегиде при комнатной температуре, дважды промывали в течение 10 мин и в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, дважды промывали в течение 10 мин в 0,1% смеси РВ§-тритона Х-100 при комнатной температуре, инкубировали в течение ночи при +4°С с антителом козы против 1§О человека (Р1етсе № 31132, 1/50 в 0,1 смеси РВ8-14 тритона Х-100) за исключением контрольного образца, который инкубировали только в 1-кратном РВ§, трижды промывали в течение 10 мин в 0,1% смеси РВ§-тритона Х-100 при комнатной температуре, инкубировали в течение 1 ч при +20°С в темноте с молекулярными зондами антитела осла против
1§О козы (Н+Ь) - флуоресцентный краситель А1еха 594 (красный) 1/50, дважды промывали в течение 10 мин в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, инкубировали в ОАР1 (4',6'-диамидино-2-фенилиндол) (синий) 1/5000 в 1-кратном РВ§ для мечения ядра в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре, пять раз промывали в течение 5 мин в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, один раз промывали в течение 10 мин в дистиллированной воде при комнатной температуре и сушили, помещали на предметные стекла флуоресцентного микроскопа (О1ушри8) для исследования.
Для достижения конфокальной локализации АС-8 на роговице иммуногистохимический анализ также выполняли на плоской роговице. Оптимизированный иммуногистохимический анализ выполняли в отношении 1/4 части роговиц. Чувствительность данного метода нельзя оптимизировать в достаточной степени при использовании данного вещества для получения четкого конфокального изображения. Полученные результаты нельзя интерпретировать достаточно точно. Именно поэтому для определения проникновения АС-8 были использованы срезы всего глаза.
Ядра окрашивали в синий цвет красителем ИАР1, при этом антитела против 1§О человека, используемые для обнаружения АС-8, окрашивались в красный цвет (вторичное антитело, меченное флуоресцентным красителем А1еха 594).
Группа 1 Н1 (0-й день: 1 инстилляция 10 мкг/мл АС-8, крыс умерщвляли через 1 ч).
Не было обнаружено различий в флуоресценции между глазами, на которые воздействовали АС-8 (группа 1) и контрольными глазами, на которые воздействовали РВ§ (группа 6), из чего следует, что через 1 ч после однократной инстилляции 10 мкг/мл АС-8 указанное вещество не проникло в ткани глаза.
Группа 2 Н6 (0-й день: 5 инстилляций 10 мкг/мл АС-8, крыс умерщвляли через 1 ч).
При закапывании АС-8 через каждый час в течение 5 ч и умерщвлении крыс через 1 ч после последней инстилляции АС-8 был обнаружен в периферической части роговицы в виде точек, соответствующих поглощению АС-8 дендритными клетками, локализованными в субэпителиальной строме. В центре роговицы также было обнаружено окрашивание в строме в виде диффузного сигнала, а также в виде очажковых сигналов. В цилиарном теле и сетчатке диффузное, но слабое окрашивание можно обнаружить при сравнении с крысами, которым вводили РВ§ (группа 6).
- 6 022923
Группа 3 Ό4 (с 0-го дня до 3-го дня: 5 инстилляций АС-8 в день, 10 мкг/мл, 4-й день: 1 инстилляция, крыс умерщвляли через 1 ч).
Иммуногистохимический анализ роговицы после введения АС-8 5 раз в день в течение 4 дней и одно введение на пятый день. Результаты данного анализа сравнивали с группой 6, которой вводили наполнитель. При закапывании АС-8 5 раз в день в течение 4 дней в концентрации 10 мкг/мл (фиг. 1а-к) было обнаружено интенсивное проникновение АС-8 в периферическую часть роговицы (фиг. 1е-Н). а также в переднюю строму в центре роговицы (фиг. 1а-б). Проникновение АС-8 было намного больше в периферической части роговицы, лимбе и цилиарном теле, чем в центре роговицы, из чего следует, что АС-8 проникает в глаз через склеру и затем распространяется в роговицу. Дендритные клетки здесь также, по-видимому, поглощают АС-8, так как дендритные клетки, положительно окрашенные АС-8, локализованы в субэпителиальной строме (фиг. 16). В сетчатке АС-8 находится в астроцитах на внутренней границе сетчатки.
Группа 4 §СЛ (0-й день: 1 инъекция АС-8 в субконъюнктиву, 10 мкг/мл, крыс умерщвляли через
ч).
Одна инъекция АС-8 в субконъюнктиву вызывает очень сильное окрашивание АС-8 в переднем и заднем сегментах глаза. Полученные результаты сравнивали с группой 7, которой вводили наполнитель. В роговице АС-8 сконцентрирован в эпителии и строме в виде диффузного окрашивания, а также в клетках роговицы.
В цилиарном теле АС-8, по-видимому, проникает и накапливается в эпителиальных клетках. В сетчатке АС-8 локализован в глиальных клетках (астроцитах и отростках глиальных клеток Мюллера). Сильный сигнал также обнаружен в пигментированных эпителиальных клетках сетчатки (клетки КРЕ).
Группа 5 §С16 (0-й день: 1 инъекция АС-8 в субконъюнктиву, 10 мкг/мл, крыс умерщвляли через
ч).
В роговице АС-8, по-видимому, в основном частично остается в строме. В цилиарном теле флуоресцентный сигнал является более слабым по сравнению с группой 4, но лимб роговицы все еще остается окрашенным в данный период времени. В сетчатке сигнал АС-8 отсутствует в глиальных клетках и астроцитах. В пигментированных эпителиальных клетках сетчатки (клетки КРЕ) сигнал также является слабым. Полученные результаты сравнивали с группой 7, которой вводили наполнитель.
В указанных экспериментах внутренние контрольные образцы, в которых отсутствовало первое антитело, были отрицательными и характеризовались очень ограниченным неспецифическим фоном в отличие от глаз, которые подвергали воздействию РВ§, в которых наблюдался некоторый неспецифический фон.
Результаты иммуногистохимического анализа образцов позволяют предположить, что АС-8 может быть обнаружен специфическими иммуногистохимическими методами. После инстилляции 10 мкг/мл АС-8 в нормальную роговицу антитело отсутствует в роговице или в любых тканях глаза через 1 ч после однократной инстилляции; присутствует в роговице после 5 инстилляций, при этом слабый сигнал обнаружен в цилиарном теле и сигнал не обнаружен в сетчатке;
присутствует в большом количестве в роговице, цилиарном теле и сетчатке при закапывании 5 раз в день в течение 4 дней.
При проникновении АС-8 в роговицу были обнаружены два типа окрашивания: одно диффузное окрашивание, локализованное в строме, и другое концентрированное окрашивание в субэпителиальных клетках роговицы (кератоциты или дендритные клетки). Так как АС-8 присутствует в клетках субэпителиальной стромы в нормальной роговице и в клетках всей стромы в деэпителизированной роговице (см. следующие примеры), то вполне вероятно, что АС-8 подвергается фагоцитозу в дендритных клетках.
Через один час после однократной инъекции 10 мкг/мл АС-8 в субконъюнктиву антитело локализовано не только в роговице, но также присутствует в цилиарном теле, астроцитах и глиальных клетках сетчатки. При данном способе введения глубокие наружные слои сетчатки (пигментированные эпителиальные клетки сетчатки) также окрашиваются. Окрашивание является более сильным в периферической части роговицы, чем в центральной части, как это имеет место после инстилляции. Через 6 ч после однократной инъекции 10 мкг/мл АС-8 в субконъюнктиву антитело почти полностью отсутствует в глазу, оно остается в незначительном количестве в роговице и лимбе, но практически полностью отсутствует в цилиарном теле и сетчатке.
В заключение следует отметить, что полученные результаты позволяют предположить, что АС-8 может проникать внутрь тканей глаза через интактную роговицу или смежный с ней лимб, и такое проникновение может быть обнаружено при концентрации АС-8, равной 10 мкг/мл.
АС-8, по-видимому, проникает через склеру в лимб, что объясняет проникновение в сетчатку и сильное окрашивание периферической части роговицы. АС-8 поглощается клетками роговицы, которые соответствуют дендритным клеткам или кератоцитам. Способность АС-8 активировать дендритные клетки требует дальнейшего исследования.
Пример 3.
АС-8 проникает в интактный глаз и может быть обнаружен во внутриглазной жидкости и эндолим- 7 022923 фе при помощи анализа ЕЫ§Л, выполняемого через 1 ч после инстилляции.
Шестьдесят (60) пигментированных крыс, относящихся к линии серых крыс, произвольно распределяли в десять (10) групп по шесть (6) животных в каждой группе.
Животным (группы 1-8) местно вводили 10 мкл испытуемых веществ или наполнителей в оба глаза раз в день.
При введении в субконъюнктиву (группы 9 и 10) животным делали однократную инъекцию 50 мкл испытуемого вещества в оба глаза.
В приведенной ниже таблице суммировано распределение животных в экспериментальной группе:
| Группа | Способ введения | Вводимое вещество | Время после последнею введения | Число животных |
| 1 | РаЬ-фрагмент АС-8 | 1 час | ||
| 2 | (1 мг/мл) | 6 часов | ||
| 3 | РаЬ-фрагмент АС-8 | 1 час | ||
| 4 | (0,5 мг/мл в РВ5) | б часов | ||
| 5 | 5 инсталляций | РаЬ-фрагмент АС-8 (0,5 мг/мл в висмеде®) | 1 час | 6 животных с введением в оба гла.:# |
| 6 | 6 часов | |||
| 7 | РВ5 (наполнитель 1) | 1 час | ||
| 8 | РВ5/висмед® (наполнитель 2) | 1 час | ||
| 9 | 1 инъекция в | АС-8 (1 мг/мл) РаЬ-фрагмснг | 1 час | |
| 10 | субконъюнктиву | 6 часов |
В соответствующие периоды времени животных анестезировали.
Брали пробы цельной крови для получения сыворотки. После эфтаназии из обоих глаз брали образцы внутриглазной жидкости (АН), эпителия роговицы (Сер1), стромы + эндотелия роговицы (С51г+спб). эндолимфы (V) и сетчатки (К) и группировали для каждого животного для выполнения анализов ЕЬ1§А.
Способ применения и введения. Животным в группах 1-8 испытуемое вещество или наполнители закапывали в оба глаза 5 раз по 10 мкл в течение дня (с 8:00 часов утра до 16:00 часов дня), используя соответствующую микропипетку.
Животным в группах 9-10, находящимся под наркозом (внутримышечная инъекция 5 мг/кг ксилазина; 25 мг/кг кетамина), делали однократную инъекцию (50 мкл) в субконъюнктиву обоих глаз.
В периоды времени, указанные в приведенной выше таблице, животных анестезировали при помощи внутримышечной инъекции смешанного раствора ромпуна® (5 мг/кг ксилазина) и имальгена® 1000 (25 мг/кг кетамина).
Непосредственно перед умерщвлением у животных брали примерно 2 мл крови при помощи сердечной пункции. 600 мкл сыворотки для каждого животного хранили при -80°С до выполнения анализа ЕЬ1§А.
Животных умерщвляли путем инъекции чрезмерной дозы пентобарбитала в сердце.
Сразу же после умерщвления из обоих глаз двух крыс быстро и осторожно удаляли внутриглазную жидкость (АН), эпителий роговицы (Сер1), строму + эндотелий роговицы (Скй+еиб), эндолимфу (V) и сетчатку (К). Элементы обоих глаз группировали для каждого животного в каждой группе.
Результаты введения АС-8 в разных концентрациях во внутриглазной жидкости и эндолимфе показаны на фиг. 4.
Пример 4.
После деэпителизации роговицы увеличивалось проникновение АС-8 во внутриглазную жидкость и эндолимфу.
Данную серию экспериментов выполняли для оценки биораспределения РаЬ-фрагмента при местном введении в деэпителизированную роговицу крыс и на стадии реэпителизации роговицы. Указанный эксперимент позволил оценить проникновение РаЬ-фрагмента в роговицу во время рубцевания язвы роговицы в результате проникновения РаЬ-фрагмента АС-8 при местном введении.
В качестве испытуемого вещества было использовано вышеописанное вещество, но концентрация указанного вещества была равна 100 мкг/мл. Были использованы такие же экспериментальные животные, что и в приведенном выше примере. Инстилляцию или инъекцию в субконъюнктиву производили в один глаз, а не в оба глаза.
В 0-й день один глаз каждого животного деэпителизировали под общим наркозом (ксилазин + кетамин) и местной анестезией на калиброванном участке роговицы, используя калиброванный дерматом и скальпель. По этическим причинам модель язвы роговицы и последующее лечение были произведены
- 8 022923 только на одном глазу каждого животного. Противоположный глаз не должен подвергаться воздействию. Использовали 5 крыс (5 глаз, только правые глаза) в каждой группе. Животным вводили испытуемое вещество следующим образом:
| Групп- пы (11=5) | Код группы | Вводимое вещество | Способ введения | ДеньО | День 1 | День 2 | Умерщвле- ние |
| 1 | Н5 | РаЬ АС-8 | Инстилляция | 5 (1/час) | 0-й день; через 1 час после 5-й инстилляции | ||
| 2 | 1129 | РаЬ АС-8 | Инстилляция | 5 (1/час) | 1 -й день: через 24 часа после 5-й инстилляции | ||
| 3 | ϋ2 | РаЬ АС-8 | Инстилляция | 5 (1/час) | 5 (1/час) | 1 | 2-1 день: через 1 час после последней инстилляции |
| 4 | 5СЛ | РаЬ АС-8 | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день; через 1 час после инъекции | ||
| 5 | 8СЛ | РаЬ АС-8 | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день: через 6 часов после инъекции | ||
| 6 | 8024 | РаЬ АС-8 | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 1-й день: через 24 часа после инъекции | ||
| 7 | С-132 | Наполни- тель | Инстилляция | 5 (1/час) | 5(1/час) | 1 | 2-й день; через 1 час после последней ИНСТИЛЛЯЦИИ |
| 8 | СХС7 | Наполни' тель | Инъекция в субконъюнктиву | 1 | 0-й день, через 1 час после инъекции |
Взятие проб суммировано в нижеследующей таблице:
| Группы 1-8 | Крыса 1 | Крыса 2 | Крыса 3 | Крыса 4 | Крыса 5 | Общее число образцов | Анали- зы |
| Внутри- глазная жидкость | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 32 | ΕΙ.Ι5Α | |
| Эндолимфа | 1 обработанный таз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 32 | Ε1.Ι8Α | |
| Роговица | 1 обработанный таз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 32 | ЕЫ8А | |
| Сетчатка | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 1 обработанный глаз | 32 | ЕЫ8А | |
| Весь глаз | - | - | - | - | 1 глаз | 8 | 1НС |
| Сыворотка | 1 -2 мл | 1-2 мл | 1-2 мл | 1-2 мл | 1-2 мл | 40 | ЕЫ8А |
Образцы внутриглазной жидкости и эндолимфы, сыворотки и сетчатки, предназначенные для анализа методом ЕЫ§Л, были получены у 4 крыс (4 обработанных глаза). Образцы сыворотки (примерно 12 мл) были получены у 5 крыс в каждой из групп 1-8 непосредственно перед умерщвлением. В общей сложности было получено 32 образца внутриглазной жидкости (примерно 10-20 мкл) и эндолимфы (примерно 20-30 мкл), 32 образца роговицы и сетчатки и 40 образцов сыворотки, которые хранили при -80°С в емкостях ЕррспйогГ с завинчивающимися крышками.
Оба глаза пятой крысы в каждой группе (всего 16 образцов) фиксировали и готовили для получения криосрезов.
- 9 022923
Криосрезы использовали для иммуногистохимических (1НС) анализов с мечеными антителами для определения распределения РаЬ-фрагментов АС-8 в слоях роговицы и глазном яблоке.
Замороженные криосрезы (10 мкм) обрабатывали следующим образом:
фиксировали в течение 15 мин в 4% параформальдегиде при комнатной температуре, дважды промывали в течение 10 мин в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, дважды промывали в течение 10 мин в 0,1% смеси РВ§-тритона Х-100 при комнатной температуре, инкубировали в течение ночи при +4°С с антителом козы против 1§С человека (Р1етсе № 31132, 1/50 в 0,1% смеси РВ§-тритона Х-100) за исключением контрольного образца, который инкубировали только в 1-кратном РВ§, трижды промывали в течение 10 мин в 0,1% смеси РВ§-тритона Х-100 при комнатной температуре, инкубировали в течение 1 ч при +20°С в темноте с молекулярными зондами антитела осла против
1§С козы (Н+Ь) флуоресцентный краситель А1еха 594 (красный) 1/50, дважды промывали в течение 10 мин в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, инкубировали в ЭАР1 (4',6'-диамидино-2-фенилиндол) (синий) 1/5000 в 1-кратном РВ§ для мечения ядра, выдерживали в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре, промывали 5 раз в течение 5 мин в 1-кратном РВ§ при комнатной температуре, промывали один раз в течение 10 мин в дистиллированной воде при комнатной температуре и сушили, помещали на предметные стекла флуоресцентного микроскопа (О1ушри5) для исследования.
Ядра окрашивали в синий цвет красителем ЭАР1. при этом антитела против 1§С человека, используемые для обнаружения АС-8, окрашивались в красный цвет (вторичное антитело, меченное флуоресцентным красителем А1еха 594).
Группа 1 Н5 (0-й день: 5 инстилляций 100 мкг/мл АС-8, крыс умерщвляли через 1 ч после последней инстилляции.
АС-8 отчетливо обнаружен в центральной части (особенно на стыке между эпителизированными и деэпителизированными участками) и периферической части роговицы: АС-8 концентрируется в субэпителиальном пространстве на границе язвы. Интересно отметить, что проникновение АС-8 также обнаружено в субэпителиальном пространстве периферической части роговицы. В эндотелии роговицы АС-8 не обнаружен в центральной части и обнаружен в незначительном количестве в периферической части. Иммуногистохимический анализ контрольной роговицы, обработанной РВ§, показал наличие очень слабого фона.
В лимбе АС-8 локализован в цилиарном теле, а также в радужной оболочке. Следует отметить, что АС-8 также обнаружен в эндотелиальных клетках сосудов лимба.
Такое распределение АС-8 на деэпителизированной роговице свидетельствует о том, что проникновение РаЬ-фрагментов происходит главным образом через лимб и склеру, а не прямо через роговицу.
В группе 1 обнаружено очень слабое мечение АС-8 в сетчатке.
Группа 2 Н29 (0-й день: 5 инстилляций 100 мкг/мл АС-8, крыс умерщвляли через 24 ч после последней инстилляции).
В группе 2 эпителий центральной части роговицы почти полностью восстановлен во всех исследованных срезах (фиг. 2а-_|) при наличии некоторых аномалий на поверхности восстановленного эпителия (белый квадрат на фиг. 2а). АС-8 сохраняется в клетках субэпителиального пространства. В периферической части роговицы (фиг. 2е-_) АС-8 сконцентрирован в эпителии, субэпителиальном пространстве (стрелки на фиг. 2ί) и аккумулирован в эндотелии (стрелки на фиг. 2д и 2_().
Через 24 ч после 5 инстилляций АС-8 проник с поверхности роговицы в более глубокий слой роговицы вплоть до эндотелия. АС-8 также отчетливо виден в радужной оболочке в указанный период времени (стрелки на фиг. 2ί и 21ι). Инфильтрующие клетки, содержащие АС-8, локализованы в субэпителиальном пространстве роговицы (стрелки на фиг. 2ί и 2Ь, сильное увеличение на фиг. 2с, стрелки на фиг. 21). Указанные клетки могут соответствовать нейтрофильным клеткам, макрофагам или дендритным клеткам.
В лимбе и цилиарном теле АС-8 проникает через эпителий и локализован в субэпителиальной области и цилиарном теле.
В группе 2 АС-8 обнаружен в периферической части сетчатки и не обнаружен в центре задней части сетчатки. При сравнении с контрольной группой 7 установлено, что АС-8 локализован в нуклеарных слоях периферической части сетчатки.
Группа 3 Ό2 (с 0-го дня до 1-го дня: 5 инстилляций в день 100 мкг/мл АС-8, 2-й день: 1 инстилляция, крыс умерщвляли через 1 ч после инстилляций).
В группе 3 эпителий полностью восстановлен, при этом инстилляцию продолжали в течение всего периода рубцевания. АС-8 обнаружен в большом количестве в эпителиальных клетках роговицы, в стромальных клетках и незначительно в эндотелии по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель.
Исследование в группе 3 лимба и передней части сетчатки показывает, что АС-8 проник глубоко в
- 10 022923 цилиарное тело по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель. АС-8 обнаружен в эпителии цилиарного тела.
В группе 3 значительное окрашивание АС-8 обнаружено в периферической части и не обнаружено в задней (центральной) части сетчатки. Интересно отметить, что АС-8, по-видимому, распространился во все слои сетчатки, а также в слой клеток КРЕ.
Сравнение с проникновением АС-8 с интактную роговицу (см. выше) позволяет предположить, что язва в эпителии увеличивает проникновение АС-8 в сетчатку.
Группа 4 §СЛ (0-й день: 1 инъекция раствора АС-8, 100 мкг/мл, крыс умерщвляли через 1 ч после инъекции), группа 5 §С16 (0-й день: 1 инъекция раствора АС-8, 100 мкг/мл, крыс умерщвляли через 6 ч после инъекции), группа 6 §024 (0-й день: 1 инъекция раствора АС-8, 100 мкг/мл, крыс умерщвляли через 24 ч после инъекции).
Однократная инъекция АС-8 в область субконъюнктивы обеспечивает эффективное проникновение АС-8 в периферическую часть роговицы через 1, 6 и 24 ч.
Проникновение АС-8 после инъекции в субконъюнктиву является более сильным в периферической части роговицы, чем в центральной части роговицы, где АС-8 находится в небольшом количестве во все периоды времени даже в изъязвленной роговице (группа 4 и группа 5). Восстановление целостности эпителия не влияет на распределение АС-8 во все слои роговицы и в радужную оболочку через 24 ч (группа 6).
АС-8 гомогенно распределен в лимбе и цилиарном теле, как было обнаружено в группах 4 и 5, при наличии дополнительной концентрации АС-8 в субэпителиальной области лимба в группе 6. Инъекция в субконъюнктиву также обеспечивает эффективное проникновение АС-8 в глаз с язвой роговицы не только в слои периферической части сетчатки, но также, хотя в гораздо меньшей степени, в заднюю область сетчатки через 1 ч (группа 4), через 6 ч (группа 5) и через 24 ч (группа 6). Через 24 ч АС-8 сконцентрирован главным образом в периферической части сетчатки (группа 6).
В сетчатке АС-8 обнаружен в виде пятнистого окрашивания в клетках сетчатки, при этом АС-8 распространен неравномерно во всей сетчатке.
Результаты иммуногистохимического анализа суммированы в следующей таблице:
| Роговица | Лимб/цилиарное тело | Сетчатка | ||||||||
| Центральная часть (из*ьяэвленная зона) | Периферическая часть | радужка/ цилиарное тело | лимб | Перифери- ческая часть | задняя часть | |||||
| Эпите- лий | строма | Эндоте- лий | эпителий | строма | Эндоте- лий | |||||
| Группа 1 (5 инстилляций, 1 час) | ++ + | + + + | +/- | ++ + | +++ | |||||
| Группа 2 (5 инстилляций, 24 часа) | + | + + | + + | + | + | +/- | ||||
| Группа 3 (5 инстилляций, 5 инстилляций, 1 инстилляция, 1 час) | + + | + | ++ | + + + | + + | ++ | + | |||
| Группа 4 (1 инъекция в субконъюнктиву, 1 час) | -/+ | + | + | +/- | + + | ++ | + | +/- | ||
| Группа 5 (1 инъекция в субконъюнктиву, 6 часов) | +/- | + + | + + + | ++ | + + | ++ | + | +/- | ||
| Группа 6 (1 инъекция в субконъюнктиву, 24 часа) | +/- | ++ | ++ + | +++ | + | +/- |
| Группа 7 контрольная (5 инстилляций, 5 инстилляций, 1 инстилляция, 1 час) | ||||||||||
| Группа 8 контрольная (1 инъекция в субконъюнктиву, 1 час) | ||||||||||
| Контрольная группа без использования первичного антитела |
В процессе реэпителизации инстилляция АС-8 не замедляет рубцевания роговицы по сравнению с контрольной группой и не усиливает в значительной степени любую клиническую или гистологическую воспалительную реакцию.
Проникновение АС-8 в роговицу (эпителий, строму и эндотелий) обнаружено главным образом в
- 11 022923 периферической части роговицы и лимбе. АС-8 обнаружен в клетках роговицы (эпителиальные, эндотелиальные и стромальные клетки), а также в субэпителиальных инфильтрующих клетках, что может быть связано с локальной иммунологической реакцией на инъекцию АС-8 (АС-8 распознается как чужеродный человеческий белок).
АС-8 позже проникает также в радужную оболочку, цилиарное тело и периферическую часть сетчатки, что позволяет предположить наличие диффузии от наружных к внутренним тканям глаза. Интересно отметить, что АС-8 также обнаружен в эндотелиальных клетках сосудов, из чего следует, что потенциально может происходить системная диффузия АС-8.
Локализация АС-8 в разных областях роговицы ясно показывает, что АС-8 проникает главным образом через склеру даже при наличии язвы в центральной части эпителия.
При инстилляции АС-8 может проникать в роговицу на всех стадиях герпетического кератита, даже в процессе восстановления эпителия роговицы.
Инъекция в субконъюнктиву характеризуется такой же эффективностью, что и повторные инстилляции АС-8 для направленного воздействия на роговицу.
АС-8, по-видимому, проникает в роговицу через склеру как в случае инстилляции, так и в случае инъекции в субконъюнктиву.
Инъекция в субконъюнктиву является более эффективным способом введения по сравнению с повторными инстилляциями для направленного воздействия на цилиарное тело и сетчатку.
Результаты анализа ЕЫ8А, полученные при исследовании внутриглазной жидкости и эндолимфы деэпителизированной роговицы, суммированы на фиг. 5. Как показано на данной фигуре, количественное определение АС-8 во внутриглазной жидкости и эндолимфе свидетельствует об эффективном проникновении в глаз.
В заключение следует отметить, что при исследовании распределения лекарственного средства по настоящему изобретению на изъязвленной роговице установлено, что 5 инстилляций в день не оказывают токсического воздействия на деэпителизированную роговицу.
После 5 инстилляций в день АС-8 сохраняется в клетках роговицы в течение 24 ч и проникает в глубокие слои роговицы, а также в радужную оболочку и цилиарное тело.
АС-8 проникает главным образом через лимб и склеру, из чего следует, что АС-8 может проникать в роговицу на всех стадиях герпетического кератита, даже в процессе восстановления эпителия.
Список последовательностей <110> РЬЬоуах ЫоЬесЬпоЬодЬез з.а.
<120> АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮ1ЦИЕ ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ
| <130> | ДИАГНОСТИКИ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 209-09 |
| <160> | 4 |
| <170> | РаСепС1п уегзЬоп 3.3 |
<210> 1 <211> 231 <212> РРТ <213> Ьото зараепз <400> 1
СЬп Уа1 СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег С1у А1а С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу Зег 15 10 15
Зег νβΐ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег С1у СЬу Зег РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а Не Азп Тгр УаЬ Агд С1п А1а Рго С1у СЬп С1у Ьеи С1и Тгр МеГ. 35 40 45
СЬу СЬу Ьеи МеС. Рго 11е РЬе С1у ТЬг ТЬг Азп Туг А1а СЬп Ьуз РЬе 50 55 60
СЬп Азр Агд Ьеи ТЬг Не ТЬг А1а Азр УаЬ Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80
МеС СЬп Ьеи Зег СЬу Ьеи ТЬг Туг С1и Азр ТЬг А1а МеС Туг Туг Суз 85 90 95
АЬа Агд УаЬ АЬа Туг МеС Ьеи СЬи Рго ТЬг УаЬ ТЬг А1а СЬу СЬу Ьеи 100 105 110
Азр νβΐ Тгр С1у СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег А1а Зег ТЬг 115 120 125
Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег 130 135 140
С1у С1у ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи νβΐ Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и 145 150 155 160
Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег С1у АЬа Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Н1з 165 170 175
- 12 022923
ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег 180 185 190 ба! ба1 ТКг ба1 Рго Зег Зег Зег Ьеи <31у ТКг С1п ТКг Туг Не Суз 195 200 205
Азп ба1 Азп Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз ба1 Азр Ьуз Ьуз ба1 С1и 210 215 220
Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТКг
225 230 <210> 2 <211> 214 <212> РРТ <213> Кото зартепз <400> 2
61и 11е Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго <31у ТКг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
С1и Агд А1а ТКг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С!п Зег ба1 Зег Зег А1а 20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у <31_п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 35 40 45
11е Туг <31у А1а Зег Зег Агд А1а ГЬг 31у 11е Рго Азр Агд РКе Зег
С1у Зег С1у Зег С1у ТКг Азр РКе ГЬг Ьеи ТКг 11е Зег Агд Ьеи С1и 65 70 75 80
Рго С1и А?р РКе А1а ба! Туг Туг Суз <51п С1п Туг С1у Агд Зег Рго 85 90 95
ТКг РЬе С1у С1у С1у ТКг Ьуз ба1 С1и Не Ьуз Агд ТКг ба1 А1а А1а 100 105 110
Рго Зег ба1 РКе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег <31у 115 120 125
ТКг А1а Зег ба1 ба1 Суз Ьеи Ьеи Азл Азп РКе Туг Рго Агд С1и А1а 130 135 140
Ьуз ба1 С1п Тгр Ьуз ба! Азр Азп А1а Ьеи СЬп Зег С1у Азп Зег С1п 145 150 155 160
С1и Зег 7а1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬс Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
А1а Суз С1и ба1 ТКг Ηΐδ С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго ба1 ТКг Ьуз Зег 195 200 205
РКе Азп Агд С1у С1и Суз
210 <212> РРТ <213> Кото заргепз <400> 3
С1л ба! С1л Ьеи ба! С1п Зег С1у А1а С1и ба! Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
Зег ба1 Ьуз ба! Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у С1у Зег РКе Зег Зег Туг
А1а 11е Азп Тгр ба! Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи <31и Тгр МеС
С1у С1у Ьеи МеС Рго 11е РКе С1у ТКг ТКг Азп Туг А1а <31п Ьуз РКе
61п Азр Агд Ьеи ТКг Не ТКг А1а Азр ба! Зег ТКг Зег ТКг А1а Туг
МеС. С1п Ьеи Зег С1у Ьеи ТКг Туг С1и Азр ТКг А1а МеС Туг Туг Суз <210> 4 <211> 107 <212> РРТ <213> Кото зархепз <400> 4
С1и Не ба1 Ьеи ТКг С1п Зег Рго С1у ТКг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
Claims (14)
1. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, включающего последовательность, которая на 90% гомологична 81%) ГО ΝΟ: 3 или 8Ε^ ГО ΝΟ: 4, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, при местном введении.
2. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, состоящего из 81%) ГО ΝΟ: 3 или 81%) ГО ΝΟ: 4, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, при местном введении.
3. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, включающего последовательность 81%) ГО ΝΟ: 3 и 8Ε^ ГО ΝΟ: 4, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, при местном введении.
4. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, состоящего из 81%) ГО ΝΟ: 3 и 8Ε^ ГО ΝΟ: 4, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, при местном введении.
5. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, включающего последовательность 81%) ГО ΝΟ: 1 и 8Ε^ ГО ΝΟ: 2, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни при местном введении.
6. Применение полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела против Н8У, состоящего из 81%) ГО ΝΟ: 1 и 8Ε^ ГО ΝΟ: 2, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, при местном введении.
7. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело нейтрализует Н8У1 и Н8У2.
8. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что поверхностный антиген вируса, с которым связывается указанное антитело, представляет собой дО.
9. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство получено с использованием усилителя ретенции антигенсвязывающего фрагмента в глазу.
10. Применение по п.9, отличающееся тем, что усилитель ретенции выбран из группы, состоящей из гиалуроната натрия, гидроксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксиэтилметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилового спирта, ксантановой камеди, геллановой камеди, хитозана, полимолочной кислоты и их производных.
11. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство имеет форму глазных капель, мази, геля, глазного крема.
12. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что глазная болезнь, вызванная Н8У, представляет собой глазной кератит, блефарит, конъюнктивит, блефароконъюнктивит, язвы.
13. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что полностью человеческий антигенсвязывающий фрагмент имеет связанную с ним детектируемую метку.
14. Фармацевтическая композиция для местного введения в глаз, предназначенная для лечения глазной болезни, вызванной Н8У, которая включает эффективное количество полностью человеческого антигенсвязывающего фрагмента антитела, охарактеризованного в любом из предшествующих пунктов.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09159303A EP2248825B1 (en) | 2009-05-04 | 2009-05-04 | Antigen binding fragments of an antibody for use in treating and diagnosing ocular diseases |
| PCT/EP2010/056047 WO2010128053A1 (en) | 2009-05-04 | 2010-05-04 | Antigen binding fragments of an antibody for use in treating or diagnosing ocular diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201171352A1 EA201171352A1 (ru) | 2012-05-30 |
| EA022923B1 true EA022923B1 (ru) | 2016-03-31 |
Family
ID=40740137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201171352A EA022923B1 (ru) | 2009-05-04 | 2010-05-04 | Антигенсвязывающие фрагменты антитела и их применение для лечения или диагностики глазных болезней |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8747856B2 (ru) |
| EP (1) | EP2248825B1 (ru) |
| JP (1) | JP2012526075A (ru) |
| AU (1) | AU2010244465B2 (ru) |
| DK (1) | DK2248825T3 (ru) |
| EA (1) | EA022923B1 (ru) |
| ES (1) | ES2395746T3 (ru) |
| PL (1) | PL2248825T3 (ru) |
| PT (1) | PT2248825E (ru) |
| WO (1) | WO2010128053A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA201608812B (en) | 2014-06-26 | 2019-08-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
| SG11201610320RA (en) | 2014-06-26 | 2017-01-27 | Heidelberg Immunotherapeutics Gmbh | Topical application for an anti-hsv antibody |
| SG11201610459XA (en) | 2014-06-26 | 2017-01-27 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
| EP3050897A1 (en) * | 2015-01-28 | 2016-08-03 | Polichem S.A. | Human monoclonal antibodies endowed with strong neutralizing activity against HSV-1 and HSV-2 |
| JP6816332B1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-01-20 | 奥田 研爾 | アデノウイルス結膜炎に対する医薬組成物 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1492383A (en) * | 1974-03-16 | 1977-11-16 | Seperic | Therapeutic composition |
| US5646041A (en) * | 1987-02-12 | 1997-07-08 | Harfeldt; Elisabeth | Monoclonal antibody to herpes simplex virus and cell line producing same |
| AU1257895A (en) * | 1993-11-17 | 1995-06-06 | Schepens Eye Research Institute, Inc., The | Antibody to ocular and vaginal surface epithelium |
| WO1995018634A1 (en) * | 1994-01-04 | 1995-07-13 | The Scripps Research Institute | Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor |
| CA2483337C (en) * | 2002-04-23 | 2015-10-27 | The Scripps Research Institute | Expression of polypeptides in chloroplasts, and compositions and methods for expressing same |
| AR042145A1 (es) * | 2002-11-27 | 2005-06-08 | Dow Agrociences Llc | Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida |
| US6984492B2 (en) * | 2003-09-05 | 2006-01-10 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating herpes infections |
| KR20130133302A (ko) * | 2003-12-10 | 2013-12-06 | 메다렉스, 인코포레이티드 | Ｉｐ―１０ 항체 및 그의 용도 |
| EP1968540A2 (en) * | 2005-08-05 | 2008-09-17 | Universite De Geneve | Topical drug delivery by iontophoresis |
| WO2010129033A2 (en) * | 2009-04-29 | 2010-11-11 | Calmune Corporation | Modified antibodies for passive immunotherapy |
-
2009
- 2009-05-04 ES ES09159303T patent/ES2395746T3/es active Active
- 2009-05-04 DK DK09159303.8T patent/DK2248825T3/da active
- 2009-05-04 PL PL09159303T patent/PL2248825T3/pl unknown
- 2009-05-04 EP EP09159303A patent/EP2248825B1/en not_active Not-in-force
- 2009-05-04 PT PT91593038T patent/PT2248825E/pt unknown
-
2010
- 2010-05-04 US US13/318,805 patent/US8747856B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-04 JP JP2012509016A patent/JP2012526075A/ja active Pending
- 2010-05-04 WO PCT/EP2010/056047 patent/WO2010128053A1/en active Application Filing
- 2010-05-04 AU AU2010244465A patent/AU2010244465B2/en not_active Ceased
- 2010-05-04 EA EA201171352A patent/EA022923B1/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012526075A (ja) | 2012-10-25 |
| US8747856B2 (en) | 2014-06-10 |
| EP2248825A1 (en) | 2010-11-10 |
| EA201171352A1 (ru) | 2012-05-30 |
| PL2248825T3 (pl) | 2013-04-30 |
| AU2010244465B2 (en) | 2015-12-17 |
| AU2010244465A1 (en) | 2011-12-22 |
| DK2248825T3 (da) | 2013-01-02 |
| US20120165512A1 (en) | 2012-06-28 |
| WO2010128053A1 (en) | 2010-11-11 |
| ES2395746T3 (es) | 2013-02-14 |
| EP2248825B1 (en) | 2012-09-19 |
| PT2248825E (pt) | 2013-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| An et al. | Neutrophil extracellular traps (NETs) contribute to pathological changes of ocular graft-vs.-host disease (oGVHD) dry eye: Implications for novel biomarkers and therapeutic strategies | |
| Levin et al. | Optic neuritis in neuromyelitis optica | |
| Ghosh et al. | Neutrophils homing into the retina trigger pathology in early age-related macular degeneration | |
| Watson | The sclera and systemic disorders | |
| Coulon et al. | NLRP3, NLRP12, and IFI16 inflammasomes induction and caspase-1 activation triggered by virulent HSV-1 strains are associated with severe corneal inflammatory herpetic disease | |
| Li et al. | Evidence that rhesus macaques self-cure from a Schistosoma japonicum infection by disrupting worm esophageal function: a new route to an effective vaccine? | |
| da Silveira et al. | Enteroglial cells act as antigen-presenting cells in chagasic megacolon | |
| Boyd et al. | Reduced retinal transduction and enhanced transgene-directed immunogenicity with intravitreal delivery of rAAV following posterior vitrectomy in dogs | |
| EA022923B1 (ru) | Антигенсвязывающие фрагменты антитела и их применение для лечения или диагностики глазных болезней | |
| JP2022512946A (ja) | 自己抗体媒介性眼疾患の治療および診断 | |
| Abreu-Velez et al. | Human eyelid meibomian glands and tarsal muscle are recognized by autoantibodies from patients affected by a new variant of endemic pemphigus foliaceus in El-Bagre, Colombia, South America | |
| Maguire et al. | Recovery of intraocular Toxocara canis by pars plana vitrectomy | |
| da Silveira et al. | Glial fibrillary acidic protein and S-100 colocalization in the enteroglial cells in dilated and nondilated portions of colon from chagasic patients | |
| Mishra et al. | Research models of sulfur mustard-and nitrogen mustard-induced ocular injuries and potential therapeutics | |
| Krishnan et al. | PolySialic acid-nanoparticles inhibit macrophage mediated inflammation through Siglec agonism: A potential treatment for age related macular degeneration | |
| Paulsen et al. | Loss of tear duct–associated lymphoid tissue in association with the scarring of symptomatic dacryostenosis | |
| CN116672453A (zh) | Sting抑制剂在制备抑制脉络膜新生血管生成的药物中的应用 | |
| TW201932130A (zh) | 脂質運載蛋白型前列腺素ｄ２合成酵素產生促進劑 | |
| US20150148350A1 (en) | Drug for preventing/treating ocular disease | |
| US20220220206A1 (en) | Treating chronic liver disease | |
| Da Wang et al. | Knockout of TGF-β receptor II by CRISPR/Cas9 delays mesenchymal transition of Lens epithelium and posterior capsule opacification | |
| Wang et al. | Upregulation of histone H3 caused by CRYAA may contribute to the development of age-related cataract | |
| EP3916015A1 (en) | Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases | |
| Bobrova | Trachoma is Coming Back to Ukraine: Two Case Reports | |
| Ikeda et al. | Two cases of primary open angle glaucoma with serum autoantibody against retinal ganglion cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |