EA010723B1 - Medicament normalizing kidney functions and method for preparing thereof - Google Patents
Medicament normalizing kidney functions and method for preparing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA010723B1 EA010723B1 EA200700621A EA200700621A EA010723B1 EA 010723 B1 EA010723 B1 EA 010723B1 EA 200700621 A EA200700621 A EA 200700621A EA 200700621 A EA200700621 A EA 200700621A EA 010723 B1 EA010723 B1 EA 010723B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- solution
- temperature
- acetone
- drug
- medicament
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из почек и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, нормализующее функции почек.The group of inventions relates to a medicinal product and a method for its preparation from animal organs, in particular to the isolation of a biologically active substance from the kidneys and the preparation of a parenteral dosage form that can be used in medicine as a means of normalizing kidney function.
Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (а.с. 8И № 1218521, 1994; а.с. 8И № 1227198, 1986; патент РФ 1298879, 1993; патент РФ № 1448443, 1994; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ № 2104702, 1998; патент РФ № 2161501, 2001; патент РФ № 2163129, 2000; патент И8 4341765; патент РВ 2583982, 1987).Known methods for producing biologically active substances and medicines from animal raw materials (A.S. 8I No. 1218521, 1994; A.S. 8I No. 1227198, 1986; RF patent 1298879, 1993; RF patent No. 1448443, 1994; RF patent No. 2075944 , 1997; RF patent No. 2104702, 1998; RF patent No. 2161501, 2001; RF patent No. 2163129, 2000; I8 4341765; patent PB 2583982, 1987).
Известны способы получения комплексных пептидных препаратов, обладающих тканеспецифическим действием (патент РФ № 944191, 1994; патент РФ № 1122606, 1993; патент РФ № 1417244, 1993; патент РФ № 2104702, 1998).Known methods for producing complex peptide preparations having tissue-specific action (RF patent No. 944191, 1994; RF patent No. 1122606, 1993; RF patent No. 1417244, 1993; RF patent No. 2104702, 1998).
Известен способ получения указанных препаратов (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы. СПб., Наука, 1996. 74 с.), включающий получение биологически активного вещества из органов и тканей животных путем экстракции 3% раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработкой надосадочной жидкости ацетоном, являющийся наиболее близким аналогом-прототипом для предлагаемого способа получения средства, нормализующего функции почек.A known method of producing these drugs (Morozov V.G., Havinson V.Kh. Peptide bioregulators. St. Petersburg, Nauka, 1996. 74 pp.), Which includes obtaining a biologically active substance from animal organs and tissues by extraction with a 3% solution of acetic acid the addition of zinc chloride and the treatment of the supernatant with acetone, which is the closest analogue of the prototype for the proposed method of obtaining funds that normalize kidney function.
К недостаткам указанного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани большого количества (более 70%) веществ непептидной природы - балластных компонентов, которые, являясь примесями, не определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.The disadvantages of this method include the extraction during the extraction process from the tissue of a large amount (more than 70%) of substances of a non-peptide nature - ballast components, which, being impurities, do not determine the biological activity of the isolated active substance, as well as its low yield.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, нормализующего функции почек, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из почек телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 456 Да и получения водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.The present invention has posed and solved the problem of developing a method for producing a means that normalizes renal function in the form of a parenteral dosage form isolated from kidneys of calves no older than 12 months of age or pigs, the technical result of which is the optimal technology for isolating the peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90%, with a molecular weight of its peptide components ranging from 70 to 456 Da and obtaining an aqueous solution of the extract with a concentration of poly eptidov 2.5-2.9 mg / ml, which allows not only to clean impurities from the resulting product, but also to increase its output.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего функции почек, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.Experimental verification showed that the proposed method provides pharmaceutical stability, maximum biological value and therapeutic efficacy of a drug that normalizes renal function, made in the form of a parenteral dosage form, which is confirmed by the experimental results given in the examples illustrating the invention.
Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее функции почек, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 456 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из животного сырья, по молекулярной массе (от 500 до 1500 Да) входящих в него пептидных компонентов (патенты РФ №№ 1298879, 2104702, 2163129), а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.Another aspect of the invention is a means for normalizing renal function, in the form of a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90%, with a molecular weight of its constituent peptide components ranging from 70 to 456 Da, with a concentration polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml, the technical result of which is that the isolated substance differs from known substances obtained previously from animal raw materials in molecular weight (from 500 to 1,500 Da) included in peptide components (RF patents Nos. 1298879, 2104702, 2163129), as well as its non-toxicity and pyrogen-free nature due to complete purification from impurities.
В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах данной патологии. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.In the course of studies in animal experiments, it was revealed that the obtained aqueous solution of the agent with a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml is a therapeutically effective dose, which allows us to consider the use of the agent for various types of this pathology. This is confirmed by the following examples.
В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего функции почек, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):In the process of conducting research, the importance of the following stages of the method of obtaining funds that normalize renal function, made in the form of a dosage form for parenteral administration (hereinafter referred to as the drug), was established:
повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее 2 раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;repeated precipitation of the resulting homogenized precipitate with double volumes of acetone at least 2 times and subsequent washing on the suction filter with double volumes of acetone until a light gray precipitate is obtained, which indicates complete purification of the precipitate from impurities such as lipid, protein, phospholipid and others;
получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, и добавление в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,6-6,6;obtaining an aqueous solution of the extract in a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml; its centrifugation, filtration, followed by ultrafiltration cleaning at the installation with a back pressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Da, and the addition of glycocol to the ultrafiltrate to a final concentration of 10-20 mg / ml at pH 5.6-6 , 6;
стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.sterilizing filtration, ampouling and autoclaving for 8 min at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2 , which ensures the stability of the drug while maintaining therapeutic efficacy.
Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.The mode and time of autoclaving were established experimentally.
Указанный технический результат достигается тем, что средство, нормализующее функции почек, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих вThe specified technical result is achieved in that the agent normalizing the function of the kidneys is made in the form of a parenteral dosage form and is a peptide complex with a low molecular weight fraction of from 70 to 90%, with a molecular weight of
- 1 010723 него пептидных компонентов в пределах от 70 до 456 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и получено из почек телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.- 1 010723 peptide components ranging from 70 to 456 Yes, with a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml and obtained from the kidneys of calves no older than 12 months of age or pigs by extraction with acetic acid in the presence of zinc chloride.
Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, нормализующего функции почек, характеризуется тем, что почки телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее -40°С, выдерживают при температуре 20 - -22°С в течение не менее 2 месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-6°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-6°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,6-6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.The specified technical result is also achieved by the fact that the proposed method of obtaining a means of normalizing renal function is characterized in that the kidneys of calves no older than 12 months of age or pigs are frozen at a temperature of at least -40 ° C, kept at a temperature of 20 - -22 ° C for at least 2 months, then crushed, add a 3% solution of acetic acid in a volume ratio of 1: 5 at a temperature of 20 ± 5 ° C, the extraction is carried out with constant stirring, after obtaining a homogeneous suspension, add a 1% solution of chloride zinc in a volume ratio of 50: 1, cooled with constant stirring to a temperature of 7-6 ° C, then stirred for 1 hour after every 4 hours of settling for 48 hours, the extract is separated from the ballast substances by separation, acetone is added to the extract in a volume ratio of 1 : 5, kept at a temperature of 3-5 ° C for 4 h, the resulting homogenized precipitate is re-precipitated with acetone at least 2 times, then the precipitate containing the active substance is washed on a suction filter with two volumes of acetone cooled to a temperature of 7-6 ° C to the floor the precipitate is light gray, wiped through a metal sieve, dried, dissolved in distilled water at room temperature and constant stirring to a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml, the solution is centrifuged, filtered, subjected to ultrafiltration purification on the installation with back pressure not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Yes, glycol is added to the ultrafiltrate to its final concentration of 10-20 mg / ml at pH 5.6-6.6, the solution is subjected to sterilizing filtration under pressure not more than 2.0 kgf / cm 2 , poured into ampoules of 2 ml and autoclaved for 8 min at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2 .
Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.The invention is illustrated by the figure and tables.
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов почки.The figure shows the effect of the drug on the development of kidney explants.
В табл. 1 показано влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.In the table. 1 shows the effect of the drug on the morphological and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs in the study of toxicity.
В табл. 2 показано влияние препарата на химический состав мочи больных подагрической нефропатией.In the table. Figure 2 shows the effect of the drug on the chemical composition of the urine of patients with gouty nephropathy.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; пример 2 - подтверждающий биологическую активность препарата; пример 3 - изучение токсичности препарата; пример 4 - подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.The invention is illustrated by the following examples: example 1 - a method of obtaining a preparation; example 2 - confirms the biological activity of the drug; example 3 - the study of the toxicity of the drug; example 4 - confirms the therapeutic effectiveness of the drug, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
Пример 1. Способ получения препарата.Example 1. The method of obtaining the drug.
В качестве сырья используются почки телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, которые замораживают при температуре не менее -40°С и выдерживают при температуре -20 - -22°С в течение не менее 2 месяцев.As raw materials, the kidneys of calves (not older than 12 months of age) or pigs are used, which are frozen at a temperature of at least -40 ° C and kept at a temperature of -20 - -22 ° C for at least 2 months.
В реактор для экстракции перекачивают 450 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры 20±5°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 90 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры +7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.450 l of a 3% solution of acetic acid are pumped into the extraction reactor and cooled to a temperature of 20 ± 5 ° C, then 90 kg of crushed material is loaded into the reactor with constant stirring until a homogeneous mass of raw material is obtained. The extraction is carried out with constant stirring, after obtaining a homogeneous suspension, a 1% solution of zinc chloride in a volume ratio of 50: 1 is added to it, it is cooled with constant stirring to a temperature of + 7-16 ° C, then it is stirred for 1 hour every 4 hours of settling for 48 h
Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при 5000±500 об./мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре +3-5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-6°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.The extract is separated from the ballast substances by separation at 5000 ± 500 rpm for 1 hour. Acetone in a volume ratio of 1: 5 is added to the extract. It is kept at a temperature of + 3-5 ° C for 4 hours. The precipitate formed is homogenized and reprecipitated with acetone at least 2 times. Then, the precipitate containing the active substance is washed on a suction filter with twice volumes of acetone cooled to a temperature of 7-6 ° C until a light gray precipitate is obtained. The washed precipitate is wiped through a metal sieve, spread in a thin layer into enameled cuvettes, covered with a double layer of cotton cloth and dried with periodic stirring in a fume hood until the smell of acetone is completely removed.
Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из почек) составляет 50 г на 1 кг исходного сырья.The output of the active substance (powder of a biologically active peptide complex isolated from the kidneys) is 50 g per 1 kg of feedstock.
Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5-2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при 3000±200 об./мин в течение 20±5мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.The resulting powder is dissolved in distilled water with constant stirring at room temperature for 40 minutes to a concentration of peptides of 2.5-2.9 mg / ml. The resulting solution was centrifuged at 3000 ± 200 rpm for 20 ± 5 min. The centrifuge is filtered through an AP-15 filter or similar.
Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.The filtrate is subjected to ultrafiltration purification in an ultrafiltration unit with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Da.
В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола до его конечной концентрации 10-20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН 5,6-6,6.In the ultrafiltrate add the calculated sample of glycol to its final concentration of 10-20 mg / ml, mix until the glycol is completely dissolved while maintaining a pH of 5.6-6.6.
Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0, кгс/см2.The solution is subjected to sterilizing filtration, which is carried out under pressure not exceeding 2.0 kgf / cm 2 .
- 2 010723- 2 010723
Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см2.The resulting solution is poured into 2.0 ml ampoules and autoclaved, and the ampoules with the preparation are sterilized for 8 min at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of not more than 1.1 kgf / cm 2 .
Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.The preparation is a colorless, transparent solution and contains a peptide complex with a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.Testing for the absence of high molecular weight protein components is carried out by adding to the contents of 1 ampoule of the drug 1 ml of 10% trichloroacetic acid solution. The transparency of the solution indicates the absence of high molecular weight protein components.
Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.To determine peptide bonds in a preparation, a biuret reagent is added to its solution. Staining the solution with violet color indicates the peptide bonds present in the preparation.
С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.In order to determine the polypeptides and their fractions in the preparation, the methods of ultraviolet spectrophotometry, gel chromatography, mass spectrometry, high performance liquid chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis are used.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.The ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the region of wavelengths from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 270 ± 5 nm.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами: методом гель-хроматографии на сефадексах 0-25 и 0-50 («Рйаттааа», Швеция). Для калибровки колонки 1,6x60 см используют РсрОкс Мо1есиаг \Уещ111 Κίΐ Μδ III («§етуа», Германия);The molecular weight of the polypeptides included in the preparation is determined by the following methods: gel chromatography on Sephadex 0-25 and 0-50 (Ryattaa, Sweden). For calibration of a 1.6x60 cm column, use RsrOks Mo1eciag \ Uchet111 Κίΐ Μδ III (“§etua”, Germany);
методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадет ΌΕ Вю8рес1готе1гу с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6х 106 тор;mass spectrometry method. The spectra are obtained on a Wouadet ΌΕ Vu8res1gote1gu time-of-flight mass spectrometer with laser desorption and ionization using a matrix (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ) at a relative intensity of a nitrogen laser of 2300-2400, an accelerating voltage of 25000 V, a delay time of 90 ns, and a pressure in the vacuum chamber of 2.6 x 10 6 torus;
методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.by electrophoresis in 15% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins.
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 70 до 456 Да.Using the methods listed above, it was found that the composition of the drug includes polypeptides with a molecular weight of from 70 to 456 Da.
С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «ЫсйтокотЬ С18», колонка 2x62 мм) установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.Using reversed-phase high-performance liquid chromatography in an acetonitrile gradient (sorbent “Ysutokot C18”, column 2x62 mm), it was established that the composition of the preparation consists mainly of low molecular weight fractions - from 70 to 90%, and there are no high molecular weight components in the preparation.
Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с. 183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.Pyrogenicity of the drug is determined in rabbits by the generally accepted method (GF XI, issue 2, p. 183) with a test dose of 0.25 mg per 1 kg of animal weight in 1.0 ml of an isotonic 0.9% sodium chloride solution for injection. It is shown that the drug is pyrogen-free.
Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 456 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.Thus, in the above method, a preparation was obtained - a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90%, with a molecular weight of its peptide components ranging from 70 to 456 Da, with a concentration of 2.5 polypeptides -2.9 mg / ml.
Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов почек.Example 2. The effect of the drug on the development of kidney explants.
Эксперименты проведены на 45 фрагментах почек крыс линии «^М18(аг» с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты почек помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли препарат в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента почек. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.The experiments were performed on 45 kidney fragments of rats of the ^ ^ M18 (aH) rat with a body weight of 150-200 g. The culture medium for explant cultivation consisted of 35% Eagle's solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks' solution, 5% chicken embryonic extract , glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml), penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mM) were added to the medium. Kidney fragments were placed in this medium and cultured on a collagen substrate in Petri dishes in a thermostat at a temperature of 36.7 ° C for 2 days. ia 2, 10, 20, 50, 100 ng / ml Area biological index was the area index (PI) - the ratio of the area of the entire explant together with the growth zone to the outgoing area of the kidney fragment. The PI values were expressed as a percentage, the control PI value was taken as 100 %
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов почек.The figure shows the effect of the drug on the development of kidney explants.
Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3 сутки культивирования при концентрации препарата 20 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 31% по сравнению с контрольными значениями ИП (фигура). При исследовании эксплантатов почек на более длительных сроках культивирования (7 дней) были выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.It was found that after 1 day of cultivation, the explants spread on a collagen substrate and the proliferation of proliferating and migrating cells began on the periphery of the explant. On the 3rd day of cultivation at a drug concentration of 20 ng / ml, a significant increase in the explant PI by 31% was observed compared with the reference PI values (figure). When studying kidney explants for longer cultivation periods (7 days), a similar stimulating effect of the drug at the same concentration was revealed.
Таким образом, в отношении ткани почек препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.Thus, in relation to kidney tissue, the drug exerted a tissue-specific effect, manifested in stimulating the growth of explants.
Пример 3. Изучение токсичности препарата.Example 3. The study of the toxicity of the drug.
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.The general toxic effect of the drug was investigated in accordance with the requirements of the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances (2000): acute toxicity with a single administration of the drug, as well as subacute and chronic toxicity with prolonged administration of the drug.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 78 белых беспородных мышах-самцахA study of acute toxicity was conducted on 78 white mongrel males.
- 3 010723 с массой тела 18-21 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35, 50, 100, 150, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора №1С1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор ИаС1.- 3 010723 with a body weight of 18-21 g. Animals were randomly divided into 6 equal groups. The drug was administered to animals once intramuscularly at doses of 35, 50, 100, 150, 200 mg / kg in 0.25 ml of sterile 0.9% solution No. 1C1. Animals of the control group were injected with the same volume of 0.9% solution of IAl.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысахсамцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор №1С1. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.Studies on the study of subacute toxicity were carried out on 65 white mongrel rats with a body weight of 150-180 g. Daily, once a day, animals of experimental groups were injected intramuscularly with doses of 1, 10, 100 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.9 % solution of IAl. The animals of the control group were injected in the same volume with a sterile 0.9% solution No. 1C1. Before administration of the drug on the 30, 60 and 90 days after the start of drug administration, the morphological composition and properties of peripheral blood were studied in animals. At the end of the experiment, biochemical and coagulological blood parameters were examined.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах массой 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 месяцев в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор №1С1 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.Studies of chronic toxicity were carried out for 6 months, based on the duration of the recommended clinical prescription of the drug, in 84 male guinea pigs weighing 250-280 g. Animals of the experimental groups received intramuscularly once daily drug for 6 months in doses of 1, 10, 100 mg / kg in 0.5 ml of a sterile 0.9% solution of IAl. In the control group, animals were injected according to a similar scheme to a sterile 0.9% solution No. 1C1 in the same volume. In animals, the number of erythrocytes, hemoglobin, reticulocytes, platelets, leukocytes, leukocyte formula, erythrocyte sedimentation rate (ESR), and erythrocyte resistance were determined by the generally accepted methods in peripheral blood. Along with this, the content of total protein in blood serum was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry. After the experiment, a pathomorphological study of the brain and spinal cord, spinal ganglia, thyroid gland, parathyroid glands, adrenal glands, testes, pituitary gland, heart, lungs, aorta, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, colon intestines, thymus, spleen, lymph nodes, bone marrow.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.When studying acute toxicity, it was found that a single administration of the studied drug to animals in a dose exceeding the therapeutic recommended for clinical use by more than 5000 times does not cause toxic reactions, which indicates a large therapeutic breadth of the drug.
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 3003000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (табл. 1).The study of subacute and chronic toxicity of the drug indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug in doses exceeding the therapeutic by 3003000 times. When studying the effect of the drug on the morphological composition and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs after 3 and 6 months after the start of the drug administration, no significant change in the indicators was revealed (Table 1).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.When assessing the general condition of animals, morphological and biochemical parameters of peripheral blood, the morphological state of internal organs, the state of the cardiovascular and respiratory systems, and liver and kidney function, pathological changes in the body were not detected.
Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать препарат, нормализующий функции почек, для проведения клинических испытаний.The absence of a general toxic effect allows us to recommend a drug that normalizes renal function for clinical trials.
Пример 4. Эффективность применения препарата у больных подагрической нефропатией.Example 4. The effectiveness of the drug in patients with gouty nephropathy.
В исследовании принимали участие 25 больных подагрической нефропатией в возрасте 43-57 лет. Больные предъявляли жалобы на периодически возникающие боли в области суставов, плохое самочувствие, слабость, тошноту, бессонницу. Все больные ранее получали симптоматическую и патогенетическую терапию по поводу данного заболевания.The study involved 25 patients with gouty nephropathy aged 43-57 years. Patients complained of intermittent pain in the joints, feeling unwell, weakness, nausea, and insomnia. All patients previously received symptomatic and pathogenetic therapy for this disease.
Пациентов методом рандомизации разделили на 2 группы. 15 больных, вошедших в основную группу, получали препарат в дозе 5 мг в 2 мл физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно течение 10 дней.Patients were randomized into 2 groups. 15 patients included in the main group received the drug in a dose of 5 mg in 2 ml of saline intramuscularly once daily for 10 days.
Контрольная группа включала 10 пациентов, получавших общепринятое лечение.The control group included 10 patients who received conventional treatment.
В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи, биохимическое изучение крови, ультразвуковое исследование почек.The complaints of patients were evaluated in dynamics, a general clinical study of blood and urine, a biochemical blood test, and an ultrasound examination of the kidneys were performed.
Пациенты основной группы, получавшие лечение с применением препарата, в 78% случаев отмечали значительное улучшение самочувствия, нормализацию сна, уменьшение частоты и интенсивности суставных болей. Сглаживание клинических симптомов сопровождалось улучшением лабораторных показателей. На фоне приема препарата наблюдалась активация метаболизма почечных тканей, сопровождающаяся усилением секреторной функции почек (табл. 2).Patients of the main group treated with the drug in 78% of cases noted a significant improvement in well-being, normalization of sleep, a decrease in the frequency and intensity of joint pain. The smoothing of clinical symptoms was accompanied by an improvement in laboratory parameters. While taking the drug, activation of renal tissue metabolism was observed, accompanied by an increase in the secretory function of the kidneys (Table 2).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о лечебной эффективности препарата и целесообразности его применения в комплексном лечении больных подагрической нефропатией в терапевтически эффективной дозировке 5 мг (2,5 мг/мл) внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.Thus, the results obtained indicate the therapeutic efficacy of the drug and the feasibility of its use in the complex treatment of patients with gouty nephropathy in a therapeutically effective dosage of 5 mg (2.5 mg / ml) intramuscularly once daily for 10 days.
- 4 010723- 4 010723
Таблица 1Table 1
Таблица 2table 2
*Р<0,05 по сравнению с показателем до лечения;* P <0.05 compared with the indicator before treatment;
#Р<0,05 по сравнению с показателем после лечения с применением общепринятых средств.# P <0.05 compared with the indicator after treatment using conventional means.
- 5 010723- 5 010723
Claims (2)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006122059/15A RU2302868C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Agent normalizing kidney function and method for its preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700621A1 EA200700621A1 (en) | 2007-12-28 |
| EA010723B1 true EA010723B1 (en) | 2008-10-30 |
Family
ID=38431013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700621A EA010723B1 (en) | 2006-06-22 | 2007-04-11 | Medicament normalizing kidney functions and method for preparing thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA010723B1 (en) |
| RU (1) | RU2302868C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002308788A (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-23 | Kenzen Kyu | Remedy for nephritis and kidney debility |
| RU2220732C2 (en) * | 2001-11-01 | 2004-01-10 | Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" | Agent normalizing renal function and method for it preparing |
-
2006
- 2006-06-22 RU RU2006122059/15A patent/RU2302868C1/en active
-
2007
- 2007-04-11 EA EA200700621A patent/EA010723B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002308788A (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-23 | Kenzen Kyu | Remedy for nephritis and kidney debility |
| RU2220732C2 (en) * | 2001-11-01 | 2004-01-10 | Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" | Agent normalizing renal function and method for it preparing |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MOROZOV V. G. i dr. Peptidnye bioregulyatory. SPb, Nauka, 1996, s.55 * |
| MOROZOV V. G. i dr. Tsitaminy (bioregulyatory kletochnogo metabolizma). SPb, 1999, s. 101-104 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200700621A1 (en) | 2007-12-28 |
| RU2302868C1 (en) | 2007-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2644767B2 (en) | Methods and agents for removing advanced glycosylation end products | |
| CN1290862C (en) | Spleen polypeptide extract, its preparing process and use | |
| RU2302874C1 (en) | Agent normalizing reproductive function in men and method for its preparing | |
| RU2301071C1 (en) | Hepatoprotective agent and method for production thereof | |
| JPS60258120A (en) | Thymus product and manufacture | |
| RU2302868C1 (en) | Agent normalizing kidney function and method for its preparing | |
| CN101081250B (en) | Potygonum multiflorum thunb extract medicament for treating anemia and the preparing method thereof | |
| US20030080056A1 (en) | Extraction of biological components from body fluids | |
| RU2301072C1 (en) | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof | |
| RU2303454C1 (en) | Preparation for normalizing female reproductive function and method for its obtaining | |
| RU2302875C1 (en) | Agent normalizing pancreas function and method for its preparing | |
| RU2302867C1 (en) | Agent normalizing bladder tonus and method for its preparing | |
| RU2302872C9 (en) | Agent normalizing cartilage tissue function and method for its preparing | |
| RU2152219C1 (en) | Peptides showing immunostimulating activity, method of their synthesis, drug based on thereof, splenopid and its using | |
| EA010739B1 (en) | Medicament normalizing drain functions and method for preparing thereof | |
| RU2405560C1 (en) | Medication for brain cell protection | |
| RU2433134C1 (en) | Erythropoetin conjugated with polyethylene glycol | |
| RU2799637C1 (en) | Method of producing biologically active peptide-amino acid preparation based on human blood plasma | |
| Zeng et al. | Specneuzhenide ameliorate complete Freund adjuvant induced arthritis in rats: involvement of NF-κB and HO-1/Nrf-2 pathway | |
| RU2811901C1 (en) | Agent for stimulating proliferative activity of bone marrow cells | |
| RU2033796C1 (en) | Peptide-containing fraction from mammalian spleen showing immunostimulating activity, and a method of its preparing | |
| RU2297239C1 (en) | Peptide stimulating regeneration of liver tissue, pharmaceutical composition based on thereof and method for its using | |
| RU2582965C9 (en) | Pharmaceutical composition for treatment of endometriosis and method for preparation thereof | |
| EA010737B1 (en) | Medicament having heteroprotective activity and method for preparing thereof | |
| RU2341272C1 (en) | Nonspecific immunotherapy agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM MD TJ |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KG TM |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |