CN101243188B - 抗核盘菌芸苔及开发抗核盘菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了平均菌核病发病率(SSDI％)得分比合适的参照变种的SSDI％得分低约60％的芸苔系。也提供了在温室、小温室和田间筛选核盘菌抗性的方法学。

Description

抗核盘菌芸苔及开发抗核盘菌的方法

技术领域

本发明涉及抗核盘菌(Sclerotinia)芸苔(Brassica)。本发明也涉及在温室和田间筛选抗核盘菌的新方法。

发明背景

核盘菌可感染100多种植物，包括各种重要的经济农作物，例如芸苔、向日葵、芸豆、大豆、紫花豌豆、小扁豆、莴苣及马铃薯(Bolandand Hall，1994)。油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)可引发99％以上的菌核病，而小核盘菌(Sclerotinia minor)只引发少于1％的该种病害。核盘菌可产生带菌核的、形状不规则的、黑色的、可过冬的菌体，它可在土壤中存活4到5年。菌核根据环境状况及农作物冠层(canopy)可按子实体或菌丝体方式萌发。这两种类型的萌发可导致两种截然不同的病害。按子实体萌发的菌核产生可感染地上组织的子囊盘和子囊孢子，从而导致植物的茎枯萎、梗腐、顶部腐烂、荚腐、白霉病及花簇枯萎。按菌丝体萌发的菌核可产生感染根组织的菌丝体，从而导致根冠腐烂、根腐及基部茎杆腐烂。

核盘菌可在包括卡诺拉(canola)在内的芸苔中引发核盘菌茎腐，也称之为白霉病。卡诺拉是一种在种子中含有低水平芥子油苷与芥酸的芸苔。在夏季菌核按子实体方式萌发，产生子囊盘。子囊盘可释放能传播1千米以上的靠风传送的子囊孢子。在卡诺拉开花前或开花期，潮湿的土壤条件(在或接近最高有效水量的情况下至少10天)和15-25℃的温度可促进病害。孢子不能直接感染叶片和茎，他们必须首先落在茎和叶片上的花上、脱落的花瓣上以及花粉上。花龄影响感染效率，越老的花瓣越容易被感染(Heran et al.，1999)。真菌孢子在萌发并感染植物时，利用花部分作为食物来源。

在芸苔中核盘菌的严重度是不同的，依赖于感染时间及气候条件(Heran et al.，1999)。凉爽的温度和延长的降水期可促进病害。最适植物感染所需的温度在20和25℃之间、相对湿度大于80％(Heran et al.，1999)。已报道在不同田间的损失为5到100％(Manitoba Agriculture，Food and Rural Initiatives，2004)。平均而言，产量损失为感染百分比的0.4到0.5倍。例如，如果田地有20％受感染(20/100感染植物)，那么产量损失为约10％。此外，核盘菌可在潮湿的割刈地带造成严重的损失。在1999年、2000年和2001年，核盘菌在明尼苏达州和北达科他州给卡诺拉栽培者分别造成了1730、2080和1680万美元的经济损失(Bradley et al.2006)。

核盘菌感染的症状通常在开花后的几周内逐步显示出来。植物在位于或高于土壤线以及上部的枝或荚上展现出浅灰色到白色的枯斑。感染通常发生在叶片和茎的连接处，是因为被感染的花瓣在那里倒伏。一旦植物被感染，则霉菌继续向茎中生长并侵入健康组织。被感染的茎表现为褪色并易于破裂。深黑色的真菌菌核在感染的茎、枝或荚中发育。在花期被感染的植株产生很少或不产生种子。环剥了茎的植株会枯萎并过早成熟。严重感染的农作物通常在收割处倒伏、破碎，使得收割更为耗时。感染可发生在植物所有的地上部分，在密集或堆积地带尤为如此，在那里植株与植株的接触帮助了感染的蔓延。新菌核可将病害带到下个季节。

控制菌核病的传统方法包括：(a)化学控制、(b)病害抗性及(c)培养控制，下面对它们进行一一介绍。

(a)诸如苯菌灵、烯菌酮及咪唑霉这样的杀真菌剂仍是控制菌核病的主要方法(Morall et al.，1985；Tu，1983)。近来，也开发了其它的杀真菌剂配方用于抵抗核盘菌，包括嘧菌酯、丙硫菌唑和啶酰菌胺(Boscalid)(Johnson 2005)。但是，使用杀真菌剂比较昂贵，而且对于使用者及环境有害。另外，由于重复使用已对某些杀真菌剂产生了抗性。

(b)在豆、红花、向日葵和大豆某些栽培种中，可进行一些改进以产生部分(不完全的)抗性。部分抗性通常是指耐受性。不过，成功开发部分抗性是非常有限的，可能是因为部分生理抗性如在豆中所揭示的那样是一个多基因性状(Fuller et al.，1984)。除了部分生理抗性外，也可对譬如直立生长习性、抗倒伏性以及狭窄的冠层这样的形态性状进行某些改进，以避免核盘菌感染。例如，具有部分生理抗性并具有直立姿态、狭窄冠层及不确定的生长习性的豆类植物最能避免核盘菌(Saindonet al.，1993)。红花的早期成熟培养品种对核盘菌具有很好的田间抗性。最后，在大豆中，诸如高度、早期成熟及优异的抗倒伏性这样的培养性状可减少病害，这主要是因为降低了对病害有利的微气候环境(Bolandand Hall 1987；Buzzell et al.1993)。

(c)诸如使用不含病原体或者用杀真菌剂处理过的种子、增加行间距、降低播种率以减少病害的次级传播、以及掩埋菌核以防止子实体萌发这样的培养实践，可减少菌核病，但不能有效地控制该病害。

所有的加拿大卡诺拉基因型对核盘菌茎腐都是敏感的(ManitobaAgriculture，Food and Rural Initiatives，2004)。包括所有已知的春天开花的卡诺拉品种的基因型。澳大利亚卡诺拉变种对核盘菌也没有抗性(Hind-Lanoisel et al.2004)。某些具有特定形态性状的变种可以更好地抵抗核盘菌感染。例如，波兰变种(Brassica rapa)具有更高的冠层，表现出更低的感染水平。另外，花瓣较少的变种(无花瓣变种)也可在更大程度上避免核盘菌感染(Okuyama et al.，1995；Fu，1990)。芸苔基因型中其它的可在一定程度上降低田间敏感性的形态性状包括增加的直立性、减少的花瓣维持、分枝(更疏松和/或更高)以及早期叶脱落。Jurke和Fernando(2003)筛选了11个卡诺拉基因型来研究菌核病发病率。通过植物形态来解释病害发病率之间的显著性差异，鉴定出花瓣维持上的差异是最为重要的因素。不过，单单是这些形态性状不会赋予对核盘菌的抗性，在加拿大所有的卡诺拉产品均对核盘菌敏感。

越冬的卡诺拉的基因型也对核盘菌敏感。例如，在德国，没有抗核盘菌的变种(Specht，2005)。广布的德国变种Express被认为是敏感至中等敏感的，并且属于敏感程度更低的变种/杂合子一类(参见表4)。

对处于花期并生长在利于病害的条件下的卡诺拉农作物，喷洒杀真菌剂是唯一的控制核盘菌的手段。典型的用于控制芸苔上的核盘菌的杀真菌剂包括产自Bayer的Rovral^TM和产自BASF的Ronilan^TM/Lance^TM。Lance^TM中的活性成分是啶酰菌胺，它在美国以Endura^TM销售。应该在出现茎腐症状之前，通常是在农作物20-30％的开花期时使用杀真菌剂。如果感染已经很明显了，那么使用杀真菌剂也没有作用，因为已经太晚了不会有效果的。因此，栽培者必须估计其田间病害的危险性以决定是否使用杀真菌剂。这可通过使用政府提供的清单或者通过使用花瓣检测试剂盒来完成。其中每种方法都是很繁琐的，而且容易出错(Hind-Lanoiselet 2004；Johnson 2005)。

已进行了很多工作来开发抗核盘菌的芸苔植物。内在固有的抗性比通过使用杀真菌剂来控制核盘菌更为方便、更为经济、对环境更有利。由于性状是多基因遗传的，所以它比较稳定，不像杀真菌剂那样容易丧失有效性。

春季生长的卡诺拉(Brassica napus subsp.oleifera var.annua)不同于越冬的卡诺拉(Brassica napus subsp.oleifera var.biennis)，主要是没有了必需的春化作用。亚洲油菜籽(Rapeseed)和卡诺拉品种对春化作用具有低度到中度需求，因此被视为半越冬类型。在春季种植越冬卡诺拉时，它无法完成繁殖周期，而早春种植并暴露在低温中可使亚洲品种开花并结籽。若在晚春种植，则亚洲品种无法完成其繁殖周期。在可控条件下，越冬品种需要12-14周的春化作用，而亚洲品种需要2-8周。表1总结了在越冬、半越冬(亚洲)和春季卡诺拉变种之间的差异。

表1.在欧洲油菜(Brassica napus)品种中生长习性的主要测定

^*加拿大、欧洲和澳大利亚的春季品种可在任何适于春季卡诺拉的环境或播种时间种植并生长。

某些中国(半越冬)油菜籽/卡诺拉栽培种对核盘菌具有部分抗性。例如，ChunYun et al.，2003；HanZhong et al.，2004；XeiXin et al.，2002；YongJu et al.，2000；ChaoCai et al.，1998描述了具有部分抗性的油菜籽变种。但这些变种中有一些不是卡诺拉品系，而且它们均需要春化作用。中国变种中的部分田间抗性主要来自油菜籽变种Zhong you 821。尽管改进了Zhong you 821中的部分抗性，但它对病害的反应在利于核盘菌发展的环境条件下是不稳定的(Yunchang等人，1999)。这显示的是更低水平的部分抑制(Li et al.，1999)。

某些日本油菜籽栽培种对核盘菌具有部分茎抗性。可通过室内试验与越冬卡诺拉相比较来检测部分茎抗性(Brun et al.，1987)。不过，这些变种不是卡诺拉品系，而且是半越冬类型(参见表1)。

在卡诺拉中繁育出核盘菌田间抗性是非常困难的，这归因于该性状的数量特性。此外，生理抗性与避免或降低感染的形态性状的结合倍增了繁育出抗性的复杂性。另外，由于环境与植物居群的直接相互作用(也就是温度和湿度需求，以及微环境需求)，所以很难筛选出抗性。如上所述，尽管通过多年的共进化及环境压力来选择该性状，仍未获得抗核盘菌的加拿大春季芸苔变种。在油菜籽(及近来某些卡诺拉品种)中可实现的最高田间抗性水平是通过在中国使用所述的Zhong you 821的繁育工作所获得的(Yunchang et al.，1999)。这种部分抗性或耐受性的水平相对较低，因为在中国仍推荐在所有的油菜籽和卡诺拉品种中使用杀真菌剂(口头交流)(Baocheng et al 1999)。显然，在自然界没有发现对核盘菌具有高水平抗性的芸苔及卡诺拉变种。

卡诺拉品系欧洲油菜是在1970年代开发的。尽管有30年的广泛的繁育工作，但之前并没有开发出对核盘菌具有抗性的卡诺拉变种。举例来说，繁育工作包括定量性状基因座分析(Zhao-Jianwei et al.，2003)、诱变繁育(Mullins et al.，1999；Wu-Yanyou et al.，1996；LiangHong et al.，2003)、广泛的筛选工作(Sedune et al.，1989；Zhao et al.，2004)、及筛选表达序列标签(ESTs)(Rugang et al.，2004)。已开发出几种对核盘菌具有中度耐受性春季卡诺拉变种(Ahmadi et al.，2000a；Ahmadi et al.，2000b；BaoMing et al.，1999；and Liu et al.，1991)，不过耐受性水平较低，并且该品系无法抵抗较高的病害压力。近来已开发出携带草酸氧化酶基因的转基因卡诺拉(US 6,166,291及其分案专利)；但对转基因植物仍存在管理上和社会上的争论。如同需要使用杀真菌剂那样，也需要抗核盘菌的越冬卡诺拉基因型(Johnson 2005)。因此，需要有重要的技术性人工干预来繁育抗核盘菌的卡诺拉变异体。

发明概述

本发明的一个方面提供了对油菜核盘菌具有更高抗性的芸苔植物或植物类群。在一方面，本发明提供了春季欧洲油菜植物或植物类群，该植物或植物类群代表了在田间相同环境与病害状态下，其平均菌核病发病率(SSDI％)得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的种群。欧洲油菜植物或植物类群也代表了其平均菌核病发病率(SSDI％)得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的得分、或者这两个变种平均得分低约50％、35％或者20％的种群。

本发明的另一个方面提供了越冬欧洲油菜植物或植物类群，该植物或植物类群代表了在田间相同环境与病害状态下，其平均菌核病发病率(SSDI％)得分比Columbus.变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的种群。越冬欧洲油菜植物或植物类群也代表了其平均菌核病发病率(SSDI％)得分比Columbus变种、或Express变种的得分、或者这两个变种平均得分低约50％、35％或者20％的种群。

本发明的另一个方面提供了春季欧洲油菜植物或植物类群，代表其种群的植物或者植物类群至少具有以下特征：(a)种群中种子的固体成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩尔每克非油类固体(oil freesolid)，(b)植物中种子的油类含有低于2％的芥酸，(c)50％的开花时间在30天到90天之间，以及(d)在田间相同环境与病害状态下，SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％。欧洲油菜植物也可代表其中平均菌核病发病率(SSDI％)得分比PioneerHi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的得分、或者这两个变种平均得分低约50％、35％或者20％的种群。

本发明的另一个方面提供了越冬欧洲油菜植物或植物类群，代表其种群的植物或者植物类群至少具有以下特征：(a)种群中种子的固体成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩尔每克非油类固体，(b)植物中种子的油类含有低于2％的芥酸，(c)50％的开花时间在30天到90天之间，以及(d)在田间相同环境与病害状态下，SSDI％得分比Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％。越冬欧洲油菜植物也可代表其中平均菌核病发病率(SSDI％)得分比Columbus变种、或Express变种的得分、或者这两个变种平均得分低约50％、35％或者20％的种群。

欧洲油菜植物可以描述为以下春季欧洲油菜系：

(a)03SN40341的S3混合增加(bulk increase)，以ATCC保藏号PTA-6776保藏；或者来源于03SN40341的加倍单倍体系，以ATCC保藏号PTA-6780保藏。

(b)03SN40441的S3混合增加，以ATCC保藏号PTA-6779保藏；或者来源于03SN40441的加倍单倍体系，以ATCC保藏号PTA-6778保藏。

(c)02SN41269的F4混合增加，以ATCC保藏号PTA-6777保藏；或者来源于02SN41269的加倍单倍体系，以ATCC保藏号PTA-6781保藏。

(d)命名为04SN41433的S2混合，以NCIMB保藏号41389保藏，或者来源于04SN41433的加倍单倍体系，以NCIMB保藏号41391保藏。

(e)命名为04SN41415的S2混合，以NCIMB保藏号41388保藏，或者来源于04SN41415的加倍单倍体系，以NCIMB保藏号41390保藏。

(也参见表11a.)

欧洲油菜植物可以描述为以下越冬欧洲油菜系：

(a)04CWB930128系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41396保藏。

(b)04CWB930127系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41395保藏。

(c)04CWB930081系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41393保藏。

(d)04CWB930111系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41394保藏。

(e)04CWB930144系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41398保藏。

(f)04CWB930015系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41392保藏。

(g)04CWB930135系的F4混合增加，以NCIMB保藏号41397保藏。

(也参见表11b.)

本发明的另一个方面提供了任何上述方面中的芸苔植物的后代植株，其中后代植株至少具有以下特征：(a)种群中种子的固体成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩尔每克非油类固体，(b)植物中种子的油类含有低于2％的芥酸，(c)50％的开花时间在30天到90天之间，以及(d)代表在田间相同环境与病害状态下，SSDI％得分比(1)其后代植物具有春季生长习性的Pioneer Hi-Bred变种46A76、或PioneerHi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分，或者(2)其后代植物具有越冬生长习性的Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的种群。后代欧洲油菜植物也代表了在田间相同环境与病害状态下，菌核病发病率平均水平比(1)其后代植物具有春季生长习性的Pioneer Hi-Bred变种46A76或Pioneer Hi-Bred变种46A65或者这两个变种平均得分，或者(2)其后代植物具有越冬生长习性的Columbus变种Express变种或者这两个变种平均SSDI％得分低50％、35％或20％的种群。

本发明的另一个方面提供了欧洲油菜植物或植物类群、该植物或植物类群具有生理性状或者具有可同时发挥功能的形态及生理性状的组合，以降低病害发展，其中植物或植物类群所代表的种群，在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比(1)种群具有春季生长习性的Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65、或者这两个变种平均得分，或者(2)种群具有越冬生长习性的Columbus变种、或Express变种、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％。

本发明的另一个方面提供了任何上述欧洲油菜植物的后代、所述后代通过加倍单倍体选取核盘菌抗性性状产生，其中含有所述后代的同源种群的SSDI％得分在田间相同环境与病害状态下，比(1)种群具有春季生长习性的Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65、或者这两个变种平均得分，或者(2)种群具有越冬生长习性的Columbus变种、或Express变种、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％

此外，本发明还提供了由任何上述欧洲油菜植株所产生的加倍单倍体系、来自任何植株的种子、来自任何植株的碾碎的欧洲油菜种子、来自任何植株的植物细胞、以及来自任何植株的植物细胞物质，例如花粉或胚珠物质。

本发明的另一个方面提供了一种在可控的环境条件下筛选对核盘菌具有抗性的植物的方法，包括(a)用含有核盘菌菌丝体的低营养PDA塞状物接种处于可控环境条件下生长的植物，及(b)筛选对核盘菌具有抗性的植物。塞状物可以通过昆虫针附着在植物上。塞状物约3mm。可控的环境条件包括可控的湿度。

本发明的另一个方面提供了筛选在田间生长的对核盘菌具有抗性的植物的方法，包括(a)用核盘菌接种植物，(b)用水灌溉植物，其中水含有很低的或者不含可与草酸结合的离子；(c)使植物保持预定阈值的持续的湿度，及(d)筛选对核盘菌具有抗性的植物。可使用载体材料实现接菌。载体可以是诸如定植了核盘菌的Niger种子这样的种子，可以以约5-20kg/ha的速率进行散播。水可以是去离子水、蒸馏水、径流水或收集的雨水。该方法进一步可包括用网状围栏(enclosure)来提供一个可控的微环境。

本发明的另一个方面提供了一种在田间相同环境与病害状态下，产生SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的欧洲油菜系03SN40341的连续后代的方法，包括(a)将欧洲油菜系03SN40341与其自身或者另一种芸苔植物杂交，产生来源于芸苔系03SN40341的后代芸苔种子，(b)培养步骤(a)中的欧洲油菜种子，以产生另外的来源于芸苔系03SN40341的芸苔植株，(c)选择性地对连续后代重复步骤(a)和(b)中的杂交及培养过程，以产生其它来源于欧洲油菜系03SN40341的植株，及(d)筛选后代植株，其中所述植株代表在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的植物种群。本发明对系03SN40441、02SN41269、04DHS12921、04DHS11319、04DHS11418、04SN41433、04SN41415、05DHS12897和04DHS12879也提供了类似的方法。在田间相同环境与病害状态下，后代植株所代表的种群其SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约50％、35％或20％。

本发明的另一个方面提供了一种在田间相同环境与病害状态下，产生SSDI％得分比Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的欧洲油菜系04CWB930127的连续后代的方法，包括(a)将欧洲油菜系04CWB930127与其自身或者另一种芸苔植物杂交，产生来源于芸苔系04CWB930127的后代芸苔种子，(b)培养步骤(a)中的欧洲油菜种子，以产生另外的来源于芸苔系04CWB930127的芸苔植株，(c)选择性地对连续后代重复步骤(a)和(b)中的杂交及培养过程，以产生其它来源于欧洲油菜系04CWB930127的植株，及(d)筛选后代植株，其中所述植株代表在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％的植物种群。本发明对系04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135和04CWB930015也提供了类似的方法。在田间相同环境与病害状态下，后代植株所代表的种群其SSDI％得分比Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约50％、35％或20％。

本发明的另一个方面提供了春季欧洲油菜植物在培养农作物、油类及膳食生产、或者培育新的芸苔系方面的用途，在田间相同环境与病害状态下，该植物所代表的种群其SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％。植物可命名为03SN40341、03SN40441、02SN41269、04DHS12921、04DHS11319或04DHS11418，代表性的种子分别以ATCC保藏号PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780或PTA-6778保藏，所述种子约于2005年6月8日保藏；或者命名为04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879，代表性的种子分别以NCIMB保藏号41389、41388、41391或41390保藏。

本发明的另一个方面提供了越冬欧洲油菜植物在培养农作物、油类及膳食生产、或者培育新的芸苔系方面的用途，该植物所代表的种群在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分低于Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分约60％。植物可命名为04CWB930127、04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135或04CWB930015，代表性的种子分别以NCIMB保藏号41395、41396、41393、41394、41398、41397或41392保藏。

本发明的另一个方面是提供了生产卡诺拉油的方法，包括(a)碾碎由命名为03SN40341、03SN40441、02SN41269、04DHSl2921、04DHS11319或04DHS11418的欧洲油菜植物所产生的种子，代表性的种子分别以ATCC保藏号PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-678l、PTA-6780、或PTA-6778保藏，所述的种子约在2005年6月8日保藏；或者命名为04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879，代表性的种子分别以NCIMB保藏号41389、41388、41391或41390保藏；或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的种群在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％，(b)从上述碾碎的种子中提取原油，并且可选择地(c)对所述原油进行精炼、脱色及除臭，以产生卡诺拉油(canola oil)。

本发明的另一个方面提供了生产卡诺拉油的方法，包括(a)碾碎由命名为04CWB930127、04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135或04CWB930015的欧洲油菜植物所产生的种子，代表性的种子分别以NCIMB保藏号41395、41396、41393、41394、41398、41397或41392保藏，或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的种群在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％，(b)从上述碾碎的种子中提取原油，并且可选择地(c)对所述原油进行精炼、脱色及除臭，以产生卡诺拉油。本发明的另一个方面提供了上述的欧洲油菜植物，进一步地在田间相同环境与病害状态下，具有高于Pioneer Hi-Bred变种的46A76的黑胫病(Leptosphaeria maculans)抗性水平。植物命名为03SN40341、03SN40441、2SN41269、04DHS12921、04DHS11319或04DHS11418，代表性的种子分别以ATCC保藏号PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780或PTA-6778保藏，所述的种子约在2005年6月8日保藏；或者命名为04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879，代表性的种子分别以NCIMB保藏号41389、41388、41391或41390保藏；或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的种群在田间相同环境与病害状态下，其SSDI％得分比PioneerHi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％，并且进一步地，在田间相同环境与病害状态下，其平均黑胫病抗性水平要高于Pioneer Hi-Bred变种46A76。还提供了来自该植物的植物细胞。

附图的简要描述

图1是在极端病害压力田间研究条件下从2000-2005年期间种群T的5到10周期的柱状图。Y轴所示的是后代频率。X轴所示的是如表4所述的1-9个SSDI核盘菌等级。

图2所示的是特定的具有核盘菌抗性的春季卡诺拉系的农艺学与核盘菌数据。核盘菌数据以46A76、46A65及其平均值的百分比来表示。A部分包括在极端病害压力田间研究条件下的农艺学数据和核盘菌数据。B部分包括自然田间数据。C部分所示的是A部分与B部分的联合结果。D部分是省略了一个自然田间试验(NDSU)数据的B部分。E所示的是A部分与D部分的联合结果。

发明的详细描述

I.概述

本发明描述了第一个具有春季或越冬习性、并对核盘菌具有高水平田间抗性的低芥酸及低芥子油苷的卡诺拉系。田间抗性基于针对核盘菌的传统部分生理抗性以及形态性状的积累，它们可同时发挥作用以降低病害发展。

本发明具有几个方面。

第一个方面是开发了抗核盘菌的卡诺拉系。本发明的该方面在实施例1、2、3、4、8和9中有所描述。这是关于在田间相同环境与病害状态下，通过SSDI％得分来测定的平均核盘菌发病率水平比PioneerHi-Bred变种46A76、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的发病率水平、或这两个变种平均得分低约60％的春季卡诺拉系；或者在田间相同环境与病害状态下，通过SSDI％得分来测定的平均核盘菌发病率水平比Columbus变种、或Express变种的发病率水平、或这两个变种平均得分低约60％的越冬卡诺拉系的首次报道。在过去6年的(2000-2005)源于15年来的研究(1991到2005)的育种与筛选工作中，对遗传操纵的直接人类技术干预以及逐步增加的多个生理及形态性状产生了对核盘菌具有抗性的春季卡诺拉系。已经在本文其它地方，包括表11a和11b，详细描述了代表着改良系的种子保藏。

本发明的第二个方面是开发了同时具有核盘菌抗性及黑胫病抗性的卡诺拉系。在实施例1、2、3和4中所描述的育种及筛选工作，不仅产生了具有核盘菌抗性的品系，也产生了具有黑胫病抗性的品系。在过去6年的源于15年来的研究的育种与筛选中，多个生理及形态性状的逐步增加，产生了具有核盘菌抗性并且也具有黑胫病抗性的品系。在实施例5中描述了本发明的该部分。

本发明的第三个方面是开发了在温室或小温室中以及在田间筛选核盘菌抗性的方法学。这些方法学的发展，在开发如实施例1、2、3、4和5中所述的本发明的核盘菌抗性系及黑胫病抗性系方面是一个重要的成功因素。该方面在实施例6和7中有所描述。

II.卡诺拉育种技术

卡诺拉育种程序使用了诸如混合与轮回选择、回交、谱系繁育及加倍单倍体发育这样的技术。对于油菜籽与卡诺拉的一般性描述，可参见R.K.Downey and G.F.W.Rakow，1987：Rapeseed and Mustard(In：Fehr，W.R.(ed.)，Principles of栽培种Development，437-486.New York：Macmillan and Co.)；Thompson，K.F.，1983：Breeding winter oilseed rape欧洲油菜.Advances in Applied Biology 7：1-104；and Oilseed Rape，Ward，et al.，Farming Press Ltd.，Wharefedale Road，Ipswich，Suffolk(1985)，其中每一个均以参考的方式整合在本文中。

两个不同纯合子系之间的杂交会产生一致的杂种植物种群(也称为F1杂种植物)，它在很多基因座上是杂合的。两个在很多基因座上有差异的杂合子植物杂交，会产生遗传上不同并且不一致的植物种群。不管是什么谱系，自花授粉并且筛选多代的植物都会在几乎所有基因座上变成纯合的，产生真正的纯系后代一致的种群。本文所用术语“近亲繁殖的”是指纯合植物或者纯合植物集合。普通技术人员知道在近亲繁殖个体中可存在某些残留的杂合现象。

育种或者选择方法的选取依赖于植物繁殖模式、改良性状的遗传可能性以及商业上可用的变种类型(譬如，F1杂合变种、纯系变种等)。对于可高度遗传的性状，选择在单个区域评估出的优异个体植物就很有效，而对于低遗传可能性的性状，应基于相关植物家族重复评估的平均值来进行选择。流行的选择方法一般包括谱系选择、修正的谱系选择、混合选择及轮回选择。

遗传的复杂性会影响育种方法的选取。通常，通过两个基因型杂交来开始进行育种，其中的每一个具有一种或多种对方所缺少的或者可与对方互补的所需特性。如果两个最初的亲本没有提供所有所需的特性，可通过进行更多次杂交来涵盖其它供体。在每一个连续的子代中，F1到F2；F2到F3、F3到F4、F4到F5等等，植物均进行自交以增加该系的纯合性。典型地，在一个育种程序中，要进行5代或者以上的选择及自交以获得纯合植物。

谱系育种通常用来改良自花授粉的农作物。两个具有优良的、互补的性状的亲本，进行杂交以产生F1。通过一个或几个F1自交或者两个F1同胞授粉来产生F2种群。可在F2种群中开始进行最优个体的选择；然后在F3中开始，在最优的家族中选择最优的个体。可在F4代中开始对家族进行重复检验，以改善对于低遗传可能性性状的选择效率。在同系繁殖更增进的阶段(即F6和F7)，检验最佳系或者表型相似系的混合，以寻找潜在的新变种。

回交育种已经用于从供体亲本中将简单遗传的、具有高度可遗传性的性状的基因转移到所需的、最好是纯合的可用作轮回亲本的变种中。被转移的性状的来源被称为供体亲本。初次杂交后，选择具有所需性状或者供体亲本性状的个体，然后与轮回亲本重复杂交(回交)。预计所获得的植物会具有轮回亲本的特征加上所需性状或来自供体亲本的性状。这种方法已广泛用于繁育抗病害的变种。

每种卡诺拉育种程序均应包括对育种过程效率进行定期的、客观的评估。评估标准根据目的及目标有所差异，但应包括同适当的标准相比较从每年的选择中所获得的收益、增进的育种系的全部价值、及每单位投入(譬如，每年、每美元支出等)产生成功变种的数目。

多种轮回选择技术可用于改良由多个基因控制的数量遗传性状。在自花授粉农作物中轮回选择的应用依赖于授粉的难易程度以及来自每个成功杂交的杂合后代的数目。

混合选择(mass selection)及轮回选择(recurret selection)可用于改良自花授粉或者交叉授粉农作物的种群。可通过与几个不同的亲本杂交来鉴定或者产生遗传上多变的杂合个体的种群。基于个体的优势、突出的后代、或优秀的配合力来选择最佳的植物。所选择的植物进行杂交以产生新的种群，并在其中继续进行下一轮的选择。

在严格意义上，一粒传法过程是指栽培一个隔离的种群，收集每个植株一粒种子这样一个样本，然后使用该一粒种子样本去栽培下一代。当种群已经从F2增进到繁育所需的水平时，种系所来源的植株均可追溯到不同的F2个体。在种群中植株的数目由于一些种子无法发芽或者由于某些植株无法产生种子从而每代均有所减少。因此，当世代增进结束时，并非种群中初始采样的所有F2植株均有后代来代表。

在多粒程序中，卡诺拉育种工作者通常从一个种群的每个植株上收集一个或多个荚或者长角果，然后将其一起脱粒混合在一起。部分混合物用来栽培下一代，部分保存起来。该程序可参照改良的一粒传法(single-seed descent)或荚混合技术(pod-bulk technique)。

已使用多粒程序来在收获中节省劳力。用机器脱粒荚要比单粒程序中通过手工来分离单个种子快许多。多粒程序也可栽培同系繁殖的每一代种群中相同数量的种子。收集足够的种子，以弥补那些没有发芽或者产生种子的植株。如果需要，可使用加倍单倍体方法来获得同源系，从而增加具有所需基因型的种子的供应。

可在植物育种方法中使用包括诸如同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多肽DNAs(RAPDs)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCARs)、扩增片段长度多态性(AFLPs)、简单序列重复(SSRs)及单核苷酸多态性(SNPs)这样的技术在内的分子标记。分子标记的一个用途是数量性状座位(QTL)作图。OTL作图使用了与在数量性状上具有可测量效果的等位基因连锁的已知标记。在育种过程中的选择基于来自植物基因组中与阳性效应等位基因相联的标记的积累，和/或与阴性效应等位基因相联的等位基因的消除。

也可在育种过程使用分子标记来选择数量性状。例如，与等位基因连锁的标记，或含有位于实际目标等位基因中的序列的标记，可用来在回交育种程序中选择含有目的等位基因的植株。标记也可用于选择轮回亲本的基因组并可排除供体亲本的标记。使用该程序可使在选择的植株中所保留的供体亲本的基因组的量最小化。也可用来降低在回交程序中所需的轮回亲本回交的次数。在选择过程中使用分子标记通常称为遗传标记增强选择或者标记辅助选择(MAS)。

产生加倍单倍体(Swanson et al.，1987)也可用来在育种程序中开发同系繁殖系。杂交后，可使用加倍单倍体方法来快速获得纯合植株。在欧洲油菜中，可在产生单倍体胚芽时使用微孢子培养技术。然后将单倍体胚芽在合适的培养基上再生成单倍体幼苗。将其染色体二倍体化，产生加倍单倍体的植株。由于该过程省略了从杂合子来源获得纯合植株所需的自花授粉世代，因此具有优势。

授粉控制系统及将花粉从一个亲本到其它亲本的有效传递，可改良植物育种，并提供了用于产生杂合卡诺拉种子与植株的有效方法。例如，在萝卜(Raphanus sativus)和油菜籽(欧洲油菜)之间通过原生质体融合所开发的ogura细胞质雄性不育(cms)系统是一种产生杂合子的最为常用的方法。它可提供稳定表达的雄性不育性状(Ogura，1986)，Pelletieret al.(1983)及有效的育性恢复基因(Pellan-Dourme et al.，1988)。

在开发改良的新型芸苔杂合变种中，育种工作者使用了自交不亲和的(SI)、细胞质雄性不育的(CMS)及核雄性不育的(NMS)芸苔植株农作物雌性亲本。在使用这些植株时，育种工作者试图改良产生种子的效率及F1杂合子的品质，并降低育种成本。当不使用SI、CMS或NMS来进行杂交时，则更难在后代(F1代)中获得并分离所需性状，这是因为亲本可进行异花授粉及自花授粉。如果亲本之一是不能产生花粉的SI、CMS或NMS植株，则仅发生异花授粉。通过在杂交中排除一个亲本变种的花粉，则植物育种工作者可确认获得了具有一致品质的杂合种子，只要亲本具有一致品质并且育种工作者进行了单次杂交即可。

在一个例子中，F1杂合子的产生包括将CMS芸苔雌性亲本与产生花粉的雄性芸苔亲本进行杂交。但为了有效繁殖，F1杂合子的雄性亲本必须具有育性恢复基因(Rf基因)。Rf基因的存在意味着F1代不是完全或部分不育的，从而可进行自花授粉或异花授粉。Fl代自花授粉以产生几个后续世代很重要，可确保所需性状是可遗传的并是稳定的，并且可分离新的变种。

细胞质雄性不育并且可用于育种的芸苔植株的例子有ogura(OGU)细胞质雄性不育(R.Pellan-Delourme et al.，1987)。在法国的Instit.National de Recherche Agricole(INRA)in Rennes，Ogura雄性不育植株的育性恢复已从Raphanus sativus(萝卜)中转移到芸苔中(Pelletier et al.，1987)。在WO 92/05251及Delourme et al.，(1991)中描述了来源于萝卜的Ff1恢复基因。可开发出该种恢复的改良版本。例如，参见WO98/27806中含改良的针对ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因的油籽芸苔，该发明通过参考整合在本文中。

卡诺拉中的CMS不育的其它来源及改进包括Polima细胞质雄性不育植株、以及美国专利5,789,566 DNA“sequence imparting cytoplasmicmale sterility，mitochondrial genome，nuclear genome，mitochondria andplant containing said sequence and process for the preparation of hybrids”、美国专利5,973,233“Cytoplasmic male sterility system production canolahybrids”及WO97/02737“Cytoplasmic male sterility system producingcanola hybrids”、欧洲专利申请0 599042“A Methods for introducing afertility restorer gene and for producmg F1 hybrids of Brassica plantsthereby”、美国专利6,229,072“Cytoplasmic male sterility systemproduction canola hybrids”、美国专利 4,658,085“Hybridization usingcytoplasmic male sterility，cytoplasmic herbicide tolerance，and herbicidetolerance from nuclear genes”中的那些植株，所有这些均整合在本文中。

通常在代表着商品化目的地区的环境中，将有潜在价值的增进的育种系与适合的标准进行检测和比较。最佳系会作为新的商品化系的候选者；而那些在某些性状上仍有缺陷的品系可用作亲本以产生新的种群进行进一步的选择。

对绝大多数性状而言，真正的基因型价值可被其它混杂的植物性状或者环境因素所掩盖。一种鉴定优异植物的方法是观察其相对于其它试验植物和一种或多种广泛种植的标准系的表现。如果单次观察无法下结论，则重复观察可对遗传价值提供更好的评估。

育种工作者使用多种方法来协助确定应从隔离的种群中选择哪些植株，及最终哪些系可用于商品化。除了种质知识及育种工作者使用的技术外，部分筛选过程依赖于使用统计学分析进行的实验设计。实验设计及统计学分析可用于协助确定哪些植株、哪些植物家族及最终是哪些品系在一个或多个目的性状上显著优越或者不同。实验设计方法可用于控制误差，从而可更精确地测定两个系之间的差异。统计学分析包括计算平均值、确定变量来源在统计学上的显著性、及计算合适的方差分量。通常用百分之五和百分之一显著性水平来测定给定性状所产生的差异是否是真实的，或是归因于环境或实验误差。

正确的检验方法应当可检测任何主要错误，并确定比当前系优异或改进的水平。新系除了有优异的表现外，也必须与工业化标准兼容，或可形成新的市场。引入新系通常会对于种子生产者、栽培者、加工者及消费者造成额外开销，用来进行专门的广告及销售、变换种子及商业化生产实践、以及新产品利用。对前述新系发布所进行的检验应考虑到研发成本以及最终系的技术优越性。对于种子繁殖系，一定要能够容易地并且经济地进行切实产生。优选地，残余的杂合性不应超过5％。

这些通向销售及发行最终步骤的过程，从第一次杂交开始通常要花费约6到12年。所以，开发诸如本发明中这样的新系是一个耗时的过程，需要精确的预先计划、有效利用资源、及在方向上的最小变动。因此，需要有人为的重要技术干预。

此外，由于不育系统的增进，种系会被开发成可用作开放授粉的变种(即出售给栽培者用于种植的纯系栽培种)，和/或作为用于生产F1杂合种子的不育同系繁殖系(雌性)。在后一种情况下，期望具有与恢复者(雄性)有利的配合力(combining ability)。然后可将所获得的杂合种子出售给栽培者用于种植。

可使用细胞质雄性不育来产生卡诺拉的杂合种子。该类型的杂合子生产使用了3种同系繁殖系：恢复系、A系及B系。恢复系，也称为R系，用来作为杂合种子生产中的雄性。恢复系具有所熟知的作为恢复基因、负责杂合不育性的显性核基因。R系与A杂交以产生F1杂合种子。A系由于细胞质及由于核基因组中的非恢复等位基因因而是雄性不育的。由于A系是雄性不育的，所有它不能仅依赖自身来繁殖。为了产生A系，开发了B系。B系，也称为维持系，在遗传上与A系等价，只是B系具有正常的细胞质，因此是雄性可育的。A系由B系来授粉。收集在A系植株上发育的种子，其后代与R系杂交以产生F1杂合种子。

在卡诺拉植物育种程序中开发卡诺拉杂合子包括3个步骤：(1)从多种种质库中选择植株用于首次育种杂交；(2)对从育种杂交中选择的植株进行几代的自花授粉，以产生一系列同系繁殖系，尽管它们彼此间有差异，但进行了真实的育种并且是高度一致的；以及(3)用不同的同系繁殖系与所选的同系繁殖系杂交，以产生杂合子。在卡诺拉的同系繁殖过程中，种系的活力会降低。当两个不同的同系繁殖系杂交产生杂合子时，活力会恢复。关于同系繁殖系的纯合性及同质性的一个重要推论，就是在一对给定的同系繁殖系之间，杂合子总是相同的。一旦鉴定出可提供优越杂合子的同系繁殖系，只要维持了同系繁殖系亲本的同质性，就可以无限生产杂合子种子。

一个系的配合力，以及该系自身的表现，是选择改良的可用作同系繁殖系的卡诺拉系中的一个因素。配合力是指一个系作为亲本与其它系杂交形成杂合子时的贡献。将出于选择优越品系目的而产生的杂合子指定为测交系。然后将该含义调整成除去了环境影响，并调整为只考虑品系间已知的遗传关系。

生产杂合种子需要将由雌性亲本产生的花粉失活。花粉的不完全失活会提供自花授粉的潜力。这种不经意间的自花授粉种子可能会在无意中被收集并与杂合种子包在一起。类似地，由于在田间雄性亲本与雌性亲本相邻种植在一起，也有可能会在无意间收集了雄性自花授粉的种子并与杂合种子包在一起。一旦播种了来自杂合子袋子中的种子，可能会鉴定并选择这些自花授粉的植株。这些自花授粉的植株在遗传上等价于用于产生杂合子的同系繁殖系之一。尽管存在将同系繁殖的种子包括在杂合种子袋子中的可能性，但这种事情极少出现，因为会格外注意以防止此类夹杂。本领域的技术人员可通过视觉或分子方法，来鉴定并选出这些自花授粉的植株。

欧洲油菜卡诺拉植株，没有任何雄性不育或者自交不亲和系统，通常被认为是自育的，大约70到90％的种子通常是由于自花授粉而形成的。当在给定栽培地点上的公认的昆虫授粉者的种群变大时，异花授粉的百分比也可进一步增加。

III.定义

单位、前缀及符号以其SI接受的形式进行注释。

在本文用法中，“合适的参照”是指可为实验系提供核盘菌抗性评估的基础的芸苔基因型。同实验系一样，在包括病害压力在内的相同环境条件下培养合适的参照，它同实验系具有大致相同的成熟期。例如，对于春季卡诺拉而言，期望合适的参照可在实验系的+/-10天、通常是+/-5天内成熟。成熟的标准对于本领域技术人员而言是周知的。合适的参照通常是可普遍获得或者广泛培养的变种。术语“合适的参照”实际上反映了多种合适的变种。例如，对于春季卡诺拉基因型而言，PioneerHi-Bred变种46A76和46A65中的每一个均是合适的参照；两个变种的平均表现也是合适的参照。对于冬季卡诺拉基因型而言，公共系Columbus及Express中的每一个均是合适的参照；两个变种的平均表现也同样是。

术语“卡诺拉”是指其中油类必须含有低于2％的芥酸、并且种子的固体组分中每克风干的不含油的固体中所含的的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苷、2-羟基3-丁烯基芥子油苷和2-羟基4-戊烯基芥子油苷中的任何一种或者任意的混合物必须低于30微摩尔的芸苔植物。

在本发明语境中的术语“杂交的”或“杂交”是指配子通过授粉进行融合以产生后代(即细胞、种子或植株)。该术语既包括有性杂交(一个植株由另一个植株来授粉)也包括自交(自花授粉，即花粉和胚珠来自相同的植株)。

术语“最高有效水量(field capacity)”是指在土壤的最上面4英寸、或者大约是土壤的最上面4英寸湿度完全饱和了，但是没有或几乎没有积水。

术语“田间抗性”是指在田间条件下测定的抗性。它反映的是整个植物或者植物种群暴露在自然田间条件下的害虫或者病害中时的抗性。田间抗性可通过植株的发育阶段来测定，也可根据可收获产量的效果来表示，所反映的是当植物处对于病害发生最为敏感的生长阶段中时的定向评估。

术语“遗传连锁”是指遗传的基因座处于连锁不平衡状态，在统计学上可确定不是独立分配。遗传连锁的基因座的独立分配在51％到99％之间或者是其间的任意整数值，优选地至少为60％、70％、80％、90％、95％或99％。

本文所用术语“同系繁殖”是指纯合子植物或者纯合子植物的集合。本领域的普通技术人员知道在同系繁殖中可存在某些残留的杂合性。

术语“基因渗入”是指将所需的基因座通过亲本植株间的有性杂交导入到至少一个后代植株中，其中至少一个亲本植株在其基因组中具有所需的基因座。

术语“部分叶片抗性”是指同敏感植株的叶片反应相比，对核盘菌的抗性扩展到叶片上。由于部分叶片抗性，与敏感植株中的情况相比，病害在植物上发展更为缓慢，或者程度更低。

术语“标记”或者“分子标记”是指当鉴定诸如QTL(数量性状基因座)这样的遗传连锁基因座时用作参考点的基因座。该术语也可指同基因组序列互补的核酸序列，譬如用作探针的核酸。

术语“部分茎抗性”或者“茎抗性”是指茎中的不完全抗性。同敏感植株的茎反应相比，对核盘菌的抗性扩展到茎上。在部分茎抗性中，与敏感植株中的情况相比，病害在植物上发展更为缓慢，或者程度更低。不过，在具有“部分茎抗性”的植株中，该植株会表现出害病状况(同完全抗性相比较)。

术语“完全抗性”是指其中病害的发展中的某一方面、通常是症状表现或者病原体的生殖被完全阻断(同部分抗性相比较)的抗性反应。

术语“轮回选择”是指其目标是通过重复杂交及循环选择来增加有利的数量遗传性状基因的频率的育种系统。

术语“成熟”或者“至成熟天数”是指从播种到收获的日期数目。在基因型之间或者之中，成熟根据位置、生长季节及播种时间可变化很大。

本文所用术语“种群”是指植株的杂种繁殖类群或者共享一个基因库的个体的集合。种群可以是同质的(在遗传上一致)，譬如由纯合亲本杂交而建立的F1种群；或者是遗传上多样的，譬如通过杂合植株自花授粉或者杂合亲本杂交而建立的隔离的后代。此外，可将同质的种群几乎所有的基因座均培育为纯合的，产生一个真正纯系后代的一致的种群。

术语“种群育种”是指对使用来自相同种群的个体作为亲本来进行育种的种群进行改进。种群育种意味着可在一个种群内进行轮回选择。

术语“春季芸苔”或者“春季卡诺拉”是指不需要进行春化的芸苔植物。

术语“有利于核盘菌的形态”或“有利于核盘菌的表型”是指同对核盘菌感染具有更低帮助的芸苔表型相比，更容易形成并扩大核盘菌感染的芸苔表型。例如，有利于核盘菌的形态至少包括以下形态性状中的一种：紧密的枝条、过低的枝条、延长的花期、过高的花瓣维持、过高程度的叶片维持、及易于倒伏或倾斜。这些形态性状为最初从花瓣生菌提供了良好的条件，并增加了植物周围的湿度。相反，对核盘菌感染具有较少有利条件的形态性状的植株的例子至少包括以下性状中的一种：较低的花瓣维持、缺少花瓣的表型、良好的直立性、缺少紧密枝条、枝条较高、及早期叶片脱落。这些形态性状降低花瓣生菌、以及植物周围的湿度水平。

术语“病害发病率”是指在样本中受病害侵袭的植株数目。典型地，使用受病害侵袭的植株占样本中植株总数目的百分比来表示。

术语“SSDI％”是指作为种群中感染了核盘菌的植株的百分比来测定的菌核病发病率百分比。

术语“SSDI”是指从1到9的等级级别，用来在如实施例7及表4中所述的可控极端病害压力田间实验条件下测定菌核病发病率。SSDI可测定同合适的参照变种相比，种群中被核盘菌所感染的植株的百分比。对于春季卡诺拉而言，合适的参照有Pioneer Hi-Bred变种46A76和/或Pioneer Hi-Bred变种46A65。对越冬卡诺拉而言，合适的参照有Columbus和/或Express。例如，对于春季卡诺拉，在一侧的一排PioneerHi-Bred变种46A76与另一侧的一排Pioneer Hi-Bred变种46A65之间播种5排待测种系。典型地，在极端病害条件下，Pioneer Hi-Bred变种46A76的病害发病率为60％(SSDI％)，46A65的病害发病率为70％(SSDI％)，平均为65％。如果在任一特定的检测点上Pioneer Hi-Bred变种46A65和Pioneer Hi-Bred变种46A76的平均SSDI％不是65％，那么Pioneer Hi-Bred变种46A65和Pioneer Hi-Bred变种46A76的得分将乘以一个系数使得它们平均为65％。待测种系的得分也要乘以这个系数。然后根据表4中相应的SSDI％来对种系给定其等级级别。例如，如果参照的平均值为70％，由于超出了目标病害压力，就使用系数65/70来降低生长在参照之间的实验系所测定的病害百分比。相反，如果参照的平均值为60％，由于低于目标病害压力，就使用系数65/60来增加(调节)实验系的SSDI％。尽管目标病害发病率是65％，可以预料到由于大样本的植株、环境变化及接菌上的变化会出现围绕该目标变动的偏差，因此，通过参照来进行调整使得可在苗圃中对种系进行比较，并防止了对田间反应进行错误分类。由于利于核盘菌的条件不会在自然界按照可预测的方式出现，因此可广泛使用在实施例7中所述的极端病害压力田间实验条件来产生本发明的核盘菌抗性系。所以，试图进行快速选择以及希望提供可重复的条件时，可使用极端病害压力田间实验条件。

试验中的SSDI分级等级，在针对病害做了调整后，可以根据病害的严重度进行进一步调整。因此，按先前所述调整了SSDI％之后，可同样来进行SSDS的调整。将感染的参照植株的平均SSDS(1-8分)与实验数据进行比较。如果平均SSDS优于实验系(例如参照等级为3而实验系等级为4)，则SSDI％通过乘以3/4来进行调整。例如，如果实验系的SSDI％为20％，3/4乘以20％＝15％。这在SSDI等级这对应的是7.5的级别。相反，如果实验数据的SSDS是2(更受影响)而参照的为3，则SSDI％要乘以3/2。例如，如果SSDI％是20％，乘以3/2等于30％。这在SSDI等级这对应的是6.0的级别。

术语“极端病害压力田间实验条件”是指如实施例7这所述的可控病害实验条件。例如，使用Niger种子载体模拟带有核盘菌的花瓣来产生极端病害压力。在田间，自然的生菌可作为备用接菌而存在。将待测植株的百分比病害发病率按照上述所用的参照进行调整，并赋给1到9的SSDI得分。不过，在这些极端条件下，植株由于以下原因对核盘菌更为敏感：(1)在极端病害压力田间实验条件下，植株处于通过喷雾进行灌溉的有利于核盘菌发生的潮湿环境中，(2)在极端病害压力田间实验条件下，因为使用了确保有利于核盘菌发生的持续潮湿条件而使用的人工大棚，使得植株处于半封闭的环境中，及(3)在极端病害压力田间实验条件下，在每块地上有6排不同的待测植株，所以，任意一排具有特定形态学表型的植株都被两排具有不同形态学表型的不同植株所围绕。因此，任何由对核盘菌感染缺少有利因素的形态学表型所带来的益处(例如更高的分枝)，都因为任意一排都是被具有不同的形态学表型的植株(例如较低的分枝)所围绕，而被降低了。相反，在自然田间条件下生长的植株，(1)没有封闭在确保持续湿度的人工大棚内，及(2)生长在被具有相同形态学表型的植株所围绕的用地上，可以使得来自该形态学的所有益处都表现出来。因此，对于选择例如更高的分枝这样的对核盘菌感染缺少有利因素的形态而言，在自然的田间条件下要比在极端病害压力田间实验条件下明显优越。

术语“自然田间病害条件”是指在灌溉或非灌溉田地中生产用地里的条件。感染是通过定植在花瓣上的菌丝体来实现的。生产用地提供了可反映出与农场田地类似的自然条件中植物种群的样本。使用SSDI％来表示在重复实验中被感染植株的百分比。除了SSDI％之外，也可收集个体植株的数据来在不同等级上(1-9的Pioneer等级以及0-5的公共等级)来反映严重度(SSDS)。其它的可进一步对病害效果进行量化的参数，例如下述及表2中所示的核盘菌田间严重度(SSFS)，也可用于评估。SSFS可提供一些情报，在高自然田间病害压力下尤为如此。

术语“病害严重度”是指由于病原体感染而导致的植株损害程度。在本发明追使用了两种尺度来测定病害严重度。第一个是从1到9的Pioneer Hi-Bred等级。第二个是在公共机构的研究者中所使用的等级，这里用0-5的等级表示。二者均在表15中有所描述。在表2中给出了它们用途的某些例子。

术语“SSDS”是指菌核病严重度，是对感染植株上病害发生程度的度量。例如，它可区分只有很小症状的植株及死亡植株。为了本发明的目标，使用了两种分级等级：(1)在表15中描述了范围为1到9的Pioneer SSDS分级等级：及(2)在表2的脚注中描述了范围在0到5的Public Scientist’s的等级。

术语“SSFS”是指核盘菌田间严重度，是对病害发病率(SSDI％)后果、以及在自然田间条件下感染植株发病程度(SSDS)的度量。它是对田间真菌影响的一个度量，在高病害压力下，及当病害发病率在田间非常显著时，可提供更多信息。它可通过用病害严重度乘以SSDI％并且除以5来计算，其中病害严重度的分级为0-5，如表2所述，0表示没有感染，5表示是死亡植株。

术语“数量性状遗传位点”或者“QTL”是指可影响表型性状表现的分离的遗传因子。

表2.田间收集的核盘菌参数SSDI％和SSDS，以及它们相对于原始参数SSDI(实验数据)和SSFS(自然数据)的关系.

SSDI％是种群中感染了核盘菌的植株的百分比。

SSDS是对受感染植株上病害发展程度的分级。在本发明使用了两种等级。范围从1(死亡)到9(没有病害)的Pioneer SSDS等级与范围从0(没有病害)到5(死亡植株)的公共等级。对于Pioneer SSDS等级的细节可参见表15。下面给出了公共等级：0＝没有病害；1＝表面损害或者小枝条受感染；2＝大枝条死亡；3＝主干至少50％环剥；4＝主干环剥但植株可产生良好的种子；5＝主干环剥，产量大幅下降。

SSDI如表4所述分为1到9个等级，并对春季卡诺拉按照参照变种46A65和/或46A76、对越冬卡诺拉按照参照变种Express和/或Columbus的SSDI％进行了调整。仅仅在可控的极端病害压力田间实验条件下使用该等级。可通过使用因子X乘以观测的SSDI％来计算，其中因子X是使合适参照的平均SSDI％为65％的因子。在调整发病率后可对严重度进行调整。然后根据表4的等级计算SSDI。对于实施例1到5，假定参照的平均SSDI％＝65％、参照的平均SSDS＝4来计算SSDI值。

SSFS是在田间自然病害压力下对病害发病率与严重度的度量。它可通过下面来计算：SSFS＝[SSDI％x SSDS(0-5scale)]÷5。

IV.实施例

在花期处于长期潮湿条件下的卡诺拉中，核盘菌茎腐是通过生菌花瓣来发展的。掉落的花瓣使得核盘菌可感染会将其引向茎部的卡诺拉叶片。真菌导致了核盘菌茎腐。植株在成熟期前死亡，导致产量损失约50％。

卡诺拉对核盘菌茎腐是敏感的。在有着过长潮湿周期的年份里，对卡诺拉的损害非常显著。为了降低或预防这种损害，农民通常根据潮湿周期的持续时间使用一或两种杀真菌剂。

实施例1：在低、中、高、很高和极端病害田间研究条件下测定卡诺拉

参照的表现

方法和材料

为了在低、中、高和很高核盘菌条件下测定可普遍获得的春季卡诺拉培养物的核盘菌耐受水平，收集了多年来包括公共生产用地在内的自然田间条件下的数据。数据总结在表3中。44A89和46A65的数据来自2001年明尼苏达州的5次重复自然试验(Jurke and Fernando，2003)。Pioneer Hi-Bred变种46A76的数据是基于对相同的明尼苏达州试验中相似项目的反应的评估、以及2003年北达科他州的数据。在本研究中生成了极端病害条件下卡诺拉参照的表现的数据。

越冬卡诺拉系Columbus和Express作为连续参照包括在极端病害压力研究试验中。如表4和表10c所示，它们是敏感或中度敏感系。

极端病害条件极少见，但可能发生，其目的是筛选在这种条件下的品系。极端病害压力是指连续20-30天潮湿及平均温度为20到25℃。用核盘菌感染的植株在极端病害条件下通常需要使用两种杀真菌剂来抵抗病害。在每次使用时，杀真菌剂可提供平均10-14天的保护。在极端病害条件下进行筛选选择可确保选择能够抵抗典型的病害压力。

由于极端病害条件在自然界很少发生，因此在田间使用人工极端条件，如实施例7所述。这包括人工接种定植了核盘菌的Niger种子，进行灌溉，使用网格维持潮湿环境。对Pioneer Hi-Bred变种44A89、46A65和46A76进行了检测。使用敏感性更低的46A65和46A76作为连续参照来监测病害水平并测定表现(SSDI)。

为了测定喷洒在感染核盘菌的田间的杀真菌剂的效果，收集并总结了自然田间条件下生产用地的数据，以及接菌并在30％开花期喷洒了Lance^TM杀真菌剂的数据。

结果

表3所示的是春季卡诺拉参照在各种条件下的表现。对病害发病率(即，被核盘菌感染的植株的百分比)的筛选是首要目标。

以前的田间数据表明典型的中度或高度病害压力可对46A65产生20-50％的病害发病率，对46A76产生10-40％的病害发病率(表3)。但在极端条件下，如表3所示，Pioneer Hi-Bred变种46A65的病害发病率百分比约为70％，Pioneer Hi-Bred变种46A66的病害发病率百分比约为60％。如果天气对核盘菌感染不利，则卡诺拉参照所受影响降低，而且病害发病率对部分抗性植株来说是部分降低或消除的。由于多数田间情况是基于低于极端病害压力条件的，因此参照和开发的品系通常比表4所示的影响更小一些。

在极端病害压力下，根据喷雾灌溉下每隔6行的连续参照来筛选病害发病率，如实施例7所述。该极端病害压力研究田间数据在表4中表示为等级为1到9的SSDI。典型地，5行待测品系播种在一边为一行Pioneer Hi-Bred变种46A76、另一边为一行Pioneer Hi-Bred变种46A65之间。在极端病害条件下，Pioneer Hi-Bred变种46A76的病害发病率为60％(SSDI％)，Pioneer Hi-Bred变种46A65的病害发病率为70％(SSDI％)，平均为65％(SSDI％)。如果在任何特定的待测用地中，PioneerHi-Bred变种46A65和46A76的平均SSDI％不是65％，则对PioneerHi-Bred变种46A65和Pioneer Hi-Bred变种46A76乘以一个系数，使其平均值为65％。待测品系的分数也乘以该系数。在如所述的SSDI定义进行了严格调整后，将品系根据SSDI划分等级，如表4所示。

表3.在普遍获得的春季卡诺拉的自然核盘菌田间反应中的变化(SSDI％)

·^*极端病害压力用于实施例7所述的核心研究和开发中。

·^**在加拿大西部北达科他州和明尼苏达州的农场田间的每个感染水平的频率估计。

表4.在极端病害压力(研究试验)下测定田间表现

^*SSDI％核盘菌菌核病发病率％

^**SSDI核盘菌菌核病发病率等级，以极端病害压力(研究试验)下的春季卡诺拉参照46A65/46A76和越冬卡诺拉参照Express/Columbus来调整发病率和严重性。

表5所示的是杀真菌剂的使用可降低核盘菌对芸苔的作用，可用作抗核盘菌表现的改进的间接测定方法。表5所示的是一种杀真菌剂于2004年在Morden和Carman、马尼托巴省自然感染条件下应用在重复田间用地的效果。从表5可看出，在低病害压力条件下，除了高敏感植株外，可使用单一的杀真菌剂来实现对核盘菌的近乎完全控制。杀真菌剂对等级为1的品种的效率(HS)低于杀真菌剂对等级为2或3的品种的效率(S或MS)。

表5.2004年于Morden，马尼托巴省和Carman，马尼托巴省地区，在自然条件下的生产用地中，核盘菌对喷洒或未喷洒的参照的感染情况(SSDI％)

^*Lance^TM(啶酰菌胺)-BASF登记的控制核盘菌的杀真菌剂。

HS＝高度敏感；S＝敏感；MS＝中度敏感

表6所示的是2003年北达科他州/明尼苏达州田间试验的结果。绝大多数普遍商品化的卡诺拉变种根据如表2所述的Pioneer SSDI的1到9等级而定级为1或2。某些罕见变种为等级3，可更有效地受到杀真菌剂的保护。例如，表6所示的是核盘菌等级约为2的Hyola 357在北达科他州杀真菌剂试验中具有约69％的发病率。在使用最好的杀真菌剂后，发病率降低为44％。表6也表明核盘菌等级为1或2的Invigor2663在明尼苏达州试验中有22.3％发病率，其病害压力是较低的。在使用杀真菌剂后，发病率降低为5％。

表6.2003年在North Dakota State University CarringtonResearch/Extension Center和University of Minnesota Red Lake Falls的相同地区，在核盘菌筛选和杀真菌剂试验中卡诺拉变种的表现。^*

基于病害发病率和表3，北达科他州试验可划分为很高或极端病害压力。在北达科他州的杀真菌剂试验的结果与极端病害压力下对等级为1-9的Pioneer SSDI是相当的，表明最好的杀真菌剂对敏感变种的保护作用。在试验中，在该压力下，Endura^TM(啶酰菌胺^TM)与其它杀真菌剂相比较，可提供最高水平的保护作用。

^*来源于2003年的Evaluations for fungicides for Control ofSclerotinia Stem Rot of Canola in North Dakota and Minnesota，NDSUExtension Service April 2004。

实施例2：开发对核盘菌的抗性--种群T的开发

本研究的目标是用核盘菌抗性变种来替代卡诺拉的杀真菌剂处理。其策略是使用具有部分抗性的天然来源，通过群体内的轮回选择来增加这些可避免病害的形态性状来源，以获得很高水平的部分抗性。一旦在避免病害的背景中增加了抗性，如果此抗性可维持最大长度的从花瓣凋落到花期结束暴露在病害中的时间，则该抗性是彻底的，因此可在不显著损害植株的情况下抵抗病原体。

避免病害的形态性状包括，例如，良好的直立性和不易弯曲的柄(茎)、更迟的成熟期、高分枝、较低的花瓣维持和快速的叶片脱落。生理性状主要是与某些叶抗性相关的较强的茎抗性。因此，由形态性状所降低的病害发展可进一步被茎和/或叶抗性所降低。当较强的部分茎抗性与可降低病害影响的形态性状相结合时，可降低或最小化真菌对茎的整体影响。在缺少有利的形态性状时，会降低整体表现，但仍显著优于卡诺拉参照。

当延长有利于核盘菌感染的天气情况的时间时，会产生极端病害压力。典型地，这在温度在20到25℃、相对湿度大于80％时发生。在这些情况下，可发生最理想的植物感染(Heran et al.，1999)。除了湿度外，另一个潮湿植物冠层的指示物是植物上的自由水分和绝对含水量。

方法与材料

表7和8描述了在种群T中开发田间抗性所用的组分及开发和筛选田间抗性所用的方法。

从1986年开始，从美国(美国农业部)、日本(渔业和自然资源省)及加拿大(植物遗传资源部)的政府部门获得了欧洲油菜油菜籽。油菜籽中芥子油苷及芥酸的含量很高，因此不是卡诺拉品种。这称为双高。相反，欧洲油菜卡诺拉品种的芥酸和芥子油苷含量很低，也称之为双低。所定义的芸苔植物，其中油类必须含有低于2％的芥酸，种子的固体成分必须在每克干重、不含油的固体中含有低于30微摩尔的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苷、2-羟基3-丁烯基芥子油苷和2-羟基4-戊烯基芥子油苷。

鉴定所获得的油菜籽种质对核盘菌的茎反应(表7)。很多部分茎抗性油菜籽的筛选与卡诺拉品系的筛选交叉进行，提取具有部分茎抗性及卡诺拉品种性状(低芥酸和/或低芥子油苷)的后代。表现出部分茎抗性的卡诺拉品系可用于进一步的研究及种群发育。用于开发改良的春季卡诺拉系的核盘菌抗性的来源列在表7中。来自USDA(US)及MAFF(Japan)的简介也用于开发改良的越冬卡诺拉系。

在1991年，Pioneer开始了重组具有生理部分茎抗性及田间形态抗性的卡诺拉品种的种群繁育计划。组合成了种群T。在表8中给出了0-10循环的详细情况。每个循环均在表中的一行进行了描述。每行描述了所用品种、杂交以产生S₀，种子的增加及对S₀进行温室选择，产生S₁，然后在田间进行S₁检验，并进行包括农艺学及质量分析在内的选择。前四个循环使用的是封闭种群，如表8中所述。将生理部分茎抗性的进一步变异引入到循环5、6、7和8中(表8)。在如实施例6与7所述的温室及田间选择方法之后，对品系进行检验。筛选表现出高水平抗性的后代，并在田间观察持续的改良(图1)。在实施例6的方法之后，只有温室茎选择的后代在田间是优异的。

表7.种群T的开发-转变为卡诺拉、并用于种群T开发的油菜籽组分(在原始系或其春季筛选(USDA)vs.敏感参照中的室内茎损害长度及SSDS数据)

^*是作为日本原品种的春季卡诺拉的敏感参照Westar

^**对于USDA和PGR原品种的敏感参照是Pioneer春季系NS1602。

结果

图1是种群T在循环5到10中生成的品系的柱状图，表明了在极端病害压力田间实验条件下产生核盘菌抗性方面的进展，如在循环5到10中对参照所测定的那样。随着每一年种群T的改进，病害发病率的百分率降低，种群平均SSDI 1-9的分级提高了。Y轴代表后代频率，X轴代表按表4所述的1-9的SSDI分级来定级的核盘菌抗性。图1表明每个循环的方式和模式在持续提高。例如，循环5的种群模式从2.5提高到循环8的5.5，循环10的7.5。另外，在循环7、8和9的单个选择的等级为7.5、8.0和8.5。筛选具有高水平抗性的后代，并在田间观察持续的改进。

图1所示的试验中的病害发病率的程度是在极端病害压力田间实验条件下测定的。这是在自然田间环境中最高的可能病害压力。该病害水平在农场田间很少发生(表3)。因此，希望在本试验中筛选的品种在更低和更典型的病害压力下会表现更好。例如，在典型的中度田间病害压力下，Pioneer Hi-Bred变种46A65和46A76的病害发病率通常分别为20-30％及10-20％(表3)。但在极端病害压力下，病害发病率的水平分别为70％和60％(表3)。具有部分田间抗性的植株表现出(i)在植株上降低病害发生，(ii)病害发作显著延迟，及(iii)当用茎直接接触进行接菌时，抵抗病害发生的时间更长。如果存在利于病害发生的条件，在部分抗性品种中可观察到病害影响的显著降低(表3和图1)。

表9描述了部分具有改进的田间抗性的品系，并给出了由独立的第三方团体在田间自然条件下所进行的检验中的表现。2004年的SSDI％数据是在马尼托巴省的开放田间试验中，于中度病害压力下进行检测的(通过测定3个参照中2个的表现)。其中一些相同的品系在2003年于明尼苏达大学(MN)，在高度压力下(2个参照中的2个)和在2003年于北达科他州(ND)，在很高及极端压力下进行检测的，如表3所示。所有田间抗性品系具有显著高于参照的部分茎抗性水平。值得注意的是，在这4个地方，这五个列出的品系每个的表现都在本权利要求的范围内，即，在相同的田间环境和病害条件下，平均菌核病病害发病率(SSDI％)得分比Pioneer Hi-Bred变种46A76的SSDI％得分低约60％。

也在极端病害压力田间实验条件下对种群T的筛选进行试验(表10a和表10b)。在循环8引入了选择02SN41269。循环8中选择03SN40441用于开发循环9和03SN40341，及来自先前如表8所述的循环8的22个S1品系。用3个品系(即02SN41269、03SN40341和03SN40441)进行杂交，种群T后代会在其一个或多个中恢复其遗传抗性。

表10a所示的是对03SN40341、03SN40441和02SN41269在极端病害压力田间实验条件下的3次试验的结果(2004两次，2003年1次)。与46A76相比较，03SN40341、03SN4044和02SN41269的病害发病率分别平均为39％、39％和44％。在这些极端条件下，植株对核盘菌更敏感，其原因至少是上述定义“极端病害压力田间实验条件”中所讨论的原因。相反，在自然田间条件下培育的植株(1)不覆盖保证持续湿度的人工冠层，及(2)栽培在由具有相同形态表型的植株包围的用地中，从而可使所有来自形态的优势都被表达。因此，具有对核盘菌感染不利的形态，例如高度分枝的选择在自然田间条件下比在极端病害压力田间实验条件下表现得明显更好。例如，与46A76相比较，在自然田间条件下，03SN40341、03SN40441和02SN41269的病害发病率分别为23.2％、13.7％和49.1％，如表9所示。因此，02SN41269具有比03SN40341和03SN40441更利于核盘菌感染的形态。与03SN40341和03SN40441相比较，02SN41269更容易倒伏(图2A)。图2A表明02SN41269双倍体系04DHS12921和双倍体04DHS11319也比参照和其它待测品种更易于倒伏。在自然数据组中，对倒伏的低抗性可危及核盘菌表现，特别是在诸如2005年的NDSU-Carrington 2005这样的具有大量湿气或过度灌溉时尤为如此。研究数据组避开倒伏抗性，提供了反映遗传抗性与形态一起构成的可能性的分数。

可以使用参照变种46A76、46A65和44A89作为示例来说明极端病害压力田间实验条件同自然田间条件相比对形态的影响。46A76是北达科他州核盘菌变种试验和明尼苏达州大学扩展试验中最不敏感的变种之一(表9，2003数据)。与46A65或44A89相比较46A76所具有的形态最不易被核盘菌感染。形态包括诸如高度分枝和良好直立性等特征。对于在极端病害压力田间实验条件下的SSDI％得分(表10a)，44A89是46A76的115％，而46A65是46A76的98％。但在2004年的自然试验中(表9)，44A89是46A76的232％，46A65是46A76的199％。这清楚说明，与其它卡诺拉参照相比较，特别是在自然田间条件下，46A76是测定田间抗性的高标准。这也说明自然田间结果与极端病害压力田间研究结果的差异。极端病害压力田间实验条件对所有基因型进行调整，代表最恶劣的情况，即，通常在自然田间环境中仅发生1到2％。(参见表3.)。在这种极端条件下表现良好的品系被认为至少在自然田间环境中也会表现良好。

用参照变种，例如44A89和46A76来协助评估检测环境和产生的数据的可靠性。例如，表9b和9c比较了在2001、2003和2005年，在北达科他州和明尼苏达州试验中的对照品系后代的结果。这些地方是具有更高病害压力的地区，具有痕量水平的病害的年份获得的数据组除外(Bradley，et al.，2006)。在2005年46A76的低水平病害发病率(NDSU-Carrington)表明环境条件可使病害得分复杂化，如研究者BobHanson(NDSU)所述。在这种情况下，过度灌溉可导致在早期品系中过度倒伏及在晚期品系中的延迟成熟，这利于晚期成熟品系，例如46A76。表9b和9c表明在NDSU-Carrington 2005年收集的数据与在相同地方及明尼苏达州地区在前两年获得的结果不一致(也参见Bradley，et al.，2006)。

图2提供了在极端病害压力和自然田间条件下，春季品系在多个试验中的数据。在4个以上的试验中收集通常的极端病害压力田间研究数据。自然田间数据在3个以上地区，包括上述北达科他州地区进行收集(2005数据)。当除去单个异常试验时(图2D和2E)，所有被测品系在目标范围内均表现良好，即，在田间相同环境和病害条件下，SSDI％得分比Pioneer变种46A76的SSDI％得分、Pioneer变种46A65的SSDI％得分，或这两个变种的平均SSDI％得分低60％。

在极端病害压力田间实验条件下选取并鉴定表示为02SN41269(2个系)、03SN40441和03SN40341的加倍单倍体系(表10b)。加倍单倍体系是通过本领域技术人员所知的方法来产生的，例如可参见Swanson et al.(1987)；Mollers et al.(1994)；Hansen et al.(1996)；美国专利6,200,808及加拿大专利2,145,833。这四个加倍单倍体系的SSDI等级在6.6到7.3之间。这与等级为3.8的对照Pioneer Hi-Bred变种46A76的对比十分鲜明。加倍单倍体系具有与其亲本系相似的形态表型，它们在自然条件下也会表现得更好一些。

表10c提供了F3越冬卡诺拉系2005的表现数据。该表中的数据来源于在Tavistock(Ontario，Canada)进行了三次重复的2005田间试验。使用了极端病害压力来产生该研究数据集。

提交物的田间反应优于参照Express与Columbus，即便在可导致比预期更高病害压力的天气条件下也是如此。在Soest(德国)收集的越冬卡诺拉选择中的倒伏得分可以对具有良好直立性的抗性品种进行选择。

表11a给出了5个杂合的春季卡诺拉选择的谱系(02SN41269、03SN40341、03SN40441、04SN41433和04SN41415)及其纯合的加倍单倍体后代。由于所有的选择都是来自单个植株(来自田间试验第一年的100-500个种子)，因此需对它们进行进一步的自交并增加其份数以进行进一步的田间试验与种子提交。

总而言之，如图1中的柱状图所示，基于15年研究(1991到2005)的6年多来(2000-2005)的繁育与选择工作，得到了改良的春季卡诺拉系。在自然田间条件下，这些品系的平均菌核病发病率(SSDI％)得分比在田间相同的环境与病害条件下的Pioneer Hi-Bred变种46A76的SSDI％得分、或Pioneer Hi-Bred变种46A65的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分低约60％。表9所示的是在田间Pioneer Hi-Bred变种46A76是不易感染的卡诺拉参照之一(在SSDI分级中为3级，而绝大多数流通的卡诺拉产品是1或2级)，代表了一个非常有挑战性的可与新品种进行比较的目标。此外，Lance^TM或Endura^TM被认为是市场上最为有效的杀真菌剂。最不易感染的卡诺拉参照与最有效的杀真菌剂的组合使得柱型非常高。从图1中的柱状图可看出，种群T循环10的SSDI模式为7.5，其中某些个体的等级为8或8.5。根据表4中的分级等级以及图1中所示的结果，开发了SSDI等级为5、6、7或8的品系。将它们归类为中度抗性(等级为5或6)和抗性(等级为7或8)。

实施例3：卡诺拉的确认

依照加拿大卡诺拉理事会，卡诺拉是通过以下特征来进行定义的：油类必须含有低于2％的芥酸、并且种子的固体组分中每克风干的不含油的固体中所含的的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苷、2-羟基3-丁烯基芥子油苷和2-羟基4-戊烯基芥子油苷中的任何一种或者任意的混合物必须低于30微摩尔。

测定芥酸水平及芥子油苷的含量，以确认由种群T所产生的种子符合卡诺拉的定义。如下所述，通过全种子脂肪酸图谱来测定芥酸水平，通过扫描NIR测定芥子油苷的水平：

脂肪酸含量：测定成熟完整干种子的内源生成油类中所存在的脂肪酸的典型的重量百分比。在测定时，将种子碾碎，并在与甲醇和甲醇钠反应后提取脂肪酸甲基酯。然后通过气液色谱，用根据不饱和程度和脂肪酸链长度进行分离的毛细管柱分析得到的酯的脂肪酸含量。在J.K.Daun et al.(1983)的工作中描述了该流程，本文通过参考整合在文中。

芥子油苷含量：通过AOCS官方方法AK-1-92(通过HPLC测定油菜籽的芥子油苷含量)所测定在8.5％湿度时的种子中总芥子油苷是以每克微摩尔来表示的。在最优条件下提取并纯化二芥子油苷的三甲基色氨酸衍生物以获得最优吲哚芥子油苷检测的毛细管气相色谱描述在“Procedures of the Western Canada Canola/Rapeseed RecommendingCommittee Incorporated for the Evaluation and Recommendation forRegistration of Canola/Rapeseed Candidate Cultivars in Western Canada.”中。

卡诺拉也必须满足农艺学上生长季节的需求。对春季卡诺拉，达到50％开花的平均天数典型地为30-90天(表1)。为了控制任何一年中或任何一个田间的生长条件，将开花的天数与培育在相同田间和相同条件下的官方参照变种进行了比较。表12总结了与官方WCC/RRC(Western Canada Canola/Rapeseed Recommending CommitteeIncorporated for the Evaluation and Recommendation for Registration ofCanola/Rapeseed Candidate Cultivars in Western Canada)参照变种46A65和Q2相比较，芥子油苷、芥酸、50％开花的天数和成熟试验的天数的结果。从表12可看出，由种群T产生的植株与参照是相当的，符合春季卡诺拉的定义。由于环境差异，发生了处于可接受范围内的变异。

表12.卡诺拉品系/春季环境-芥酸(C22∶1)/芥子油苷/开花/成熟

^*总脂肪酸的百分比-Erucic(C22∶1)

^**芥子油苷(u摩尔-总脂肪族芥子油苷/克风干膳食)

^***官方登记品质参照

实施例4：性状复杂性

表13所示的是为了产品开发在与敏感的原种品种所进行的杂交中遗传分离的复杂性。图1中的有效数据所示的是性状表现，而表13中的分离数据所示的是部分抗性系的低回复性。这表明增加的遗传组分可导致复杂的分离。据估计在这些品种中有3或4个基因提供了部分抗性。需要大量工作才能将这3或4个基因渗入到原种品种中。敏感的原种品种的成分越大，则核盘菌抗性基因的渗入就越困难。例如，将核盘菌抗性基因渗入到含50％敏感原种品种的品种中，要比渗入到含75％敏感原种品种的品种中更为容易。可使用单倍体技术以与表10中所示的固定抗性原料相似的方式来固定分离的后代。

表13.繁育行为的结果-在2003和2004年*将部分抗性选择物与敏感的原种系进行杂交后抗性后代的回复

^*在不同的年份/计划中使用了不同的来源

^**迟滞会显著夸大选择物的数目。同参照相比较，品系更晚开花

实施例5：筛选黑胫病抗性

黑胫病(Leptosphaerla maculans及其它Leptosphaerla种)，也称为茎点霉属茎腐，是一种在国际上很重要的、在欧洲、澳大利亚和北美造成了严重的经济损失的芸苔病害(Fitt et al.2006)。通过在“Proceduresof the Western Canada Canola/Rapeseed Recommending CommitteeIncorporated for the Evaluation and Recommendation for Registration ofCanola/Rapeseed Candidate Cultivars in Western Canada”中WCC/RRC的程序所概述的方法来从种群T的后代中筛选黑胫病抗性。

表14描述了来自西加拿大两个地点的病害最为恶性的亚种的黑胫病分级。发现选择物02SN41269和02SN40441对黑胫病具有高水平的成年植物抗性，其2004年平均等级为8.7，比较而言，敏感参照Westar的等级为5.8(表14)。在2005年收集的数据也表明02SN41269和03SN40441的黑胫病抗性优于46A76。

Tavistock的田间观察资料(2004和2005)表明越冬品系对黑胫病的抗性与Columbus/Express的抗性类似。

表14.在2004/2005年在西加拿大试验品种对黑胫病抗性的反应

^*1＝死亡植物，9＝没有病害症状

实施例6：温室和小温室筛选核盘菌抗性

在温室/小温室中对筛选核盘菌方法的开发是一个开发出核盘菌抗性芸苔系的重要的成功因素。已经公认生成可靠的核盘菌筛选数据仍是充满问题的。

开发了下述方法用于在温室及小温室评估对核盘菌茎腐的卡诺拉茎和/或叶反应。该方法用于开发并筛选实施例1、2、3、4和5中的核盘菌抗性系。尽管所述的方式是针对芸苔的，应理解对于任意对核盘菌敏感的植物，例如大豆或向日葵均可使用。

一致性

核盘菌与环境及植物相作用，病害发展会反应出相互作用的所有方面。为了在繁育出核盘菌抗性中获得最精确的结果，在(1)植物品种(生长阶段、茎或叶大学、接菌位点)、(2)接菌及(3)环境(潮湿箱、小温室或分隔间)上必须达到最大的一致性。这是收集可靠数据的必要条件。

核盘菌&培养基

可使用PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)来繁殖核盘菌。培养基营养富集，可使真菌快速生长。此外，可通过PDA来感染植物组织。因此，PDA非常适于初次转移，并适于需要施加更高或更快的感染压力的情况，譬如在非常晚的生长阶段或者品种需要较短周转时间的时候。

对于更为敏感的试验，可使用低营养PDA。减缓了菌丝生长及感染过程，植物品种可有更好的机会来表达其典型反应。此外，可更可靠地打断感染过程，从而使选择物具有更好的产生种子的机会。可使用列在下面的步骤：

培养基

PDA-马铃薯葡萄糖琼脂

培养基成分             1L

PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)  39g

低营养PDA

培养基成分             1L

PDB(马铃薯葡萄糖汤)    12g

琼脂(Sigma A-1296)     15g

1.重新获得核盘菌分离株的菌核。

2.无菌条件下将菌核切成两半，并将切面向下置于PDA平皿上。

3.在暗处于19℃(+/-3℃)温育72到90小时，或者直至菌丝接近平皿边缘为止。可以利用更低温度来减缓生长(4-16℃)。

4.对于在温室或小温室的接菌，使用软木塞打孔器切成直径约2-4mm的塞状物。优选地，使用来自菌丝外侧一圈的塞状物，在那里菌丝发育一致，这样所有的塞状物都有相似的年龄及品质。

茎部接菌方法

可在茎延伸至生理成熟，即种子颜色改变后对卡诺拉接菌。在田间，植株在花瓣凋落阶段是受影响的。一般来说，早期感染的植株更敏感，而老的植株不太敏感。根据筛选目标，可在开花前到开花后进行接菌。植株可在32孔平地或4英寸(及更大的)罐中培育。较大和较强壮的植株对核盘菌的抗性更大。较小和较弱植株更敏感。不推荐检测节间，但邻近节在叶腋上部的点例外，以用于模拟自然感染。在筛选中包括核盘菌敏感和/或部分抗性参照。

昆虫针方法

对在潮湿房间内检测的植株，可使用例如昆虫针的方法。制备3mm塞状物(+/-1mm)，并用针，例如无锈昆虫针#1到3#进行检测。使用针来支撑携带有菌丝体的塞状物附着在茎上。该方法可检测大量植株。植株可以比较稀疏，例如在32孔平地上生长。以下列出的步骤包括：

1.根据实验目的，可在茎的单点或多个点进行接菌。

2.将植株在潮湿房间或潮湿环境中放置20到60小时，或直到症状开始发展。观察敏感和/或部分抗性参照的反应。根据筛选目标，除去接菌物(限定的术语为接菌)，而且当新鲜伤口长度在多数敏感和/或部分抗性参照中至少为5-30mm时，停止在潮湿环境的培养。伤口长度是最可靠的参数。可在房间中接种后立刻进行最初的筛选，最初的反应是关于表现的良好指示。

3.将植株移植到温室/培养间的苗床上，在所需处接菌后，记录伤口长度生长阶段。确保植株不干燥。如果需要，可在接种前记录生长阶段。

4.比较所需目标和参照或比较邻近植株的表现而进行筛选。

5.如果实验目的需要，在达到满意的差异后或在1和2周后，测定伤口长度和病害严重性等级(1-9)。这可根据病害在植株中的发展过程而改变。对病害严重性等级，需考虑伤口长度、茎直立性和环剥程度。

6.当在夏季月份温室温度升高时，避免进行接种实验。如果需要，可在培养间，优选地空气湿度增加的房间进行实验。

可使用昆虫针及具有菌丝体的小直径低营养PDA塞状物来筛选大量植株，并可在单个植株上进行多次接菌，以验证反应。这在向田间筛选和推进最有抗性的后代进行进一步评估是非常重要的。

核盘菌等级标尺(室内SSDS-室内菌核病严重度)

1-早熟或死亡的植株

3-大伤口，弱及完全环剥的茎

5-大伤口＞30mm，直立，几乎环剥的茎

7-小伤口＜30mm，直立，无环剥的茎

9-无损伤

如果症状严重度在所定义的分数之间，则可指定为中间分数。

在感染后，可使用不潮湿的，通气好的环境，以利于感染的开花植株在感染中存活。

叶接菌方法

进行叶片接菌，以检测不同项目在抗性水平上的差异。它是在茎接菌之前更早的生长阶段譬如抽苔之前进行的，以对部分抗性进行早期检测。不过，叶筛选通常在开花时进行，可在田间对全体植物考察时进行。由于叶子比茎对核盘菌更为敏感，因此除非特别说明，否则使用的都是低营养PDA。可以用塞状物或者带有昆虫针的塞状物对完整的叶子进行接菌，用于试验及选择目的。可按照下列步骤进行：

1.可在潮湿的温室内进行大规模筛选。温室内湿气的水平应该充分高，可使得感染发生，但又不能过高，以免妨碍真菌感染，这一点很重要。

2.优选地，从覆盖了相同菌丝的菌落边界外侧1cm处取下2-4mm的塞状物，并将塞状物上部向下置于叶片上面。调整塞状物相对于叶片的位置，使得尽可能多的叶片区域能够发生枯斑。

3.在塞状物周围的枯斑发育一致之前不必去测定枯斑的直径。应避免塞状物没有与发育良好的叶片接触。如果发生这种情形，将其记做遗漏。在真菌发展倒敏感参照中叶片组织的有效边缘之前或者认为适当的时候，以毫米为单位来测定叶片枯斑直径。

4.在塞状物周围已形成一致的枯斑后(或者在敏感与抗性参照直接已有很好的差异时)可从潮湿温室中移走品种，并在适当潮湿条件下保存品种。对相对于参照或附近植株的敏感反应或者中度及敏感反应两个参数通过视觉进行选择。

实施例7：在极端病害压力田间实验条件对核盘菌抗性进行田间筛选

对于成功开发抗核盘菌的芸苔系而言方法学上的改进是至关重要的。已经知道在一年生的基础上生成可靠的田间数据并不普遍。核盘菌是一种烈性疾病，但它仅在潮湿的夏季并且温度适度时才发生。当核盘菌的条件并不理想时，多年来在田间筛选核盘菌抗性方面很多组织都会变得至关重要。湿度饱和度、水质、接菌的有效性、和是否存在潮湿的或湿润的环境均影响农作物中病害的发展。尽管所描述的方法是针对芸苔的，但应理解这些方法可用于任何对经由子囊孢子的核盘菌感染敏感的植物。这包括向日葵(头腐)、红花(头腐)、菜豆(荚腐)、干豌豆(荚腐)、大豆(茎腐及荚腐)、紫花苜蓿(花腐病)、及莴苣(莴苣凋落)。Bardin and Huang 2001。也可参见针对大豆中核盘菌影响的美国专利申请2003/0150016。

田间关键问题已按下述方式解决：

(a)适当的人工接菌用于连续数据收集：由于并不总是在田间可触发天然接菌，因此开发了通过花瓣来模拟感染的接菌方式。用于真菌的载体可以是定植了核盘菌并将在全部花瓣凋落时进行散播的Niger种子(Guizotia abyssinica-Nyer种子)。

(b)水质与核盘菌：最初，使用地下水来灌溉移植了核盘菌的田地。不过，在低降雨量及高温或低温的年份里观察到缺乏感染转移。体外试验已经证实了地下水会抑制核盘菌生长。通过实验室及田间试验，认为去离子(DI)水处理可改变地下水水质，防止其对核盘菌发展的抑制作用。因此，使用DI水来灌溉极端病害压力田间研究用地。理论上，处理过的去离子水与最初的地下水的不同之处在于清除了例如镁与钙(石灰)这样的矿物质，而pH不受影响。核盘菌会产生可散播的毒素--草酸，以协助感染过程(US 6,380,461)。钙可以与草酸结合生成草酸钙。在去离子水中除去了钙很可能造成了水质改变，可使得核盘菌生长。因此，可使用低矿物质或者无矿物质的水源，例如降低或者除去镁与钙的水源。

(c)通过叶湿润传感器进行灌溉：为了在田间保持持续的湿润，使用了仅在湿度低于预设阈值时候才会触发灌溉的叶湿润传感器(Campbell Scientific)。理想的灌溉可以促进病害发展并增强对病害抗性的筛选。但过度地灌溉可能会干扰有意义的评估。特别地，在单一基因型彼此邻近处于一排这样的研究设置中，某一类型出现倒伏会导致病原体通过植株对植株接触的方式进行转移，并增加了在另一个基因型上病害的发病率。这样，对另一个基因型的核盘菌抗性得分就会低估其在更为均一种群中的潜在表现。在自然田间数据试验中，过度灌溉会通过增加某个给定基因型的倒伏而创造一个对核盘菌更有利的环境。这样，会由于过度灌溉而曲解试验项目的表现，例如在2005 NDSU试验中发生的那样(参见图2)。

(d)提供围栏，以帮助维持病害发展所必需的微环境：为了使得病害可以在干燥、炎热和/或多风的季节发展，使用了网状围栏。

这些新方法同上述的繁育与杂交努力相关联，从而可以对抗核盘菌的卡诺拉系进行精心选择。新方法可在有利于核盘菌的条件下控制病害发展、可靠表达表型并鉴定多个不同品系，从而改进图1中所示的柱状图。

开发了下述方法，用于在田间筛选核盘菌抗性。

一致性

核盘菌与环境及植物品种相作用。收集的数据反应了这种作用的所有方面。为了减少变化，需要在(1)植物品种、(2)接菌及(3)环境方面有最大的一致性。这是收集可靠数据的先决条件。

地点选择/试验设计/栽培

1.鉴定可以移植核盘菌用作天然补充接菌及人工接菌的地点。如果该地点没有核盘菌定植下来，可以尝试通过感染诸如大豆或白豆这样的其它宿主来产生核盘菌，用诸如Niger种子这样的载体来接菌，或者直接导入核盘菌。

2.如果可能使植物项目位于重复的用地或者行列中。对合适的敏感与/或抗性参照使用随机化完全区组设计(RCBD)(RCBD在每个组中均有每种单位的实验品种(重复))。尽可能使得实验较小以降低由于环境变化导致的误差。应使用连续参照，表现通过相对于参照的形式来表示。参照的成熟应与检测系的成熟相一致。

3.尽可能地种植密集健康的卡诺拉农作物以促进病害发展。播种率应当一致。精确种植是优选的，或者减少植株使植株数目一致。为了促进病害发展，可以考虑在农作物周围或者其上面通过植树带或额外的过道和/或安装网状物的方式来使用防风墙。

有利的环境/灌溉/补充自然感染

核盘菌茎腐的发展是环境依赖的，仅有接菌是不够的，除非在农作物中存在有利的潮湿或湿润的微环境。感染的相对成功率可通过相对于实验中敏感参照所受影响的程度来测定。

由于自然感染几乎不可能具有可靠性或一致性，因此使用灌溉系统来促进病害发展。灌溉可以在农作物一产生冠层就开始进行，这样冠层可保持潮湿。在开花之前，目标是保持表层土的湿润并达到核盘菌萌发的条件，从而使得子囊盘进行发育，产生可定植在花瓣上的子囊孢子。

一旦在花瓣上定植，目标就是在足够的花瓣凋落后促进病害向叶片及茎上发展。这种转移在具有延长的潮湿或湿润状况的年份里可自然发生。叶片湿度感应器通过在冠层干燥时触发灌溉来调节冠层中的湿度。病害的转移可被地下水所抑制(尤其是在更低温度时)，因此，如果可行，应使用收集的雨水或者去离子地下水。直至敏感参照的茎感染重复发展之前，豆需要保持冠层的湿度。

当环境对于病害发展非常重要时，实现病害发病率及严重度同下列因素的时机直接相关：有利的环境、生长阶段及接菌压力。

可使用网状围栏来维持潮湿或湿润条件，使得病害得以发展。

接菌准备/人工感染

使用人工接菌作为主要接菌，以定点增加病害压力，并使得病害发展与极端病害压力下的相似。在这种情况下自然接菌为补充接菌。为了该目的可使用定植了核盘菌的Niger种子作为载体。可按下列步骤进行：

1.如实施例6所述，制备核盘菌的PDA平皿，于19℃(+/-3℃)温育3-6天，或者直至菌落接近平皿边缘。

2.将5到6个菌丝塞状物(直径2-4mm)置于含按0.5g/l添加了链霉素的200ml(+/-100ml)PDB的烧瓶内，开始产生新鲜的菌丝体。

3.在暗处于摇床上以1.2rpm、19C(+/-3C)温育2-3天。

4.从菌丝群中取走PDB，在搅拌器中使菌丝群均匀化，加入Tween^TM(约0.5ml/l)并稀释到1-3g(最优为2g)新鲜菌丝/1L水，用于田间接菌。称出菌丝体后，可加回PDB。为了使接菌物定植在Niger种子上，可采用下述流程：按H₂O∶Niger为1∶2的比例将种子高压灭菌2次。在Niger冷却后，加入约100ml的PDB：500g Niger并在暗中于室温下温育。可以直接使用PDB或者按需要进行稀释。一旦完成温育以及真菌接种物在种子上的发育，干燥接种物并打散种子结块。典型地，这需要花费5至15天时间。为了模拟并增强自然感染，可在有效的花瓣凋落期间进行接菌。

5.保证在开花前有足够的Niger接种物。

6.在使用前先筛一下定植了核盘菌的Niger种子。可以用手将定植了的种子铺在植物品种上。对于大规模接菌，可使用肥料撒施机或其它撒放设备，例如鼓风喷雾器来散播Niger种子。应在每个行列的前面或者后面使用这些设备。

7.使用约5-20kg/ha的Niger种子。应确认散播的一致性与质量。

8.应用Niger的目标是在每个植株上产生很多可发展为茎感染的叶片枯斑。

9.如果需要，应重复应用定植了核盘菌的Niger种子。

分级

一旦在敏感和/或抗性参照上出现了预期的发病率以及症状扩展到茎部，便可对感染植株的百分比及病害严重度进行分级(表2和15)。当有了预期的分化时，推荐进行分级。后续分级的可靠性降低，因为其结果会受到在初次分级期间的冠层及群落地段物理效应的影响。相对于症状在受影响植物的产量上的作用来调整分级。例如，在较低茎部的环状剥皮要比在较高茎部的环剥对产量有更大影响。影响侧总状花序会降低只是在该总状花序上的荚的产量，而影响主总状花序会影响整个植株上的荚。这可通过SSDS得分反映出来；参见表15。

每行或每块用地上分级植株的数目及位置可通过相对于实验中该植物以及病害的发展来确定。在横排或者用地中间，病害压力趋于最大一致。在计数中应排除非典型的及小的植株，优选地，在计数前或者计数时应将其从横排中排除。在时节早期进行疏苗可以解决这个问题。如果可能，出界植株不应被分级。

为了能够对品种进行可行的比较，并说明环境变化，试验应包括诸如46A65和46A76这样的连续参照。

表15.对田间-Pioneer SSDS田间-菌核病严重度-田间方面单个植株的症状严重度进行记分的指导方针。括号中的数字是指公共等级。

实施例6和7中的方法需要重要的人类技术干预，用于开发本发明的核盘菌抗性系中。重要的人类技术干预可以进行全年的选择试验，并提供一致的且可重复的结果。此外，实施例7中的方法不管自然环境如何均可在每一年都产生极端病害条件。

实施例8：产生对核盘菌具有抗性的近交系

表13略述了在开发近交系中的工作，并在在2003和2004年成功开发了原种近交系。其性状是综合的，包含了来自2003/2004年试验的原种杂交品种中的约3-4个基因。由于种群T中的品种属于卡诺拉品系(表12)，因此在表13中略述的不同方法都可使用。在原种近交系承担了50％遗传的直接杂交中(F₂)，性状回复(即核盘菌抗性)是可行的。

抗性来源中有BC1可使性状回复更加容易，但危害是降低了原种近交系遗传背景的比例。如果首要目标是恢复抗性，而不怎么考虑其它繁育结果，例如品系、杂种优势等，则可通过繁育BC2来完全回复抗性，或者利用抗性背景使其更高。将BC1引入敏感原种的目的是回复原种背景(75％)与核盘菌抗性性状，但核盘菌抗性性状的回复会变得更加复杂。

一旦回复了具有田间抗性的原种系，就可以使用新的育种方法，其中抗性回复会变得更为可行(例如，田间抗性原种与田间抗性原种杂交)。在这类杂交中回复抗性相对简单，并可用F1品种进行加倍单倍体化，并且抗性后代在遗传上是稳定的--即固定了，可产生重复的且可预期的应答。

实施例9：产生对核盘菌具有抗性的杂种

由于实际情况是部分抗性并非是显性的，所以对于涉及杂种种子生产的父系与母系近交系而言均有必要具有抗性。因此，田间抗性近交系一定是从父系及母系遗传素材库中开发的。已知杂种农作物由于存在基于杂种中父系与母系组分遗传距离的杂种优势，因此相比其先天组分具有更高产量，

通过将充分建立起来的敏感父系及母系近交系(表13)与具有本发明中的核盘菌抗性系进行杂交，回复了具有多种原种背景与抗性背景组合(例如如表13中所示的25-75％原种背景)的有田间抗性的原种系。这种新开发的父系及母系近交系同时具有田间抗性以及先前在其原种而不是敏感亲本中所确定的遗传距离。与正规杂交育种类似，随后进行了广泛的田间试验以确定哪一种近交组合可提供高产量并对核盘菌提供足够水平的田间抗性。

一旦鉴定出很多可产生具有高产量以及对核盘菌有田间抗性的杂种的原种父系与母系，可通过将这些品系与开发中的可进一步提高产量以及对核盘菌的田间抗性的近交系来进行杂交，以获得更多进展。

因此，本发明不但包括那些在本文中特别描述过的品系，还包括其任何后裔或后代，尤其是通过选取加倍单倍体系所产生的具有核盘菌抗性性状的后代。本发明还包括任何使用本文中所描述的品系所产生的杂种。此外，本发明包括来源于改良的植物、品系或后代的种子、植物细胞及包括花粉与胚珠在内的细胞素材。植物细胞可以按照本领域技术人员所知的方法从植物上进行分离。例如，参见Chuong et al.，(1985)；Barsby，T.L.，et al.，(Spring 1996)；Kartha，K.et al.，(1974)；Narasimhulu，S.，et al.，(Spring 1988)；and Swanson，E.，(1990)。

可按照本领域技术人员已知的方法，使用本发明中的植物来栽培农作物。此外，可使用本发明中的植物来进行油类与膳食的生产。可按照本领域技术人员已知的方法，使用本发明中的植物种子来生产卡诺拉油。该方法包括碾碎种子，从种子中提取原油，并对所述原油进行精炼、脱色及除臭，以产生卡诺拉油。可按照本领域技术人员已知的方法来生产卡诺拉膳食。因此，本发明也包括碾碎来自本发明中的植物的种子。

最后，可按照本领域技术人员已知的方法，使用本发明中的植物来进行育种，尤其是下述的实施例。

V.本发明的进一步的实施方案

实施例8和9中的自交和杂交系可用本领域技术人员已知的如上和如下所述的植物育种方法获得。除了开发自交和杂交系，本发明也指导用本发明的抗核盘菌系来满足其它植物育种目的的方法。

该方法的一个实施方案是将本发明的核盘菌抗性系与其它卡诺拉植株杂交，以形成第一代F 1植物种群。由本方法产生的第一代F1植物种群也是本发明的一个实施方案。该第一代F1植物种群含有本发明的必需的完整的核盘菌抗性系等位基因。典型地，在本领域中，F1杂合子被认为具有每个纯合亲本的所有等位基因。本领域普通技术人员可通过育种书籍或分子生物学方法来鉴定特定的用本发明中核盘菌抗性系产生的F1植株，任何这种单个植株也包括在本发明中。这些实施方案也包括对本发明核盘菌抗性系使用了转基因或单基因转换的这些方法的用途。

本发明的另一个实施方案是在育种中使用本发明的核盘菌抗性系的方法，它涉及与本发明的核盘菌抗性系进行任意次数的重复回交。通过回交方法，或此处所述的转基因方法，此处所述的单基因转换方法，或其它本领域普通技术人员已知的育种方法，可开发至少保留25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％本发明中核盘菌抗性系的遗传谱的单个植株和植物种群。在后代中保留的遗传图谱的百分比可通过谱系分析或通过基因技术，例如分子标记或电泳进行测定。在谱系分析中，平均约50％的起始种质在与另一个品系杂交后可传递到后代品系中，与不同品系再次杂交后约25％可被传递，等等。分子标记也可用于验证和/或测定后代系的谱系。

下面是产生来源于本发明的核盘菌抗性系的品系的特定方法。本领域普通技术人员可将本发明的核盘菌抗性系与另一种卡诺拉植株，例如原种系杂交。来源于该杂交的F1种子含有单拷贝100％来源于本发明的核盘菌抗性系的等位基因和单拷贝100％其它植株的等位基因。培养F1种子，以形成纯合种群，并进行自交，从而得到F2种子。F2种子平均具有50％来自本发明的核盘菌抗性系和50％来自其它卡诺拉植株的等位基因，但来自种群的多个个体植株其更大比例的等位基因是来自本发明的核盘菌抗性系(Wang J.and R.Bernardo，2000 and Bernardo，R.andA.L.Kahler，2001)。培养F2种子，并根据视觉观测和/或性状测定来进行植株的筛选。用于筛选的性状可以是与本发明的核盘菌抗性系相关的性状。筛选具有所需的本发明的核盘菌抗性系的性状的衍生后代，并对每个植株单独进行收获。将来自每个植株的F3种子在单独的行进行培养，并允许自交。然后收获所选择的行或来自这些行的植株，并分别脱粒。再次根据视觉观测和/或植株所需性状的测定来进行筛选。重复多次进行培养和筛选过程，直到获得本发明中的核盘菌抗性系的自交系。本发明的核盘菌抗性系的自交系将具有核盘菌抗性性状。

如果与核盘菌抗性系杂交的其它卡诺拉植株也含有核盘菌抗性基因，则从后代发育的自交系具有等于或高于在本发明的核盘菌抗性系中的表达水平的核盘菌抗性水平。自交系平均50％的基因来自本发明的核盘菌抗性系，但来自种群的多种个体植株其更大比例的等位基因是来自本发明的核盘菌抗性系。杂交、自交和筛选的繁育过程可重复进行，以产生另一个本发明的核盘菌抗性系衍生的卡诺拉植株的种群，其平均25％的基因来自本发明的核盘菌抗性系，但来自种群的多种个体植株其更大比例的等位基因是来自本发明的核盘菌抗性系。

可在多个方面修改先前的实施例；例如，在每次自交代中可进行或不进行筛选，可在实际自花授粉过程之前或之后进行筛选，或可通过收获所述育种过程中任何点上对个体的荚、植株、行、或用地进行单独筛选。另外，可在流程的任何步骤使用二倍体化单倍体育种方法。在自交的每一代和任何代产生的植物种群也是本发明的实施方案。

本发明的另一个实施方案是通过将本发明的核盘菌抗性系与另一个卡诺拉植物杂交，并对通过该杂交的自交所获得的本发明的核盘菌抗性系的F1种子或F2种子或任何后代使用二倍体化单倍体方法，从而获得纯合的核盘菌抗性系的方法。

而且本发明进一步也指导通过将本发明的核盘菌抗性系与卡诺拉植株杂交、培养后代种子，并用本发明的核盘菌抗性系重复杂交和培养步骤1到2次、1到3次、1到4次或1到5次，并在第一、第二、第三、第四或第五次杂交后进行任何次数的自交，从而产生本发明的核盘菌抗性系的方法。

因此，任何和所有用一个或多个本发明的核盘菌抗性系进行育种的方法都是本发明的一部分，包括自交、谱系繁育、回交、杂合子产生和与种群杂交。所有以一个或多个本发明的核盘菌抗性系为亲本产生的植株和种群均在本发明的范围内。本领域普通技术人员可使用特定的分子标记图谱和/或育种记录来鉴定来源于一个或多个本发明中核盘菌抗性系的后代品系或后代种。

所有以一个或多个本发明的核盘菌抗性系为亲本产生的植株均在本发明的范围内，包括那些从来源于本发明的核盘菌抗性系的自交系所产生的后代。

本发明的另一个实施方案是本发明的核盘菌抗性系的单基因转换。当通过传统的(非转化)育种技术，例如回交引入DNA序列时会发生单基因转换。可通过这些传统的育种技术引入天然存在的或转基因的DNA序列。通过该过程所转移的所需性状包括，但不限定于，育性改变、脂肪酸图谱改变、其它的营养增强、产业增强、病害抗性、昆虫抗性、除草剂抗性和产量增强。目的性状从供体亲本转移到循环亲本，在这种情况下，卡诺拉植株也包括在内。单基因性状从显性等位基因或隐性等位基因的转移而获得。可通过直接筛选与显性等位基因相关的性状来进行含目的性状的后代的筛选。对通过隐性等位基因转移的性状的后代筛选需要培养和自交第一次回交，以测定哪个植株携带隐性等位基因。隐性性状需要在连续回交世代中进行另外的后代检测，以测定目的基因的存在。在筛选目的性状时，根据循环亲本的表型筛选后代。应理解，偶尔另外的多核苷酸序列或基因可与目的单基因转换性状一起被转移。所含有来自本发明所示的卡诺拉植株轮回亲本中至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％基因的后代，加上含有单基因转换性状的后代，被认为是本发明的核盘菌抗性系的单基因转换。

应理解本发明的核盘菌抗性系可通过常规的胞质基因、核基因或其它因子的操作而在上述参考文献中所述的雄性不育形式中产生。这种实施方案也在本权利要求的范围内。本发明的核盘菌抗性系可通过本领域已知的各种方法，包括使用机械方法、化学方法、自体不兼容、胞质雄性不育(甘蓝或其它系统)或核雄性不育来制备为雄性不育。术语“制备为雄性不育”是指用任何可用技术产生本发明中核盘菌抗性系的雄性不育系。雄性不育可以是部分或完全雄性不育。该发明也针对使用本发明的核盘菌抗性系所产生的F1杂合种子及植株。

本发明也针对在组织培养中使用本发明的核盘菌抗性系。此处所用术语植物细胞包括来自可再生卡诺拉植株、植物愈伤组织、植物丛植的植物原生质体、植物细胞组织，和在诸如胚胎、花粉、胚珠、种子、花、穗、长角果、叶片、茎、根、根尖、花药、子叶等这样的植物或植物部分中完整的植物细胞。已成功进行了卡诺拉植株再生的组织培养和微孢子培养(Chuong et al.，(1985)；Barsby，T.L.，et al.，(Spring 1996)；Kartha，K.et al.，(1974)；Narasimhulu，S.，et al.，(Spring 1988)；Swanson，E.，(1990)。因此，从文献中可得知本领域的情况是：这些获得植株的方法从其可常规使用并具有很高成功率的意义上而言，是并且曾经是“传统的”。

本发明中核盘菌抗性系的用途也延伸到了与其它物种杂交。通常，合适的物种是芸苔科。特别是，在育种工程中可用核盘菌抗性越冬品系作为春季或半越冬品系的来源。在育种工程中，核盘菌抗性春季品系可作为半越冬或越冬品系的来源。所有这些用途也是本发明的一部分。

新的分子生物学技术的出现可以分离和检测诸如编码特定代表产物这样的具有特定功能的遗传元件。植物学领域的科学家对改造植物基因组产生强烈兴趣，使其含有和表达外源遗传元件，或另外的或修饰的天然或内源遗传元件，从而以特定方式改变植物的性状。任何通过转化插入到物种基因组中的DNA序列，无论是来自不同物种或相同物种，都统称为“转基因”。“转化”过程是将DNA插入到基因组中。在过去的15到20年，已开发出几种产生转基因植物的方法，本发明在特定的实施方案中，也与本发明的核盘菌抗性系的转化形式相关。

已开发了多种植物转化方法，包括生物和物理的植物转化流程。参见，例如Miki et al.(1988)。另外，也可使用表达载体和体外培养植物细胞或组织转化。参见，例如Evans et al(1983)，Binding(1985)和Weissbach et al.，1988。

最常用的植物转化类型包括构建表达载体。这种载体包括含有位于诸如启动子这样的调控元件控制下、或与调控元件可操作连接的基因的DNA序列。载体可含有一个或多个调控元件。

可用植物育种领域周知的传统育种技术，将通过转化技术在特定的卡诺拉植株中构建遗传性状转移到另一个品系中。例如，可使用回交方法将转基因从转化的卡诺拉植株转移到原种自交系，则得到的后代含有转基因。而且，如果用自交系进行转化，则转基因植株可与不同的品系杂交，以产生转基因杂合卡诺拉植株。此处所用“杂交”根据上下文是指简单的X被Y杂交，或回交过程。可通过转化向植物基因组中引入各种遗传元件。这些元件包括但不限定于基因；编码序列；诱导型、组成型和组织特异性启动子；增强序列；和信号及定位序列。参见美国专利6,222,101，此处通过参考整合在文中。

根据本发明用转基因植物可产生具有商业化品质的外源蛋白。因此，本领域周知的转化植物的筛选和繁殖技术可产生大量的以传统方式进行收获的转基因植物，从而可从目标组织或从总生物量提取外源蛋白。可通过例如Heney and Orr(1981)所述的已知方法从植物生物量中进行蛋白提取。

可通过鉴定所整合的用于编码外源蛋白的DNA分子在染色体上的合适位置的传统的限制性片段长度多态性(RFLP)、聚合酶链反应(PCR)分析和简单序列重复(SSR)来构建基因图谱。在这方面的示例方法参见Glick and Thompson(1993)。关于染色体位置的图谱信息可用于对目标转基因植物进行产权保护。如果进行了未授权的培育及与其它种系杂交，则可将整合区域的图谱与目标植物的相似图谱进行比较，以测定是否后者具有与目标植物共同的来源。图谱比较包括杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，这些方法都是传统技术。

同样，根据本发明，可构建表达各种农艺学目的的表型的植物。在这方面所使用的转基因示例包括但不限定于以下那些类别。

1.赋予对害虫或病害抗性的基因，它编码：

(A)植物病害抗性基因。植物防御通常由植物的病害抗性基因(R)产物与病原体对应的无毒(Avr)基因产物的特定相互作用而激活。可用克隆的抗性基因转化植物变异体，从而构建出对特定病原体具有抗性的植株。参见，例如Jones et al.，(1993)；Mindrinos et al。

(B)对真菌病原体赋予抗性的蛋白，例如草酸氧化酶或草酸脱羧酶(Zhou et al.，(1998)，US 3,303,846 and US 6,297,425)。

(C)苏云金芽孢杆菌蛋白，其衍生物或以其微模板合成的多肽。参见，例如Geiser et al.，(1986)，描述了Btδ内毒素基因的克隆和核苷酸序列。另外，可从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)购买例如ATCC登录号40098、67136、31995和31998的编码δ内毒素基因的DNA分子，。

(D)凝集素。参见，例如Van Damme et al.，(1994)描述了几种君子兰甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。

(E)维生素结合蛋白，例如亲和素。参见PCT申请US93/06487，其内容通过参考整合在文中。其应用包括亲和素及亲和素同源物作为抗昆虫害虫的杀幼虫剂。

(F)酶抑制剂，例如，蛋白酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见，例如Abe et al.，(1987)(鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)、Huub et al.，(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)、Sumitani et al.，(1993)(硝孢链霉菌α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利5,494,813(Hepher and Atkinson，1996年2月27日授权)。

(G)昆虫特异的激素或外激素，例如蜕皮激素和保幼激素，其变异体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或竞争剂。参见，例如，Hammocket al.，(1990)描述了克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达，及保幼激素的失活。

(H)表达后可破坏所影响的害虫的生理功能的昆虫特异性肽或神经肽。例如，参见Regan，J.(1994)的描述(表达产生编码昆虫利尿激素受体的DNA的克隆)，及Pratt et al.，(1989)(在Diploptera puntata中鉴定出allostatin)。也参见美国专利5,266,317及Tomalski et al.，描述了编码昆虫特异的麻痹神经毒素的基因。

(I)由自然界中蛇、蜂等产生的昆虫特异的毒液。例如，参见Panget al.，(1992)，描述了在植物中编码蝎昆虫毒素肽的基因的异源表达。

(J)负责高积累具有杀虫活性的单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、a phenylpropanoid衍生物或其它非蛋白分子的酶。

(K)参与生物活性分子修饰，包括翻译后修饰的酶，例如，天然或合成的糖酵酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶。参见PCT申请WO 93/02197，由Scott et al.描述了葡聚糖酶基因的核苷酸序列。例如，可从ATCC登录号39637和67152获得含几丁质酶编码序列的DNA分子。也参见Kramer et al.，(1993)，描述了编码烟草钩虫几丁质酶cDNA的核苷酸序列，和Kawalleck et al.，(1993)，提供了欧芹ubi4-2多聚泛肽基因的核苷酸序列。

(L)刺激信号传导的分子。例如，参见Botella et al.，(1994)，描述了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，及Griess et al.，(1994)，提供了玉米钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。

(M)疏水钜肽(hydrophobic moment peptide)。参见PCT申请WO95/16776(描述了抑制真菌植物病原体的抗菌肽衍生物)及PCT申请WO95/18855(描述了赋予病害抗性的合成抗微生物肽)，其相关内容通过参考整合在文中。

(N)膜透性酶、通道形成体或通道阻断剂。例如，参见Jaynes et al.，(1993)描述了抗菌肽-β裂解肽类似物的异源表达，以使转基因烟草植株对茄假单胞菌有抗性。

(O)病毒侵入蛋白或其衍生的复合物毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化植物细胞中的积累可对由外壳蛋白基因来源的病毒及相关病毒造成的病毒感染和/或病害发展具有抗性。参见Beachy et al.，(1990)。外壳蛋白介导的抗性已赋予转化的植物具有抗紫花苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。

(P)昆虫特异的抗体或其衍生的免疫毒素。这样，针对昆虫肠道中关键代谢功能的抗体可使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。Cf.Tayloret al.，(l994)(通过产生单链抗体片段在转基因烟草中的酶学失活).。

(Q)病毒特异性抗体。参见，例如Tavladoraki et al.，(1993)，描述了表达重组抗体基因的转基因植物可防御病毒的攻击。

(R)自然界中由病原体或寄生虫产生的发育停止蛋白。这样真菌内源α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶利于真菌定植，通过溶解植物细胞壁的同-α-1，4-D-半乳糖醛酶而释放植物的营养。参见Lamb et al.，(1992)。Toubart et al.，(1992)描述了编码大豆内源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和鉴定。

(S)自然界中由植物产生的发育停止蛋白。例如Logemann et al.，(1992)描述了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌病害的抗性增加。

(T)参与系统性获得性抗性(SAR)应答的基因产物和/或病原体相关基因产物。Briggs，S.(1995)。

(U)抗真菌基因产物(Cornelissen and Melchers，(1993)and Parijset al.，(1991)and Bushnell et al.，(1998))。

2.赋予对除草剂抗性的基因，例如：

(A)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺酰脲。这种示例基因编码如Lee et al.，(1988)和Miki et al.，(l990)分别所述的突变ALS和AHAS酶。

(B)抗草甘膦(分别由突变的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予抗性)和其它磷基化合物，例如草铵膦(草胺膦乙酰转移酶PAT)和吸水链霉菌草胺膦乙酰转移酶bar基因)，及氧化吡啶(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和cycloshexones(ACCase抑制剂编码基因)。参见，例如美国专利4,940,835，Shah et al.描述了赋予草甘磷抗性的EPSP形式的核苷酸序列。可从ATCC登录号39256获得编码突变的aroA基因的DNA分子，突变基因的核苷酸序列描述在Comai的美国专利4,769,061中。Kumada et al.欧洲专利申请O 333 033和Goodman et al.美国专利4,975,374，描述了赋予对除草剂例如L-草胺膦抗性的谷氨酸合成酶基因。草胺膦乙酰转移酶的核苷酸序列描述在Leemans et al.，(1989)欧洲专利申请0 242 246，可产生表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的模拟bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和cycloshexones，例如稀禾定和氟吡甲禾灵抗性的示例基因是Marshall etal.，(1992)所述的Acc1-Sl、Acc1-S2和Acc1-S3基因。

(C)抑制磷酸合成的除草剂，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苯基氰(腈水解酶基因)。Przibilla et al.，(1991)描述了用编码突变psbA基因的质粒转化衣藻。腈水解酶基因的核苷酸序列描述在Stalker美国专利No.4,810,648,含这些基因的DNA分子可在ATCC登录号53435、67441和67442获得。编码谷光甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达描述在Hayes et al.，(1992)中。

3.赋予或产生附加性状的基因，例如：

(A)改变脂肪酸代谢，例如，用硬脂酰ACP脱饱和酶的反义基因转化植物，以增加植物中硬脂酸含量。参见Knultzon et al.，(1992)。

(B)降低的植酸含量

(1)引入编码植酸酶的基因可在转化的植株中增强植酸的降解，增加更多的自由磷酸。例如，参见Van Hartingsveldt(1993)，描述了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列。

(2)引入可降低植酸含量的基因。例如，在玉米中，可通过克隆并再引入与负责以低水平植酸为特征的玉米突变株的单个等位基因相关的DNA。参见Raboy et al.(1990)。

(C)例如，通过用编码改变淀粉分枝模式的酶的基因转化植物而改变碳水化合物的组成。参见Shiroza et al.，(1988)(变形链球菌果糖基转移酶基因的核苷酸序列)、Steinmetz et al.，(1985)(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)、Pen et al.，(1992)(产生可表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物)、Elliot et al.，(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)、Sogaard et al.，(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点突变)和Fisher et al.，(1993)(玉米胚乳淀粉分枝酶II)。

(D)还原的绿色种子，通过在卡诺拉种子中下调CAB基因而产生(Morisette et al.，1997)。

(E)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰而降低亚油酸(参见美国专利6,063,947；6,323,392和WO 93/11245)。

4.控制授粉或杂合种子产生的基因；例如，加拿大专利2,087,703。

工业应用性

本发明中核盘菌抗性系的种子、由这类种子所产生的植株、由本发明中核盘菌抗性系杂交所产生的杂种卡诺拉植株、所获得的杂种种子、以及杂种卡诺拉植株的不同部位均可根据已知技术用于生产可食用的蔬菜油或其它食物产品。例如，生产卡诺拉油的方法可包括：(a)碾碎卡诺拉种子；(b)提取原油；及(c)对所述原油进行精炼、脱色及除臭，以产生卡诺拉油。残余的来自这些种子的固体食物成分可用作营养家畜饲料。

VI.保藏

已经由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州20852对某些种子进行了保藏，保藏物包括来自02SN41269(F4)、PTA-6777；04DHS12921(加倍单倍体)、PTA-6781；03SN40341(F4)、PTA-6776；04DHS11319(加倍单倍体)、PTA-6780；03SN40441(F4)、PTA-6779；04DHS11418(加倍单倍体)、PTA-6778中的每一个的2500粒种子。自先于本发明的申请日起，由ATCC保藏的种子就已属于Pioneer Hi-Bred International，Inc.，800 Capital Square，400 Locust Street，Des Moines，Iowa 50309-2340，并由其来保持。保藏物将由作为公共保藏中心的ATCC保藏中心保持30年、或者在最近申请后保持5年、或者在专利的有限期之内都保持--择其长者，如果保藏物在此期间内无法存活可以进行替换。此外，申请人满足37 C.F.R.Sections 1.801-1.809的所有要求。申请人对来自ATCC的保藏品种的有效性方面没有强加任何限制；不过，申请人无权放弃法律所规定的有关转移生物品种或其商业运输上的限制。对本专利所赋予的权利的侵权行为，申请人不会放弃追究。在本申请的未决期间，对于专利与商标官员以及该官员确认为有资格去处理申请的人员，可以接触这些保藏物。对本专利和/或植物品种保护法(7 USC 2321 et seq.)所赋予的权利的侵权行为，申请人不会放弃追究。

在2006年5月由苏格兰阿伯丁的NCIMB公司在布达佩斯条约所承认的公共保藏中心进行了另外的种子保藏，如下：

NCIMB 41388 Brassica napus 04SN 41415

NCIMB 41389 Brassica napus 04SN 41433

NCIMB 41390 Brassica napus 05DHS 12879

NCIMB 41391 Brassica napus 05DHS 12897

保藏日期为2006年5月12日

NCIMB 41392 Brassica napus 04CWB 930015

NCIMB 41393 Brassica napus 04CWB 930081

NCIMB 41394 Brassica napus 04CWB 930111

NCIMB 41395 Brassica napus 04CWB 930127

NCIMB 41396 Brassica napus 04CWB 930128

NCIMB 41397 Brassica napus 04CWB 930135

NCIMB 41398 Brassica napus 04CWB 930144

保藏日期为2006年5月15日

关于这些保藏品系的细节如表11所示。在每个实例中，均保藏了3000粒种子，只有NCIMB 41393例外，由于供应有限它仅保藏了400粒种子。如果需要，可以进行追加保藏。

此外，于2006年5月17日由马尼托巴省Winnipeg的加拿大国际寄存主管当局对核盘菌分离株SS#4进行保藏，其序列号为170506-01。在本文所述的所有室内筛选及选择方法以及极端病害压力田间实验条件中均可使用该分离株。诸如在表9中所列出的这样的自然田间研究数据，通过使用SS#4分离株来反映针对核盘菌天然种群的试验并确认育种工作的有效性。

出于举例的目的，通过图例与实施例的方式详细描述了前述发明。不过，很明显，可认为诸如单基因修饰与突变、季节性变种、从所述品系植株种群中选择的变异个体以及其它类似物这样的改变及修饰，仍在本发明的范畴之内。本文所使用的参考文献，无论是期刊、专利、公开申请或者其它类似物，均通过参考的方式完全整合在本文中。

应当理解到，对于本领域普通技术人员而言，某些修饰应该是而且也的确是显而易见的，这类对于本发明中所述的具体的品系、变种及流程的修饰，被认定为仍在本发明的范畴之内。

参考文献

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Claims (1)

1.代表植物种群的芸苔（Brassica）植物的细胞，其中所述种群具有：

(i)春季生长习性且是ATCC保藏号为PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780或PTA-6778；或NCIMB保藏号为41388、41389、41390或41391的植物系；或

(ii)越冬生长习性且是NCIMB保藏号为41392、41393、41394、41395、41396、41397或41398的植物系；

其中所述种群的油菜核盘菌病发病率％，即SSDI％，得分在田间相同环境与病害状态下比合适参照的SSDI％得分低60％，

在春季生长习性的情况下，所述合适参照是Pioneer Hi-Bred变种46A65、或Pioneer Hi-Bred变种46A76的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分；或

在越冬生长习性的情况下，所述合适参照是Columbus变种、或Express变种的SSDI％得分、或者这两个变种平均SSDI％得分。

2.  衍生自权利要求1的植物细胞的F1或F2子代植物的细胞。

3.  权利要求1所述的代表植物种群的芸苔（Brassica）植物的细胞，其中所述植物产生芥子油苷水平低于30微摩尔每克无油固体、而且油类中芥酸低于2％的种子。

4.  权利要求3所述的植物细胞，其中所述植物具有春季生长习性。

5.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6776表示。

6.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6779表示。

7.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6777表示。

8.    权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6781表示。

9.    权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6780表示。

10.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由ATCC保藏号PTA-6778表示。

11.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41388表示。

12.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41389表示。

13.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41390表示。

14.  权利要求4所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41391表示。

15.  权利要求3所述的植物细胞，其中所述植物具有越冬生长习性。

16.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41392表示。

17.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41393表示。

18.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41394表示。

19.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41395表示。

20.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41396表示。

21.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41397表示。

22.  权利要求15所述的植物细胞，其中植物由NCIMB保藏号41398表示。

23.   产生权利要求1所述的植物的后代的方法，包括：

（a）  将权利要求1中所述的植物与其自身或与另一种芸苔植物杂交，以产生种子；

（b）  栽培步骤（a）中所述的芸苔种子以产生派生的植物；

（c）  选择性地，对连续世代重复进行步骤（a）和（b）的杂交和培养过程，以产生由权利要求1中芸苔植物所进一步派生的植物；及

（d）  选择代表了SSDI％得分比合适参照的SSDI％得分低60％的种群的后代植物。

24.   通过权利要求23所述的方法所产生的植物的细胞。

25.   权利要求24的植物细胞，其中所述植物具有春季生长习性。

26.   权利要求24的植物细胞，其中所述植物具有越冬生长习性。

27.   权利要求1所述的植物细胞在栽培农作物方面的用途。

28.   权利要求24所述的植物在栽培农作物方面的用途。

29.   权利要求1所述的植物在繁育SSDI％得分比合适参照的SSDI％得分低60％的新芸苔系方面的用途。

30.   权利要求3所述的植物在繁育SSDI％得分比合适参照的SSDI％得分低60％的新芸苔系方面的用途。

31.   产生油类的方法，包括：

（a）  碾碎权利要求1中所述的植物的种子；及

（b）  从这些碾碎的种子中提取原油。

32.   产生卡诺拉油的方法，包括：

（a）  碾碎权利要求3中所述的植物的种子；

（b）  从这些碾碎的种子中提取原油；及

（c）  对所述原油进行提炼、漂白和/或除臭以产生卡诺拉油。

33.  权利要求1所述的植物细胞，其中所述的植物进一步代表在相同的环境及病害条件下，平均黑胫病抗性水平高于Pioneer Hi-Bred变种46A76的种群。

34.  权利要求1所述的植物细胞，其中所述的植物进一步包括转基因。

35.  权利要求1所述的植物细胞，其中所述植物是雄性不育的。

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