EA013330B1

EA013330B1 - Бактериоцины и новые бактериальные штаммы

Info

Publication number: EA013330B1
Application number: EA200701730A
Authority: EA
Inventors: Норман Дж. Стерн; Эдуард А. Светоч; Борис В. Ерусланов; Лариса И. Володина; Юрий Н. Ковалёв; Тамара Ю. Кудрявцева; Владимир В. Перелыгин; Виктор Д. Похиленко; Владимир П. Левчук; Валерий Н. Борзенков; Ольга Е. Светоч; Евгений В. Мицевич; Ирина П. Мицевич
Original assignee: Де Юнайтед Стэйтс Оф Америка Эз Репрезентид Бай Де Секретэри Оф Агрикалчэ; Государственный Научный Центр Прикладной Микробиологии И Биотехнологии
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2010-04-30
Also published as: AU2005329462A1; CN101282743B; CA2601591A1; EP2359836A1; WO2006101486A3; WO2006101486A2; EP1858534A2; MX2007011503A; AP2007004168A0; CN101282743A; NZ561654A; EP1858534A4; AU2005329462B2; BRPI0520154A2; EA200701730A1; EP2371373A1

Abstract

Новые бактериоцины и/или новые штаммы, продуцирующие молочную кислоту, используют, по меньшей мере, для снижения уровней колонизации животных, особенно домашней птицы, по меньшей мере одной бактерией-мишенью.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к контролю за заболеваниями животных, особенно домашней птицы, посредством использования новых продуцирующих бактериоцины молочно-кислых бактерий и/или новых бактериоцинов, продуцируемых этими видами. Изобретение также относится к новым бактериоцинам, аминокислотным последовательностям новых бактериоцинов и к штаммам молочно-кислых бактерий, продуцирующих новые бактериоцины. Кроме того, изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим новые бактериоцины и/или продуцирующие их штаммы молочно-кислых бактерий, и к применению таких терапевтических композиций.

Уровень техники

Потребление неправильно приготовленных продуктов из домашней птицы является причиной кишечных заболеваний человека. Давно признано, что возбудителями таких заболеваний являются 8а1топе11а крр., а не так давно к ним также были отнесены Сатру1оЬас!ег крр., особенно Сатру1оЬас!ег _)е.)иш. Оба микроорганизма могут колонизировать желудочно-кишечный тракт домашних птиц, не оказывая каких-либо вредных воздействий на этих птиц, и хотя существует возможность выявления некоторых колонизированных птиц, бессимптомные носители могут легко разносить данные микроорганизмы в процессе производства или обработки, что приводит к дополнительному инфицированию как живых птиц, так и тушек. Домашняя птица является основным источником микроорганизмов 8а1топе11а и Сатру1оЬас!ег при снабжении пищевыми продуктами (1опек е! а1., 1оитпа1 о! Еооб Рго!ес!юп, Уо1ите 54, № 7, 502-507, 1и1у, 1991). Предупреждение колонизации живой домашней птицы в процессе ее выращивания может уменьшить проблему инфицирования домашней птицы.

В колонизации и постоянном наличии бактерий в пищеварительном тракте животных задействован ряд факторов. Подробный обзор этих факторов приведен в 8ауаде (Ргодгекк ш Еооб апб МЦпбоп 8с1епсе, Уо1ите 7, 65-74, 1983). В число этих факторов входят: (1) кислотность желудка (ОбШапб, 1оитпа1 о! Еооб Ргобисбоп, Уо1ите 42, 164-167, 1979); (2) соли желчных кислот (8багре & Мабюк, Мбсйвдккепксйай, Уо1ите 12, 348-349, 1967; Е1осй е! а1. Лтепсап 1оита1 о! Сбшса1 Иибйюп, Уо1ите 25, 1418-1426, 1972; Ье^18 & СогЬасй, Агсйшек о! 1п1егпа1 Мебюше, Уо1ите 130, 545-549, 1972; ОбШапб апб 8реск, 1оита1 о! Еооб Рго!есбоп, Уо1ите 40, 820-823, 1977; Нидбай1 е! а1. 1п!есбоп апб 1ттипйу, Уо1ите 56, 1560-1566, 1988); (3) перистальтика; (4) пищеварительные ферменты (Магшиг, 1оигиа1 о! Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 3, 208-218, 1961); (5) иммунный ответ и (6) собственные микроорганизмы и продуцируемые ими антибактериальные соединения. Первые четыре фактора зависят от фенотипа хозяина и могут оказаться практически нерегулируемыми переменными. Иммунный ответ в желудочно-кишечном (С1) тракте не поддается легкому модулированию. Факторы, вовлекающие собственные микроорганизмы и их метаболиты, зависят от нормальной флоры ΟΙ тракта.

Одним из возможных подходов к контролю за колонизацией Сатру1оЬас!ег и/или 8а1топе11а является использование конкурентного исключения (СЕ). Νιιηηί и Еап1а1а (Ыа1иге, Уо1ите 241, 210-211, 1973) продемонстрировали возможность эффективного регулирования инфицирования 8а1топе11а путем введения через желудочный зонд бактерий из веществ кишечника здоровой домашней птицы молодым цыплятам с еще неустоявшейся микрофлорой для противодействия колонизации 8а1топе11а. Введение неопределенных СЕ-препаратов цыплятам ускоряет созревание пищеварительной флоры у птиц, недавно вылупившихся из яйца, и обеспечивает замену естественному процессу передачи микрофлоры от взрослой курицы своему потомству. Результаты лабораторных и полевых исследований доказывают полезность регулирования С'атру1оЬас1ег путем введения нормальной микрофлоры цыплятам; сообщается об уменьшенной частоте инфицирования стад Сатру1оЬас!ег (Ми1бег апб Во1бег, ш Со1ошх;Шоп Соп!го1 о! йитап Ьас(ег1а1 еп!егора1йодеп8 ш роийгу, Ь.С. ВйткепкЫр (еб.), Асабепбс Ргекк, 8ап О1едо, Сай!., 359363, 1991) и пониженных уровнях Сатру1оЬас!ег ]сщш (С. _)е_)иш) в фекалиях колонизированных птиц (8!ет, Роийгу 8с1епсе, Уо1ите 73, 402-407, 1994).

8сйоеш и ^опд (Арр1. Епубоп. МюгоЬюк, Уо1ите 60, 1191-1197, 1994) сообщали о значительном снижении колонизации С. _)е_)иш бройлерных цыплят в результате применения углеводных добавок вместе с тремя идентифицированными антагонистами: СйгоЬас!ег бгуегкик 22, К1еЬые11а рпеитошае 23 и ЕксйепсЫа сой 25. Также имеется доказательство значительного снижения С. _)е_)иш в образцах кишечника инфицированных бройлерных цыплят после обработки выделенными от домашней птицы культурами ЬасФЬасШик ааборййик и 8!гер!ососсик !аесшт (Мопкййа е! а1., Ау1ап □белкек, Уо1ите 41, 850-855, 1997).

8поеуепЬок е! а1. (патент США № 4335107, июнь 1982 года) разработали методику конкурентного исключения (СЕ) для микрофлоры с целью предотвращения колонизации 8а1топе11а посредством лиофилизации экскрементов животных и анаэробного культивирования этого препарата. М1ко1а е! а1. (патент США № 4657762, апрель 1987 года) в качестве источника СЕ-микрофлоры для предотвращения колонизации 8а1топе11а использовали фекальное содержимое кишечника и содержимое слепой кишки. 8!егп е! а1. (патент США № 5451400, сентябрь 1995 года, и патент США № 6241335, апрель 2001 года) описывают мукозальную СЕ-композицию для защиты домашней птицы и домашнего скота от колонизации 8а1топе11а и Сатру1оЬас!ег, для приготовления которой соскабливают муциновый слой предварительно промытой слепой кишки, и соскобы, хранящиеся без доступа кислорода, анаэробно культивируют. №кЬе!

- 1 013330 с1 а1. (патент США № 5478557, декабрь 1996 года) раскрывают определенный пробиотик, который может быть выделен от разнообразных домашних животных и который получают посредством непрерывного культивирования партии культуры клеток, приготовленной непосредственно из экскрементов, содержимого слепой кишки и/или толстой кишки взрослого целевого животного.

Микроорганизмы продуцируют ряд соединений, демонстрирующих антибактериальные свойства. Одна группа таких соединений, бактериоцины, состоит из бактерицидных белков с механизмом действия, аналогичным ионофорным антибиотикам. Бактериоцины часто активны в отношении видов, близко родственных их продуценту. Их широкое распространение в бактериальных видах, выделенных из сложных микробных сообществ, таких как кишечный тракт, поверхность рта или другие эпителиальные поверхности, позволяет предположить, что бактериоцины могут играть регуляторную роль в динамике популяции в бактериальных экосистемах. Бактериоцины определены как продуцируемые бактериями соединения, имеющие биологически активную белковую группировку и обладающие бактерицидным действием (Тадд с1 а1., Вас(сг1о1од1са1 Есу1С\\ъ. Уо1ите 40, 722-256, 1976). Другие характеристики могут включать (1) узкий ингибиторный спектр действия, сосредоточенный на близкородственных видах; (2) присоединение к конкретным клеточным рецепторам и (3) переносимые плазмидами генетические детерминанты продуцирования бактериоцинов и иммунитета клетки-хозяина к бактериоцинам. Не полностью охарактеризованные антагонистические вещества названы бактериоциноподобными веществами. Некоторые бактериоцины, эффективные в отношении грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных бактерий, имеют более широкий спектр действия. Предполагается, что термин бактериоцин, когда он использован для описания ингибирующих агентов, продуцируемых грамположительными бактериями, должен удовлетворять следующим минимальным критериям: (1) представлять собой пептид и (2) обладать бактерицидной активностью (Тадд еГ а1., выше).

Молочно-кислые бактерии принадлежат к наиболее важным пробиотическим микроорганизмам. Они являются грамположительными, не образующими спор каталазонегативными организмами, лишенными цитохромов. Они являются анаэробными, но аэротолерантными, неприхотливыми, толерантными к кислотам и в качестве основного конечного продукта ферментации ими сахаров получается только молочная кислота. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, включают виды ЬасГоЬасШик, виды ΒίίϊбоЬасГегшт, ЕпГегососсик Гаесайк, ЕпГегососсик Гаесшт, ЬасГососсик 1асбк, ЬеисопокГос текепЮгсибек. Ребюсоссик аабйасйсц 8рого1асГоЬасШик тийпик, 8!герГососсик Гйегторйбик и т.д. Эти виды представляют особый интерес из-за широкой распространенности бактериоцинов внутри этой группы, и, кроме того, их широко применяют при ферментации в молочной, пищевой и мясоперерабатывающей отраслях промышленности. Их роль в консервировании пищевых продуктов и придания им аромата хорошо описана. Большинство бактериоцинов, продуцируемых этой группой, активны только в отношении других молочно-кислых бактерий, однако некоторые демонстрируют антибактериальную активность по отношению к более филогенетически отдаленным грамположительным бактериям и, в некоторых условиях, грамотрицательным бактериям.

ЬасГоЬасйй широко исследовали в отношении продуцирования антагонистов. Они включают хорошо охарактеризованные бактериоцины (ЭеК1егк, 1967; Иргей апб НткбШ, 1975; ВагеГооГ апб К1аепйаттег, 1983; 1оегдег апб К1аепйаттег, 1986); потенциальные бактериоциноподобные вещества (УтсепГ еГ а1., 1959) и другие антагонисты, не обязательно родственные бактериоцинам (Уакб апб 8йайш, 1965; Натбап апб М|ко1а)ак. 1974; М1ко1а)с1к апб Натбап, 1975 и 8йайш еГ а1., 1976).

К1аепйаттег (1993) классифицировал бактериоцины молочно-кислых бактерий, известные на данный момент, на четыре основные группы:

класс I - лантибиотики, представляющие собой небольшие пептиды с массой менее 5 кДа, содержащие необычные аминокислоты лантионин и β-метиллантионин; они особенно интересны тем, что имеют очень широкие спектры действия по сравнению с другими бактериоцинами; примеры включают низин, низин Ζ, карноцин и 149, лактицин 481 и лактоцин 5;

класс II - небольшие пептиды, не содержащие лантионин: гетерогенная группа небольших пептидов с массой менее 10 кДа; эта группа включает пептиды, активные в отношении видов ЫкГепа;

класс III - большие термолабильные белки с массой более 30 кДа, примером является гелветицин;

класс ГУ - комплексные бактериоцины - белки, содержащие дополнительные группировки, такие как липиды и углеводы.

В настоящем изобретении предложены новые композиции, содержащие по меньшей мере один новый штамм, представляющий собой молочно-кислый бактериальный штамм, и/или новые бактериоцины, продуцируемые по меньшей мере одним новым штаммом, способ применения этого штамма или бактериоцина, новые штаммы, аминокислотные последовательности для новых бактериоцинов и способы применения; все из которых отличаются от штаммов, бактериоцинов и способов применения, известных из уровня техники.

Сущность изобретения

Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в предложении новых штаммов ЬасГоЬасШик и ЕпГегососсик, продуцирующих новые бактериоцины.

Следующая задача настоящего изобретения заключается в предложении нового штамма ЬасГоЬасб

- 2 013330

1из зайуатшз РУЭ32. имеющего идентификационные характеристики ΝΚΚ6 В-30514.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового штамма Бас1оЬасШиз ас1борЫ1из БАУР320. имеющего идентификационные характеристики ΝΚΚΕ В-30510.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового штамма Еп1етососсиз Баесайз БАУР21. имеющего идентификационные характеристики ΝΚΚΕ В-30645.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового штамма Еп1етососсиз бигапз БАУР26. имеющего идентификационные характеристики ΝΚΚΕ В-30511.

Следующей задачей настоящего изобретения является предложение новых бактериоцинов, продуцируемых новыми штаммами Бас1оЬасШиз и Еп1етососсиз.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового бактериоцина 0К.7. имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС ГО N0 1.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового бактериоцина БАУР320. имеющего аминокислотную последовательность. приведенную в 8ЕС ГО N0 2.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение нового бактериоцина БАУР21. имеющего аминокислотную последовательность. приведенную в ЗЕЦ ГО N0 3.

Следующей задачей настоящего изобретения является предложение нового бактериоцина БАУР26. имеющего аминокислотную последовательность. приведенную в ЗЕЦ ГО N0 4.

Другая задача настоящего изобретения заключается в предложении способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей по меньшей мере один новый штамм Бас1оЬасШиз или Еп1етососсиз. продуцирующий новый бактериоцин. по меньшей мере один новый бактериоцин. продуцируемый новым штаммом Бас1оЬасШиз или Еп1етососсиз. или комбинацию новых штаммов и/или новых бактериоцинов.

Следующая задача настоящего изобретения заключается в предложении способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей новый штамм Бас1оЬасШиз. имеющий характеристики NΚΚ^ с номером депонирования В-30514 и В-30510. Еп1етососсиз. имеющий идентификационные характеристики МВКБ В-30511 и МЯКБ В-30645 и их смеси.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей по меньшей мере один новый штамм с идентификационными характеристиками МВКБ В-30510. МЯКБ В-30511. МЯКБ В-30514. МЯКБ В-30645 и их смеси; по меньшей мере один новый бактериоцин. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в 8ЕС ГО N0 1. 8ЕЦ ГО N0 2. ЗЕЦ ГО N0 3. ЗЕЦ ГО N0 4 и их смеси; или комбинацию новых штаммов и новых бактериоцинов.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей новый бактериоцин. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в ЗЕЦ ГО N0 1.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей новый бактериоцин. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в 8ЕС ГО N0 2.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей новый бактериоцин. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в 8ЕС ГО N0 3.

Следующей задачей настоящего изобретения является предложение способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животных по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей новый бактериоцин. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в 8ЕС ГО N0 4.

Другая задача настоящего изобретения заключается в предложении способа. по меньшей мере. уменьшения уровней колонизации животного по меньшей мере одной бактерией-мишенью путем введения животному терапевтической композиции. содержащей бактериоцин. продуцируемый новым штаммом бактерий Бас1оЬасШиз. имеющим идентификационные характеристики ИЯКБ В-30510 или ИЯКБ В30514. новым штаммом Еп1етососсиз. имеющим идентификационные характеристики ИЯКБ В-30511 или МВКБ В-30645. и их смесями.

Дополнительные задачи и преимущества изобретения будут очевидны из следующего далее описания.

Депонирование микроорганизмов

Бас1оЬасШиз зайуатшз. обозначенный как NΚΚ^ В-30514 (штамм РУЭ32). Бас1оЬасШиз асШорЫ1из. обозначенный как МВКБ В-30510 (штамм БАУР320). Еп1етососсиз бигапз. обозначенный как МЯКБ

- 3 013330

В-30511 (штамм БАУР26) депонированы 3 августа 2001 года, а Еп1егососси8 ГассаПз. обозначенный как ΝΒΚΕ В-30645 (штамм БАУР21) депонирован 1 апреля 2003 года. Все указанные выше штаммы депонированы согласно положениям Будапештского соглашения (Вибарей Тгеа1у) в υ.δ.Ό.Ά. коллекции культур сельскохозяйственной научно-исследовательской службы для патентной процедуры (Адпси11ига1 Ве5еагс11 8егу1се Ра1еи1 Си11иге СоПесбоп (Ναΐίοηαΐ Сеп1ег Гог Адг1си11ига1 υΐίΐίζαΐίοη Векеагсй. 1815 Ν. ишуег8Йу 81гее1. Реопа. Шшощ 61604)).

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой фотографию. иллюстрирующую непосредственное детектирование ОВ7 после δΌδ-РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). На гель наносили Сатру1оЬас1ег )е)иш для определения полос(ы). соответствующих(ей) противомикробной активности. и молекулярной массы такой полосы. обладающей активностью. Дорожка 1 - маркеры молекулярной массы (МУМ) в диапазоне 6500-97000 (АМЕВ8НАМ РНАВМАС1А В1ОТЕСН): 97000. 66000. 43000. 30000. 21000. 14400 и 6500 Да. Полоса на дорожке 2 - чистый лактоцин ОВ7. полоса на дорожке 3 - САР лактоцин (неочищенный противомикробный препарат) ОВ7 после абсорбции С. )е)ипг соответствующая противомикробной активности. зона ингибирования роста (см. стрелку). имела массу приблизительно 6000 Да. полоса на дорожке 4 - САР лактоцин ОВ7. Другие полосы не проявляли противомикробную активность.

Фиг. 2 представляет собой фотографию. иллюстрирующую непосредственное детектирование бактериоцина БАУР320 и БАУР26 после δΌδ-РАСЕ. На гель наносили Сатру1оЬас1ег )ещш для определения полос(ы). соответствующих(ей) противомикробной активности. и молекулярной массы. ассоциированной с этой активностью. Дорожка 3 - маркеры молекулярной массы (БАУМ) в диапазоне 3000-43000 (АМЕВ8НАМ РНАВМАС1А В1ОТЕСН): 3000. 11400. 18000. 21000 и 43000 Да. Полоса на дорожке 1 - бактериоцин БАУР320. полоса на дорожке 2 - бактериоцин БАУР26. соответствующая противомикробной активности. зона ингибирования роста имела массу приблизительно 6000 и приблизительно 3000 Да соответственно. Другие полосы не проявляли противомикробную активность.

Фиг. 3 представляет собой фотографию. показывающую непосредственное детектирование энтероцина БАУР21 после δΌδ-РАСЕ. На гель наносили Сатру1оЬас1ег )е)иш для определения полос(ы). соответствующих(ей) противомикробной активности. и молекулярной массы активной полосы. Дорожка 4 маркеры молекулярной массы в диапазоне БАУМ 1060-43000 (АМЕВ8НАМ РНАВМАС1А В1ОТЕСН): 1060. 2500. 3500. 14400. 20000. 30000 и 43000 Да. Полоса на дорожке 1 (энтероцин БАУР21 после 8Р8ер11аго5е) и полоса на дорожке 2 (пик 2 после фенил-Зерйагоке СБ-4В). которая соответствует противомикробной активности. зона ингибирования роста (см. стрелку) имела массу приблизительно 6000 Да. Полоса на дорожке 3 (пик после фенил-8ерйаго5е СБ-4В) имела массу приблизительно 3000 Да.

Другие полосы не проявляли противомикробную активность.

Подробное описание изобретения

Все больше осознается важность кишечных инфекций у людей. и хорошо описана взаимосвязь между инфицированностью домашней птицы и инфицированием людей. Также хорошо известна возможность уменьшить эту угрозу для здоровья путем вмешательства в заводской процесс производства домашней птицы. При выращивании и обработке бройлерных цыплят вещества фекалий. содержащие патогены. переносятся на мясо и остаются в нем в процессе приготовления пищи на кухне.

Метаболиты конкурирующих организмов могут вносить вклад в контроль за такими патогенами. как Сатру1оЬас1ег )е)иш и 8а1топе11а. Новые антагонистические штаммы по настоящему изобретению были выделены из слизистых оболочек слепой кишки и зоба бройлерных цыплят. Природными компонентами охарактеризованного антагониста являются низкомолекулярные пептиды. бактериоцины. имеющие широкий спектр антагонистической активности.

Согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы Бас1оЬасП1и5 и Еп1егососси8. новые бактериоцины. аминокислотные последовательности указанных бактериоцинов. терапевтические композиции. содержащие новые бактериоцины и/или штаммы. продуцирующие их. и способы применения новых терапевтических композиций.

Изолят БАУР320 ЬасФЬасШш ас1борЫ1и8 представляет собой факультативные анаэробные (микроаэрофильные) каталазонегативные грамположительные неподвижные плейоморфные палочки с задержкой роста на агаре МВ8 при приблизительно 37°С. При выращивании на агаре МВ8 такой изолят образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром от приблизительно 0.5 до приблизительно 0.8 мм после приблизительно 24-часовой микроаэрофильной инкубации. В бульоне МВ8 штамм БАУР320 растет только на дне культуральной пробирки.

Штамм БасЮЬасШих каПуапш РУЭ32 представляет собой факультативные анаэробные (микроаэрофильные) грамположительные каталазонегативные неподвижные плейоморфные палочки. которые образуют гладкие выпуклые колонии с четкими границами. от круглой до правильной формы. диаметром от приблизительно 1 до приблизительно 3 мм после микроаэрофильной инкубации в течение приблизительно 18-24 ч при приблизительно 37°С. Штаммы продуцируют молочную кислоту и Н₂О₂.

Штамм Еп1егососси8 ГаесаШ БАУР21 представляет собой факультативные анаэробные (микроаэрофильные) грамположительные кокки. каталазонегативные. Их рост замедлен на агаре МВ8 при 37°С.

- 4 013330

При культивировании на агаре МВБ этот штамм образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром приблизительно 0,2 мм после микроаэрофильной инкубации в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С. Спустя приблизительно 48 ч микроаэрофильной инкубации при приблизительно 37°С диаметр колоний составляет от приблизительно 1 до приблизительно 1,2 мм. Штамм растет в бульоне МВБ только приблизительно в 2/3 объема от дна культуральной пробирки.

Штамм Еи1егососси§ бигаик Ь^Р2б представляет собой факультативные анаэробные (микроаэрофильные) грамположительные кокки, каталазонегативные, с задержкой роста на агаре МВБ при приблизительно 37°С. При выращивании на агаре МВБ штамм образует беловатые полупрозрачные колонии, которые становятся непрозрачными через приблизительно 24 ч микроаэрофильной инкубации при приблизительно 37°С. Спустя приблизительно 48 ч микроаэрофильной инкубации при приблизительно 37°С средний размер колоний составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,0 мм. В бульоне МВБ штамм растет во всем объеме пробирки.

Скрининг изолированных видов ЬаСоЬасШик и Еи1егососси5 с точки зрения продуцирования бактериоциновой активности осуществляют на питательном агаре на культурах с разными внесенными бактериями-мишенями, представляющими интерес. Другие тестируемые штаммы культивируют в аэробных условиях при приблизительно 37°С в течение приблизительно 14-24 ч. Уегаша ейегосоШгса и Υ. ркеибо1иЬегси1о818 культивируют при приблизительно 28°С в аэробных условиях в течение приблизительно 14-24 ч. Тесты на активность в отношении Сашру1оЬас1ег )сщш выполняют на засеянном С. _)е_)ип1 агаре для Сашру1оЬас1ег, содержащем приблизительно 5% лизированной крови. Использование крови известно специалисту обычной квалификации в данной области и включает кровь, например, овцы, лошади и т.д. Тесты на активность в отношении Сашру1оЬас1ег )сщш проводят в микроаэробных условиях при приблизительно 5% О₂, приблизительно 10% СО₂ и приблизительно 85% Ν₂, в течение приблизительно 24-48 ч при приблизительно 42°С. Приблизительно 0,2 мл антагонистических бактерий, суспендированных в изотоническом растворе, наносят на агар для Ьас1оЬасШи8 и инкубируют в течение приблизительно 24 ч. Вырезают кусочки агара приблизительно 0,5 см³ и переносят на агар для бруцелл или Сашру1оЬас1ег с добавлением лизированной крови, приблизительно 10 мкг/мл рифампицина, приблизительно 2,4 ед./мл полимиксина, и высевают приблизительно 10⁷ клеток Сашру1оЬас1ег )сщш. Чашки инкубируют при приблизительно 42°С в течение приблизительно 24-48 ч в микроаэробных условиях. Активность оценивают, измеряя зоны ингибирования роста.

Изоляты Ьас1оЬасШи8, для которых обнаружено антагонистическое действие, оценивают с точки зрения продуцирования бактериоцинов. Неочищенные противомикробные препараты (САР) получают путем осаждения сульфатом аммония только из культур антагонистических штаммов, выращенных на минимальной среде

К2НРО4 6,0 грамма

КН2РО4 0,2 грамма (ΝΗ₄>23Ο₄ 0,2 грамма

МдЗО₄ 0,1 грамма

Глюкоза 9,0 грамма

Гистидин 0,08 грамма

Аргинин 0,02 грамма

Добавить дистиллированную НгО до 1000 мл, рН приблизительно 7,2 при приблизительно 37°С в течение приблизительно 18 ч в аэробных условиях. Культуральные жидкости затем центрифугируют при приблизительно 12000 х д в течение приблизительно 10 мин. Значения рН в полученных супернатантах затем доводят до приблизительно б,2, добавляя 1 н. ΝηΘΗ. а для удаления органических кислот и перекиси водорода и ингибирующих факторов добавляют приблизительно 130 ед./мл каталазы. Антагонистические пептиды выделяют из супернатанта, комбинируя осаждение сульфатом аммония, обессоливающую хроматографию и гель-фильтрацию с получением неочищенного противомикробного препарата (САР). Образцы САР фильтруют через 0,22 мкм фильтры (М1Шроге, ВебТогб, МА, И8А).

Изоляты Еи1егососси8, для которых обнаружено антагонистическое действие, оценивают с точки зрения продуцирования бактериоцинов. Неочищенные противомикробные препараты (САР) готовят путем осаждения сульфатом аммония только из культур антагонистических штаммов, выращенных в бульоне МВБ бульон МНЗ 15,0 грамма

Лактоза 0,05 грамма

Добавить дистиллированную НгО до 1000 мл, рН приблизительно 7,2 при приблизительно 37°С в течение приблизительно 18 ч в аэробных условиях. Культуральные

- 5 013330 жидкости затем центрифугируют при приблизительно 12000 х д в течение приблизительно 10 мин. рН в полученных супернатантах затем доводят до приблизительно 6,2, добавляя 1 н. ΝαΟΗ, а для удаления органических кислот, и перекиси водорода, и ингибирующих факторов добавляют приблизительно 130 ед./мл каталазы. Антагонистические пептиды выделяют из супернатанта, комбинируя осаждение сульфатом аммония, обессоливающую хроматографию и гель-фильтрацию с получением неочищенного противомикробного препарата (САР). Образцы САР фильтруют через фильтры 0,22 мкм (Мййроге, ВейГогй, МА, И8А).

Молекулярные массы всех пептидов определяют при помощи 8Ό 8-РАСЕ. Величины р1 пептидов определяют посредством изоэлектрического фокусирования. Аминокислотные последовательности определяют при помощи расщепления по Эдману, используя, например, автоматический секвенатор 491 еЬС (Аррйей Вюкук1етк, 1пс.).

Для целей настоящего изобретения термин пептид означает соединение, состоящее по меньшей мере из двух или более аминокислот либо аминокислотных аналогов. Аминокислоты или аминокислотные аналоги могут быть соединены пептидными связями. В другом воплощении аминокислоты могут быть соединены другими связями, например сложноэфирными, эфирными и т.д. Пептиды могут находиться в любой структурной конфигурации, включая линейную, разветвленную или циклическую конфигурации. При использовании в данном описании термин аминокислоты относится либо к природным, либо к синтетическим аминокислотам, включая как Ό-, так и Ь- оптические изомеры, и к аминокислотным аналогам.

Производные и аналоги пептидов по настоящему изобретению включают, без ограничения ими, содержащие в качестве первичной аминокислотной последовательности всю или часть аминокислотной последовательности пептида, включая измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки заменены остатками, приводящими к консервативной аминокислотной замене в рамках данной последовательности.

Например, один или более чем один аминокислотный остаток в рамках данной последовательности может быть заменен другой аминокислотой с аналогичной полярностью, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит к молчащему изменению. Заместители аминокислоты в рамках данной последовательности могут быть выбраны из других членов класса, к которому эта аминокислота принадлежит. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Аминокислотами, содержащими ароматические кольцевые структуры, являются фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Не ожидается, что такие изменения будут оказывать значительное воздействие на кажущуюся молекулярную массу, определяемую электрофорезом в полиакриламидном геле, или на изоэлектрическую точку. Кроме того, для замены на аминокислоту с особенно предпочтительным свойством также можно ввести неконсервативные аминокислотные замены. Например, Сук может быть введен в место, потенциально подходящее для образования дисульфидных мостиков с другим Сук. Рго может быть введен из-за его исключительно плоской структуры.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены посредством химического синтеза. Синтетические пептиды можно получить, используя хорошо известные методики получения в твердой фазе, жидкой фазе, или методики пептидной конденсации, либо любую их комбинацию, и они могут включать в себя природные и/или синтетические аминокислоты. Аминокислоты, используемые для пептидного синтеза, могут представлять собой стандартный Вос(№-аминозащищенный Ν''-третбутилоксикарбонил)аминокислотную смолу, со стандартными протоколами удаления защиты, нейтрализации, сочетания и промывки, используемыми в оригинальной твердофазной процедуре Мерифилда (1. Ат. СНет. 8ос, Уо1ите 85, 2149-2154, 1963), или лабильную в щелочных условиях Ν''-аминозащищенную 9-флуоренилметоксикарбонил(Еток)-аминокислоту (Сагрто апй Нап, 1. Огд. СНет., Уо1ите 37, 3403-3409, 1972). В дополнение к этому, в способе по настоящему изобретению могут быть использованы другие №-защитные группы, известные специалистам в данной области техники. Твердофазный пептидный синтез может быть осуществлен с использованием методик, известных специалисту обычной квалификации в данной области техники (см., например 81е\уаг1 апй Уоипд, 8о11й РНаке 8уп(Неκίκ, 8есопй Еййюп, Р1егсе СНет1са1 Со., ВоскГогй, III., 1984; Е1е1йк апй ЫоЫе, 1п1. I. Рер1. Рго1еш Век., Уо1ите 35, 161-214, 1990), или используя автоматические синтезаторы.

Согласно настоящему изобретению пептиды и/или новые бактериальные штаммы можно вводить в терапевтически приемлемом носителе местно, парентерально, через слизистые, например перорально, назально или ректально, или трансдермально. При необходимости пептиды по настоящему изобретению могут быть модифицированы с целью увеличения способности пептида проходить через клеточные мембраны, например, путем усиления гидрофобной природы пептида, введения пептида в виде конъюгата с носителем, например лигандом, к конкретному рецептору и т. д.

- 6 013330

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено конъюгирование нацеленной молекулы с пептидом по изобретению. Нацеленные молекулы для задач настоящего изобретения означают молекулу, которая при введении ίη νίνο локализуется в желаемом месте или местах. В различных воплощениях настоящего изобретения нацеленная молекула может представлять собой пептид или белок, антитело, лектин, углевод или стероид. Нацеленная молекула может представлять собой пептидный лиганд рецептора на клетке-мишени или антитело, такое как моноклональное антитело. Для облегчения сшивания антитело может быть уменьшено до двух гетеродимеров легких и тяжелых ветвей или может быть уменьшен Е(аЬ')₂-фрагмент, и после этого они сшиваются с пептидом через восстановленную сульфгидрильную группу.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены терапевтические композиции. Композиции могут быть для перорального, назального введения, введения в легкие, для инъекции и т.д. Терапевтические композиции включают эффективные количества по меньшей мере одного бактериоцина по настоящему изобретению и его производных и/или по меньшей мере один новый штамм, по меньшей мере, с целью, по меньшей мере, снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактериеймишенью, вместе с приемлемыми растворителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгирующими агентами, адъювантами и/или носителями. Растворители могут включать буферы, такие как, например, Трис-НС1, ацетатный, фосфатный; добавки могут включать детергенты и солюбилизирующие агенты, такие как, например, Твин 80, Полисорбат 80 и т.д.; антиоксиданты включают, например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия и т.д.; консерванты могут включать, например, тимерсол, бензиловый спирт и т.д.; а наполнители - такие вещества, как лактоза, маннит и т.д.

Терапевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена в композицию, представленную в виде частиц полимерных соединений, таких как поливинилпирролидон, полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Липосомальное инкапсулирование включает инкапсулирование различными полимерами. Можно использовать большое разнообразие полимерных носителей для заключения в них и/или доставки из них одного или более терапевтических агентов, рассмотренных выше, включая, например, как биоразлагаемые, так и бионеразлагаемые композиции. Типичные примеры биоразлагаемых композиций включают альбумин, коллаген, желатин, гиалуроновую кислоту, крахмал, целлюлозу (метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, фталат ацетат целлюлозы, сукцинат ацетат целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы), казеин, декстраны, полисахариды, фибриноген, полиШ.Й-лактид), поли(сополимер Ό,Τ-лактида и гликолида), поли(гликолид), поли(гидроксибутират), поли(алкилкарбонат) и полиортоэфиры, полиэфиры, поли(гидроксивалериановую кислоту), полидиоксанон, поли(этилентерефталат), полияблочную кислоту, политартроновую кислоту, полиангидриды, полифосфазены, полиаминокислоты и их сополимеры (в целом см. 111ит Ь., Эа\тбк 8.8. (ебк.) Ро1утегк ίη СоШгоНеб Эгид Пейуегу, Χν^ΙιΡ Вг1к!о1, 1987; Аткйабу 1. СоШгоИеб Ке1еаке 17: 1-22, 1991; Ρίίί, Ιηΐ. 1. Рйат. 59: 173-196, 1990; Но11апб е! а1., 1. СоШтоПеб Ке1еаке 4: 155-0180, 1986). Типичные примеры неразлагаемых полимеров включают сополимеры поли(этиленвинилацетата) (ЕУА), силиконовая резина, акриловые полимеры (полиакриловую кислоту, полиметилакриловую кислоту, полиметилметакрилат, полиалкилцианоакрилат), полиэтилен, полипропилен, полиамиды (нейлон 6,6), полиуретан, поли(сложный эфируретаны), поли(простой эфируретаны), поли(эфирмочевину), простые полиэфиры (полиэтиленоксид, полипропиленоксид, соединения на основе плюроновых кислот (Р1итошск) и поли(тетраметиленгликоль)), силиконовые резины и виниловые полимеры, такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, поли(винилацетатфталат). Также можно разработать полимеры, которые будут либо анионными (например, альгинат, каррагинин, карбоксиметилцеллюлоза и полиакриловая кислота), либо катионными (например, хитозан, поли-Ь-лизин, полиэтиленимин и поли(аллиламин)) (в целом см. Эипп е! а1., 1. Аррйеб Ро1утег 8с1. 50: 353-365, 1993; Саксопе е! а1., 1. Ма!епа1к 8с1.: Ма!епа1к ίη Мебюте 5: 770-774, 1994; 8ЫгакЫ е! а1., Вю1. Рйатт. Ви11. 16 (11): 11641168, 1993; Тйасйагоб1 амб Као, Ιηΐ'1 1. Рйагш. 120: 115-118, 1995; М|уахак| е! а1., Ιηΐ'1 1. Рйатт. 118:257263, 1995).

Полимерным носителям можно придать различные формы с необходимыми характеристиками по высвобождению и/или с конкретными необходимыми свойствами. Например, полимерные носители могут быть изготовлены в форме для высвобождения терапевтического агента под действием конкретного запускающего события, такого как рН (см., например, Не11ег е! а1. Сйетюа11у 8е1Г-Кеди1а!еб Эгид Оейуегу 8ук1етк в Ро1утегк ίη Мебюте III, Е1ке\тег 8с1спсс РиЬНкйегк В.У., Атк!егбат, 1988, р. 175-188; Канд е! а1., 1. Аррйеб Ро1утег 8с1. 48: 343-354, 1993; Эонд е! а1., 1. СойтоНеб Ке1еаке 19: 171-178, 1992; Эонд апб Нойтащ 1. СойгоНеб Ке1еаке 15: 141-152, 1991; К1т е! а1., 1. Сойгойеб Ке1еаке 28: 143-152, 1994; Соте)о-Вгато е! а1., 1. Сойгойеб Ке1еаке 33: 223-229, 1995; XVи аиб Ьее, Рйагт. Кек. 10(10): 1544-1547, 1993; 8еггек е! а1., Рйатт. Кек. 13 (2): 196-201, 1996; Реррак, ЕгтбатегИак о! рН- апб Тетре^а!и^е-8еηк^!^νе Оейуегу 8ук!етк в Ситу е! а1. (ебк.), Ри1ка!11е Эгид ПеНуегу, V^ккеηксйай1^сйе Уег1адкдеке11ксйай тЬН, 8!и!!дай, 1993, р.41-55; ЭоеП/ек Се11и1оке Пегшайуек, 1993, в Реррак амб Бандег (ебк.), Вюро1утетк I, 8рттдег-Уег1ад, Вет1ш). Типичные примеры рН-чувствительных полимеров включают полиакриловую кислоту и ее производные (в том числе, например, гомополимеры, такие как полиаминокарбоновая кислота, полиакриловая кислота, поли(метилакриловая кислота), сополимеры таких гомополимеров и со

- 7 013330 полимеры полиакриловой кислоты и акрилмономеров, аналогично рассмотреным выше. Другие рНчувствительные полимеры включают полисахариды, такие как фталат ацетат целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, сукцинат ацетат гидроксипропилметилцеллюлозы, тримеллитат ацетат целлюлозы и хитозан. Другие рН-чувствительные полимеры включают любую смесь рН-чувствительного полимера и водорастворимого полимера.

Также могут быть получены полимерные носители, чувствительные к температуре (см., например, Сбей е! а1. Νονοί Нубгодек оГ а Тетрега!иге-Зеиз1буе Р1игошс Сгайеб !о а Вюабкез1уе Ро1уасгубс Ас1б ВаскЬоие Сот Уадша1 Эгид Оекуегу в Ргосееб. 1п1егп. Зутр. Сои!го1. Ке1. Вюас!. Ма!ег. 22: 167-168, Сои1го11еб Ке1еазе Зоск!у, 1ис., 1995; Окаио, Мо1еси1аг Эебдп оГ Збти11-Кезроиз1уе Нубгодек Бог Тетрога1 Сои!го11еб Эгид ОеКуегу в Ргосееб. 1и!еги. Зутр. Сои!го1. Ке1. Вюас!. Ма!ег. 22: 111-112, Соибо11еб Ке1еазе Зос1е(у, 1ис., 1995; 1ойи81ои е! а1., Ркагт. Кез. 9(3): 425-433, 1992; Тиид, Ιπί'1 1. Ркагт. 107: 85-90, 1994; Нагзк аиб Секгке, 1. Сотго11еб Ке1еазе 17: 175-186, 1991; Вае е! а1., Ркагт. Кез. 8 (4): 531-537, 1991; Όίиагуаиб аиб ВЕта^ек, 1. Сои!го11еб Ке1еазе 36: 221-227, 1995; Уц аиб Сгашдег №уе1 Ткегто-зеиз1буе АтрЫркШс Се1з: Ро1у №коргору1асгу1ат1бе-со-зобшт асгу1а!е-со-и-к-а1ку1асгу1ат1бе ΝοΙ\\όγ1< Зуи!кезк аиб Ркузкоскетка1 Скагаскб/абои, Эер1. оГ Скетка1 & Вю1одка1 ЗсБ, Огедои Сгабиа!е 1изб!и!е оГ Зс1еисе & Тескиокду, Веауепои, ОК, р.820-821; Ζΐκιιι аиб Зт1б Ркузка1 Нубгодек оГ Аззоаабуе З!аг Ро1утегз, Ро1утег Кезеагск 1изб!и!е, Эер1. оГ Скеткбу, Со11еде оГ Еиу^^οηтеиίа1 Зскисе аиб Еогезбу, З!а!е Ишу. оГ Νο\υ Уогк, Зугасизе, Ν.Υ., р.822-823; НоГГтаи е! а1. Скагас1еп/шд Роге З|/ез аиб \Уа1ег З!гис!иге ш Збтик-Кезроиз1уе Нубгодек, Сеи!ег Гог Вюеидшеебид, ишу. оГ ^азкшд!ои, Зеаб1е, ^азк., р.828; Υυ аиб Сгашдег Ткегто-зеизШуе З^еШид Векауюг ш СгоззИикеб к-коргору1асгу1ат1бе №!^огкз: Сабошс, Ашотс аиб Атрко1убс Нубгодек, Эер1. оГ Скетка1 & Вю1одка1 ЗсБ, Огедои Сгабиа!е 1изб!и!е оГ Зскисе & Тескиокду, Веауейои, ОК, р.829-830; К1т е! а1., Ркагт. Кез. 9(3): 283-290, 1992; Вае е! а1., Ркагт. Кез. 8(5): 624-628, 1991; Коио е! а1., 1. Сотго11еб Ке1еазе 30: 69-75, 1994; Υοзк^ба е! а1., 1. Сои!го11еб Ке1еазе 32: 97-102, 1994; Окаио е! а1., 1. Сотго11еб Ке1еазе 36: 125-133, 1995; Скии аиб К1т, 1. Сои!го11еб Ке1еазе 38: 39-47, 1996; П'Етаииек аиб Ошагуаиб, 1и!'1 1. Ркагт. 118: 237-242, 1995; Ка!оио е! а1., 1. Сои!го11еб Ке1еазе 16: 215-228, 1991; НоГГтаи Ткегта11у Кеуегз1Ь1е Нубгодек Сои!а1шид Вю1одка11у Асбуе Зрескз в М1дкагез1 е! а1. (ебз.), Ро1утегз ш Мебкше III, Е1зеу1ег Заеисе РиЫккегз В. V., Атз!егбат, 1988, р.161-167; НоГГтаи Аррксабоиз оГ Ткегта11у Кеуегз1Ь1е Ро1утегз аиб Нубгодек в Ткегареибсз аиб Э|адиозбсз, в Тк1гб 1и!егиабоиа1 Зутрозшт ои Кесеи! Абуаисез ш Эгид Оекуегу Зуз!етз, За1! Баке Ску, И1ак, ЕеЬ. 24-27, 1987, р.297-305; СиЮ^зка е! а1., 1. Сои!го11еб Ке1еазе 22: 95-104, 1992; Ра1азк аиб Секгке, 1. Сои!го11еб Ке1еазе 18: 1-12, 1992; Раауо1а е! а1., Ркагт. Кез. 12 (12): 1997-2002, 1995).

Типичные примеры термогелеобразующих полимеров и температура их гелеобразования (БСЗТ (нижняя критическая температура растворения) (°С)) включают гомополимеры, такие как поли(Ц-метил-н-пропилакриламид), 19,8; поли(Ц-н-пропилакриламид), 21,5; поли(Ц-метил-к-изопропилакриламид), 22,3; поли(Ц-нпропилметакриламид), 28,0; поли(Ц-изопропилакриламид), 30,9; поли-(Ц,н-диэтилакриламид), 32,0; поли(Ц-изопропилметакриламид), 44,0; поли(к-циклопропилакриламид), 45,5; поли(Ц-этилметакриламид), 50,0; поли(Цметил-к-этилакриламид), 56,0; поли(К-ииклопропилметакриламид) 59,0; поли(Б1-этилакриламид), 72,0. Кроме того, термогелеобразующие полимеры могут быть изготовлены путем получения сополимеров (из) упомянутых выше мономеров или путем объединения таких гомополимеров с другими водорастворимыми полимерами, такими как акрилмономеры (например, акриловая кислота и ее производные, такие как метилакриловая кислота, акрилат и его производные, такие как бутилметакрилат, акриламид и Ν-н-бутилакриламид). Другие типичные примеры термогелеобразующих полимеров включают эфирные производные целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, 41°С; метилцеллюлоза, 55°С; гидроксипропилметилцеллюлоза, 66°С, и этилгидроксиэтилцеллюлоза, и Р1шотс8, такие как Е-127, 10-15°С; Б-122, 19°С; Б-92, 26°С; Б-81, 20°С и Б-61, 24°С.

С использованием полимерных носителей по настоящему изобретению может быть получено большое разнообразие форм, включая, например, палочкообразные структуры, шарики, плитки или капсулы (см., например, Сообе11 е! а1., Ат. 1. Нозр. Ркагт. 43: 1454-1461, 1986; Баидег е! а1. Сои!го11еб ге1еазе оГ тасгото1еси1ез Ггот ро1утегз в Вютебка1 Ро1утегз, Ро1утебс Ма!еба1з аиб Ркагтасеибсак Гог Вютеб1са1 Изе, Со1бЬегд Е.Р., №1кадкп А. (ебз.) Асабетк Ргезз, р.113-137, 1980; Ккше е! а1., 1. Ркагт. ЗсБ 69: 265-270, 1980; Вго^и е! а1., 1. Ркагт. ЗсБ 72: 1181-1185, 1983 и Ва\та е! а1., 1. Сои!го11еб Ке1еазе 1: 259267, 1985).

Терапевтические агенты могут быть связаны посредством заключения их в матрицы из полимера, присоединены ковалентными связями или инкапсулированы в микрокапсулы. В некоторых предпочтительных воплощениях изобретения терапевтические композиции предложены в виде некапсулированных препаратов, таких как микросферы (размером в диапазоне от нанометров до микрометров), пасты, нити различного размера, пленки и спреи.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены терапевтическая композиция и корм для животных. Терапевтическая композиция по настоящему изобретению может быть инкапсулирована с использованием полимерного носителя, как описано выше, и затем добавлена в корм любым известным способом введения ее в корм, таким как, например, механическое смешивание, распыление и т.д. Терапевтическая композиция включает в себя, например, некоторое количество по меньшей мере одного бактериоцина и/или антагонистических бактерий, эффективных, по меньшей мере, для пониже

- 8 013330 ния уровней колонизации животного по меньшей мере одной бактерией-мишенью, такое как, например, приблизительно 0,5 г каждого из лактоцина и/или энтероцина/1000 г, приблизительно 1,25 г полимерного носителя, такого как поливинилпирролидон/1000 г, и приблизительно 8,6% растворителя, такого как вода/1000 г, в смеси с любым перевариваемым гранулированным компонентом, таким как, например, молотая кукурузная крупа, дробленое зерно, такое как, например, овес, пшеница, гречка; измельченные фрукты, такие как, например, груши, и т.д. Терапевтическую композицию затем добавляют к любому типу корма для животных в количествах, эффективных, по меньшей мере, для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью, например с соотношениями бактериоцина к корму, составляющими от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100. Для целей настоящего изобретения примеры корма для животных включают фураж, силосы, сухой зеленый корм, коренья, клубни, сочные плоды, зерна, семена, пивное зерно, жмыхи, пивные дрожжи, остатки от перегонки, побочные продукты размола, побочные продукты при производстве сахара, крахмала или масла, и различные пищевые отходы. Продукт можно добавлять в корма для животных, использующиеся для разведения крупного рогатого скота, домашних птиц, кроликов, свиней или овец и т.д. Его можно использовать в виде смеси с другими пищевыми добавками для этих пород.

Следующие далее примеры предназначены только для дополнительной иллюстрации данного изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, который определен формулой изобретения.

Пример 1.

Из слепой кишки и зоба бройлерных цыплят были выделены два новых антагонистических штамма Ьас1оЬасШик кайуапик, обозначенный как ΝΚΚΕ В-30514 (штамм РУБ32). и БасЮйасШик ас1борЫ1ик, обозначенный как ΝΚΚΕ В-30510 (штамм Ь^Р320), продуцирующих бактериоцины. Слепую кишку и зоб предварительно опорожняли и дважды промывали приблизительно 100 мл стерильного 0,85%-ного (мас./об.) физиологического раствора (изотонического раствора). Материал слепой кишки и зоба суспендировали в стерильном физиологическом растворе, рН приблизительно 7,0. Приблизительно 0,1 мл 10-кратно разбавленной суспензии наносили прямо на чашки с селективным агаром МКБ. Чашки инкубировали в анаэробных условиях при приблизительно 37°С в течение приблизительно 16-18 ч. Из каждого образца отбирали по меньшей мере 10 колоний, характерных для Ьас1оЬасШик крр. Лактобактерии идентифицировали, используя систему для микротестирования АРО 50 СНЬ (ЬюМейеих, Франция).

Штаммы ЬасФЬасШик кайуапик РУБ 32 и Ьас1оЬасШик ааборййик Ь^Р320 выращивали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24 ч на агаре МКБ. Эти два штамма представляют собой факультативные анаэробные грамположительные неподвижные палочки, способные расти при приблизительно 30, 37 и 42°С. Штамм РУБ 32 растет на агаре МКБ с образованием после микроаэрофильной инкубации в течение приблизительно 18-24 ч при приблизительно 37°С, гладкие выпуклые колонии от круглой до правильной формы с четкими границами диаметром приблизительно 1-3 мм. Штамм ЙАУР320 растет на агаре МКБ с образованием после микроаэрофильной инкубации в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37°С беловатых полупрозрачных колоний диаметром от приблизительно 0,5 до приблизительно 0,8 мм.

Ейегососсик Гаесайк ЙАУР21 и Еп1егососсик бигапк ЙАУР26 выращивали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24 ч на агаре МКБ. Они представляют собой грамположительные факультативные анаэробные неподвижные кокки, способные расти при приблизительно 30, 37 и 42°С. Штамм ЙАУР21 растет на агаре МКБ с образованием беловатых полупрозрачных колоний, которые становятся непрозрачными после микроаэрофильной инкубации в течение приблизительно 24 ч. После приблизительно 48-часовой микроаэрофильной инкубации при приблизительно 37°С диаметр колонии составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,0 мм.

Результаты в АР1 50СНБ и ΕΝ-СОССИБ галереях с использованием суспензионной среды АР1 50СНБ представлены ниже в табл. 1. Результаты, представленные ниже в табл. 2, указывают на то, что штамм РУБ32 представляет собой БасЮйасШик кайуапик, штамм ЙАУР320 представляет собой йасЮйасб1ик ас1борЫ1ик, штамм ЙАУР21 представляет собой Еи1егососсик Гаесайк и штамм ЙАУР26 представляет собой ЕШегососсик бигапк.

Бактерии-мишени для оценки антагонистической активности антагонистических изолятов включали штаммы С. )е)иш Ь4 и В1, выделенные от бройлерных цыплят в России, а Сашру1оЬас1ег )сщш АТСС 11168, несколько видов из семейства Еп1егоЬас1ейасеае, Ркеибошопак аегищпока штамм АТСС 9027, Б!арЫ1ососсик аигеик и Ык1епа шопосу!опдепек использовали в качестве тестируемых культур для оценки изолятов на антагонистическую активность. Культуры С. )ещш выращивали либо на агаре для бруцелл, либо на агаре для Сашру1оЬас1ег с добавлением приблизительно 0,02% бисульфита натрия, приблизительно 0,05% сульфата двухвалентного железа и приблизительно 5% частично лизированной овечьей крови при приблизительно 37°С в течение приблизительно 18-24 ч в микроаэробных условиях с приблизительно 5% О₂, приблизительно 10% СО₂ и приблизительно 85% Ν₂. Другие штаммы культивировали на питательном агаре при приблизительно 37°С или приблизительно 28°С для Υ. егИегосоййса и Υ. ркеибо1иЬегси1ок1к в течение приблизительно 18-24 ч в аэробных условиях. Оценивали антагонистическую активность изолятов в отношении Сашру1оЬас1ег. Приблизительно 0,2 мл суспензий в изотоническом фи

- 9 013330 зиологическом растворе помещали на чашки с агаром МК8 и инкубировали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24 ч. Вырезали кусочки агара приблизительно 0,5 см³ и переносили на агар для бруцелл или агар для Сашру1оЬас1ет с добавлением приблизительно 5-10% частично лизированной овечьей крови, приблизительно 10 мкг/мл рифампицина и приблизительно 2,5 ед./мл полимиксина, и инокулировали приблизительно 10⁷ клеток Сашру1оЬас1ет )сщш на чашку. Чашки инкубировали при приблизительно 42°С в течение приблизительно 24 ч в микроаэробных условиях, как описано выше. Антагонистическую активность оценивали, измеряя величину диаметра зон ингибирования С. )е)шп.

Антагонистическую активность по отношению к Сашру1оЬас1ет )сщш оценивали, используя 11790 изолятов. Из них 279 изолятов продемонстрировали антагонизм к С. )сщш.

Таблица 1 Результаты идентификации в тесте ΑΡΙ 50СНЬ и ЕИ-СОССИ^

Штаммы	Тест (баллы)	Виды
РУР 32	ΑΡΙ 50СН1. (99,9%)	Сас1оЬааПиз заНцапиз
ШР320	ΑΡΙ 50СН1. (96,6%)	Ьас1оЬасШиз аск!орЫ1из
ί1Λ/Ρ21	ΕΝ-СОССиЗ-тест (96%)	Еп1егососсиз ГаесаНз
1УУР26	ΕΝ-СОССиБ-тест (98%)	Еп(егососсиз дигапз

Таблица 2а

Характеристика штаммов Ьас1оЬасШи8 (результаты в ΑΡΙ 50СНЬ)

	Изоляты и их свойства
УГЛЕВОДЫ	РУР32 ί\Λ/Ρ320
0 - контроль
Глицерин
Эритрит
Р-Арабиноза
ί-Арабиноза
Рибоза
Р-Ксилоза
ί-Коилоза
Адонит .
β-Метилксилозид
Галактоза	+ +
Р-Глюкоза	+ +
Р-Фруктоза	+ +
Р-Манноза	+ -
ί-Сорбоза	- -
Рамноза
Дульцит	- -
Инозит	- -
Маннит	4- -
Сорбит	+ -
а-Метил-Р-маннозид	- ?

- 10 013330

а-Метил-О-глюкозид	. 7
М-Ацетилглюкозамин	+ +
Амигдалин	- +
Арбутин	- ?
Эскулин	- ’
Салицин	- +
Целлобиоза	- +
Мальтоза	+ +
Лактоза	+ +
Мелибиоза	+ -
Сахароза	+ +
Трегалоза	+ -
Инулин	- -
Мелезитоза	’ -
β-Раффиноза	+ ?
Амидон
Гликоген
Ксилит
Гентиобиоза
В-Тураноза
В-Ликсоза
В-Тагатоза
В-Фукоза
ί-Фукоза	7 -
β-Арабит	? _
ί-Арабит	- -
Глюконат	- -
2 Цетоглюконан	- -
5 Цетоглюконан	- -
Идентифицирован как	Ьас(оЬасП1из Ьас‘оЬасИ1из зайУализ асИорЬИиз

Таблица 2б

Характеристика штаммов ЕгДсгососсиз с использованием теста ΕΝ-СОССИЗ

	Изоляты и их свойства
ТЕСТ	ίννΡ21	ίννΡ26
ί-Арабиноза	-	-
Рибоза	+	+
ί-Сорбоза	-
Маннит	4-	-
Сорбит		-
Лактоза	+	+
Мелибиоза	-	ά
Сахароза		-
Мелезитоза	(+)	-
β-Раффиноза
Аргинин	+	+
Идентифицирован как	Еп(егососсиз (аесаИз	Еп1егососсиз дигапз

- 11 013330

Таблица 3

Ингибиторная активность изолятов в отношении тестируемых штаммов Сашру1оЬас1ет )ещш

Антагонистич. идентификация	Источник штамма	Диаметр (мм) ингибирования роста С. уе/ил/
		11168	В1	Ь4	Р2	ΚΙ	1ЖЗ
Ι1Λ/Ρ21	Слепая кишка бройлерных цыплят	7	5	4	5	2	4
1.У7Р26	Слепая кишка бройлерных цыплят	2	5	4	6	3	7
1ДЛ/Р320	Слепая кишка бройлерных цыплят	4	5	4	5	3	6
РУО32	Зоб бройлерных цыплят	5	5	4	5	4	6

Пример 2.

Из мазков слепой кишки и зоба здоровых бройлерных цыплят были выделены два новых антагонистических штамма, Еп1етососси8 ГаесаПк 21 (ИККЬ В-30645) и Еп1етососси8 битапк 26 (ИККЬ В-30511), продуцирующие бактериоцины. Слепую кишку и зоб опорожняли и дважды промывали стерильным 0,085%-ным (мас./об.) изотоническим физиологическим раствором при рН приблизительно 7,0. Материал слепой кишки и зоба суспендировали в стерильном изотоническом физрастворе при рН приблизительно 7,0. Приблизительно 0,1 мл 10-кратно разбавленной суспензии наносили прямо на чашки с селективной средой МК8, и чашки инкубировали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24-48 ч. Энтерококки идентифицировали, используя набор для микротестирования ΕΝ-ΟΘΟΟυδ.

В качестве тестируемой культуры для оценки изолятов на антагонистическую активность, как описано выше в примере 1, использовали Сашру1оЬас1ет )е)иш АТСС 11168. Тридцать три других штамма использовали в качестве тестируемых культур для оценки антагонистической активности изолятов, как описано выше в примере 1. Антагонистическую активность изолятов в отношении Сашру1оЬас1ег также оценивали, как описано выше в примере 1.

Антагонистическую активность по отношению к Сашру1оЬас1ег )е)иш оценивали, используя 1200 изолятов, выделенных от приблизительно 125 бройлерных цыплят. Из них 63 изолята проявляли антагонизм по отношению к С. )е)иш АТСС 11168. Способность продуцировать бактериоцины в процессе культивирования в среде МК8 изучали для 12 наиболее активных изолятов (см. табл. 1-3 выше).

Пример 3.

Неочищенные противомикробные препараты получали путем осаждения сульфатом аммония только из культур антагонистических штаммов Ьас1оЬасШи8, выращенных на минимальной среде

К₂НРО₄	6,0 грамма
КН₂РО₄	0,2 грамма
(НН₄)_гЗО₄	0,2 грамма
МдЗО₄	0,1 грамма
глюкоза	9,0 грамма
гистидин	0,08 грамма
аргинин	0,02 грамма
Добавить дистиллированную НгО до 1000 мл, рН 7,2

в течение приблизительно 18 ч в аэробных условиях при приблизительно 37°С. Культуральные жидкости центрифугировали при приблизительно 12000 х д в течение приблизительно 10 мин. Значения рН в полученных супернатантах доводили до приблизительно 6,2, добавляя 1н. ΝηΘΗ. а для удаления органических кислот и перекиси водорода и ингибирующих факторов добавляли приблизительно 130 ед./мл каталазы. Антагонистические пептиды выделяли из супернатанта, комбинируя осаждение сульфатом аммония, обессоливающую хроматографию и гель-фильтрацию, с получением неочищенного препарата (САР). Образцы САР фильтровали через 0,22 мкм фильтры (М1Шроте, ВебГогб, МА).

- 12 013330

Пример 4.

Проявляющие противомикробную активность изоляты Еп1егососси5 из приведенного выше примера 2 культивировали в бульоне МЯ8 (Н1Меб1а)

Бульон МВ8 15 граммов

Лактоза 0,05 грамма

Добавить дистиллированную Н₂О до 1000 мл, рН приблизительно 7,2 при приблизительно 37°С в течение приблизительно 18 ч в аэробных условиях. Культуральные жидкости собирали и центрифугировали при приблизительно 12000 х д в течение приблизительно 10 мин. Значения рН в полученных супернатантах подводили до приблизительно 6,2, добавляя 1н. ИаОН. а для удаления органических кислот и перекиси водорода и ингибирующих факторов добавляли приблизительно 130 ед./мл каталазы.

Антагонистические пептиды выделяли из супернатанта. комбинируя осаждение сульфатом аммония. обессоливающую хроматографию и гель-фильтрацию с получением неочищенного противомикробного препарата (САР). Образцы САР фильтровали через 0.22 мкм фильтры (Мбйроге).

Пример 5.

Спектр противомикробной активности САР определяли. используя спот-тест. Приблизительно 1 мл стерильного неочищенного противомикробного препарата (САР). полученного как в примерах 3 и 4 выше. разбавляли приблизительно 1 мл натрий-фосфатного буфера (рН приблизительно 7.0) и стерилизовали. как в приведенных выше примерах 3 и 4. Приблизительно 10 мкл каждого образца наносили на чашки с агаром для Сатру1оЬас!ег или питательным агаром с добавлением крови. предварительно засеянным клетками бактерий-мишеней. Чашки. содержащие культуры С. _)е_)иш. выращивали при приблизительно 42°С в микроаэробных условиях. Υ. еШегосойбса и Υ. р5еибо!иЬегси1о515 культивировали аэробно при приблизительно 28°С. а другие бактериальные штаммы инкубировали аэробно при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24 или 48 ч. Идентификацию осуществляли на основе площадей ингибирования. получаемых у бактерий-мишеней. Активность САР выражали в произвольно условных единицах (Аи) на один миллилитр препарата. при которых появляется видимая зона ингибирования роста культуры (Непбегаоп е! а1.. АгсЫуек о! ВюсйетМгу апб Вюрйуыск. Уо1ише 295. 5-12. 1992; включен в данное описание посредством ссылки). Все эксперименты проводили в двух параллелях.

Приведенные ниже табл. 4 и 5 демонстрируют антагонистическую активность неочищенных противомикробных препаратов. приготовленных для Ьас!оЬасШи8 в примере 3 и Еп1егососси§ в примере 4.

Два изолята вида Ьас!оЬасШи8 ингибировали рост Сатру 1оЬас!ег ,|сщш (табл. 3). Изоляты идентифицировали. используя тест АР1 50СНЬ (ЬюМепеих. Франция). и они представляют собой Ьас!оЬасШи8 8а11уапи8 РУИ32 (ИЯРЬ В-30514) и Ьас!оЬасШи8 ас1борЫ1и8 ЬАУР320 (ИЯЯЬ В-30510). Как видно из табл. 4. все эти штаммы продуцируют лактоцин с широким спектром антибактериальной активности. Они ингибируют рост как грамположительных. так и грамотрицательных микроорганизмов. Лактоцин ОЯ-7 является самым активным в отношении С. _)е_)иш.

Два изолята вида ЕпЮгососсш ингибировали рост С. ,|сщш (табл. 3). Изоляты идентифицировали. используя тест ЕИ-СОССИ8. как Еп1егососси§ ГаесаШ (изолят Ь^Р21) (ИЯРЬ В-30645) и Еп1егососси§ бигапз (изолят Ь^Р26) (ИЯЯЬ В-30511). Оба штамма продуцируют энтероцины с широким спектром действия. подавляя как грамположительные. так и грамотрицательные микроорганизмы. Энтероцин 21. продуцируемый Е. ГаесаШ. уникален в том. что он ингибирует рост всех 33 тестируемых штаммов. включая Рго!еи§ уи1дап8 и Могдапе11а тогдапи. которые особенно устойчивы к бактериоцинам разного происхождения.

- 13 013330

Таблица 4

Активность лактоцина и лактококцина, продуцируемых

ЬасГоЬасШик крр. и Ьас1ососсик крр., в спот-тесте (АИ/мл)

Тестируемые штаммы	Лактоцин ОН-7	Лактоцин ЮТР320
С./е/Дп/АТСС 11168	3200	1600
С. ]е]ип114	3200	1600
С. ίβίυηί υν3	3200	800
С. ίθβΐηί Е2	3200	800
5. θηίθπ'Ιίάίϊ 1	1600	800
3. βηίθπΐίάΐβ 4	1600	800
8. еп(еп1кИз 204	800	800
8. βηίβπΙκΙΪ3 237	1600	800
8. даШпагит риИогит	800	400
8. {урЫтипит 320	1600	400
8. {урЫтипит 383/60	1600	800
8. С1ю1егаези!з 370	1600	800
3. с1ю1егаези13 434/4	800	400
Е. СОН 0157 : 7 ΕϋΙ_ 933	1600	1600
Е. со//0157 :7 904	3200	3200
Е. со//0157 : 7161	3200	400
Е. со//0157 : 7 131	3200	600
СНгоЬас(ег /геипсШ	1600	400
К1еЬз1е11а рпеитотае	1600	200
31). с1узеп1епав	1600	200
Υ. еп1егосоПИса 03	1600	400
У. еп(егосоИвса 09	1600	200
У. еп1вгосоИНса 11	800	400
У. рзеиРо(иЬегси1оз1з сер. 4	1600	200
У. рзеи<1о1иЬегси1оз13 сер.14	1600	200

Таблица 5

Активность энтероцинов, продуцируемых ЕиГегососсик Гаесайк 21 и ЕиГегососсик бигапк 26

Тестируемый штамм	Е. {аесаИз САР	Е. (аесаИз Пик I	Е. (аесаПз Пик II	Е. /аесайз Пик I & II	Е. с!игапз САР
С. /еуол/ АТСС 11168	12800	-	400	12800	6400
С. ;θ}υηί 1.4	6400		400	6400	3200
С. уе/ип/ и\/3	6400		400	6400	3200
С. ίθίυηί Р2	6400		400	6400	3200
8. еп(епИсНз 1	1600		400	1600	3200
3. еп(еп1кНз 4	1600		400	1600	3200
8. βηΐθήίκΐίε 204	1600		400	1600	3200
8. еп1егНкИз 237	1600		400	1600	3200
8. даШпагит риИогит	3200		800	3200	1600
3.1урЫтипит 320	3200		800	3200	1600
8.1ур!итипит 386/60	3200		800	3200	3200
8. с1ю1егаези1з 370	3200		400	3200	3200
8. С1ю1егаезшз 434/4	1600		400	1600	3200
Е. СО//0157 : 7 ΕΟί 933	3200		400	3200	1600
Е. соИ 0157 :7 904	3200		800	3200	1600
Е. со// 0157 : 7 161	3200		400	3200	3200
Е. со//0157 : 7 131	3200		200	3200	3200
СйгаЬас/ег /геипвН	6400		400	6400	1600

- 14 013330

К1еЬз1е11а рпеитотае	1600	-	200	1600	1600
З/ι. дузеп(епае	6400	-	800	6400	1600
Υ. еп1егосоНИса 03	6400	-	400	6400	3200
Υ. еМегосоНЯса 09	3200	-	400	3200	3200
Υ. еп1егосоНИса 11	3200	-	400	3200	1600
Υ. рзеидо(иЬегси1оз!3 сер. 4	3200		400	3200	1600
Υ. рзеи<ЮиЬегси1оз13 сер. 14	3200		400	3200	1600
Рга(еиз пйгаЫНз	800	-	200	800	-
МогдапеНа тогдапИ	800	-	200	800	-
РзеиРотопаз аегидтоза АТСС 9027	6400		400	6400
Г. топосу/одепез 9-72	6400		800	6400	3200
/.. топосу1одепез 9-30	12800		800	12800
Г. топосу(одепез А	6400	-	800	6400	3200
81арЬу!ососсиз зигеиз	6400		800	6400	1600
31арйу1ососсиз ерМепгшИз 4	3200		400	3200	1600

Пример 6.

САР и бактериоцины разделяли электрофоретически посредством 808-РАСЕ, используя приблизительно 15%-ный агарозный гель и приблизительно 1% 8Ό8 (9x12 см) в трис-глициновом буфере. После проведения электрофореза при приблизительно 100 мА в течение приблизительно 4 ч гели фиксировали раствором, содержащим приблизительно 15% этанола и приблизительно 1% уксусной кислоты. Затем гели промывали дистиллированной водой в течение приблизительно 4 ч. Для определения молекулярных масс белковых фракций гели окрашивали раствором, содержащим приблизительно 0,15% Соота881 Вп1йаи! В1ие В-250 (8щша. США), приблизительно 40% этанола и приблизительно 7% уксусной кислоты. Гели последовательно промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8) в течение приблизительно 1,5 ч и деионизованной водой в течение приблизительно 3 ч. Промытые гели тестировали в отношении трех типов бактерий-мишеней - С. )сщш АТСС 11168, Е. сой 0157:Н7 904 и 8. еШегйШз 237 способом Вйиша е! а1. (1оигиа1 οί 1пби81па1 МюгоЬю1оду, Уо1ите 2, 319-322, 1987; включен в данное описание посредством ссылки). Гели помещали в чашки Петри, покрытые полутвердым агаром для Сатру1оЬас!ег (приблизительно 0,75%-ным), содержащим приблизительно 5% лизированной крови овцы, или полутвердым агаром (0,7%-ным), и засевали клетками тестируемых штаммов. Чашки, содержащие С. )сщпг инкубировали при приблизительно 42°С в течение приблизительно 48 ч в микроаэробных условиях, Е.сой 0157:Н7 и 8. еШепЕбЕ - при приблизительно 37°С в течение приблизительно 24 ч. Оценка была основана на визуализации зон ингибирования роста тестируемых штаммов в присутствии бактериоцинов. Проводили оценку активности очищенных бактериоцинов (табл. 6 для вида Ьас1оЬасШи8 и табл. 7 для вида Еп1егососсиб).

Образцы САР и бактериоцинов помещали в гели для ΙΕΕ (изоэлектрофокусирования) (рН приблизительно 3,1-10,0) (Иоуех, 8ап О1едо, СА). Изоэлектрофокусирование в гелях проводили при приблизительно 100 В в течение приблизительно 1 ч, 200 В в течение приблизительно 2 ч и 500 В в течение приблизительно 30 мин в устройстве ХСМ II™ М1ш-Се11 (Потех). Гели промывали дистиллированной водой в течение приблизительно 30 с без фиксирования с последующей окраской Соота881е ВпШап! В1ие В-250 (81дта, США) для определения изоэлектрических точек (р1) бактериоцинов и их способности ингибировать рост тестируемых штаммов, как показано ниже в табл. 6 для лактоцинов и табл. 7 для энтероцинов.

Как видно из фиг. 1, САР ОВ7 из Ь. заШализ РУО 32 содержит три белковые фракции приблизительно 6 кДа, приблизительно 16 кДа и приблизительно 40 кДа. Для измерения их активности окрашенные электрофоретические полоски, содержащие пептиды, помещали на полутвердый агар для Сатру1оЬас1ег, инокулированный клетками С. )сщш АТСС 11168, 8. еп1егй1б18 и Е. сой 0157:Н7. Обнаружено, что фракция с массой приблизительно 6 кДа активна в отношении всех трех тестируемых штаммов. Изоэлектрофокусированием идентифицирована фракция с р1, равным приблизительно 9,0, которая демонстрировала активность в отношении всех трех тестируемых штаммов.

Как видно из фиг. 2, чистый лактоцин ί·\νΡ320 из Ь. ас1борЫ1и8 Ь^Р320 и чистый энтероцин Ь^Р26 из Е. бигапз ΕνΡ26 содержат белковые фракции приблизительно 6 кДа и приблизительно 3 кДа соответственно. Для измерения их активности окрашенные электрофоретические полоски, содержащие

- 15 013330 пептиды, помещали на полутвердый агар для Сатру1оЬасГег, инокулированный клетками С. _)е_)иш АТСС 11168, 8. епГегШб1к и Е. со11 0157:Н7. Обнаружено, что фракции приблизительно 6 кДа и приблизительно 3 кДа активны в отношении всех трех тестируемых штаммов. Изоэлектрофокусированием идентифицированы фракции с р1, равным приблизительно 8,5 и приблизительно 7,8 соответственно, которые демонстрировали активность в отношении всех трех тестируемых штаммов.

Как видно из фиг. 3, выделенный энтероцин ЬУР21 из Е. Гаесайк ЬУР21 содержит две белковые фракции приблизительно 3,0 кДа (пик 1) и приблизительно 6,0 кДа (пик 2). Для определения противомикробной активности электрофоретические полосы помещали на полутвердый агар для Сатру1оЬасГег, инокулированный С. .)е.)иш АТТС 11168, 8. епГегй1б1к и Е. сой 0157:Н7. Фракция приблизительно 6,0 кДа была активна в отношении всех трех штаммов. Никакой антибактериальной активности не наблюдалось для фракции приблизительно 3,0 кДа. Для выделенного энтероцина ЬУР26 изоэлектрофокусированием идентифицирована единственная белковая фракция с р1 приблизительно 7,8, которая была антагонистической в отношении всех трех тестируемых штаммов (табл. 7). Наивысшая активность ассоциировалась с фракциями пика 1 + пика 2 энтероцина ЬУР21 в спот-тесте, в то время как с использованием 8Э8-РЛСЕ и ΣΕΡ была показана самая низкая активность.

Таблица 6

Противомикробная активность САР лактоцинов, определенная в спот-тесте, 8Э8-РЛСЕ и ШЕ

САР	Тестируемый штамм	Ингибирующая активность в спот-тесте (АИ/мл)	Ингибирующая активность по 808-РАСЕ (кДа)	Ингибирующая активность по ΙΕΡ (ρΐ)
Лактоцин ОК-7	С. ίβ/ίΐηί АТСС 11168	3200	Μνν = 6,0	9,0
	5. βηίβηΐκΐίς 204	800	Μνν = 6,0	9,0
	Е, соН 0157:Н7 904	3200	Μνν = 6,0	9,0
Лактоцин 1Д/УР320	С. ίββΐηί АТСС 11168	1600	Μνν = 6,2	8,5
	5. βηίβήάίε 204	800	Μνν = 6,2	8,5
	Е. соП 0157:Н7 904	800	Μνν = 6,2	8,5

Таблица 7

Характеристика активных фракций энтероцинов ЬУР21 и ЬУР26 на основании результатов 8Э8-РЛСЕ и изоэлектрофокусирования

Энтероцины	Тестируемые штаммы	Активность в споттесте (Аи/мл)	Молекулярные массы согласно δϋδ-ΡΑΘΕ (кДа)	Изоэлектрические точки бактериоцинов
Энтероцин Ι_\Λ/Ρ21, фракция пика I	С. уе/'ип/ АТСС 11168	-	3,0	5,6
	3. еп(епИсИз 204	-	3,0	5,6
	е. сои 0157:Н7 904	-	3,0	5,6

- 16 013330

Энтероцин 1_УУР21, фракция пика II	С. ιβίυηί АТСС 11168	400	6,1	8,4
	8. еп(еп(кНз 204	400	6.1	8,4
	Е. со// 0157Ή7 904	400	6,1	8,4
Энтероцин 1АА/Р21, фракция пика I + пика II	С. АТСС 11168	12800	3,0;6,1	5,6; 8,4
	8. еп(еп(кНз 204	1600	3.0; 6,1	5,6; 8,4
	Е. соН 0157:Н7 904	3200	3,0; 6,1	5,6; 8,4
Энтероцин 1_УУР26	С. /е/ип/ АТСС 11168	6400	3,0	7,8
	3. еп1епНсНз 204	3200	3,0	7,8
	е. сои 01571Н7 904	1600	3,0	7,8

Пример 7.

Бактериоцины, полученные в виде неочищенного противомикробного препарата, как описано выше в примере 2, очищали гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией. Неочищенные противомикробные препараты (САР) лактоцина ОВ7 и лактоцина БЛУР320 инъецировали на колонку 8ирегоке 12НВ 16/50 (РНагшааа; 1,6 х 50 см), уравновешенную приблизительно 75 мл натрий-фосфатного буфера, рН приблизительно 5,9. Препараты элюировали тем же буфером при скорости потока приблизительно 8 мл/мин. Активности элюированных фракций тестировали в отношении Сатру1оЬас1ег )е)иш АТСС 11168. Концентрацию белков измеряли, используя способ, описанный Ьо^гу е! а1. (1оигпа1 оГ Вю1од1са1 СНет1к1гу, Уо1ите 193, 1951). Фракции, ингибирующие рост С. ,|е)ипг дополнительно очищали катионообменной хроматографией, используя колонку с СМ-8ерНагоке (РНагтааа; 2,5 х 20 см). Колонку с СМ-8ерНагоке уравновешивали буфером С (50 мМ фосфатно-цитратный буфер, рН приблизительно 5,0) при скорости потока приблизительно 8 мл/мин. Бактериоцины элюировали приблизительно 8 мМ буфером С в присутствии №1й в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8%, при скорости потока приблизительно 8 мл/мин. Определяли противомикробную активность и концентрацию белка для каждой фракции. Очищенные фракции обозначали как лактоцины ОВ7 и БЛУР320.

Очищенные ОВ7 и Ь\УР320 оценивали, используя 8Э8-РАСЕ и изоэлектрофокусирование, как описано выше в примере 4. Наиболее активная фракция (ОВ7) представляла собой пептид с молекулярной массой приблизительно 6 кДа и р1 приблизительно 9,0 (фиг. 1 и табл. 6), а активная фракция БАУР320 представляла собой пептид с молекулярной массой приблизительно 6 кДа, р1 приблизительно 8,5 (фиг. 3 и табл. 6).

Энтерококковые бактериоцины из САР очищали, используя двухстадийную методику: ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография. Активные фракции САР, полученные в примере 4, инъецировали на колонку с 8Р-8ерНагоке Рак! Р1о\\' (У равен 30 мл), уравновешенную буфером С (20 мМ фосфат натрия; рН приблизительно 7,8) при скорости потока приблизительно 18 мл/мин. Колонку промывали четырьмя объемами буфера С, и фракции элюировали приблизительно 100 мл 0,5 М №101 в буфере С. Активность фракций определяли, используя спот-тест, как описано выше в примере 5, используя С. _)е.)иш АТСС 11168. Фракции, способные ингибировать рост С. ,|е)ипг инъецировали на колонку с Р11епу1-8ер11агоке СБ-4В, уравновешенную буфером Ό (0,06 М боратный буфер, рН приблизительно 8,5), содержащим 0,2 М №1С1. Колонку промывали четырьмя объемами буфера Ό. Фракции элюировали приблизительно 4 мл буфера Ό, содержащего приблизительно 70% (об./об.) этанола. Антагонизм каждой фракции измеряли, используя спот-тест. Очищенные препараты получали методами катионообменной рехроматографии на 8Р-8ерйагоке, а также на РНепу1-8ерНагоке СБ-4В. Концентрацию белка определяли, используя способ Лоури (выше). Выделенные фракции обозначали как энтероцины Б\УР21 и Б\УР26.

- 17 013330

Выделенные фракции БАУР21 и БАУР2б оценивали с использованием БББ-РАСЕ и изоэлектрофокусирования, как описано выше в примере 4. Наиболее активная фракция 2 для БАУР21 представляла собой пептид с молекулярной массой приблизительно б кДа и р1 приблизительно 8,4 (фиг. 2 и табл. 7), а неактивная фракция 1 для БАУР21 представляла собой пептид с молекулярной массой приблизительно 3 кДа, р1 приблизительно 5,б (фиг. 2. и табл. 7). Наиболее активная фракция для Ь^Р2б представляла собой пептид с молекулярной массой приблизительно 3 кДа и р1 приблизительно 7,8 (фиг. 3 и табл. 7).

Аминокислотные последовательности очищенных бактериоцинов определяли с помощью расщепления по Эдману, используя автоматический секвенатор 491 сЬС (Аррйеб Вюкуйетк, США). Бактериоцины гидролизовали приблизительно в б М НС1 под вакуумом при приблизительно 110°С в течение приблизительно 72 ч. Молекулярные массы определяли масс-спектрометрически, используя Уоуадег-БЕВР (Регкш-Е1тег, США). Использовали систему МАЬБ1-ТОБ, времяпролетную систему с ионизацией посредством лазерной десорбции при содействии матрицы, вместе с матрицей, 2-циано-гидроксикоричной кислотой. Аминокислотные последовательности четырех бактериоцинов представляют собой

ОН7:

ΚΤΥΥΘΤΝθνΗΟΤΚΝ31Λ/ν6ΚνΚΕΚΝΜΚΥΟΟΝΤΤΥΜΘΚΙ.ΟΟΙΙ±6ννΑΤΟΆΡΟΚΤΡΗ

5ЕО ΌΝΟΙ;

Ь\Л/Р320:

ΑΚΚΥΟΝ(3ν005ΚννΐΝΝΘ(3Ε0νΐΟΝΝΑΑΑΝΙΤΝνν6ΕΑΡΑ5ΑΤΚδΘΟ5ΑΤΤΟΙΙΝΑΜΑ

5ЕО Ю N0 2;

1ЭЛ/Р21 (ФРАКЦИЯ 1): ΡΝΙΚΘΟΥΝΡΘΚδνΗΗννΟΑΙΘΝΜΑΟΙΙΚΙ.

3ΕΩ ΙϋΝΟ3;

ШР21 (ФРАКЦИЯ 2): νΡΗΑΥδΑΡΘνκΝΝΥΚΟΑΘνΡΟΑΙΟΌΑνΒΘΙΡΙΗΘΥδίαννΜΟνκννΘννΕΡΚ 5Ε0 ΙΟ N0 4;

1_УУР26: ΤΚΤΤΚΘΝΟνΝΚΕΟννΕΤΥΚΑΟΤνΟΙίννΑδννδΚ δΕΟ Ю N0 5.

Расчетная молекулярная масса пептида ОВ7 составляла приблизительно б000 Да. В анализе с использованием МАББ1-ТОБ обнаружено следующее значение молекулярной массы ОВ7: 5123 Да.

Расчетная молекулярная масса пептида БАУР320 составила приблизительно б000 Да. В анализе с использованием МАББ1-ТОР обнаружено следующее значение молекулярной массы ОВ7: 5858 Да.

Расчетная молекулярная масса пептида БАУР21 (фракция 1) составила приблизительно 3000 Да. В анализе с использованием МАББ1-ТОР обнаружено следующее значение молекулярной массы БАУР21 (фракция 1): 278б Да.

Расчетная молекулярная масса пептида БАУР21 (фракция 2) составила приблизительно б000 Да. В анализе с использованием МАББ1-ТОР обнаружено следующее значение молекулярной массы БАУР21 (фракция 2): 498б Да.

Расчетная молекулярная масса пептида БАУР2б составила приблизительно 3000 Да. В анализе с использованием МАЬБТ-ТОР обнаружено следующее значение молекулярной массы БАУР2б: 3231 Да.

Таблица 8

Биохимическая очистка лактоцина ОВ7

Образец	Объем (мл)	Белок (мг/мл)	Удельная активность (Аи/мг)	Чистота (%)
Культуральный супернатант	150	1,2	13034	0
САР (осаждение ((ΝΗ₄)₂3θ4)	9,8	0,9	19174	9,09
Гель-фильтрация на бирегозе 12	6	0,4	58312	82,3
Катионообменная хроматография на СМ-ЗерЬагоае	1,3	0,14	532317	93,8

- 18 013330

Таблица 9

Биохимическая очистка энтероцина Ь^Р21

Образец	Объем (мл)	Белок (мг/мл)	Удельная активность (Аи/мг)	Чистота (%)
Культуральный супернатант	1500	2,3	17932	0
САР (осаждение ((ΝΗ₄)₂8Ο₄)	4,5	1,2	24142	10,2
8Р-8ирегозе Раз! Р1о«	2,1	0,9	79243	80,2
Рбепу1-8ерЬагозе С1.-4В	1,3	0,4	238732	93,3

Пример 8.

Установлено влияние ферментов, температуры и рН на активность бактериоцинов. В пробирки, содержащие приблизительно 20 мл бактериоцинов, переносили приблизительно 10 мкл одного из следующих ферментов: бета-химотрипсина - приблизительно 100 мг/мл, протеиназы К - приблизительно 200 мг/мл, папаина - приблизительно 60 мг/мл, лизоцима - приблизительно 75 мг/мл и липазы - приблизительно 100 мг/мл (все от 81дта-Л1бг1сй Согр., 8ΐ. Ьошз, МО). Приблизительно после трехчасового периода инкубации при приблизительно 37°С смесь бактериоцина и фермента анализировали на противомикробную активность, используя спот-тест, как в примере 5. Необработанные бактериоцины служили в качестве положительных контролей.

Для исследования термостабильности бактериоцинов образец приблизительно 2 мг/мл кипятили в водяной бане в течение приблизительно 15 мин, охлаждали и оценивали в отношении их противомикробной активности, используя спот-тест. Для оценки влияния рН использовали приблизительно 2 мг/мл бактериоцина. Для тестирования рН от приблизительно 3 до приблизительно 10 к образцам добавляли приблизительно по 2 мл стерильных растворов, приблизительно 10 мМ ЫаОН или приблизительно 10 мМ НС1. Образцы инкубировали при приблизительно 37°С в течение приблизительно 2 и 24 ч, а при приблизительно 90°С в течение приблизительно 20 мин. Образцы доводили до рН приблизительно 7,2 путем добавления приблизительно 4 мМ стерильного фосфатного буфера и анализировали на их противомикробную активность, используя спот-тест, как описано выше в примере 5.

Бактериоцины теряли свою противомикробную активность после обработки бета-химотрипсином, протеиназой К и папаином, но сохраняли ее при обработке лизоцимом, липазой или нагревании до приблизительно 90°С (табл. 10 и 11). Они были стабильны при разных значениях рН в диапазоне от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, но становились неактивными при рН приблизительно 10 (табл. 12 и 13). Энтероцины теряли свою активность при рН приблизительно 9,1 и приблизительно 10.

Таблица 10

Влияние ферментов и температуры на противомикробную активность ОВ7

(+) наличие активности (-) потеря активности после обработки

- 19 013330

Таблица 11

Влияние ферментов и температуры на противомикробную

(+) наличие активности после обработки (-) потеря активности после обработки

Таблица 12

Влияние рН на активность лактоцина 0Κ7

Таблица 13

Влияние рН на активность энтероцина БЛУР21 и Б\УР26

рН	Активность* через 2 часа при 37°С
3,0	-
5,0	+
6,2	+
7,0	+
8,4	+
9,1	-
10,0	-

Активность* через 24 часа при 37°С	Активность* через 20 минут при 90°С
-	-
+	+
+	+
+	+
+	+
-	-
-	-

Пример 9.

* активность в отношении С. )е)ип1 АТСС 11168 в спот-тесте (+) наличие активности после обработки (-) потеря активности после обработки

Бактериоцин 0Я7 очищали. как описано в примере 5. Очищенный бактериоцин 0Я7 добавляли в концентрации приблизительно 250 мг/кг имеющегося в продаже корма для домашней птицы в поливинилпирролидоне. как это известно в данной области техники. Приблизительно 100 г терапевтической композиции. приготовленной с использованием молотой кукурузной крупы. содержат приблизительно 0.5 г бактериоцина 0Я7. приблизительно 1.25 г поливинилпирролидона и приблизительно 8.6% воды. Приблизительно 100 г этой композиции добавляют к приблизительно 2 кг корма для домашней птицы. Цыплят в возрасте 1. 6 и 18 суток размещали группами в отдельных изолированных секциях. оборудованных кормушками и подачей воды и фильтрованного воздуха. Корм и воду давали без ограничения.

Для цыплят в возрасте 1 сутки (табл. 14): цыплята Группы один служили в качестве контрольной группы. которой предоставляли свободный доступ к пище без добавленного бактериоцина. Этим цыплятам в первые сутки жизни вводили провокационную пробу штаммов Ь4 и В1 С. )сщш. как описано выше в примере 1. Штаммы вводили с применением перорального желудочного зонда в концентрации приблизительно 2 х 10⁶ в объеме 0.2 мл. Пять цыплят умерщвляли приблизительно через 7 суток после провокационной пробы. а остальные пять умерщвляли приблизительно через 10 суток после провокационной

- 20 013330 пробы. Цыплятам Группы два в первый день жизни вводили провокационную пробу штаммов Ь4 и В1 С. _)е_)иш, как описано выше для Группы один. Этим цыплятам предоставляли свободный доступ к пище, содержащей приблизительно 250 мг бактериоцина ОЯ7 на килограмм корма, в течение трех суток, начиная с 4-х суток жизни. Цыплят Группы два умерщвляли приблизительно через семь суток после провокационной пробы С. _)е_)иш. Цыплятам Группы три вводили провокационную пробу и их кормили так же, как цыплят Группы два, и их умерщвляли через 10 суток после провокационной пробы. Результаты представлены в табл. 14.

Таблица 14

Терапевтические эффекты бактериоцина ОЯ-7 в отношение экспериментально индуцированной инфекции С. )е)иш у бройлерных цыплят

Группа	№ птицы	Время умерщвления после введения провокационной	Концентрация С. /е/υηί (грамм/грамм содержимого слепой	Коэффициент защиты в %
		пробы в сутках	кишки)
Один, контроль	1	7	6,63
	2	7	6,18
	3	7	6,15
	4	7	5,87
	5	7	6,21
	6	10	9,00
	7	10	8,68
	3	10	8,95
	9	10	9,34
	10	10	8,99
Два	1	7 .	0,00	100
	2	7	0,00	100
	3	7	6,95	0,89
	4	7	0	100
	5	7	4,23	1,47

	7	7	0	100
	8	7	0	100
	9	7	5,63	1,16
	10	7	0	100

Три	1	10	0	100
	2	10	0	100
	3	10	0	100
	4	10	0	100
	5	10	0	100
	6	10	0	100
	7	10	6,11	1,47
	8	10	0	100
	9 \| 10	0	100

| 10 0 100 * Лечебный корм, приготовленный на основе имеющегося в продаже корма, предназначенного для цыплят в возрасте 1-10 суток.

Что касается цыплят в возрасте 6 суток, то контрольным группам предоставляли свободный доступ к пище без добавленного бактериоцина. Этим цыплятам на 2-е сутки эксперимента вводили провокационную пробу штаммов Ь4 и В1 в количестве приблизительно 10⁶ КОЕ (колониеобразующие единицы) в объеме приблизительно 0,2 мл С. _)е_)иш, как описано в примере 1. С. _)е_)иш вводили с применением пероральных желудочных зондов. Цыплят умерщвляли через 9, 11 и 14 суток после провокационной пробы. Цыплятам экспериментальной группы, поделенной на две части, предоставляли свободный доступ к пище с бактериоцином ОВ7, инкапсулированным в поливинилпирролидон, начиная с 6 суток жизни. Этим

- 21 013330 цыплятам на 2-е сутки эксперимента вводили провокационные пробы, как описано выше для контрольных цыплят. Цыплят умерщвляли на 9, 11 и 14 сутки жизни. Результаты показаны ниже в табл. 15.

Таблица 15

Лечение экспериментальной С. _)е_)иш-ассоциированной инфекции у цыплят в возрасте 6 суток с использованием бактериоцина ΘΚ7, добавленного в корм

Группа	Кол-во цыплят в группе	Время введения провокационной пробы С. ]е]ип1 и доза в КОЕ	Продолжительность кормления (сутки)	Возраст умерщвленных цыплят (сутки)	Концентрация С. ίβΐυηί на грамм вещества слепой кишки
Контроль	4	2-е сутки 10® КОЕ		4	’ 8X10®
	5	2-е сутки 10^е КОЕ		9	1,8 X 10“
	5	2-е сутки 10® КОЕ		11	1,02X10®
	δ '	2-е сутки 10^е КОЕ		14	8,2 X 10“
Бактериоцин ОК7 в корме	10	2-е сутки 10® КОЕ	3	9	3 цыпленка = 0 1 цыпленок = 1Х10¹ 4 цыпленка = 1x10² 2 цыпленка = 1х10³
	9	2-е сутки 10® КОЕ	5	11	6 цыплят = 0 1 цыпленок = 1x10¹ 2 цыпленка = 1x10“
	9	2-е сутки 10® КОЕ	8	14	4 цыпленка = 0 1 цыпленок= 1x10^э 1 цыпленок = 1x10⁴ 1 цыпленок = 1x10® 1 цыпленок = 1x10⁷ 1 цыпленок = 1x10®

* чистая доза, введенная цыплятам в течение 3-суточного периода, составляет приблизительно 26,4 мг; в течение 5-суточного периода - приблизительно 50,6 мг; в течение 8-суточного - приблизительно 80,5 мг

Что касается цыплят в возрасте 18 суток, то контрольным цыплятам предоставляли свободный доступ к пище без добавленного бактериоцина.

Этим цыплятам на 15 сутки эксперимента путем перорального кормления через желудочный зонд вводили провокационную пробу штаммов Ь4 и В1 С. _)е_)иш величиной 10⁷ КОЕ в объеме приблизительно 0,2 мл. Цыплят умерщвляли на 24 сутки эксперимента. Цыплятам, получавшим обычную пищу с включением бактериоцина ΘΚ7, как описано выше, предоставляли свободный доступ к корму, содержащему приблизительно 0,25 г бактериоцина ΘΚ7 на килограмм корма, в течение приблизительно пяти суток,

- 22 013330 начиная приблизительно с 19-х суток жизни. Чистая терапевтическая доза составляет приблизительно 109 мг на цыпленка. Цыплят умерщвляли приблизительно на 24 сутки жизни. Результаты показаны ниже в табл. 16.

Таблица 16

Лечение экспериментальной С. _)е_)иш-ассоциированной инфекции у цыплят в возрасте 18 суток бактериоцином ΘΚ7, добавленным в корм

Группа	Кол-во цыплят	Возраст и доза провокационной пробы С. уе/ит (КОЕ)	Возраст умерщвленных цыплят (сутки)	Концентрация (КОЕ) С. ]е^ип! на грамм вещества слепой кишки
Контроль	5	15-е сутки Ю⁷КОЕ	24	7,84 х 10⁹
Лечение бактериоцином ОК7	9	15-е сутки Ю⁷КОЕ	24	3 цыпленка = 0 6 цыплят = 2,4x10²

Цыплятам на 1-е сутки жизни вводили провокационную пробу, и контрольным цыплятам предоставляли свободный доступ к пище и воде без добавленного бактериоцина. Цыплятам вводили провокационную пробу величиной приблизительно 10⁶ КОЕ смеси штаммов Ь4 и В1 С. _)е_)иш с помощью перорального желудочного зонда на 1-е сутки жизни. Контрольных цыплят умерщвляли на 17-е сутки жизни. В экспериментальной группе Ι цыплятам в возрасте 1 сутки вводили провокационную пробу как контрольным цыплятам, предоставляли свободный доступ к корму, содержащему приблизительно 0,250 г бактериоцина ΘΚ7 на килограмм корма, начиная с 14-х суток жизни, и умерщвляли приблизительно на 17-е сутки жизни; а цыплятам группы ΙΙ вводили провокационную пробу как контрольным цыплятам на 1-е сутки жизни и предоставляли свободный доступ к пище, содержащей приблизительно 0,500 г бактериоцина ΘΚ7 на килограмм корма на 14-е сутки жизни; и умерщвляли на 17-е сутки жизни. Результаты показаны ниже в табл. 17.

Таблица 17

Лечение экспериментальной С. _)е_)иш-ассоциированной инфекции у цыплят бактериоцином ΘΚ7, добавленным в корм

Группа	Кол-во цыплят	Возраст и доза провокационной пробы С. )βίυηί в КОЕ	Концентрация С.]е)ип( на грамм вещества слепой кишки на 17-е сутки жизни
Контроль	10	1 сутки 10® КОЕ	2 цыпленка = 4,0x10® 1 цыпленок = 1,9x10⁷ 7 цыплят = 0,3x10^е
Лечили кормом, содержащим 0,250 г /1 килограмм корма	16	1 сутки 10® КОЕ	14 цыплят = 0 1 цыпленок = 1,3x10³ 1 цыпленок = 1,2x10³
Лечили кормом, содержащим 0,500 г /1 килограмм корма	16	1 сутки 10® КОЕ	13 цыплят = 0 1 цыпленок = 3,5x10³ 1 цыпленок = 0,4x10³

Приведенное выше подробное описание предназначено для иллюстрации. Подробности приведены исключительно для этой задачи, и специалисты в данной области техники могут создать варианты без отклонения от сущности и объема изобретения.

Claims

1. Выделенный бактериоцин, продуцируемый молочно-кислым бактериальным штаммом, имеющим отличительные признаки штамма, выбранного из группы, состоящей из Ьас!оЬасШик кайуапик ΝΕΕ6 В-30514, Ьас!оЬасШик ас1борй11ик ΝΕΕ6 В-30510, Еп!егососсик бигапк ΝΕΕ6 В-30511 и Еп!егососсик Гаесайк ΝΚΚΕ В-30645.

2. Бактериоцин по п.1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0 1.

- 23 013330

3. Бактериоцин по п.1. имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ NО 2.

4. Бактериоцин по п.1. имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ NО 3.

5. Бактериоцин по п.1. имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ NО 4.

6. Выделенный Ьас1оЬасШик крр.. имеющий отличительные признаки штамма Ьас1оЬасШик. выбранного из группы. состоящей из БасЮЬасШик какуапик ΝΒΚΣ В-30514 и Ьас!оЬасШик ааборЫ1ик ΝΚΚΣ В-30510.

7. Выделенный Ьас1оЬасШик ас1борЫ1ик. имеющий отличительные признаки ΝΚΗΣ В-30510.

8. Выделенный Ьас1оЬасШик кайуапик. имеющий отличительные признаки ΝΚΚΣ В-30514.

9. Выделенный штамм Ейсгососсик. имеющий отличительные признаки штамма Еп1егососси8. выбранного из группы. состоящей из Еп1егососси8 Гаесабк ΝΚΚΣ В-30645 и Ейсгососсик бигапк ΝΚΚΣ В-30511.

10. Выделенный Еп1егососси8 Гаесабк. имеющий отличительные признаки ΝΕΚΣ В-30645.

11. Выделенный Еп1егососси8 бигапк. имеющий отличительные признаки ΝΚΚΣ В-30511.

12. Терапевтическая композиция. содержащая:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый молочно-кислым бактериальным штаммом. имеющим отличительные признаки штамма. выбранного из группы. состоящей из Ьас1оЬасШик каПуапик ΝΚΚΣ В-30514. Ьас1оЬасШик ас1борЫ1ик ΝΚΚΣ В-30510. Ейсгососсик Гаесабк ΝΚΚΣ В-30645. Еп1егососси8 бигапк ΝΚΗΣ В-30511 и их смесей. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (б) подходящий терапевтический носитель.

13. Терапевтическая композиция. содержащая:

(а) выделенный бактериоцин. продуцируемый штаммом Ьас!оЬасШик каНуапик. имеющим отличительные признаки ΝΚΚΕ В-30514. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (б) подходящий терапевтический носитель.

14. Терапевтическая композиция по п.12. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ ЫО 1. 8ЕО ΙΌ ЫО 2. 8ЕО ΙΌ ЫО 3. 8ЕО ΙΌ МО 4 или их смесей.

15. Терапевтическая композиция по п.14. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ НО 1.

16. Терапевтическая композиция по п.14. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ КО 2.

17. Терапевтическая композиция по п.14. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ПО 3.

18. Терапевтическая композиция по п.14. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ NО 4.

19. Терапевтическая композиция. содержащая:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый Ьас1оЬасШик ас1борЫ1ик. имеющим отличительные признаки ΝΚΗΣ В-30510. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (б) терапевтически приемлемый носитель.

20. Терапевтическая композиция. содержащая:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый Еп1егососси8 бигапк. имеющим отличительные признаки ΝΚΚΕ В-30511. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (б) терапевтически приемлемый носитель.

21. Терапевтическая композиция. содержащая:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый Еи1егососси8 ГаесаНк. имеющий отличительные признаки ΝΒΚΕ В-30645. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (б) терапевтически приемлемый носитель.

22. Терапевтический корм для животных. содержащий:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый молочно-кислым бактериальным штаммом. имеющим отличительные признаки штамма. выбранного из группы. состоящей из Ьас1оЬасШик каПуапик ΝΚΚΣ В-30514. БасЮЬасШик ас1борЫ1ик ΝΚΚΣ В-30510. ЕЩегососсик бигапк ΝΚΗΣ В-30511. Ейегососси8 ГаесаНк ΝΚΚΣ В-30645 и их смесей. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью;

(б) терапевтический носитель и (в) корм для животных.

23. Терапевтический корм по п.22. где по меньшей мере один указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8ЕО ΙΌ NО 1. 8ЕО ΙΌ NО 2. 8ЕО ΙΌ NО 3. 8ЕО ΙΌ NО 4 и их смесей.

- 24 013330

24. Терапевтический корм для животных. содержащий:

(а) бактериоцин. продуцируемый штаммом Ьас!оЬасШиз. имеющим отличительные признаки штамма Ьас!оЬасШи8. выбранного из группы. состоящей из Ьас!оЬасШи8 астборЕПиз ИЯЯЬ В-30510. ЬасЮЬасП1из заЕуапиз ИЯЯЬ В-30514 и их смесей; в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью;

25. Терапевтический корм по п.24. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0 1 и 8Е0 ГО N0 2.

26. Терапевтический корм для животных. содержащий:

(а) по меньшей мере один выделенный бактериоцин. продуцируемый штаммом Еп!егососсиз. имеющим отличительные признаки штамма Еп!егососсиз. выбранного из группы. состоящей из Еп!егососсиз бигапз ИЯЯЬ В-30511. Ейегососсиз ГаесаЕз ИЯЯЬ В-30645 и их смесей; в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью;

27. Терапевтический корм по п.26. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ГО N0 3 и 8Е0 ГО N0 4.

28. Способ. по меньшей мере. снижения уровней колонизации животного по меньшей мере одной бактерией-мишенью. включающий введение животному терапевтической композиции. содержащей по меньшей мере один бактериоцин. продуцируемый молочно-кислым бактериальным штаммом. имеющим отличительные признаки штамма. выбранного из группы. состоящей из Ьас!оЬасШиз заЕуагшз НЯЯЬ В-30514. Ьас!оЬасШи8 ас1борЕЕиз НЯЯЬ В-30510. Еп!егососсиз бигапз НЯЯЬ В-30511. Еп!егососсиз ГаесаЕз НЯЯЬ В-30645 и их смесей. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и терапевтический носитель.

29. Способ по п.28. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ГО N0 1. 8Е0 ГО N0 2. 8Е0 ГО N0 3. 8Е0 ГО N0 4 и их смесей.

30. Способ по п.29. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0 1.

31. Способ по п.29. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0 2.

32. Способ по п.29. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0 3.

33. Способ по п.29. где указанный бактериоцин имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0 4.

34. Способ. по меньшей мере. снижения уровней колонизации животного по меньшей мере одной бактерией-мишенью. включающий введение животному терапевтической композиции. содержащей:

(а) по меньшей мере один бактериоцин. продуцируемый молочно-кислым бактериальным штаммом. имеющим отличительные признаки штамма. выбранного из группы. состоящей из Ьас!оЬасШиз заЕуагшз НЯЯЬ В-30514. Ьас!оЬасШиз ас1борЫ1из НЯНЬ В-30510. Еп!егососсиз бигапз НЯЯЬ В-30511. Еп!егососсиз ГаесаЕз ХЯЯЬ В-30645 и их смесей. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью;

(б) по меньшей мере один молочно-кислый бактериальный штамм. имеющий отличительные признаки штамма. выбранного из группы. состоящей из Ьас!оЬасШиз заЕуагшз ХЯЯЬ В-30514. Ьас!оЬасШиз ааборЕПиз ХЯЯЬ В-30510. Еп!егососсиз бигапз МЯКЕ В-30511. Еп!егососсиз ГаесаЕз ХЯЯЬ В-30645 и их смесей. в количествах. эффективных. по меньшей мере. для снижения уровней колонизации по меньшей мере одной бактерией-мишенью; и (в) терапевтический носитель.