EA010578B1

EA010578B1 - Антивирусное средство на основе гемолимфы насекомых подкласса pterigota

Info

Publication number: EA010578B1
Application number: EA200601150A
Authority: EA
Inventors: Сергей Иванович Черныш
Original assignee: Сергей Иванович Черныш
Priority date: 2004-01-15
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2008-10-30
Also published as: WO2005067949A1; EA200601150A1; RU2004100857A; US20090311339A1; EP1707210A4; RU2276988C2; EP1707210A1; AU2004314020A1

Abstract

Изобретение относится к фармакологически активным средствам природного происхождения и может быть использовано для получения антивирусных лекарственных средств и лечения вирусных инфекций. Техническим результатом изобретения является существенное расширение арсенала антивирусных лекарственных средств, повышающих устойчивость к вирусным инфекциям на основе гемолимфы насекомых подкласса Pterigota, за счет создания новой группы антивирусных средств - антивирусных препаратов прямого действия, полученных экстракцией тканей разных отрядов насекомых, используемых в качестве источников энтовиронов. Эти препараты, экспериментально опробованные, представляют собой индивидуальные вещества или их смеси, увеличивающие устойчивость клеток организма к вирусной инфекции путем разрушения вируса, блокирования его репликации или иным способом, который может осуществляться без участия иммунной системы.

Description

Настоящее изобретение относится к фармакологически активным средствам природного происхождения и может быть использовано для получения антивирусных лекарственных средств и лечения вирусных инфекций.

Известны фармацевтические препараты, содержащие комплекс экстрактивных средств животных или растительных тканей и применяемые для лечения вирусных инфекций путем стимуляции иммунной системы и прямого воздействия на вирионы или зараженные вирусом клетки.

Известен процесс получения из СИ4-позитивных Т-лимфоцитов и клеток костного мозга белков, подавляющих развитие вируса иммунодефицита человека (патент И8 5480782).

Известно наружное средство, содержащее экстракт растения Сшкдо Ы1оЬа и обладающее антивирусной и антибактериальной активностью (патент ΌΕ 4334600 А1).

Патент \ЧО 81/03124 описывает полипептидную фракцию, выделенную из моллюска Муй1и8 ебийк и активную в отношении различных вирусов, бактерий и простейших.

Известны антивирусные препараты растительного происхождения, механизм действия которых основан на инактивации свободных вирусных частиц, блокировании их транспорта через клеточную мембрану или подавлении репликации вируса в клетке-хозяине (Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. М.: изд-во «Медицина», 1998).

Известна многокомпонентная композиция, выделенная из тканей насекомого СаШрйога уюта К.оЬтеаи-Ое8УО1бу (01р1ега, СаШрйопбае) и обладающая антивирусной активностью (патент И8 6337093). Из состава данной композиции выделен пептид аллоферон с антивирусной и противоопухолевой активностью (патент КП 2172322). Антивирусная активность указанной композиции и ее действующего вещества аллоферона обусловлена иммуномодулирующими свойствами: способностью индуцировать синтез интерферона и усиливать цитотоксическую активность естественных киллеров (СйегпуЛ е1 а1. Аийу1га1 аиб аийишог рерббек Ггот иъесй //ΡΝΑ8, 2002, 99, р. 12628-12632). В то же время ни указанная композиция, ни аллоферон не оказывают прямого защитного действия на клетки, подвергнутые вирусной инфекции.

Указанная композиция и ее действующее вещество аллоферон являются единственными антивирусными препаратами из насекомых, известными в настоящее время. По этому признаку они являются наиболее близкими аналогами настоящего изобретения.

Перечисленные выше и аналогичные им фармацевтические препараты природного происхождения увеличивают арсенал антивирусных лекарственных средств. Однако известные препараты не покрывают существующую потребность, в связи с чем вирусные инфекции остаются одной из наиболее опасных и трудноизлечимых групп заболеваний человека и животных.

В задачу настоящего изобретения входит расширение арсенала антивирусных лекарственных средств.

Сущность изобретения

В процессе создания настоящего изобретения установлено, что гемолимфа различных насекомых содержит экстрактивные вещества, введение которых в культуру клеток млекопитающих увеличивает устойчивость последних к вирусной инфекции. Дальнейшие систематические исследования крылатых насекомых (подкласс Р1егщо1а класса 1п5ес1а) позволили выявить наличие аналогичной антивирусной активности в отдельных таксономических группировках ранга видов, родов, семейств и отрядов. В результате была разработана методология поиска антивирусных лекарственных средств, содержащихся в тканях насекомых, и определены на ее основе виды и группы более высокого ранга, наиболее перспективные в качестве источника антивирусных веществ. Таким образом, предметом настоящего изобретения является новая группа антивирусных средств - антивирусные препараты прямого действия, получаемые путем экстракции тканей насекомых, в частности представителей отрядов Обопа1а (стрекозы), МаШор1ега (богомолы), НепйрЮга (полужесткокрылые), Со1еор1ега (жуки), О1р1ега (двукрылые), Месор1ега (скорпионницы) или Ьер1бор1ега (бабочки). Под препаратами прямого действия в данном случае понимаются индивидуальные вещества или их смеси, увеличивающие устойчивость клеток организма к вирусной инфекции путем разрушения вируса, блокирования его репликации или иным способом, который может осуществляться без участия иммунной системы. Отличительной особенностью и родовым признаком таких препаратов служит повышение устойчивости клеток-мишеней к вирусной атаке вне организма (ίη уйго). например, при введении препарата в культуральную среду с клетками. Антонимами препаратов прямого действия в контексте настоящего изобретения являются иммуномодуляторы, фармакологическая активность которых основана на стимуляции антивирусного иммунного ответа организма. Понятно, что некоторые метаболиты насекомых могут сочетать свойства антивирусного препарата прямого и иммуномодулирующего механизма действия. Последнее обстоятельство не должно препятствовать их включению в заявляемую группу лекарственных средств, если терапевтическая эффективность этих веществ полностью или частично обусловлена механизмом прямого антивирусного действия.

Понятно также, что антивирусные вещества, первоначально выделенные из тканей указанных насекомых, могут быть воспроизведены путем химического или биологического синтеза и использованы в таком или модифицированном виде в качестве лекарственных средств. Модификации базовой структуры могут преследовать цели увеличения стабильности, биодоступности, антивирусной активности, сниже

- 1 010578 ния токсичности или иных побочных эффектов препарата. Полученные индивидуальные вещества и их смеси могут использоваться в составе фармацевтических композиций, а также в комбинации с другими антивирусными средствами.

Указанную совокупность антивирусных веществ прямого действия, выделяемых из тканей различных насекомых, предлагается обозначать термином энтовироны (энто- от греческого энтомон - насекомое и вирон от латинского вирус). С целью изучения распределения энтовиронов в пределах класса насекомых были исследованы по единой методике препараты гемолимфы 31 вида насекомых:

отряд Маи1ор1ега: 1пк ро1укйсйса;

отряд Нет1р1ега: Лрйгорйога кайсша;

отряд Со1еор1ега: Ркеиборйопик гийрек, Асапйюсйшкк аебШк, №сгорйогик уекрШо;

отряд Нутепор1ега: Уекра сгаЬго, О1рг1опр1п1, Л1йайа сойЬп;

отряд О1р1ега: Эейа ЬгаккВае, СаШрйога ига1епк1к, Микса ботекйса, Ерукугрйик Ьа11еа1ик, 81гайотук кшди1апог, Оак1егорЫ1ик уе!еппик, йипайрЫа киЬ1ипа1а Отряд Месор1ега: Рапогра соттишк;

отряд Ьер1бор1ега: Матекйа регкюапа, П1асйгук1а сйгукШк, ОрегорЫега Ьгита1а, Соккик соккик, Эепбгойтик кйшсик, Ьакюсатра 1г1Го11, АхуНары1г1к, Ио1обоп1а бготебагшк, 8рЫих йдикйт, Ерйекйа кийшейа, Тойпх утбапа;

отряд Обопа1а: Аексйпа суапеа, Аексйпа дгапйк, ЫЬе11и1а циабг1таси1а1а, 8ота1осЫога те!аШса.

Присутствие энтовиронов установлено в образцах 26 видов, относящихся ко всем исследованным отрядам насекомых (см. таблицу). Лишь 5 образцов дали негативный результат. Исследованные отряды, как показано на фигуре, относятся к двум главным ветвям эволюции подкласса Р1епдо1а (крылатые насекомые): Ра1аеор1ега (древнекрылые) и Иеор1ега (новокрылые). На этом основании энтовироны можно считать характерной особенностью подкласса Р1епдо1а в целом. Этот вывод подтверждается тем обстоятельством, что энтовироны обнаружены во всех подразделениях группы Иеор1ега, включающих Ро1упеор!ега, Рагапеор1ега и Ойдопеор1ега, а также во всех подразделениях наиболее многочисленной группы Ойдопеор1ега, а именно Иеигор1его1беа, Нутепор1его1беа и Месор1его1беа. Представители подкласса Ар1епдо1а в исследовании не участвовали в связи с техническими трудностями получения образцов гемолимфы. Поэтому формула настоящего изобретения ограничена представителями подкласса Р1епдо1а.

Хотя энтовироны широко распространены среди насекомых, активность их существенно различается у представителей различных группировок. Наибольшей активностью отличаются энтовироны представителей отряда Обопа1а (стрекозы), в частности стрекоз семейства Аексйшбае, таких как Аексйпа дгапйк и Аексйпа суапеа, а также семейства ЫЬеПийбае, в частности ЫЬе11и1а с.|иабптаси1а1а и 8ота1осй1ога те!аШса. Другая группа с повышенной активностью энтовиронов относится к отряду Ьер1бор1ега, в частности к семейству Иос1шбае, представленному видами П1асйгук1а сйгукШк и Матек1га регкюапа семейства, а также семейству Оеотейбае на примере ОрегорИега Ьгита1а. Кроме того, высокий уровень активности энтовиронов характерен для некоторых представителей отрядов Со1еор1ега (Ркеиборйопик гийрек, СагаЫбае) и Э|р1ега (81гайошук ктди1апог, ЗйаНошуИае). Представители перечисленных выше видов, семейств и отрядов особенно полезны в качестве источника получения энтовиронов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Выделение энтовиронов из гемолимфы насекомых.

Исходный биологический материал для постановки опытов (личинок насекомых определенного вида и стадии развития) получали из природных популяций, определяли видовую принадлежность и содержали в лабораторных условиях при комнатной температуре и естественной влажности. Имунную систему личинок активировали путем прокола кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием (1 мин на кипящей водяной бане) клеток бактерий ЕксйепсЫа сой и МВгососсик 1и1еик (10⁹/мл клеток каждого вида). Иммунизированных таким образом личинок инкубировали в течение суток при комнатной температуре. По истечение этого срока поверхность личинок стерилизовали 70%-ным этанолом, промывали личинок в стерильной дистиллированной воде и подсушивали на фильтровальной бумаге. Гемолимфу личинок собирали через разрез кутикулы в охлажденные на льду пробирки с добавлением апротинина и фенилтиомочевины для подавления протеолитической и фенолоксидазной активности гемолимфы, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили до использования при -20°С.

Размороженную гемолимфу центрифугировали 10 мин при 4000 О, супернатант подкисляли трифторуксусной кислотой до конечной концентрации кислоты 0,05% (ν/ν) и наносили на колонку 8ер-Рак с сорбентом С₁₈ (фирма ^а!егк) из расчета 3 мл гемолимфы на 1 г сорбента. Гидрофильные компоненты гемолимфы удаляли, промывая колонку 0,05 %-ной трифторуксусной кислотой. Затем сорбированные на колонке гидрофобные компоненты элюировали 50%-ным ацетонитрилом в 0,05 %-ной трифторуксусной кислоте. Полученную в результате элюции ацетонитрилом смесь гидрофобных компонентов лиофилизировали и использовали для определения антивирусной активности.

Пример 2. Антивирусная активность энтовиронов, выделенных из гемолимфы насекомых.

Антивирусную активность определяли в системе ш уйго, обычно используемой для определения антивирусной активности интерферонов (Сйегпукй е! а1. Апй\зга1 апб апйШтог рерйбек йот шкес1к//РИА8, 2002, 99, р. 12628-12632). Культуру клеток человека Ь 41 выращивали в лунках 96-луночных планшетов до образования монослоя клеток на дне лунки. Затем в лунку вносили тестируе

- 2 010578 мый препарат и одновременно вирус везикулярного стоматита (У8У, штамм Индиана) в дозе 100 ЦПД₅₀(цитопатическая доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя). В контрольные лунки вносили эквивалентное количество растворителя. Зараженную вирусом культуру инкубировали 18 часов при 37°С, затем клетки окрашивали 0.1% раствором красителя кристаллический фиолетовый. Долю погибших клеток определяли путем последующей экстракции красителя и определения его оптической плотности при 590 нм. Критерием активности энтовиронов служило увеличение доли выживших клеток монослоя по сравнению с контролем. Результат признавался положительным при уровне достоверности различий между опытом и контролем Р<0.01 по критерию Стьюдента.

Результаты изучения антивирусной активности препаратов гемолимфы 31 вида насекомых представлены в таблице. Образцы, давшие положительную реакцию в тесте на антивирусную активность, отмечены знаком · Всего таких образцов обнаружено 26 или 84% всего массива данных.

Как видно из фигуры, содержащие энтовироны образцы относятся к 8 отрядам, представляющим всем подразделения крылатых насекомых (Р(сг1до1а): Ра1аеор1ега и №ор!ега, Ро1уиеор1ега, Рагаиеор1ега и О1щопсор1сга. Ыеигор1его16еа, Нутеиор1его16еа и МесорЕегоИеа. На этом основании энтовироны следует считать характерным компонентом гемолимфы класса насекомых в целом. Среди исследованных образцов выделяются высоким уровнем активности энтовиронов четыре кластера, относящихся к определенным отрядам и семействам. Прежде всего, это образцы, полученные из гемолимфы стрекоз (отряд Обоиа!а), представленных семействами Лексйшбае и ЫЬеПиШае на примере Лексйиа дгаиб18 и ЫЬе11и1а диа6птаси1а1а, соответственно. Второй кластер относится к отряду жуки (Со1еор1ега), представленному семейством СагаЫбае на примере Ркеиборйоиш гийрек. Третий кластер образуют препараты гемолимфы бабочек (Ьер16ор1ега), представленные семейством Ыос1ш6ае на примере совок П1асй1уща сйгуыЩ и Матейга регысапа, а также семейством Оеотейлбае на примере пяденицы ОрегорЫега Ьгита1а. Наконец, четвертый кластер относится к отряду двукрылых (01р(ега), представленному семейством 81га11оту1бае на примере 81га1юту5 8шди1апог.

Перечисленные виды, семейства и отряды являются особенно полезными в качестве источника получения энтовиронов.

- 3 010578

Антивирусная активность энтовиронов, выделенных из гемолимфы насекомых

Препарат	Семейство	Выживаемость инфицированных вирусом клеток, %	Наличие энтовиронов (Р<0.01)
		Серия 1	Серия 2
Контроль		8.2 ±0.23	6.0 ± 0.27
Отряд О0опа(а
Аезскпа суапеа	АезсйпИае		17.0± 1.0***	•
Аезскпа кгап&з	Аезсйшйае		38.5± 3.5***	•
ЫЬе11и1а риаАптаси1а1а	ЫЪеИийсИе	69.5± 5.5***		•
ЗотаЮсЫога тееаШса	ОЬеПиПОае		15.5± 1.5***	•
Отряд Мап1ор1ега
1пз рсАузНсНса	МапйОае	13.5 ± 1.5***		•
Отряд Неппр1ега
Аркгоркога заНста	АркгорНопОае	11.0 ± 1.0**		•
Отрад Со1еор1ега
РзеиАоркопиз ги/грез	СагаЫОае	30.0 ±3.0***		•
Асап1кос!пизз аесНИз	СетатЫсИае		12.0 ± 1.0***	•
Мсгоркогиз геЗрШо	8ИрЫ(1ае		9.0 ±0.0***	•
Отряд 1)1р(ега
Река Ьгаззкае	Ап1Ноту14ае		10.0 ±0.0***	•
СаШркога ига1епзгз	СаШрйопйае	9.3 ± 1.75
Мизса Аотезкса	МизсИае		8.5 ± 0.5
Ерузугркиз ЪакеЫиз	ЗугрЫйае	17.5± 2.5***		•
81га(1отуз хт^и1апог	81га1юту1с1ае	32.5 ±4.5***		*
баМегоркНиз уеСеппиз	(ЗайсгорЫИОае	11.5 ± 1.5***		•
1мпаНри1а зиЫипа1а	ПриНОае		9.5 ± 1.5**	•
Отряд Месор1ега
Рапогра соттитз	РапогрИае	15.0 ±2.0***		•
Отряд Нушепор1ега
Уе$ра сгакго	УезрИае	10,1 ± 0.9*
βϊρήοη ρίηί	О1рг1от<1ае		7.0± 1.0
ΑΐΙιαϋα соНМ	ТеШпсНпИае		9.5 ±0.5 ***	•
Отрад ЬерЮорГега
Матенга регзкхпАа	Ыос(ш<1ае	25.0±2.0***		•
Ргаскгуз^а скгузгИз	ИосГиИае	23.5±2.5***		•
Орегг>рк1ега ЬгитаЮ	СтсотейИае	35.5±3.5***		•
Соззиз соззиз	СоззИае	7.1± 1.4
БепАгоНтиз зИшйсиз	Еаз1осатр1(1ае		12.5± 0.5***	♦
Ьазюсатра 1ή(ο1ϊ	БазюсатрИае		9.5 ± 0.5***	•
АхуНа ри1пз	МосТиМае		11.5± 0.5***	•
Νοίοάοηία АготеАапиз	МЛоЗопНОае		9.5 ± 0.5***	•
Еркшх Иуиз1п	8рй1П£1<1ае		10.0± 1.0***	•
ЕркезИа киктеНа	Руга1удае		10.0±0.0***	•
ТогГпх νίχίΑαηα	ТоПйсИае	12.5± 1.5***		•

*Р< 0.05; **Р< 0.01; ***Р< 0.001

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антивирусное средство на основе гемолимфы насекомых подкласса Р1спдо1а. отличающееся тем, что оно получено путем активации иммунной системы насекомых проколом кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием клеток бактерий, например ЕзсйспсЫа сой или Мюгососсиз 1н1сиз. сбора гемолимфы и дальнейшей обработки полученной гемолимфы центрифугированием, хроматографией супернатанта путем элюирования сорбированных на колонке гидрофобных компонентов с получением элюата, содержащего смесь гидрофобных компонентов, обладающих антивирусной активностью.
2. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что хроматографию супернатанта проводят на колонке с сорбентом С₁₈ путем элюирования сорбированных на колонке гидрофобных компонентов 50% ацетонитрилом.
3. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1сгщо1а используют виды отряда Ойопа1а.
4. Антивирусное средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ойопа1а используют виды семейства Асзсйшйас.
5. Антивирусное средство по п.3, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Аезсйшйае используют стрекоз рода Асзсйпа.
6. Антивирусное средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ойопа1а используют виды семейства ЫйеНиШае.
7. Антивирусное средство по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства ЫйеНиШае

- 4 010578 используют стрекоз рода Ь1Ье11и1а.
8. Антивирусное средство по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства ЫЬе11ийбае используют стрекоз рода 8ота1осЫога.
9. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1епдо1а используют виды отряда Маи1ор1ега.
10. Антивирусное средство по п.8, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Маи1ор1ега используют богомолов рода 1гщ.
11. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда НепйрЮга.
12. Антивирусное средство по п.10, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Непйр1ега используют пенниц рода Арйгорйога.
13. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда Месор1ега.
14. Антивирусное средство по п.12, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Месор1ега используют скорпионниц рода Рапогра.
15. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда Нутепор1ега.
16. Антивирусное средство по п.14, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Нутепор1ега используют пилильщиков рода А1йайа.
17. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда Со1еор1ега.
18. Антивирусное средство по п.16, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Со1еор1ега используют виды семейства СагаЫбае.
19. Антивирусное средство по п.17, отличающееся тем, что в качестве видов семейства СагаЫбае используют жужелиц рода Ркеиборйопик.
20. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда Э|р1ега.
21. Антивирусное средство по п.19, отличающееся тем, что в качестве видов отряда 0|р1ега используют виды семейства 81гайоту1бае.
22. Антивирусное средство по п.20, отличающееся тем, что в качестве видов семейства 81гайоту1бае используют львинок рода Ыгайотуъ.
23. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Р1егщо1а используют виды отряда Ьер1бор1ега.
24. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ьер1бор1ега используют виды семейства Ыос1шбае.
25. Антивирусное средство по используют совок рода МатеЧга.
26. Антивирусное средство по используют совок рода О|ас11П51а.
27. Антивирусное средство по используют совок рода Ахуйа.
28. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что пользуют виды семейства Сеоте1пбае.
29. Антивирусное средство по п.27, отличающееся тем, что используют пядениц рода ОрегорЫега.
30. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что пользуют виды семейства Ьа8юсатр1бае.
31. Антивирусное средство по п.29, отличающееся тем, что бае используют шелкопрядов рода Эепбгойтих.
32. Антивирусное средство по п.29, отличающееся тем, что бае используют шелкопрядов рода Ьаыосатра.
33. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что пользуют виды семейства Ыо1обопйбае.
34. Антивирусное средство по п.32, отличающееся тем, что в качестве видов семейства ИЫобопйбае используют хохлаток рода №1обоШа.
35. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ьер1бор1ега используют виды семейства ЗрЫпщбае.
36. Антивирусное средство по п.34, отличающееся тем, что в качестве видов семейства ЗрЫпщбае используют бражников рода 8рЫпх.
37. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ьер1бор1ега используют виды семейства Руга1убае.
38. Антивирусное средство по п.36, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Ругайбае

п.23,

п.23,

п.23, отличающееся тем, отличающееся тем, отличающееся тем, что что что качестве качестве качестве видов видов видов семейства Ыос1шбае семейства Ыос1шбае семейства Ыос1шбае в качестве видов отряда Ьер1бор1ега исв качестве видов семейства Сеоте1пбае качестве качестве качестве качестве видов отряда Ьер1бор1ега исвидов семейства ЬаыосатрК видов семейства ЬаыосатрК видов отряда Ьер1бор1ега ис- 5 010578 используют огневок рода ЕрйевПа.
39. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Ьер1кор1ега используют виды семейства Тойпсйае.
40. Антивирусное средство по п.38, отличающееся тем, что в качестве видов семейства ТогйгсИае используют листоверток рода Тогйгх.