EA021701B1

EA021701B1 - ПРИМЕНЕНИЕ НЕИММУНОСУПРЕССИВНОГО ПРОИЗВОДНОГО ЦИКЛОСПОРИНА A [D-MeAla]-[EtVal]-CsA ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПОЯСНОКОНЕЧНОСТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИИ И СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ МЫШЕЧНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ У СУБЪЕКТА, СТРАДАЮЩЕГО ПОЯСНОКОНЕЧНОСТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИЕЙ

Info

Publication number: EA021701B1
Application number: EA201070945A
Authority: EA
Inventors: Джефри Д. Молкентин
Original assignee: Дебиофарм Интернейшнэл Са
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2015-08-31
Also published as: JP5536673B2; CN101939021B; CA2713416C; KR20100114914A; DK2249860T3; RS54494B1; MX2010008533A; ZA201005483B; CA2713416A1; TN2010000342A1; EP2249860B8; EA201070945A1; ES2558710T3; HK1148665A1; IL207477A0; PT2249860E; WO2009098577A2; WO2009098577A3; AU2009211129B2; HRP20151413T1

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению неиммуносупрессивного производного циклоспорина A [D-MeAla]-[EtVal]-CsA для изготовления лекарства для лечения поясноконечностной мышечной дистрофии и способу предупреждения или уменьшения мышечной дегенерации у субъекта, страдающего поясноконечностной мышечной дистрофией.

Description

Настоящее изобретение относится к применению неиммуносупрессивного производного циклоспорина А для снижения индукции некроза мышечных волокон и дегенерации мышечных волокон у субъекта, у которого диагностирована поясноконечностная мышечная дистрофия (ПКМД), в частности саркогликанопатия.

Мышечные дистрофии (МД) включают разнотипную группу наследственных расстройств, которые обширно поражают поперечнополосатую мышечную ткань, приводя в результате к прогрессирующей мышечной слабости, истощению и во многих случаях к преждевременной смерти. Многие охарактеризованные мутации, которые причинно связаны с МД у людей, обусловлены изменениями в структурных связывающих белках, которые прикрепляют нижележащие сократительные белки к базальной пластинке, обеспечивая ригидность клеточной мембраны скелетных мышц (сарколеммы), или в белках, которые непосредственно стабилизируют или репарируют клеточную мембрану, таких как, например, саркогликан или дистрофин.

Наследуемые мутации генов саркогликана (генов альфа-, бета-, гамма- и дельта-саркогликана) вызывают скелетно-мышечное заболевание с гетерогенными синдромами, ПКМД и его подгруппу, саркогликанопатии. Синдромы или фенотипы саркогликанопатий зависят от того, какой ген саркогликана мутирован, и от типа генетических мутаций (аллельного варианта), и проявляют четыре формы конкретных расстройств: ПКМД типов 2С, 2Ό, 2Е и 2Р (мутации генов гамма-, альфа-, бета- и дельта-саркогликана соответственно), которые представляют 25% всех диагностированных случаев ПКМД. В частности, различные мутации, специфично обнаруживаемые в гене дельта-саркогликана, приводят в результате к тяжелому расстройству ПКМД типа 2Р или ПКМД2Р (Опйпе Мепйейап 1ийегйапсе ίη Мап [0ΜΙΜ] #601287, депейс тШайош: [0ΜΙΜ] 601411. Етегу е! а1., Тйе Ьапсе!, 2002, 359:687-695).

Различные типы ПКМД характеризуются прогрессирующим истощением и слабостью с атрофией, преимущественно вовлекающей мышцы рук и ног, проксимальные к плечу и бедру соответственно. Фенотипы заболевания напоминают синдромы тяжелой мышечной дистрофии типа Дюшенна или Беккера.

Однако в последние заболевания вовлечены другие молекулярные механизмы и генетические расстройства. До того, как стали доступны молекулярные диагностики ПКМД, пациентов с ПКМД часто диагностировали как страдающих мышечной дистрофией Дюшенна. Начало заболевания варьирует от раннего детства до взрослого состояния с клиническими формами от легких до тяжелых. Вплоть до 25% пациентов проявляют тяжелые формы заболевания, и у них развивается тяжелый поясничный лордоз, контрактуры пяточных сухожилий, мышечная гипертрофия, кардиомиопатия и нарушения сердечной проводимости. Гипертрофия икроножных мышц или языка, избирательность вовлеченности мышц и сердечные осложнения поздней стадии более или менее специфично связаны с каждой из различных форм (Иаше1е е! а1., 1п1 1. Вюсйет Се11 ΒίοΙ., 2007; 39:1608-1624). Прогрессирующая слабость приводит к рестриктивному легочному процессу и гиповентиляции, требующей вспомогательной вентиляции. В целом заболеваемость и смертность варьируют. При раннем начале прогрессирование заболевания до смерти типично является очень быстрым. Смерть часто наступает вследствие респираторных осложнений.

К настоящему времени недоступно специфическое лечение для пациентов, страдающих любым из синдромов ПКМД. Интенсивная поддерживающая терапия, например ортопедия, хирургия и физиотерапевтическое лечение для сохранения мышечной функции, максимально увеличивает функциональную способность и продлевает ожидаемую продолжительность жизни. Однако эти меры не могут предотвратить дегенерацию мышечных волокон и возникновения, в конечном счете, респираторных осложнений.

Благодаря разработке моделей на животных, у которых отсутствуют специфичные гены, вовлеченные в мышечную дистрофию, приблизились к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе саркогликанопатий. Недавно было показано, что мышечные клетки мышей, у которых отсутствует дельта-саркогликан (мышей 8сдй-/-) вследствие направленной инактивации гена дельтасаркогликана (зсдй), обладают предрасположенностью к повышенному клеточному притоку кальция. Предполагают, что потеря компонентов комплекса дистрофин-гликопротеин (ДГК), такого как комплекс дистрофина или саркогликана, приводит в результате к фундаментальному изменению физических свойств клеточной мембраны мышц и к повышенной проницаемости и протеканию сарколеммы. Активация нерегулируемых каналов притока кальция, вызванная нестабильностью и ломкостью мембраны, может инициировать дистрофическое заболевание в скелетной мышце, приводящее к дегенерации мышечных волокон и индукции некроза мышечных волокон.

Авторами Раг8оп8 е! а1. (1. ΒίοΙ. Сйет., 2007, 282:10068-10078) показано, что ингибирование активируемой кальцием/кальмодулином активности сериновой/треониновой протеинфосфатазы кальцинеурина (са1сшеигт) в результате генетической делеции уменьшало дегенерацию и воспаление скелетной мышцы и мышечных волокон у мышей 8сдй-/-, а также было цитопротекторным. Аналогичные улучшения заболевания вследствие ингибирования активности кальцинеурина не наблюдали у мышей, у которых отсутствует ген тйх (мутация гена дистрофина), используемых в качестве модели мышечной дистрофии Дюшенна, даже, несмотря на то, что в обеих моделях мышечной дистрофии наблюдали повышенный приток кальция. Действительно, активированный трансген для кальцинеурина защищал мышей тйх (Сйакка1ака1 е! а1., Нит. Мо1. Оепе!., 2004, 13: 379-399; §!ирка е! а1. Ас!а №игора!йо1., 2004, 107: 299-310, но

- 1 021701 см. Эе Ьиса е! а1., Ат. 1. Ра11ю1.. 2005, 166: 477-489). Авторами Рагкопк е! а1. идентифицирован кальцинеурин как потенциальная мишень для терапевтических агентов ПКМД. На основании этих наблюдений Рагкопк е! а1. предположили, что ингибирование активности кальцинеурина может обеспечить некоторую пользу при избранных типах мышечных заболеваний, таких как поясноконечностная мышечная дистрофия, и что, следовательно, циклоспорин А (СкА) мог бы обладать потенциальной пользой.

Эффекторные механизмы, которые вызывают прогрессирующую дегенерацию мышечных волокон, индуцированную измененной проницаемостью мембраны при ПКМД, плохо поняты и являются предметом активных исследований, которые могут обеспечить основу для конечной разработки основанных на механизме новых стратегий лечения для пациентов, страдающих этим расстройством. В данное время, однако, отсутствует эффективный способ, доступный для лечения пациентов, страдающих ПКМД. Поэтому существует необходимость в новых терапевтических подходах, таких как описано в данной заявке.

Цель настоящего изобретения состоит в обеспечении врачей терапией для лечения как индукции, так и прогрессирования некроза мышечных волокон и дегенерации мышцы у пациента, страдающего ПКМД, и, в частности, саркогликанопатией, и более конкретно ПКМД типа 2Р. Эта терапия должна защищать против некроза дистрофических скелетных мышц, а также сердечной и диафрагмальной мышцы и должна замедлить прогрессирование заболевания.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что введение неиммуносупрессивного производного циклоспорина А (СкА), которое не ингибирует кальцинеурин, субъекту, страдающему расстройствами, диагностированными как ПКМД, и, в частности, саркогликанопатией, и более конкретно ПКМД типа 2Р, является эффективной терапией. Они наблюдали, что введение неиммуносупрессивного производного СкА [Э-МеА1а]³-[Е!Уа1]⁴-СкА уменьшает мышечную патологию субъекта, у которого диагностирован некроз мышечных волокон, в частности, с ПКМД, и более конкретно с ПКМД типа 2Р, а также дегенерацию и прогрессирование заболевания, а также нормализует распределение площади мышечных волокон путем снижения чувствительности митохондрий к латентной перегрузке кальция.

Субъект может представлять собой человека или млекопитающее, такое как, например, мышь, которые проявляют фенотип мышечной дистрофии в результате делеции гена или отсутствия экспрессии гена, ответственного за фенотип заболевания.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению неиммуносупрессивного производного СкА [Э-МеА1а]³-[Е!Уа1]⁴-СкА формулы I, для получения лекарственного препарата для предупреждения или уменьшения мышечной дегенерации у субъекта, страдающего ПКМД, и, в частности, саркогликанопатией, и более конкретно ПКМД типа 2Р. Неиммуносупрессивные производные СкА, пригодные для применения настоящим изобретением, были также описаны в международной заявке на патент \νϋ 2005/021028 Ыоуагйк АС, на страницах 3-6. [Э-МеА1а]³-[Е!Уа1]⁴-СкА был раскрыт авторами ХУепдег е! а1. в международной заявке на патент νθ 00/01715. [Э-МеА1а]³-[Е!Уа1]⁴-СкА формулы I приписан регистрационный номер СА§ 254435-95-5.

Формула I.

νν- X-В-Υ-Ζ-О-А1а-Т, Т₂ — Т_э—МеУа112 3 456 789 10 11 где

V представляет собой МеВт!;

X представляет собой аАЬи;

К представляет собой (Э)-МеА1а;

Υ представляет собой Ы-этил-Уа1 (Е!Уа1);

Ζ представляет собой Уа1;

О представляет собой МеЬеи;

Т₁ представляет собой (Э)А1а;

Т₂ представляет собой МеЬеи и

Т₃ представляет собой МеЬеи, и где МеВт! представляет собой Х-метил-(4К)-4-бут-2Е-ен-1-ил-4-метил-(Е)треонин, аАЬи представляет собой Ь-а-аминомасляную кислоту, Э-МеА1а представляет собой Ν-метил-О-аланин, Е!Уа1 представляет собой Ν-этил-Ь-валин, Уа1 представляет собой Ь-уаНие, МеЬеи представляет собой Νметил-Ь-лейцин, А1а представляет собой Ь-аланин, (Э)А1а представляет собой Ό-аланин, и МеУа1 представляет собой Ν-метил-Ь-валин. Общепринятая нумерация положений аминокислот, обычно используемая в ссылке на циклоспорин А, показана в приведенной ниже формуле. Составные названия используют для производных СкА, где эти составные названия включают первую часть, указывающую идентичность остатков, которые отличаются от остатков в циклоспорине А, и дающую их положение, и вторую часть, обозначенную СкА, указывающую, что все другие остатки идентичны остаткам в циклоспорине А. Например, [Ме11е]⁴-СкА представляет собой циклоспорин, который идентичен циклоспорину А, за исключением того, что МеЬеи в положении 4 заменен Ме11е (Ν-метил-ЬизолеВйцдирнуогмо)й. форме осуществления изобретение относится к способу предупреждения или уменьшения

- 2 021701 мышечной дегенерации у субъекта, страдающего ПКМД, и, в частности, саркогликанопатией, и более конкретно ПКМД типа 2Р, включающему введение субъекту эффективного количества неиммуносупрессивного производного СкА [П-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-С8А формулы I. Эффективное количество неиммуносупрессивного производного циклоспорина А понимают как количество, которое при повторном введении в ходе терапевтической схемы субъекту, страдающему ПКМД, и, в частности, саркогликанопатией, и более конкретно ПКМД типа 2Р приводит в результате к объективному клиническому ответу, такому как улучшение, стабилизация или замедление прогрессирования заболевания. При введении перорально эффективное количество для суточного введения или введения три раза в неделю должно составлять от примерно 1 мг/кг (массы тела) до примерно 100 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 до примерно 20 мг/кг. Внутривенным путем показанная соответствующая дозировка может составлять от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 до примерно 25 мг/кг.

Настоящее изобретение будет дополнительно объяснено ниже с помощью приведенных ниже графических материалов.

На фиг. 1(а) представлено набухание базового уровня, измеренное как поглощение при 540 нм, митохондрий из скелетной мышцы 6-недельных мышей дикого типа (^У1) (белый столбик) и мышей ксдй-/(черный столбик). Митохондрии из группы подошвенных мышц, четырехглавой и передней большеберцовой мышц объединяли. Как показывает более низкое измерение поглощения, митохондрии из мышц мышей ксдй-/- были в большей степени набухшими при базовом уровне, чем митохондрии от мышей XVI.

На фиг. 1(б) представлены изменения в набухании митохондрий через 10 мин после обработки кальцием (Са2+) или ПЭГ-3350 (ПЭГ), измеренные как разности поглощения при 540 нм между необработанными и обработанными митохондриями от 6-недельных мышей дикого типа (VI) (белый столбик) и мышей ксдй-/- (черный столбик). Митохондрии из группы подошвенных мышц, четырехглавой и передней большеберцовой мышц объединяли.

На фиг. 2(а) представлено уменьшение мышечной патологии после введения О-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴СкА у мышей ксдй-/-. Отношения массы мышц (Μν) к длине большеберцовой кости (ТЬ) (Μν/ТЬ) измеряли в икроножной (Сак1гос), четырехглавой (Оиай.), передней большеберцовой (ТА) и сердечной мышце от мышей дикого типа (VI), обработанных либо носителем (белый столбик), либо Э-|МеА1а|³[Е1Уа1]⁴-С§А (черный столбик), или от мышей ксдй-/-, обработанных либо носителем (серый столбик или второй от конца в группе), либо О-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴-СкА (столбик с точечной заливкой или последний столбик в группе). ИДМеАНЕ^Уаф-СкА предотвращает увеличение массы мышцы у мышей 8сдй-/-, которое обусловлено заболеванием.

На фиг. 2(б) представлено уменьшение мышечной патологии после введения Ю-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴СкА у мышей 8сдй-/-, наблюдаемое в репрезентативных срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, четырехглавой мышцы от мышей дикого типа (VI) и мышей ксдй-/-, обработанных Ю-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴СкА. Также показаны соответствующие контроли носителя.

На фиг. 2(в) представлено уменьшение мышечной патологии после введения Ю-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴СкА у мышей ксдй-/-, оцениваемое путем количественного определения площадей волокон в срезах, окрашенных трихромом, из диафрагмы (Όίαρίι.), передней большеберцовой мышцы (ТА), икроножной мышцы (Сак1гос), четырехглавой мышцы (Оиай). Оценивали срезы от мышей дикого типа (VI), обработанных либо носителем (белый столбик), либо О-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴-СкА (черный столбик), и от мышей ксдй-/-, обработанных либо носителем (серый столбик или второй столбик от конца в группе), либо Ό[ΜеА1а]³-[ЕΐУа1]⁴-СкА (столбик с точечной заливкой или последний столбик группы). Э-|МеА1а|³^Уаф-СкА уменьшал фиброз у мышей ксдй-/-.

На фиг. 3(а) представлено уменьшение гетерогенности площади мышечных волокон в мышце от мышей ксдй-/- после введения О-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴-СкА, которую оценивали путем количественного определения распределения площадей волокон в передней большеберцовой (мышце). Исследование включало мышей дикого типа (VI), обработанных либо носителем (белый столбик), либо Ю-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴СкА (черный столбик), и у мышей ксдй-/-, обработанных либо носителем (серый столбик или второй столбик от конца в группе), либо ИДМеАЦ^-^Уаф-СкА (столбик с точечной заливкой или последний столбик группы). (< обозначает ниже, > обозначает выше). Обработка ИДМеАП^-^Уаф-СкА нормализовала гетерогенность площади волокон у мышей ксдй-/-.

На фиг. 3(б) представлено уменьшение гетерогенности площади мышечных волокон в мышце от мышей ксдй-/- после введения Ю-|МеА1а|³-|Е1Уа1|⁴-СкА, которую оценивали путем количественного определения распределения площадей волокон в икроножной (мышце). Исследование включало мышей дикого типа (VI), обработанных либо носителем (белый столбик), либо ИДМеАН^-^Уаф-СкА (черный столбик), и у мышей ксдй-/-, обработанных либо носителем (серый столбик или второй столбик от конца в группе), либо ИДМеАНр-^Уаф-СкА (столбик с точечной заливкой или последний столбик группы). (< обозначает ниже, > обозначает выше). Обработка ИДМеАЛ^-^Уаф-СкА нормализовала гетерогенность площади волокон у мышей ксдй-/-.

На фиг. 3(в) представлено уменьшение гетерогенности площади мышечных волокон в мышце от мышей ксдй-/- после введения О-|МеА1а|³-|Е1Уа1|'¹-СкА, которую оценивали путем количественного оп- 3 021701 ределения распределения площадей волокон в четырехглавой мышце. Исследование включало мышей дикого типа (^1), обработанных либо носителем (белый столбик), либо И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СвА (черный столбик), и у мышей всдб-/-. обработанных либо носителем (серый столбик или второй столбик от конца в группе), либо И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СвА (столбик с точечной заливкой или последний столбик группы). (< обозначает ниже, > обозначает выше). Обработка И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СвА нормализовала гетерогенность площади волокон у мышей всдб-/-.

Если повышенная концентрация кальция служит в качестве инициатора ПКМД посредством некроза мышечных волокон, ряд нижележащих кальций-зависимых эффекторов можно потенциально считать причинными факторами. Например, повышенный кальций может привести к некрозу мышечных трубочек посредством активации активируемой кальцием протеазы калпаина, сигнального белка, критически вовлеченного в регенерацию скелетных мышц после повреждения и в дифференциацию скелетномышечных клеток.

Авторы Рат5ОИ5 е1 а1. (2007) показали в мышиной модели ПКМД, что ингибирование активности активируемой кальцием/кальмодулином сериновой/треониновой протеинфосфатазы кальцинеурина (са1сшеигш) в результате генетической делеции уменьшало дегенерацию и воспаление скелетной мышцы и мышечных волокон, то есть улучшало патологию скелетной мышцы. Этого не было в случае мышиной модели дистрофии Дюшенна, где ингибирование кальцинеурина СвА было вредным для мышечной патологии (§1ирка е1 а1., Ас1а Иеигора1ко1, 2004, 107: 299-310). Это расхождение в последствиях ингибирования активности кальцинеурина при различных дистрофиях, характеризующихся повышенными концентрациями кальция в мышечных клетках, преимущественно является следствием их соответствующих различных генетических делеций, вовлекающих и действующих на различные изменения мембраны мышечных клеток и различные пути передачи сигнала.

Другим основным механизмом, ведущим к клеточному некрозу, является перегрузка митохондриального кальция, которая вторично усиливает образование активных форм кислорода (АФК) и дополнительно способствует МРТ (изменению мембранной проницаемости митохондрий). Повышенный субсарколеммальный кальций также способствует локальному повышению активных форм кислорода (АФК), приводящему к более значительным дефектам в клеточной мембране и дополнительному поступлению кальция, дополнительно способствующему клеточному некрозу и/или апоптозу.

Были проведены эксперименты по экспериментальной проверке существования причинной связи между отсутствием гена всдб, прогрессирующей дегенерацией мышечных волокон и клеточным некрозом и/или апоптозом, индуцированным митохондриальной дисфункцией.

Чтобы оценить, может ли индуцированная кальцием митохондриальная дисфункция инициировать и направлять прогрессирующую дегенерацию мышечных волокон, обусловленную ПКМД, авторы настоящего изобретения сравнивали митохондрии, выделенные из дистрофической скелетной мышцы мышей всдб -/- и мышей дикого типа. Митохондрии, выделенные путем гомогенизации в буфере, содержащем сахарозу (250 мМ сахароза, 10 мМ Трис (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА), из группы подошвенных мышц, четырехглавой и передней большеберцовой мышц, суспендировали после промывок и центрифугирования в изотоническом буфере (120 мМ КС1, 10 мМ Трис (рН 7,4), 5 мМ КН₂РО₄) и тестировали в анализе набухания. Этот анализ состоял в инкубации выделенных митохондрий с 200 мкМ СаС1₂ (набухание) или 5% (мас./об) ПЭГ-3350 (сморщивание). Набухание дает уменьшение, а сморщивание увеличение поглощения при 540 нм. Результаты представлены в виде средних значений ± СОС (стандартной ошибки средних) (фиг. 1(а) и фиг. 1(б)). Использовали двухвыборочный ΐ-критерий Стьюдента и значения считали значимыми только при р<0,05.

Митохондрии, выделенные из скелетной мышцы мышей всдб-/-, набухали при базовом уровне по сравнению с митохондриями мышей дикого типа. Они были также рефракторными к дополнительному набуханию экзогенно наносимым кальцием и не проявляли реверсии в набухании базового уровня (фиг. 1(а) и фиг. 1(б)). Эта нечувствительность митохондрий мышей всдб -/- к дополнительному кальцию указывала на то, что они были набухшими и патологическими, что соответствует нижележащим патологическим эффектам, таким как ответ псевдогипертрофии в икроножной мышце и четырехглавой мышце в возрасте 6 недель, где эта гипертрофия обусловлена воспалением ткани, выраженное снижение мышечных масс с возрастом по сравнению с мышами дикого типа, характерное увеличение центральной нуклеации мышечных волокон, указывающей на регенерацию вследствие продолжающейся дегенерации и многочисленные циклы дегенерации/регенерации, и дестабилизация мышечной мембраны, поврежденной избытком кальция.

Вышеуказанные открытия являются сильным свидетельством в пользу предположения, что кальций-зависимый процесс МРТ лежит в основе прогрессирующей дегенерации мышечных волокон, обусловленной ПКМД, даже, несмотря на то, что латентная митохондриальная аномалия может не являться предсказывающей тяжесть клинического синдрома. В принципе, патогенная цепь событий вслед за генетическим повреждением может быть прервана соответствующим лекарством. Например, потеря активности миостатина может ослаблять ПКМД у мышей всдб-/- посредством уменьшения фиброза и индуцировать регенерацию мышцы. Ингибирование активности кальцинеурина, как сообщали, производит анало- 4 021701 гичные эффекты. В соответствии с обсужденными выше новыми открытиями и теми, которые представлены в примерах 1 и 2, модулирование циклов дегенерации/регенерации и уменьшение дегенерации скелетной мышцы в мышиной модели ПКМД может быть достигнуто посредством нормализации митохондриальной функции. Эти открытия авторов изобретения дают возможность нового фармакологического лечения пациентов, пораженных ПКМД, которое направлено на функцию митохондрий, но не на активность кальцинеурина, и не вызывает иммуносупрессию.

Соответственно, настоящее изобретение относится к применению неиммуносупрессивного производного СкА, наиболее предпочтительно О-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА, для предупреждения или уменьшения мышечной дегенерации у субъекта, страдающего ПКМД. Неиммуносупрессивное производное СкА можно также применять для нормализации митохондриальной функции в митохондриях, препарированных из мышечных биопсий субъекта, страдающего ПКМД. Обнаружение толерантности к перегрузке кальция в таких митохондриях должно служить в качестве индикатора того, что лечение пациента неиммуносупрессивным производным СкА будет эффективно при уменьшении тяжести заболевания.

Активное соединение, то есть неиммуносупрессивное производное циклоспорина А, применяемое для лечения пациентов, страдающих ПКМД, можно вводить любым общепринятым путем. Его можно вводить парентерально, например, в форме инъекционных растворов или суспензий, или в форме инъекционных депо-препаратов. Предпочтительно его следует вводить перорально в форме растворов или суспензий для приема внутрь, таблеток или капсул. Фармацевтические композиции для перорального введения, содержащие неиммуносупрессивное производное циклоспорина А [О-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА, описаны в примерах. Такие фармацевтические композиции типично содержат выбранное неиммуносупрессивное производное циклоспорина А и одно или более чем одно вещество, являющееся фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие фармацевтические носители описаны, например, в Репипдΐοη'κ Рйагтасеийса1 8с1епсек, 171Н ей., Маек РиЬйкНпд Сотрапу, ЕакЮп, РА (1990), который является стандартным справочником в данной области. Типично эти композиции являются концентрированными, и их необходимо комбинировать с соответствующим разбавителем, например с водой, перед введением. Фармацевтические композиции для парентерального введения типично также включают один или более чем один эксципиент. Возможные, но не обязательные эксципиенты включают изотонический агент, буфер или другой агент, регулирующий рН, и консервант. Эти эксципиенты можно добавлять для поддержания композиции и для достижения предпочтительных диапазонов рН (примерно 6,5-7,5) и осмолярности (примерно 300 мосм/л).

Дополнительные примеры препаратов циклоспорина для перорального введения можно найти в патентах США №№ 5525590 и 5639724 и в заявке на патент США 2003/0104992. Посредством перорального пути показанная дозировка неиммуносупрессивного производного циклоспорина А для введения от ежесуточного до трех раз в неделю может составлять от примерно 1 мг/кг (массы тела) до примерно 100 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 до примерно 20 мг/кг. Посредством внутривенного пути соответствующая показанная дозировка может составлять от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 до примерно 25 мг/кг. Эффективное количество неиммуносупрессивного производного циклоспорина А понимают как количество, при повторном введении в ходе терапевтической схемы пациенту с ПКМД приводит в результате к объективному клиническому ответу, такому как улучшение, стабилизация или замедление прогрессирования заболевания. Такой клинический ответ можно оценить, например, с помощью тестирования количественного изометрического напряжения (018). 018 дает возможность объективно оценить напряжение мышцы с помощью преобразующего давление и регистрирующего оборудования. Альтернативно нормализацию скоростей апоптоза можно оценить в биопсиях мышцы биохимическими и иммуногистохимическими методами, известными специалистам в данной области техники. Наконец, можно использовать электромиографию, которая показывает мышечную диаграмму вместо нейрогенной, которую можно определить количественно.

При определении испытуемых доз для тестирования эффективности фармацевтической композиции по изобретению, содержащей неиммуносупрессивное производное циклоспорина А, наиболее предпочтительно [О-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА, врач должен учитывать многочисленные факторы. Главными среди них являются токсичность и время полужизни неиммуносупрессивного производного циклоспорина А. Дополнительные факторы включают размер пациента, возраст пациента, общее состояние пациента (включая механическую вентиляцию, клиническую стадию заболевания, тяжесть симптомов), наличие других лекарств у пациента и тому подобное. Курс лечения потребует повторного введения фармацевтической композиции по изобретению. Типично адекватную дозу лекарства будут вводить один раз в сутки. В связи с генетической природой заболевания может быть необходимость продолжать лечение в течение пролонгированного периода времени, возможно в течение жизни пациента.

В настоящее время неизвестно эффективное фармакологическое лечение ПКМД. Пациентов поддерживают вакцинацией против гриппа и пневмококковой инфекции, и любую инфекцию интенсивно лечат антибиотиками. Поэтому фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать один или более чем один другой активный ингредиент в дополнение к неиммуносупрессивному производному циклоспорина А, такой как, например, один или более чем один антибиотик. Неиммуносупрессивное производное циклоспорина А и такой другой активный ингредиент можно вводить вместе

- 5 021701 как часть одной и той же фармацевтической композиции, или можно вводить по отдельности как часть соответствующего режима дозировки, предназначенного для получения пользы всех активных ингредиентов. Соответствующий режим дозировки, количество каждой вводимой дозы и специфичные интервалы между дозами каждого активного агента будут зависеть от конкретной применяемой комбинации активных агентов, от состояния пациента, подлежащего лечению, и от других факторов, обсужденных в предыдущем разделе. Такие дополнительные активные ингредиенты, как правило, вводят в количествах, равных тем, для которых они известны как эффективные в качестве отдельных терапевтических агентов. Одобренные РИА дозировки для таких активных агентов, которые получили одобрение ΡΌΆ для введения людям, опубликованы.

Все патенты, заявки на патенты и публикации, цитируемые в данной заявке, следует считать включенными посредством ссылки в их полном объеме.

Изобретение дополнительно разработано посредством нижеследующих примеров. Примеры приведены в целях иллюстрации для специалистов в данной области техники и не предназначены для ограничения объема изобретения, как описано в формуле изобретения. Таким образом, изобретение не следует истолковывать как ограниченное приведенными примерами, но следует истолковывать как охватывающее любые и все вариации, которые становятся очевидными как результат приведенных здесь положений.

Примеры

Пример 1. Стабилизации индуцированного кальцием повреждения в мышечной мембране и уменьшение прогрессирования и патологии мышечной дистрофии

Для стабилизации индуцированного кальцием повреждения и уменьшения прогрессирования заболевания, вызванного многочисленными циклами дегенерации/регенерации, мышей ксдй-/- обрабатывали П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-С5А.

Мышей ксдй-/- обрабатывали подкожным введением либо П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА в дозе 50 мг/кг/сутки, либо носителя (препарата, который не содержит активный ингредиент И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴СкА), начиная с 4-недельного возраста и заканчивая в возрасте 10 недель. Различные препарированные мышцы, то есть икроножную, четырехглавую, переднюю большеберцовую и сердечную мышцы, взвешивали и определяли отношения массы мышцы (М№) к длине большеберцовой кости (ТЬ) (МХУ/ТЬ). Результаты на фиг. 2(а) и 2(в) представлены в виде средних ± СОС (стандартной шибки средних). Односторонний критерий ΛΝθνΛ использовали для сравнения средних среди 3 или большего числа независимых групп. Апостериорный критерий Ньюмана-Кейлса применяли всегда, когда проводили множественные сравнения, используя ΙηδΙηΙ 3.0 (программное обеспечение СгарЬРай от 8аепсе 1пс.). Значения считали значимыми при р<0,05.

В ответ на многочисленные циклы дегенерации/регенерации у мышей ксдй-/- исходно представлены гипертрофические скелетные мышцы, как видно у субъектов, страдающих ПКМД. Введение И-[МеА1а]³[Е1Уа1]⁴-СкА у мышей ксдй-/-приводило в результате к уменьшению мышечной патологии, наблюдаемому как снижение псевдогипертрофических ответов в скелетных мышцах обработанных мышей ксдй-/(фиг. 2(а)). Снижение скелетной мышечной гипертрофии было примерно 1,3-кратным в икроножной (Саккос.), четырехглавой (Циай.) и передней большеберцовой (ТА) и примерно 1,2-кратным в сердечной мышце (НеаП) П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА-обработанных мышей ксдй-/- по сравнению с животными, обработанными носителями.

Сниженную патологию у мышей ксдй-/-, обработанных П-[МеА1а]³-[Е^а1]⁴-СкА, также наблюдали в гистологических препаратах четырехглавой мышцы (фиг. 2 (б)). Улучшение организации мышечных волокон и нормализация распределений площади мышечных волокон были отмечены в гистологических препаратах, обработанных П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА, мышей ксдй-/-по сравнению с мышами дикого типа и мышами ксдй-/-, обработанными носителем.

Процент фиброза оценивали с помощью биохимического анализа, который количественно определяет содержание гидроксипролина (Рагкопк е1 а1., Ат. 1. РаЙюк 2006, 168:1975-1985) в диафрагмальной Щарк). передней большеберцовой (ТА), икроножной (Саккос.) и четырехглавой (Спай) мышцах от мышей дикого типа и мышей ксдй-/-, обработанных или не обработанных И-[МеА1а]³-[Е^а1]⁴-СкА. Обработка мышей ксдй-/- П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА уменьшала фиброз в различных мышцах примерно на 1,5-3,5% (фиг. 2(в)).

Пример 2. Нормализация распределения малых и больших волокон и снижение циклов дегенерации/регенерации в скелетных мышцах мышей ксай-/-после обработки И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА

Обработка П-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА мышей ксдй-/- частично нормализовала распределения площади волокон в передней большеберцовой (фиг. 3(а)), икроножной (фиг. 3(б)) и четырехглавой мышцах (фиг. 3(в)), указывая на снижение циклов дегенерации/регенерации. Мышам ксдй-/- вводили подкожно либо И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СкА в дозе 50 мг/кг/сутки, либо носитель в течение 6 недель. Гистологический анализ волокон трех скелетных мышц от мышей ксдй-/- показал значительные увеличения численности волокон малых диаметров (менее 200 мкм²) относительно мышей дикого типа, что указывает на возросшее число регенерирующих волокон, прохождение циклов дегенерации/регенерации и прогрессирование

- 6 021701 заболевания. Введение неиммуносупрессивного И-[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-С8А мышам 8сдд-/- снижало скорость регенерации волокон и частично нормализовало распределение малых и больших волокон. Меньшее количество малых волокон наблюдали у мышей 8сдд-/-, обработанных неиммуносупрессивным Ό[МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-С§А, по сравнению с мышами 8сдд-/-, которые получали только носитель.

Пример 3. Пероральные препараты [И-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-С8А.

Количества выражены в виде % мас./мас.

Пример А.

Пример Б.

Пример В.

Пример Г.

Пример Д.

[О-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СзА Глюкофурол 75 Мигликол 812 Кремофор РН40 альфа-Т окоферол [О-МеА1а]³-(ЕАа1]⁴-СзА Тетра гликоль Сар1ех 800 ΝΐΜ^οΙ НСО-40 Бутилгидрокситолуол (БГТ) [О-МеА1а]³-[ЕАа1]⁴-СзА

Глюкофурол 75 Мигликол 812 Кремофор ВН40 Бутилгццроксианизол (БГА) [О-МеА1а]^э-[ЕАа1]⁴-СзА Тетрагликоль Миритол Кремофор ВН40 альфа-Т окоферол |О-МеА1а]³-[Е1Уа1]⁴-СзА

Этанол

Пропиленгликоль Кремофор ВН40 Глицеринмонолинолеат

35,95

35.95 0,1

85,9

0,1

39.95 14 36

0,05-0,1

74,9

0,1

Индивидуальные компоненты препаратов А-Г и способы их получения см. британскую заявку на патент № 2222770.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение циклического ундекапептида следующей формулы:

—νν-X-К-Υ-Ζ-О-А1а-Т, Т₂ — Т₃— МеУа11 2 3 456 789 10 11 где

А представляет собой МеВт1;

X представляет собой аАЬи;

К представляет собой (И)-МеА1а;

Υ представляет собой И-этил-Уа1 (Е1Уа1);

Ζ представляет собой Уа1;

О представляет собой МеЬеи;

Т₁ представляет собой (И)А1а;

Т₂ представляет собой МеЬеи и

Т₃ представляет собой МеЬеи;

для изготовления лекарства для лечения поясноконечностной мышечной дистрофии.

- 7 021701

2. Способ предупреждения или уменьшения мышечной дегенерации у субъекта, страдающего поясноконечностной мышечной дистрофией, включающий введение пациенту эффективного количества циклического ундекапептида следующей формулы:

—νν-X-К-Υ-Ζ-О-А1а-Т,-Ц — Т₃—МеУа11 2 3 456 789 10 11 где представляет собой МеВш1:

X представляет собой аАЬи:

К представляет собой (Э)-МеА1а:

Υ представляет собой Ы-этил-Уа1 (Е1Уа1): Ζ представляет собой Уа1:

О представляет собой МеЬеи:

Τι представляет собой (Э)А1а:

Т₂ представляет собой МеЬеи и Т₃ представляет собой МеЬеи.