EA018509B1 - Потомство и семя растения brassica, устойчивого к sclerotinia, и их применение для получения масла или муки - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к растению Brassica, в частности его потомству и семени этого потомства, обладающему устойчивостью к заболеванию, вызванному Sclerotinia sclerotiorum, с показателем SSDI% менее чем приблизительно 60% показателя SSDI% для контрольного сорта. Также предоставлены способы скрининга растения Brassica на устойчивость к Sclerotinia в поле. Кроме того, изобретение касается применения растения Brassica и его семени, получаемых по способу, раскрытому в изобретении, для получения масла и муки.

Description

(57) Изобретение относится к растению Вганн1са, в частности его потомству и семени этого потомства, обладающему устойчивостью к заболеванию, вызванному 8с1егойша 8с1егойогши, с показателем 88Э1% менее чем приблизительно 60% показателя 88Э1% для контрольного сорта. Также предоставлены способы скрининга растения Вганн1са на устойчивость к 8с1егойша в поле. Кроме того, изобретение касается применения растения Втаннюа и его семени, получаемых по способу, раскрытому в изобретении, для получения масла и муки.

018509 ΒΙ

Техническая область

Настоящее изобретение относится к устойчивой к 8с1етойша Втакмса. Изобретение также относится к новым способам скрининга устойчивости к 8с1етойша в теплице и в поле.

Предпосылки изобретения

8с1етойша инфицирует более 100 видов растений, включая многочисленные экономически важные сельскохозяйственные культуры, такие как виды Втакыса, подсолнечника, зрелой фасоли, соевых бобов, полевого гороха, чечевицы, латука и картофеля (Во1апб аиб На11, 1994). 8с1егойша 5с1егоОогит отвечает за более 99% заболеваний, вызванных 8с1етойша, в то время как 8с1егойша тшот вызывает менее чем 1% заболеваний. 8с1етойша образует склероции неправильной формы, темные перезимовывающие тела, которые могут сохраняться в почве от четырех до пяти лет. Склероции могут развиваться с образованием плодовых тел или с образованием мицелия, в зависимости от окружающих условий и типов растительного покрова. Два типа развития вызывают два разных типа заболеваний. Склероции, которые развиваются с образованием плодовых тел, образуют апотеции и аскоспоры, которые инфицируют надземные ткани, приводя к заболеванию стеблей, стеблевой гнили, гнили кочанов, гнили бобов, белой гнили и заболеванию цветков растений. Склероции, которые развиваются с образованием мицелия, образуют мицелии, которые инфицируют ткани корня, вызывая гниль корневой шейки, корневую гниль и гниль основания стебля.

8с1етойша приводит к стеблевой гнили, вызванной 8с1етойша, также известной как белая гниль, у Втакыса, включая канолу. Канола представляет собой тип Втакыса, содержащий низкий уровень глюкозинолатов и эруковой кислоты в семенах. Склероции развиваются с образованием плодовых тел летом, образуя апотеции. Апотеции высвобождают разносимые ветром аскоспоры, которые распространяются вплоть до одного километра. Заболеванию способствуют условия влажной почвы (по меньшей мере 10 суток при или вблизи нормальной влагоемкости) и температуры 15-25°С перед цветением канолы и в ходе него. Споры не способны непосредственно инфицировать листья и стебли; они должны сначала попасть на цветки, опавшие лепестки и пыльцу на стеблях и листьях. Возраст лепестков влияет на эффективность инфекции, более старые лепестки с большей вероятностью подвержены инфекции (Негап е1 а1., 1999). Грибные споры используют части цветка в качестве источника пищи по мере своего прорастания и инфицирования растения.

Тяжесть инфекции, вызванной 8с1етойша, у Втакыса варьирует и зависит от продолжительности инфекции и климатических условий (Негап е1 а1., 1999). Заболеванию способствуют холодные температуры и продолжительные периоды осадков. Температуры между 20 и 25°С и относительные влажности более 80% необходимы для оптимального инфицирования растения (Негап е1 а1., 1999). Для конкретных полей сообщали о потерях, варьирующих от 5 до 100% (МапйоЬа ЛдпсиНиге. Еооб апб Яига1 1шйабуе8, 2004). В среднем, потери урожая равны от 0,4 до 0,5 величины процентной доли инфекции. Например, если поле инфицировано на 20% (20/100 инфицированных растений), то потеря урожая, возможно, составит приблизительно 10%. Более того, 8с1етойша может вызывать значительные потери во влажных валках. 8с1етойша 8с1ето1югит вызывает экономические убытки для фермеров, выращивающих канолу, в Миннесоте и Северной Дакоте в размере 17,3, 20,8 и 16,8 млн долларов в 1999, 2000 и 2001 г. соответственно (Вгаб1еу е1 а1., 2006).

Симптомы инфекции, вызванной 8с1етойша, обычно развиваются спустя несколько недель после начала цветения. На растениях развиваются участки повреждения, от бледно-серых до белых, на линии почвы или выше ее и на более высоких ветвях и стручках. Инфекции часто развиваются на месте соединения листа и стебля, так как там задерживаются инфицированные лепестки. Как только растения инфицированы, гриб продолжает врастать в стебель и проникать в здоровую ткань. Инфицированные стебли выглядят обесцвеченными и склонны к расщеплению. Твердые черные склероции гриба развиваются внутри инфицированных стеблей, ветвей или стручков. Растения, инфицированные в период цветения, производят мало семян или не производят их. Растения с окольцованными стеблями преждевременно увядают и созревают. Сильно инфицированные сельскохозяйственные культуры часто полегают, раздробляются при валковании и делают валкование занимающим более продолжительное время. Инфекции могут возникать во всех надземных частях растения, в особенности, в плотных или полегших насаждениях, где контактирование растения с растением облегчает распространение инфекции. Новые склероции переносят заболевание в следующий сезон.

Общепринятые способы борьбы с заболеваниями, вызванными 8с1етойша, включают (а) химические меры борьбы, (Ь) устойчивость к заболеванию и (с) агротехнические меры борьбы, каждый из которых описан ниже.

(a) Фунгициды, такие как беномил, винклозолин и ипродион, остаются основным способом борьбы с заболеванием, вызванным 8с1етойша (Мога11 е1 а1., 1985; Ти, 1983). В последнее время разработаны дополнительные фунгицидные композиции для применения против 8с1етойша, включая азоксистробин, протиоконазол и боскалид (ЗоНщоп, 2005). Однако применение фунгицида является дорогостоящим и может приносить вред потребителю и окружающей среде. Более того, вследствие многократного применения возникла устойчивость к некоторым фунгицидам.

(b) Для определенных сортов бобов, сафлоры, подсолнечника и соевых бобов, достигнут опреде

- 1 018509 ленный прогресс в развитии частичной (неполной) устойчивости. Частичную устойчивость часто обозначают как толерантность. Однако успех в развитии частичной устойчивости оказался очень ограниченным, вероятно вследствие того, что частичная физиологическая устойчивость является мультигенным признаком, как продемонстрировано на бобах (Ри11ег с1 а1., 1984). В дополнение к частичной физиологической устойчивости, достигнут определенный прогресс в селекции на морфологические признаки, чтобы предотвратить инфекцию, вызванную 8с1ето!1и1а, такие как прямостоячая форма роста, устойчивость к полеганию и незначительный растительный покров. Например, бобовые растения с частичной физиологической устойчивостью и с прямостоячим положением, незначительным растительным покровом и неопределенной формой роста оказались лучше всего способными противостоять 8с1егоЦша (8ашйоп е1 а1., 1993). Для рано созревающих сортов сафлора показана хорошая устойчивость на полях к 8с1его!1ша. В заключение, у соевых бобов характеристики сорта, такие как высота, раннее созревание и значительная устойчивость к полеганию приводят к уменьшению заболеваемости, в основном вследствие ухудшения условий микроклимата, благоприятных для заболевания (Во1апй апй На11, 1987; ВиххеП е! а1., 1993).

(с) Агротехнические способы, такие как использование свободных от патогена или обработанных фунгицидом семян, повышение расстояния между рядами, снижение нормы высева семян для уменьшения вторичного распространения заболевания и закапывание склероций для предотвращения развития с образованием плодовых тел могут снижать заболеваемость, вызванную 8с1егойша, но не могут эффективно бороться с заболеванием.

Все генотипы канадской канолы подвержены стеблевой гнили, вызванной 8с1етойша (МапйоЬа АдпсиИите, Роой апй К.ита1 1ш!1а!1уек, 2004). Они включают в себя все известные яровые генотипы сортов канолы. Также отсутствует устойчивость к 8с1етойп1а у австралийских сортов канолы (Ншй-Еапо1ке1е! е! а1., 2004). Некоторые сорта с определенными морфологическими признаками лучше приспособлены противостоять инфекции, вызванной 8с1етойп1а. Например, польские сорта (Втаккюа тара) образуют более слабый растительный покров и, как представляется, обладают значительно меньшими уровнями инфицирования. Кроме того, безлепестковые сорта (апетальные сорта) в значительной степени не подвержены инфекции, вызванной 8с1етойп1а (Окиуата е! а1., 1995; Ри, 1990). Другие примеры морфологических признаков, которые придают до некоторой степени снижение восприимчивости в полевых условиях у генотипов Втаккюа, включают повышенную устойчивость к полеганию, пониженное сохранение лепестков, ветвление (менее компактное и/или более высокое) и раннее опадение листьев. 1игке апй Регпапйо (2003) осуществили скрининг одиннадцати генотипов канолы на распространенность заболевания, вызванного 8с1его!1ша. Значительную вариацию распространенности заболевания объясняли морфологией растения, и различия в сохранении лепестков идентифицировали в качестве наиболее важного фактора. Однако эти морфологические признаки сами по себе не придают устойчивость к 8с1его!1ша, и все образцы канолы в Канаде считаются подверженными инфекции, вызванной 8с1етойп1а.

Озимые генотипы канолы также подвержены инфекции, вызванной 8с1ето!1и1а. В Германии, например, отсутствуют устойчивые к 8с1етойша сорта (8рес111. 2005). Широко культивируемый немецкий сорт Ехргекк считается подверженным-умеренно подверженным и принадлежит к группе менее подверженных сортов/гибридов (см. табл. 4).

Опрыскивание фунгицидом является единственным способом борьбы со 8с1его!1ша у сельскохозяйственных культур канолы, выращиваемых в условиях, благоприятных для заболевания в период цветения. Типичные фунгициды, используемые для борьбы со 8с1етойп1а у Втаккюа, включают роврал™ от Вауег и ронилан™/ланс™ от ВА8Р. Активный ингредиент в лансе™ представляет собой боскалид, и его продают в США как эндуру™. Фунгицид следует применять перед появлением видимых симптомов стеблевой гнили и обычно на стадии 20-30% цветения сельскохозяйственной культуры. Если инфекция уже заметна, то нет смысла в применении фунгицида, так как уже слишком поздно для развития эффекта. Следовательно, фермеры должны оценивать свои поля на риск заболевания, чтобы решить, стоит ли применять фунгицид. Это можно осуществить с использованием предоставляемого правительством проверочного листа или с использованием набора для тестирования лепестков. Любой из способов является трудоемким и склонным к ошибкам (Ншй-Ьапощек!, 2004; 1ойпкоп, 2005).

Осуществлены многочисленные попытки разработки устойчивых к 8с1етойп1а растений Втаккюа. Врожденная устойчивость, вероятно, является более подходящей, экономичной и безвредной для окружающей среды, чем борьба со 8с1етойп1а посредством применения фунгицидов. Так как признак является полигенным, он, вероятно, является стабильным и не склонным к утрате эффективности, как это может происходить с фунгицидами.

Яровая канола (Втаккюа парик киЬкр. о1е!Гега уат. аппиа) отличается от озимой канолы (Втаккюа парик киЬкр. оШГега уат. Ыепшк) в основном отсутствием потребности в облигатной яровизации. Азиатские сорта рапса и канолы обладают потребностью в яровизации от низкой до промежуточной и известны как полуозимые типы. В то время как озимая канола не способна завершить свой репродуктивный цикл при посадке весной, посадка ранней весной и воздействие холодом позволяет азиатским растениям цвести и давать семена. Азиатские растения не способны завершить свой репродуктивный цикл при посадке поздней весной. В контролируемых условиях для озимых растений необходимо 12-14 недель яровизации, в то

- 2 018509 время как для азиатских растений необходимо 2-8 недель. В табл. 1 суммированы различия между озимыми, полуозимыми (азиатскими) и яровыми сортами канолы.

Таблица 1 Основные характеристики характера роста у растений Втаккка парик

Тип	Яровой*	Яровой	Полуозимый (Азиатский)	Озимый
Области выращивания	Канада, Европа	Австралия	Китай, Япония	Европа
Потребность в яровизации;	Нет	Нет	2-8 недель, промежуточная	12-14 недель, сильная или облигатная
Время посадки	Весна (увеличение продолжительности дня)	Осень (уменьшение продолжительности дня)	Осень (уменьшение продолжительности дня)	Осень (уменьшение продолжительности дня)
Количество суток до цветения	30-90	90-150	120-180	150-270

* Канадские, европейские и австралийские яровые растения можно сажать и выращивать при любых внешних условиях или времени посадки для яровой канолы.

Некоторые китайские (полуозимые) сорта рапса/канолы частично устойчивы к 8с1ето!1ша. Например, в СНипУип е! а1., 2003, Нап2йопд е! а1., 2004, ХеЖп е! а1., 2002, УопдТи е! а1., 2000, СНаоСш е! а1., 1998, описаны частично устойчивые сорта рапса. Однако некоторые из этих сортов не являются сортами канолы, и все они нуждаются в яровизации. Частичная устойчивость в полевых условиях у китайских сортов берет начало преимущественно от сорта рапса 2йопд уои 821. Несмотря на улучшение частичной устойчивости у 21юп§ уои 821, его реакция на заболевание менее стабильна в условиях окружающей среды, благоприятных для развития 8с1ето!1ша (Уипсйапд е! а1., 1999). Это указывает на более низкий уровень частичной устойчивости (Ь1 е! а1., 1999).

Некоторые японские сорта рапса обладают частичной устойчивостью стебля к 8с1ето!1ша. Частичную устойчивость стебля выявили испытаниями в закрытом помещении по сравнению с озимой канолой (Вгип е! а1., 1987). Однако эти сорта не являются сортами канолы и относятся к полуозимым типам (см. табл. 1).

Селекция на устойчивость к 8с1етойша в полевых условиях у канолы очень затруднена вследствие количественной природы данного признака. Более того, включение физиологической устойчивости наряду с морфологическими признаками, которые не подвержены или менее подвержены инфекции, повышает сложность селекции на устойчивость. Кроме того, как оказалось, очень сложно осуществлять скрининг на устойчивость вследствие непосредственного взаимодействия окружающей среды (т.е. требований к температуре и влажности, а также требований к микроокружению) с популяцией растений. Как указано выше, не существует канадских яровых сортов Втаккюа с устойчивостью к 8с1ето!1ша, это несмотря на многие годы совместной эволюции и воздействия окружающей среды на отбор данного признака. Наиболее высокий достигнутый уровень устойчивости в полевых условиях у рапса (и, недавно, у некоторых образцов канолы) получен с помощью попыток селекции в Китае, как описано для 2йопд уои 821 (Уипсйапд е! а1., 1999). Уровни такой частичной устойчивости или толерантности являются относительно низкими, так как применение фунгицидов по-прежнему рекомендовано для всех сортов рапса и канолы в Китае (устное сообщение) (Ваосйепд е! а1., 1999). Очевидно, что сорта Втаккюа и канолы с высокими уровнями устойчивости к 8с1ето!1ша не обнаружены в природе.

Сорта канолы Втаккюа парик выведены в 1970 годах. Несмотря на 30 лет значительных усилий, затраченных на селекцию, до настоящего момента не выведено сортов канолы, устойчивых к 8с1ето!1ша. Попытки селекции включали, чтобы назвать несколько, анализ локусов, ответственных за количественные признаки (21ао-Лапте1 е! а1., 2003), селекцию с помощью мутагенеза (МиШпк е! а1., 1999; \УиУапуои е! а1., 1996; ЫапдНопд е! а1., 2003), попытки обширного скрининга (8ейипе е! а1., 1989; 2йао е! а1., 2004), и скрининг на экспрессирующиеся маркерные последовательности (Е8Т) (Еидапд е! а1., 2004). Выведено несколько яровых сортов канолы с умеренной толерантностью к 8с1ето!1ша (АНшаШ е! а1., 2000а; А1нпаЙ1 е! а1., 2000Б; ВаоМшд е! а1., 1999; Ыи е! а1., 1991), однако уровень толерантности является низким и линии не способны противостоять сильному воздействию заболевания. Недавно выведена трансгенная канола, несущая ген оксалатоксидазы (патент США 6166291 и выделенные из него патенты); однако существуют регламентирующие и социальные проблемы, связанные с трансгенными растениями. Озимые

- 3 018509 генотипы канолы с устойчивостью к 8с1етойша также нуждаются, как отмечено, в использовании фунгицидов (1ойпкои, 2005). Следовательно, необходимо значительное техническое вмешательство человека для выведения сортов канолы, которые устойчивы к 8с1етойша.

Сущность изобретения

Аспект настоящего изобретения относится к растению Втаккюа или группе растений с улучшенной устойчивостью к 8с1ето11И1а кс1его1югиш.

В одном из аспектов изобретение относится к потомству ярового растения Втаккюа парик, где растение или группа растений являются представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1етоИша кс1его1югиш, (88ΌΙ%), которое составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеет Ηί-Втеб сорта 46А76, или для Рюпеет Ηί-Вгеб сорта 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Растение Втаккка парик или группа растений могут также являться представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1етоПп1а кс1его1югиш, (88ΌΙ%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для Рюпеет Ηί-Втеб сорт 46А76, или для Рюпеет Ηί-Втеб сорт 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов.

Другой аспект настоящего изобретения относится к потомству озимого растения Втаккюа парик, где растение или группа растений являются представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1егойша кс1его1югиш (88ΌΙ%), которое составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для сорта Со1ишЬик, или для сорта Ехргекк, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Озимое растение Втаккка парик или группа растений могут также являться представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1етоИша кс1его1югиш, (88ΌΙ%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для сорта Со1ишЬик, или для сорта Ехргекк, или среднего значения показателя для двух сортов.

При этом яровое растение или группа растений по изобретению представляет популяцию, характеризуемую, по меньшей мере, следующими признаками: (а) твердый компонент семян популяции, содержащий количество глюкозинолата менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества, (Ь) масло из семян растения, содержащее менее чем 2% эруковой кислоты, (с) 50% период цветения между приблизительно 30-90 сутками и (б) показатель 88ΌΙ%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеет Ηί-Втеб сорт 46А76, или для Рюпеет Ηί-Втеб сорт 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Растение Вгаккюа парик может также являться представителем популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1егойша кс1его1югиш, (88ΌΙ%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для Рюпеет Ηί-Втеб сорта 46А76, или для Рюпеет Ηί-Втеб сорта 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов.

Озимое растение Втаккка парик или группа растений по изобретению представляет популяцию, характеризуемую, по меньшей мере, следующими признаками: (а) твердый компонент семян популяции, содержащий количество глюкозинолата менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества, (Ь) масло из семян популяции, содержащее менее чем 2% эруковой кислоты, (с) 50% период цветения между приблизительно 30-90 сутками и (б) показатель 88ΌΙ%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для сорта Со1ишЬик или для сорта Ехргекк, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. Озимое растение Вгаккюа парик или группа растений могут также являться представителями популяции, где популяция обладает средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1егойша кс1его1югиш, (88ΌΙ%), которое составляет менее чем 50, 35 или 20% показателя для сорта Со1ишЬик, или для сорта Ехргекк, или среднего значения показателя для двух сортов.

Растение Вгаккюа парик по изобретению может представлять потомство яровой линии Вгаккюа парик, как указано далее.

(a) Групповое добавление 83 из 038Ν40341, депонированное под инвентарным № АТСС РТА-6776; или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 038Ν40341 и депонированная под инвентарным № АТСС РТА-6780.

(b) Групповое добавление 83 из 038Ν40441, депонированное под инвентарным № АТСС РТА-6779; или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 038Ν40441 и депонированная под инвентарным № АТСС РТА-6778.

(c) Групповое добавление Е4 из 028Ν41269, депонированное под инвентарным № АТСС РТА-6777; или удвоенная гаплоидная пиния, полученная из 028Ν41269 и депонированная под инвентарным № АТСС РТА-6781.

(б) Группа 82, обозначенная 048Ν41433, депонированная под инвентарным № NСIΜВ 41389, или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 048Ν41433 и депонированная под инвентарным № ΝΕΊΜΕ 41391.

- 4 018509 (е) Группа 82, обозначенная 048Ν41415, депонированная под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41388, или удвоенная гаплоидная линия, полученная из 048Ν41415 и депонированная под инвентарным № ΝΟΙΜΒ41390.

(См. также табл. 11а).

Растение Вга881еа парив по изобретению может представлять потомство озимой линии Вгаввюа парив, как указано далее.

(a) Групповое добавление Р4 линии 04С\УВ930128. депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41396.

(b) Групповое добавление Р4 линии 04ί'’\νΒ930127, депонированное под инвентарным № Νί'ΊΜΒ 41395.

(c) Групповое добавление Р4 линии 04ίνΒ930081, депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41393.

(б) Групповое добавление Р4 линии 04ίνΒ930111, депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41394.

(е) Групповое добавление Р4 линии 04ίνΒ930144, депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41398.

(ί) Групповое добавление Р4 линии 04ίνΒ930015, депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41392.

(д) Групповое добавление Р4 линии 04ίνΒ930135, депонированное под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41397.

(См. также табл. 11Ь).

Другой аспект изобретения относится к потомству любого из растений ΒπίδδΚη парив, где указанное потомство получено выделением придающего устойчивость к 8с1егойп1а признака с помощью удвоенной гаплоидии, и где однородная популяция, содержащая указанное потомство, обладает показателем 88ΌΙ%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для (1) Рюпеег Ηι-Βιό6 сорта 46А76, или Рюпеег Ηι-Βιό6 сорта 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов, где популяция обладает яровым характером роста, или (2) для сорта Со1итЬив, или сорта Ехргевв, или среднего значения показателя для двух сортов, где популяция обладает озимым характером роста, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению ярового растения Β^авв^са парив, где растение является представителем популяции, которая обладает показателем 88ΌΙ%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеег Ηι-Βιό6 сорта 46А76, или для Рюпеег Ηι-Βιό6 сорта 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, для выращивания сельскохозяйственной культуры для получения масла и кормовой муки, или для селекции новой линии Β^аββ^са. Растение можно обозначить как 038Ν40341, 038Ν40441, 028Ν41269, 04ΌΗ812921, 04ΌΗ811319 или 04ΌΗ811418, где семена представителей депонированы под инвентарным № АТСС: РТА-6776, РТА-6779, РТА-6777, РТА-6781, РТА6780 или РТА-6778 соответственно, указанные семена депонированы 8 июня 2005 г. или приблизительно в это время; или его можно обозначить как 048Ν41433, 048Ν41415, 05ΌΗ812897 или 04ΌΗ812879, где семена представителей депонированы под инвентарным № ΝίΙΜΒ 41389, 41388, 41391 или 41390 соответственно.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению озимого растения Β^аββ^са парив, где растение является представителем популяции, которая обладает показателем 88ΌΙ%, который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для сорта Со1итЬив или для сорта Ехргевв, или среднему значению показателя для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, для выращивания сельскохозяйственной культуры для получения масла и кормовой муки, или для селекции новой линии Β^^Κη. Растение можно обозначить как 04ίνΒ930127, 04ίνΒ930128, 04ίνΒ930081, 04ίνΒ930111, 04ίνΒ930144, 04ίνΒ930135 или 04ίνΒ930015, где семена представителей депонированы под инвентарным № ΝίΙΜΒ: 41395, 41396, 41393, 41394, 41398, 41397 или 41392 соответственно.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой гистограмму 5-10 циклов популяции Т от 2000-2005 при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Ось Υ представляет собой частоту у потомков. Ось X представляет собой ранжирование 1-9 по 88ΌΙ для 8с1егойп1а, как описано в табл. 4.

На фиг. 2 представлены агрономические данные и данные для 8с1егойша для конкретных устойчивых к 8с1егойп1а яровых линий канолы. Данные для 8с1егойша представлены в виде % для 46А76, 46А65 и их среднего значения. Часть А содержит агрономические данные и данные для 8с1егойша при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Часть В содержит данные для поля в естественных условиях. Часть С содержит объединенные результаты части А и части В. Часть Ό представляет собой часть В, где данные одного испытания в поле в естественных условиях (ΝΏ8ϋ 2005) опущены. Часть Е содержит объединенные результаты части А и части Ό.

- 5 018509

Подробное описание изобретения

I. Краткий обзор.

В настоящем изобретении описаны первые линии канолы с низким содержанием эруковой кислоты и низким содержанием глюкозинолата, обладающие яровым или озимым характером развития и обладающие высокими уровнями устойчивости в полевых условиях к 8с1етобша. Устойчивость в полевых условиях основана на накоплении обычной частичной физиологической устойчивости к 8с1егобп1а в сочетании с морфологическими признаками, которые функционируют синхронно в направлении снижения развития заболевания.

Существует несколько аспектов этого изобретения.

Первый аспект состоит в разработке устойчивых к 8с1етобша линий канолы. Этот аспект изобретения описан в примерах 1, 2, 3, 4, 8 и 9. Это является первым сообщением о яровых линиях канолы, обладающих средним уровнем распространенности 8с1етобша менее чем приблизительно 60% от уровня распространенности для Рюиеет Ηί-Втеб сорта 46А76, или для Рюпеет Ηί-Втеб сорта 46А65, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, как измерено с помощью показателя 88ΌΙ%; или об озимых линиях канолы, обладающих средним уровнем распространенности 8с1етобша менее чем приблизительно 60% от уровня распространенности для сорта Со1итЬик или сорта Ехргекк, или среднего значения показателя для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, как измерено с помощью показателя 88ΌΙ%. Непосредственное техническое вмешательство человека для генетического манипулирования и постепенного накопления многочисленных физиологических и морфологических признаков в течение шести лет усилий по выведению и селекции (2000-2005), обусловленное 15 годами исследований (1991-2005), привело к созданию яровых линий канолы с устойчивостью к 8с1етобша. Коллекции семян, представляющие улучшенные линии, получены, как подробно описано в других местах данного документа, включая табл. 11а и 11Ь.

Второй аспект изобретения состоит в разработке линий канолы с сочетанием устойчивости к 8с1етобша и устойчивости к черной ножке. Усилия по выведению и селекции, описанные в примерах 1, 2, 3 и 4, не только привели к получению линий с устойчивостью к 8с1етобша, но также привели к получению линий, обладающих устойчивостью к черной ножке. Постепенное накопление многочисленных физиологических и морфологических признаков в течение шести лет усилий по выведению и селекции, обусловленное пятнадцатью годами исследований, привело к созданию линий с устойчивостью к 8с1етобп1а, и также с устойчивостью к черной ножке. Этот аспект изобретения описан в примере 5.

Третий аспект изобретения состоит в разработке способов скрининга на устойчивость к 8с1етобп1а в теплице или фитотроне и в поле. Разработка этих способов являлась одним из критических факторов успеха в разработке устойчивых к 8с1етобп1а линий и устойчивых к черной ножке линий по изобретению, описанных в примерах 1, 2, 3, 4 и 5. Этот аспект описан в примерах 6 и 7.

II. Способы селекции канолы.

В программах селекции канолы используют способы, такие как массовая и рекуррентная селекция, возвратное скрещивание, селекция педигри и получение удвоенных гаплоидов. Для общего описания селекции рапса и канолы см. КК. Эомпеу апб С.РЛУ. Ваком, 1987: Варекееб апб Мийатб (Ιη: Рейт, У.В. (еб.), Рппар1ек о! СиШуат Эеуе1ортеп1. 437-486. кем Уотк: МастШап апб Со.); Тйотркоп, К.Р., 1983: Втеебшд м1Шег обкееб таре Втаккюа парик. Абхапсек ш Аррбеб Вю1оду 7:1-104; Обкееб Варе, Уагб, е1 а1., Раттшд Ргекк Ыб., \УйагеГеба1е Воаб, 1ркмюй, 8нГГо1к (1985), каждая из которых приведена здесь в качестве ссылки.

Скрещивание между двумя разными гомозиготными линиями приводит к однородной популяции гибридных растений (также называемых гибридными растениями Р1), которая может являться гетерозиготной по многим генным локусам. Скрещивание двух гетерозиготных растений, которые отличаются по ряду генных локусов, будет приводить к популяции растений, которые генетически различны и будут однородными. Несмотря на происхождение, растения, которые подвергали самоопылению и отбирали по типу в течение многих поколений, становятся гомозиготными почти по всем генным локусам и дают однородную популяцию потомства настоящей чистой линии. Термин инбредный, как применяют здесь, относится к гомозиготному растению или коллекции гомозиготных растений. Рядовым специалистам станет понятно, что некоторая остаточная гетерозиготность может существовать у инбредных растений.

Выбор способов выведения или селекции зависит от способа размножения растений, наследуемости признака(ов), которые подвергают улучшению, и типа коммерчески используемого сорта (например, гибридный сорт Р1, сорт чистой линии и т.д.). Для очень хорошо наследуемых признаков выбор лучших индивидуальных растений, оцениваемых в одном месте, будет эффективным, в то время как для признаков с низкой наследуемостью селекция должна быть основана на средних величинах, полученных из повторных оценок семейств родственных растений. Популярные способы селекции обычно включают селекцию педигри, модифицированную селекцию педигри, массовую селекцию и рекуррентную селекцию.

Сложность наследования влияет на выбор способа селекции. Как правило, селекцию начинают со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может обладать одной или несколькими требуемыми

- 6 018509 характеристиками, которые отсутствуют в другом генотипе, или которые дополняют другой генотип. Если два исходных родителя не обеспечивают всех требуемых характеристик, то можно включить другие источники посредством осуществления большего количества скрещиваний. В каждом последующем дочернем поколении, от Е1 к Е2, от Е2 к Е3, от Е3 к Е4, от Е4 к Е5 и т.д., растения подвергают самоопылению для повышения гомозиготности линии. Как правило, в программе селекции используют пять или более поколений селекции и самоопыления для получения гомозиготного растения.

Селекцию педигри обычно используют для улучшения самоопыляющихся сельскохозяйственных культур. Два родителя, которые обладают подходящими, взаимодополняющими признаками, скрещивают для получения Е1. Популяцию Е2 получают посредством самоопыления одного или нескольких Е1 или посредством родственного опыления двух Е1. Селекцию лучших индивидуумов можно начинать в популяции Е2; затем, начиная в Е3, отбирают лучшие индивидуумы в лучших семействах. Повторное тестирование семейств можно начинать в поколении Е4 для улучшения эффективности селекции признаков с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. Еб и Е7) лучшие линии или смеси фенотипически аналогичных линий тестируют на потенциальное получение в качестве новых сортов.

Селекцию с возвратным скрещиванием используют для переноса генов для легко наследуемых, очень хорошо наследуемых признаков от родителя-донора в требуемый оптимально гомозиготный сорт, который используют в качестве рекуррентного родителя. Источник признаков, которые подвергают переносу, называют родителем-донором. После начального скрещивания отбирают индивидуумы, обладающие требуемым признаком или признаками родителя-донора, и затем повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Полученное растение, как ожидают, обладает признаками рекуррентного родителя плюс требуемый признак или признаки, перенесенные от родителя-донора. Этот способ широко используют для селекции устойчивых к заболеванию сортов.

Каждая программа селекции канолы должна включать периодическую, объективную оценку эффективности процедуры селекции. Критерии оценки варьируют в зависимости от цели и требований, но должны включать выгоду от селекции за год на основе сравнений с подходящим стандартом, общую величину перспективных селекционных линий и количество успешных сортов, полученных на единицу затрат (например, за год, на потраченный доллар и т.д.).

Различные способы рекуррентной селекции используют для улучшения количественно наследуемых признаков, контролируемых многими генами. Использование рекуррентной селекции в самоопыляющихся сельскохозяйственных культурах зависит от простоты опыления и количества гибридного потомства из каждого успешного скрещивания.

Массовую селекцию и рекуррентную селекцию можно использовать для улучшения популяций или само- или перекрестно опыляющихся сельскохозяйственных культур. Генетически вариабельную популяцию гетерозиготных индивидуумов или идентифицируют, или получают с помощью перекрестного скрещивания нескольких разных родителей. Лучшие растения отбирают на основе индивидуального преимущества, перспективного потомства или прекрасной скрещиваемости. Селектируемые растения перекрестно скрещивают для получения новой популяции, в которой продолжают осуществлять дополнительные циклы селекции.

Способ получения поколения одного семени в узком смысле относится к посадке расщепляющейся популяции, собиранию образца по одному семени с растения и использованию односемянного образца для посадки следующего поколения. Когда популяцию получают из Е2 до требуемого уровня инбридинга, тогда каждое из растений, из которых получены линии, будет приводить к разным индивидуумам Е2. Количество растений в популяции снижается с каждым поколением вследствие неспособности к прорастанию для некоторых семян или вследствие неспособности некоторых растений давать по меньшей мере одно семя. В результате не все растения Е2, исходно взятые в качестве образцов в популяции, будут представлены в виде потомства, когда получение поколения будет закончено.

В способе с использованием множества семян селекционеры канолы обычно собирают один или несколько стручков или длинных стручков с каждого растения в популяции и обмолачивают их вместе для образования массы семян. Часть массы используют для посадки следующего поколения и часть оставляют в запасе. Способ обозначают как модифицированное получение поколения одного семени или способ со смешиванием стручков.

Способ с множеством семян используют для уменьшения трудозатрат при сборе урожая. Значительно быстрее обмолачивать стручки машиной, чтобы затем взять по одному семени из каждого рукой для способа с одним семенем. Способ с использованием множества семян также делает возможным посадку одинакового количества семян из популяции каждого поколения инбридинга. Собирают достаточное количество семян для компенсации тех растений, которые не прорастают или не дают семян. При необходимости можно использовать удвоенный гаплоидный способ для выделения однородных линий, таким образом повышая обеспечение семенами с требуемым генотипом.

Молекулярные маркеры, включающие способы, такие как электрофорез изоферментов, полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов (КЕТР), случайным образом амплифицируемые полиморфные ДНК (КАРИ), полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами (АР-РСК), фингерпринтинг амплифицированной ДНК (ИАЕ), амплифицированные области с охарактеризованной последовательно

- 7 018509 стью (8САК), полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ЛЕЬР), простые повторяющиеся последовательности (88К) и полиморфизмы одиночных нуклеотидов (8ΝΡ), можно использовать в способах селекции растений. Одно из применений молекулярных маркеров состоит в картировании локусов количественных признаков (ОТЬ). Картирование ОТб представляет собой применение маркеров, которые, как известно, тесно связаны с аллелями, которые обладают измеримыми эффектами на количественный признак. Селекция в процедуре выведения основана на накоплении маркеров, связанных с аллелями, обладающими положительным эффектом, и/или элиминацией маркеров, связанных с аллелями, обладающими отрицательным эффектом, из генома растений.

Молекулярные маркеры можно также использовать в ходе процедуры селекции для селекции качественных признаков. Например, маркеры, тесно связанные с аллелями, или маркеры, содержащие последовательности в пределах фактически интересующих аллелей, можно использовать для селекции растений, которые содержат интересующие аллели, в ходе программы селекции с помощью возвратного скрещивания. Маркеры можно также использовать для отбора генома рекуррентного родителя и против маркеров родителя-донора. С использованием этого способа можно минимизировать количество генома родителя-донора, которое остается в селектируемых растениях. Его также можно использовать для уменьшения количества возвратных скрещиваний с рекуррентным родителем, необходимых для программы возвратного скрещивания. Использование молекулярных маркеров в процедуре селекции часто называют селекцией, усиленной генетическими маркерами, или маркер-вспомогательной селекцией (МА8).

Получение удвоенных гаплоидов (8\гапкоп е! а1., 1987) можно также использовать для получения инбредных растений в программе селекции. После осуществления скрещивания можно использовать способы с получением удвоенных гаплоидов для быстрого получения гомозиготного растения. У Вгак81са парик используют способ культивирования микроспор для получения гаплоидных эмбрионов. Гаплоидные эмбрионы затем регенерируют в подходящих средах в виде гаплоидных проростков, удваивание хромосом которых приводит к удвоенным гаплоидным растениям. Это может обладать преимуществами вследствие того, что из процедуры исключают поколения с самоопылением, необходимые для получения гомозиготного растения из гетерозиготного источника.

Система контроля опыления и эффективный перенос пыльцы от одного родителя к другому обеспечивают улучшенную селекцию растений и эффективный способ получения семян и растений гибридов канолы. Например, система цитоплазматической мужской стерильности Одига (стк), разработанная с помощью слияния протопластов редьки (Карбапик кабчик) и рапса (Втаккюа парик), представляет собой один из наиболее часто используемых способов получения гибридов. Она дает стабильную экспрессию признака мужской стерильности (Одига, 1986; Ребебет е! а1., 1983) и эффективный ядерный генвосстановитель (РеПап-Эопгте е! а1., 1988).

При разработке улучшенных новых гибридных сортов Втаккюа селекционеры используют самонесовместимые (81), обладающие цитоплазматической мужской стерильностью (СМ8) и ядерной мужской стерильностью (ΝΜ8) растения Втаккюа в качестве женского родителя. При использовании этих растений селекционеры пытаются улучшить эффективность получения семян и качество гибридов Е1 и уменьшить затраты на селекцию. Когда гибридизацию проводят без использования растений 81, СМ8 или ΝΜ8, то более трудно получить и выделить требуемые признаки в потомстве (поколение Е1) вследствие того, что родители могут подвергаться как перекрестному опылению, так и самоопылению. Если один из родителей является растением 81, СМ8 или ΝΜ8, то оно неспособно производить пыльцу, будет происходить только перекрестное опыление. При удалении пыльцы одного из родительских сортов при скрещивании селекционер растений уверен в получении гибридных семян однородного качества при условии, что родители обладают однородным качеством, и селекционер осуществляет одиночное скрещивание.

В одном из случаев получение гибридов Е1 включает скрещивание женского родителя СМ8 Вгакк1са с продуцирующим пыльцу мужским родителем Втаккюа. Для эффективного воспроизведения, однако, мужской родитель гибрида Е1 должен обладать геном восстановления фертильности (ген КГ). Наличие гена КГ означает, что поколение Е1 не будет полностью или частично стерильным так, что может происходить или самоопыление или перекрестное опыление. Самоопыление поколения Е1 для получения нескольких последующих поколений важно, чтобы гарантировать, что требуемый признак наследуется и стабилен и что выделен новый сорт.

Примером растения Втаккюа, которое обладает цитоплазматической мужской стерильностью и его используют для селекции, является растение с цитоплазматической мужской стерильностью Одига (ОСИ) (К. Ре11ап-Эе1опгте е! а1., 1987). Восстановитель фертильности для растений с цитоплазматической мужской стерильностью Одига перенесен от Карбапик кабчик (редька) к Втаккюа в 1пкб1. №Шопа1 бе Кесйегсбе Лдпсо1е (ΙΝΚΑ) в Кеппек, Франция (Ребебет е! а1., 1987). Ген-восстановитель КП. происходящий из редьки, описан в УО 92/05251 и в Эе1оигте е! а1. (1991). Разработаны улучшенные версии этого восстановителя. Например, см. УО 98/27806 для масличных культур Втаккюа, содержащих улучшенный ген-восстановитель фертильности для цитоплазматической мужской стерильности Одига, который приведен здесь в качестве ссылки.

- 8 018509

Другие источники и усовершенствования стерильности СМ8 у канолы включают растение с цитоплазматической мужской стерильностью Ройта, а также те, которые описаны в патенте США 5789566, последовательность ДНК, сообщающая цитоплазматическую мужскую стерильность, митохондриальный геном, ядерный геном, митохондрии и растение, содержащие указанную последовательность и способ получения гибридов; патенте США 5973233, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; и кО 97/02737, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; патентной заявке ЕР 0599042А, способы введения гена-восстановителя фертильности и получения посредством этого гибридов Е1 растений Вга881са; патенте США 6229072, система получения цитоплазматической мужской стерильности в гибридах канолы; патенте США 4658085, гибридизация с использованием цитоплазматической мужской стерильности, цитоплазматической устойчивости к гербицидам и устойчивости к гербицидам из ядерных генов; все из которых приведены здесь.

Многообещающие перспективные селекционные линии обычно тестируют и сравнивают с подходящими стандартами в окружающей среде, представляющей коммерческую целевую область(и). Лучшие линии являются кандидатами для новых коммерческих линий; и те, которые все еще лишены некоторых из признаков, можно использовать в качестве родителей для получения новых популяций для дальнейшей селекции.

Для большинства признаков истинная генотипическая ценность может маскироваться другими привходящими признаками растения или факторами окружающей среды. Один из способов идентификации лучшего растения состоит в исследовании его характеристик по сравнению с другими экспериментальными растениями и с одной или несколькими широко выращиваемыми стандартными линиями. Если одиночное исследование неубедительно, то повторные исследования обеспечивают лучшую оценку генетической ценности.

Селекционер использует различные способы для облегчения определения того, какие растения следует отбирать из расщепляющихся популяций и, в конечном итоге того, какие линии будут использовать с коммерческими целями. В дополнение к знанию зародышевой плазмы и другим навыкам, которые использует селекционер, часть процедуры селекции зависит от планирования эксперимента в сочетании с использованием статистического анализа. Планирование эксперимента и статистический анализ используют для облегчения определения того, какие растения, какие семейства растений и, наконец, какие линии значимо лучше или отличаются по одному или нескольким интересующим признакам. Способы планирования эксперимента используют для контролирования ошибки так, что различия между двумя линиями можно определить более точно. Статистический анализ включает вычисление средних величин, определение статистической значимости источников вариации и вычисление подходящих компонентов вариации. Значимость на уровне пяти и одного процентов, как правило, используют для определения того, является ли отличие, которое существует для данного признака, действительным, или оно возникает вследствие воздействия окружающей среды или экспериментальной ошибки.

Надлежащее тестирование должно детектировать любые основные ошибки и устанавливать уровень преимущества или улучшения по сравнению с существующими линиями. В дополнение к обладанию лучшими характеристиками, должна существовать потребность в новой линии, которая совместима с промышленными стандартами или которая создает новый рынок. Внедрение новой линии, как правило, будет приводить к дополнительным затратам для производителя семян, фермера, обрабатывающего предприятия и потребителя, на специальную рекламу и маркетинг, изменение способов получения семян и коммерческого производства, и использование нового продукта. Тестирование, предшествующее выпуску в продажу новой линии, должно учитывать исследовательские затраты и затраты на разработку, а также техническое преимущество конечной линии. Для линий, размножающихся семенами, получение семян должно быть осуществимо без труда и экономично. Предпочтительно, остаточная гетерозиготность не должна превышать 5%.

Эти стадии, которые приводят к последней стадии маркетинга и распределения, как правило, занимают приблизительно от шести до двенадцати лет от времени осуществления первого скрещивания. Таким образом, разработка новых линий, таких как линии по настоящему изобретению, является продолжительным по времени процессом, который требует точного перспективного планирования, эффективного использования ресурсов и минимальных изменений в направлении. Следовательно, необходимо значительное техническое вмешательство человека.

Более того, как результат развития систем стерильности, получены линии, которые можно использовать в качестве сорта с открытым опылением (т.е. сорта чистой линии, проданного фермеру для посадки) и/или в качестве стерильного инбредного растения (женского), используемого для получения семян гибрида Е1. В последнем случае, может потребоваться подходящая скрещиваемость с восстановителем (мужским). Полученные семена гибрида можно затем продавать фермеру для посадки.

Получение гибридных семян канолы можно достичь с использованием цитоплазматической мужской стерильности. При этом типе получения гибрида используют 3 инбредных линии: линию восстановителя, А-линию и В-линию. Линию восстановителя, также называемую Р-линией. используют в качестве мужского растения при получении гибридных семян. Линия восстановителя содержит доминантные ядерные гены, известные как гены-восстановители, которые отвечают за фертильность гибрида. Р-линию

- 9 018509 скрещивают с А-линией для получения гибридных семян Р1. А-линия обладает мужской стерильностью благодаря цитоплазме и благодаря невосстанавливающим аллелям в ядерном геноме. Вследствие того, что А-линия обладает мужской стерильностью, она не может самовоспроизводиться. Для получения Алинии разработана В-линия. В-линия, также называемая поддерживающей линией, является генетическим эквивалентом А-линии, за исключением того, что В-линия обладает нормальной цитоплазмой и обладает, таким образом, мужской фертильностью. А-линию опыляют с помощью В-линии. Семена, развивающиеся на растениях А-линии, собирают и их потомство скрещивают с В-линией для получения гибридных семян Р1.

Получение гибрида канолы по программе селекции растений канолы включает три стадии: (1) селекцию растений из различных пулов зародышевой плазмы для начальных селекционных скрещиваний; (2) самоопыление селектируемых растений из селекционных скрещиваний в течение нескольких поколений для получения серий инбредных линий, которые, хотя отличаются друг от друга, выводятся в чистоте и высокооднородны; и (3) скрещивание селектируемых инбредных линий с другими инбредными линиями для получения гибридов. В ходе процесса инбридинга у канолы жизнеспособность линий снижается. Жизнеспособность восстанавливается, когда две разные инбредные линии скрещивают для получения гибрида. Важное следствие гомозиготности и гомогенности инбредных линий состоит в том, что гибрид между определенной парой инбредных растений всегда будет одинаковым. Как только идентифицировали инбредные растения, которые дают лучший гибрид, гибридные семена можно воспроизводить неопределенное количество времени при условии поддержания гомогенности инбредных родителей.

Скрещиваемость линии, а также характеристики линии как таковой, являются фактором в селекции улучшенных линий канолы, которые можно использовать в качестве инбредных. Скрещиваемость обозначает вклад линии в качестве родителя при скрещивании с другими линиями для образования гибридов. Гибриды, получаемые с целью отбора лучших линий, обозначают как аналитические скрещивания. Один из способов измерения скрещиваемости осуществляют с использованием селекционных показателей. Селекционные показатели основаны на суммарном среднем значении количества аналитических скрещиваний. Это среднее значение затем поправляют для исключения эффектов окружающей среды и поправляют на известные генетические взаимоотношения между линиями.

Получение гибридных семян требует инактивации пыльцы, произведенной женским родителем. Неполная инактивация пыльцы дает возможность самоопыления. Эти семена, возникшие путем случайного самоопыления, можно непреднамеренно собрать и упаковать с гибридными семенами. Аналогично, вследствие того, что мужского родителя выращивают рядом с женским родителем в поле, существует также вероятность того, что семя, возникшее путем самоопыления мужского растения, можно непреднамеренно собрать и упаковать с гибридными семенами. После посадки семян из гибридной тары возможно идентифицировать и селектировать эти растения, возникшие путем самоопыления. Эти растения, возникшие путем самоопыления, будут генетически эквивалентны одной из инбредных линий, используемых для получения гибрида. Хотя существует возможность попадания инбредных семян в тару с гибридными семенами, событие является редким вследствие того, что уделяют большое внимание, чтобы избежать таких попаданий. Эти растения, возникшие путем самоопыления, может идентифицировать и селектировать специалист в данной области, или с помощью визуальных или молекулярных способов.

Растения канолы Вгакыса парик без какой-либо системы мужской стерильности или самонесовместимости, как показано, обычно являются самофертильными с приблизительно 70-90% нормально образующихся семян в результате самоопыления. Процентную долю перекрестного опыления можно дополнительно увеличить, если популяции общепризнанных насекомых-опылителей в данном участке выращивания обладают большей численностью. Таким образом, открытое опыление часто используют для коммерческого получения канолы.

III. Определения.

Единицы, приставки и символы можно обозначать в принятой для них форме СИ.

Подходящий контроль, как применяют здесь, означает генотип Вгаккюа, который обеспечивает основу для оценки устойчивости к 8с1егойша для экспериментальной линии. Подходящий контроль выращивают в тех же условиях окружающей среды, включая воздействие заболевания, как экспериментальную линию, и он обладает приблизительно той же степенью зрелости, как экспериментальная линия. Например, для яровой канолы ожидают, что подходящий контроль созревает в пределах ±10 суток, обычно ±5 суток для экспериментальной линии. Стандарты степени зрелости хорошо известны специалисту в данной области. Подходящий контроль обычно представляет собой широкодоступный или широко выращиваемый сорт. Термин подходящий контроль может фактически отражать множество подходящих сортов. Например, для яровых генотипов канолы каждый из сортов Рюпеег Ηί-Вгей 46А76 и 46А65 является подходящим контролем; средние характеристики для двух сортов являются также подходящим контролем. Для озимых генотипов канолы каждая из общедоступных линий Со1итЬик и Ехргекк является подходящим контролем, а также средние характеристики для двух сортов.

Термин канола означает растение Вгакыса, где масло должно содержать менее чем 2% эруковой

- 10 018509 кислоты, и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4-пентенилглюкозинолата, 2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на 1 г высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества.

Термин скрещиваемый или скрещивание в контексте данного изобретения означает слияние гамет посредством опыления для получения потомства (т.е. клеток, семян или растений). Термин относится как к половому скрещиванию (опыление одного растения другим), так и к самоопылению (самоопыление, т.е. когда пыльца и яйцеклетка происходят из одного и того же растения).

Термин нормальная влагоемкость означает, что верхние 4 дюйма почвы, или приблизительно верхние 4 дюйма почвы, полностью насыщены влагой, но без стоячей воды или с небольшим ее количеством.

Термин устойчивость в полевых условиях означает устойчивость, измеренную в полевых условиях. Он отражает устойчивость целого растения или популяции растений при воздействии вредителя или патогена в естественных полевых условиях. Устойчивость в полевых условиях можно измерять на всех стадиях развития растения и можно выразить в терминах эффекта на собранный урожай, или она может отражать целенаправленную оценку в ходе стадии роста, когда растение наиболее подвержено развитию заболевания.

Термин генетически сцепленный (связанный) относится к генетическим локусам, которые находятся в неравновесии по сцеплению и, как статистически выявлено, не распределяются независимым образом. Генетически сцепленные локусы распределяются зависимым образом от 51 до 99% случаев или выражаются любой целочисленной величиной между этими значениями, предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99%.

Термин инбредный, как применяют здесь, относится к гомозиготному растению или коллекции гомозиготных растений. Рядовым специалистам станет понятно, что у инбредных растений может существовать некоторая остаточная гетерозиготность.

Термин интрогрессия относится к введению требуемого генетического локуса в, по меньшей мере, одно потомство растения посредством полового скрещивания между родительскими растениями, и где, по меньшей мере, одно из родительских растений обладает требуемым генетическим локусом в своем геноме.

Термин частичная устойчивость листьев означает степень устойчивости листьев к 8с1егойи1а по сравнению с реакцией листьев на подверженном растении. При наличии частичной устойчивости листьев заболевание развивается более медленно на растении или в меньшей степени по сравнению с подверженным растением.

Термин маркер или молекулярный маркер относится к генетическому локусу, используемому в качестве контрольной точки при идентификации генетически сцепленных локусов, таких как ОТЙ (локусы количественных признаков). Термин также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, комплементарных геномным последовательностям, таких как нуклеиновые кислоты, используемые в качестве зондов.

Термин частичная устойчивость стебля или устойчивость стебля означает неполную устойчивость стебля. Он обозначает степень устойчивости стебля к 8с1егойша по сравнению с реакцией стебля у подверженного растения. При частичной устойчивости стебля заболевание развивается более медленно на растении или в меньшей степени по сравнению с подверженным растением. Однако в случае растения, которое обладает частичной устойчивостью стебля, растение заболевает (по сравнению с полной устойчивостью).

Термин полная устойчивость означает устойчивую реакцию, при которой развитие аспекта заболевания, обычно проявление симптома или размножение патогена, полностью прекращается (по сравнению с частичной устойчивостью).

Термин рекуррентная селекция означает систему селекции с целью повышения частоты подходящих генов количественно наследуемой характеристики посредством повторной гибридизации и циклов селекции.

Термин степень зрелости или сутки до достижения зрелости означает количество суток от посадки семян до сбора урожая. Степень зрелости будет значительно варьировать между генотипами и внутри них, в зависимости от места, сезона выращивания и даты посадки семян.

Термин популяция, как применяют здесь, означает внутриселекционную группу растений или группу индивидуумов, которые обладают общим пулом генов. Популяция может являться гомогенной (генетически однородной), такой как популяция Р1, полученная скрещиванием гомозиготных родителей; или генетически различной, такой как расщепляющееся потомство популяции, полученной самоопылением гетерозиготного растения или скрещиванием гетерозиготных родителей. Более того, гомогенную популяцию можно подвергнуть селекции, чтобы получить гомозиготность почти по всем генным локусам и получить однородную популяцию потомства настоящей чистой линии.

Термин селекция популяции относится к улучшению популяции, осуществляемому посредством селекции с использованием индивидуумов из той же самой популяции в качестве родителей. Селекция

- 11 018509 популяции может означать осуществление рекуррентной селекции в пределах популяции.

Термин яровая Вгакыса или яровая канола означает растение Вгакыса, которое не нуждается в яровизации.

Термин морфология, способствующая инфекции 8с1его1ш1а или фенотип, способствующий инфекции 8с1егойша означает фенотип Вгакыса, при котором инфекция 8с1егойп1а может возникнуть и развиться более легко по сравнению с фенотипом Вгакыса, который менее подвержен инфекции 8с1егойша. Например, морфология, способствующая инфекции 8с1егойп1а, может включать по меньшей мере один из следующих морфологических признаков: густое ветвление, низкое ветвление, увеличенная продолжительность цветения, высокая сохранность лепестков, высокая степень сохранности листьев и предрасположенность полеганию или нагибанию. Эти морфологические признаки являются хорошим источником начальной инокуляции с лепестков и повышению влажности в окружении растения. В противоположность этому, растения, обладающие морфологическими признаками, которые менее способствуют инфекции 8с1егойп1а, могут включать по меньшей мере один из следующих признаков: низкая сохранность лепестков, безлепестковый фенотип, хорошая устойчивость к полеганию, менее компактное ветвление, высокое ветвление и раннее опадение листьев. Эти морфологические признаки снижают инокуляцию с лепестков, а также уровень влажности в окружении растения.

Термин распространенность заболевания означает количество растений в выборке, пораженных заболеванием. Его, как правило, представляют в виде процентной доли растений, пораженных заболеванием, по отношению к суммарному количеству растений в выборке.

Термин 88ΌΙ% означает процентную долю распространенности заболевания, вызванного 8с1егойша 8с1егойогит, и ее измеряют как процентную долю растений в популяции, инфицированных 8с1егойша 8с1его1югит.

Термин 88ΌΙ означает ранжирование от 1 до 9 и измерение распространенности заболевания, вызванного 8с1егойп1а 8с1егойогит, при контролируемом экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях, как описано в примере 7 и табл. 4. Посредством 88ΌΙ измеряют процентную долю растений в популяции, которые инфицированы 8с1егойша 5с1его11огит, по сравнению с подходящим контрольным сортом. Для яровой канолы подходящий контроль представляет собой Рюпеег Ηί-Вгеб, сорт 46А76, и/или Рюпеег Ηί-Вгеб, сорт 46А65. Для озимой канолы подходящий контроль представляет собой Со1нтЬн5 и/или Ехргекк. Например, для яровой канолы 5 рядов тестируемых линий засевают между одним рядом Рюпеег Ηί-Вгеб, сорт 46А76, с одной стороны и Рюпеег Ηί-Вгеб, сорт 46А65, с другой. Как правило, в экстремальных условиях для заболевания Рюпеег Ηί-Вгеб сорта 46А76 обладает распространенностью заболевания 60% (88ΌΙ%), и 46А65 обладает распространенностью заболевания 70% (88ΌΙ%), со средним значением 65% (88ΌΙ%). Если на каком-либо конкретном опытном участке среднее значение 88ΌΙ% для Рюпеег Ηί-Вгеб сорта 46А65 и Рюпеег Ηί-Вгеб сорта 46А76 не составляет 65%, показатели для Рюпеег Ηί-Вгеб сорта 46А65 и Рюпеег Ηί-Вгеб сорта 46А76 следует умножить на фактор, чтобы довести их среднего значения 65%. Показатели для тестируемых линий также следует умножить на этот фактор. Затем следует произвести ранжирование линий, которое соответствует 88ΌΙ%, как представлено в табл. 4. Например, если среднее значение для контролей составляет 70%, следует использовать фактор 65/70 для снижения процентной доли распространенности заболевания, измеренной для экспериментальных линий, растущих между контролями, вследствие превышения планируемого воздействия заболевания. Наоборот, если среднее значение составляет 60%, следует использовать фактор 65/60 для соответствующего увеличения (коррекции) 88ΌΙ% для экспериментальных линий вследствие снижения воздействия заболевания по сравнению с планируемым. Хотя планируемая распространенность заболевания составляет 65%, ожидается отклонение от планируемой распространенности вследствие большой выборки растений, изменений окружающей среды и изменений инокулята, таким образом, коррекции посредством контролей позволяют сравнивать линии внутри участка и предотвращают неправильную классификацию реакции в полевых условиях. Экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях, как описано в примере 7, широко использовали для получения устойчивых к 8с1егойп1а линий по изобретению, так как условия, подходящие для 8с1егойша, не возникают в природе предсказуемым образом. Таким образом, пытаясь ускорить селекцию и обеспечить воспроизводимые условия, использовали экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях.

Ранжирование по 88ΌΙ для испытаний после коррекции на распространенность дополнительно корректируют, принимая в расчет тяжесть заболевания. Таким образом, после коррекции 88ΌΙ%, как объяснено выше, коррекции 88Ό8 также осуществлены. Среднее значение 88Ό8 у инфицированных растений для контролей (показатели 1-8) сравнивают со значением для экспериментальных образцов. Если среднее значение показателя 88Ό8 лучше у экспериментальной линии (например, ранг 3 для контролей по сравнению с 4 для экспериментальной линии), то 88ΌΙ% корректируют умножением на 3/4. Например, если 88ΌΙ% экспериментальной линии составлял 20%, 3/4 умножали на 20% = 15%. Это соответствует рангу 7,5 на шкале 88ΌΙ. Наоборот, если 88Ό8 для экспериментальных образцов составлял 2 (более пораженные) против 3 для контролей, то 88ΌΙ% следует умножить на 3/2. Например, если 88ΌΙ% составлял 20%, то при умножении на 3/2 должен равняться 30%. Это соответствует рангу 6,0 на шкале 88ΌΙ.

- 12 018509

Термин экстремальное воздействие заболевания в экспериментальных полевых условиях означает контролируемые условия для исследования заболевания, как описано в примере 7. Например, экстремальное воздействие заболевания получают путем применения семян масличного нуга в виде носителя, мимикрирующего колонизированные 8с1егойша лепестки. Природный инокулят может присутствовать в поле в виде резервного инокулята. Процент распространенности заболевания тестируемых растений корректируют на используемые контроли, как описано выше, и представляют в виде показателя 88ΌΙ от 1 до 9. Однако в этих экстремальных условиях растения более подвержены инфицированию 8с1егойша, по меньшей мере, по следующим причинам: (1) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях растения подвержены воздействию влажности, обусловленной мелкокапельным орошением, которое способствует развитию 8с1егойша, (2) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях растения находятся в полузакрытой окружающей среде благодаря искусственному навесу, который обеспечивает условия постоянной влажности, благоприятные для развития 8с1егойша, и (3) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях используют шесть рядов разных тестируемых растений на каждом участке, таким образом, любой ряд тестируемых растений, обладающих специфическим морфологическим фенотипом, может находиться в окружении двух разных рядов растений с другими морфологическими фенотипами. Следовательно, любые преимущества морфологического фенотипа, который менее подвержен инфекции 8с1егойша (например, высокое ветвление), снижаются вследствие того, что каждый ряд может быть окружен растениями, обладающими другим морфологическим фенотипом (например, низкое ветвление). Наоборот, растение, растущее в естественных полевых условиях (1) не находится под искусственным навесом, который обеспечивает постоянную влажность, и (2) его выращивают на участках в окружении растений с таким же морфологическим фенотипом, которое обеспечивает выявление всех преимуществ морфологии.

Следовательно, отобранные растения, обладающие морфологией, которая менее подвержена инфицированию 8с1его11Н1а. например высоким ветвлением, функционируют значительно лучше в естественных полевых условиях по сравнению с экстремальным воздействием заболевания в экспериментальных полевых условиях.

Термин естественные полевые условия для заболевания означает условия на участках для получения урожая на орошаемых или неорошаемых полях. Инфицирование происходит посредством лепестков, колонизированных мицелием. Участки для получения урожая дают пример популяции растений, который отражает естественные условия, аналогичные полям фермеров. 88ΌΙ% используют для выражения процентной доли инфицированных растений при повторных испытаниях. В дополнение к 88ΌΙ%, можно собирать данные по индивидуальным растениям для отражения тяжести (88Ό8) на разных шкалах (шкала 1-9 для Рюиеег и общепринятая шкала 0-5). Можно также оценивать другие параметры, которые дополнительно количественно определяют воздействие заболевания, например, тяжесть заболевания 8с1егойша кс1его1югиш в поле (88Р8), как описано ниже и представлено в табл. 2. 88Р8 может являться информативным в особенности при высоком воздействии заболевания в естественных полевых условиях.

Термин тяжесть заболевания означает степень повреждения растения вследствие инфекции патогеном. В данном изобретении применяют две шкалы для измерения тяжести заболевания. Первая представляет собой шкалу для Рюиеег Ηί-Вгеб от 1 до 9. Вторая представляет собой шкалу, используемую исследователями в государственных учреждениях, и ее обозначают как общепринятая шкала 0-5. Обе описаны в табл. 15. Некоторые примеры их использования представлены в табл. 2.

Термин 88Ό8 означает тяжесть заболевания 8с1его11ша кс1егобогиш и представляет собой измерение степени развития заболевания у инфицированного растения. Например, посредством него проводят различия между растениями с незначительными симптомами и мертвыми растениями. Для целей данного изобретения используют две шкалы ранжирования: (1) шкалу ранжирования 88Ό8 для Рюиеег от 1 до 9 и описанную в табл. 15; и (2) общепринятую научную шкалу, изменяющуюся от 0 до 5 и описанную в примечании к табл. 2.

Термин 88Р8 означает тяжесть заболевания 8с1егойша кс1его1югиш в поле и представляет собой измерение произведения распространенности заболевания (88ΌΙ%) и степени, до которой инфицированные растения заболевают в естественных полевых условиях (88Ό8). Он является мерой поражения грибом в поле и может являться более информативным при высоком воздействии заболевания, т.е. когда распространенность заболевания в поле становится значительной. Его вычисляют умножением 88ΌΙ% на тяжесть заболевания и делением на 5, где тяжесть заболевания варьирует от 0 до 5, где 0 означает отсутствие инфекции, и 5 означает мертвое растение, как описано в табл. 2.

Термин локус количественного признака или ОТБ относится к расщепляющимся генетическим факторам, которые влияют на вариабельность экспрессии фенотипического признака.

- 13 018509

Таблица 2

Параметры 88ΩΙ% и 88Ό8 для собранной в поле 8с1етойша и их взаимоотношение с выведенными параметрами 88ΌΙ (исследовательские данные) и 88Е8 (природные данные)

Признак	33ϋΙ% Распростра- ненность заболевания	55ϋ5 Тяжесть заболевания у пораженных растений	5301 Основан на скорректированном 3301% при экстремальном воздействии заболевания в э ксперимен тальных полевых условиях	88 Е8 Тяжесть заболевания в поле на основе как 8501%, так и 5505, используют в естественных полевых условиях
Шкала	0-100%	Шкала 3503 для Рхопеег 1 = мертвое 9 = отсутствие заболевания Общепринятая шкала 0 = отсутствие заболевания 5 = мертвое растение	1-9 Преобразование 3301% и поправка на контроля	0-100% % поражения в поле количественное определение повреждения в поле безотносительно к воздействию заболевания
Исполь зование	Общее	Общее	Только для Ртопеег	Общее
Поправки	Нет данных	Нет данных	Поправка на контроли	Без поправки
Примеры: разные сочетания распространенности заболевания и тяжести заболевания		Шкала 3508 для Рьопеег	Общеприня- тая шкала
Пример 1	80	1	5, 0	1,0 (90)	80
Пример 2	80	5	2,0	2,6 (64)	32
Пример 3	50	5	2,00	5,0 (40)	20
Пример 4	30	7	1,0	7,3 (17)	6
Пример 5	10	8	1,0	8,5 (5)	2

88ΌΙ% представляет собой процентную долю растений в популяции, инфицированных 8с1етойша.

88Ό8 представляет собой ранжирование степени развития заболевания у пораженного растения. В изобретении используют две шкалы. Шкала 88Ό8 для Рюиеет изменяется от 1 (мертвое растение) до 9 (отсутствие заболевания) и общепринятая шкала изменяется от 0 (отсутствие заболевание) до 5 (мертвое растение). Для подробностей шкалы 88Ό8 для Рюиеет см. табл. 15. Общепринятая шкала представлена, как указано далее:

= отсутствие заболевания;

= поверхностные повреждения или поражение мелких ветвей;

= омертвение крупных ветвей;

= главный стебель окольцован, по меньшей мере, на 50%;

= главный стебель окольцован, но растение дает хорошие семена;

= главный стебель окольцован, значительное снижение урожайности.

88ΌΙ представляет собой ранжирование от 1 до 9, как описано в табл. 4, и он скорректирован на 88ΌΙ% для контрольных сортов 46А65 и/или 46А76 для яровой канолы, и контрольных сортов Ехртекк и/или Со1итЬи8 для озимой канолы. Это ранжирование используют только при контролируемом экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Его вычисляют умножением наблюдаемого 88ΌΙ% на фактор X, где фактор X является фактором, который доводит среднее значение 88ΌΙ% для подходящих контролей до 65%. Коррекцию на тяжесть осуществляют после коррекции на распространенность. 88ΌΙ затем вычисляют согласно шкале в табл. 4. Для примеров 1-5 допущения состоят в том, что среднее значение 88ΌΙ% для контролей = 65% и среднее значение 88Ό8 для контролей = 4 для вычисления величин 88ΌΙ.

88Е8 является мерой как распространенности заболевания, так и тяжести при естественном воздействии заболевания в поле. Его вычисляют, как указано далее:

55Г5=[3301%х8305(шкала 0-5)1+5.

Ιν. Примеры.

Стеблевая гниль, вызванная 8с1егоДша, развивается у канолы посредством колонизированных лепестков в условиях повышенной влажности при цветении. Опавшие лепестки позволяют 8с1егоДша инфицировать листья канолы, направляя ее в сторону стеблей. Гриб вызывает обусловленную 8с1етойша стеблевую гниль. Растение преждевременно умирает, что приводит к потере урожая приблизительно на 50%.

Канола подвержена вызываемой 8с1егоДша стеблевой гнили. В годы с периодами повышенной влажности ущерб для канолы может являться очень значительным. Для уменьшения или предотвраще

- 14 018509 ния этого ущерба фермеры, как правило, используют одну или две обработки фунгицидом в зависимости от продолжительности влажного периода.

Пример 1. Определение характеристик контролей канолы при низком, умеренном, высоком, очень высоком и экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях.

Методы и материалы.

В попытке определить уровень толерантности к 8с1ето!1ша у доступных в настоящее время сортов яровой канолы в условиях низкой, умеренной, высокой и очень высокой заболеваемости 8с1етойша, получали данные в естественных полевых условиях в течение многих лет, включая общедоступные участки для получения урожая. Данные суммированы в табл. 3. Данные для 44А89 и 46А65 получены из испытания в естественных условиях в пяти повторностях в Миннесоте в 2001 (1итке апй Ретпапйо, 2003). Данные для Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А76, являются оценкой на основании реакции аналогичных образцов в том же самом испытании в Миннесоте, а также данных по Северной Дакоте в 2003. Данные по характеристикам контролей канолы в условиях экстремального воздействия заболевания получены в этом исследовании.

Озимые линии канолы Со1итЬик и Ехргекк включали в исследовательские испытания при экстремальном воздействии заболевания в качестве текущих контролей. Как показано в табл. 4 и 10с, они являются подверженными или умеренно подверженными линиями.

Экстремальные условия заболевания являются редкими, но они могут возникать, и целью являлся скрининг линий в таких условиях. Экстремальное воздействие заболевания возникает при наличии 20-30 суток постоянной влажности и температур в среднем от 20 до 25°С. Растения, инфицируемые 8с1ето!1ша в экстремальных условиях, обычно нуждаются в двух обработках фунгицидом для сопротивления заболеванию. В среднем, фунгициды обеспечивают 10-14 суток защиты на обработку. Скрининг отобранных растений в экстремальных условиях гарантирует, что отобранные растения смогут сопротивляться обычному воздействию заболевания.

Вследствие того, что экстремальные условия для заболевания в природе возникают редко, создали в поле искусственные экстремальные условия, как описано в примере 7. Они включали искусственный инокулят в форме колонизированных 8с1етойша семян масличного нуга, использование орошения и использование сетчатого покрытия для поддержания влажной окружающей среды. Тестировали сорта Рюпеег Ηί-Втей 44А89, 46А65 и 46А76. Наименее подверженные 46А65 и 46А76 использовали в качестве текущих контролей для отслеживания уровней заболевания и определения характеристик (88ΌΙ).

В попытке определить эффект опрыскивания фунгицидом на инфицированных 8с1етойша полях собирали и суммировали данные с участков для получения урожая в естественных полевых условиях с инокулятом и опрыскиванием фунгицидом ланс™ в течение 30% периода цветения.

Результаты.

В табл. 3 представлены характеристики контролей яровой канолы в разных условиях. Главной целью являлся скрининг на распространенность заболевания (т.е. процентную долю растений, инфицированных 8с1етойша).

Предыдущие данные в полевых условиях указывали, что типичное умеренное или высокое воздействие заболевания в поле приводит к 20-50% распространенности заболевания для 46А65 и 10-40% распространенности заболевания для 46А76 (табл. 3).

Однако в экстремальных условиях, как показано в табл. 3, процентная доля распространенности заболевания для Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А65, составляет приблизительно 70%, и процентная доля распространенности заболевания для Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А76, составляет 60%. Если погода становится неподходящей для инфекции 8с1ето!1ша, то контроли канолы менее поражены, и распространенность заболевания у частично устойчивых растений пропорционально минимизирована или ликвидирована. Так как для большинства ситуаций в полевых условиях воздействие заболевания меньше экстремального, контроли и селектируемые линии, как правило, будут менее поражены, чем представлено в табл. 4.

Скрининг на распространенность заболевания при экстремальном воздействии заболевания и по сравнению с текущими контролями в каждом шестом ряду при мелкокапельном орошении также осуществляли, как описано в примере 7. Эти исследовательские данные по экстремальному воздействию заболевания в поле представлены в виде ранжирования 88ΌΙ от 1 до 9 в табл. 4. Как правило, 5 рядов тестируемых линий засевали между одним рядом Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А76, с одной стороны и одним рядом Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А65, с другой. В экстремальных условиях для заболевания Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А76, обладает распространенностью заболевания 60% (88ΌΙ%), и Рюпеет Ηί-Втей, сорт 46А65, обладает распространенностью заболевания 70% (88ΌΙ%), со средним значением 65% (88ΌΙ%). Если для любого конкретного опытного участка среднее значение 88ΌΙ% для Рюпеет Ηί-Втей сортов 46А65 и 46А76, не равнялось 65%, то показатели для Рюпеет Ηί-Втей сорта 46А65 и Рюпеет Ηί-Втей сорта 46А76 следует умножить на фактор, чтобы довести их до среднего значения 65%. Показатели для тестируемых линий также следует умножить на этот фактор. После осуществления коррекции тяжести заболевания, как описано в определении 88ΌΙ, следует произвести ранжирование линий, которое соответствует 88ΌΙ, как представлено в табл. 4.

- 15 018509

Таблица 3

Вариация реакции на 8с1егойша в естественных полевых условиях для доступной в настоящее время яровой канолы (88ΌΙ%)

	Воздействие заболевания
Категория	Сорт	Низкое	Умеренное	Высокое	Очень высокое	Экстремальное*
Очень подверженные	44А89	10-30	30-60	50-80	70-90	80-100
Подверженные	4 6А65	0-10	20-30	30-50	40-60	70
Умеренно подверженные	4 6А76	1-10	10-20	20-40	30-50	60
% случаев - поле**		40	30	20	8-9	1-2

* Экстремальное воздействие заболевания использовали для основного исследования и разработки, как описано в примере 7.

** Оценка частоты для каждого уровня инфицирования для полей фермеров в Западной Канаде, Северной Дакоте и Миннесоте.

Таблица 4 Измерение характеристик в полевых условиях при экстремальном воздействии заболевания (исследовательские испытания)

Ранжирование по 33ΟΙ**	Категория	Распространенность заболевания, 55ϋΙ%	Яровые контроли	Озимые контроли
1.0	Очень подверженные	>8 0	44А89, Иезбаг	РапРЬег
1.1-2.0	Подверженные	79-70	46А65=2	Со1итЬиз=2
2.1-3.0	Умеренно	69-60	46А76=3	Ехргезз=3
3.1-4.0	подверженные	59-50
4.1-5.0	Умеренно	49-40
5.1-6.0	устойчивые	39-30
6.1-7.0	Устойчивые	29-20
7.1-8.0	19-10
8.1-9.0	Высокоустойчивые	9-0

* 88ΌΙ%> = распространенность заболевания, вызванного 8с1егойша 8с1егоНогиш.

** 88ΌΙ = ранжирование распространенности заболевания, вызванного 8с1егоИша 8с1его1югит, скорректированное на распространенность и тяжесть заболевания для контролей 46А65/4 бА7б для яровой канолы и Ехрге88/Со1итЬи8 для озимой канолы при экстремальном воздействии заболевания (исследовательские испытания).

В табл. 5 показано, что обработки фунгицидом уменьшают воздействие 8с1егоЕша на Вгакыса, и их можно использовать в качестве непрямого измерения улучшений характеристик против 8с1егойша. В табл. 5 представлен эффект одной обработки фунгицидом на параллельных участках для получения урожая при естественном уровне инфекции в Мордене и Кармане, Манитоба, в 2004. Как видно из табл. 5, в условиях более низкого воздействия заболевания почти полное сдерживание 8с1егойша достигают при однократной обработке фунгицидом, за исключением сильно подверженных растений. Эффективность фунгицида на растениях с рангом 1 (Н8) ниже, чем эффективность фунгицида на растениях с рангом 2 или 3 (8 или М8).

- 1б 018509

Таблица 5

Инфекция 8с1егойша (88ΌΙ%) для опрыскиваемых* и неопрыскиваемых контролей на участках для получения урожая в естественных условиях в районах Мордена, Манитоба и Кармана, Манитоба, в 2004

Сорт	Категория	Морден	Карман	Среднее значение	Обработка фунгицидом
44А89	ИЗ	30,7	22,5	27	Без опрыскивания
44А89	нз	8, 0	19,5	14	С опрыскиванием
4 6А65	3	11,3	11,5	11	Без опрыскивания
46А65	3	0, 0	2,0	1	С опрыскиванием
46А76	из	11,3	9,5	10	Без опрыскивания
46А76	из	2,7	1,0	2	С опрыскиванием

* Ланс™ (боскалид) = зарегистрированный ΒΆ8Ρ фунгицид для борьбы со 8с1егойша.

Η8 = Очень подверженные.

= Подверженные.

Μ8 = Умеренно подверженные.

В табл. 6 представлены результаты испытаний в полевых условиях в Северной Дакоте/Миннесоте, проведенных в 2003.

Большинство в настоящее время коммерчески доступных сортов канолы обладают рангом 1 или 2, основываясь на ранжировании 88ΌΙ для Рюпеег от 1 до 9, как описано в табл. 2. Некоторые редкие сорта обладают рангом 3 и более эффективно защищены фунгицидами. Например, в табл. 6 показано, что Ηγо1а 357, обладающий рангом устойчивости к 8с1егойша приблизительно 2, обладал 69% распространенностью при испытаниях с использованием фунгицидов в Северной Дакоте. После обработки лучшим фунгицидом распространенность снижалась до 44%. В табл. 6 также показано, что Iπν^до^2663. обладающий рангом устойчивости к 8с1егойша от 1 до 2, обладал 22,3% распространенностью при испытании в Миннесоте, где воздействие заболевания являлось низким. После обработки фунгицидом распространенность снижалась до 5%.

Таблица 6 Характеристики сортов канолы в скрининге на 8с1егойша и испытаниях с использованием фунгицида в тех же местностях, №г111 Эако1а 81а1е Ипуегвйу Са^^^ηдιоη Кевеагск/Ех1епвюп Сепΐе^ и ипуегвйу о£ Μίπпево!а Кеб Баке Ра11в, 2003*

Сорт	Северная Дакота	Миннесота
Распространенность заболевания	Тяжесть заболевания	Тяжесть в полевых условиях	Распространенность заболевания	Тяжесть заболе- вания	Тяжесть в полевых условиях
Нуо1а 357 испытание без обработки фунгицидами	69	2,3	32, 1
Нуо1а 357 испытание с обработкой фунгицидами Эндура (боскалид)	44 ,0	1, э	16, 6
Нуо1а 357 испытание сорта	60, 5	2,6	30,9	18	4 6	17, 3

- 17 018509

1пУ1дог2б63 испытание сорта	61,5	2,8	34,4	30, 0	4,5	27,0
1П\/1дог2663 * испытание без обработки фунгицидами				22, 3	4,0	17,9
1пУ1дог2663 испытание с обработкой фунгицидами Эндура (боскалид)				5, 0	3, 3	3,1

На основе распространенности заболевания и табл. 3 испытание в Северной Дакоте можно классифицировать как очень высокое-экстремальное воздействие заболевания. Результат испытания с использованием фунгицида в Северной Дакоте сравним с экстремальным воздействием заболевания на шкале 88ΌΙ для Рюпеет 1-9 и указывает на характеристики лучшего фунгицида для защиты подверженного сорта. Эндура™ (боскалид™) обеспечивали наиболее высокий уровень защиты при испытании по сравнению с рядом других фунгицидов при этом воздействии.

* Из оценок 2003 года для фунгицидов для борьбы со стеблевой гнилью канолы, вызванной 8с1егоби1а, в Северной Дакоте и Миннесоте, служба распространения знаний ΝΌδυ, апрель 2004.

Пример 2. Развитие устойчивости к 8с1егоНша - выведение популяции Т.

Целью исследовательского усилия являлась замена обработки фунгицидом канолы на устойчивые к 8с1етобша сорта. Стратегия представляла собой использование естественно доступных источников с частичной устойчивостью и осуществление постепенного накопления этих предотвращающих заболевание морфологических признаков в ходе рекуррентной селекции в популяции для достижения очень высокого уровня частичной устойчивости. При постепенном накоплении на предотвращающем заболевание фоне устойчивость может являться полной, если ее можно получить для перенесения воздействия заболевания максимальной продолжительности, начиная от опадения лепестков до конца цветения, и, таким образом, посредством нее можно сопротивляться патогену без существенного повреждения растения.

Предотвращающие заболевание морфологические признаки включают, например, хорошую устойчивость к полеганию и жесткий ствол (стебель), более позднее созревание, высокое ветвление, более низкую сохранность лепестков и быстрое опадение листьев. Физиологические признаки в основном представляют собой сильную частичную устойчивость стебля, которая может являться связанной с некоторой устойчивостью листьев. Таким образом, развитие заболевания, которое снижено морфологическими признаками, дополнительно снижено там, где присутствует устойчивость стебля и/или листьев. Суммарное воздействие гриба на стебель снижено или минимизировано тогда, когда сильная частичная устойчивость стеблей сочетается с морфологическими признаками, которые уменьшают воздействие заболевания. В отсутствие подходящих морфологических признаков суммарные характеристики снижены, но все еще значительно лучше, чем у контролей канолы.

Экстремальное воздействие заболевания возникает в продолжительные периоды подходящих погодных условий для инфекции 8с1егоНша. Как правило, это происходит при температурах между 20 и 25°С и относительной влажности более чем 80%. В этих условиях происходит оптимальное инфицирование растения (Негап е! а1., 1999). Кроме влажности другим индикатором влажного растительного покрова является свободная влажность или абсолютная влажность на растениях.

Методы и материалы.

В табл. 7 и 8 описаны компоненты, используемые при развитии устойчивости в полевых условиях в популяции Т, и способы, используемые для развития и скрининга устойчивости в полевых условиях.

Начиная с 1986 г. приобретена зародышевая плазма рапса Втаккюа парик от правительственных учреждений в США Шпбеб 81а1ек Иерайтеп! οί АдтсиЙиге), Японии (М1шкбу οί Икбету апб Ν;·ιΙιιπι1 йекоигсек) и Канады (Р1ап! Сепебс йекоигсек). Рапс богат глюкозинолатами и эруковой кислотой и, таким образом, не является сортом канолы. Его обозначают как двойной высокий. В отличие от этого сорта канолы Втаккюа парик обладают низким содержанием эруковой кислоты и низким содержанием глюкозинолатов, и ее также обозначают как двойной низкий. Ее определяют как растение Втаккюа, в котором масло должно содержать менее чем 2% эруковой кислоты, и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4пентенилглюкозинолата, 2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2-гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на

- 18 018509 грамм высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества.

Приобретенную зародышевую плазму рапса охарактеризовали на реакцию стебля на 8с1егойша (табл. 7). Ряд обладающих частичной устойчивостью стебля отобранных растений рапса скрещивали с линиями сортов канолы, и отбирали потомков с частичной устойчивостью стебля и признаками сортов канолы (низкое содержание эруковой кислоты и/или низкое содержание глюкозинолатов). Линии сортов канолы, которые обладали частичной устойчивостью стебля, использовали для дополнительного исследования и выведения популяции. Источники устойчивости к 8с1егойша, использованные в выведении улучшенных яровых линий канолы, перечислены в табл. 7. Поступления из υδΌΆ (США) и МАРЕ (Япония) также использовали при выведении улучшенных озимых линий канолы.

В 1991 году в Рюиеег начали программу селекции популяции для рекомбинации образцов канолы с физиологической частичной устойчивостью стебля и морфологической неподверженностью в полевых условиях. Вывели популяцию Т. Подробности циклов от 0 до 10 представлены в табл. 8. Каждый цикл описан в строке таблицы. В каждой строке описан используемый материал, перекрестное скрещивание для получения 8₀, увеличение количества семян и селекция в теплице 8₀ для получения 81, с последующим тестированием 8₁ в поле и селекцией, включающей агрономический анализ и анализ качества. В первых четырех циклах использовали замкнутую популяцию, как описано в табл. 8. Дополнительную вариабельность физиологической частичной устойчивости стебля вводили в циклы 5, 6, 7 и 8 (табл. 8). Линии тестировали, следуя способам селекции в теплице и поле, как описано в примерах 6 и 7. Отбирали потомков, обладающих высокими уровнями устойчивости, и исследовали постоянное улучшение в поле (фиг. 1). Следуя способу примера 6, только селектированные в теплице на устойчивость стебля потомки адаптировали к полю.

Таблица 7

Выведение популяции Т - компоненты рапса, которые превратили в канолу и использовали в выведении популяции Т (данные по длине повреждения стебля в помещении и 8808 по исходным линиям или их яровым отобранным растениям (υ8ΌΑ) по сравнению с подверженными контролями)

Учреждение	Название сорта источника рапса	Год получения	Год интрогрессии	Длина повреждения Миллиметр	5505 1-9	Длина повреждения Подверженный контроль	5305 1-9 Подверженный контроль
ТЬе М1п1зСгу о£ Адг1си1£.иге, ЕогезЕгу апб ГгзИеглед о£ Дарап МАГ?, Япония	ДАР 3-1-1	1988	1991	33	4,4	72*	2,0
Ко (иззв.) б	1988	1991	28	4,2	48	1,0
Сепкаг	1988	1999	60	1,4	72	2,0
М1паш1 куичзЬии 17	1988	2000	10	5, 4	48	1,0
□50А ИогЕЬ Сеп£са1 Κβφίοηβΐ Р1апЕ ΙηϊΓΟάιΐύΕίοη ЗГаШоп 1оиа ЗЕабе ϋηϊνβΓδίΛγ	ΡΙ470079	1988	2001	32	4 7	109**	1,1
ΡΙ469955	1988	2001	27	4,5	120	1,0
ΡΙ469830	1988	2002	35	5,0	104	1,0
Р1апЕ СепеГгс йезоигсез Канада	РСК8487	1988	2002	27	5, 2	85	1,2
РСР.8 4 88	1986	2002	32	4,8	85	1,2
РСР8490	1986	2002	33	4,1	85	1,2
РСН8492	1986	2002	34	4,6	85	1,2
РСК8493	1986	2002	23	6,3	85	1,2

* Подверженный контроль для японских образцов яровой канолы кеЧаг.

** Подверженным контролем для образцов υ8ΌΑ и РСК являлась яровая линия Рюиеег N81602.

- 19 018509

Таблица 8

Выведение популяции Т посредством способа рекуррентной селекции 81 с модификациями

Популяция	Материал	Скрещиваемые отобранные растения	ОТ 30 К 3!	Характеристика 3!				Комментарии Дополнительная селекция на 3!
Популяция т	Частично устойчивый источник	Перекрестное скрещивание для 30	Отобранные из Зо в 3] по тестированию роста в СН	Тестирование 31 в поле из отобранных 50 на 5с1егоТ1П1а	Год	Тип тестируемого воздействия заболевания	Контроли для поля	Агрономический анализ и анализ качества
Цикл 0 Основание популяции	ЦАР 3-1-1 Ко(Ц55Е)б	12 линий Дважды П олудиаллел ь ный	500	ЕН Инокуляция стебля 500	1993- 1995	Тестирование стебля
Цикл 1	Замкнутая популяция	33 линии 31	500	150	1996	Естественный Воздействие от умеренного до высокого	N31602 N51604 Не исполь- зовали	Селекция 5] ΝΙΕ Низкое содержание глюкозинолатов
Цикл 2	Замкнутая популяция	30 линий 31	500	90	1997	Умеренное воздействие	4 6А65 N31604 Пары контролем	Селекция 31 ΝΙΡ Низкое содержание т'люкозинолатов
Цикл 3	Замкнутая популяция	12 линий 5]	500	150	1998	Умеренное воздействие	4 6А65 N51604 Пары контролей	Селекция 31 ΝΙΚ Низкое содержание глюкозинолатов
Цикл 4	Замкнутая популяция	15 линий 5}	3,000	1, 100 без повтор- ностей	1999	Экстремальное	4 6А65 N31604	Селекция 51 ΝΙΚ Низкое содержание глюкозин олат о в
Цикл 5	Открытая популяция ВС1 ΕΕΝΚΑΙ	62 ЛИНИИ 315 + 15 линий Сепка!	3.000	176	2000	Экстремальное 2 повторения	4 6А65 N51604	Агрономическая селекция ΝΙΕ Низкое содержание глюкозинолатов
Цикл 6	Открытая популяция ВС1 ΜΙΝΑΜΙ кущщнии 1?	Интрогресии 41 С5 + 9 Г1	3,000	150	2001	Экстремальное 2 повторения	4 6А65 4 6А7 6	Агрономическая селекция $ι ΝΙΕ Низкое содержание глюкозинолатов Селекция черной ножки

- 20 018509

Цикл	Ί	Открытая популяция ВС1 ΡΙ469955 ΡΙ470079	Интрогрессия скрещиванием 24 51 с П	3.000	600	2002	Экстремальное 2 повторения	4 6А65 4 6А7 6	Агрономическая селекция 51 ΝΙΡ. Низкое содержание глюкозимолатов
Цикл	8	Открытая популяция ВСО РСК8487 РСР.8 4 8 8 РСК8490 РОК8492 РСК8493 ΡΙ469830	30 31	4,000	600	2003	Экстремальное 2 повторения	46А65 4 6А7 6	Агрономическая селекция 5к ΝΙΒ Низкое содержание глюкозинолатов
Цикл	9	Замкнутая популяция	24 315	4,000	600	2004	Экстремальное 2 повторения	4 6А65 4 6А7 6	Агрономическая селекция 5к ΝΙΚ Низкое содержание глюкозинолатов
Цикл	Ю	Замкнутая популяция	62 515	4,000	390	2005	Экстремал ь ное 2 повторения	•4 6А65 46А76	Агрономическая селекция ΝΙΕ

Примечания.

Повторное тестирование осуществляли с цикла 6.

Материал включает генетические источники, используемые в выведении исходных образцов сортов канолы.

Замкнутая популяция = Выведение популяции основано только на потомках из предыдущего цикла, не используется никаких новых источников.

Открытая популяция = Выведение популяции основано на потомках из предыдущего цикла, а также новых источниках, ранее отсутствовавших в популяции.

Интрогрессия = Введение нового источника в популяцию; связана с открытой популяцией. ОН = теплица.

Букву Р обычно используют в селекции (в селекции педигри), и она обозначает дочернее поколение/поколение потомства, где Р1 является семенами первого поколения или растением из скрещивания.

обозначает самоопыление, Р1 представляет собой 80 или отсутствие самоопыления. Таким образом, можно дифференцировать потомков из популяции (8) по сравнению с селекцией педигри (Р).

представляет собой Р1 и часто используется в популяционной селекции для указания на количество самоопыляющихся поколений.

в популяционной селекции эквивалентно Р2 в селекции педигри.

Примеры разных способов, как указано далее.

Образцы источника для перекрестного скрещивания 0 года для получения 80, самоопыления/отбора 80, селекции 81 в поле в замкнутой популяции.

Перекрестное скрещивание 1 года 81 для получения 80, самоопыления/отбора 80, селекции 81 в поле; пример замкнутого цикла (циклы 1-4 и цикл 9, 10).

Перекрестное скрещивание 2 года 81 из 1 года и новые источники - способ ВСО (цикл 8) или пример открытого цикла (цикл 8).

Перекрестное скрещивание 81 из 1 года и новые источники, уже подвергнутые скрещиванию с популяцией Т - способ ВС1 (циклы 5, 6, 7); пример открытого цикла (циклы 5, 6, 7).

Результаты.

Фиг. 1 представляет собой гистограмму линий, полученных в циклах 5-10, для популяции Т, показывая развитие по направлению к устойчивости к 8с1егойша, полученной при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях, как измерено по сравнению с контролями в циклах 5-10. С каждым годом улучшения популяции Т процентная доля распространенности заболевания снижалась, и среднее значение для популяции улучшалось на шкале 88ΌΙ 1-9. Ось Υ представляет собой частоту у потомков, и на оси X представлено ранжирование устойчивости к 8с1егойша на шкале 88ΌΙ 19, как описано в табл. 4. На фиг. 1 показано, что среднее значение и мода для популяции для каждого цикла постоянно улучшались. Например, мода для популяции улучшилась от 2,5 в цикле 5 до 5,5 в цикле 8, до 7,5 в цикле 10. Кроме того, индивидуальные отобранные растения в циклах 7, 8 и 9 обладали рангами 7,5, 8,0 и 8,5. Отбирали потомков, обладающих высокими уровнями устойчивости, и исследовали постоянное улучшение в поле.

Степень распространенности заболевания в тестах, представленных на фиг. 1, измеряли при экс

- 21 018509 тремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях. Это является наиболее высоким возможным воздействием заболевания в естественном окружении в поле. Этот уровень заболевания редко возникает на полях фермеров (табл. 3). Следовательно, ожидают, что образцы, отобранные в этом тесте, будут расти значительно лучше при более низком и более обычном воздействии заболевания. Например, при типичном умеренном воздействии заболевания в поле распространенность заболевания для Рюпеег Ηί-Вгей сортов 46А65 и 46А76, как правило, составляет 20-30% и 10-20% соответственно (табл. 3). Однако при экстремальном воздействии заболевания уровень распространенности заболевания составляет 70% и 60% соответственно (табл. 3). Растение с частичной устойчивостью в полевых условиях обладает (ί) сниженным развитием заболевания на растении, (ίί) значительно отсроченным началом заболевания и (ίίί) устойчивостью к развитию заболевания в течение более продолжительного времени, когда инокулят находится в непосредственном контакте со стеблем. Если подходящие для заболевания условия продолжают сохраняться, наблюдают значительное уменьшение воздействия заболевания у частично устойчивых растений (табл. 3 и фиг. 1).

В табл. 9а, 9Ь и 9с описаны некоторые из линий с улучшенной устойчивостью в полевых условиях и показаны их характеристики в поле в естественных условиях в тестах, выполненных независимыми третьими лицами. Данные для 2004 года по 88ΌΙ% получены в Манитобе в испытаниях в открытом поле при умеренном воздействии заболевания (как определено характеристиками для 2 из 3 контролей). Некоторые из тех же самых линий тестировали в Университете в Миннесоте (ΜΝ) при высоком воздействии в 2003 (2 из 2 контролей) и в Северной Дакоте (ΝΏ) при воздействии от очень высокого до экстремального в 2003, согласно табл. 3. Все устойчивые в поле линии обладают уровнями частичной устойчивости стебля значительно более высокими, чем у контролей. Следует обратить внимание, что во всех четырех местностях характеристики каждой из пяти перечисленных линий хорошо соответствовали требованиям настоящей формулы изобретения, т.е. обладали средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1етойша 8с1его11огнт, (88ΌΙ%), который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеег Ηί-Вгей, сорт 46А76, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле.

Отобранные растения популяции Т также тестировали при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10а и 10Ь). Отобранное растение 028Ν41269 вводили в цикл 8. Отобранное растение 038Ν40441 из цикла 8 использовали для выведения в цикле 9 в сочетании с 038Ν40341 и 22 линиями 81 из предыдущего цикла 8, как описано в табл. 8. Эти три линии (т.е. 028Ν41269, 038Ν40341 и 038Ν40441) широко использовали в скрещивании, и для потомков популяции Т обратно прослеживается часть их генетической устойчивости к одному или нескольким из них.

В табл. 10а представлены результаты трех тестов (два в 2004 и один в 2003) при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях для 038Ν40341, 038Ν40441 и 028Ν41269. В среднем, 038Ν40341, 038Ν40441 и 028Ν41269 обладали распространенностью заболевания (88ΌΙ%) 39, 39 и 44% соответственно по сравнению с 46А76. При этих экстремальных условиях растения более подвержены 8с1етойша, по меньшей мере, по причинам, рассмотренным выше при определении экстремального воздействия заболевания в экспериментальных полевых условиях. В отличие от этого, растение, растущее в естественных полевых условиях, (1) не покрыто искусственным навесом, который обеспечивает постоянную влажность, и (2) его выращивают на участках, окруженных растениями с тем же самым морфологическим фенотипом, который позволяет проявиться всем преимуществам морфологии. Следовательно, отобранные растения, обладающие морфологией, которая менее способствует инфекции 8с1ето!1ша, например высоким ветвлением, растут значительно лучше в естественных полевых условиях по сравнению с экстремальным воздействием заболевания в экспериментальных полевых условиях. Например, в среднем, в естественных полевых условиях 038Ν40341, 038Ν40441 и 028Ν41269 обладали распространенностью заболевания 23,2, 13,7 и 49,1% соответственно по сравнению с 46А76, как показано в табл. 9а. Следовательно, 028Ν41269 обладает морфологией, которая более способствует инфекции 8с1етойша, чем 038Ν40341 и 038Ν40441. 028Ν41269 более склонен к полеганию по сравнению с 038Ν40341 и 038Ν40441 (фиг. 2А). На фиг. 2А показано, что 04ΌΗ812921, удвоенная гаплоидная линия 028Ν41269, а также удвоенный гаплоид 04ΌΗ811319 также склонны к полеганию больше, чем контроль 46А65 и другой тестируемый материал. Низкая устойчивость к полеганию может дискредитировать характеристики устойчивости к 8с1егоЦша в сравнении с совокупностями данных в естественных условиях, в особенности, при обилии влаги или избыточном орошении, таких как ΝΏ8ϋСатпд!оп 2005. В экспериментальных совокупностях данных обходят устойчивость к полеганию и предоставляют показатели, которые отражают потенциал генетической устойчивости в сочетании с морфологией.

Эффект морфологии при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях по сравнению с естественными полевыми условиями можно показать с использованием контрольных сортов 46А76, 46А65 и 44А89 в качестве примеров. 46А76 является одним из наименее подверженных сортов в испытаниях сортов на устойчивость к 8с1ето!1ша в организуемых университетом испытаниях в Северной Дакоте и Миннесоте (табл. 9а и 9Ь, данные 2003 г.). 46А76 обладает морфологией, которая менее способствует инфекции 8с1етойша по сравнению с 46А65 или 44А89. Морфология

- 22 018509 включает характеристики, такие как высокое ветвление и очень хорошую устойчивость к полеганию. При рассмотрении показателей 88ΌΙ% при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10а) 44А89 составляет 115% от 46А76 и 46А65 составляет 98% от 46А76. Однако в естественных испытаниях в 2004 (табл. 9а) 44А89 составляет 232% от 46А76 и 46А65 составляет 199% от 46А76. Это ясно показывает, что 46А76 является высоким стандартом для измерения устойчивости в полевых условиях, в особенности в естественных полевых условиях, по сравнению с другими контролями канолы. Это также показывает различие между естественными полевыми результатами и экспериментальными полевыми результатами при экстремальном воздействии заболевания. При экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях подвергаются испытанию все генотипы, и оно представляет собой наихудший сценарий, т.е. такой, который обычно возникает только в 1-2% в естественном окружении в поле (см. табл. 3). Линия, которая хорошо растет в этих экстремальных условиях, как ожидают, растет, по меньшей мере, также хорошо в естественном окружении в поле.

Включение контрольных сортов, таких как 44А89 и 46А76, помогает в оценке тестирования окружающей среды и надежности полученных данных. Например, в табл. 9Ь и 9с сравниваются результаты, полученные на контрольных линиях на тестируемых участках в Северной Дакоте и Миннесоте в 2001, 2003 и 2005. Эти участки являются выборкой из участков с более высоким воздействием заболевания, исключая совокупности данных по годам со следовыми уровнями заболеваемости (Вгай1еу, е! а1., 2006). Низкий уровень распространенности заболевания для 46А76 в 2005 (ΝΏδυ-Сагппдоп) указывает на то, что условия окружающей среды могут усложнять оценку заболевания, как предположил исследователь ВоЬ Наикоп (ΝΏδυ). В этом случае избыточное орошение приводит как к избыточному полеганию более ранних линий, так и к задержке созревания более поздних линий, способствуя более поздно созревающим линиям, таким как 46А76. Табл. 9Ь и 9с позволяют предположить, что данные, собранные на участке ИВ8и-Сагг1пд!оп 2005, не согласуются с данными, полученными на том же участке, а также на участках в Миннесоте в предыдущие два года (см. также Вгай1еу, е! а1., 2006).

На фиг. 2 представлены данные многочисленных испытаний яровых линий как при экстремальном воздействии заболевания, так и в естественных полевых условиях. Общие экспериментальные данные при экстремальном воздействии заболевания в поле получали, самое большее, в четырех тестах. Данные для поля в естественных условиях собирали, самое большее, в трех местностях, включая участок в Северной Дакоте, рассмотренный выше (данные 2005). При удалении результатов одиночного отклоняющегося испытания (фиг. 2Ό и 2Е) все тестируемые линии отчетливо хорошо растут в пределах выбранного диапазона, т.е. показателя 88ΌΙ% менее чем 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеег, сорт 46А76, или показателя 88ΌΙ% для Рюпеег, сорт 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле.

Удвоенные гаплоидные линии, представляющие 028Ν41269 (2 линии), 038Ν40441 и 038Ν40341, отбирали и охарактеризовывали при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях (табл. 10Ь). Удвоенные гаплоидные линии получали способами, известными специалистам в данной области; например, см. 8\\апкоп е! а1. (1987), Мо11егк е! а1. (1994), Напкеп е! а1. (1996), патент США 6200808 и патент Канады 2145833. Четыре удвоенные гаплоидные линии обладали рангами 88ΌΙ от 6,6 до 7,3. Это хорошо отличается от контроля, Рюпеег Ηί-Вгей, сорт 46А76, с рангом 3,8. Удвоенные гаплоидные линии обладают морфологическими фенотипами, аналогичными своим родительским линиям, и они, вероятно, также лучше растут в естественных условиях.

На табл. 10с представлены данные по характеристикам для озимых линий канолы Р3, 2005. Данные в этой таблице получены из испытания в поле в 2005, выполненного в Тавистоке (Онтарио, Канада), которое повторили три раза. Экстремальное воздействие заболевания использовали для получения этой экспериментальной совокупности данных.

Реакция в полевых условиях у исследуемых образцов оказалась лучше, чем у контролей, Ехргекк и Со1итЬик, даже в погодных условиях, которые приводили к воздействию заболевания, более высокому, чем намеченное. Показатели полегания у отобранных растений озимой канолы, полученные в Зосте (Германия), позволили осуществить селекцию устойчивых образцов с хорошей устойчивостью к полеганию.

На табл. 11а представлено происхождение пяти отобранных образцов гетерозиготной яровой канолы (028Ν41269, 038Ν40341, 038Ν40441, 048Ν41433 и 048Ν41415) и их гомозиготные удвоенные гаплоидные потомки. Так как все отобранные растения происходят из одного растения (давшего 100-500 семян в первый год тестирования в поле), им требуется в дальнейшем самоопыление и увеличение количества для дальнейшего тестирования в поле и предоставления семян.

В заключение, как показано на гистограмме фиг. 1, усилия по выведению и селекции в течение шести лет (2000-2005), обусловленные 15 годами исследований (1991-2005), привели к улучшению яровых линий канолы. В естественных полевых условиях эти линии обладают средним значением показателя распространенности заболевания, вызванного 8с1его!1ша 8с1его!югит (88ΌΙ%), который составляет менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для Рюпеег Ηί-Вгей, сорт 46А76, или показателя 88ΌΙ% для Рюпеег Ηί-Вгей, сорт 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле. На табл. 9а показано, что Рюпеег ΗίВгей, сорт 46А76, является одним из наименее подверженных контролей канолы в поле (ранг 3 на шкале

- 23 018509

88ΌΙ, в то время как большинство существующих образцов канолы обладают рангами 1 или 2) и представляет собой очень перспективный контроль, с которым сравнивают новые образцы. Кроме того, ланс™ или эндура™ считают наиболее эффективными фунгицидами на рынке. Это сочетание наиболее чувствительного контроля канолы и наиболее эффективного фунгицида задает очень высокие требования. Как видно из гистограммы фиг. 1, цикл 10 популяции Т обладал рангом 88ΌΙ 7,5, где некоторые индивидуумы обладали рангами 8 или 8,5. Согласно шкале ранжирования в табл. 4 и результатам, представленным на фиг. 1, выведены линии, обладающие рангами 88ΌΙ 5, 6, 7 или 8. Их классифицировали как умеренно устойчивые (ранги 5 или 6) и устойчивые (ранги 7 или 8).

Таблица 9а Суммирование результатов данных в естественных условиях в поле для 8с1егойша по выведенным устойчивым к 8с1егойша растениям в 2003/2004

2004 2004 2003 2003 2003/004 2003/2004 2003/2004 2003 2003

Сорт	Происхождение	3501%	8801%	33ϋΙ%	33ϋΙ%	8801%	5801%	88Я8*	58РЗ	35Ε8	88Р8
2003/2004		МВ (Морден)	МВ (Карман)	Νϋ’*	ΜΝ	4 местности	% 46А76	ΝΟ	ΜΝ	Среднее значение	% 46А76
025Ν40680	Цикл 7-ΒΝ3	0.6	1.4	18.5	4.0	6.1	23.4	8.4	0.6	4.5	20.6
023Ν40209	Цикл 7-ΒΝ4	4.9	17.4	22.0	0.0	11.1	42.3	10.1	0	5.1	23.1
028И41269	028Ν40102-ΒΝ1	4.0	1.4	39.0	7.0	12.9	49.1	16.6	3.5	10.1	46.0
46А76	Контроль М5	18.3	14.6	51.0	21.0	26.2	100.0	25.6	18.1	21.9	100.0
44А89	Контроль Н5	42.2	35.4	90.0	76.0	60.9	232.4	64.8	76.0	70.4	322.2
ТОЛЬКО 2004						2 местности	% 46А76
033Ν40441	Цикл 8	1.7	2.8			2.2	13.7
038Ν40341	Цикл з	3.2	4.4			3.8	23.2
46А65	Контроль 8	33.3	32.0			32.6	198.8

Тяжесть заболевания в поле в ΝΌ и ΜΝ вычисляли умножением распространенности заболевания (88ΌΙ%) на тяжесть заболевания инфицированных растений и делением на 5 (55Г5= [ЗЗСП%хЗЗОЗ (шкала 0-5) ]-=-5). Меньшая тяжесть 1 по сравнению с мертвым растением 5 будет значительно снижать суммарное воздействие заболевания, как видно посредством сравнения 44А89 и 028Ν40680.

ΝΏ = Северная Дакота.

ΜΝ = Миннесота.

МВ = Манитоба.

Таблица 9Ь

Данные ΝΏ8υ и Бшуегкку о£ Мтпеко1а в естественных условиях по реакции в поле сортов канолы на 8с1егойша (% распространенности заболевания) 2001/2003/2005

	2001	2001	2003	2003	2005	2001-2003 ВСЕ
	СагппяСоп	Бей каке РаНз	СагппдЕоп1	Нед каке РаНз2	Сагппд1оп
Сорт						Меап	Меап
Нуйе201**	14.7	15	65.0	4.0	41	25	28
Нуо1а401	20.7	33	55.0	11.0	54.5	30	35
4М70	22.7	34.7	51.0	21.0	16.0	32	29
Нуо1а357	34.0	41	60.5	18.0	55.5	38	42
1.(33455	41.3	41	52.5	29.0	30	41	39
44А89	36.0	73	90.0	76.0	49,5	69	65

* Данные получены ВоЬ Иапкоп (ΝΏ8υ) и Эауе Бедаге (БшуегкПу о£ Мтпеко1а).

** Безлепестковая канола.

¹ Данные по СагппдЮп (Северная Дакота), 2003, соответствуют данным для ΝΌ, 2003, в табл. 9а.

² Данные по Кеб Баке Еа11к (Миннесота), 2003, соответствуют данным для ΜΝ, 2003, в табл. 9а.

Таблица 9с Данные ΝΏ8υ (СагппдЮп) и БшуегкПу о£ Μω^^ΐΗ (Кеб Баке Еа11к) в естественных условиях по реакции в поле сортов канолы на 8с1егойша (распространенность заболевания), 2001/2003, выраженные в виде % от 46А76

	2001	2001	2003	2003	2005	20012003
	Сагппд1оп	Нед каке РаНз	Сагппдюп	Нед каке Райз	СагдпдГоп
	Распространенность 5с1его1ш 1а (%)
Сорт						Меап	Меап
Ну1йе201**	65	42	127	19	256	63	102
Нуо1а401	91	96	108	52	341	67	138
46А76	100	100	100	100	100	100	100
Нуо!а357	150	118	119	86	347	118	164
ίΘ3455	182	119	103	138	188	135	146
44А89	159	211	176	362	309	227	243

* Данные получены ВоЬ Ηаηкоη (ΝΏ8υ) и Эауе Бедаге (БшуегкПу о£ Μ^ппекоιа). ** Безлепестковая канола.

- 24 018509

Таблица 10а

Суммирование источников экспериментальных данных 2003/2004 по экстремальному воздействию заболевания (88ΌΙ), 3 теста

2004 2004 2003

	ТЕСТ 1		ТЕСТ 2		ТЕСТ 3		Меап	Меап	Преобразование*	88ϋ!%
Сорт	8801	ЦвеТуЩее ртст«М>>*м	88ϋ1	Цввтущве раетенпе	8801	инетущее Р1стем*е	88ϋ1	Цветущее		46А76
035Ν40341	5.8	48	7.2	48	7.2	44	6.7	46.7	23	39
038N40441	5.6	46	6.8	49	7.8	45	6.7	46.7	23	39
028Ν41269	5.9	44	6.6	45	6.6	41	6.4	43.3	26	44
46А76	3.8	48	2.0	52	3.4	44	3.1	48.0	59	100
46А65	2.9	46	3.2	46	3.6	42	3.2	44.7	58	98
44А89	п/а	п/а	2.5	47	1.8	46	2.2	46.5	68	115

* Преобразование 1-9 для 88ΌΙ в 88ΌΙ% в табл. 4.

** 50% цветущих растений.

Таблица 10Ь Экспериментальные данные по экстремальному воздействию заболевания в поле для удвоенных гаплоидных линий и их родительских источников (028Ν41269, 038Ν40441 и 038Ν40341), селектированных на высокий уровень устойчивости в полевых условиях

88ΟΙ	Цветущее растение	Сорт	I Происхождение
6.8	48	04ОН811319	ΡΟΡΤ08-038Ν40041 Удвоенный гаплоид
6.6	48	04ϋΗ311418	ΡΟΡΤ08-038Ν40050 Удвоенный гаплоид
7.0	47	04ОН812921	038Ν40919 Удвоенный гаплоид
7.3	47	04ОН812927	038Ν40919 Удвоенный гаплоид
5.8	48	038N40341	ΡΟΡΤ08-038Ν40041 Цикл 8
5.6	46	038Ν40441	ΡΟΡΤ08-038Ν40050 Цикл 8
5.9	44	028Ν41269	028Ν40102
1.9	49	Ν33181ΒΕ	Чувствительный к раундапу ОН
3.8	48	46А76	'Умеренно чувствительный контроль
2.9	46	46А65	Чувствительный контроль

Таблица 10с

Характеристика озимых линий Е3 канолы против 8с1егобша (Тависток, Онтарио) и их агрономические/качественные признаки (Зост, Германия), 2005

СОРТ-РЗ	Происхождение	550Ι8	Преобразование	л среднее значение объединенных контролен	Полегание*	Высота*	Эруковая кислота 22:1	•’Тлюкозинолаты	Сорт -Р2
04С\4/В930128	03ШВ926237Л0	6.3	27	42	6.0	7	0.03	19.1	03ШВ925237
04СИ/В930127	03СИВ925237-7	5.3	27	42	6.0	7.0	0.16	7.9	03ОТВ925237
04С\МЗ930081	ОЗС\Л/В925200-4	5.9	31	48	6.0	4.0	0.03	8.1	ОЗСУУВ925200
04ОТВ930111	03СУУВ925024-9	5-8	32	49	6.0	5	0.02	9.9	03СТУВ925024
04СУ7В930144	03С1ЛВ925261-5	5.4	36	55	6.0	3.0	0.10	8.3	ОЗСМУВ925261
04СУУВ930015	03СУУВ925059-1	5.3	37	57	8.0	5.0	0.02	18.5	03С1А/В925056
04СУУВ930135	03ОЛ/В925245-3	5.3	37	57	6.0	8.0	0.20	17.2	03СУ7В925245
Со1итЬиа	Со1цтЬи$	2.0	70	108					Со1итЬиэ
Ехргезз	Ехргезз	3.0	60	92	6.2	5.1	0.02	15.0	Ехргезз

* Показатели полегания (1 - полегшие, 9 - прямостоячие) и высоты (1 - низкие, 9 - высокие) для Зоста, Германия, 2005.

** Содержание глюкозинолатов определено на образцах Е3 из Зоста, Германия, 2005.

- 25 018509

Таблица 11а Происхождение трех отобранных образцов яровой канолы и их удвоенные гаплоидные потомки

Линия #	Происхождение
41269 и ЦН5
040Н812921	038Ν40919
04ОН512927	035Ν40919
038Ν40919	02ΘΝ40102
038Ν40918	028Ν40102
028Ν41269	023Ν40102
026Ν40102	015Ν41722
018Ν41722	013Ν41702 Χ018Ν41209
015Ν41702	Ο13Ν41338 Χ018Ν41277
018Ν41338	РОРТС5 х (Р6К8493Х (РОРТСЗ х N31602))
018Ν41277	Р0РТС5 х (РСЕ8492 х (РОРТСЗ х N32082))
013Ν41209	Р0РТС5 х (ΡΘΚ8488 х (РОРТСЗ ΧΝ81602))
40341 и ОНЗ
040Н311319	ΡΟΡΤ08-038Ν40041
043Ν441521	РОРТС8-033N40041
043Ν40006	РОРТСЙ-035М40041
Ο38Ν40341	ΡΟΡΤ08-033Ν40041
40441 и ΏΗ5
040Н811418	ΡΟΡΤ08-033Ν40050
048Ν441522	РОРТСЗ-ОЗЗШООбО
048Ν40009	РОРТС8-038Ы40050
038Ν40441	ΡΟΡΤ08·033Ν40050
41433 и ЦН5
050Н312897	ΡΟΡΤ09-048Ν40049
058Ν-41433	ΡΟΡΤΟ9-048Ν40049
048Ν-41433	РОРТС9-048Ы40049
41415 и ЦН5
04ϋΗ812879	РОРТС9-048Ы40047
055Ν-41415	ΡΟΡΤΟ9-043Ν40047
045Ν-41415	ΡΟΡΤ09-045Ν40047

Статус	'Образцы, тестируемые в поле
Удвоенный гаплоид, депонированный под инвентарным № АТСС РТА-6781
Удвоенный гаплоид
Групповое добавление Е5 023Ν41269
Групповое добавление Р4 из 023Ν41269, депонированное как 0281141269 под инвентарным № АТСС РТА-6777	2003 и далее
ГЗ из единственного растения Р2	2002
Р2 568 РЗ, отобранных по тестированию в поле
Е1
Е1
Селекция ЕЗ из 60 тестируемых в поле
Селекция ЕЗ из 33 тестируемых в поле
Селекция ЕЗ из 73 тестируемых в поле
Удвоенный гаплоид, депонированный под инвентарным № АТТС РТА-6780
Групповое добавление 043Ν441521-33 из 043Ν40006, депонированное как038К140341 под инвентарным № АТСС РТА-6776	2004 и далее
Групповое добавление из 6Н 52 из 035Ν40341
038Ν40341-31 из единственного растения 80	2003
Удвоенный гаплоид, депонированный под инвентарным N9 АТСС РТА-6778
Групповое добавление 043Ν441522-33 из 0431440009, депонированное как 033Ν40441 под инвентарным № АТСС РТА-6779	2004 и далее
Групповое добавление из СН 32 из 035Ν40441
038Ν40441-51 из единственного растения 30	2003
Удвоенный гаплоид, Инвентарный № ΝΟΙΜΒ 41391
Групповое добавление 82, депонированное как 043Ν-41433 под инвентарным № ΝΟΙΜΒ 41389	2005 и далее
81 из единственного растения 80 цикла 9	2004
Удвоенный гаплоид, Инвентарный № ΝΟΙΜΒ 41390
Групповое добавление 32, депонированное как 048Ν-41415 под инвентарным № ЫС1МВ 41388	2005 и далее
51 из единственного растения 30 цикла 9	2004

* Расщепляющийся материал, происходящий из единственного растения 81 или Р3 и размножаемый в течение последующих лет тестирования после первого года.

- 26 018509

Таблица 11Ь

Происхождение 7 рассматриваемых озимых образцов канолы

Депонирование ЫС1МВ	Депонирования	Е3*“ Из единственного растения Е2	Р2 ** Селектируемое Е2 с обозначенным единственным растением из него
41395	05СУУВ940127	04С\Л/В930127	03ОЛ/Е925237-7
41396	05ОТ/В940128	04СУУВ930128	03СУУВ925237-10
41393	05С1Л/В940081	04СУ7В930081	03С\Л/В925200-4
41394	05СУУВ940111	04СУУВ930111	ОЗСУУВ925024-9
41398	05СУУВ940144	04С1Л/В930144	03СУУВ925261-5
41397	05С1Л/В940135	040Л1В930135	03ОТВ925245-3
41392	05С1Л/В940015	04СМВ930015	03СУУВ925059-1

* Потомство Е1 из комплексного скрещивания {[СУ0242х01С^В940022]х[(00Е^В940100х 00Е^В940919)х01С^В910012]} подвергали самоопылению и отбирали в теплице по реакции к 8с1егойша.

** Селекцию на реакцию к 8с1егойша и качество осуществляли среди 400 линий Е2 в скрининге в поле без повторностей.

*** Селекцию на реакцию к 8с1егойша, полегание и качество осуществляли среди 200 линий Е3 при тестировании в поле в трех параллелях. Каждую линию Е3 получали из единственного растения Е2.

**** Групповое добавление Е4 на участках, урожай из Зоста, 2005, для запатентованного депонирования в виде добавления отобранного поколения Е3 из единственного растения.

Таблица 11с Компоненты комплексного скрещивания на устойчивость к 8с1егойша для зимней канолы

Компонент		Родители***	Компоненты устойчивости	Поколение	Комментарии
1	01СИВ940022	97ОТМ39131 х (070058 х С70057)	ΡΙ469955	Р4	Скрининг в закрытом помещении (4 из 16 отобранных растений) перед последующим скрещиванием
	0ЮТВ930022	97С\МЧ39131 х (ΟνΟΟδβ X СУОО57)	ΡΙ469955	РЗ	Скрининг в закрытом помещении (4 из 16 отобранных растений)
	01С\Л/В920022	97СУУМ39131 х (01/0058 х 01/0057)	ΡΙ469955	Е2	Скрининг е закрытом помещении (4 из 16 отобранных растений)
	0101/78910022	(97ОТМ39131 χ (С 1/0058 χ С1/0057)	ΡΙ469955	Р1	скрещивание
	97СУт39131	СУ0065 χ Ρ1469955	Р1469955	РЗ	Селекция на признаки канолы (эруковая кислота) и устойчивость. Тестирование 4 растений на селекцию (глюкозинолаты в семенах) 20 семейств Р2 с низким содержанием эруковой кислоты
	96СУ/Ц29131	СУООбб χ ΡΙ469965	ΡΙ469955	Р2	самоопыление для получения 1300 семян для тестирования семядолей на содержание эруковой кислоты
	95ΟΛίΝ19131	С70065 χ ΡΙ469955	ΡΙ469955	Е1	скрещивание
2*	99НЧВ940100	(СУООЛЗ χ СУООбЗ) χ97Ο\ΜΝ39191	РИ69830	Р4
	97СЭДН39191	СТ0114 X ΡΙ469830	Р1469830	РЗ
3*	00тВ940919	((СУ0063 X θν0059) х(СТ0060х ονοοιι»χ 97Ο1Λ/Ν39260	Р1470079	Р4
	97СТУЫ39260	0/0087 X Ρ1470079	Р1470079	РЗ
4*	ОЮТВ9Ю012	N773978 X (СУООбО χ 003Ν42757)	РорТ цикл 6	ВСЮ
Описание в таблице 8	008Ν42757	РорТ цикл 6 (таблица 8)	РорТ цикл б (таблица 8)	Р2	суммарная пыльца 3000 растений РорТ из цикла 6

* Компонент 2 и 3 получали аналогично компоненту 1.

*** Обозначения СУ и Νν означают чувствительные к 8с1егойша элитные сорта из коллекции озимой канолы Рюиеег.

- 27 018509

Пример 3. Определение канолы.

Согласно Совета по каноле (Канада), канолу определяют посредством следующих свойств: масло должно содержать менее чем 2% эруковой кислоты и твердый компонент семян должен содержать менее чем 30 мкмоль любого одного или любой смеси из 3-бутенилглюкозинолата, 4-пентенилглюкозинолата, 2-гидрокси-3-бутенилглюкозинолата и 2-гидрокси-4-пентенилглюкозинолата на грамм высушенного на воздухе, не содержащего масла твердого вещества.

Уровень эруковой кислоты и содержание глюкозинолатов измеряли для подтверждения того, что семена, произведенные популяцией Т, удовлетворяют определению канолы. Уровень эруковой кислоты измеряли с помощью профиля жирных кислот целых семян и уровень глюкозинолатов измеряли сканированием ΝΙΚ, как описано ниже:

Содержание жирных кислот.

Определяют общепринятые процентные содержания по массе жирных кислот, присутствующих в эндогенно образуемом масле зрелых целых сухих семян. В ходе такого определения семена дробят и экстрагируют в виде метиловых сложных эфиров жирных кислот после реакции с метанолом и метоксидом натрия. Затем полученный сложный эфир анализируют на содержание жирных кислот газожидкостной хроматографией с использованием капиллярной колонки, которая позволяет осуществить разделение на основе степени ненасыщенности и длины цепи жирных кислот. Этот способ описан в работе БК. Бапп е( а1. (1983), которая приведена здесь в качестве ссылки.

Содержание глюкозинолатов.

Суммарное содержание глюкозинолатов в семенах при 8,5% влажности при измерении официальным способом ΑΟί8 АК-1-92 (Определение содержания глюкозинолатов в семенах рапса-кользы посредством НРБС) выражено в мкмоль на грамм. Капиллярная газовая хроматография триметилсилилпроизводных экстрагированных и очищенных десульфоглюкозинолатов с оптимизацией для получения оптимального детектирования индолглюкозинолатов описана в Ргосебигев о£ (Не Vевΐет Сапаба Сапо1а/Каревееб Кесоттепбтд СоттШее ШсогроШеб £ог (Не Еуа1иабоп апб Кесоттепбабоп £ог Кед1вбаИоп о£ Сапо1а/Каревееб Сапб1ба1е СиШуагв т Vевΐе^π Сапаба.

Канола должна также агрономически удовлетворять требованиям сезона выращивания. Для яровой канолы среднее количество суток до достижения 50% цветения, как правило, попадает в диапазон 30-90 суток (табл. 1). Для контролирования условий выращивания для любого года или для любого поля количество суток до цветения сравнивают с официальными контрольными сортами, растущими в том же самом поле и в тех же самых условиях. В табл. 12 суммированы результаты тестов на глюкозинолаты, эруковую кислоту, сутки до 50% цветения и сутки до достижения зрелости по сравнению с официальными контрольными сортами νίί/ККС ^ев1егп Сапаба Сапо1а/Каревееб Кесоттепбтд СоттШее Шсогрога(еб £ог (Не ЕуаШабоп апб Кесоттепбабоп £ог Кед1в1габоп о£ Сапо1а/Каревееб Сапб1ба1е СиШуагв т Vевΐет Сапаба), 46Α65 и 02. Как можно видеть из табл. 12, растения, произведенные популяцией Т, сравнимы с контролями и удовлетворяют определению яровой канолы. Изменения в пределах допустимого диапазона могут возникать из-за различий в окружающей среде.

- 28 018509

Таблица 12

Качество/яровой характер развития - эруковая кислота (С22:1)/глюкозинолаты/цветение/зрелость для канолы

Сорт	С22:1* ** ***		ГлюкозинолатьГ*	50% цветение	Зрелость	Источник
Онтарио 2004
028Ν40209	0.06	ННЭ' кое	11.98	низкое	48.3	102.5	РорТ
023Ν40680	0.06	низкое	27.79	низкое	48.2	102.5	РорТ
028Ν41269	0.00	низкое	14.50	низкое	44.7	100.8	родственный Рор Т
033Ν40341	0.08	низ- кое	11.53	низкое	47.8	102.7	РорТ
038Ν40441	0.13	НИЗ' кое	11.42	низкое	46.2	101.3	РорТ
038Ν40698	0.10	низкое	13.59	низкое	45.0	103.2	Рор Т
46А76	0.13	низкое	11.15	низкое	50.2	102.8	контроль
46А65*’*	0.11	низкое	16.24	низкое	47.0	102.0	Официальный контроль
02—	0.07	низкое	13.02	низкое	50.0	102.0	Официальный контроль
Чили 04/05 \/апр1у	С:22:1
04ОН311319	0.01	низ* кое	15.97	низкое	59.0	119	038Ν40341
04ОН811418	0.01	низкое	12.56	низкое	63.5	118.5	038Ν40441
04ОН312921	0.01	низ* кое	20.12	низкое	57.0	114	025Ν41269
040Н312927	0.02	низкое	20.65	низкое	57.0	116	023Ν41269
048Ν41415	0.02	низкое	10.39	низкое	60	113	РорТ
048Ν41433	0.02	низ- кое	10.38	низкое	63	116	РорТ
46А65	0.01	низкое	14.65	низкое	59.0	114	Официальный контроль
Чили 05/06 Уаг1е4у
05ϋΗ812879	0.02	низкое	9.91	низкое	62	114	043Ν41415
05ОН812897	0.02	низкое	9.98	низкое	65	114	048Ν41433
46А65	0.03	низкое	14.31	низкое	67	118	Официальный контроль

* Процентное содержание суммарных жирных кислот - эруковой (С22:1).

** Глюкозинолаты (мкмоль - суммарные алифатические глюкозинолаты/г высушенной на воздухе муки).

*** Официально зарегистрированные контроли качества.

Пример 4. Сложность признака.

На табл. 13 показана сложность генетического расщепления при скрещиваниях с использованием подверженного элитного материала, нацеленного на выведение продукта. В то время как данные по эффективности на фиг. 1 показывают характеристики признака, данные по расщеплению в табл. 13 показывают низкий выход частично устойчивых линий. Это указывает на то, что постепенно накапливаемые генетические компоненты приводят к сложному расщеплению. Подсчитано, что придают частичную устойчивость у данных образцов три или четыре гена. Интрогрессия этих трех или четырех генов в элитный материал требует значительного усилия. Чем больше вклад подверженного элитного материала, тем сложнее интрогрессия генов устойчивости к 8с1егойша. Например, легче ввести гены устойчивости к 8с1егойша в материал, который содержит 50% подверженного элитного материала, по сравнению с материалом, который содержит 75% подверженного элитного материала. Можно использовать гаплоидные способы для установления расщепляющегося потомства аналогично используемым для установления источников устойчивости, представленных в табл. 10а, 10Ь и 10с.

- 29 018509

Таблица 13

Результат деятельности по селекции - выход устойчивых потомков после скрещивания частично устойчивых отобранных образцов с подверженными элитными линиями в 2003 и 2004*

Поле	Поко-	%	КолВО	растения,	Оконча-	Выход	Выход
год	ление	вклада	растений.	отобранные	тельное	селекции	селекции
		подвер-	взятых в	в СН для	кол-во	в % от	в % от
		женных	тестиро-	тестиро-	линий,	взятых в	взятых в
		родите-	вание в	гания в	отобран-	тестиро-	тестиро-
		лей	сн	поле	ных в	вание в	вание в
					поле	сн	поле
2003	ВС1Г3	75	1870	170	3	0,2	1,8
2003	Гз	50	500	260	6	1,3	2,3
2004	вс1Р3	75	2400	455	46	2	11
2004		50	122	122	20	15	15**
2004	ВС1ЕЭ	25	630	235	39	6	16

* Разные источники, используемые в разные годы/разных проектах.

** Позднеспелость значительно увеличила количество отобранных растений.

Линии цвели позже по сравнению с контролями.

Пример 5. Скрининг на устойчивость к черной ножке.

Черная ножка (йерЮ^рйаепа таси1ап8 и другие виды йерЮ^рйаепа), также известная как рак стеблей Рйота, является важным в международном масштабе заболеванием Вгаккюа, вызывающим значительные экономические потери в Европе, Австралии и Северной Америке (Είΐΐ е1 а1., 2006). Потомки популяции Т скринировали на устойчивость к черной ножке способами, описанными в способах АСС/ККС, в Ргосебигез ой Не Ае51егн Саиаба Саио1а/Карезееб Кесоттеибтд СотпиНее 1исогрога!еб йог Не Еуа1иайои аиб Кесоттеибайои йог КедкЧабои ой Саио1а/Каре8ееб Саиб1ба!е СиШуагк ίη Аейеги Саиаба, приведенных здесь в качестве ссылки.

В табл. 14 описаны ранжирования по устойчивости к черной ножке из двух местностей в Западной Канаде для наиболее вирулентных рас заболевания. Отобранные растения 028Ν41269 и 028Ν40441, как обнаружили, обладают высокими уровнями устойчивости взрослого растения к черной ножке со средним рангом 8,7 для 2004 по сравнению с подверженным контролем, Аейаг, который обладал рангом 5,8 (табл. 14). Данные, полученные в 2005, также указывали, что устойчивость к черной ножке у 028Ν41269 и 038Ν40441 выше, чем у 46А76.

Исследования в поле в Тавистоке (2004 и 2005) указывают на то, что устойчивость озимых линий к черной ножке аналогична устойчивости Со1итЬи8/Ехрге88.

Таблица 14

Реакция экспериментальных растений на черную ножку в Западной Канаде, 2004/2005

Сорт	Реакция на черную ножку	Ρΐυτπ Сои1ее, Манитоба	К111ат, Альберта	2004 Среднее значение*	К111ат, Альберта 2005
023Ν41269		8,9	8,5	8,7	6,3
033Ν40441		8,5	8, 8	8, 7	5,5
46Г65	Устойчивый контроль	7,0	8, 4	7,7	4,6
02	Устойчивый контроль	7,1	8, 0	7, 6	Нет данных
033Ν40341		7,0	7, 5	7, 3	4,7
0331440698		6, 0	3, 4	7,2	5,2
023Ν40209		6, 3	7, 8	7,0	Нет данных
02ΞΝ40680		6,3	3,3	6, 8	5,2
4 6А76		4, 9	8,5	6, 7	3, 6

- 30 018509

04ϋΗ511319
04ϋΗ312921
04РН311418
045Ν-41415
045Ν-41433
ΝΕ8ΤΑΚ	Подверженный контроль	6т 4

		3,8
		5, 6
		6,5
		5,8
		5, 3
5,2	5, 8	3,3

= мертвое растение.

= отсутствие симптомов заболевания.

Пример 6. Скрининг в теплице и вегетационной камере на устойчивость к 8с1егойша.

Разработка способов скрининга на устойчивость к 8с1егойша в теплице/фитотронах являлась одним из критических для успеха факторов в выведении устойчивых к 8с1егойша линий Вгакыса. Хорошо установлено, что получение надежных данных в скрининге на устойчивость к 8с1егойша является проблема тичным.

Следующий способ разработан для оценки реакции стеблей и/или листьев канолы на стеблевую гниль, вызванную 8с1егойша, в теплице и фитотроне. Этот способ использовали для выведения и скрининга устойчивых к 8с1егойша линий из примеров 1, 2, 3, 4 и 5. Хотя описанные способы нацелены на Вгакыса, следует понимать, что их можно использовать для любого растения, чувствительного к 8с1егойша, например, соевых бобов или подсолнечника.

Однородность.

8с1егойша взаимодействует как с окружающей средой, так и с растением, и развитие заболевания отражает все аспекты этого взаимодействия. Для получения наиболее точных результатов в селекции на устойчивость к 8с1егойша, необходимо достичь максимальной однородности (1) образцов растений (стадия роста, размер стеблей или листьев, место инокулирования), (2) инокулята и (3) окружающей среды (влажные камеры, фитотроны или оранжереи). Это является требованием для получения надежных дан ных.

8с1егойша и среды.

РОЛ (картофельно-декстрозный агар) можно использовать для размножения 8с1егойша. Среда богата питательными веществами, обеспечивающими быстрый рост гриба. Также ткань растения можно инфицировать с помощью РОЛ. Таким образом, РОЛ является очень хорошим для начальной пересадки и для ситуаций, где необходимо проявить более высокое или более быстрое воздействие инфекции, например, на очень поздних стадиях роста, или когда для образца требуется короткая продолжительность цикла.

Для более чувствительных тестов следует использовать РОЛ с низким содержанием питательных веществ. Рост мицелия и инфекционный процесс замедляется и растительный материал получает лучшую возможность для проявления своей типичной реакции. Также, инфекционный процесс можно более надежно прервать так, что отобранные растения получают лучшую возможность дать семена. Стадии, перечисленные ниже, могут представлять собой следующее.

Среды.

РОЛ - картофельно-декстрозный агар.

Ингредиенты сред1 л

РИА (картофельно-декстрозный агар)39 г

РОЛ с низким содержанием питательных веществ.

Ингредиенты сред1 л

РЭВ (картофельно-декстрозный бульон)12 г

Агар (31дта А-1296)15 г

1. Получить склероции изолята 8. §с1егойогит.

2. Разрезать склероции пополам в асептичных условиях и поместить отрезанной стороной вниз на чашку с РОЛ.

3. Инкубировать в темноте при 19°С (±3°С) в течение 72-90 ч или до тех пор, пока мицелий почти не достигнет края чашки. Можно использовать более низкие температуры для замедления роста (4-16°С).

4. Для инокулирования в теплице или фитотроне разрезать тампоны на приблизительно 2-4 мм в диаметре с использованием коркового сверла. Предпочтительно использовать тампоны из внешнего кольца мицелия, где мицелий однородно развит так, что все тампоны обладают сходным возрастом и качеством.

Способ инокулирования стебля.

Канолу можно инокулировать после удлинения стебля до физиологической степени зрелости, т.е. изменения цвета семян. В поле растение поражается в ходе стадии опадения лепестков. Как правило, рано инфицируемые растения более чувствительны и, следовательно, более старшие растения менее чувствительны. В зависимости от цели скрининга можно инокулировать в интервале от перед цветением до

- 31 018509 после цветения. Растения можно выращивать в 32-ячеечных стеллажах или 4-дюймовых (и более крупных) горшках. Более крупные и более сильные растения более устойчивы к 8с1егойша. Более мелкие и тонкие растения более чувствительны. Рекомендуется тестировать не междоузлия, а места рядом с узлами непосредственно над листовыми пазухами, чтобы стимулировать естественную инфекцию. Следует включить в скрининг чувствительные и/или частично устойчивые к 8с1его11П1а контроли.

Способ с использованием энтомологической иглы.

Для растений, тестируемых во влажной камере, можно использовать способ инокулирования иглой, например энтомологической иглой. Готовят 3-мм тампон (±1 мм) и протыкают иглой, например энтомологической иглой из нержавеющей стали от № 1 до 3. Иглу используют для обеспечения прикрепления тампона, несущего мицелий, к стеблю. Способ дает возможность тестировать большое количество растений. Растения могут являться тонкими, например, при выращивании в 32-ячеечных стеллажах. Стадии, перечисленные ниже, могут представлять собой следующее.

1. Инокулирование можно осуществлять в одном или нескольких местах на стебле в зависимости от цели эксперимента.

2. Поместить растения во влажную камеру или влажную окружающую среду на приблизительно 2060 ч или до начала развития симптомов. Наблюдать реакцию чувствительных и/или частично устойчивых контролей. Удалить инокулят (инокулирование с ограниченным сроком) и прекратить инкубирование во влажных условиях, когда длина свежего повреждения на большинстве растений чувствительного и/или частично устойчивого контроля составит по меньшей мере 5-30 мм, в зависимости от цели скрининга. Длина повреждения является наиболее надежным параметром. Первоначальные выборки можно осуществить непосредственно после инкубирования в камере, так как начальная реакция является хорошим индикатором эффективности.

3. Переместить растения на стеллаж в теплице/фитотроне и зарегистрировать длину повреждения и стадию роста после инкубации там, где это необходимо. Обеспечить растениям отсутствие возможности высыхания. Стадию роста в случае необходимости можно зарегистрировать перед инокулированием.

4. Селекцию следует осуществлять относительно требуемой цели и контролей или относительно характеристик соседних растений.

5. В случае необходимости для экспериментальных целей измерять длину повреждения и степень тяжести заболевания (1-9) при достижении удовлетворительной дифференциации или после одной и двух недель. Это может варьировать в зависимости от прогрессирования развития заболевания на растениях. При ранжировании тяжести заболевания принимать во внимание длину повреждения, жесткость стебля и степень кольцевых повреждений.

6. Избегать проведения экспериментов по инокулированию в летние месяцы, когда температуры в теплице повышены. При необходимости эксперименты можно проводить в фитотроне, предпочтительно при повышенной влажности воздуха.

Использование энтомологических игл и тампонов небольшого диаметра с ΡΌΆ с низким содержанием питательных веществ с мицелием обеспечивает скрининг большого количества растений и обеспечивает множественные инокулирования одного растения для подтверждения реакции. Это очень важно при отборе и выведении наиболее устойчивых потомков для поля для дополнительного тестирования.

Шкала ранжирования для 8с1егойша (88Ό8 внутри помещения тяжесть заболевания 8с1егойша 8с1егойогит внутри помещения):

- преждевременно созревшее или мертвое растение;

- значительное повреждение, слабый и полностью окольцованный стебель;

- значительное повреждение >30 мм, жесткий и почти окольцованный стебель;

- небольшое повреждение <30 мм, жесткий и неокольцованный стебель;

- нет повреждения.

Промежуточные показатели можно определить, если тяжесть симптома попадает между определенными показателями.

Меньшую влажность и хорошо аэрируемую окружающую среду можно использовать после инфицирования для облегчения инфицированным цветущим растениям противостоять инфекции.

Способ инокулирования листьев.

Инокулирование листьев осуществляют для детектирования различий в уровнях устойчивости разных образцов. Его осуществляют на более ранних стадиях роста, чем инокулирование стебля, например, перед цветением, для раннего детектирования частичной устойчивости. Однако скрининг листьев, как правило, проводят во время цветения, и он может происходить в поле при оценивании целого растения. Так как листья более чувствительны к 8с1егойша по сравнению со стеблем, следует использовать ΡΌΆ с низким содержанием питательных веществ, если не указано иначе. Интактные листья можно инокулировать тампонами, или тампонами с энтомологическими иглами для целей тестирования и селекции. Стадии, перечисленные ниже, могут представлять собой следующее.

1. Крупномасштабный скрининг можно проводить во влажной камере. Важно, чтобы уровень влажности в камере являлся достаточно высоким для обеспечения возникновения инфекции, но не избыточным, так как свободная вода препятствует инфекции грибом.

- 32 018509

2. Взять 2-4-мм тампон предпочтительно из внешнего 1 см края колонии с однородным мицелиальным покрытием и поместить тампон в перевернутом виде на лист. Поместить тампон так, чтобы оставить по возможности больше области листа для развития повреждения.

3. Не пытаться измерить диаметр повреждения до тех пор, пока не образуется однородное развитие повреждений вокруг тампонов. Избегать наложения тампонов без хорошего контакта с листом. Если это происходит, то эти случаи не учитывать. Измерить диаметр повреждения листа в миллиметрах до того, как гриб достигнет конца доступной ткани листа на чувствительном контроле, или когда это считается подходящим.

4. Перенести образцы из влажной камеры после появления однородного повреждения вокруг тампонов (или хорошей разницы между чувствительными и устойчивыми контролями) и содержать образцы в условиях регулярной влажности. Визуальную селекцию относительно контролей или соседних растений осуществляют для обоих параметров, по сравнению с чувствительной(ыми) реакцией(ями) или сочетаниями умеренных и чувствительных реакций.

Пример 7. Скрининг в поле на устойчивость к 8с1егойша при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях.

Улучшения способов являлись критичными для успешного выведения устойчивых к 8с1его!1ша линий Вгаккюа. Хорошо установлено, что получение надежных данных в поле на ежегодной основе не является общепринятым. 8с1его!1ша приводит к сильному заболеванию, но оно развивается только во влажное лето с умеренными температурами. Ряд проблем становится критическим при скрининге на устойчивость к 8с1его!1ша в поле в годы, когда условия для 8с1егойша являются субоптимальными. Продолжительность влажного периода, качество воды, доступность инокулята и наличие сырого или влажного микроокружений вызывают развитие заболевания у сельскохозяйственной культуры. Хотя описанные способы нацелены на Вгаккюа, следует понимать, что способы можно применять для любого растения, подверженного инфекции 8с1егойша посредством аскоспор. Они включают в себя подсолнечник (гниль соцветий), сафлор (гниль соцветий), зрелую фасоль (гниль бобов), зрелый горох (гниль бобов), соевые бобы (гниль стебля и бобов), люцерну (заболевание цветков) и латук (полегание латука), Вагйт апй Ииапд 2001. См. также публикацию патентной заявки США 2003/0150016 для воздействия 8с1его!1ша на соевые бобы.

Критические проблемы в поле разрешали, как указано далее.

(a) Подходящий искусственный инокулят для непрерывного сбора данных: так как естественный инокулят не всегда образуется в поле, разработан инокулят, который мимикрирует инфицирование посредством лепестков. Носителем гриба могут являться семена масличного нуга (семена Сшхойа аЬукк1шса-Ыуег), колонизированные 8с1егойша и распространяемые во время полного опадения лепестков.

(b) Качество воды и 8с1егойша: первоначально использовали грунтовую воду для орошения полей, колонизированных 8с1егойша. Однако наблюдали отсутствие переноса инфекции в годы с небольшим количеством осадков и/или высокими, или низкими температурами. Тестами ш νίΙΐΌ подтверждено, что грунтовая вода ингибирует рост 8с1его!1ша. В ходе тестирования в лаборатории и в поле определено, что обработка деионизованной (ΌΙ) водой изменяет качество грунтовой воды достаточным образом для того, чтобы предотвратить ингибирование развития 8с1его!1ша. В дальнейшем ΌΙ-воду использовали для орошения экспериментальных участков в поле с экстремальным воздействием заболевания. Теоретически, обработанная деионизованная вода отличается от исходной грунтовой воды тем, что минералы, например магний и кальций (известь), удаляются, в то время как рН не изменяется. 8с1егойша производит щавелевую кислоту, диффундирующий токсин, для облегчения инфекционного процесса (И8 6380461). Кальций может связываться со щавелевой кислотой с образованием оксалата кальция. Удаление кальция весьма вероятно представляет собой количественное изменение в деионизованной воде, которое дает возможность роста 8с1егойша. Следовательно, можно использовать источник воды с низким содержанием минералов или с отсутствием минералов, например, с уменьшенным количеством магния и кальция или их отсутствием.

(c) Орошение, производимое посредством датчиков влажности листьев: для обеспечения постоянной влажности в поле используют датчики влажности листьев (СатрЬе11 8с1епЦПс), которые запускают орошение, только если влажность ниже, чем установленная пороговая величина. Оптимизированное орошение обеспечивает развитие заболевания и повышает эффективность скрининга на устойчивость к заболеванию. Однако избыточное орошение может препятствовать достоверному оцениванию. В частности, в экспериментальной обстановке с рядами уникальных генотипов в непосредственной близости, полегание одного образца может привести к переносу патогена при контакте растения с растением и повысить распространенность заболевания у второго генотипа. Таким образом, показатель устойчивости к 8с1его!1ша для второго генотипа может занижать его потенциальные характеристики в более однородной популяции. Согласно данным по испытаниям в поле в естественных условиях, избыточное орошение может создавать окружение, более благоприятное для 8с1его!1ша, посредством усиления полегания, превышающего обычное для данного генотипа. Таким образом, характеристики испытуемых образцов можно исказить вследствие избыточного орошения, такого как произошедшее в тесте ΝΏδυ в 2005 (см. фиг. 2).

- 33 018509 (б) Обеспечение покрытием, которое облегчает поддержание микроокружения, необходимого для развития заболевания: для обеспечения развития заболевания в сухие, жаркие и/или ветреные периоды можно использовать сетчатое покрытие.

Эти новые способы, объединенные с усилиями по селекции и скрещиванию, описанными выше, позволили осуществить тщательную селекцию устойчивых к 8с1егойша линий канолы. Новые способы обеспечивают контролируемое развитие заболевания, надежную экспрессию фенотипа и получение характеристик многих разных линий в оптимальных условиях для 8с1егойша для осуществления прогресса, показанного на гистограмме фиг. 1.

Следующий способ разработан для скрининга на устойчивость к 8с1егойша в поле.

Однородность 8с1егойша взаимодействует с окружающей средой и растением. Полученные данные отражают все аспекты этого взаимодействия. Для уменьшения вариабельности требуется максимальная однородность (1) растительного материала, (2) инокулята и (3) окружающей среды. Это является предпосылкой для получения надежных данных.

Селекция на участке/план эксперимента/посадка.

1. Определить участок, который можно колонизировать склероциями для естественного резервного инокулята вместе с искусственным инокулятом. Если участок не колонизирован склероциями, то можно попытаться получить склероции с помощью инфицирования альтернативных хозяев, таких как соевые бобы или белые бобы, инокулировать с использованием носителя, такого как семена масличного нуга, или внести склероции непосредственно.

2. Посадить образцы на участках или рядах в параллелях, если возможно. Использовать рандомизированный полноблочный план (КСВЭ) с подходящими чувствительными и/или устойчивыми контролями (в КСВЭ каждая единица экспериментального материала присутствует в каждом из блоков (параллелях)). Стараться осуществлять небольшие эксперименты для уменьшения ошибки вследствие изменения окружающей среды. Следует использовать текущие контроли, и характеристики выражать относительно контролей. Степень зрелости контролей должна соответствовать степени зрелости тестируемых линий.

3. Стараться выращивать сомкнутую и здоровую культуру канолы для стимулирования развития заболевания. Нормы расхода семян должны являться одинаковыми. Предпочтительна точная посадка, или растения можно прореживать до одинакового количества растений. Для стимулирования развития заболевания, рассмотреть использование защиты от ветра посредством посадки полос или дополнительных проходов и/или установки сетчатого покрытия вокруг сельскохозяйственной культуры или над ней.

Подходящая окружающая среда/орошение/резервная естественная инфекция.

Развитие стеблевой гнили, вызванной 8с1егойша, зависит от окружающей среды, и наличия инокулята не достаточно, если только в сельскохозяйственной культуре не созданы подходящая влажность или влажное микроокружение. Относительный успех инфекции измеряют степенью, до которой поражаются чувствительные контроли в эксперименте.

Поскольку естественная инфекция редко является надежной или однородной, используют оросительные системы для стимулирования развития заболевания. Орошение можно начинать, как только сельскохозяйственная культура образует закрытый растительный покров так, что растительный покров может удерживать влагу. Перед началом цветения целью является поддержание влажным верхнего слоя почвы и помещение склероциев в условия для прорастания, чтобы обеспечить развитие апотециев для получения аскоспор для колонизации лепестков.

После колонизации лепестков целью является обеспечение прогрессирования заболевания к листьям и стеблям после достаточного опадения лепестков. Этот перенос происходит естественно в годы с продолжительными сырыми или влажными условиями. Датчики влажности листьев регулируют влажность растительного покрова посредством включения орошения при высыхании растительного покрова. Перенос заболевания можно ингибировать грунтовой водой (в особенности, при низких температурах), поэтому, если возможно, использовать собранную дождевую воду или деионизованную грунтовую воду. Влажность растительного покрова необходима до тех пор, пока инфекция стеблей на чувствительных контролях не разовьется полностью.

Хотя окружающая среда важна для развития заболевания, достигаемая распространенность и тяжесть заболевания непосредственно связаны с синхронностью действия следующих факторов: подходящая окружающая среда, стадия роста и воздействие инокулята.

Сетчатое покрытие можно использовать для сохранения сырых или влажных условий и обеспечения развития заболевания.

Получение инокулята/искусственная инфекция.

Искусственный инокулят используют в качестве первичного инокулята для повышения воздействия заболевания на участке и обеспечения развития заболевания аналогично экстремальному воздействию заболевания. В этом случае естественный инокулят представляет собой резервный инокулят. Семена масличного нуга, колонизированные 8с1его11Н1а, можно использовать в качестве носителя для этой цели. Стадии, перечисленные ниже, могут представлять собой следующее.

1. Приготовить чашки с ΡΌΆ для 8с1егойп1а, инкубировать при 19°С (±3°С) в течение 3-6 суток или до тех пор, пока колонии почти не достигнут края чашки, как описано в примере 6.

- 34 018509

2. Поместить от пяти до шести тампонов с мицелием (2-4 мм в диаметре) в колбы с 200 мл (±100 мл) ΡΌΒ с 0,5 г/л стрептомицина для стимулирования образования свежего мицелия.

3. Инкубировать в темноте при 19°С (±3°С) в течение 2-3 суток на качалке при 1,2 об/мин.

4. Удалить ΡΌΒ из гифальной массы, гомогенизировать гифальную массу в измельчителе, добавить Т\\ееп™ (приблизительно 0,5 мл/л) и развести до 1-3 г (оптимально 2 г) свежего мицелия/1 л воды для инокулирования в поле. ΡΌΒ можно добавить снова после взвешивания мицелия. Для колонизации семян масличного нуга инокулятом использовать следующую процедуру: автоклавировать семена два раза с использованием соотношения Н₂О:семена масличного нуга 1:2. После охлаждения семян масличного нуга добавить приблизительно 100 мл ΡΌΒ на 500 г семян масличного нуга и инкубировать при комнатной температуре в темноте. Можно использовать неразбавленный ΡΌΒ или развести его при необходимости. После инкубации и завершения развития грибного инокулята на семенах высушить инокулят и измельчить комки семян. Это, как правило, занимает от 5 до 15 суток. Для стимулирования и усиления естественной инфекции инокулят можно наносить в ходе значительного опадания лепестков.

5. Быть уверенным, что достаточное количество инокулята семян масличного нуга находится в наличии перед цветением.

6. Колонизированные 8с1егобша семена масличного нуга сортируют по размеру перед нанесением. Колонизированные семена можно распространять над растениями рукой. Для крупномасштабного инокулирования для распределения семян масличного нуга можно использовать разбрасыватель удобрений или другое распространяющее оборудование, например аэрозольный распылитель. Нанесение следует осуществлять спереди и сзади каждого ряда.

7. Используют приблизительно 5-20 кг/га семян масличного нуга. Следует подтвердить однородность и качество распределения.

8. Целью нанесения семян масличного нуга является получение ряда повреждений листьев на растение, которые могут прогрессировать до развития инфекции стебля.

9. Нанесение колонизированных 8с1егобша семян масличного нуга при необходимости следует повторить.

Ранжирование.

Можно ранжировать процентную долю инфицированных растений и тяжесть заболевания (табл. 2 и 15) после развития планируемой распространенности и степени симптомов поражения стебля на чувствительных и/или устойчивых контролях. Рекомендуется осуществлять одно ранжирование при достижении требуемых различий. Последующие ранжирования менее надежны, так как на результатах может отражаться физическое воздействие на растительный покров и подрост в ходе первоначального ранжирования. Ранжирование корректируют относительно эффекта, который могут оказывать симптомы на урожайность поврежденного растения. Например, образование кольца на более низком стебле по сравнению с более высоким стеблем оказывает более заметный эффект на урожайность. Пораженные боковые соцветия уменьшают урожай стручков, которые находятся только на этом соцветии, в то время как поражение главного соцветия приведет к поражению стручков на целом растении. Это отражено в показателе 88Ό8; см. табл. 15.

Количество и расположение ранжируемых растений на ряд или участок следует определять относительно развития растения и заболевания в эксперименте. Воздействие заболевания обладает тенденцией быть наиболее однородным в середине рядов или участков. Атипичные и мелкие растения следует исключать из подсчета и предпочтительно удалять из ряда перед подсчетом или во время него. Прореживание в начале сезона может решить эту проблему. Если возможно, внешние растения не следует ранжировать.

Для обеспечения надежного сравнения материала и вклада изменений окружающей среды в испытания включают текущие контроли, такие как 46А65 и 46А76.

- 35 018509

Таблица 15 Руководство для оценки тяжести симптомов на основе отдельного растения в поле - 88Ό8 для Рюиеег в поле - тяжести заболевания 8с1его11П1а 5с1его1югит в поле. Числа в скобках обозначают общепринятую шкалу

Шкала 5303 для Рюиеег 1-9 Обще- принятая шкала 0-5 в скобках	Симптомы	Приблизительная потеря урожая
Главный стебель	Первичные ветви (от главного стебля)	Вторичные ветви (от первичных)	Стручки
1 (5)	Преждевременно созревшее растение мертвое				50
2(5)	Окольцованное и слабое - приведет к потере урожая				4 0-50
3(4)	Окольцованное, но с меньшей потерей урожая	Большинство - мертвые или отмирающие ветви			30-40
4 (3)	Окольцовано, по меньшей мере, 50%; Некоторое воздействие на урожай	Много мертвых или отмирающих ветвей			20-30
5 (2)	Очень значительное повреждение	Немного мертвых или отмирающих ветвей			10-20

5(2)	Значительное повреждение	Одна мертвая или отмирающая ветвь	Много мертвых или отмирающих ветвей	Много инфицированных стручков	5-10
7(1)	Среднее повреждение (-30 мм)	Окольцованн ая ветвь	Немного мертвых или отмирающих ветвей	Немного инфицированных стручков	1-5
8(1)	Незначительное повреждение	Ветвь с повреждением, не образующим кольца	Одна мертвая или отмирающая ветвь	Один инфицированный стручок	1
9(0)	Отсутствие симптомов	Отсутствие симптомов	Отсутствие симптомов	Отсутствие симптомов	0

Способы примеров 6 и 7 требовали значительного технического вмешательства человека, и их применяли для выведения устойчивых к 8с1егойша линий по настоящему изобретению. Значительное техническое вмешательство человека позволило осуществить круглогодичное тестирование отобранных растений и дало согласующиеся и воспроизводимые результаты. Кроме того, способ примера 7 обеспечивал

- 36 018509 получение условий для экстремального проявления заболевание каждый год, несмотря на естественную окружающую среду.

Пример 8. Получение инбредных линий, обладающих устойчивостью к 8с1етойша.

В табл. 13 описаны усилия по выведению инбредных линий и успех в выведении элитных инбредных растений в 2003 и 2004. Признак является сложным, включающим приблизительно 3-4 гена у растений из элитных скрещиваний, тестируемых в 2003/2004. Так как растения в популяции Т обладают характеристиками канолы (табл. 12), доступны разные подходы, как описано в табл. 13. Выделение признака (т.е. устойчивости к 8с1ето!1ша) осуществимо в прямых скрещиваниях, где элитные инбредные растения дают 50% наследственности (Р2).

ВС1 для устойчивых источников позволяет осуществлять более легкое выделение признака, но платой за это является более низкая доля генетического фона элитных инбредных растений. Возможно полностью выделить устойчивость с помощью селекции ВС2 или выше с устойчивыми фонами, если основной целью является выделение устойчивости, с меньшим учитыванием других вопросов селекции, например качества, гибридной мощности и т.д. ВС1 для чувствительных элитных растений нацелен на выделение элитных фонов (75%) и дающего устойчивость к 8с1ето!1ша признака, но выделение дающего устойчивость к 8с1ето!1ша признака становится более сложным.

После выделения элитных линий с устойчивостью в полевых условиях возможны новые способы селекции, где выделение устойчивости становится более осуществимым (элитное растение, устойчивое в поле, скрещиваемое с элитным растением, устойчивым в поле, например). Выделение устойчивости в таких скрещиваниях относительно легко, и растения Р1 можно подвергать удвоенной гаплоидизации, и устойчивые потомки генетически стабилизировать, т.е. придать им стойкость, для воспроизводимой и предсказуемой реакции.

Пример 9. Получение гибридов, обладающих устойчивостью к 8с1етойша.

Вследствие того, что частичная устойчивость не является доминантной, необходимо наличие устойчивости, как у мужских, так и у женских инбредных растений, включенных в получение гибридных семян. Таким образом, устойчивые в поле инбредные растения необходимо получать как в женских, так и в мужских пулах генетического материала. Гибридные сельскохозяйственные культуры известны по более высокой урожайности по сравнению с их инбредными компонентами вследствие гетерозиса на основе генетического расстояния между женским и мужским компонентами гибрида.

С помощью скрещивания хорошо установленных чувствительных женских и мужских инбредных растений (табл. 13) с устойчивыми к 8с1етойша линиями по настоящему изобретению выделяют элитные линии с устойчивостью в полевых условиях, обладающие разнообразными сочетаниями элитного фона и устойчивого фона (например, 25-75% элитного фона, как представлено в табл. 13). Такие вновь выведенные женские и мужские инбредные растения обладают как устойчивостью в полевых условиях, так и генетическим расстоянием, ранее полученным у их элитных, но чувствительных родительских линиях. Аналогично обычной селекции гибридов затем используют комплексное тестирование в поле для определения того, какие инбредные сочетания обеспечивают высокую урожайность, а также адекватный уровень устойчивости в полевых условиях к 8с1етойша.

После идентификации ряда элитных женских и мужских линий, пригодных для получения гибридов с высокой урожайностью и устойчивостью в полевых условиях к 8с1етойша, можно осуществить дальнейшее совершенствование с помощью скрещивания таких линий и получения инбредных растений, которые будут дополнительно обладать повышенной урожайностью, а также устойчивостью в полевых условиях к 8с1ето!1ша.

Следовательно, изобретение относится не только к подробно описанным здесь линиям, но к любому потомку или потомству, в частности потомству, полученному выделением удвоенных гаплоидных линий, обладающих признаком, дающим устойчивость к 8с1ето!1ша. Изобретение также относится к любым гибридам, полученным с использованием описанных здесь линий. Более того, изобретение относится к семенам, растительным клеткам и клеточному материалу, включая пыльцу и яйцеклетки, полученным из улучшенных растений, линий или потомства. Растительные клетки можно выделить из растений способами, известными специалистам в данной области. Например, см. Сйиоид е! а1. (1985); ВагкЬу, Т.Ь. е! а1. (8рппд 1996); КаПйа, К. е! а1. (1974); №гак1тйи1и, 8. е! а1. (8рппд 1988) и 8\\апкоп, Е. (1990).

Растения по настоящему изобретению можно применять для выращивания сельскохозяйственной культуры способами, известными специалистам в данной области. Более того, растения по настоящему изобретению можно применять для получения масла и кормовой муки. Семена из растений по настоящему изобретению можно применять для получения масла канолы способами, известными специалистам в данной области. Способ может включать раздробление семян, экстрагирование неочищенного масла из семян и рафинирование, обесцвечивание и дезодорирование неочищенного масла для получения масла канолы. Кормовую муку из канолы можно получить способами, известными специалистам в данной области. Следовательно, изобретение также относится к раздробленным семенам из растений по настоящему изобретению.

В заключение, растения по настоящему изобретению можно применять для селекции способами, известными специалистам в данной области, конкретные примеры которых описаны ниже.

- 37 018509

V. Дополнительные варианты осуществления изобретения.

Инбредные и гибридные линии из примеров 8 и 9 можно получить с использованием способов селекции растений, которые известны специалистам в данной области, как описано выше и как описано ниже. В дополнение к выведению инбредных и гибридных линий изобретение также направлено на способы применения устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению для достижения других целей селекции растений.

Один из таких вариантов осуществления представляет собой способ скрещивания устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению с другим растением канолы для получения популяции первого поколения растений Р1. Популяция растений первого поколения Р1, полученных данным способом, представляет собой также вариант осуществления по изобретению. Эта популяция первого поколения растений Р1 будет содержать, по существу, полный набор аллелей устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению. Как правило, в данной области гибрид Р1 рассматривают, как обладающий всеми аллелями каждого гомозиготного родителя. Рядовой специалист в данной области может использовать или пособия для селекционеров, или молекулярные способы для идентификации конкретного растения Р1, полученного с использованием устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению, и любое такое индивидуальное растение также относится к данному изобретению. Эти варианты осуществления также относятся к применению данных способов с трансгенными конверсиями или конверсиями одиночных генов устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению.

Другой вариант осуществления данного изобретения представляет собой способ с использованием устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению в селекции, который включает повторное возвратное скрещивание с устойчивыми к 8с1егойша линиями по данному изобретению любое количество раз. С использованием способов возвратного скрещивания или трансгенных способов, описанных здесь, способов конверсии одиночного гена, описанных здесь, или других способов селекции, известных рядовому специалисту в данной области, можно получать индивидуальные растения и популяции растений, которые сохраняют по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% генетического профиля устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению. Процентную долю наследственности, сохраненную в потомстве, можно измерить или анализом родословной, или с помощью использования генетических способов, таких как молекулярные маркеры или электрофорез. При анализе родословной в среднем 50% начальной зародышевой плазмы может передаваться линии потомства после одного скрещивания с другой линией, 25% после другого скрещивания с отличающейся линией и т.д. Молекулярные маркеры можно также использовать для подтверждения и/или определения родословной линии потомства.

Конкретный способ получения линии, полученной из устойчивых к 8с1егобша линий по данному изобретению, представляет собой следующее. Рядовой специалист в данной области может скрещивать устойчивую к 8с1егойша линию по данному изобретению с другим растением канолы, таким как элитная линия. Семена Р1, полученные из этого скрещивания, могут содержать одиночную копию 100% аллелей от устойчивой к 8с1егобша линии по данному изобретению и одиночную копию 100% аллелей другого растения. Семена Р1 можно выращивать с образованием однородной популяции и обеспечить самоопыление, таким образом, получая семена Р2. В среднем, семена Р2 могут получить 50% своих аллелей от устойчивой к 8с1егойша линии по данному изобретению и 50% от другого растения канолы, но разные индивидуальные растения в популяции могут содержать значительно большую процентную долю аллелей, полученных от устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению ^апд Б апб К. Βе^πа^бо, 2000, и Βе^πа^бо, К. апб А.Б. КаЫег, 2001). Семена Р2 можно выращивать, и селекцию растений можно основывать на внешнем осмотре и/или измерении признаков. Признаки, используемые для селекции, могут являться признаками, связанными с устойчивыми к 8с1егобша линиями по данному изобретению. Полученное потомство, которое обладает требуемыми признаками устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению, можно подвергать селекции, и урожай с каждого растения можно собирать по отдельности. Эти семена Р3 из каждого растения можно выращивать в индивидуальных рядах и обеспечить самоопыление. Затем можно собирать урожай с селектируемых рядов или растений из рядов и обмолачивать индивидуально. Отбор можно снова основывать на внешнем осмотре и/или измерениях требуемых признаков растений. Процесс выращивания и селекции можно повторять любое число раз до получения инбредного растения устойчивой к 8с1егобша линии по данному изобретению. Инбредное растение устойчивой к 8с1егобша линии по данному изобретению может содержать признак устойчивости к 8с1егойша.

Если другое растение канолы, с которым скрещивали устойчивую к 8с1егобша линию, также содержало гены устойчивости к 8с1егойша, то инбредное растение, полученное от потомства, может обладать устойчивостью к 8с1егобша на уровне, равном или большем уровня, которым обладает устойчивая к 8с1егобша линия по данному изобретению. Инбредное растение может содержать в среднем 50% генов, полученных от устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению, но разные индивидуальные растения в популяции могут содержать значительно большую процентную долю аллелей, полученных от устойчивых к 8с1его11п1а линий по данному изобретению. Процесс выведения в виде скрещивания, самоопыления и селекции можно повторять для получения другой популяции полученных из устойчивых к

- 38 018509

8с1его!1ша линий по изобретению растений канолы с в среднем 25% генов, полученных от устойчивой к 8с1его!1ша линии по данному изобретению, но разные индивидуальные растения в популяции могут содержать значительно большую процентную долю аллелей, полученных от устойчивой к 8с1его!1ша линии по данному изобретению.

Предыдущий пример можно модифицировать множеством способов; например, селекцию можно осуществлять или не осуществлять в каждом самоопыляющемся поколении, селекцию можно осуществлять до или после того, как происходит действительный процесс самоопыления, или индивидуальную селекцию можно осуществлять посредством сбора урожая с индивидуальных стручков, растений, рядов или участков в любой точке в течение описанного процесса селекции. Кроме того, способы удвоенной гаплоидной селекции можно применять на любой стадии процесса. Популяция растений, полученная из любого поколения самоопыления, также представляет собой вариант осуществления изобретения.

Другой вариант осуществления данного изобретения представляет собой способ получения гомозиготных устойчивых к 8с1его1нна линий скрещиванием устойчивой к 8с1егойша линии по данному изобретению с другим растением канолы и применением способов удвоенной гаплоидии к семенам Р1 или растению Р1, или любому поколению устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению, полученных самоопылением этого скрещивания.

Более того, это изобретение также относится к способам получения устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению скрещиванием устойчивой к 8с1его!1ша линии по данному изобретению с растением канолы и выращиванием потомства из семян, и повторением стадий скрещивания и выращивания с устойчивой к 8с1егойша линией по данному изобретению от 1 до 2 раз, от 1 до 3 раз, от 1 до 4 раз или от 1 до 5 раз, и самоопылением любое количество раз после первого, второго, третьего, четвертого или пятого скрещивания.

Таким образом, все способы с использованием в селекции одной или нескольких устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению являются частью данного изобретения, включая самоопыление, селекцию педигри, возвратные скрещивания, получение гибридов и скрещивания с популяциями. Все растения и популяции растений, полученные с использованием одной или нескольких устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению в качестве родителя, входят в объем этого изобретения. Уникальные профили молекулярных маркеров и/или протоколы селекции могут использовать рядовые специалисты в данной области для идентификации линий потомства или популяций потомства, полученных из одной или нескольких устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению.

Все растения, полученные с использованием устойчивой к 8с1егойша линии по данному изобретению в качестве родителя, входят в объем этого изобретения, включая растения, полученные из потомства, полученного из инбредных растений устойчивой к 8с1его!1ша линии по данному изобретению.

Дополнительный вариант осуществления изобретения представляет собой конверсию одиночного гена у устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению. Конверсия одиночного гена происходит, если последовательности ДНК вводят с помощью традиционных (без трансформации) способов селекции, таких как возвратное скрещивание. Последовательности ДНК, или встречающиеся в природе или трансгены, можно вводить с использованием этих традиционных способов селекции. Требуемые признаки, переносимые с помощью этого процесса, включают в качестве неограничивающих примеров модификацию фертильности, модификацию профиля жирных кислот, другие улучшения питательных свойств, улучшения промышленного применения, устойчивость к заболеванию, устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам и улучшения урожайности. Интересующий признак переносят от родителя-донора к рекуррентному родителю, в этом случае, описанному здесь растению канолы. Моногенные признаки могут получаться в результате переноса или доминантной аллели или рецессивной аллели. Селекцию потомства, обладающего интересующим признаком, осуществляют непосредственной селекцией по признаку, связанному с доминантной аллелью. Для селекции потомства по признаку, который переносят посредством рецессивной аллели, требуется выращивание и самоопыление первого возвратного скрещивания для определения того, какие растения несут рецессивную аллель. Для рецессивных признаков может потребоваться дополнительное тестирование потомства в поколениях из последующего возвратного скрещивания для определения наличия интересующего гена. Наряду с селекцией по интересующему признаку, потомство отбирают по фенотипу рекуррентного родителя. Следует понимать, что иногда дополнительные полинуклеотидные последовательности или гены переносятся вместе с интересующим признаком, возникшим из конверсии одиночного гена. Потомство, содержащее по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% генов от рекуррентного родителя, описанного здесь растения канолы, плюс содержащее признак, возникший из конверсии одиночного гена, рассматривают как конверсию одиночного гена устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению.

Следует понимать, что устойчивые к 8с1егойша линии по изобретению можно, посредством общепринятой манипуляции цитоплазматическими генами, ядерными генами или другими факторами, получить в мужской стерильной форме, как описано в рассмотренных ранее ссылках. Такие варианты осуществления также входят в объем настоящей формулы изобретения. Из устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению можно получить мужские стерильные растения любым из ряда способов, известных в данной области, включая использование механических способов, химических способов, самонесо

- 39 018509 вместимости, цитоплазматической мужской стерильности (или системы Одига или другой системы) или ядерной мужской стерильности. Термин получение мужского стерильного растения относится к использованию любых доступных способов для получения мужского стерильного варианта устойчивой к 8с1его1йиа линии по данному изобретению. Мужская стерильность может представлять собой или частичную или полную мужскую стерильность. Это изобретение также относится к семенам и растениям гибридов Е1, полученным с применением устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению.

Это изобретение также относится к применению устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению в культуре тканей. Как применяют здесь, термин растительная клетка включает растительные протопласты, культуры тканей из растительных клеток, из которых можно получить растения канолы, растительные каллусы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными у растений или частей растений, таких как эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, семена, цветки, колосья, стручки, листья, стебли, корни, кончики корней, пыльники, семядоли и т.п. Можно успешно получить культуру тканей, а также культуру микроспор для воспроизведения растений канолы (Сйиоид е1 а1. (1985); ВагкЬу, Т.Ь., е1 а1. (8ргтд 1996); Каййа, К., е1 а1. (1974); Ыага81тйи1и, 8., е1 а1. (8ргтд 1988); 8\уап5оп, Е. (1990)). Таким образом, из литературы очевидно, что состояние данной области таково, что эти способы получения растений являются, и являлись, общепринятыми в том смысле, что их используют в общепринятой практике, и степень их успешности очень высока.

Пригодность устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению также распространяется на скрещивания с другими видами. Как правило, подходящие виды будут относиться к семейству Вгакыса. В частности, устойчивые к 8с1егойша озимые линии могут являться источниками устойчивости в программах селекции для яровых или полуозимых линий. Устойчивые к 8с1егойша яровые линии могут являться источниками устойчивости в программах селекции для полуозимых или озимых линий. Все такие применения предусмотрены настоящим изобретением и составляют его часть.

Появление новых молекулярно-биологических способов позволило осуществить выделение и характеризацию генетических элементов с конкретными функциями, таких как кодирующие конкретные белковые продукты. Исследователи в области биологии растений усиленно интересовались конструированием геномов растений для содержания и экспрессии чужеродных генетических элементов, или дополнительных или модифицированных версий нативных или эндогенных генетических элементов, чтобы изменять признаки растения конкретным образом. Любые последовательности ДНК, или из разных видов или из того же вида, которые встроены в геном вида с использованием трансформации обозначают здесь собирательно как трансгены. Процесс трансформирования представляет собой встраивание ДНК в геном. В течение последних пятнадцати или двадцати лет разработано несколько способов получения трансгенных растений, и настоящее изобретение, в конкретных вариантах осуществления, также относится к трансформированным версиям заявленных устойчивых к 8с1егойша линий по данному изобретению.

Разработаны многочисленные способы трансформации растений, включая способы биологической и физической трансформации растений. См., например, М1к1 е1 а1. (1988). Кроме того, доступны экспрессирующие векторы и способы культивирования ίη уйго для трансформации растительных клеток или тканей и воспроизведения растений. См., например, Еуапк е1 а1. (1983), Вшйшд (1985) и ХУеЕ^Ьасй е1 а1., 1988.

Наиболее преобладающие типы трансформации растений включают конструирование экспрессирующего вектора. Такой вектор содержит последовательность ДНК, которая содержит ген под управлением регуляторного элемента или функционально связанный с ним, например, промотором. Вектор может содержать один или несколько генов, и один или несколько регуляторных элементов.

Генетический признак, который ввели в конкретное растение канолы с использованием способов трансформации, можно перенести в другую линию с использованием традиционных способов селекции, которые хорошо известны в области селекции растений. Например, способ возвратного скрещивания можно использовать для переноса трансгена из трансформированного растения канолы в элитную инбредную линию, и полученное потомство может содержать трансген. Также, если инбредную линию использовали для трансформации, то трансгенные растения можно скрещивать с другой линией для получения трансгенного гибридного растения канолы. Как применяют здесь, скрещивание может обозначать простое скрещивание X с Υ, или процесс возвратного скрещивания, в зависимости от контекста. Разные генетические элементы можно встраивать в геном растения с использованием трансформации. Эти элементы включают в качестве неограничивающих примеров гены и кодирующие последовательности, индуцибельные, конститутивные и тканеспецифичные промоторы, последовательности энхансеров, и сигнальные и направляющие последовательности. См. патент США 6222101, который приведен здесь в качестве ссылки.

С применением трансгенных растений согласно настоящему изобретению чужеродный белок можно вырабатывать в коммерческих количествах. Таким образом, способы селекции и размножения трансформированных растений, которые хорошо известны в данной области, дают множество трансгенных растений, с которых собирают урожай общепринятым способом, и чужеродный белок затем можно выделять из интересующей ткани или из общей биомассы. Выделение белка из растительной биомассы

- 40 018509 можно осуществить известными способами, которые рассмотрены, например, в Непеу апб Огг (1981).

Можно создать генетическую карту преимущественно посредством общепринятых полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (КЕЬР), анализа с помощью полимеразной цепной реакции (РСК) и простых повторяющихся последовательностей (88К), с помощью которой идентифицируют приблизительное расположение на хромосоме встроенной молекулы ДНК, кодирующей чужеродный белок. В качестве иллюстративных способов в данном отношении см. СНск апб Тйотркоп (1993). Информация, предоставляемая картой, относительно расположения на хромосоме пригодна для патентной защиты данного трансгенного растения. Если предпринято несанкционированное размножение, и произведены скрещивания с другой зародышевой плазмой, карту области интеграции можно сравнить с аналогичными картами для подозреваемых растений, для определения того, обладают ли последние общим происхождением с данным растением. Сравнения карт могут включать гибридизации, КЕЬР, РСК, 88К и секвенирование, которые все являются общепринятыми способами.

Аналогичным образом, с помощью настоящего изобретения растения можно генетически конструировать для экспрессии разнообразных фенотипов, представляющих агрономический интерес. Типичные трансгены, относящиеся к данному вопросу, включают в качестве неограничивающих примеров перечисленные ниже трансгены.

1. Гены, которые придают устойчивость к вредителям или заболеванию, и которые кодируют:

(A) Гены устойчивости растения к заболеванию. Защитные механизмы растений часто активизируются посредством специфического взаимодействия между продуктом гена устойчивости к заболеванию (К) у растения и продуктом соответствующего гена авирулентности (Αντ) в патогене. Сорт растения можно трансформировать клонированным геном устойчивости для создания растений, которые являются устойчивыми к конкретным штаммам патогена. См., например, 1оиек е! а1. (1993), Мшбтшок е! а1.

(B) Белок, придающий устойчивость к грибным патогенам, такой как оксалатоксидаза или оксалатдекарбоксилаза (АНон е! а1. (1998), и8 3303846 и и8 6297425).

(C) Белок ВасШик Шиттд1епкк, его производное или моделирующий его синтетический полипептид. См., например, Секег е! а1. (1986), где описаны клонирование и нуклеотидная последовательность гена δэндотоксина В!. Более того, молекулы ДНК, кодирующие гены δ-эндотоксина, можно приобрести у Атепсап Туре Си1!иге СоПесбоп (Мапаккак, УА), например, под инвентарным № АТСС 40098, 67136, 31995 и 31998.

(Ό) Лектин. См., например, описание у Уап Эатте е! а1. (1994), где описаны нуклеотидные последовательности нескольких генов связывающего маннозу лектина С1Ма т1п1а!а.

(Е) Витамин-связывающий белок, такой как авидин. См. заявку РСТ υ893/06487, содержание которой приведено здесь в качестве ссылки. В заявке описано применение авидина и гомологов авидина в качестве ларвицидов против насекомых-вредителей.

(Е) Ингибитор ферментов, например, ингибитор протеазы или протеиназы или ингибитор амилазы. См., например, АЬе е! а1. (1987) (нуклеотидная последовательность ингибитора цистеинпротеиназы риса), НииЬ е! а1. (1993) (нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей ингибитор I протеиназы табака), 8итйаш е! а1. (1993) (нуклеотидная последовательность ингибитора α-амилазы 8!гер!отусек шйокротеик) и патент США № 5494813 (Нерйет апб Аббпкоп, опубликованный 27 февраля 1996 г.).

(С) Специфичный для насекомых гормон или феромон, такой как экдистероид и ювенильный гормон, их вариант, основанный на них миметик, или их антагонист или агонист. См., например, описание у Наттоск е! а1. (1990), бакуловирусной экспрессии клонированной эстеразы ювенильного гормона, инактивации ювенильного гормона.

(H) Специфичный для насекомых пептид или нейропептид, который, при экспрессии, нарушает физиологию поражаемого вредителя. Например, см. описания у Кедап, ί. (1994) (получение экспрессии клонированной ДНК, кодирующей рецептор диуретического гормона насекомых), и Рга!! е! а1. (1989) (идентификация аллостатина у О1р1ор!ега рнп1а1а). См. также патент США № 5266317, Тота1кк1 е! а1., где описаны гены, кодирующие специфичные для насекомых паралитические нейротоксины.

(I) Специфичный для насекомых яд, вырабатываемый в природе змеей, осой и т.д. Например, см. Рапд е! а1. (1992), для описания гетерологичной экспрессии в растениях гена, кодирующего токсичный для насекомых пептид скорпиона.

(I) Фермент, отвечающий за избыточное накопление монотерпена, сексвитерпена, стероида, гидроксамовой кислоты, фенилпропаноидного производного или другой небелковой молекулы с инсектицидной активностью.

(К) Фермент, принимающий участие в модификации, включая посттрансляционную модификацию, биологически активной молекулы, например, гликолитический фермент, протеолитический фермент, липолитический фермент, нуклеаза, циклаза, трансаминаза, эстераза, гидролаза, фосфатаза, киназа, фосфорилаза, полимераза, эластаза, хитиназа и глюканаза, или природный или синтетический. См. заявку РСТ кО 93/02197 на имя 8со!! е! а1., в которой описана нуклеотидная последовательность гена каллазы.

Молекулы ДНК, которые содержат кодирующие хитиназу последовательности, можно получить, например, от АТСС под инвентарными № 39637 и 67152. См. также Кгатег е! а1. (1993), где описана нук

- 41 018509 леотидная последовательность кДНК, кодирующая хитиназу анкилостомы табака, и Ка\\'а11еск е! а1. (1993), где представлена нуклеотидная последовательность гена полиубиквитина иЫ4-2 петрушки.

(Ь) Молекула, которая стимулирует передачу сигнала. Например, см. описание у Βοΐе11а е! а1. (1994), нуклеотидных последовательностей клонов кДНК кальмодулина золотистой фасоли, и Спекк е! а1. (1994), где представлена нуклеотидная последовательность клона кДНК кальмодулина кукурузы.

(М) Пептид с гидрофобным моментом. См. заявку РСТ \У095/16776 (описание пептидных производных тахиплезина, которые ингибируют грибные патогены растений) и заявку РСТ ХУ095/18855 (описаны синтетические противомикробные пептиды, которые придают устойчивость к заболеванию), соответствующие содержания которых приведены здесь в качестве ссылки.

(Ν) Мембранная пермеаза, каналообразователь или блокатор канала. Например, см. описание у 1аупек е! а1. (1993), гетерологичной экспрессии литического пептидного аналога цекропина-β для придания трансгенным растениям табака устойчивости к Ρкеибοтοπак ко1апасеагит.

(O) Вирусный инвазивный белок или сложный токсин, полученный из него. Например, накопление белков вирусной оболочки в трансформированных растительных клетках придает устойчивость к развитию вирусной инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом, из которого получен белок оболочки, а также родственными вирусами. См. Беас11у е! а1. (1990). Устойчивость, опосредованную белком оболочки, сообщили трансформированным растениям к вирусу мозаики люцерны, вирусу мозаики огурца, вирусу стрика табака, вирусу X картофеля, вирусу Υ картофеля, вирусу гравировки табака, вирусу погремковости табака и вирусу табачной мозаики.

(P) Специфичные для насекомых антитела или полученный из них иммунотоксин. Таким образом, антитела направленные на ключевую метаболическую функцию в кишечнике насекомых могут инактивировать поражаемый фермент, убивая насекомого. Сравни Тау1ог е! а1. (1994) (ферментативная инактивация у трансгенного табака посредством получения одноцепочечных фрагментов антител).

(0) Вирусоспецифические антитела. См., например, Тау1абогак1 е! а1. (1993), где показано, что трансгенные растения, экспрессирующие гены рекомбинантных антител защищены от воздействия вируса.

Останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе патогеном или паразитом. Таким образом, грибные эндо-а-1,4-О-полигалактуроназы облегчают колонизацию грибом и высвобождение питательных веществ из растения растворением гомо-а-1,4-О-галактуроназой стенки растительных клеток. См. ЬатЬ е! а1. (1992). Клонирование и характеризация гена, который кодирует белок, ингибирующий эндополигалактуроназу бобов, описаны в ТоиЬаг! е! а1. (1992).

(8) Останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе растением. Например, в Ьодетапи е! а1. (1992), показано, что трансгенные растения, экспрессирующие ген ячменя, инактивирующий рибосомы, обладают повышенной устойчивостью к заболеванию, вызванному грибом.

(Т) Продукты генов, принимающие участие в реакции системной приобретенной устойчивости (8Ай), и/или генные продукты, связанные с патогенезом, Е^дк, 8. (1995).

(и) Фунгицидные генные продукты (Сотейккеп апб Ме1сйегк, (1993), Ρа^^^к е! а1. (1991), Β^^^Π е! а1. (1998)).

2. Гены, которые придают устойчивость к гербициду, например следующие.

(А) Гербицид, который ингибирует конус нарастания или меристему, такой как имидазолинон или сульфонилмочевина. Типичные гены в данной категории кодируют мутантный фермент АЬ8 и АНА8, как описано, например, в Ьее е! а1. (1988) и М1к1 е! а1. (1990) соответственно.

(Β) Глифосат (устойчивость, придаваемая генами мутантной 5-енолпирувил-3-фосфикиматсинтазы (ΕΡ8Ρ) и агоА соответственно) и другие фосфоносоединения, такие как глуфосинат (гены фосфинотрицинацетилтрансферазы, ΡАТ, и фосфинотрицинацетилтрансферазы 8!гер!отусек йудгоксорюик, Ьаг), и пиридинокси- или феноксипропионовые кислоты, и циклогексоны (гены, кодирующие ингибитор АССазы). См., например, патент США № 4940835, 811а11 е! а1., в котором описана нуклеотидная последовательность формы ΕΡ8Ρ, которая может придавать устойчивость к глифосату. Молекулу ДНК, кодирующую мутантный ген агоА, можно получить под инвентарным № АТСС 39256, и нуклеотидная последовательность мутантного гена описана в патенте США № 4769061, Сотак В европейской патентной заявке № 0333033, Китаба е! а1., и патенте США № 4975374, Сообтап е! а1., описаны нуклеотидные последовательности генов глутаминсинтетазы, которые придают устойчивость к гербицидам, таким как Ьфосфинотрицин. Нуклеотидная последовательность гена фосфинотрицинацетилтрансферазы представлена в европейской заявке № 0242246, Ьеетапк е! а1. (1989), в которой описано получение трансгенных растений, которые экспрессируют химерные гены Ьаг, кодирующие фосфинотрицинацетилтрансферазную активность. Примеры генов, придающих устойчивость к феноксипропионовым кислотам и циклогексонам, таким как сетоксидим и галоксифоп, представляют собой гены Асс1-81, Асс1-82 и Асс1-83, описанные в Магкйа11 е! а1. (1992).

(С) Гербицид, который ингибирует фотосинтез, такой как триазин (гены ркЬА и дк + ) и бензонитрил (ген нитрилазы). В Ργζι^11η е! а1. (1991) описана трансформация СЫатуботопак плазмидами, кодирующими мутантные гены ркЬА. Нуклеотидные последовательности генов нитрилазы описаны в патенте

- 42 018509

США № 4810648, 81а1кег, и молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступны под инвентарным № АТСС 53435, 67441 и 67442. Клонирование и экспрессия ДНК, кодирующей глутатион-3-трансферазу, описаны в Иауез е! а1. (1992).

3. Г ены, которые придают или сообщают признак с дополнительными положительными характеристиками, такой как следующее.

(A) Модифицированный метаболизм жирных кислот, например, посредством трансформирования растения антисмысловым геном стеароил-АСР-десатуразы для повышения содержания стеариновых кислот в растении. См. КпиНхоп е! а1. (1992).

(B) Сниженное содержание фитатов.

(1) Введение гена, кодирующего фитазу, может усилить расщепление фитата, дополнительно увеличивая содержание свободного фосфата в трансформированном растении. Например, см. Уап (1993) для описания нуклеотидной последовательности гена фитазы АзрегдШиз шдег.

(2) Можно вводить ген, который уменьшает содержание фитата. У кукурузы это можно осуществить, например, клонированием и, затем, повторным введением ДНК, ассоциированной с одиночной аллелью, которая отвечает за мутанты кукурузы, характеризуемые низким содержанием фитиновой кислоты. См. ВаЬоу е! а1. (1990).

(C) Измененное сочетание углеводов, вызываемое, например, трансформированием растений геном, кодирующим фермент, который изменяет характер ветвления крахмала. См. 81нгоха е! а1. (1988) (нуклеотидная последовательность гена фруктозилтрансферазы 8!гер!ососсиз ти!апз), 81етте1х е! а1. (1985) (нуклеотидная последовательность гена левансахаразы Васх11из зиЬ!Шз), Реп е! а1. (1992) (получение трансгенных растений, которые экспрессируют α-амилазу ВасШиз КсНетГ огт1з), ЕШо! е! а1. (1993) (нуклеотидные последовательности генов инвертазы томатов), 8одаагб е! а1. (1993) (сайт-специфический мутагенез гена α-амилазы ячменя), и Изйег е! а1. (1993) (ветвящий фермент крахмала эндосперма кукурузы ΙΙ).

(Ό) Снижение количества зеленых семян посредством отрицательной регуляции гена САВ в семенах канолы (Мопзе!!е е! а1., 1997).

(Е) Увеличение количества олеиновой кислоты посредством модификации гена ЕАЭ-2 и/или снижение количества линоленовой кислоты посредством модификации гена ЕАЭ-3 (см. патенты США 6063947, 6323392 и \\'О 93/11245).

4. Гены, которые регулируют опыление или образование гибридных семян; например, патент Канады 2087703.

Промышленное применение

Семена устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению, растение, полученное из таких семян, гибридное растение канолы, полученное из скрещивания устойчивых к 8с1его!1ша линий по данному изобретению, полученные гибридные семена и разные части гибридного растения канолы можно применять в получении пищевого растительного масла или других пищевых продуктов в соответствии с известными способами. Например, способ получения масла канолы может включать: (а) раздавливание семян канолы; (Ь) экстрагирование неочищенного масла и (с) рафинирование, обесцвечивание и дезодорацию неочищенного масла для получения масла канолы. Остающийся твердый пищевой компонент, полученный из семян, можно применять в качестве питательного корма для скота.

V!. Депонирования.

Осуществлены определенные депонирования семян в Атепсап Туре Си1!иге Со11есйоп (АТСС), Мапаззаз, VI гд1п1а 20852, которые представляют собой депонирования, включающие 2500 семян каждого из 028Ν41269 (Е4), РТА-6777; 04ΌΗ812921 (удвоенный гаплоид), РТА-6781; 038Ν40341 (Е4), РТА-6776; 04ΌΗ811319 (удвоенный гаплоид), РТА-6780; 038Ν40441 (Е4), РТА-6779; 04ΌΗ811418 (удвоенный гаплоид), РТА-6778. Семена, депонированные в АТСС, относились к и поддерживались Рюпеег Ηί-Вгеб Ιΐ'ΐ1егпа1юпа1, Шс., 800 Сарйа1 8цнаге, 400 Ьосиз! 8!гее!, Эез Мошез, йга 50309-2340, с тех пор до даты регистрации данной заявки. Депонирования будут поддерживаться в хранилище АТСС, которое является общедоступным хранилищем, в течение периода 30 лет, или 5 лет после самого последнего запроса, или в течение срока годности патента, независимо от продолжительности, и будут заменены, если они станут нежизнеспособными в течение этого периода. Кроме того, заявитель выполнил все требования 37 С.Е.В. разделов 1.801-1.809. Заявитель не налагает ограничений на доступность депонированного материала в АТСС; однако заявитель не обладает полномочиями отменять любые ограничения, наложенные законом на передачу биологического материала или его транспортирование в коммерческих целях. Заявитель не отказывается от любого нарушения своих прав, предоставленных данным патентом. Доступ к данным депонированиям будет доступен в течение рассмотрения заявки для Комиссара по патентам и торговым маркам и для лиц, назначенных Комиссаром, чтобы предоставлять на это право при запросе. Заявитель не отказывается от любого нарушения своих прав, предоставленных в чем-либо данным патентом и/или Законом об охране сортов растений (7 И8С 2321 и далее).

- 43 018509

Дополнительные депонирования семян осуществлены в мае 2006 года в ΝΟΙΜΒ Ь1б., АЬегбееп, 8сойапб, общедоступное хранилище, признаваемое Вибарек! Тгеа1у. как указано далее:

ΝΟΙΜΒ 41388 ВгаззЮа парив 043Ν 41415

ΝΟΙΜΒ 41389 Вгав&'са парив 045Ν 41433 ΝΟΙΜΒ 41390 Вгазз/са парив 05ЮНЗ12879 ΝΟΙΜΒ 41391 Вгаззюа парив 05ϋΗ512897

Дата депонирования 12 мая 2006 г.

ΝΟΙΜΒ 41392 Вгаввкза парив 04СУУВ 930015

ΝΟΙΜΒ 41393 Вгазв/са парив 04СУУВ 930081 ΝΟΙΜΒ 41394 Вгаззюа парив 04СЭДВ 930111 ΝΟΙΜΒ 41395 Вгаззка парив 04СУУВ 930127 ΝΟΙΜΒ 41396 ВгавзЮа парив 04С\Л/В 930128 ΝΟΙΜΒ 41397 Всав^са парив 04СУУВ 930135 ΝΟΙΜΒ 41398 Вгавз1са парив 04С1Л/В 930144

Дата депонирования 15 мая 2006 г.

Подробности относительно этих депонированных линий представлены в табл. 11а и 11Ь. В каждом случае депонировано 3000 семян, за исключением ΝΟΙΜΒ 41393, для которого депонировано только 400 семян вследствие ограниченного количества. При необходимости можно осуществить дополнительное депонирование.

Кроме того, осуществлено депонирование изолята 88#4 8с1егойша кс1егойогит в йИегпайогий Эерокбагу Либтогбу оГ Сапаба, ЭДбпйред, МапбоЬа, 17 мая 2006 г., и назначен инвентарный номер 17050601. Этот изолят использовали в ходе всего скрининга в закрытом помещении и способов селекции, и при экстремальном воздействии заболевания в экспериментальных полевых условиях, описанных здесь. Данные исследований в поле в естественных условиях, такие как представленные в табл. 9, отражают тестирование по сравнению с естественной популяцией 8с1егойша и подтверждают эффективность усилий по селекции с использованием изолята 88#4.

Вышеупомянутое изобретение подробно описано посредством демонстрации и примера с иллюстративными целями. Однако будет очевидно, что изменения и модификации, такие как модификации одиночного гена и мутации в нем, сезонные варианты, варианты индивидуумов, отобранные из популяций растений описанных линий и т.п., рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения. Все описанные здесь ссылки, или на журнал, патенты, опубликованные заявки или им подобное, приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Следует понимать, что определенные модификации должны являться и будут очевидными для рядовых специалистов в данной области и что такие модификации конкретных линий, сортов и способов, описанных в изобретении, предназначены входить в объем изобретения.

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Потомство растения Вгаккка, полученное способом, включающим следующие стадии:

   (a) скрещивание растений, выбранных из группы, содержащей:

   (ί) растения, имеющие яровой характер роста и представляющие собой линии АТСС РТА-6776, РТА-6779, РТА-6777, РТА-6781, РТА-6780 или РТА-6778 либо линии ^1МВ 41388, 41389, 41390 или 41391;

   (б) растения, имеющие озимый характер роста и представляющие собой линии NСIМВ 41392, 41393, 41394, 41395, 41396, 41397 или 41398, с другими растениями Вгаккка для получения семян;

   (b) выращивание семян Вгаккка, полученных на стадии (а), для получения растений;

   (c) необязательное повторение стадий скрещивания (а) и выращивания (Ь) для последующих поколений, с получением дополнительных растений, происходящих из родительских растений Вгаккка; и (б) отбор растения-потомка, у которого:

   (ί) уровень глюкозинолата в твердом веществе семян растения-потомка составляет менее чем 30 мкмоль/г;

   (б) масло семян растения-потомка содержит менее чем 2% эруковой кислоты;

   (ш) указанное растение-потомок имеет 50%-ный период цветения между приблизительно 30-90 сутками;

   (ίν) растение-потомок обладает показателем 88ΌΙ% (распространенности заболевания, вызванного 8с1егобша кскгобогит, в %), составляющим менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для растений Вгаккка:

   - 47 018509 (1) Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А76, или Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с яровым характером роста, или (2) сорта Со1итЬик, или сорта Ехргекк, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с озимым характером роста, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле.
2. 2. Семя растения по п.1.
3. 3. Клетка растения по п.1.
4. 4. Применение растения по п.1 для получения масла или муки.
5. 5. Способ получения масла, включающий:

   (a) раздавливание семян, произведенных растением по п.1, и (b) экстракцию неочищенного масла из таких раздавленных семян.
6. 6. Способ по п.5, дополнительно включающий:

   (c) рафинирование, обесцвечивание и/или дезодорацию указанного неочищенного масла.
7. 7. Растение по п.1, где указанное растение обладает мужской стерильностью.
8. 8. Способ получения потомства растения Вгаккюа, у которого:

   (ί) уровень глюкозинолата составляет менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества семян растения-потомка;

   (ίί) масло семян растения-потомка содержит менее чем 2% эруковой кислоты;

   (ίίί) указанное растение-потомок имеет 50%-ный период цветения между приблизительно 30-90 сутками;

   (ίν) растение-потомок обладает показателем 88ΌΙ% (распространенности заболевания, вызванного 8с1его!1ша кс1егойогит, в %), составляющим менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для:

   (1) Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А76, или Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с яровым характером роста, или (2) сорта Со1итЬик, или сорта Ехргекк, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с озимым характером роста, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле, включающий удвоение гаплоидности растений, выбранных из группы, содержащей:

   (ί) растения, имеющие яровой характер роста и представляющие собой линии АТСС РТА-6776, РТА-6779, РТА-6777, РТА-6781, РТА-6780 или РТА-6778 либо ΝΠΜβ 41388, 41389, 41390 или 41391;

   (ίί) растения, имеющие озимый характер роста и представляющие собой линии Ж'ЧМВ 41392, 41393, 41394, 41395, 41396, 41397 или 41398.
9. 9. Способ получения потомства растения Вгаккюа, включающий:

   (a) скрещивание растений, выбранных из группы, содержащей:

   (ί) растения, имеющие яровой характер роста и представляющие собой линии АТСС РТА-6776, РТА-6779, РТА-6777, РТА-6781, РТА-6780 или РТА-6778 либо линии ΝΠΜβ 41388, 41389, 41390 или 41391;

   (ίί) растения, имеющие озимый характер роста и представляющие собой линии NСIΜВ 41392, 41393, 41394, 41395, 41396, 41397 или 41398, с другими растениями Вгаккюа для получения семян;

   (b) выращивание семян Вгаккюа, полученных на стадии (а), для получения растений;

   (c) необязательное повторение стадий скрещивания (а) и выращивания (Ь) для последующих поколений, с получением дополнительных растений, происходящих из родительских растений Вгаккюа; и (й) отбор растения-потомка, у которого:

   (ί) уровень глюкозинолата составляет менее чем 30 мкмоль/г не содержащего масла твердого вещества семян растения-потомка;

   (ίί) масло семян растения-потомка содержит менее чем 2% эруковой кислоты;

   (ίίί) указанное растение-потомок имеет 50%-ный период цветения между приблизительно 30-90 сутками;

   (ίν) растение-потомок обладает показателем 88ΌΙ%, составляющим менее чем приблизительно 60% показателя 88ΌΙ% для растений Вгаккюа:

   (1) Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А76, или Рюпеег Ηί-Вгей сорта 46А65, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с яровым характером роста, или (2) сорта Со1итЬик, или сорта Ехргекк, или среднего значения показателя 88ΌΙ% для двух сортов в случае растения с озимым характером роста, в одних и тех же условиях окружающей среды и заболеваемости в поле.
10. 10. Способ получения масла, включающий:

    (a) раздавливание семян, полученных, как раскрыто в способе по п.9;

    (b) экстракцию неочищенного масла из таких раздавленных семян.
11. 11. Способ по п.10, дополнительно включающий:

    (c) рафинирование, обесцвечивание и/или дезодорацию указанного неочищенного масла.