EA011695B1

EA011695B1 - Штамм-продуцент растворимой формы рекомбинантного хепсина человека (hpntm)

Info

Publication number: EA011695B1
Application number: EA200801823A
Authority: EA
Inventors: Евгений Сергеевич СЕВЕРИН; Сергей Евгеньевич СЕВЕРИН; Екатерина Михайловна КУЗНЕЦОВА; Мария Владимировна САВВАТЕЕВА; Михаил Петрович КИРПИЧНИКОВ
Original assignee: Ано "Институт Молекулярной Диагностики"
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2009-04-28
Also published as: WO2009154514A2; EA200801823A1; WO2009154514A3

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства хепсина в растворимой форме, который может быть использован в здравоохранении для диагностики рака предстательной железы, а также при лечении онкологических больных, в том числе для получения антител, обладающих способностью связывать в крови хепсин человека.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства рекомбинантной сериновой протеазы хепсин для применения в здравоохранении, в частности для диагностирования и лечения рака предстательной железы.

В настоящее время рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин, частота которого напрямую связана с возрастом. Так, начиная с 45 лет заболеваемость РПЖ растет в геометрической прогрессии и у мужчин в возрасте 70 лет и выше встречается более чем у 60%.

В связи с этим стоит задача выбора из общей массы потенциальных маркеров РПЖ тех, которые обладают наиболее высокой прогностической ценностью и специфичностью и могут быть использованы в клинической практике без усложнения методики использования при диагностике и существенного ее удорожания.

Из уровня техники известно, что таким маркером может служить хепсин (1). Хепсин представляет собой сериновую протеазу, которая не экспрессируется клетками здоровой предстательной железы, но присутствует в значительном количестве на поверхности клеток РПЖ. Это обстоятельство позволяет с высокой степенью достоверности использовать хепсин в диагностике и лечении заболевания (2). Другая важная особенность хепсина связана с его ферментативной активностью, обусловливающей его роль в процессе онкогенеза опухоли предстательной железы. В экспериментальных данных было показано, что при использовании моноклональных антител для связывания хепсина на поверхности клеток значительно уменьшалась способность опухоли к метастазированию (3). Следовательно, тест, основанный на определении именно этой его функции (ферментативной), наиболее полно характеризует стадию заболевания и развитие опухолевого процесса.

Для решения поставленной задачи использования хепсина для диагностики РПЖ и стадии этого заболевания необходимо создание штамма-продуцента растворимого хепсина, поскольку из него предусмотрено последующее получение белка в активной форме.

Из уровня техники не известен штамм-продуцент хепсина, но на сегодняшний день в мире получена полноразмерная форма неактивного рекомбинантного хепсина с глутатион-с-трансферазой (АЬпоуа, кат. № Н00003249-Р01). Данный продукт используется в качестве концентрационного стандарта при постановке методик ИФА и вестерн-блот. Однако он не является активной формой белка и не пригоден для осуществления ферментативных реакций, специфичных для полноценного хепсина, и, соответственно, не применим для диагностики РПЖ.

Штамм-продуцент Е.сой, несущий плазмидную ДНК ρΗΡΝΤΜ^-Α со встроенным геном, кодирующим хепсин человека, получен методом кальциевой трансформации клеток ВБ21(ИЕ3)СобопР1и5В1Б. Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под № В-10098.

Условия хранения.

Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре -70°С в среде следующего состава:

1% бактотриптона,

0,5% дрожжевого экстракта,

0,5% №С1, ρΗ 7,0,

15% глицерина,

7% ДМСО не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Клетки представляют собой короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор.

На мясопептонном бульоне дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На мясопептонном агаре колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины с темным металлическим блеском.

Физиолого-биохимические свойства.

Факультативный аэроб. Температурный диапазон роста - 18-38°С. Оптимальная температура роста 37°С. Растет при значениях рН среды - 5,0-8,0. Оптимум рН роста - 6,5-7,5. Отрицательная реакция Фогис-Параскау; положительная реакия на образование индола; отрицательная реакция на образование сероводорода; отрицательная реакция на цитрат; отрицательная реакция на образование малоната; отрицательная реакция на образование мочевины; положительная реакция на лизиндекарбоксилазу; отрицательная реакция на орнитин; положительная реакция на газообразование; отрицательная реакция на синтез лактозы; положительная реакция на расщепление маннита.

Вид Е.сой, к которому отнесен штамм ВЕ21(ИЕ3)СобопР1и8К1Е (81га1адеп, и.8. патент №. 6706525), не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения,

- 1 011695 отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения», отсутствует в списках патогенных бактерий по Положению Минздрава и в списках патогенных бактерий в Ой1с1а1 1оигиа1 οί 1Пс Еигореап Сотшишйек N0 217/3237, 24.08.92.

Характеристика штамма:

семейство Еп1егоЬас1епасеае;

род ЕксйепсЫа;

вид ЕксйепсЫа сой;

происхождение РгоЮдепе;

источник выделения - желудочно-кишечный тракт крупного рогатого скота;

генотип: Е.соЕ В Р^- отрТ йкй8(гв^- шв^-) бсш⁺ Те1^г да1 Х(ОЕЗ) епйА Н1е [агдИ ПеУ 1еи\У Саш¹]; Биотехнологическая характеристика.

Штамм-продуцент содержит плазмидную ДНК, полученную на основе вектора рЕТ28а (карта плазмиды, нуклеотидная и аминокислотная последовательности представлены на чертеже фигуры).

Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены.

Включенные в состав гены:

внеклеточная часть хепсина (5128 Ьр-6246 Ьр), сайт разрезания тромбином (5464 Ьр-5481 Ьр),

Н1к-1ад (5089 Ьр-5106 Ьр), сайт разрезания фактором X (5107 Ьр-5127 Ьр).

Генетическая карта клонированного фрагмента (размер - 1175 Ьр)

ΝοοΙ

5051 АТССССАССС ССССТАСССА ТСАТСАТСАТ

ТАССССТСОС ССССАТСССТ астастаста

5101 САТСАСАССС СТАВСАТТЗА ОВВТСОТССС СТСТАСССАС ТССАСЗТСАЗ

СТАСТ6ТССС затсстааст сссассаосс сасатссстс асстссастс

5151 СТСТ0СВ6АС ОСТС6ОСТСА ТССТСТТТСА СААЗАССЗАА ЗВЗАС6ТЗЗС

САСАССССТС ССАССССАСТ АССАОАААСТ ЗТТСТСССТТ СССТ6САССС

5201 СССТОСТСТС СТССТССССС ТССААСЗССА СОСТАССССС АСТСАССТ6С СССАССАСАС ОАСЗАОСОСС АЗЗТТЗСЗЗТ СССАТСЗЗСС ТЗАЗТСЗАСС

5251 САССАСАТСС ССТТССТСАС ЗССАСТСАСС САСТСССАСС ТССАССТССС

СТССТСТАСС СЗААЗЗАЗТС ССЗТСАСТЗЗ 6ТЗАСЗСТСЗ АССТОСАСВС

5301 ААСВ6СВССС СССААТС6СА ССТССС6СТТ СТТСТЗТ6ТС САССАССОСА

ТТСССЗСССС СОЗТТАССВТ ССАОССССАА ВААСАСАСАС СТССТССССТ

5351 СССТСССССА САСССАСАСС СТССТССАСС ТСАТСТСССТ СТСТСАТТСС ссбАСвоеет зтзезтстсс сассасстсс астаоассса сасастаасс

5401 СССАВАС6СС 6ТТТСТТС6С ССССАТСТСС СААЗАСТВТЗ СССССАССАА

ЗВЗТСТССВЗ САААСААССЗ ССССТАСАСС СТТСТСАСАС СССССТССТТ

5451 ССТЗСССЗТЗ бАССТЗЗТЗС СССЗСЕЗСАС СбТВСЗАЗСС

ССЗЗАСАССА

СЗАСОСВСАС СТСЗАССАСС ССССССССТС ЗСАСССТСС6 ССССТЗТЗЗТ

5501 ССТТООСССС СТСССССТСС СААСТСАССС ТТСОСТАТСА ТССАССАСАС

ССААСССССС САСССССАСС СТТСАСТССС ААСССАТАСТ АССТСОТЗТб

ВатН1

5551 СТСТСТСС36 САТСССТССТ СТССЗбЗЗАС ТСВ6Т6СТСА САСССССССА

САСАСАСССС СТА60САССА САОЗССССТС АСССАСЗАСТ СТССЗСЗЗСТ

5601 ТТОСТТСССС САССССААСС СССТССТСТС СС0АТ63ССА СТСТТТСССС

ААССААСССС СТССССТТСС СССАССАСАС 6ССТАССЗСТ САСАААСС6С

Рай

5651 СТССССТОСС ССАСЗССТСТ ССССАСССТС ТССАССТССС

ССТОСАСССТ

САССССАССС ССТССССАСА СОССТСССАС АСОТССАССС ССАССТСССА

5701 СТССТСТАСС АСССССССТА ТСТТСССТТТ ССССАССССА АСАСССАССА

САССАСАТСС ТСССССССАТ АСААСССААА ССССТССССТ ТСТС6СТССТ

5751 СААСАССААС САТАТТСССС ТССТССАССТ СТССАСТССС СТСССССТСА СТТСТССТТС СТАТААСССС АССАСОТОСА САССТСАССа САСССССАСТ

- 2 011695

5801 СА6ААТАСАТ ССАВССТОТВ Т6ССТСССА6 СТ0ССЙ6ССА В6СССТ66Т6

ВТСТТАТСТА ВВТСОВАСАС АСССАСССТС ВАСВВССВСТ ССВВОАССАС

5851 6АТВ6САА6А ТСТ6ТАСС6Т 6АС66ВСТ66 БВСААСАСВС А6ТАСТАТ66

СТАССВТТСТ А0АСАТ6БСА СТССССОАСС ССВТТВТ6С6 ТСАТСАТАСС

Ауа|

5901 ССААСАЙОСС СВССТАСТСС АСВА66СТС6 АОТССССАТА АТСАВСААТС

6ВТТСТСС66 ССССАТВАСВ ТССТССОАСС ТСАВВВВТАТ ТАВТСОТТАС

5951 АТВТСТВСАА Т6ВС6СТ6АС ТТСТАТ60АА АССА6АТСАА ВСССААВАТВ

ТАСА6АССТТ АССВСВАСТВ АА6АТАССТТ Т6ВТСТА6ТТ С66ВТТСТАС

А7а1

6001 ТТСТ6ТВСТ6 ВСТАССССВА 666Т6ВСАТТ ВАТ6ССТ6СС АВСВСВАСАВ

ААВАСАСВАС СВАТВВВВСТ СССАССВТАА СТАСО6АС66 ТСССВСТВТС

6051 С66Т66ТССС ТПВТ6Т6ТВ А6ВАСА6САТ СТСТС66АС6 ССАС0ТТ6ВС

6ССАССА606 АААСАСАСАС ТССТ0ТС6ТА 6А6А6ССТ6С 0ВТ6СААСС6

6101 ВВСТВТВТВВ САТТВТВА6Т Т6В66САСТВ 6СТ6Т6СССТ 6ВСССА6ААВ

СС6АСАСАСС 6ТААСАСТСА АССССВТВАС СВАСАСВВВА СС6В6ТСТТС

6151 ССАВВСВТСТ АСАССАААВТ СА6ТВАСТТС СО66А6Т66А ТСТТССАВВС

66ТСС6САВА ТВТВВТТТСА ОТСАСТВААВ 6СССТСАССТ А6АА66ТССО 6201 САТАААСАСТ САСТСС6ААВ ССАВСВ6САТ В6ТВАСССАВ СТСТ6А

6ТАТТТСТВА 6Т6А6ВСТТС 66ТС6СС6ТА ССАСТ6В6ТС ВАВАСТ

Аминокислотная последовательность тд5гд5Ь№№п5а51едгр1уруя755абаг1ттГс1к(ед№г11с58Г8папгад18сеетдЛгаКЬге1с1уг1адапд1гд£Гси бедг1рМдгиеу18УСбсргдгПаа1сд<1сдггк!рус11ургдэуддгсИ81дпл'р'№ду81гус1даЫсдд8115дс1№/11ааЬсГретл/)8Г «Мадауада8рЛд1д1дуцаУ7у1?дду1р!гбрп5ееп8пс11аМ1|58р1р11еугчр7с1раадда1ус1дк1сМдй'дп(дуудядад у|деап/р|1зпс1успдас1Гудпд1кркт(садуреддИасддб8ддрй/сес1818г(ргиг1сд1У81лгд1дса1адкрд7у(кУ5с((ге1Л(11 Ча1к018еа8дту!ч1

Продуцируемое полезное вещество - внеклеточный фрагмент хепсина, трансмембранной сериновой протеазы II типа.

Обладает всеми характерными признаками сериновых протеаз, гидролизует пептидную связь по аргинину в положении Ьук Р₂Рз Агд 4, где Р₂ предпочтительно Акп, Ьеи или Тйг, Р₃ предпочтительно Ьук или б1п (4).

Уровень продуктивности 20%.

Пример осуществления изобретения.

Плазмидная ДНК ρΗΡΝΤΜ^-Α, несущая ген, кодирующий хепсин человека, создана в соответствии с представленной на чертеже фигуры картой и заданными нуклеотидной и аминокислотной последовательностями с использованием стандартных методов молекулярной биологии известных из научнотехнической литературы (5). Полученную плазмиду, содержащую ген ΗΡΝΤΜ^-Α, трансформировали в клетки Е.сой штамма ВЕ21(ОЕ3)СобопР1ик К1Ь.

Проводили аналитическую экспрессию целевого белка с использованием химического индуктора. Для этого колонии Е.сой, несущие ген целевого белка, выращивали на жидкой питательной среде ЬВ с антибиотиком в пробирках в течение 15±2 ч при температуре 37°С при постоянном покачивании в качалке. Добавляли 0,5 мл в колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл жидкой среды ЬВ с антибиотиком. Растили при температуре 37°С при постоянном покачивании до оптической плотности 0,5±0,1 (ΘΌ540). Затем добавляли химический индуктор - ИПТГ (изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид) и наращивали далее в течение 3 ч. Биомассу собирали центрифугированием в пластиковых пробирках на 50 мл (центрифуга ОПН-8, 4,000 об/мин 8 мин).

Проводили электрофоретический анализ клеточного белка в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для этого к аликвоте клеток 10 мг добавляли 40 мкл воды, перемешивали на встряхивателе и добавляли 40 мкл 2х буфера для образцов для белкового денатурирующего электрофореза. Образец прогревали при 95°С в течение 4 мин и наносили на денатурирующий гель с концентрацией акриламида 12%. После проведения электрофоретического разделения гель промывали дистиллированной водой, после чего окрашивали краской, содержащей краситель Кумасси. Избыток краски отмывали раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту.

Анализ наличия целевого белка проводили визуально, сравнивая набор клеточных белков в неиндуцированных клетках и клетках, индуцированных ИПТГ. Для определения молекулярной массы полученного целевого белка использовали набор белков с известными молекулярными весами.

Проводили анализ количества целевого белка по отношению к общему клеточному белку. Для этого гель сканировали на сканере Еркоп 1660 Рйо1о. Полученное изображение обрабатывали с помощью программы Опебксап.

- 3 011695

Результаты экспрессии показывают высокий уровень синтеза целевого белка, целевой белок составляет не менее 20% от общего клеточного белка (в среднем составляет 20-25%).

Источники информации

1. Ьеу1и8 8.Р., ЬоеЬ К.В., Надеп Б.8., Кцгасйг К., Ωανίο Е.^. А поуе1 (гуркт-йке кеппе рго!еаке (йеркш) тейй а рШаНге (гапктетЬгапе ботагп ехргеккеб Ьу йитап Нуег апб йера(ота се11к. Вюсйепик(гу. 1988; 27 (3): 1067-74.

2. Ташто(о Н., Уап Υ., С1агке 1., Когоипап 8., 8йгдетака К., Рагт1еу Т.Н., Рагйат 6.Р., О'Впеп Т.1. Неркт, а се11 кигТасе кеппе рго!еаке 1бепййеб т йера(ота се11к, 1к оуегехргеккеб т оуапап сапсег. Сапсег Век. 1997; 57 (14): 2884-7.

3. Хиап 1.А., 8сйпе1бег Ό., Тоу Р., Ьт В., №\у(оп А., 2йи Υ., Бшк1ег 8., Уоде1 Ό., МшГгег В., От(ег Н., Ыдй! Ό., Раггу В., Ро1окоТТ М., ^Ыботе М., \Уи О.. Раггу 6. АпбЬоб1ек пеШгакхтд Неркт рго!еаке асЙУЙу бо по! 1трас1 се11 дгоМй Ьи! 1пйгЬй туакюп оТ ргок(а(е апб оуапап (итог се11к ш сийиге. Сапсег Векеагсй 2006; 66 (7): 3611-9.

4. Небег 8., Р1рег Ό.Ε., Аагоп ^., 6аЬпе1е Т., Си(1ег 6., Сао Р., Вйаб А.8., Сйое Υ., Сга1к С.8., \Уа1кег Ν., Мейппдег Ό., Ноеу Т., ЛикОм В.1. Нера1осу1е дго\у(й Тас!ог 18 а ргеТеггеб ш уйго киЬк(га(е Тог йитап йеркт, а тетЬгапе-апсйогеб кеппе рго!еаке 1трйса1еб т ргок(а(е апб оуапап сапсегк. Вюсйеппкбу 1оита1 2005; 390 (Р!. 1): 125-36.

5. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (Тйбб Еббюп) Ву 1окерй 8атЬгоок, Ре!ег МасСа11ит, Эа^зб Викке11.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Ексйепсйга сой рНРКТМ^-А - продуцент растворимой формы рекомбинантного хепсина человека (НРКТМ^-А).

Физическая карта плазмиды рНРNТМ^-А