RU2433134C1

RU2433134C1 - Erythropoetin conjugated with polyethylene glycol

Info

Publication number: RU2433134C1
Application number: RU2010140709/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Викторович Шереметьев (RU); Сергей Викторович Шереметьев; Виталий Васильевич Зверев (RU); Виталий Васильевич Зверев; Сергей Анатольевич Коровкин (RU); Сергей Анатольевич Коровкин; Антон Викентьевич Катлинский (RU); Антон Викентьевич Катлинский; Андрей Викторович Семченко (RU); Андрей Викторович Семченко; Владимир Антонович Катлинский (RU); Владимир Антонович Катлинский
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ФОРТ"
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2011-11-10

Abstract

FIELD: chemistry. ^ SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and immunology. The invention discloses erythropoetin which is conjugated with polyethylene glycol, where polethylene glycol is bonded to erythropoetin via an aromatic azo group. ^ EFFECT: invention increases circulation time of erythropoetin in blood while preserving its biological activity. ^ 3 cl, 2 dwg, 1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается биологически активного конъюгата эритропоэтина с полиэтиленгликолем. Конъюгат обладает увеличенным временем циркуляции в крови.The invention relates to biotechnology and medicine, and relates to a biologically active conjugate of erythropoietin with polyethylene glycol. The conjugate has an increased circulation time in the blood.

Биологически активные белки (далее БАБ) играют важную роль в поддержании жизнедеятельности организма в целом и каждой его клетки в частности. Примерами таких белков могут быть как ферменты и гормоны, так и цитокины. Наиболее распространенными лекарственными средствами БАБ являются препараты на основе интерферонов, инсулина, гранулоцитного колониестимулирующего фактора, эритропоэтина (далее ЭПО), гормона роста человека и др.Biologically active proteins (hereinafter referred to as BAB) play an important role in maintaining the vital functions of the organism as a whole and of each of its cells in particular. Examples of such proteins include enzymes and hormones, as well as cytokines. The most common BAB medicines are preparations based on interferons, insulin, granulocyte colony stimulating factor, erythropoietin (hereinafter EPO), human growth hormone, etc.

Однако в практической деятельности у данных препаратов было выявлено много недостатков: быстрое разрушение в организме, что вынуждает значительно увеличивать дозу и частоту введения; плохое прохождение в ткани; побочные, в том числе аллергические, реакции и пр. Это диктует необходимость поиска новых лекарственных форм применения БАБ для достижения лучшего биологического эффекта.However, in practice, these drugs revealed many shortcomings: rapid destruction in the body, which forces a significant increase in the dose and frequency of administration; poor passage in tissue; adverse, including allergic, reactions, etc. This necessitates the search for new dosage forms for the use of BAB to achieve a better biological effect.

Одним из результатов такого поиска было создание соединений протеинов с полиэтиленгликолем (А.В.Кучумова. Пегилирование рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств. Диссертация… кандидата биологических наук: 03.00.04 Москва, 2007 102 с.: 61 07-3/645). Этот процесс получил название "ПЭГилирование".One of the results of this search was the creation of protein compounds with polyethylene glycol (A.V. Kuchumova. Pegylation of the recombinant L-asparaginase Erwinia carotovora in order to enhance its therapeutically significant properties. The dissertation ... candidate of biological sciences: 03.00.04 Moscow, 2007 102 pp .: 61 07-3 / 645). This process is called PEGylation.

Полиэтиленгликоль (далее ПЭГ) - химическое вещество, обладающее свойствами, которые позволяют использовать его в качестве носителя для биоорганических молекул или соединений. Например, ПЭГ агломерирует молекулы, что позволяет создавать депо лекарственного вещества. Кроме того, вследствие локальной повышенной концентрации действующего вещества усиливается его проведение внутрь тканей.Polyethylene glycol (hereinafter PEG) is a chemical substance that has properties that allow it to be used as a carrier for bioorganic molecules or compounds. For example, PEG agglomerates molecules, which allows you to create a depot of a drug substance. In addition, due to local increased concentration of the active substance, its conduction into the tissues is enhanced.

Весьма большой интерес в этом плане вызывает создание ПЭГилированного эритропоэтина - одного из гормонов почек, который по химическому строению является гликопротеином, состоящим из 165 аминокислот. Физиологически ЭПО является основным регулятором эритропоэза, т.е. стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга. Он способствует пролиферации и дифференцировке клеток эритроидного ростка, а также препятствует их апоптозу. Для выполнения последней функции концентрация эритропоэтина должна поддерживаться на определенном, постоянном для каждого человека, уровне. До тех пор пока не нарушена оксигенация тканей, концентрация эритропоэтина, так же как и объем циркулирующих эритроцитов, остается постоянной (Ермоленко В.М., Николаев А.Ю. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинике. Тер. арх. 1990; 62(11): 141-145).Of great interest in this regard is the creation of PEGylated erythropoietin - one of the hormones of the kidneys, which by its chemical structure is a glycoprotein consisting of 165 amino acids. Physiologically, EPO is the main regulator of erythropoiesis, i.e. stimulates the formation of red blood cells from late progenitor cells and increases the release of reticulocytes from the bone marrow. It promotes the proliferation and differentiation of erythroid germ cells, and also prevents their apoptosis. To perform the latter function, the concentration of erythropoietin must be maintained at a certain, constant level for each person. Until tissue oxygenation is disturbed, the concentration of erythropoietin, as well as the volume of circulating red blood cells, remains constant (Ermolenko V.M., Nikolaev A.Yu. Erythropoietin: biological properties and use in the clinic. Ter. Arch. 1990; 62 (11): 141-145).

Клинически ЭПО применяется для лечения анемии при хронической почечной недостаточности (диализные и предиализные пациенты), при онкологических заболеваниях (цитостатическая терапия), при трансплантации органов и тканей, при комплексном лечении СПИД (терапия ВИЧ-инфекции зидовудином), при аутодонорстве, для лечения анемии при хронических воспалительных заболеваниях, при анемии у ослабленных пациентов (пожилые люди, недоношенные дети, обожженные и т.д.) и при отказе от трансфузий аллогенных гемокомпонентов (Дж.Денхэм, И. Чанарин. Болезни крови у пожилых // М., Медицина, 1989; И.Е.Тареева. Нефрология: Руководство для врачей. М.: Медицина, 1995; 1496 cc., Шевченко Ю.Л. и др., Эритропоэтин в профилактике и лечении анемий. Воен-мед. журн., 1996; 317 (II): 45-8; А.В.Папаян, Л.Ю.Жуков. Анемии у детей, СПБ: Современная медицина, 2008).Clinically, EPO is used to treat anemia in chronic renal failure (dialysis and predialysis patients), for oncological diseases (cytostatic therapy), for organ and tissue transplantation, for the complex treatment of AIDS (HIV therapy with zidovudine), for autologous donation, for the treatment of anemia in chronic inflammatory diseases, with anemia in debilitated patients (elderly people, premature babies, burned, etc.) and with refusal of transfusions of allogeneic blood components (J. Denham, I. Chanarin. Diseases to ovia in the elderly // M., Medicine, 1989; I.E. Tareeva. Nephrology: A guide for doctors. M: Medicine, 1995; 1496 cc., Shevchenko Yu.L. et al., Erythropoietin in the prevention and treatment of anemia Military Medical Journal, 1996; 317 (II): 45-8; A.V. Papayan, L.Yu. Zhukov. Anemia in Children, St. Petersburg: Modern Medicine, 2008).

Биодоступность коммерческих препаратов на основе рекомбинантного эритропоэтина ограничена из-за короткого периода полураспада в плазме крови и склонности к деградации протеазами (Павлов А.Д., Морщакова Е.Ф. Регуляция эритропоэза: Физиологические и клинические аспекты. М.: Медицина, 1987. 272 cc.).The bioavailability of commercial preparations based on recombinant erythropoietin is limited due to the short half-life in plasma and the tendency to degradation by proteases (Pavlov A.D., Morshchakova E.F. Regulation of erythropoiesis: Physiological and clinical aspects. M .: Medicine, 1987. 272. cc.).

Таким образом, пегилирование ЭПО является весьма перспективным способом устранения вышеуказанных недостатков.Thus, pegylation of EPO is a very promising way to eliminate the above disadvantages.

ПЭГ - химическое вещество, обладающее свойствами, которые позволяют использовать его в качестве носителя для биоорганических молекул или соединений. Одной из важнейших особенностей ПЭГ-молекул является их высокая гидрофильность, формирующая принципиально новые физико-химические свойства модифицируемого пептида. Высокое содержание атомов водорода даже в одной молекуле ПЭГ позволяет ей связываться с 2-3 молекулами воды. Подобный эффект влечет за собой формирование «водного облака» вокруг модифицированной молекулы «ПЭГ-белок», в результате значительно повышается ее гидродинамический радиус. Этот своеобразный «щит» воды, с одной стороны, значительно повышает растворимость и биодоступность препарата, а с другой - защищает молекулу от других белков (антитела, комплемент). (Никитин. И.Г. Пегилированные интерфероны-альфа: новые возможности в лечении хронического гепатита С. Фарматека, №9 (60), 2002).PEG is a chemical substance with properties that allow it to be used as a carrier for bioorganic molecules or compounds. One of the most important features of PEG molecules is their high hydrophilicity, which forms fundamentally new physicochemical properties of the modified peptide. The high content of hydrogen atoms even in one PEG molecule allows it to bind to 2-3 water molecules. A similar effect entails the formation of a "water cloud" around the modified PEG-protein molecule, as a result of which its hydrodynamic radius increases significantly. This unique “shield” of water, on the one hand, significantly increases the solubility and bioavailability of the drug, and on the other hand, protects the molecule from other proteins (antibodies, complement). (Nikitin. I.G. Pegylated interferons-alpha: new possibilities in the treatment of chronic hepatitis C. Farmateka, No. 9 (60), 2002).

ПЭГилирование позволяет пролонгировать действие протеинов: получить длительный терапевтический эффект при однократном применении лекарственного средства; избежать колебаний концентрации лекарственных веществ в крови, вызывающих нежелательные побочные явления; снизить токсичность лекарственного вещества (Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты, http://medi.ru/doc/08h1301.htm).PEGylation allows you to prolong the action of proteins: get a long therapeutic effect with a single use of the drug; avoid fluctuations in the concentration of drugs in the blood, causing undesirable side effects; to reduce the toxicity of a drug substance (Nikitin I.G., Storozhakov T.N. Pegylated drugs, http://medi.ru/doc/08h1301.htm).

В ковалентных конъюгатах ПЭГ защищает полипептид от ферментативной деградации в организме, снижает его иммуногенность, улучшает переносимость, а также увеличивает общий размер молекулы и, как следствие, время ее циркуляции в организме, препятствуя выведению через почки, что допускает более редкое введение препарата и более ровное поддерживание терапевтических концентраций в крови (Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. «Вирусные гепатиты, достижения, перспективы», 2001, №3(13), с.3-8).In covalent conjugates, PEG protects the polypeptide from enzymatic degradation in the body, reduces its immunogenicity, improves tolerance, and also increases the overall size of the molecule and, as a result, its circulation time in the body, preventing the excretion through the kidneys, which allows for more rare drug administration and more even maintaining therapeutic concentrations in the blood (I. Nikitin, G. Storozhakov “Viral hepatitis, achievements, prospects”, 2001, No. 3 (13), pp. 3-8).

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является препарат МИРЦЕРА по патенту WO №2002/049673. В данном конъюгате ЭПО и ПЭГ одна линейная молекула полимера массой 30 кДа присоединена к терминальной α-аминогруппе белка посредством амидной связи. Недостаток данного препарата заключен в способе производства, так как ввиду специфики процесса получения препарата МИРЦЕРА определенная часть ε-аминогрупп и гетероциклических атомов азота гистидина и триптофана в данном конъюгате остается заблокированной, что снижает конечную биологическую активность препарата из-за препятствования взаимодействию со специфическими рецепторами.The closest analogue of the claimed invention is the drug MIRZERA according to patent WO No. 2002/049673. In this EPO and PEG conjugate, one linear polymer molecule of 30 kDa is attached to the terminal α-amino group of the protein via an amide bond. The disadvantage of this drug lies in the production method, since, due to the specifics of the MIRZERA preparation process, a certain part of the ε-amino groups and heterocyclic nitrogen atoms of histidine and tryptophan in this conjugate remains blocked, which reduces the final biological activity of the drug due to the inhibition of interaction with specific receptors.

Предлагаемое изобретение, помимо расширения арсенала эффективных биологически активных средств на основе ЭПО, позволяет по сравнению с наиболее близким аналогом достигнуть увеличения времени циркуляции в крови с большим сохранением биологической активности модифицированного белка.The present invention, in addition to expanding the arsenal of effective biologically active agents based on EPO, allows, in comparison with the closest analogue, to achieve an increase in the circulation time in the blood with greater conservation of the biological activity of the modified protein.

Данная задача решается за счет получения нового биологически активного конъюгата ЭПО и ПЭГ, отличающегося тем, что молекула ПЭГ присоединена к гликопротеину посредством ароматической азогруппы.This problem is solved by obtaining a new biologically active conjugate of EPO and PEG, characterized in that the PEG molecule is attached to the glycoprotein via an aromatic azo group.

Из известного уровня техники не следует, что такое присоединение приведет к меньшей потере уровня активности белка. Данный технический эффект является неочевидным.It does not follow from the prior art that such an attachment will result in less loss of protein activity level. This technical effect is not obvious.

Таким образом, заявленное техническое решение не только является новым, но и не следует из существующего уровня техники.Thus, the claimed technical solution is not only new, but also does not follow from the existing level of technology.

Следующая структура иллюстрирует заявленное изобретениеThe following structure illustrates the claimed invention

где ЭПО - эритропоэтин;where EPO is erythropoietin;

N - целое число в интервале от 450 до 1140.N is an integer in the range from 450 to 1140.

Молекулярная масса ПЭГ в предлагаемом конъюгате находится в интервале от 20 до 50 кДа.The molecular weight of PEG in the proposed conjugate is in the range from 20 to 50 kDa.

Особенность предлагаемого конъюгата заключается в том, что ПЭГ с ЭПО связан посредством азогруппы, образующей хромофор, поглощающий в видимой и ближней УФ-области электронного спектра (20000-34000 см^-1) и придающий окраску целевому конъюгату (фиг.1).A feature of the proposed conjugate is that PEG with EPO is connected through an azo group forming a chromophore, which absorbs in the visible and near UV regions of the electronic spectrum (20000-34000 cm ^-1 ) and gives color to the target conjugate (Fig. 1).

Рекомбинантный эритропоэтин, используемый в заявленном изобретении, может быть типа альфа или бета.The recombinant erythropoietin used in the claimed invention may be of the type alpha or beta.

Пример 1. Фармакокинетика конъюгата ПЭГ-ЭПО.Example 1. The pharmacokinetics of the conjugate PEG-EPO.

Самцам мышей линии СВА внутримышечно вводили по 1 мкг конъюгата ПЭГ-ЭПО, после чего собирали кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля использовали препарат МИРЦЕРА и свободный ЭПО, которые вводили по той же схеме. Взятые пробы крови инкубировали в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяли тромб и повторно инкубировали при 4°С, полученную сыворотку центрифугировали и сохраняли при -65°С до проведения тестов. Содержание ПЭГ-ЭПО в сыворотках крови определяли с помощью иммуноферментного анализа. Данные по фармакокинетики препаратов представлены на фиг.2, из которой видно, что время циркуляции ПЭГ-ЭПО сопоставимо со временем циркуляции препарата МИРЦЕРА.Male mice of CBA line were intramuscularly injected with 1 μg of the PEG-EPO conjugate, after which blood was collected on the first day 2 hours after injection and then every 24 hours for 10 days. As a control, MIRZERA and free EPO were used, which were administered according to the same scheme. Blood samples were incubated for 45 min at 37 ° C, after which the thrombus was separated and re-incubated at 4 ° C, the obtained serum was centrifuged and stored at -65 ° C until testing. The content of PEG-EPO in blood serum was determined using enzyme-linked immunosorbent assay. Data on the pharmacokinetics of the drugs are presented in figure 2, which shows that the circulation time of PEG-EPO is comparable to the circulation time of the drug MIRZERA.

Пример 2. Специфическая активность ПЭГ-ЭПО.Example 2. The specific activity of PEG-EPO.

Специфическую активность определяли измерением увеличения количества эритроцитов после парентерального введения ПЭГ-ЭПО нормоцитемическим мышам линии B₆D₂F₁, возрастом от 7 до 15 недель. Животным вводили ранжированные дозы, которые приводили к измеряемому увеличению числа ретикулоцитов. Подсчет количества ретикулоцитов в крови экспериментальных животных осуществляли методом микрофлуориметрии в проточном цитометре. In vivo активность испытуемых образцов ПЭГ-ЭПО рассчитывали методом параллельных линий по сравнению с биологической активностью стандартного образца. В качестве контроля использовали препарат МИРЦЕРА. Показатели биологических активностей приведены в таблице.Specific activity was determined by measuring the increase in the number of red blood cells after parenteral administration of PEG-EPO to normocytemic mice of the B ₆ D ₂ F _{1 line} , aged 7 to 15 weeks. The animals were given ranked doses that led to a measurable increase in the number of reticulocytes. The count of the number of reticulocytes in the blood of experimental animals was carried out by microfluorimetry in a flow cytometer. In vivo activity of the tested PEG-EPO samples was calculated by the parallel line method compared to the biological activity of the standard sample. As a control, the drug MIRZERA was used. Indicators of biological activities are shown in the table.

Сравнение биологической активности препарата МИРЦЕРА, немодифицированного и ПЭГилированного ЭПОComparison of the biological activity of the drug MIRZERA, unmodified and pegylated EPO ПрепаратA drug Удельная активность, МЕ/мгThe specific activity, IU / mg % активности% activity ЭПОEPO 100·10³ 10010 ³ 100one hundred ПЭГ(20 кДа)-ЭПОPEG (20 kDa) -EPO 22·10³ 22 · 10 ³ 2828 ПЭГ(30 кДа)-ЭПОPEG (30 kDa) -EPO 17·10³ 17 · 10 ³ 2424 ПЭГ(50 кДа)-ЭПОPEG (50 kDa) -EPO 13·10³ 13 · 10 ³ 1919 МИРЦЕРАMIRCERA 9·10³ 9 · 10 ³ 14fourteen

Таким образом, полученные данные показали, что предложенный конъюгат ПЭГ-ЭПО сохраняет значительную часть биологической активности немодифицированного ЭПО и превосходит активность препарата МИРЦЕРА.Thus, the obtained data showed that the proposed PEG-EPO conjugate retains a significant part of the biological activity of unmodified EPO and exceeds the activity of the MIRZERA preparation.

Пример 3. Токсичность ПЭГ-ЭПО.Example 3. The toxicity of PEG-EPO.

Токсичность ПЭГ-ЭПО оценивали на самцах мышей линии СВА, которым вводили конъюгат ПЭГ-ЭПО в интервале от 50 до 500 МЕ/кг. При введении животным предлагаемого конъюгата не регистрировались летальные эффекты, не установлено значимых изменений во внутренних органах, гематологических и биохимических показателей крови. На основании полученных данных, исходя из того, что разовая доза конъюгата для человека составляет не более 50 МЕ/кг, был сделан вывод о том, что предлагаемый конъюгат ПЭГ-ЭПО является нетоксичным соединением.The toxicity of PEG-EPO was evaluated in male CBA mice that were injected with a PEG-EPO conjugate in the range from 50 to 500 IU / kg. When the proposed conjugate was introduced to animals, lethal effects were not recorded, significant changes in the internal organs, hematological and biochemical parameters of blood were not established. Based on the data obtained, based on the fact that a single dose of a conjugate for humans is not more than 50 IU / kg, it was concluded that the proposed PEG-EPO conjugate is a non-toxic compound.

Claims

1. Erythropoietin conjugated to polyethylene glycol (PEG), characterized in that the PEG is attached to erythropoietin via an aromatic azo group and has the following structure:

where EPO is erythropoietin;
n is an integer in the range from 450 to 1140.

2. The erythropoietin conjugated with PEG according to claim 1, characterized in that the erythropoietin is a recombinant erythropoietin of the alpha or beta type.

3. Erythropoietin conjugated to PEG according to claim 1, characterized in that the molecular weight of the polyethylene glycol fragment is in the range from 20 to 50 kDa.