EA015275B1 - Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов - Google Patents
Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов Download PDFInfo
- Publication number
- EA015275B1 EA015275B1 EA200801321A EA200801321A EA015275B1 EA 015275 B1 EA015275 B1 EA 015275B1 EA 200801321 A EA200801321 A EA 200801321A EA 200801321 A EA200801321 A EA 200801321A EA 015275 B1 EA015275 B1 EA 015275B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- horseradish peroxidase
- norbrassinolide
- oxa
- conjugate
- labeled antigen
- Prior art date
Links
Landscapes
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена. Задачей настоящего изобретения является конъюгат 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном определении 7-окса-6-оксобрассиностероидов - брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28-гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который получают N-оксисукцинимидного эфира (22R,23R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7-окса-5α-холестан-6-она (гаптена) с пероксидазой хрена в диоксановой среде в присутствии гидрокарбоната калия (рН 8,5) и очисткой образовавшегося продукта на сефадексе с последующим замораживанием раствора в глицерине.
Description
Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена формулы 1
где ПХ - пероксидаза хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в аналитической тест-системе для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов - брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28гомокастастерона, 28-норбрассинолида и др.
Брассиностероиды (БС) - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1, 2]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10-5%. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [3-8]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат эпин, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Наибольшую активность проявляют брассиностероиды, имеющие в своей структуре 7-окса-6-оксогруппировку (так называемые брассиностероидные лактоны) [1]. Низкое содержание БС в природных объектах и исчезающе малые дозы, вызывающие их эффект, делают необходимым разработку методов анализа брассиностероидов, в частности брассиностероидных лактонов.
Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа брассиностероидов, которые должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время методов, основанных на использовании антител, в частности иммуноферментного анализа, требует наличия как иммуногена, так и иммуноферментной метки, в качестве которой может выступать субстрат, меченный пероксидазой хрена.
В настоящее время известен конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена 2, который был получен и использован в иммуноаналитических системах для определения только 24Кметилбрассиностероидов (24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида, 24-эпи-6-дезоксокастастерона) [9]. Применение его для определения других БС проблематично из-за низкой чувствительности.
Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном анализе 7-окса6-оксобрассиностероидов (брассиностероидных лактонов).
Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 1, который получают взаимодействием Νоксисукцинимидного эфира (22К,23К)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7-окса-5ахолестан-6-она (гаптена) с пероксидазой хрена в диоксановой среде в присутствии гидрокарбоната калия (рН 8,5) и очисткой образовавшегося продукта на сефадексе с последующим замораживанием раствора конъюгата в глицерине.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Растворяют 30 мг (52 ммоль) (22К,23К)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7окса-5а-холестан-6-она (1) в 6 мл абс. диоксана, добавляют 8 мг сухого Ν-оксисукцинимида (70 ммоль) и прикапывают при 1 = 8-10°С 13 мг (63 ммоль) дициклогексил карбодиимида в 4 мл абс. диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5°С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Να28Θ4, упаривают. Образовавшийся эфир используют без до
- 1 015275 полнительной очистки.
К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дист. воды в присутствии 2-3 капель 0,1М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 3 мг (4,4 ммоль) Ν-сукцинимидного эфира, перемешивают 30 мин при 10°С и при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дист. вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (1:2) и хранят в морозильнике (при -18°С).
Синтезированный конъюгат используют в качестве меченого антигена в иммуноаналитической системе для количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов, что подтверждается примером конкретного выполнения.
Пример 2.
Для проведения анализа в лунки планшета с иммобилизованными антителами вносили по 50 мкл калибровочных проб или исследуемых растворов брассиностероидов и 100 мкл рабочего раствора конъюгата 28-норбрассинолидпероксидаза хрена. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С без встряхивания, затем удаляли жидкость из лунок и промывали их 1%-ным раствором №С1, содержащим 0,02% Тетееи 20. Для проведения цветной реакции в лунки немедленно вносили по 150 мкл раствора 3,3',5,5'тетраметилбензидина в субстратном буфере и инкубировали планшет в течение 15 мин при 37°С без доступа света. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (5%-ный раствор Н2804) и не позже чем через 30 мин проводили измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине волны 450 нм.
Результаты анализа рассчитывали методом интерполяции по калибровочной кривой [9].
Концентрация нативного антигена, при которой достигается замещение половины меченого антигена в комплексе антитело-антиген, составила 0,3 нмоль/л или 7 пкг в 50 мкл образца.
Заявляемый конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена получается с высоким выходом, обладает стабильностью, обеспечивает необходимую иммунореактивность метки и позволяет проводить количественное определение 7-окса-6-оксобрассиностероидов (брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др.) методом иммуноферментного анализа.
Литература
1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Навука ί тэхшка, 1993. 288 с.
2. Кйпрасй ν.Α., ΖΙιαόίηδΚίί ν.Ν., бе Сгоо! Ае. Вга88шо81его1б8 - А Νονν С1а§8 о£ Р1аи1 Ногтопек. 8аи П1едо: Асаб. Ргекк. 1999, 456 р.
3. Патент РБ № 2806 от 23.11.1995. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения./Хрипач В. А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000, № 2 (26). С. 159.
4. Патент РБ № 3488 от 4.07.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля./Хрипач
B. А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И. (Беларусь), Вакуленко В.В. (Россия).//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000, № 3 (27). С. 74.
5. Патент РБ № 3400 от 4.07.1996. Способ защиты картофеля от фитофтороза./Хрипач В. А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова
C. Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000, № 2 (25). С. 75.
6. Патент РБ 5168./Хрипач В. А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.В.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 2(37). С. 95.
7. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003, № 2 (37). С. 93.
8. Патент РБ № 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля./Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 № 4 (39).
9. Патент РБ № 9771 (С2 С071 41/00). Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24К.-метилбрассинстероидов./Хрипач В.А., Свиридов О.В., Литвиновская Р.П., Прядко А.Г., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В.//Оф. Бюл. изобрет. НЦИС, 2007, № 5, с. 94.
10. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михаилопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О. А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24В)-брассиностероидов.//Биоорг. химия. - 2007 - т. 33, № 3. С. 371378.
11. Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991.
Claims (1)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯКонъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена формулы- 2 015275 где ПХ - пероксидаза хрена, в качестве меченого оксобрассиностероидов.антигена для иммуноферментного определения7-окса-6-
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801321A EA015275B1 (ru) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801321A EA015275B1 (ru) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200801321A1 EA200801321A1 (ru) | 2009-10-30 |
| EA015275B1 true EA015275B1 (ru) | 2011-06-30 |
Family
ID=41353753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200801321A EA015275B1 (ru) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA015275B1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4591650A (en) * | 1983-02-17 | 1986-05-27 | Schering Aktiengesellschaft | Hexanor-brassinolid-22-ethers |
| SU1433005A1 (ru) * | 1987-02-13 | 1991-12-30 | Институт биоорганической химии АН БССР | 2 @ ,3 @ ,22S,23S-Тетраокси-24S-этилхолест-4-ен-он, обладающий фиторостостимулирующей активностью |
| RU2114116C1 (ru) * | 1993-06-01 | 1998-06-27 | Тама Биокемикал Ко., Лтд. | Брассиностероидные производные и регулирующее рост растений средство |
-
2008
- 2008-04-22 EA EA200801321A patent/EA015275B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4591650A (en) * | 1983-02-17 | 1986-05-27 | Schering Aktiengesellschaft | Hexanor-brassinolid-22-ethers |
| SU1433005A1 (ru) * | 1987-02-13 | 1991-12-30 | Институт биоорганической химии АН БССР | 2 @ ,3 @ ,22S,23S-Тетраокси-24S-этилхолест-4-ен-он, обладающий фиторостостимулирующей активностью |
| RU2114116C1 (ru) * | 1993-06-01 | 1998-06-27 | Тама Биокемикал Ко., Лтд. | Брассиностероидные производные и регулирующее рост растений средство |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Khripach V.A. i dr. Immunofermentnyy analiz (24R)-brassinosteroidov. Bioorganicheskaya khimiya, 2007, t. 33, Ôäû 3, str. 371-378 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200801321A1 (ru) | 2009-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104076155B (zh) | 用于检测25-羟基维生素d的检测剂及制备方法和应用 | |
| Lei et al. | Hapten synthesis and antibody production for the development of a melamine immunoassay | |
| JP6681350B2 (ja) | ビタミンｄエピマーのためのアッセイ | |
| CN106771137A (zh) | 检测尼卡巴嗪的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN110563708B (zh) | 一种快速检测亚硫酸（氢）盐的turn-on型荧光探针及合成方法和应用 | |
| Hu et al. | Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of okadaic acid in shellfish sample | |
| Lei et al. | Fluorescent strip sensor for rapid and ultrasensitive determination of fluoroquinolones in fish and milk | |
| FR2637897A1 (fr) | Dosages immunologiques de l'azt, derives et conjugues et anticorps | |
| JPH0376422B2 (ru) | ||
| EA015275B1 (ru) | Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов | |
| CN110551220A (zh) | 一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用 | |
| CN109608479A (zh) | 一种毒鼠强半抗原及单克隆抗体的制备方法与应用 | |
| JP5690514B2 (ja) | アゾキシストロビン誘導体、アゾキシストロビンに対する抗体またはそのフラグメント、ならびにそれらの抗体またはフラグメントを用いた測定キットおよび測定方法 | |
| CN113896651A (zh) | 一种显性孔雀石绿半抗原的合成方法及其半抗原的应用 | |
| JP2005247822A (ja) | コプラナーｐｃｂハプテン、コプラナーｐｃｂに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| CN109324187B (zh) | 一种检测甲霜灵的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| EA014771B1 (ru) | Конъюгат кастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24s-метилбрассиностероидов | |
| CN105823872B (zh) | 检测抑芽丹的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN102628871B (zh) | 甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途 | |
| JP6917049B2 (ja) | 特定のサルファイド化合物に結合する抗体及びその使用 | |
| EA015684B1 (ru) | Дансилгидразид 24-эпикастастерона в качестве меченого антигена для иммунохимического анализа (24r)-метилбрассиностероидов | |
| JP2007204394A (ja) | テブフェノジドおよびその類似化合物に対する抗体の製造方法、抗体、ハイブリドーマ、その免疫学的測定方法および測定キット | |
| CN109265395A (zh) | 一种二氯喹啉酸半抗原与抗原的制备方法及应用 | |
| JP3053594B2 (ja) | ベンスルフロン誘導体、抗ベンスルフロンメチル抗体、それを分泌するハイブリドーマ、及びベンスルフロンメチルの分析方法 | |
| CN111060690B (zh) | 一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |