EA018102B1 - Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита c на биологическом микрочипе - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине и обеспечивает способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита C (ВГС) на основе анализа области NS5b генома ВГС с использованием дифференцирующего биочипа. Способ настоящего изобретения основан на двухстадийной ПЦР с получением флуоресцентно меченого преимущественно одноцепочечного фрагмента области NS5b с последующей гибридизацией этого фрагмента на биочипе, содержащем набор специфичных дискриминирующих олигонуклеотидов. Идентификацию генотипа и подтипа ВГС проводят путем определения специфичных последовательностей участков фрагмента области NS5b. Изобретение позволяет проводить анализ непосредственно из клинического образца, определять 6 генотипов и 36 подтипов ВГС, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы, снизить себестоимость анализа. Изобретение также касается биочипа, способа конструирования и набора олигонуклеотидных зондов, используемых при осуществлении способа.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины и касается способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С (ВГС) на основе анализа области Ν85Β генома ВГС с использованием дифференцирующего биочипа.

Уровень техники

ВГС относится к семейству РНК-содержащих вирусов Е1ау1ушйае и вызывает у людей инфекционный процесс, наиболее часто встречаемым осложнением которого является гепатит, перерастающий в цирроз печени и гепатокарциному (8шуеШапсе. Нераййк. СЭС Верой № 61; Υοιιηοδδί Ζ., Ка11тап 1., Κίηοαίά 1. Тйе еГГес!к оГ НСУ 1пГес!юп апй тападетеп! оп йеа1!й-ге1а!ей с|иаШу оГ йГе. Нера!о1оду. 2007 Маг.; 45(3):806-16). Этим заболеванием поражено более чем 170 млн человек на Земле, и число инфицированных продолжает увеличиваться. По всему миру насчитывается порядка 1,5 млн случаев гепатокарциномы, вызванной инфекцией ВГС. Потери, связанные с этим заболеванием только в Соединенных Штатах, оцениваются в 200 млн долларов ежегодно.

Распространённой современной тенденцией в лечении ВГС является применение комплексной терапии, включающей совместное введение мегадоз интерферона с коктейлем, содержащим как общие противовирусные препараты, так и один или два ингибитора размножения ВГС (ингибиторы специфической протеазы-геликазы и/или РНК-полимеразы) (Топшйо Р., ЕаЬпк С., Вйейо Ό., Еотаыете Е., Варе!й В., Рига М. Уа1ор1ейаЫпе йШуйгоеЫопйе: а кресйс ро1утегаке тЫЬйог оГ йераййк С уиик. Сигг Орт йуекйд Эгадк. 2007 ЕеЬ.; 8(2):150-8; 1ойпкоп С.Ь., О\теп Э.М., Са1е М. 1т. Еипсйопа1 апй !йетареийс апа1ук1к оГ йераййк С уиик Ν83.4Ά рго!еаке соп!го1 оГ апйу1та1 1ттипе йеГепке. 1. Вю1. Сйет. 2007 Арг.; 282(14):10792-803). Подобные коктейли повышают процент излечения, однако неминуемо ведут к селекции адаптивных мутантов ВГС, устойчивых к данным ингибиторам.

Идентификация генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС имеет важное значение для целей выявления лекарственной чувствительности, оценки длительности и эффективности противовирусной терапии, установления пути распространения вируса.

Для определения генотипов и подтипов вируса гепатита С в настоящее время применяются следующие методы.

I. Прямое определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) 5'-некодирующей области генома вируса гепатита С с последующим анализом полученной последовательности путем сравнения с существующей базой данных, на основании которого делается заключение о принадлежности данного образца к определенному генотипу и подтипу (набор ΤΒυΟΕΝΕ НСУ 5'-ΝΟ' (Вауег Неа1!йСаге ЬЬС, США)):

1еГГтеу 1. Сегтег. Эаузй У. Ма)е\укк! М1сйае1 Воккег, АтЬег Тйотркоп, Р. 8йа\уп Мйсйе11, Тйотак Е. 8тйй, 81ауа Е1адт, апй 1окерй Э.С. Υаο. 2003. Еуа1иайоп оГ !йе ТВиСЕЯЕ НСУ 5'-ΝΟ Сепо!уртд Кй \νί11ι !йе №\ν СепеЫЬгапап Мойи1е 3.1.2 Гог Сепо!уртд оГ Нераййк С Уиик Ггот Сйп1са1 8рес1тепк. 1. Сйп. МсгоЬю1., уо1. 41, №. 10, р. 4855-4857.

II. Метод зондов (Ыпе РгоЬе аккау (ЫРА)):

Ζ1^π§ X., Рапд М., Сйап А., ВоЬейо А., ХУагпег Ό., Υеη-^^еЬе^таη В. 2003. Эйес! сотрапкоп оГ йераййк С У1гик депо!урек !ек!ей Ьу ΙΝΝΟ-ЫРА НСУ II апй ТВиСЕЖ НСУ депо!уртд те!йойк. 1. С1т Уио1. Ос!.; 28(2):214-6;

УегЬееск 1., Маек Р., Уо11ап!к Е., Уап йег Мег\те 8., 8опд Е., №уепк Е., Уап Вапк! М. 2005. ике оГ а соттегааПу ауайаЫе йпе ргоЬе аккау Гог депо!уртд оГ йераййк С уник 5а к!гашк. 1. Сйп. МютоЬюк Эес.; 43(12):6117-9.

III. Метод экстенции генотип-специфического праймера (Рйтет-кресШс ех!епкюп апа1ук1к):

Ап!ошкйуп КА., Ак! У.М., МсЭопа1й В.В., Сйаиййагу В.К., Ып Ь., Апйопоу А.Р., Ногктап С.В. 2005. Вар1й депо!уртд оГ йераййк С у1гик Ьу рптег-кресШс ех!еп§юп апа1ук1к. 1. С1ш. МютоЬюк Ос!.; 43(10):5158-63.

ГУ. Масс-спектрометрические методы (Ма!пх-акк1к!ей 1акег йекотрйоп юшхаЕоп-Шпе оГ Й1дй! (такк крес!готе!гу)):

Шпа Е.К, Ма1акйоуа М.У., Сепегохоу Е.У., Кко1аеу Е.К, Соуогап У.М. 2005. Ма!пх-акк1к!ей 1акег йекотрйоп юшхаЕоп-Шпе оГ Шдй! (такк крес!готе!гу) Гог йераййк С у1гик депо!уртд. 1. С1т МютоЬюк 1ип.; 43(6):2810-5.

У. Методы иммуноферментного анализа (8ето!уршд оГ йераййк С уник):

Е1ка^у Е.М., 8оЬй М.А., Е1-СйепаМ Е.А., Наккап ГМ., 8йейаЬ Е1.-Эт А.В., Сйопе1т М.А. 2005. 8его!уртд оГ йераййк С уиик т йетой1а1ук1к райеп!к: сотрапкоп \νίΐ1ι а к1апйагй1хей депо!уртд аккау Όίадп. М1сгоЬю1. йГес! Э1к. ЕеЬ.; 51(2):91-4.

УТ Гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (йе!егойир1ех тоЬййу аиа1ук1к иктд !етрега!иге дгай1еп! сарШатуе1ес!торйогек1к):

МагдгаГ В.Ь., Етай М., Ыете М., ХУййуег С.Т. 2004. Сепо!уртд йераййк С у1тик Ьу йе!егойир1ех тоЬййу апа1ук1к икшд !етрета!ите дгай1еп! сарШату е1ес!горйотек1кю 1. С1ш. МютоЬюк 2004 Ос!.; 42(10):4545-51.

- 1 018102

VII. Метод инвазивных зондов (1иуабег Аззау):

Сегтег И. Ма)е\\'зк| Ό.Α., Уинд В., Мйсйей Р.8., Уао Ю. 2006. Еуа1иа11оп оГ 1йе туабег аззау Гог деио1уршд йераййз С упиз. I. С1ш. М1сгоЫо1. ЕеЬ.; 44(2):318-23.

VIII. Метод гнездовой ПЦР с последующим структурно-специфичным расщеплением (№з1еб гез!пс1юи зйе-зресйтс РСК):

Кгеки1оуа Ь., Кейак V., Аакб А.Е., Нагпз Е., Рбеу Ь.А. 2001. №з!еб гез!пс1юи зйе-зреЫйс РСК 1о бе!ес( аиб 1уре йераййз С уйиз (НСУ): а гарчб тейюб 1о бчзйидшзй НСУ зиЫуре 1Ь Ггот о!йег деио!урез. I. СИи. МкгоЬюЕ Мау; 39(5):1774-80.

IX. Высокоэффективная жидкостная хроматография (беиаЫпид Ыдй-регГогтаисе 1к|шб сйготаШ дгарйу):

Ыете М., Егай М., Раде 8., НШуагб Ό., Ачйтеег С. 2004 Нераййз С деио1уршд Ьу беиаЫпид Ыдй-регГэгтаисе Ыцйб сйгота!одгарйу. I. С1т. МкгоЫоЕ 1аи.; 42(1):158-63.

X. Транскрипционно-опосредованная амплификация в сочетании с методом зондов (йатспрЕои-тебчакб атрййсабои ш сои)иисйои \νίΐ1ι Ые 1те ргоЬеаззау):

Сотаиог Ь., Е1кт С., Ьеиид К., Кга_)беи М., Кгоидшз! К., Мсо1аз К., Ногаизку Е., беМебша М., КйНсШ-н Р., 8аЬ1ои Е., Ζ^е^тапп К., 8йег1оск С. 2003 8иссезз1и1 НСУ деио!уртд оГ ргеуюиз1у Гайеб аиб 1ο\ν У1га1 1оаб зреЫтеиз изтд аи НСУ ΚΝΑ диаШабуе аззау Ьазеб ои ι^апзс^^рι^οп-теб^аιеб атрййсабои т софиисйои тейй Ые 1те ргоЬе аззау. I. С1т Уйо1. 8ер.; 28(1):14-26.

XI. Метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления (МеНшд сигуе аиа1уз1з): Ьопз М. Науегзбск, СгаШ С. Ви11оск, аиб Эау|б Е. Вгаиз. 2004. 6еио1уртд оГ Нераййз С Уйиз Ьу МеШид Сигуе Аиа1уз1з: Аиа1уйса1 Сйагаскпзйсз аиб РегГогтаисе. С11шса1 Сйетэзйу 50, Νο. 12, р. 2405-2407.

XII. Прямое определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) области Ν85Β вируса гепатита С с последующим анализом полученной последовательности путем построения филогенетического дерева и определения генотипа и подтипа исследуемого образца на основании локализации анализируемой последовательности в одном из кластеров данного дерева (Ν85Β зедиеистд Го11отееб Ьу рйу1одеиейс аиа1уз1з):

К. 8аηб^ез-8аиие, Р. Оеиу, С. Раздшег, V. ТЫЬаи!, 6. Пиуегйе, I. Поре!. 2003. ^е!е^т^п^ид Нераййз С деио!уре Ьу ашйухшд Ые зециеисе оГ Ые Ν85Β гедюи. 1оита1 оГ У1го1од1са1 МеЙюбз. Уо1. 10, р. 187-193;

Ьарегсйе 8., Ьиие1 Е., Поре! П А1ат 8., Оеиу Р., ЭиуегНе 6., Саибу С., Рате1о!зку ЕМ., Р1аийег ЕСУ РоххеНо В., ТЫЬаи1! V., ТозеЫ Е., ЬеГгеге ЕЕ 2005. Сотрапзои оГ Нераййз С уйиз Ν85Β аиб 5' иоисобтд деие зедиеисшд тейюбз т а тиШсеШег з!ибу. I. С1ш. МюгоЫок ЕеЬ.; 43(2):733-9;

Нги-Цуз/угг 1., Ве1б М., 6иа1Ьейиз НиЬейиз М., СиейоисНе Т., Соите К., Vаи Ьег Меег, С., Веайуз Мала (Вауег НеаИйсаге ЬЬС). МеЫобз аиб геадеи!з Гог деио!уртд НСУ. А0/2007/076493. Ыктайоиа! Аррйсайои Νο. РСТ/И82006/062582. РиЬйсайои Ьа1е: 05.07.2007.

Методы Ц-ЕУ, УЗ^Ц основаны на анализе генотип- и подтип-специфических последовательностей 5'-некодирующей области генома ВГС (5'-ЫС). Анализ последовательностей 5'-ЫС области дает возможность однозначно идентифицировать все 6 генотипов ВГС, однако обладает низкой эффективностью (менее 70%) в отношении дифференциации подтипов генотипа 1, в частности подтипа 1Ь, являющегося наиболее вирулентным и устойчивым к терапии рибавирином и интерфероном (К. 8аηб^ез-8аиие, Р. Оеиу, С. Разсц-Нег V. ТЫЬаи!, 6. Пиуегйе, I. Поре!. 2003. ^е!е^т^п^ид йераййз С деио!уре Ьу ашйухшд Ые зес-щемсе оГ Ые Ν85Ρ гедюи. 1оита1 оГ Уйо1од1са1 МеЫобз, νο1. 109, р. 187-193; ЬарегсНе 8., Ьиие1 Е., Поре! I., А1а1и 8., Оеиу Р., ОтегПе 6., 6аибу С., Рате1о!зку 1.М., Р1аийег ЕСУ РоххеНо В., ТН1Ьаи1! V., Тозе!й Е., ЬеГгеге ЕЕ 2005. Сотрапзои оГ йераййз С \'йиз Ν85Ρ аиб 5' иоисобшд деие зедиеистд тебюбз 1и а тнЫсегИег з!ибу. I. С1т. МкгоЫоЕ ЕеЬ.; 43(2):733-9; Саи!а1оиЬе ТЕ., ЬарегсНе 8., СаШаи Р., ВоисНагбеаи Е., бе ЬатЬайепе X., бе Мксо Р. Аиа1уз1з оГ Ые 5' иоисобшд гедюи \'егзиз !Не Ν85Ρ гедюи ш деио!уршд йераййз С \'йиз 1зо1а!ез йот Ь1ооб боиогз ш Егаисе. I. С1ш. МкгоЬюк 2006 йт.; 44(6):2051-6; МигрНу Ό.6., АШетз В., ОезсНеиез М., Шкета! Ν., Моиззеаи К., 8аЬЬай 8. 2007. Изе оГ 8ециеисе Апа1уз1з оГ !Не Ν85Ρ Кедюи Гог Коийие 6еио1уртд оГ Нераййз С У|гиз тейН КеГегеисе !о С/Е1 аиб 5'ИТК 8ециеисез. I. С1ш. МюгоЫок ЕеЬ. 7).

В настоящее время только анализ области Ν85Ρ позволяет идентифицировать подтип 1Ь со специфичностью, близкой к 100%. Более того, исследование последовательностей данной области дает возможность выявить значительно большее число подтипов, чем при анализе последовательностей 5'-ЫС (Тйотаз Е., Шсо! Е., 8аηб^ез-8аиие К., ЬиЬо1з М., ^ед^аиб-ΑЬ^аνаие1 Е., А1пс Ь., Регои ЕМ., Разс.|шег С., коре! I. 2007. Сеиейс бйегзйу оГ НСУ деио!уре 2 з1гашз ш зои!Н теез!еги Егаисе. Меб Уйо1. Ет; 79(1):2634; Шсо! Е., ^ед^аиб-ΑЬ^аνаие1 Е., 8аибгез-8аиие К., Вои1ез!ш А., ЬиЬо1з М., А1пс Ь., Уше1 ^.Р., Разс.|1.йег С., коре! I. 2005. Не!егодеиейу оГ йераййз С \агиз деио!уре 4 зйашз спсЫайид т зои!й-теез!еги Егаисе. ί. Сеи. Уго1. ^аη.; 86 (Р!. 1):107-14).

Таким образом, проведение анализа последовательности области Ν85Ρ в настоящее время является необходимым для идентификации генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС с целью выявления лекарственной чувствительности, оценки длительности и эффективности противовирусной терапии, ус

- 2 018102 тановления пути заражения (Ьаретсйе 8., 8аипе К., Эепу Р., ЭнуегНе О., А1ат 8., Сйа1х М.Ь., Саибу С., Ьипе1 Р., Ра\\1о1кку 1М.. Рауап С., Роххейо В., Тата1е1 С., ТЫЬаик V., Уа11е1 8., Воисйатбеаи Р., 1хоре11.. Ьекгеге 1.1. 2006. ипк|ие Ν85Β йераШк С νίπ.18 депе кес.|иепсе сопкепкик 6а1аЬаке ίκ еккепИа1 кот к1ап6аг61хаОоп ок депо1уре 6е1егтта1юпк т тиШсейег ер1бетю1од1са1 к1и61ек. 1. С1т. МюгоЬю1. РеЬ.; 44(2):614-6; Кшкеп С., Уик1т К., Воукт Ь., Вкйагбкоп В., 2005. Тйе Ьок А1аток йераИИк С кециепсе бйаЬаке. ВютГогтаОск РеЬ. 1; 21(3):379-84).

Метод секвенирования последовательности области №5В ВГС с последующим филогенетическим анализом (XII) требует постановки реакций амплификации и секвенирования, проведения дополнительной очистки продуктов реакций после каждой из вышеперечисленных стадий и последующего анализа на автоматическом секвенаторе. Более того, последующий анализ хроматограмм, конструирование множественного выравнивания и построение филогенетических деревьев предъявляют повышенные требования к квалификации персонала, что препятствует широкому использованию данного подхода для анализа потока клинических образцов в условиях ординарной диагностической лаборатории.

Метод выявления серотипов с помощью вариантов иммуноферментного анализа (V) позволяет выявлять лишь ограниченный набор генотипов и подтипов (1а, 1Ь, 2а, 2Ь, 3а, и 4а) и требует наличия высокоочищенных моноклональных антител для каждого серотипа.

Также для перечисленных выше методов идентификации генотипов и подтипов отмечены следующие недостатки.

Коммерческий набор ΙΝΝΟ-ΕίΡΑ (II) и его применение в сочетании с транскрипционноопосредованной амплификацией (X) отличается высокой себестоимостью и идентифицирует ограниченное количество подтипов.

Метод с использованием генотип-специфических праймеров в пробирке (III) требует постановки независимых реакций по количеству генотипов (т.е. не менее 6) для выявления одного только генотипа.

ПЦР-гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (VI) и метод гнездовой ПЦР с последующим структурно-специфичным расщеплением (VIII) трудоемки, занимают большое количество времени и требуют типовых стандартов на каждый определяемый генотип и/или подтип.

Метод инвазивных зондов (VII) идентифицирует только генотип и не позволяет сделать заключение о подтипе, что является серьезным ограничением для его применения в клинической практике, где необходимо выявление лекарственно-устойчивых разновидностей ВГС (по крайней мере, 1Ь и 46) для оценки эффективности и длительности терапии.

Методы масс-спектрометрии (IV) и ВЭЖХ (IX) требуют наличия дорогостоящего оборудования, дополнительных стадий подготовки образца для анализа и идентифицируют ограниченное число подтипов.

ПЦР с детекцией в режиме реального времени (XI) выявляет наличие только самых распространенных генотипов и подтипов, и при этом имеет весьма высокую стоимость для рутинного анализа.

Таким образом, в данной области существует острая потребность в разработке способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокими специфичностью и информативностью в отношении числа идентифицируемых генотипов и подтипов, а также невысокой стоимостью.

Раскрытие изобретения

В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача разработки способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С может быть успешно решена путем использования биологических чипов (микрочипов) для анализа области Ж5В генома ВГС.

Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С (ВГС) на основе анализа области №5В генома ВГС на биочипах выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью выявления всех 6 генотипов (1-6) и 36 подтипов ВГС (1а-1е, 2а, 2Ь, 2с, 26, 21, 2_), 2к, 21, 2т, 3а, 3Ь,3к, 4а, 4с, 46, 4к, 4й, 41, 4к, 4п, 4о, 4р, 4г, 41, 5а, 6а, 6Ь, 66, 6д, 6й, 6к) в клинических образцах со специфичностью, близкой к 100%, за счет анализа последовательности области №5В, а также низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью метода гибридизации на биочипах, могут быть использованы для оценки и прогнозирования тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определения терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, а также для эпидемиологического генотипирования.

- 3 018102

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β генома ВГС с использованием олигонуклеотидного биочипа. Способ настоящего изобретения основан на двухстадийной ПЦР с получением флуоресцентно меченого преимущественно одноцепочечного фрагмента области Ν85Β с последующей гибридизацией этого фрагмента на биочипе, содержащем набор специфичных дискриминирующих олигонуклеотидов, комплементарных вариантам последовательностей области Ν85Β, специфичных в отношении генотипов и подтипов. Способ предусматривает следующие стадии:

(а) обратную транскрипцию, совмещенную с ПЦР (ОТ-ПЦР), с использованием вирусной РНК в качестве матрицы и первой пары праймеров, специфичных к фрагменту области Ν85Β;

(б) асимметричную амплификацию фрагмента области Ν85Β с использованием в качестве матрицы продукта ОТ-ПЦР, полученного на стадии (а), второй пары специфичных праймеров и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым, в качестве субстрата, с получением преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента;

(в) обеспечение биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (б), и выбранную из группы, включающей: а) соответствующие специфичные для каждого из генотипов ВГС (генотип-специфичные) последовательности фрагмента области Ν85Β и б) соответствующие специфичные для каждого из подтипов ВГС (подтипспецифичные) последовательности фрагмента области Ν85Β;

(г) гибридизацию амплифицированного меченого продукта, полученного на стадии (б), на биочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;

(д) регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.

В одном из своих воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (а) используют первую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 121 и 122.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (б) используют вторую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 121 и 123.

В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (б) один из праймеров второй пары используют по меньшей мере в десятикратном молярном избытке по отношению ко второму праймеру.

В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (б) в качестве флуоресцентно меченого дезоксинуклеозидтрифосфата используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически- или фотоиндуцируемой сополимеризации.

В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что биочип содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 1-120.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что регистрацию результатов на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что интерпретацию зарегистрированных результатов на стадии (д) проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в элементах биочипа, содержащих олигонуклеотидные зонды, специфичные к генотипам ВГС, тем самым идентифицируя генотип исследуемого образца; в случае идентификации генотипа на втором этапе анализируют только элементы биочипа, содержащие олигонуклеотидные зонды, специфичные к подтипам идентифицированного генотипа, независимо от наличия сигналов в элементах, содержащих зонды, специфичные к подтипам других генотипов.

Наконец, в еще одном своем воплощении способ дополнительно включает оценку и прогнозирование тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определение терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии и/или эпидемиологическое генотипирование на основе проведенной интерпретации результатов гибридизации.

В своем следующем аспекте данное изобретение относится к биочипу для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, представляющему собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, причем последовательности зондов представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 1-120.

- 4 018102

В следующем воплощении данного аспекта настоящего изобретения биочип характеризуется тем, что он представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически- или фотоиндуцируемой сополимеризации.

Следующим аспектом данного изобретения является набор олигонуклеотидных зондов для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, имеющих последовательности в 8Еф ГО N0: 1-120.

Наконец, еще одним аспектом данного изобретения является способ конструирования набора олигонуклеотидных зондов, используемых для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, предусматривающий раздельный выбор нескольких дискриминирующих зондов для каждого из генотипов и подтипов, последовательности которых комплементарны последовательностям различных участков исследуемого фрагмента области Ν85Β.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.

Краткий перечень фигур

Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных черт и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на фигуры чертежей, на которых:

фиг. 1 представляет принципиальную схему проведения анализа области Ν85Β ВГС с целью идентификации генотипа и подтипа ВГС на биологическом микрочипе;

фиг. 2 представляет схему выбора олигонуклеотидов для идентификации генотипов и подтипов на основе анализа фрагмента области Ν85Β генома ВГС;

фиг. 3 представляет схему размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе;

фиг. 4А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1а;

фиг. 4Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1а;

фиг. 5А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1Ь;

фиг. 5Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1Ь;

фиг. 6А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1е;

фиг. 6Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип 1е;

фиг. 7А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2а;

фиг. 7Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2а;

фиг. 8А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2ί;

фиг. 8Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2ί;

фиг. 9А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 3, подтип 3 а;

фиг. 9Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 3, подтип 3 а;

фиг. 10А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4а;

фиг. 10Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4а;

фиг. 11А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 46;

фиг. 11Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 46;

фиг. 12А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 5, подтип 5а;

фиг. 12Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 5, подтип 5а;

фиг. 13А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 6;

фиг. 13Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в ре

- 5 018102 зультате анализа образца ВГС, имеющего генотип 6.

Осуществление изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С на основе анализа области Ν85Β с помощью биологического микрочипа.

В заявленном способе предложено использование процедуры обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), для амплификации последовательности фрагмента области Ν85Β; получение с наработанного продукта одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента Ν85Β, при этом в качестве исходного образца может быть использована вирусная РНК, выделенная из клинического материала, такого как, например, кровь, плазма или биоптат печени. Заявленный способ также предусматривает использование оригинального олигонуклеотидного биочипа с иммобилизованными специфическими зондами, процедуры гибридизации, регистрации и интерпретации результатов.

Принципиальная схема идентификации генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС на биочипе.

Схема анализа последовательности фрагмента области Ν85Β ВГС для идентификации генотипа и подтипа с помощью биочипа представлена на фиг. 1.

Выделение РНК ВГС из клинического образца осуществляют с помощью известных в данной области способов (например, НошГаг М.К., МюНе/еи и., 8с1шиб1 М., Еегдег А., 8ейлеб Е., Яо111 \У.К. Шдй-Шгоидйри!: рипПсайоп оГ упа1 ΚΝΑ Ьакеб оп поуе1 адиеоик сНепйкйу Гог иис1е1с ааб ίδοίαΐίοη. С1т СНет. 2005 1и1.; 51(7):1217-22) или любого специализированного коммерчески доступного набора реагентов для выделения РНК из крови, плазмы или биоптата печени, например О1Аатр Ό8Ρ Уник Кй (кат. № 60704, О1адеп. Германия), МадМАХ™ ΑΙ/ΝΏ У1га1 Κ.ΝΑ Ео/Оои Кйк (кат. № АМ1939, АтЫои, США) или Комплект реагентов для выделения РНК (кат. № 05-013, ЗАО НПФ ДНК-технология, Россия).

Амплификацию фрагмента области Ν85Β генома ВГС на первом этапе выполняют с помощью реакции обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР (ОТ-ПЦР). Для проведения ОТ-ПЦР могут быть использованы как различные системы, описанные, например, в СакаЫаиса А., Ог1аиб1 С., Ега1егиа1е А., Мадиаи М. А пе\у опе-Чер ЯТ-РСЯ тебюб Гог νίπικ диаиШайои ίη тигте АШ8. 2003 1оигпа1 оГ У1го1од1са1 Мебюбк. Уо1. 110(1), р. 81-90, так и коммерчески производимые наборы, например Оие81ер ЯТ-РСЯ Кй (кат. № 210210, Р1адеи, Германия), Ассикспр!® Н1дй-Р1бе1йу ЯТ-РСЯ Кй (кат. № 600180, 81та1адеие, США) и др.

Праймеры для проведения первой стадии амплификации выбирают таким образом, чтобы они фланкировали наиболее полиморфный сегмент области Ν85Β, позволяющий дифференцировать существующие генотипы и подтипы ВГС. Предпочтительно, чтобы сегмент области Ν85Β, подлежащий амплификации, включал положения с 8256 по 8645 генома ВГС согласно СНоо, р.Ь., К.Н. Яюйтаи, ЕН. Наи, К. Еегдег С. Ьее, С. Ооид, С. СаЛедок, Ό. Сой, Я. Меб1иа-8е1Ьу, Ρ.Ε Рагг, е! а1. 1991. Сеиейс огдаш/айои аиб бгуегкйу оГ Не йераййк С νίπ.18. Ргос. №Н1. Асаб. 8сг И8А. 88: 2451-2455.

Последовательности праймеров выбирают таким образом, чтобы проводить эффективную амплификацию РНК исследуемого сегмента области Ν85Β любого генотипа и, соответственно, подтипа ВГС. Для этого, например, может быть сконструировано множественное выравнивание всех доступных в базах данных нуклеотидных последовательностей области Ν85Β, находящихся по адресам Нир://\ν\ν\ν.ηсЬ^.η11η.η^Н.дον/СеηЬаηк/^ηбеx.1и1η1 и ййр://йсν.1аη1.дον/сοиΐеиί/йсν-бЬ. Затем находят наиболее консервативные для всех генотипов ВГС участки области Ν85Β и выбирают праймеры, специфичные к данным участкам. Используя специализированное программное обеспечение, например ОНдо ν. 6.3 (Мо1еси1аг Рю1оду ЕкадИ® 1ис., США) или Рак! РСЯ (НЦр://\у\у\у.ЬюсеЩег.Не18ткгП/Ы/Ргодга1П8/Га81рсг.Н11п) или другие коммерчески доступные программы, или программы, свободно доступные в сети Шете/ рассчитывают температуры плавления праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри пары не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Каждый выбранный праймер должен обладать уникальной специфичностью в отношении анализируемого участка области Ν85Β. Специфичность праймеров проверяется с помощью программного обеспечения, использующего поиск в базах нуклеотидных последовательностей по алгоритму ЕГА8Т (например, \ν\ν\ν.ηсЬ^.η11η.η^11.дον/Β^Α8Т). В частности, необходимо избегать таких последовательностей, которые способны продуктивно гибридизоваться (отжигаться) с последовательностями генома человека.

На втором этапе получают преимущественно одноцепочечный флуоресцентно меченый продукт методом асимметричной ПЦР с использованием в качестве субстрата для построения цепи бе иονο смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым. Как известно специалистам в данной области, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов для проведения ПЦР содержит бАТР, бСТР, бСТР и бТТР, причем вместо бТТР может использоваться бИТР или смесь бТТР/бИТР в любой молярной пропорции. Любой из указанных дезоксинуклеозидтрифосфатов может нести флуоресцентную метку. Наиболее предпочтительно использование флуоресцентно меченого дезоксиуридинтрифосфата, что, с одной стороны, обусловливает эффективное включение данного

- 6 018102 субстрата во вновь синтезированную цепь ДНК в процессе ПЦР, с другой - обеспечивает возможность предотвращать получение ложных результатов за счет перекрестной кросс-контаминации ампликонами путем использования на первой стадии фермента урацил-ДНК-гликозилазы. Это имеет критическое значение при проведении массовых анализов в условиях специализированной лаборатории.

В качестве флуоресцентного красителя может быть использован любой флуоресцентный краситель, который может быть химически включен в молекулу дезоксинуклеозидтрифосфата таким образом, чтобы не препятствовать в существенной степени прохождению полимеразной цепной реакции и последующей гибридизации полинуклеотидной молекулы, содержащей такие флуоресцентно меченые нуклеотидные остатки, с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами. В случае флуоресцентно меченого дезоксиуридинтрифосфата, например, флуоресцентный краситель может быть присоединен к 5'-концу аминоаллильного производного бИТР. Примеры таких красителей хорошо известны специалисту в данной области техники и включают красители флуоресцеинового (ТАМКА®, КОХ®, ЮЕ®), родаминового (Техак Кеб®), полиметинового (СуЗ®, Су5®, Су5.5®, Су7®) рядов (Капакшдбе К. апб Вго\\п Т.). Ииогексепсе Ьакеб Ь1га1ец1е8 £ог депебс апа1ук1к. СНет. Сошшип., 2005, 5487-5502). Флуоресцентные красители коммерчески доступны, в частности от фирмы Мо1еси1аг РгоЬек, США. Наиболее предпочтительными являются красители, спектр возбуждения которых лежит в длинноволновой (красной) области спектра, что позволяет использовать для возбуждения флуоресценции недорогие источники возбуждающего излучения типа полупроводниковых лазеров.

Флуоресцентно меченые дезоксинуклеозидтрифосфаты могут быть получены как в лабораторных условиях с использованием таких известных способов, как, например, Китабага М., ЫадакЫта 1., Накеда\\а М., Татига Т., Кбада1а К., Напала К., НококЫта 8., Каката1ки Т., ΟζηΚί Н., 8а\\ш Н. 8ук1етабс с1ипас1еп/а1юп о£ 2'-беохупис1еок1бе-5'-бгрЬокрба1е апа1одк ак киЬкбШек £ог ΌΝΑ ро1утегакек Ьу ро1утегаке сбаш геасбоп апб кшебс к!иб1ек оп ешутабс ргобисбоп о£ тобШеб ΌΝΑ. ШсШс Ас1бк Кек. 2006 34(19):5383-94, так и являются коммерчески доступными, например СуЭуе Ииогексеп! Шс1еоббек (кат. № РА55021, РА55032, РА55026, СЕ Неаббсаге, США).

Праймеры для проведения второй стадии амплификации выбирают с учетом требований, изложенных выше, с тем отличием, что по меньшей мере один из праймеров выбирается внутри ПЦР-фрагмента, получаемого на первой стадии, что повышает специфичность реакции. Таким образом, получаемый продукт в конечном счете будет являться продуктом полугнездовой или гнездовой реакции амплификации. Размер амплифицируемого на второй стадии фрагмента специально не ограничивается до тех пор, пока это обеспечивает эффективную гибридизацию фрагмента с иммобилизованными на биочипе зондами. В том случае, когда биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых элементов, праймеры для проведения второй стадии амплификации выбирают так, чтобы размер амплифицируемого фрагмента составлял 100-800 п.о. Большая длина ПЦР-продукта, получаемого на второй стадии, затрудняет эффективную диффузию анализируемого фрагмента генома в гелевых элементах биочипа при гибридизации, что в конечном итоге может привести к уменьшению количества образовавшихся гибридизационных дуплексов и, как следствие, падению флуоресцентного сигнала в ячейках. При подборе праймеров следует учитывать тот факт, что на выходе реакции получают преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые продукты, которые должны быть комплементарны олигонуклеотидам, иммобилизованным на биочипе. Поэтому в каждой паре праймер, добавляемый в избытке (ведущий праймер), выбирается из той цепи, последовательность которой комплементарна последовательностям иммобилизованных на биочипе олигонуклеотидов. Т.е. в случае, если олигонуклеотиды для иммобилизации выбраны из смысловой цепи, для формирования гибридизационных дуплексов в ячейках биочипа необходима преимущественная амплификация антисмысловой цепи, тем самым ведущий праймер выбирается из цепи, комплементарной последовательности гена (антисмысловая цепь), и наоборот.

Для получения преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого продукта ведущий праймер добавляют в молярном избытке по отношению ко второму праймеру. Предпочтительно молярный избыток является по меньшей мере десятикратным.

При выборе дискриминирующих олигонуклеотидов для иммобилизации на биочипе с учетом размера и сложности анализируемой последовательности и, в частности, наличия повторов и протяженных гомополимерных последовательностей определяют длину дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающую их специфичность в отношении анализируемой последовательности.

Выбор дискриминирующих олигонуклеотидов для генотипов и подтипов осуществляют следующим образом. В сконструированном множественном выравнивании последовательностей области Ν85Β для каждого генотипа создается консенсусная последовательность данного региона, на основании которой выбираются уникальные зонды, позволяющие однозначно идентифицировать каждый генотип. При этом в силу высокой вариабельности генома ВГС для повышения надежности способа по возможности выбирают несколько дискриминирующих зондов для каждого из генотипов, комплементарных различным участкам исследуемого фрагмента области Ν85Β. Для каждого из подтипов также создают консенсусную последовательность, а затем выбирают участки фрагмента исследуемой области Ν85Β, позволяющие дифференцировать максимальное количество подтипов внутри одного генотипа. Количество

- 7 018102 таких участков должно быть достаточно для обеспечения надежной идентификации каждого из подтипов. На основании последовательностей выбранных участков конструируют зонды для идентификации подтипов, при этом последовательность одного зонда может соответствовать сразу двум и более подтипам в отдельном дифференцирующем участке исследуемого фрагмента области Ν85Β. Стратегия выбора зондов для иммобилизации на биочипе схематично представлена на фиг. 2.

Используя программное обеспечение, например Οίφο ν. 6.3 (Мо1еси1аг Βίοίοβν 1пз1дЫз 1пс., США), рассчитывают температуры плавления олигонуклеотидов и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления олигонуклеотидов составлял не более 2-3°С. Избегают таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления.

Дискриминирующие олигонуклеотиды иммобилизуют на подложке биочипа. В качестве подходящих подложек для изготовления биочипа могут использоваться активированная, например аминированная, поверхность предметных стекол (Абезз1 С., МаГгоп С., Ауа1а С., ТигсаГй С., Мегтоб 1., Мауег Р., КатазЫша Е. 8ойб рЬазе ΌΝΑ ашрййсаГюп: сЬагасГепзаГюп οί рпшег айасЬшепГ апб атрййсайоп тесЬашзшз Шс1е1с Ас1бз КезеагсЬ. 2000. Уо1. 51. 28(20):Е87), пластиковые носители (N^к^Гο^ον Т., Кепб1е К., Сое1еГ Р., Кодегз Υ., 1<о1е\\'1сх М., Апбегзоп 8., Тгатог С., Кпарр МюЬае1 К Сепейс Вй Апа1уз1з: а зойб рЬазе теГйоб Гог Гуртд зтд1е пис1еойбе ро1утогрЫзтз. №.1с1е1с Ас1бз КезеагсЬ. 1994, 22(20):4167-75), подложки с полимерными макропористыми носителями, такими как акриламид (ТниоГеет Е., КосЬеЛота 8., МйхаЬеко\' А., Р1огепГ1ет V. Кедюзе1ескте 1ттоЬШ/айоп оГ зЬой ойдопис1еойбез Го асгукс соро1утег де1з. №.1с1ею Ас1бз Кез. 1996, 24(16):3142-8), сефароза (Магдийез М., ЕдЬо1т М., АЙтап А.Е. еГ а1., Сепоте зесщепстд т ткгоГаЬпсаГеб ЫдЬ-бепзйу рко1йге геасГогз. №11иге. 2005, 437(7057):376-80) и др. Способы иммобилизации олигонуклеотидов на подложках хорошо известны в данной области и включают в себя следующее:

хемосорбцию олигонуклеотидов и ДНК, содержащих тиоловую группу, на металлах (Мнкт С.А., ЬеГзтдег К.Ь., Мисю КС. апб 8ГогЬоГГ 1.1. А ^NΑ-Ьазеб теГйоб Гог гаГюпаЛу аззетЫтд папорагйс1ез тГо тасгозсорк таГепа1з. №11иге. 1996 Аид. 15; 382(6592):607-9);

ковалентное связывание модифицированных олигонуклеотидов с функциональными группами поверхности, основанное на реакциях образования амидной (Неа1еу В.С., МаГзоп К.8., Аа1Г Ό.Κ. Р1Ьегорйс ^NΑ зепзог аггау сараЬ1е оГ беГесйпд рошГ тиГайопз. Апа1 ВюсЬет. 1997, 251(2):270-9), сложноэфирной (С1Ю811 8.8., Миззо С.Р. Сονа1епГ айасЬтепГ оГ ойдопис1еойбез Го зойб зирройз. №с1ек Ас1бз Кез. 1987, 15(13):5353-72), карбимидоильной (МаГзоп К.8., Катра1 1., РепГопеу 8.Ь. Апбегзоп Ρ.Ό., Соаззт Р. Вюро1утег зупГЬез1з оп ро1ургору1епе зирройз: ойдопис1еойбе аггауз. Апа1 ВюсЬет. 1995, 1ап 1; 224(1):110-6) связей и т.д.;

фотохимически, химически и электрохимически индуцируемую сополимеризацию олигонуклеотидов, несущих непредельную группу, с мономерами, составляющими основу формируемой твердой фазы ^азШзкот АА., ТипоГеет Е.К, 8итеЫкот 8.А., ИгоЬузЬет А.Ь., 8Ыск ν.ν. апб М^^ζаЬекον А.И., РаЬпсаГюп оГ тюгоаггау оГ де1-1ттоЬ1^еб сотроипбз оп а сЫр Ьу сοрο1уте^^ζаГ^οп. В|о1ескп1циез. 1999, 27, 592-606).

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения используют биочип на основе гидрогелевых элементов. Способы получения таких биочипов включают полимеризацию аминомодифицированных олигонуклеотидов с образованием ковалентной связи с мономерами гидрогеля при соответствующих условиях (рН, температура, состав полимеризационной смеси и др.) (КиЬша АА., Рап'кот 8.ν., Оетепкета Е.1. еГ а1. Нубгоде1 бгор ткгосЫрз χνίΐΗ питоЫ^еб ^NΑ: ргорегйез апб теГЬобз Гог 1агде-зса1е ргобисйоп. Апа1. ВюсЬет. 2004, 325:92-106). Наиболее предпочтительным является использование биочипов, содержащих гелевые элементы, которые наносятся на матрицу в виде капель диаметром от 80 до 300 мкм с периодом 150-500 мкм, без использования специальных приспособлений, например кварцевых масок. В качестве матрицы может использоваться как стеклянная подложка (предметное или покровное стекло), так и более доступные материалы, такие как пластик. Для иммобилизации олигонуклеотидов в гелевых элементах биочипа используется их совместная полимеризация с основными компонентами геля. В результате этой одностадийной реакции иммобилизуемые молекулы необратимо, ковалентно присоединяются к тем или иным мономерам растущей полимерной цепи и равномерно распределяются во всем объеме геля с высоким выходом (порядка 50% для олигонуклеотидов) (КиЫпа АЛ), Рап'кот 8.ν., Оетепкета Е.1. еГ а1. Нубгоде1 бгор ткгосЫрз тейЬ питоЫ^еб ^NΑ: ргорегйез апб теГЬобз Гог 1агде-зса1е ргобисГюп. Апа1. ВюсЬет. 2004, 325:92-106). Концентрация иммобилизованных олигонуклеотидных зондов может быть оценена прокрашиванием гелевых элементов биочипа красителем с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК (А.Л. Михейкин, А.В. Чудинов, А.И. Ярощук, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, А.С. Крылов, А.С. Заседателев, А.Д. Мирзабеков. Краситель с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК: применение для оценки количества олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках биологических микрочипов. Молекулярная биология. 2003, 37(6):1061-70).

ПЦР-продукты, полученные на второй стадии амплификации, гибридизуют на биочипе с иммоби

- 8 018102 лизованными дифференцирующими олигонуклеотидами, комплементарными участкам консенсусных последовательностей генотипов и подтипов фрагмента области Ν85Β. Гибридизацию проводят в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент, в герметичной гибридизационной камере при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе дискриминирующих олигонуклеотидов. В качестве дестабилизирующего водородные связи агента могут быть использованы, например, гуанидин тиоцианат, мочевина или формамид. Выбор оптимальной температуры гибридизации проводят с учетом удобства практического применения системы. Дискриминирующие олигонуклеотиды, заявленные в настоящем изобретении, имеют температуру плавления в интервале от 42 до 44°С, что позволяет проводить гибридизацию при 37°С с использованием хаотропного агента. Температура 37°С удобна тем, что большинство клинических лабораторий оснащены термостатами, поддерживающими эту температуру.

Изучаемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемый фрагмент ДНК дает несовершенный дуплекс. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс (I _сов), выше, чем в такой, где образовался несовершенный дуплекс (I _несов). Проведение гибридизации при оптимальных условиях (температура, подобранная концентрация хаотропного агента и ионная сила гибридизационного буфера) позволяет добиться соотношения I _сов/1 _несов>1,5 между двумя ячейками, содержащими зонды, принадлежащие одной группе и различающиеся на один нуклеотид.

Регистрация результатов гибридизации на биочипах может быть осуществлена с помощью коммерческих сканирующих устройств - анализаторов флуоресценции биочипов, например ОепеР1х 4000Β (Ахоп 1н51гнтеп15. США), оснащенных соответствующим программным обеспечением для вычисления интенсивности флуоресцентных сигналов дискретных элементов биочипа и их последующей нормировки на фоновое значение, например СепеР1х Рго, Аеийу (Ахоп ИтЛгшпепК США).

Интерпретация результатов гибридизации может быть осуществлена визуально соотнесением фиксированной флуоресцентной картины биочипа и/или полученного распределения интенсивностей сигналов элементов биочипа к расположению специфичных дискриминирующих зондов в элементах биочипа (см. фиг. 3). Обладая распределением интенсивности сигналов в ячейках биочипа, выделяют максимальный сигнал среди элементов, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды. Идентификация генотипа может быть осуществлена путем установления элемента биочипа, обладающего наибольшей интенсивностью флуоресценции, среди ячеек, содержащих зонды для определения генотипа ВГС. Идентификация подтипа исследуемого образца ВГС может быть осуществлена путем определения наибольших сигналов в ячейках, содержащих подтип-специфичные олигонуклеотиды, соответствующие установленному генотипу, в случае, если максимальные сигналы зарегистрированы по меньшей мере в двух различных ячейках, содержащих уникальные олигонуклеотиды, специфичные в отношении отдельного подтипа.

Предпочтительно интерпретацию результатов гибридизации на биочипах осуществляют следующим образом. На первом этапе проводят выделение достоверных сигналов, т.е. сигналов в ячейках, где возможно образование совершенных дуплексов. Для этого нормированные сигналы интенсивности флуоресценции всех ячеек биочипа сортируют по возрастанию и сравнивают с усредненным сигналом (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. Достоверными сигналами считаются такие, которые превосходят 1_ге£ по меньшей мере в 1,5 раза. Второй этап начинают с анализа отфильтрованных достоверных сигналов О₁ в группах ячеек, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к различным генотипам (ί - номер генотипа). Выделяют максимальный сигнал внутри каждой группы ячеек О_1тах и сравнивают между собой. Если сигнал С_1тах в одной группе превосходит максимальные сигналы в остальных группах более чем в 1,5 раза (пороговое значение), то делается заключение о принадлежности исследуемого образца к данному генотипу. В случае если отношение сигналов среди О_1тах не превышает порогового значения, то делается заключение о невозможности однозначной идентификации генотипа и о возможном присутствии в анализируемом образце смеси двух и более вариантов ВГС с различными генотипами. В случае если сигналы в группах, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, не проходят первичную фильтрацию относительно 1_ге£, то делается заключение о низкой интенсивности сигналов и возможном отсутствии РНК ВГС в исследуемом образце. При этом идентификация подтипа не проводится.

Таким образом, в случае если определен генотип на основании значения сигнала О_1тах, то далее рассматриваются только группы ячеек, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к подтипам, относящимся к идентифицированному генотипу. В соответствии с предложенной стратегий выбора зондов для идентификации подтипа олигонуклеотиды объединены в группы, соответствующие выбранным участкам исследуемого фрагмента Ν85Β, позволяющим дифференцировать максимальное число подтипов. При этом количество групп варьирует от 1 до 4 в зависимости от степени гомологии консенсусных последовательностей фрагмента Ν85Β различных подтипов и диктуется необходимостью надежной дифферен

- 9 018102 циации подтипов внутри генотипа. При идентификации подтипа сначала выбирают сигналы внутри каждой группы ячеек, превосходящие остальные сигналы в этой группе по меньшей мере в 1,5 раза, такой сигнал обозначается как 8_1Ч (при этом ί - номер генотипа, х - символьное обозначение подтипа в соответствии с принятой классификации подтипов ВГС, _) - номер группы). В случае если в группе две и более ячейки имеют сигналы, различающиеся между собой менее чем в 1,5 раза, то выбирают все такие сигналы 8;хр 8_1И и т.д. В результате получают набор ячеек из разных групп 1x1, 1у1, 1x2, ίζ2, 1x3 и т.д., сигналы в которых превосходят остальные сигналы в своих группах не менее чем в 1,5 раза. При этом если в полученном наборе присутствуют по меньшей мере 2 ячейки из разных групп, соответствующие одному подтипу, например 1x1 и 1x3 или 1x1 и 1ху2, то выдают заключение о принадлежности исследуемого образца к подтипу 'Τ' генотипа 1. В случае если в полученном наборе ячейки из разных групп соответствуют разным генотипам, например 1x1, 1у2, ίζ3 или 1x1, ίνζ3. тогда интенсивности сигналов данных ячеек сравнивают между собой. Если сигнал ячейки, соответствующей подтипу х одной группы превосходит сигналы ячеек других групп в 3 и более раза, то делают заключение о принадлежности исследуемого образца к подтипу х. В случае, если отношение сигналов 8_К1/8_1у2 не превышает трех, выдают заключение о том, что подтип не установлен и возможна принадлежность к подтипу 'Τ' или подтипу у. Такое же заключение выдается в случае, если максимальный сигнал в группе имеет ячейка, содержащая олигонуклеотид, специфичный к двум подтипам, например ^xу1, при отсутствии достоверных сигналов в других группах ячеек. В случае если сигналы в группах, содержащих подтип-специфичные олигонуклеотиды, не проходят первичную фильтрацию относительно 1_геГ, то считают, что подтип исследуемого образца не определен.

Оценка длительности противовирусной терапии и прогноз течения заболевания могут быть сделаны на основании данных идентификации генотипа и подтипа. Так, в случае установления генотипа 1, приводящего к циррозу, хроническому гепатиту и гепатоцеллюлярной карциноме, длительность терапии пегилированным интерфероном и рибавирином должна составлять не менее 24 недель для подтипов 1а, 1с, 16, 1е, а в случае обнаружения подтипа 1Ь, устойчивого к интерферону - не менее 48 недель (\Уеек К. Мо1еси1аг тебюбв оГ йераббв С деио!уртд. Εxρе^ι Рег. Μοί. Ωίαβη. 2005 1и1.; 5(4):507-20).

Инфекция, вызванная ВГС с генотипом 4, дает клиническую картину, схожую с заражением вирусом, имеющим генотип 1 (Еедгаиб-АЬтауаие1 Е., №со! Е., Вои1ев!ш А., 8аибгев-8аиие К., Уше1 1.Р., А1пс Ь., Поре! 1. Реду1а!еб т!етГегои апб пЬаушп !йетару Гог сйгошс йераббв С νίπΐδ деио!уре 4 шГесбоп. 1. Меб. У1то1. 2005 8ер.; 77(1):66-9). При этом в отличие от генотипа 1 для генотипа 4 характерно расщепление на значительно большее число подтипов (№со! Е., Еедгапб-АЬгауапе1 Е., 8аибгев-8аиие К., Вои1ев!ш А., ОнЬо1в М., А1г1с Ь., Уше1 1.Р., Равдшет С., Норе! 1. 2005. Не!егодеиейу оГ йераббв С νίπ.15 деио!уре 4 в!ташв спси1а!1ид ш вои!11-хуев!еги Егаисе. 1. Оеи. У1то1. 1аи.; 86(Р!. 1):107-14). Клиническая значимость ряда из них, например 4а и 4б, уже установлена: 4б является устойчивым к интерферону и требует пролонгированного курса лечения (не менее 48 недель) (Кои1о! Ό., Воитает V., Отаибо V. е! а1.. Ер|бетю1ощса1 с11агас1епвбсв аиб гевроиве !о редт!етГегои р1ив пЬауши !геа!теи! оГ йераббв С νίπΐδ деио!уре 4 тРесНом. 1. νίτη1. Нера!. 2007 1и1.; 14(7):460-7).

Подтипы генотипов 2 и 3 ВГС являются чувствительными к терапии лекарственными препаратами и значительно реже приводят к хронизации процесса. Длительность курса терапии рибавирином и интерфероном для больных, инфицированных ВГС с данными генотипами, составляет от 6 до 12 недель.

Помимо прогностических целей и оценки длительности терапии определение генотипа и подтипа дает информацию в плане этиологии инфекции. Субтипы 1а, 3 а, 4а, 4б чаще ассоциируются с шприцевым гепатитом у лиц, употребляющих парентеральные наркотики, в то время как генотип 2 и субтип 1Ь связан с гемотрансфузионным путем передачи (81ттоибв Р., Викй 1., СотЬе! С. е! а1. Соивеивив ргорова1в Гог а ишйеб вув!ет оГ иотеис1а!иге оГ йерабйв С У1гнв деио!урев. Нера!о1оду. 2005 Ос!;42(4):962-73).

Наконец, результаты, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы для эпидемиологического генотипирования. Распределение генотипов и подтипов ВГС варьирует в различных географических регионах (2еш Ν.Ν. Сйшса1 вщшПсаисе оГ йераййв С У1гнв деио!урев. С1ш. М1сгоЬю1. Веу. 2000, 13(2):223-35). Некоторые из подтипов являются универсальными, другие циркулируют лишь в пределах ограниченных географических зон. Подтип 1Ь превалирует на юге Европы, в Китае, Японии, России (50-80%). В США и странах Южной Америки, на севере Западной Европе чаще встречаются генотипы 1а и 1Ь, за ним следуют генотипы 2 и 3. Генотип 4 превалирует в Северной и Центральной Африке, в то время как на юге континента основным является генотип 5. Генотип 3 встречается почти всюду и является основным в Австралии и Юго-Восточной Азии. Генотип 6 также распространен в Юго-Восточной Азии и является основным типом во Вьетнаме, одним из основных в Таиланде, Индонезии.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

- 10 018102

Примеры

Пример 1. Биочип для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β.

1. Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе и праймеры для амплификации были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΚΝΑ купГкежет (Аррбеб ВюкукГетк, США) и содержали спейсер со свободной аминогруппой 3'-Атто-МобШег С7 СРО 500 (О1еи Векеагск, США) для последующей иммобилизации в гель. Изготовление биочипов производили по процедуре, описанной ранее (КиЫиа Α.Υ., Рап'коу 8.У., Иетепбеуа Ε.Ι. е1 а1. Нубгоде1 бгор тктосЫрк текк кптоЬШхеб ΌΝΑ: ргорегбек апб теГкобк Гог 1агде-кса1е ртобисГюп. Апа1. Вюскет. 2004, 325: 92-106). Биочипы содержали полусферические ячейки диаметром 100 мкм, отстоящие друг от друга на расстояние 300 мкм. Равномерность нанесения ячеек и их диаметр оценивали с помощью программного обеспечения Тест-чип (БиочипИМБ, Россия). Контроль качества микрочипов выполняли измерением концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов. Биочипы окрашивали флуоресцентным красителем 1тЭ-310 (Биочип-ИМБ), концентрацию иммобилизованных зондов оценивали, как было описано ранее (А.Л. Михейкин, А.В. Чудинов, А.И. Ярощук, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, А.С. Крылов, А.С. Заседателев, А.Д. Мирзабеков. Краситель с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК: применение для оценки количества олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках биологических микрочипов. Молекулярная биология. 2003; 37(6): 1061-70).

Структура биочипа.

Биочип содержит 110 иммобилизованных олигонуклеотидов, список которых представлен в табл. 1, четыре маркерные точки (М) для правильного позиционирования (захвата изображения), выполняемого компьютерной программой, и 4 ячейки пустого геля (0), необходимые для вычисления референсного (фонового) значения интенсивности флуоресценции 1_геГ. Расположение иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов показано на фиг. 3.

В двух верхних строках иммобилизованы олигонуклеотиды с индексом О, позволяющие идентифицировать генотип ВГС. Биочип идентифицирует все шесть генотипов ВГС.

Ниже иммобилизованы олигонуклеотиды, позволяющие идентифицировать подтипы внутри генотипа 1: 1а, 1Ь, 1с, 1б, 1е. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 1 сконструированы 4 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области Ν85Β;

внутри генотипа 2: 2а, 2Ь, 2с, 2б, 21, 2ф 2к, 21, 2т. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 2 сконструированы 3 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области Ν85Β;

внутри генотипа 3: 3а, 3Ь, 3к. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 3 сконструированы 3 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области Ν85Β;

внутри генотипа 4: 4а, 4с, 4б, 4Г, 4к, 41, 4к, 4п, 4о, 4р, 4г, 4Г. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 4 сконструированы 4 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области Ν85Β;

внутри генотипа 5: 5а. Генотип 5 представляет собой единственный подтип 5а, тем самым зонды, идентифицирующие генотип, выявляют и подтип 5а;

внутри генотипа 6: 6а, 6Ь, 6б, 6д, 6к, 6к. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 6 сконструированы 2 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области Ν85Β.

- 11 018102

Таблица 1 Перечень последовательностей олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе 8Ер Олиго- Генотип Подтип Группа Последовательность Положение [В ΝΟ: нук- олигонуклеотида в леогид *· последовательности области Ν85Β

М62321)

I	01-1	1	- 01	ОСС ТОТ СОА ОСУ ОС	904-917
2	□1-2	1	- (11	ССС ТОТ СОА ОСУ ССВ	904-918
	01-3	1	- 61	ССС ТОТ МО А ОСУ ОС к	904-918
4	01-4	1	- 61	ССС ТТТ ΑΥΚ ТСС ООО 6	776-791
5	62-1	2	- 02	ТАС А06 СОУ ΤΟΥ ССС	826-840
6	02-2	2	- 62	СТО ССО ΝΤΑ САС ССС ТТО	819-836
7	Θ2-3	2	- 62 '	СТО ССС ΝΤΑ САС ССС ΥΤΟ	819-836
8	03-1	3	- 03	УСТ ТОТ СТС ССС АСА Υ	939-954
9	03-2	3	- 03	ОСС ТТТ АСТ ССС (1(1(1 (1	776-791
10	04-1	4	- 04	СОА ОСА КОА СОТ СТА УСА ОТО	705-725
11	04-2	4	- 04	ССА ОСА КС.А СОТ МТА УСА СТО	705-725
12	04-3	4	- 04	ОТО АСС ТК.О АОС ССО А	728-743
13	05-1	5	- 65	СТС АСТ ГК С АСС ССС А	728-743
14	05-2	5	- 65	ОСА СОС ТСС ТОО ТОТ 6	932-947

15	06	б	- Об	Т6А САТ СТТ СОТ СТО СС	933-949
16	1а11	1	1а	1	САС ТОА ОАО С6А САТ СС	684-700
17	1се1	1	1с/1е	1	САС ТОА СОС ТОА ТАТ ССС	684-701
18	1а12	1	1а	1	ΥΑΤ ССО ТАС СОА СОА 60	696-712
19	1Ъ412	I	1Ъ/16	1	ΥАТ ССС ТОТ ТОА ОСА СТС	696-713
20	1а2	1	1а	2	САТ САА СТС ССТ САС Υ6Α	756-773
21	1Ь2	1	1Ъ	2	АТА АКО ТСО СТС АСА ОАО	757-774
22	1с2	1	1с	2	ССА ТАА СОТ СТС ТСА САО А	755-773
23	162	1	н	2	АТА ААС ТСС СТС АСС С	757-772
24	1е2	1	1е	3	АТС ААС ТСУ ТТО АСТ ОАА АС	758-776
25	1а31	I	1а	3	АОС ССС ОКО САС С	893-905
26	1а32		1а	3	АСКЗ ССС А1ТО САО С	893-905
27	1ЬЗ	I	1Ь	3	осс тест осв. ссс тот	895-909
28	1ъаз	1	1Ъ/1Й	3	ссте ста сос сст ст	896-909
29	1сЗ	1	1с	3	ССС АСТ ОСА ССС ТОТ	895-909
30	1еЗ	1	1е	3	САА ССС ССТ АСС АСС	891-905
31	ыз	1	16	3	ОСС АТВ ОСВ ОСС тс	895-908
32	1а4	1	1а	4	СТА УСС САС СТО ССС	825-839
33	1Ь4	1	1Ь	4	СТТ АТС ссс сст ОС	824-837
34	1с4	1	1с	4	ОСТ АТС ССС САТ СС	824-837

- 12 018102

35	Ы4	1	16	4	ССТ АСС СТС СОТ сс	824-837
36	1в4	1	1с	4	ТАТ ССС АСА ТСС СОТ	826-840
37	2а61	2	2а/2с1	1	САО ААН ТСА СОА ОТС САТ А	699-717
38	2Ы1	2	2Ъ	1	АСО ОАО АОО ОАС АТА АО	685-701
39	2Ы2	2	2Ъ	1	САТ ААС ААС АСА АСА АТС СА	696-715
40	211	2	2ί	1	ТСА СУС ААА СКО АСА ТСА О	683-701
41	2д1	2	2с/2з	1	УАС ААС СОА ОСА ОТС С	699-714
42	2к1	2	2к	1	АСС САС АСК САТ АТС АСС	685-702
43	211	2	21	1	АТА ССС АСА ОАА САА ТСС	697-714
44	2т 1	2	2т	1	ОСО АСА ТУС САК ТСС А	692-707
45	2а2	2	2а	2	ТАС АСТ ССС ТОА СТС АСА	758-775
46	2Ь2	2	2Ь	2	ТАС АСТ СОС ТСА СТС АСА	758-775
47	2с2	2	2с	2	АТА САС ТСА СТО АСТ САС АО	757-776
48	2ά2	2	26	2	СТС АСТ САС ТСА САО ОСТ	762-779
49	2кс2	2	2к/2с	2	АСА СТС АСТ ΝΑΟ ТСА САС АСТ	759-779
50	212	2	2ί	2	ТАС АСТ САС ТКА СТС АСА СС	758-777
51	2р.	2	21	2	САТ АСА ТТС АСТ САС ТСА СА	756-775
52	212	2	2!	2	ΑΤΥ ААА ТСА СТС АСА САС АС	757-776
53	2ш2	2	2т	2	АТА САС ТСА ΥΤΟ АСС ОАО А	757-775
54	2а31.	2	2а	3	ААА ОСУ СТА ССС СС	891-905
55	2а32	2	2а	3	СУС ТАС ССС СТТ ОУА	896-910
56	2Ь31	2	2Ь	3	ААА ССС СТТ ОСК СС	892-905
57	2Ь32	2	2Ь	3	ААС ССС ТСС СКС С	892-905
58	2сЗ	2	2с	3	ААС ССА ОКО ССС С	893-905
59	263	2	26	3	СМКККССАСССТС	896-908
60	213	2	2ί	3	ОСУ САА ССС ССС Т	895-907
61	2кЗ	2	2к	3	АСС ССС ТСС ССС	893-904
62	2гаЗ	2	2т	3	ААО ССС ААС САС СС	893-916
63	3а1	3	За	1	АСА ТСА ССС ТОО ААС АС	695-711
64	ЗЫ	3	зъ	1	САТ САС САС ССА ССА С	696-711
65	ЗаЗ	3	За	3	ААС ССС АСК ССС С	892-904
66	ЗЪЗ	3	ЗЬ	3	ААС ССС АСТ ССТ СС	894-905
67	ЗкЗ	3	Зк	3	ААС САА АСС САС СС	893-906
68	За2	3	За	2	АТС ТСС ТСС СТС АСС С	757-772
69	ЗЪ2	3	ЗЬ	2	АТС АСС ССТ СТС АСК О	757-772
70	Зк2	3	Зк	2	ТСА ТАА СТТ САС ТСА СОС	755-772
71	4ас1	4	4а/4с	1	ААС ССА ААА ССА САТ СА	684-700
72	44П	4	46/41	1	ТКА СУС ААА САС АСА ТСА	683-700
73	411к1	4	411/4к	1	ТСА СТС ААА ССС АСА ТСА	683-700
74	411	4	4Ϊ	1	ССТ САС ОСА САС АСА СА	681-697

- 13 018102

75	4111	4	4η.	1	АСТ ОТО АСТ ОАО ААА САС А	679-697
76	4р1	4	4р	1	ССО ТОА СТС АСА АСС АС	680-697
77	4г1	4	4т	1	ОТС АСС ОАА АКК САС АТ	682-692
78	4а21	4	4а	2	ОТТ АТТ ОСУ ССС СТС А	754-769
79	4Тр2	4	4<1/4р	2	СОТ САТ АТС ССС ССТ	753-767
80	4а22	4	4а	2	ССА ААС ТСА ТСА ССС СС	749-765
81	4с2	4	4с	2	АСУ ССС СТА АСА САС АС	760-776
82	412	4	4Г	2	АСС ТИА ТАТ ССС ССС Т	752-767
83	412	4	41	2	АОС ТСА ТСА АМО ССС	752-766
84	4к'2	4	4к	2	АКА ССК АТА ТСС ссс ст	751-767
85	4112	4	4п	2	ΟΥΥ АТА АСС ОСС СТС А	754-769
86	4о2	4	4о	2	ССС ССТ ТАС КОА ОАО	762-776
87	4г2	4	4г	2	ААО ОСС АТА АСС ОС	751-764
88	412	4	41	2	СОТ КАТ АУС АСС ССТ СА	753-769
89	4аЗ	4	4а	3	САА АОС САС АСС ССС	891-905
90	4сЗ	4	4с	3	ААА ОСС ТМА ОСС ОС	892-905
91	4®	4	44	3	ТАА ССС САС СОС АСС	891-905
92	413	4	4ί	3	ΥΑΑ ООС ТАС МСС ОСС	891-905
93	4йЗ	4	4Ь	3	АКО ССА СКС САК ССА	893-907
94	4кЗ	4	4к	3	ТТА АОО СУС УСС САС	890-904

95	4опЗ	4	4о/4п	3	ААО АСС АСК ОСС ОСС	892-907
96	413	4	4Ϊ	3	ССТ САА КОС САС АСС	891-906
97	4рЗ	4	4р	3	ΥΑΑ ООС ААС АОС АОС	891-906
98	4гЗ	4	4г	3	ААА АСС АСО ОСК ОСС А	892-907
99	4а4	4	4а	4	ТСТ ССС ТАТ ССС АСА ТО	820-836
100	4с4	4	4с	4	ССО СТА ТСС САО АТС	822-836
101	404	4	44	4	ССС ВАС ТСС АСО ОТО	822-836
102	41’4	4	4ί	4	¥00 СТА ССО ТАС АТС С	822-837
103	4114	4	411	4	ССС СНТ тсс ОАО ст	822-835
104	4ί4	4	41	4	ОТО ССА ТСС СТА САТ С	821-836
105	4к4	4	4к	4	ССО ООТ АТС ΟΎΑ СОТ О	821-836
106	4о4	4	4о	4	ССС АОС ОСА САТ ОС	824-837
107	4р14	4	4р/41	4	СОС ТОТ ВСО ΥΑΟ ОТО С	822-837
108	4т4	4	4г	4	СОО ТТА ТСО САС АТО С	822-837
109	5а	5	5а	1	СУК АТА СОС ТСА СТС АС	754-770
НО	6а1	6	ба	1	СОС АСТ САС ААС ОАС АТ	700-716
ш	6Ы	6	бЬ	1	СОА АСТ ОАА ОАО ОАС АТС	700-717
112	641	6	66	1	ССО АСТ САС САО ОАС АТ	700-716
ИЗ	6В1	б	бё	1	СОО АСА ОАО САО ΤΟΥ АТ	700-716
114	6Μ	6	бк	1	ССС АСА САА САА ОАС АТ	700-716
115	6к1	6	6к	1	АСТ ОАО СОС САТ СТС Т	703-718
116	6аЗ	6	ба	3	ССА САС ССС ССС Т	895-907
117	6ЬЗ	6	6Ъ	3	ССА САС ССС ССС Т	895-906
118	663	6	6с1	3	АСС ССС ААС САС С	893-905
119	без	6	б<7	3	АСС ССА УСС ССС	893-904
120	бкЗ	6	6И	3	ССА АСС ССС ССТ	895-906

* Названия олигонуклеотидов приведены в соответствии с их положением на фиг. 3.

** Расшифровка однобуквенных обозначений нуклеотидов в последовательностях вырожденных олигонуклеотидов:

К - А, О

Υ - С, Т

М - А, С

К - С, Т

8-С, С

ЗУ - А, Т

Н - А, С, Т в - с, а, т ν-Α, С, О

О - А, С , Т

К-А,С,С,Т

- 14 018102

Пример 2. Обратная транскрипция, совмещенная с амплификацией (ОТ-ПЦР) фрагмента области Ν85Β; получение одноцепочечных флуоресцентно меченых фрагментов методом асимметричной ПЦР.

На первой стадии проводили обратную транскрипцию, совмещенную с амплификацией (ОТ-ПЦР) фрагмента области Ν85Β длиной 418 п.о.

В 40 мкл смеси для ОТ-ПЦР вносили 10 мкл выделенного препарата РНК (конечный объем 50 мкл).

Состав ПЦР-смеси:

1Х ОТ-ПЦР-буфер: 70 мМ Трис-НС1, рН 8,3, 16,6 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 7,5 мМ МдС1₂;

200 мкМ каждого 6ЛТР, 6СТР, 6СТР. 6ИТР (Силекс, Россия);

смесь праймеров (последовательности представлены в табл. 2) Рт3_£/ Рг2_г в концентрации 200 нМ каждый;

ед. термостабильной 8Т-полимеразы (Силекс, Россия);

ед. урацил-ДНК-гликозилазы (Силекс, Россия);

ед. ингибитора РНКазы (Реттейак, Литва).

Амплификацию проводили на термоциклере РТС-200 Эуаб (М1 Кекеатсй, США) со следующим режимом: обратная транскрипция при 50°С - 30 мин, затем 50 циклов ПЦР: 95°С - 30 с, 63°С - 30 с, 72°С - 30 с; финальная элонгация при 72°С - 10 мин.

мкл реакционной смеси, полученной после первой стадии ПЦР, использовали в качестве матрицы при проведении второй стадии.

Вторую стадию ПЦР проводили в полугнездовом варианте, с праймерами Р3_£/Рт5_т, фланкирующими район области Ν85Β длиной 382 п.о. Последовательности праймеров приведены в табл. 2.

Состав ПЦР-смеси (25 мкл):

1Х ПЦР-буфер: 10 мМ КС1,10 мМ Трис-НС1 (рН 8,3) (Силекс, Россия);

1,5 мМ МдС1₂;

200 мкМ каждого 6ХТР (Силекс, Россия);

мкМ флуоресцентно меченого 6ИТР (Биочип-ИМБ, Россия);

смесь праймеров Р3_£/Рт5_т в концентрации 20 нм/100 нМ соответственно;

ед. термостабильной Тад ДНК-полимеразы (Силекс, Россия).

Амплификацию проводили на термоциклере РТС-200 Эуаб (М1 Кекеатсй, США) со следующим режимом: 95°С - 2 мин, затем 36 циклов: 95°С - 20 с, 60°С - 20 с, 72°С - 30 с, заключительная элонгация 72°С - 5 мин, 12 мкл полученного продукта использовали в гибридизации на биочипе.

Таблица 2

Перечень последовательностей праймеров, используемых в двухстадийной ПЦР для амплификации фрагмента области Ν85Β

8ЕЦ Назва- Последовательность Положение

ГО иие праймера в

ΝΟ: последовательности фрагмента Ν85&

(Асс.'Ыо М62321)

121	РтЗ_£	ТАТбАУАСССССТСУТГТОАСТС	655-677
122	Рт2_г	СССССААТТССТбСТСАТАСССТССО ТСАА	1015-1044
123	Ρΐ’5ι·	ОСТАОТСАТАОССТССОТ	1018-1035

*Однобуквенное обозначение нуклеотида в последовательности вырожденного праймера: Υ = С, Т.

Пример 3. Гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе.

К 12 мкл реакционной смеси, полученной после второй стадии ПЦР и содержавшей преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые фрагменты ДНК, соответствующие исследуемому фрагменту области Ν85Β, добавляли концентрированный раствор гибридизационного буфера так, чтобы конечная концентрация гуанидина тиоцианата составляла 1 М, НЕРЕ8 - 50 мМ, рН 7,5, ЭДТА - 5 мМ. Полученную смесь (32 мкл) помещали в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили при 37°С в течение 12-18 ч. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37°С в течение 30 с и высушивали.

Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.

Регистрация флуоресцентного изображения биочипа выполнялась на универсальном аппаратнопрограммном комплексе (УАПК) (ИМБ РАН, Россия) для анализа биочипов с использованием специализированного программного обеспечения 1таде\¥аге®® (Биочип-ИМБ, Россия).

Интерпретацию результатов осуществляли согласно приведенному выше алгоритму, реализованному в модуле программного обеспечения для анализа флуоресцентных изображений биочипов Ттадетате®.

- 15 018102

Пример 5. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 1а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ У1га1 Κ.ΝΛ (О|адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 4А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 4Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,62. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы 01, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более. Аналогичная ситуация с сигналом в ячейке 04-2 (1,37). Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, были близки к фоновым. Далее, выбирается максимальный сигнал из группы 01, 01-2 (5,7). Сигнал в данной ячейке превосходит сигнал 04-1 более чем в

1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее:

в группе 1 максимальные (т.е. превосходящие пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигналы имеют ячейки 1а11 (17,0) и 1а12 (17,0);

в группе 2 - ячейка 1а2 (16,4);

в группе 3 - ячейка 1а32 (3,4);

в группе 4 - ячейка 1а4 (3,1).

Таким образом, во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа 1а. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 1а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 1а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип 1а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 6. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 1Ь, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ У1га1 Κ.ΝΛ (О|адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадиипосле дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 5А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 5Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,67. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы 01, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более (максимальный сигнал имеет ячейка 01-3 (5,69)). Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, были близки к фоновым. Следовательно, последова

- 16 018102 тельность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка 1Ь61 (18,0);

в группе 2 - ячейка 1Ь2 (16,3);

в группе 4 - ячейка 1Ь4 (3,9);

в группе 1 совершенный дуплекс с исследуемой ДНК формирует также олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов 1Ь и 16.

Однако максимальный сигнал зарегистрирован также в ячейках, содержащих зонды, специфичные только для подтипа 1Ь - 1Ь2 и 1Ь4. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 1Ь.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 1Ь.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип 1Ь, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 7. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 1е, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ У1га1 ΡΝΛ (01адсп. Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 6А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 6Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге{) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,39. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы 01, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более. Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе 01 имеет ячейка 01-3 (4,82). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка 1се1(18,0);

в группе 2 - ячейка 1е2 (8,46);

в группе 3 - ячейка 1е3 (3,52);

в группе 4 - ячейка 1е4 (2,18).

В группе 1 совершенные дуплексы с исследуемой ДНК формирует олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов 1с и 1е. Однако максимальный сигнал зарегистрирован также в ячейках, содержащих зонды, специфичные только для подтипа 1е-1е2, 1е3 и 1е4. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 1е.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 1е.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип 1е, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 8. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 2а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ У1га1 ΡΝΛ (О|адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана

- 17 018102 и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 7А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 7Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_геГ) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_геГ составило 0,25. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы О2, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 2, превосходят 1_геГ в 1,5 раза и более. Сигнал в ячейке О6 (2,01) также является достоверным относительно 1_геГ. Максимальный сигнал в группе О2 имеет ячейка О2-2 (15,6), превосходящая сигнал в ячейке О6 более чем в

1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 2.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 2, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка 2аб1 (15,2);

в группе 2 - ячейка 2а2 (6,62);

в группе 3 - ячейка 2а31 (2,33).

Во всех трех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа 2а. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 2а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 2а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 2 и подтип 2а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 9. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 21, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК О1атр У1га1 Κ.ΝΑ (Р1адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 8А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 8Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_геГ) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_геГ составило 0,44. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что только сигналы в ячейках группы О2, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 2, превосходят 1_геГ в 1,5 раза и более.

Максимальный сигнал в группе О2 имеет ячейка О2-3 (15,9). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 2.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 2, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка 211 (2,3);

в группе 2 - ячейка 2кс2 (10,9);

в группе 3 - ячейка 213 (4,31);

в группе 2 совершенные дуплексы с исследуемой ДНК формирует олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов 2с и 2к.

- 18 018102

Однако в двух других группах максимальный сигнал принадлежит ячейкам, содержащим уникальные олигонуклеотиды, специфичные в отношении подтипа 21. В соответствии с заявленным алгоритмом интерпретации анализируемый образец относится к подтипу 21.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 21.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 2 и подтип 21, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 10. Анализ области №5В генома вируса гепатита С, имеющего подтип 3а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Ц1атр У1га1 Κ.ΝΑ (01адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ж5В заданной длины (418 и.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента №5В, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 9А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 9Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (Це) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение Це составило 0,52. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы С3, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 3, превосходят Це в 1,5 раза и более. Сигнал в ячейке С4-2 (0,85) также превосходит Це в 1,5 раза. Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе С3 имеет ячейка С3-1 (15,4), сигнал в которой превосходит сигнал в С4-2 более чем в 1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 3.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 3, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка 3а1 (16,2);

в группе 2 - ячейка 3а2 (4,69);

в группе 3 - ячейка 3а3 (1,74).

Таким образом, во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа 3а. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 3а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 3 а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 3 и подтип 3а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 11. Анализ области №5В генома вируса гепатита С, имеющего подтип 4а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Цгатр упа1 Κ.ΝΑ (Цгадеи, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ж5В заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента №5В, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 10А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 10Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вы

- 19 018102 числения усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,55. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что только сигналы в ячейках группы С4, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 4, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более. Сигналы в остальных ячейках, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, были близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе 04 зарегистрирован в ячейке 04-3 (17,9). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 4.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 4, выявляет следующее: в трех группах зондов, специфичных к генотипу 4, максимальные сигналы имеют ячейки, содержащие зонды для выявления подтипа 4а: 4ас1 (16,3), 4а21 (1,08), 4а4 (14,1). В группе 3 максимальный сигнал имеет ячейка 4x3 (1,21), однако в соответствии с описанным алгоритмом анализируемый образец относится к подтипу 4а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 4а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 4 и подтип 4а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 12. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 46, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ У1га1 Κ.ΝΛ (О|адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 11А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 11Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,35. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы 04, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 4, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более. Сигналы в остальных ячейках, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, были близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе 04 имеет ячейка 04-1 (17,4). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 4.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 4, выявляет следующее:

в группе 1 максимальный сигнал имеет ячейка 46£1 (11,6);

в группе 2 - ячейка 46р2 (3,16);

в группе 3 - ячейка 463 (1,95);

в группе 4 - ячейка 464 (7,35).

Во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные к подтипу 46. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 46.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 46.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 4 и подтип 46, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 13. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего подтип 5а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Οίαιηρ уйа1 Κ.ΝΛ (О|адеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины

- 20 018102 биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 12А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 12Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,28. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате получаем, что только сигналы в ячейках группы С5, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 5, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более.

Максимальный сигнал в группе С5 имеет ячейка С5-1 (6,58). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 5. Поскольку генотип 5 имеет всего один подтип (5а) и сигнал в ячейке 5а2, специфичной к данному подтипу, является достоверным, делается заключение, что исследуемый образец имеет подтип 5а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 5а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 5 и подтип 5а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 14. Анализ области Ν85Β генома вируса гепатита С, имеющего генотип 6, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК О1атр У1га1 КИА (01адеп. Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в ОТ-ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента Ν85Β заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента Ν85Β, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 13А представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 13Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (1_ге£) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение 1_ге£ составило 0,72. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате получаем, что сигналы в ячейке группы С6 (18,6), содержащей зонд, специфичный в отношении генотипа 6, превосходят 1_ге£ в 1,5 раза и более. Сигнал в ячейке С3-1 (5,2) также следует считать достоверным. Ячейка С6 превосходит сигнал в ячейке С3-1 более чем в 1,5 раза, что означает принадлежность РНК анализируемого образца к генотипу 6.

Из двух групп, содержащих зонды, специфичные к подтипам генотипа 6, ни в одной из ячеек сигнал не достигает порогового значения относительно 1_ге£. Следовательно, в данном образце подтип ВГС является неустановленным и классифицируется как 6х.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность не попадает ни в один из кластеров подтипов генотипа 6 и формирует отдельную ветвь филогенетического дерева, т.е. является неклассифицированной. Таким образом, результаты, полученные обоими методами, подтвердили невозможность однозначного установления подтипа данного образца.

Таким образом, представленное изобретение позволяет идентифицировать генотип и подтип вируса гепатита С на основе анализа области Ν85Β с использованием биологического микрочипа. Способ позволяет идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов вируса гепатита С, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы. Способ данного изобретения выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов высокой специфичностью в отношении идентификации подтипов генотипа 1, в частности подтипа 1Ь, а также простотой выполнения и низкой себестоимостью. Данные, полученные с помощью способа гибридизации на биочипах настоящего изобретения, могут быть использованы для прогнозирования и оценки тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз,

- 21 018102 вероятность развития рака печени), определения терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, а также для эпидемиологического генотипирования.

Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые в данном документе, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С на основе анализа области Ν85Β генома ВГС, включающий:

   (а) обратную транскрипцию, совмещенную с ПЦР (ОТ-ПЦР), с использованием вирусной РНК в качестве матрицы и первой пары праймеров, специфичных к фрагменту области Ν85Β;

   (б) асимметричную амплификацию фрагмента области Ν85Β с использованием в качестве матрицы продукта ОТ-ПЦР, полученного на стадии (а), второй пары специфичных праймеров и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым, в качестве субстрата с получением преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента;

   (в) обеспечение биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (б), и выбранную из группы, включающей а) генотип-специфичные для каждого из генотипов ВГС последовательности фрагмента области Ν85Β и б) подтип-специфичные для каждого из подтипов ВГС последовательности фрагмента области Ν85Β;

   (г) гибридизацию амплифицированного меченого продукта, полученного на стадии (б), на биочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;

   (д) регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
2. 2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии (а) используют первую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены в 8Е0 ГО ΝΟ: 121 и 122.
3. 3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии (б) используют вторую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены в 8Е0 ГО ΝΟ: 121 и 123.
4. 4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии (б) один из праймеров второй пары используют по меньшей мере в десятикратном молярном избытке по отношению ко второму праймеру.
5. 5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии (б) в качестве флуоресцентно меченого дезоксинуклеозидтрифосфата используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.
6. 6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически- или фотоиндуцируемой сополимеризации.
7. 7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что биочип содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов, последовательности которых представлены в 8Е0 ГО ΝΟ: 1-120.
8. 8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что регистрацию результатов на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов.
9. 9. Способ по п.1, где интерпретацию зарегистрированных результатов на стадии (д) проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в элементах биочипа, содержащих олигонуклеотидные зонды, специфичные к генотипам ВГС, тем самым идентифицируя генотип исследуемого образца; в случае идентификации генотипа на втором этапе анализируют только элементы биочипа, содержащие олигонуклеотидные зонды, специфичные к подтипам идентифицированного генотипа, независимо от наличия сигналов в элементах, содержащих зонды, специфичные к подтипам других генотипов.
10. 10. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку и прогнозирование тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определение терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии и/или эпидемиологическое генотипирование на основе проведенной интерпретации результатов гибридизации.
11. 11. Биочип для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, представляющий собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, причем последовательности зондов представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 1-120.

    - 22 018102
12. 12. Биочип по п.11, характеризующийся тем, что он представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически- или фотоиндуцируемой сополимеризации.
13. 13. Набор олигонуклеотидных зондов для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, имеющих последовательности 8ГС ΙΌ N0: 1-120.
14. 14. Способ конструирования набора олигонуклеотидных зондов, используемых для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области Ν85Β, предусматривающий раздельный выбор нескольких дискриминирующих зондов для каждого из генотипов и подтипов, последовательности которых комплементарны последовательностям различных участков исследуемого фрагмента области Ν85Β.