EA021352B1

EA021352B1 - Способ получения липосомальной формы кверцетина

Info

Publication number: EA021352B1
Application number: EA201201593A
Authority: EA
Inventors: Дмитрий Львович Шоболов; Юрий Михайлович Краснопольский; Андрей Михайлович Ульянов; Алексей Андреевич Натыкан; Вадим Владимирович Тарасов; Вадим Юрьевич Балабаньян; Виталий Иванович Швец
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Технология Лекарств"
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2015-05-29
Also published as: EA201201593A1

Abstract

Изобретение относится к фармацевтике. Способ включает смешивание этанольных растворов фосфатидилхолина и кверцетина, высушивание смеси в вакууме, её эмульгирование в водном растворе, гомогенизацию эмульсии с добавлением лактозы в виде водного раствора, поэтапную стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание. Достигаемый результат состоит в стандартности и стабильности полученного препарата липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), содержащих кверцетин, высокой инкапсуляции кверцетина в липосомы, стабильности липосом в процессе хранения.

Description

Изобретение относится к фармацевтике и касается способа получения липосомального средства, содержащего в составе липосом физиологически активное вещество - кверцетин, который имеет широкий спектр действия: ранозаживляющее, ангиопротекторное, противовоспалительное, антиоксидантное.

Хорошо известно использование кверцетина [3] как кардиопротекторного средства, применяемого в комплексной терапии при остром нарушении коронарного кровообращения и инфаркте миокарда, для лечения и профилактики реперфузионного синдрома при хирургическом лечении больных с облитерирующим атеросклерозом брюшной аорты и периферических артерий. Кроме того, кверцетин применяют для профилактики и лечения местных лучевых поражений после рентген - и гамма-лучевой терапии; лечения пародонтоза и эрозивно-язвенных заболеваний слизистой оболочки ротовой полости. Высокая активность отличает кверцетин при приеме в офтальмологии.

Кверцетин представляет собой агликон многих растительных флавоноидных гликозидов следующей структурной формулы:

Вместе с тем, применение кверцетина в составе лекарственных препаратов ограничено свойствами кверцетина как продукта практически нерастворимого в водной среде, а, следовательно, и в физиологических жидкостях организма. Этот фактор обусловливает создание в основном пероральных форм выпуска кверцетина - порошков и гранул, что приводит к крайне низкой биодоступности препаратов на его основе.

Известны способы получения инъекционных препаратов кверцетина [5, 6]. В частности, известен способ получения, при котором кверцетин растворяют в водном растворе (при температуре 75-85°С), содержащем натрия тетроборат, трилон Б и поливинилпирролидон в соотношении 1:(0,7-1,0):(5,5-8,0):(0,010-0,015), охлаждают, фильтруют, разливают в ампулы и термически стерилизуют. Известен также способ получения кверцетина для парентерального введения, который предусматривает растворение кверцетина и поливинилпирролидона в этаноле при соотношении 9:1, нейтрализацию, стерилизацию, розлив во флаконы и лиофилизацию. Существенными недостатками этих методов является введение в состав препарата вспомогательных токсичных веществ - трилон Б и поливинилпирролидон, которые ограничено выводятся из организма человека, накапливаясь в печени и почках (поливинилпирролидон). Именно этот факт привел к запрету использования поливинилпирролидона во многих странах.

Указанные недостатки известных способов получения препаратов на основе кверцетина обусловливают снижение биодоступности и безвредности целевых продуктов.

Одним из приоритетных направлений развития современных фармацевтических технологий является разработка и создание терапевтических систем направленного действия. Для решения этой задачи с успехом применяются наносомальные носители лекарственных веществ, которые способны увеличивать нацеленность действия и обеспечивают увеличение биодоступности. За последние годы появились сообщения о включении кверцетина в наночастицы из различных полимерных носителей, пегилированные частицы и липосомы из природных и синтетических липидов [1, 2, 4, 8-10].

Перевести кверцетин в водорастворимое состояние возможно, включив его в мембрану липидов [12-14]. В литературе описаны методы преодоления лекарственными составами низкой растворимости фармацевтических субстанций в водных растворителях, в частности кверцетина. В частности, известен лекарственный препарат Липофлавон на основе липосомальной композиции, который представляет собой фосфатидилхолиновые ЛС с инкапсулированным в них биофлавоноидом - кверцетином, применяемый в виде инъекционной формы в кардиологии и в виде глазных капель [11].

Известно, что препараты кверцетина существенно уменьшают как гемодинамические нарушения, так и объем некротического повреждения при острой ишемии и реперфузии миокарда. Этот эффект обусловлен мембраностабилизирующим действием кверцетина, о чем свидетельствует резкое торможение деградации мембранных ферментов в ишемизированном миокарде, а также торможение активности липоксигеназ и неферментных прооксидантных реакций. Существует мнение, что важным фактором, определяющим кардиопротекторные свойства кверцетина, является его способность повышать уровень оксида азота в тканях и эндотелии миокарда. Этот эффект был экспериментально доказан в опытах на культуре эндотелиоцитов пупочной вены человека и в экспериментах ίη νίνο с прямым определением уровня оксида азота в миокарде и стенке сосудов кролика и при моделировании процессов ишемии/реперфузии миокарда у собак. Сложность использования кверцетина в клинике прежде всего связана с его гидрофобностью. Создание Липофлавона как липосомальной формы кверцетина позволило решить эту проблему. Эффективность Липофлавона была показана при лечении острого инфаркта, нестабильной стенокардии, а также реперфузионных нарушений при тромболитической терапии. У экспериментальных животных на модели острого инфаркта внутривенное введение Липофлавона приводило к стабилизации

- 1 021352 электрической активности сердца, улучшению коронарного кровообращения и уменьшению зоны некроза в два раза. Препарат производил выраженный противоаритмический эффект. По-видимому, терапевтический эффект Липофлавона обусловлен комплексным действием компонентов препарата и его липосомальной структурой: блокадой липооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты за счет присутствия в препарате кверцетина, а также антигипоксическим, антиоксидантным и мембранопротекторным действием фосфатадилхолиновых липосом. Установлена безопасность и отсутствие побочных реакций (аллергических, иммунотоксичных, местно-раздражающего действия) при введении препарата. При исследовании ишемической болезни сердца установлено, что терапия Липофлавоном больных в течение 7 дней приводит к клиническому улучшению течения заболевания: уменьшению тяжести частоты приступов стенокардии, уменьшению объема необходимой поддерживающей терапии, в том числе антигипертензивных препаратов. Липофлавон обладает антиагрегатными, эндотелиопротекторными свойствами, улучшает реологические свойства крови и кровоток в микрососудах. Проведены исследования эффективности Липофлавона в комбинации с другим известным антигипоксантом - ацелизином в условиях экспериментальной хронической сердечной недостаточности. Предметом исследования было изучение влияния приведенной комбинации на состояние энергетических ресурсов, активности ферментов энергетического метаболизма - лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы. Было показано, что использование липосомальной формы кверцетина в комбинации с ацелизином позволяет на 7 сутки наблюдения существенно снизить в сыворотке крови и миокарде интенсивность свободнорадикального окисления. Лечение позволяет предупредить снижение активности ферментов, таких как супероксидисмутаза и каталаза. Было установлено, что Липофлавон обладает антирадикальными и антиоксидантными свойствами.

На основании проведенных исследований в клинике было рекомендовано применение Липофлавона : в комплексной терапии при остром инфаркте миокарда без патологического зубца О и нестабильной стенокардии приводит к более быстрой положительной динамике активности МВ-фракции креатинфосфокиназы в сыворотке крови, препятствует повышению уровня противовоспалительного цитокина интерлейкина-8, способствует электрической стабильности миокарда; при лечении стабильной стенокардии способствует уменьшению тяжести приступов стенокардии, снижению агрегации тромбоцитов, улучшению реологических показателей крови (снижению вязкости крови и агрегации эритроцитов) и микроциркуляции.

Известен способ [7] получения липосомальной композиции на основе природного фосфатидилхолина и кверцетина, который обладает фармакологической активностью. Способ [7] выбран наиболее близким аналогом по сумме признаков, а именно: сутью и последовательностью выполнения основных операций и приемов, химической природой фосфофолипида и кверцетина, липосомальной организацией целевого продукта и близостью его фармакотерапевтических проявлений.

Известный способ [7] предусматривает смешивание фосфатидилхолина в этиловом спирте и этанольного раствора кверцетина, который растворяют при температуре 47-53°С, высушивание смеси проводят при температуре 42-50°С, эмульгирование в водной среде, диспергирование эмульсии с добавлением лактозы, поэтапную стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание при массовом соотношении кверцетин:лактоза 1:24-30.

Однако способ [7] предусматривает операции и методы, которые затрудняют реализацию способа и способствуют снижению качества липосомального продукта. Во-первых, это связано с недостатком в препарате криопротектора - лактозы (при массовом соотношении кверцетин:лактоза 1:24-30), что приводит к завышенным размерам липосом после лиофилизации. Во-вторых, проведение процесса гомогенизации эмульсии при 60 МПа ухудшает стабильность системы и может изменять образующуюся систему липосом, что затрудняет стерилизующую фильтрацию и требует поэтапной и стерилизующей фильтрации. В-третьих, предлагаемая в [7] система добавления лактозы (только по окончании гомогенизации) в липосомы не позволяет криопротектору находиться как внутри липосомы, так и в окружающем водном пространстве, что приводит к нестабильности продукта после лиофилизации.

Все это снижает эффективность способа-прототипа в процессе его воспроизводства, а также стабильность целевого продукта как химиотерапевтического средства.

Задачей заявленного способа является упрощение процесса получения, повышение качества липосомального препарата по показателям стабильности липосомальной структуры после лиофилизации продукта и преимущественное накопление кверцетина в сердечной мышце, что, в свою очередь, обеспечивает фармакологическую активность. При этом результат, полученный при решении поставленной задачи, состоит в стандартности и стабильности полученного препарата липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), содержащих кверцетин, высокой инкапсуляции кверцетина в липосомы, стабильности липосом в процессе хранения, возможности стерилизующей фильтрации без поэтапной фильтрации.

Для достижения поставленного результата предлагается способ получения липосомальной композиции на основе фосфатидилхолина и кверцетина, предполагающий смешивание этанольных растворов фосфатидилхолина и кверцетина, высушивание полученной смеси в вакууме, её эмульгирование в водном растворе, гомогенизацию эмульсии с добавлением лактозы (криопротектора) в виде водного раствора, поэтапную стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание, при этом гомогенизацию про- 2 021352 водят в два этапа: первоначальный при давлении 500 атм, последующий при давлении 800 атм, лактозу добавляют дробно в два этапа: в начале и в процессе гомогенизации, при этом массовое соотношение компонентов в полученном препарате составляет кверцетин:лактоза 1:(31-76) соответственно.

Практические аспекты реализации способа предусматривают использование яичного фосфатидилхолина и кверцетина в органических растворителях, удаление растворителя упариванием в вакууме, диспергирование полученной массы в водной среде, гомогенизацию многослойных липосом при возрастающем давлении, добавление криопротектора как в начале гомогенизации, так и при достижении размера липосом 150-200 нм, получение липосом размером 80-140 нм, стерилизующую фильтрацию полученной липосомальной эмульсии, розлив во флаконы, лиофилизацию и герметизацию в атмосфере инертного газа (или азота).

Способ иллюстрируется графиками фармакокинетических профилей кверцетина в печени, мозге, почках и сердце крыс (фиг. 1-4 соответственно).

Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте липидного компонента - фосфатидилхолина оценивали методом тонкослойной хроматографии на пластинках по хроматограмме раствора целевого продукта в метанол:хлороформ:метанол - 65:25:4, на которой основное пятно желтого цвета находится на уровне основного пятна раствора стандартного образца фосфатидилхолина; индекс окисленности липидов оценивали УФ-спектроскопией при длинах волн 233 и 215 нм.

Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте кверцетина оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили для количественного определения посторонних примесей и содержания кверцетина в образцах препарата. Использовали хроматограф δΐιίιηαάζιι Ыехега, колонка хроматографическая размером С18 4,6x250 мм, с размером частиц 5 мкм аналогичная, подвижная фаза: 1% раствор уксусной кислоты и раствор метанол:ацетонитрил; скорость подвижной фазы 1 мл/мин; детектирование при длине волны 71 нм; температура колонки 30°С.

Физико-химические свойства полученного липосомального препарата оценивали определением величины частиц липосом на наносайзере 2е1а^ег Ναηο Ζδ методом фотонной корреляционной спектроскопии. Размер частиц измеряли при помощи полупроводникового лазера при длине волны 375 нм.

Нижеследующие конкретные примеры иллюстрируют процесс получения липосомальной композиции согласно заявленному способу (примеры 1-7) и способу согласно прототипу (пример 8)

Пример 1.

Лактозу в количестве 54,25 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого, ДПФХ и др.) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (27,125 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) - 0,83 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,8%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (3 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (27,125 г). Объем эмульсии 2205 мл. Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,783 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 138,2 нм - 87,1%, 57,8 нм - 12,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 98,88%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 165 нм - 87%; 75 нм - 13%; рН - 6,75. Включение кверцетина в липосомы не менее 96,2%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:31).

Пример 2.

Лактозу в количестве 93,625 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина ди- 3 021352 гидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого, ДПФХ и др.) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (46,81 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) - 0,83 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,8%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (3 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (46,81 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,8 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

148.2 нм - 93,1%; 70,8 нм - 6,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 96,88%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 154,3 нм - 100%; рН - 6,82. Включение кверцетина в липосомы не менее 97,2%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:51,3).

Пример 3.

Лактозу в количестве 133,0 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (66,5 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) - 0,825 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,8%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (3 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (66,5 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,787 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

138.2 нм - 87,1%; 57,8 нм - 12,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 96,88%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 148 нм - 87,8%; 57,8 нм - 12,2%; рН - 6,6. Включение кверцетина в липосомы не менее 95,12%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:26:76).

Пример 4.

Лактозу в количестве 54,25 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количест- 4 021352 венно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (27,125 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) - 0,827 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,8%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (4 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (27,125 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,784 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

148.2 нм - 92,1%; 67,8 нм - 7,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 98,85%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,4%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 139,6 нм - 94,8%; 42 нм - 5,2%; рН - 6,75. Включение кверцетина в липосомы не менее 93,9%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:31). В данном примере диспергирование при 500 атм - проводится 4 цикла.

Пример 5.

Лактозу в количестве 54,25 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (27,125 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) - 0,828 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,6%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (2 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (27,125 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,809 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

138.2 нм - 87,1%; 57,8 нм - 10,9%; 36,7 нм - 2% Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 96,88%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; Размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 143,0 нм - 85,4%; 61 нм - 11%; 42 нм -4,6%; рН - 6,55. Включение кверцетина в липосомы не менее 91,2%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:31). В данном примере проведено диспергирование при 500 атм - 2 цикла.

Пример 6.

Лактозу в количестве 35,0 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 105 мл стерильного раствора лактозы (17,5 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до

- 5 021352 полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) 0,825 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,6%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (3 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (17,5 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,787 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

148,2 нм - 88,1%; 67,8 нм - 11,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,775 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) 96,88%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 198 нм - 85,8%; 117,8 нм - 10,2%; 547 нм - 4%; рН - 6,6. Включение кверцетина в липосомы не менее 95,12%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:20). В данном примере проведено использование лактозы с уменьшенным количеством.

Пример 7.

Лактозу в количестве 93,625 г растворяли в фосфатной буферной смеси (рН 6,5-6,8) в объеме 210 мл. Раствор фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1750 мг растворяли в 150 мл этилового спирта. 47,25 г фосфатидилхолина (яичного, соевого, ДПФХ и др.) растворяли в 150 мл этилового спирта и перемешивали. Растворы кверцетина и фосфатидилхолина объединяли и фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стерильные растворы переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при 41-45°С до получения тонкой пленки. Пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 15-20 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали смесью растворов: 1995 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН 6,5-6,8) и 210 мл стерильного раствора лактозы (93,625 г лактозы). Колбу с раствором перемешивали в течение 2 ч до полного растворения пленки. Проводили контроль эмульсии: концентрация кверцетина в эмульсии (определение методом ВЭЖХ) 0,783 мг/мл. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,8%.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 38-44°С. Первоначально создавали давление (3 цикла) 500 атм. Затем продолжали гомогенизацию при 800 атм до размера частиц не более 200 нм. При достижении указанного размера частиц в эмульсию добавляли оставшийся стерильный раствор лактозы 105 мл (46,81 г). Гомогенизацию проводили до размера частиц не более 130-150 нм. Концентрация кверцетина до стерилизующей фильтрации 0,780 мг/мл. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром размером пор 0,2 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1830 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации

148,2 нм - 93,1%; 70,8 нм - 6,9%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,700 мг/мл. Включение кверцетина в липосомы после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) 89,74%. Количество примесей на уровне исходной субстанции кверцетина не превышало 2,62%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне - 134,3 нм - 92,4; 67 нм - 7,6%; рН - 6,82. Включение кверцетина в липосомы не менее 87,2%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:27:51,3). В данном примере добавление лактозы проводили в начале процесса диспергирования.

Пример 8 (по способу прототипа).

Точную навеску кверцетина дигидрата в количестве 1000 мг растворяли в 100 мл этилового спирта при температуре 50°С, прибавляли к раствору 40,0 г фосфатидилхолина, растворенного в 100 мл этилового спирта, и перемешивали. Раствор переносили в колбу ротационного испарителя. Этанол упаривали при температуре 42°С до получения тонкой пленки. После окончания процесса высушивания липидную пленку обрабатывали газообразным азотом в течение 5 мин. Полученную пленку со стенок колбы количественно снимали 1380 мл воды для инъекций. Колбу с эмульсией перемешивали в течение 2 ч.

Эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-45°С при давлении 600 атм. При достижении оптической плотности 0,15 (длина волны - 540 нм; толщина слоя поглощения - 0,5 см) к полученной эмульсии прибавляли стерильный раствор лактозы 24 г в 120 мл раствора. Продолжали гомогенизацию при тех же параметрах процесса до оптической плотности не более 0,15 (длина волны - 540 нм; толщина слоя поглощения - 0,5 см). Концентрация

- 6 021352 кверцетина после гомогенизации 0,65 мг/мл. Включение после гомогенизации (определение методом ВЭЖХ) 97%. Полученную эмульсию последовательно фильтровали через фильтры 0,45 и 0,22 мкм, а далее проводили еще одну фильтрацию через 0,22 мкм. Объем после стерилизующей фильтрации 1380 мл. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 153 нм - 89,7%; 56,8 нм - 10,3%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 0,615 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации (определение методом ВЭЖХ) - 94,61%. Эмульсию разливали во флаконы, лиофилизировали и герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу после лиофилизации, установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы желтоватого цвета с характерным запахом; размер частиц - 168,5 нм - 82,3%; 56,6 нм - 11,7%; 653 нм - 6%. Включение не менее 93,2%. Соотношение компонентов в препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - (1:40:24).

Пример 9.

При исследовании фармакокинетики липосомального и нелипосомального кверцетина при однократном инъекционном введении крысам наблюдается его быстрое выведение из плазмы крови с максимальной концентрацией около 40-70 мкг/мл, что согласуется с данными инструкции по медицинскому применению оригинального препарата кверцетина. Уровни концентраций в плазме липосомального и нелипосомального кверцетина существенно не различались. Наблюдались различия при определении кверцетина в печени крыс. С_тах для липосомальной формы составляла около 5,9 мкг/г (Т_тах - 1 мин), для нелипосомальной - около 15,8 мкг/г (Т_тах - 90 мин). Липосомальный кверцетин практически полностью выводился из печени к 18 ч, в отличие от нелипосомального, который сохраняется в печени к 18 ч после введения на уровне 13 мкг/г.

Также различия наблюдались для мозга - липосомальный кверцетин практически не проникал через ГЭБ и обнаруживался в небольших дозах (до 500 нг/г) не позднее 10 мин после введения. Нелипосомальный кверцетин обнаруживался в мозге крыс даже спустя 18 ч после введения в диапазоне концентраций 120-550 нг/г.

Схожие фармакокинетические профили наблюдались для почек: для липосомального кверцетина С_тах составила около 9 мкг/г, для нелипосомального - 7 мкг/г (Т_тах - 1 мин в обоих случаях).

Аналогичная, как и для почек, картина наблюдалась и для сердца. Для липосомального кверцетина С_тах составила около 4,2 мкг/г, для нелипосомального - 2,5 мкг/г (Т_тах - 1 мин в обоих случаях).

Таким образом, результаты физико-химических исследований свидетельствуют, что продукт, полученный согласно заявленному способу, - гомогенизация проводится в два этапа: первоначальный при 500 атм и последующий при 800 атм до указанного размера; соотношение компонентов в итоговом препарате: кверцетин:фосфатидилхолин:лактоза - 1:27:31-76 (см. примеры 1-3) обеспечивают стабильность композиции липосом с включенным в них кверцетином. Воспроизведение заявленного способа при изменении параметров (см. примеры 4-6), а также способ согласно прототипу (пример 8) влечет трудности в реализации собственно способа и снижение качества целевого продукта, а именно:

увеличение размера и неоднородность дисперсионного состава липосом (примеры 5, 6, 8); уменьшение включения кверцетина в липосомы и нестабильность размеров липосом (примеры 5, 7). Как видно из примеров 1-3, оптимальным является первоначальное проведение гомогенизации при

500 атм (3 цикла) - гомогенность выше 90%. При проведении диспергирования при 500 атм (2 цикла) обнаруживается гетерогенность размеров липосом, т.е. диаметр липосом находится в широком диапазоне и представлен тремя фракциями (пример 5); при проведении диспергирования при 500 атм (4 цикла) результаты не отличаются от использования трех циклов диспергирования (пример 4).

Оптимальным является содержание лактозы при соотношении кверцетин:лактоза 1:31 - 1:76. Использование меньшего количества лактозы приводит к нестабильности липосом после лиофилизации, что, в свою очередь, приводит к гетерогенности размеров липосом и их увеличению до фракции с размером 547 нм (пример 6)

Лактозу добавляют дробно: '/₂ первоначально, а затем после достижения размера липосом 200 нм вторую порцию. В случае добавления всей лактозы одновременно после лиофилизации (недостаток криопротекторного действия) увеличиваются размеры липосом и появляется фракция около более 500 нм (прототип, пример 8). При добавлении всего количества лактозы на начальной стадии обнаруживается снижение включения кверцетина в липосомы (пример 7).

- 7 021352

Список литературы

1. Антипова С.В., Шепилов А.В., Рябцева О.Д. Опыт применения Липофлавона для предупреждения развития кардиологических осложнений у больных операбельным раком молочной железы, получавших лечение антрациклинами. Проблеми сучасно1 медично1 науки та осв1ти. 2009. № 2. С. 44-46.

2. Кириченко С.В., Тишкж С.М., Соловьйов АЛ. Кверцетин-вм1СН1 лшосоми В1дновляють функщональну активжсть канал1в у гладеньких мюцитах аорти опромжених щур1в. Фармаколопя та Л1карська токсиколопя. 2008. № 1-3. С. 48 - 52.

3. Ковалев В.Б., Ковган В.В., Колчина Е.Ю. Механизмы лечебного действия биофлавоноида кверцетина (обзор литературы). Украшський медичний альманах. 1999. Т. 2. № 4. С. 176-184.

4. Манухина Е.Б., Лямина Н.П., Долотовская П.В. Роль оксида азота и кислородных радикалов в патогенезе артериальной гипертензии. Кардиология. 2002. № 11. С. 73-84.

5. Патент РФ № 2181051, МПК⁷ Ф61КЗЗ/22, А61К9/08, А61К31/79, А61КЗ1/198, 2002.

6. Патент Украины №38504, МПК⁷ А61К9/14, А61КЗ/79,

А61К31/455,2001.

7. Стефанов О.В., Григорьева Г.С., Соловйов АЛ. Пасечшкова Н.В., Хромов О.С., Конахович Н.Ф., Краснопольський Ю.М. Спошб отримання лшосомального засобу, що м1стить кверцетин. Патент У кражи № 76393. А61К 9/217, А61К 31/353, А61К 47/44, А61Р 31/00, А61Р 35/00, А61Р 39/06 2006. Прототип.

8. Чекман 1.С., Савченкова Л.В., Горчакова Н.О. и др. Лшосомальш форми л1карських засоб1в: в1д експерименту до клжики. Журнал АМН Укражи. 2006. Т.12. № 5. С. 653-667.

9. А1ехоро1ои Е., Оеог§орои1оз А., Ка§ка<Лз К.А., ОетеСгоз С. РгерагаЛоп апс! СНагас1ег12аЛоп οί 1уорНФ2еЛ Прозотез \νίΦ тсогрогаЮЛ Оиегсйт. 1. оГЫро-зоте КезеагсН. 2006. V. 16. N. 1-2. Р. 17-25.

10. ОопюХакл М., НаЩаШотои Н., Оппаз К., \Уа§пег М., Оете1гоз С. Епсарзи1аН-оп οί паШгаПу осситп§ Лауопо1Лез ΐηίο Прозотез: РНуз1сосНепнса1 ргорегНез апЛ Ыо1о§1са1 асПуку а§атз! Нитап сапсег се11 Нпез. 1. РНагтасок 2004. V. 56. N. 10. Р. 1217-1224.

11. Оп§огуеуа О.8., 81е1апоу О.У., КопакНоусЬ Ν.Ρ., Кгазпоро1зку Υ.Μ. РазесНт-коуа Ν.ν. РНуз1са1-сНегтса1 §гоипЛз οί Фе тетЬгапе 1гор1с ГасГОгз ίη тесНатзт οί Фе Нрозота1 теЛютез асПоп. 1тегпаПопа1 Нрозоте зос1е!у: Рго^гезз ίη Лги§ апб уассте ЛеПуегу. 2005. ЬопЛоп. Р. 50-54.

12. ЕгЛеп Μ.Ι., КаНгатап А., Ко§кеп Т. ВепеПс!а1 ейес1з οί циегсеПп оп охФаНуе зЧезз тЛисеЛ Ьу икгауЫеГ СПп. Е[р. Оегтаю1. 2001. V. 26. N 5. Р. 536-539.

13. МаСзио М., 8азак1 Ν., 5а§а К., Капеко Т. Су1о1охюку οί ЯауошнЛз ЮхуагЛ си1-ШгеЛ погта1 Нитап се11з. ΒίοΙ. РНагт. Ви11. 2005. V. 28. N. 3. Р. 253259.

- 8 021352

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения липосомального препарата, содержащего биофлавоноид кверцетин, путем смешивания этанольных растворов фосфатидилхолина и кверцетина, высушивания смеси в вакууме, ее эмульгирования в водном растворе, гомогенизации эмульсии с добавлением лактозы в виде водного раствора, поэтапной стерилизующей фильтрации и лиофильного высушивания, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят по меньшей мере в два этапа: первоначальный при давлении 500 атм, последующий при давлении 800 атм, лактозу добавляют дробно в два этапа в начале и в процессе гомогенизации при массовом соотношении компонентов в полученном препарате кверцетин:лактоза 1:(31-76) соответственно.

Усредненные фармакокинетические профили кверцетина в печени крыс