EA006512B1 - Способы анализа последовательностей нуклеиновых кислот с использованием биологического олигонуклеотидного микрочипа и наборы для их осуществления - Google Patents

Abstract

Разработаны альтернативные способы анализа последовательностей нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для идентификации микроорганизмов и вирусов; определения генов, детерминирующих синтез диагностически важных белков, токсинов; определения точечных мутаций, делеций, инсерций, инверсий и транслокаций в НК; определения лекарственной устойчивости возбудителей; детекции транспозонов и других мобильных элементов (IS-элементов); определения уровня экспрессии генов; определения гомо- и гетерозиготного состояния мутаций, а также в целях эпидемиологического типирования. Способы основаны на применении методов гибридизации, ПЦР и ее модификаций на микрочипе. Также разработан способ получения олигонуклеотидных микрочипов; способ получения очищенных препаратов олигонуклеотидов, необязательно включающий выбор олигонуклеотидов на основе анализа их первичной и вторичной структур; способы гибридизации и амплификации НК на микрочипе; процедуры подготовки образцов к анализу на микрочипах; способы регистрации и интерпретации результатов.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и рассматривает способы анализа последовательностей нуклеиновых кислот (НК) на биологическом микрочипе, что может быть использовано для идентификации микроорганизмов и вирусов; определения генов, детерминирующих синтез диагностически важных белков, токсинов; определения точечных мутаций, делеций, инсерций, инверсий и транслокаций в НК; определения лекарственной устойчивости возбудителей; детекции транспозонов и других мобильных элементов (Ιδ-элементов); определения уровня экспрессии генов; определения гомо- и гетерозиготного состояния мутаций, а также в целях эпидемиологического типирования.

Изобретение также включает способ создания олигонуклеотидных микрочипов; способ получения олигонуклеотидных зондов для проведения гибридизации на микрочипе и праймеров для проведения ПЦР на микрочипе, который необязательно предусматривает выбор олигонуклеотидов в соответствии с формализованными требованиями; способы гибридизации и амплификации НК на микрочипе; процедуры подготовки образцов к анализу на микрочипах; способы регистрации и интерпретации результатов.

Уровень техники

В настоящее время идентификация многих микроорганизмов, в особенности медленно растущих и трудно культивируемых в лабораторных условиях, базируется на анализе последовательности 168 РНК [Воййшдкаиз В., Т. Кода11, Т. Р1окг, Н. В1оскег, апй Е.С. Войдет. 1990. Пе!есйоп апй 1йепйДсайоп οί МусоЬас1епа Ьу Атрййсайоп οί γΚΝΆ. 1. С11п. МюгоЬюк, 28: 1751-1759; С1пдегаз Т.К., С.СЬапйоиг. Е.7апд, А. Вето, Р.М. 8та11, Р. ОгоЬше\\'зкг Ό. А11апй, Е. Иебтопй, М. Но1ойшу, апй 1. Эгепкоьу. 1998. 81ти11апеоиз Сепо1ур1пд апй 8рес1еб Иепййсайоп Изтд НуЬпй|/а1юп Райет Кесодшйоп Апа1уз1з οί Сепепс МусоЬас!епит ΌΝΑ Аггауз. Сепоте Кез., 8: 435-448; Тгоезск А., Н. Nдиуеп, С.С. М1уайа, 8. Пебуагеппе, Т.К. С1пдегаз, Р.М. Кар1ап., Р. Сгозз, апй С.МаЬПа!. 1999. МусоЬааегшт 8рес1еб ИепйРюайоп апй Кйатркт Ке8181апсе Тезйпд νίΐΠ ШдИ-ИепзИу ^NΑ РгоЬе Аггауз. 1. СЬп. МкгоЫок, 37: 49-55]. В то же время для идентификации могут быть использованы гены, уникальные для данного микроорганизма или группы микроорганизмов (например, ген т1р40, представленный в геноме только М. 1иЬегси1оз1з [ЫеЬаиа Е., А. Агапах. В. Ргапаз, апй Ό. Соизшз. 1996. Аззеззтеп! οί Сепейс Магкегз Рог 8рес1ез ПШегепйайоп тейЫп !ке МусоЬас!епит 1иЬегси1оз1з Сотр1ех. 1. СЬп. МюгоЬюк, 3.4: 933-938, Рагга С.А., Ь.Р. Ьопйопо, Р. Эе1 РогЙ11о, апй М.Е. Райагоуо. 1991. 1зо1айоп, Скагааеп/айоп апй Мо1еси1ааг С1ошпд оР а 8реайс МусоЬасйепит 1иЬегси1оз1з Апйдеп Сепе: 1йепййсайоп оР 8реаез-8реаР1с 8ес.|иепсе. Шес!. 1ттип., 59: 3411-3417], или ген трЬ70 |С’оизтз Ό.ν., 8.Ό. 7й!оп, апй В.К. Ргапаз. 1991. Изе оР ^NΑ Атрййсайоп Рог !ке Кар1й 1йепййсайоп оР МусоЬааегшт Ьоу1з. Vе!. М1сгоЬю1., 27: 187-195], инсерционные элементы Ι86110 [ТЫепу Ό., М.И. Сауе, Κ.Ό. Е1зепаск, ЕТ. СгаМогй, ЕН. Ва!ез, В. бюсщек апй ЕЬ. Сиезйоп. 1990. Ι86110, ап 18-11ке Е1етеп1 оР МусоЬааегшт 1иЬегси1оз1з сотр1ех. №с1. Аайз Кез. 18: 188] и Ι81081 [Актей N..

А.К. Мокап!у, и. Миккорайкуау, ν.Κ. Вайзк, апй 8. Сгоуег. 1998. РСК-Вазей Кар1й Пе!есй!оп оР МусоЬааегшт 1иЬегси1оз1з ш В1оой Ргот 1ттипосотре!еп1 Райеп1з тейк Ри1топагу ТиЬегси1оз1з. к. СЬп. М1сгоЬю1. 36: 3094-3095, СоШпз И.М., апй И.М. 8!еркепз. 1991. 1йепййсайоп оР ап 1пзегйоп 8едиепсе, Ι81081, ш МусоЬааегшт Ьоу1з. РЕМ8 М1сгоЬю1. Ьей. 83: 11-16, ЫеЬапа Е., А. Агапах, В. Ргапаз, апй Ό. Соизшз. 1996. Аззеззтеп! оР Сепейс Магкегз Рог 8реаез П1РРегепйайоп тейЫп !ке МусоЬааегшт 1иЬегси1оз1з Сотр1ех. к. С1ш. М1сгоЬю1., 34: 933-938], недавно описанный межгенный участок зепХ3-гедХ3 [Мадйа1епа к., А. νη^^, Р. 8ирр1у, апй С Ьоск!. 1998. [йеп(1Р1са11оп оР а №\ν ^NΑ Кедюп 8реайс Рог МетЬегз оР МусоЬааегшт 1иЬегси1оз1з Сотр1ех. к. СЬп. М1сгоЬю1., 36: 937-943], характерные для всех видов микобактерий туберкулезного комплекса), или даже гены, ответственные за синтез консервативных белков (например, ген гроВ, кодирующий РНК-полимеразу [Стдегаз Т.К., С. Скапйоиг, Е. 7апд, А. Вето, Р.М. 8та11, Р. ОгоЬше\\'зкг Ό. А11апй, Е. Пезтопй, М. Но1ойшу, апй к. Эгепкоьу. 1998. 81ти11апеоиз Сепо1уршд апй 8реаез ИепййсаНоп Изтд НуЬпй|/айоп Райет Кесодшйоп Апа1уз1з оР Сепепс МусоЬааегшт ^NΑ Аггауз. Сепоте Кез., 8: 435-448, Тгоезск А., Н. Nдиуеи, С.С. М1уайа, 8. ^езνа^еиие, Т.К. Стдегаз, Р.М. Кар1ап., Р. Сгозз, апй С. МаЬйа!. 1999. МусоЬааегшт 8реаез [йеп(1Р1са(1оп апй ШРатркш Кез1з1апсе Тезйпд νί(Π Н1дк-Пепзйу ^NΑ РгоЬе Аггауз. к. СЬп. М1сгоЬю1., 37: 49-55]). В последнем случае, как и в случае 168 РНК, анализируются видоспецифичные различия в вариабельных участках генов.

В том случае, когда заболевание вызвано вирусами, молекулярные методы идентификации возбудителя являются ценной альтернативой чрезвычайно трудоемким, дорогостоящим и требующим длительного времени методам с использованием культур клеток и тканей. Уже описаны основанные на полимеразной цепной реакции системы детекции вируса иммунодефицита человека Ι типа [АЬЬой М, Ро1ез/ В, Вугпе 8, е! а1: Епхутайс депе атрНйсайоп: ОпаШайте апй диапШайуе те!койз Рог йе!есйпд ргоуйа1 ^NΑ атрййей ш-уйго. к Шес! И1з 158:1158-1169, 1988, Ви!скег А, 8райого к: изтд РСК Рог йе!есйоп оР Н^-1 тРесОоп. СЬп Iттипο1 Кеу 12:73-76, 1992], вируса гепатита С [Уоипд ΚΥ, Кезшск КМ, Муегз Т7: Пе!есйоп оР Ьераййз С У1гиз ^А Ьу а сотЬшей геуегзе 1гапзсг1рйоп-ро1утегазе скат геасйоп аззау. к С1ш М1сгоЬю1 31:882-886, 1993], цитомегаловируса [8к1Ьа!а Ό, Майш 7Е Арр1етап МИ, е! а1: Пе!есйоп оР су1отеда1оу|гпз ^NΑ ш репркега1 Ь1оой оР райеп!з шРеаей νίΐΠ !ке китап 1ттипойейаепсу У1гиз. к Шес! И1з 158:1185-1192, 1988], вируса папилломы [Киурегз кМ, Сп1ск1о\\· С7, Сгауй! РЕ, е! а1: Сотрапзоп оР йо! Й1!ег ПуЬг1й1ха(1оп, 8ои!кет йапзРег куЬг1й1хайоп, апй ро1утегазе скат геасйоп Рог й1адпоз1з оР апа1 ки

- 1 006512 тап рарШотау1ги§ шГескоп. 1 Скп М1сгоЫо1 31:1003-1006, 1992]. Спектр возбудителей инфекционных заболеваний человека и разнообразные молекулярные методы, используемые для их идентификации, хорошо представлены в руководствах [Регхшд Ό.Η., Еб. РСК Рго!осо1х Гог Ететдшд 1пГес!юих 01хеахех. 1996. А8М Ргехх, Уахкшд!оп, Регхшд ΌΗ, 8тйк ТЕ, Тепоует ЕС, е! а1 (ебх): П1адпохЕс Мо1еси1аг МктоЫо1оду: Рппар1ех апб Арркса!юпх. УахЫпд1оп, Ό.Ο.. Лтепсап 8ос1е1у Гог М1стоЬю1оду, 1993].

Анализ последовательностей, проводимый с целью родовой/видовой идентификации организмов, предусматривает три основных методических подхода.

1. Амплификация выбранного участка генома с использованием термостабильных ферментов ДНКполимеразы (РСК) [Регхшд Ό.Η., Еб. РСК Рго!осо1х Гог Етегдшд 1пГесЕоих 01хеахех. 1996. А8М Ргехх, Уахкшд1оп, Регхшд ΌΗ, 8тйк ТЕ, Тепоует ЕС, е! а1 (ебх): О1адпохйс Мо1еси1аг МютоЬю1о§у: Ртшар1ех апб Аррксайопх. Уахкшд!оп, Э.С., Атепсап 8оае1у Гог М1стоЬю1оду, 1993] или ДНК-лигазы (ЬСК) [Викептеуег Ь, Аттх1гопд А8: Ргектшагу еуакикоп оГ Не кдахе скат геасйоп Гог хреайс бе!ес!юп оГ №е1ххепа допоггкоеае. 1 Скп МютоЬю1 30:3089-3094, 1992, ЭШе В1, Ви1хеп СС, Викепшеует ЬС: АтрНПсайоп оГ Ск1атуб1а (гаскотакх ΌΝΛ Ьу кдахе скат геасйоп. 1 Скп МютоЬю1 31:729-731, 1993, 1оуапп1хс1 ОМ, У1пп-Эееп Е8: Ыдайоп атркйсайоп апб йиотехсепсе бе!есйоп оГ Мусокааегшт !иЬегси1ох1х Э№А. Мо1 Се11 РгоЬех 7:35-43, 1993] в ходе циклического процесса или изотермическая амплификация с использованием РНК-полимеразы и обратной транскриптазы (ТА8/38К) ΙΌηνίχ СК, Вкппеуег К, П1Мюке1е Ы, е! а1: Ое1ескоп оГ китап шшшпобеПс1епсу У1тих !уре 1 ш АГО8 райеп!х ихшд атр11Псакоп-теб1а1еб кукпбС /акоп апа1ухех: КертобиаЫШу апб диапШайуе кткакопх. 1 1пГес! Όίχ 162:13-20, 1990, Сиа1е1к 1С, ХУкцйе1б КМ, Клток ΌΥ, е! а1: 1хо!кегта1, ш уйто атркПсакоп оГ пис1ею ас1бх Ьу а тЫкеп/уте геасйоп тобе1еб айег гейоуиа1 терксайоп. Ргос №111 Асаб 8а и 8 А 87:1874-1878, 1990, Клток ΌΥ, Όηνίχ СК, ХУкцПе1б КМ, е! а1: Тгапхспркоп-Ьахеб атркПсакоп хух!ет апб бе!ес!юп оГ атркПеб китап хттипобейаепсу уких !уре 1 \νϊθι а Ьеаб-Ьахеб хапб\\'1ск куЬпб1/акоп Готта!. Ргос №111 Асаб 8а и 8 А 86:1173-1177, 1989];

2. Гибридизация геномной или предварительно амплифицированной ДНК на мембранах, ш хйи и на биологических микрочипах [ПиЬйеу 8., Кт11оу Е апб А. Мй/аЬекоу. 1999. Ро1утогрк1хт апа1ух1х апб депе бе!есйоп Ьу ткпхес.|иепск1д оп ап аггау оГ деЕт-штЫк/еб рптегх. №ис1е1с Аабх Кехеагск, Уо1.27, №о.18 (е19), Сшдетах Т.К., С. Скапбоиг, Е. Уапд, А. Вето, Р.М. 8та11, Е. ОгоЬшеьухкт Ό. А11апб, Е. Эехтопб, М. ^^бшу, апб 1. Эгепкоу. 1998. 8^шийапеοих Сепо1уртд апб 8реаех 1бепкПсакоп Ихшд ΗνΠ^ί/акоп Райетп Кесодпйюп Апа1ух1х оГ Сепепс МусоЬааегшт Атгаух. Сепоте Кех., 8: 435-448, Тепоует ЕС: О1адпохйс беохуйЬопис1е1с ааб ргоЬех Гот шГескоих б1хеахех. Скп МютоЬю1 Кеу 1:82-101, 1988, Тотркшх Ь8: №ис1е1с ааб ргоЬех ш 1п£ес!юих б1хеахех, ш Кетшд1оп 18, 8ск\таг1/ М (ебх): Сиггеп! С11шса1 Торюх ш 1пГескоих П1хеахех, уо1 10. Вох!оп, В1асктее11 8аеп!1йс, 1989, рр 174-193, Тгоехск А., Η. №диуеп, С.С. М1уаба, 8. Пехуатеппе, Т.К. Сшдетах, Р.М. Кар1ап., Р. Сгохх, апб С. МаЬйа!. 1999. МусоЬааегшт 8реаех 1бепййсайоп апб ККатрюш Кех1х!апсе Техйпд \\йк Шдк-Эепхйу РгоЬе Аггаух. 1. Скп. М1стоЬю1.,

37: 49-55, ХУо1со11 М1: Абуапсех ш пис1ею ааб-Ьахеб бе!есйоп те!кобх. Скп М1стоЬю1 Кеу 5:370-386, 1992, Υе^хкον, С., Вагхку, V., Ве1доухк1у, А., Кш11оу, Ей., Кгешбйп, Е., 1уапоу, I., Райпоу, 8., Сихскш, Ό., ЭгоЫхкеу, А., ПиЬйеу, 8. & Мк/аЬекоу А. 1996. апа1ух1х апб б1адпохйсх оп окдопис1еойбе тюгосЫрх. Ргос. №а!1. Асаб. 8а. И8А 93, 4913-4918].

3. Определение первичной нуклеотидной последовательности амплифицированного (с помощью обладающих широкой специфичностью праймеров) фрагмента ДНК путем секвенирования [Ке1тап ОА, Ра1ко\у 8: 1беп!Шса!юп оГ ипсикигеб тюгоодашхтх: Ехрапбшд !ке хреагпт оГ скагааеп/еб 1шсгоЫа1 ра!кодепх. 1пГес! Адеп!х Э1х 1:245-253, 1992, Ке1тап ОА, 8скт1б! ТМ, МасОеттой КР, е! а1: 1бепЬПсакоп оГ !ке ипсикигеб ЬасШих оГ ХУк1рр1е'х б1хеахе. N Епд1 1 Меб 327:293-301, 1992, ХУИхоп КЛ, В1йскшд1оп К, Егобппдкат К, е! а1: Рку1одепу оГ УЫрр1е'х-б1хеахе-аххоаа!еб Ьас!е^^иш. Ьапсе! 338:474-475, 1991].

Спектр методов, применяемых для детекции точечных мутаций, представлен гораздо шире. Однако большинство методов так или иначе связано с использованием РСК, что обусловливает как их достоинства, так и их общие недостатки.

1. Достройка цепи меченым дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом [Майк СТ, КогГ I, Υапбе11 МО е! а1. 1999. А депега1 арргоаск !о хшд1е-пис1ео!1бе ро1утогрк1хт б1хсоуегу. №а! Сепе!., Эес;23 (4):452-456].

2. Аллель-специфичная ПЦР |Эе 1ох Моп!егах Ь.Е.Е., 1.С.Са1ап, М.Сийетгех, 8.8атрег, ТЕ.С.Мапп, С.Майш, Е.Поп1пдиех, Ь. бе КаГае1, Р.Вациего, Е.Сοшеζ-Машрахο, апб 1.В1а/цие/. 1998. А11е1е-8реайс РСК Мекюб Вахеб оп рпсА апб охуК 8ес.|иепсех Гот П1хйпдшхкшд Му^асЕйит Ьоу1х Ггош МусоЬас!етшш !иЬегси1ох1х: 1п!тахресШс М.Ьоу1х рпсА 8ес.|иепсе РоктпогрЫхт. 1. Скп. М1стоЬю1. 36:, 239-242].

3. Анализ полиморфизма рестрикционных фрагментов (РСК-КЕЬР Апа1ух1х) [РСК-КЕЬР Ое!ес!юп оГ рош! Ми!а!юпх ш !ке Са!а1ахе-Регох1бахе Сепе (ка!С) оГ Мусокааегшт !иЬегси1ох1х Аххоаа!еб \\йк 1хоша/1б Кех1х!апсе. 1п: РСК Рго!осо1х Гог Етегдшд 1пГес!юих 01хеахех (Ό.Η. Регхшд, Еб.) (1996) А8М Ргехх, Уахкшд1оп, рр. 144-149].

4. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (РСК-88СР АпаР^х) [Ое1дабо М.В. апб А. Те1епк. Ое!ес1юп оГ Екюгос.|шпо1опе Кех1х!апсе Ми!а!юпх ш Мусокааегшт !иЬегси1ох1х. 1п: РСК Рго!осо1х Гог Етегдшд 1пГес!юих 01хеахех (Ό.Η. Регхшд, Еб.) (1996) А8М Ргехх, Уахк1пд!оп, рр. 138143, Рге!огшх С.8., Р.Э. уап Ηе1беη, Е.8йде1, К.О.Е1хепаск апб Т.С.Щс!от. 1995. Ми1аЕопх ш каЮ Сепе 8едиепсех ш 1хоп1а/1б-Рех1х1ап1 Скшса1 1хо1а!ех оГ Мусокааегшт !иЬегси1ох1х Аге Каге. Апйш1сгоЬ. Адеп!х

- 2 006512

С11сто111сг.. 39, 10, 2276-2281, Те1епб, А., Р. 1тЬобеп, Р. Магсбев1, Ό. Ьоубе, 8. Со1е, Μ. 1. СсЮ/оп. Ь. Мабег, К. 8сборГег, апб Т. Вобтег. 1993. Ое/есбоп оГ пГатрт гев1в/апсе ти/абопв ίη МусоЬас/епит 1иЬегси1ов1в. Бапсе/ 341: 647-650].

5. Секвенирование [Кариг, V., Ь.-Ь. Б1, 8. 1огбапе8си, М. В. Натиск, А. ^апдег, В. N. Кге-1вМбЬ,апб

1. М. Мибвег. 1994. СНагас/епха/юп Ьу аи1ота1еб ΌΝΑ ведиепстд оГ ти1абопв т /Не депе (гроВ) епсобтд 1Не ΒΝΑ ро1утегабе Ь внЬшб/ т пГатрт-геЮ/ап/ МусоЬас/епит 1иЬегси1о818 в/гатв Ггот №\у Уогк Сбу апб Техав. 1. С1т М1сгоЬю1. 32:1095-1098].

6. Дидезоксифингерпринтинг (ббР-те/Ноб) [Вув Ρ.Ν. апб Т.А.Ре1т1ее. Ое/ес/1оп оГ ВГГатркт Вев1в1апсе Ми/абопв т МусоЬас/епит /иЬегси1ов1в Ьу О1беоху Етдегрппбпд. 1п: РСВ Рго1осо1в Гог Етегдтд 1пГесбоив П1веавев (О.Н.Регвтд, Еб.) (1996) А8М Ргевв, ^авй1пд1оп, рр. 112-121].

7. ПЦР-гетеродуплексный анализ (РСВ-Ье/егобир1ех апа1ув1в) |\νί11ίηιηβ Ό.Ε., С^.БтЬегв, Б.8рбпд, 8.1ауасбапбга, апб Т.Р. С1Шв. РСВ-Не1егобир1ех Ое/есбоп оГ Вбатрют-Вев1в/ап/ МусоЬас/епит /иЬегси1ов1в. 1п: РСВ Рго1осо1в Гог Етегдтд 1пГесбоив О1веавев (О.Н.Регвтд, Еб.) (1996) А8М Ргевв, ’№авЫпд!оп, рр. 122-129].

8. Метод несовершенного дуплекса с РНК (ΒNΑ пбвта/сН апа1ув1в) [Пгасорой, НС. Еб. Ое/есбоп оГ Ми/абопв Ьу ВМаве С1еахаде. Сиггеп/ Рго1осо1в т Нитап Сепебсв. 1998. 1оНп νίΚχ & 8опв, 1пс, Маг/Н СТ, КогГ I, Уапбе11 МО е/ а1. 1999. А депега1 арргоасН 1о втд1е-пис1еоббе ро1утогрЫвт б1всоуегу. №1/ Сепе!., Эес:23 (4):452-456, МавН, К. А., А. Сау/ап, апб С. В. 1пбегйеб. 1997. Ое/есбоп оГ пГатрт гев1в/апсе ш МусоЬас/епит /иЬегси1ов1в Ьу теапв оГ а гар1б, в1тр1е, апб вресШс ВМА/ВМА пбвта/сН аввау. 1. 1пГес/. ϋίδ. 176: 533-536].

9. Метод структурно-специфичного расщепления нуклеазой (8/гис/иге-вресб1с епбопис1еаве с1еауаде) |Вго\у М.А.О., М.С. О1бепЬигд, V. Буаткбеу, Ь.М. Не1в1ег, Ν. Буатюбеуа, ЕС. На11, N.1. Еадап, б.М. Обуе, Ь.М. 8116/6 Ь. Рогв, апб ЕЕ. ОаЫЬегд. 1996. ОбГегепбабоп оГ Вас/епа1 168 гВМА Сепев апб 1п/егдешс Ведюпв апб МусоЬас/епит /иЬегси1ов1в ка/С Сепев Ьу 8/гис/иге-8рес1бс Епбопис1еаве С1еауаде. 1. С1т. МкгоЬю1., 34: 3129-3137].

10. Метод «обратной» гибридизации ДНК с иммобилизованными на твердой подложке зондами (Бше РгоЬе Аввау (Б1РА)) [Сооквеу, В. С, С. Р. Мог1оск, 8. Сйсктап, апб 1. Т. Сга\\Гогб. 1997. Еуа1иабоп оГ а 1те ргоЬе аввау кй Гог сНагас/епхабоп оГ гроВ ти/абопв т пГатрт-гев1в/ап/ МусоЬас/епит /иЬегси1ов1в 1во1а/ев Ггот №\у Уогк Сйу. 1. С1т. МсгоЬю1. 35:1281-1283, Эе Веепйоиуег, Н., Ζ. БЫапд, V. 1аппев, Ь. МГув, Ь. МасН/еНпскх, В. Вовваи, Н. Тгаоге, апб Р. Рог/ае1в. 1995. Вар1б бе/есбоп оГ пГатрт гев1в/апсе т ври/ит апб Ьюрву вреатепв Ггот /иЬегси1ов1в рабеп/в Ьу РСВ апб 1те ргоЬе аввау. ТиЬегс1е Ьипд Э1в. 76: 425-430].

11. Гибридизация на микроматрицах (НуЬпб1ха/юп оп ткгоаггау) [Стдегав Т.В., С.СНапбоиг, Е. Vаηд, А. Вето, Р.М. 8та11, Р. ОгоЬше\Увкб Ό. А11апб, Е. Оевтопб, М. Но1обпу, апб 1. Эгепкоу. 1998. 81ти1/апеоив Сепо/уртд апб 8реаев 1бепбйсабоп Ивтд НуЬпб1ха/юп Рабет Весодшбоп Апа1ув1в оГ Сепебс МусоЬас/епит ОМА Аггаув. Сепоте Вев., 8: 435-448, ТгоевсН А., Н.Мдиуеп, С.С. М1уаба, 8. Оевуагеппе, Т.В. Стдегав, Р.М. Кар1ап., Р. Сговв, апб С. МаЬба/. 1999. МусоЬас/епит 8реаев 1бепббсабоп апб ВГГатркт Вев1в/апсе Тевбпд уЫа Н1дН-Оепв1/у ОМА РгоЬе Аггаув. 1. С1т М1сгоЬ1о1., 37: 49-55].

При исключительно высокой чувствительности, характерной для классических амплификационных методов (РСВ, ЬСВ, ТА8/38В), главной проблемой является ограниченное количество определяемых продуктов (молекул-мишеней) в одном эксперименте. Мультиплексный вариант амплификации не позволяет определить более 20 продуктов (обычно гораздо меньше), отличается сложностью и громоздкостью подбора праймеров, что, по-видимому, и не позволило данному методу найти широкое применение. В то время как для РСВ-методов стратегия борьбы с переносом ампликонов разработана [С1тто СО, Ме/сНе//е КС, Теввтап IV, е/ а1: Ров/-РСВ в/епбха/юп: А те/Ноб /о соп/го1 саггуохег соп/аттабоп Гог /Не ро1утегаве сбат геасбоп. Мис1ею Ас1бв Вев 19:99-107, 1991, Ьопдо МС, Вегшпдег М8, Нагбеу 1Ь: Иве оГ игасб ОМА д1усову1аве /о соп/го1 саггу-оуег соп/апбпа/юп т ро1утегаве сбат геасбоп. Сепе 93:125-128, 1990], при использовании ЬСВ или ТА8 в диагностических целях система контроля контаминации отсутствует. Серьезной проблемой остается получение и ложноотрицательных результатов, что может быть обусловлено наличием ингибиторов полимеразных реакций в анализируемых образцах.

Методы достройки цепи и аллель-специфичная ПЦР требуют постановки независимых реакций по числу изучаемых мутаций и, соответственно, большого количества изучаемого образца.

Методы анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов и конформационной подвижности одноцепочечной ДНК, ПЦР-гетеродуплексный анализ и метод несовершенного дуплекса с РНК отличаются трудоемкостью, занимают большое количество времени и дают заключение только о наличии/отсутствии мутации, но не ее типе. Последний зачастую обладает самостоятельной прогностической ценностью; в ряде случаев имеется прямая корреляция между типом мутации и уровнем устойчивости к тому или иному антибиотику или тяжестью прогноза течения заболевания.

Методы, основанные на анализе подвижности ДНК, требуют использования электрофореза в полиакриламидном геле, устройств для поддержания заданной температуры в геле и, как правило, радиоактивной метки, что неприемлемо в условиях медицинских диагностических лабораторий. Кроме того, для метода несовершенного дуплекса предъявляются повышенные требования к отсутствию РНК-азы и в

- 3 006512 ряде случаев он не приемлем для детекции дуплекса 6-И.

Основными недостатками метода гибридизации на мембранах и ίη δίΐιι являются низкая чувствительность и высокая трудоемкость. Методу также присуща невысокая производительность и длительность процедуры. Не исключено получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Указанные недостатки служат лимитирующими факторами для широкого применения в медицинских диагностических исследованиях.

Метод «обратной гибридизации» амплифицированного фрагмента ДНК с иммобилизованными на подложке зондами отличается трудоемкостью и высокой стоимостью.

Секвенирование ДНК не нашло широкого применения в повседневной клинической практике из-за высокой стоимости, трудоемкости, необходимости использования дорогостоящего секвенирующего оборудования. Кроме того, прямое секвенирование требует выделения чистой культуры возбудителя.

Методы структурно-специфического расщепления и дидезоксифингерпринтинг требуют стандартизации (подбора условий), что увеличивает трудоемкость. Кроме того, дидезоксифингерпринтинг выполняется с радиоактивной меткой, и разделение продуктов реакции ведется в полиакриламидном геле.

Наиболее близким к заявляемому способу анализа последовательностей НК с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа является описанный ранее метод [Ошдегаз Т.К., О. Ойапбоиг, Е. ^апд, А. Вето, Р.М. 8та11, Е. ОгоЬше\\ъкг Ό. А11апб, Е. Цезтопб, Μ. Ηοίοάηίγ, апб ί. Эгепко\г. 1998. 81ти11апеои8 6епо1уршд апб 8рес1е§ 1бепбДеа!юп Изшд НуЬпб|/абоп Рабет Кееодпйюп Апа1у§18 оЕ Сепенс МусоЬас!егшт ΌΝΑ Аггауз. бепоте Кез., 8: 435-448, Тгоезсй А., Н.Ыдиуеп, С.6.М1уаба, З.Эехуагеппе. Т.К.Отдегак, Р.М.Кар1ап., Р.Сгозз, апб С.МаЬба!. 1999. МусоЬас!егшт 8рес1ез 1беп11Дсабоп апб КЛатрюш КезМапсе ТеЛшд \νί11ι Шдй-Эепзйу ^NΑ РгоЬе Аггауз. 1. С1ш. МкгоЬюк, 37: 49-55], который направлен, в основном, на определение полной последовательности изучаемого фрагмента НК. Метод предусматривает применение нестандартного твердофазного химического синтеза олигонуклеотидов непосредственно на поверхности подложки в сочетании с фотолитографическим способом изготовления микрочипов. Вследствие этого в каждой ячейке такого микрочипа находится не индивидуальный олигонуклеотид, а смесь продуктов синтеза, в которой на долю полноразмерного олигонуклеотида приходится от 25% (при длине 20 нуклеотидов) до 40% (при длине 10 нуклеотидов). Кроме того, близкое расположение иммобилизованных олигонуклеотидов на поверхности микрочипа приводит к тому, что находящиеся в соседних ячейках молекулы олигонуклеотидов могут взаимодействовать друг с другом, а молекула анализируемой НК может одновременно взаимодействовать сразу с несколькими ячейками микрочипа. В результате термодинамика процесса образования дуплексов на микрочипе становится гетерогенной и сильно отличной от термодинамики в гомогенном водном растворе, что драматически снижает дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов на таком микрочипе. Вследствие этого нельзя оганичиться использованием набора только тех олигонуклеотидных зондов, которые необходимы и достаточны для однозначного определения мутаций в известной последовательности ДНК. По этой причине, например, микрочип, позволяющий определять первичную нуклеотидную последовательность фрагмента гро Ь гена М. ШЬегси1о515 длиной 705 п.н., требует наличия 5640 различных олигонуклеотидных зондов. Стоимость производства такого микрочипа очень высока, а для регистрации и интерпретации результатов гибридизации требуется сложное регистрирующее оборудование и математическое обеспечение. Метод гибридизации на микрочипах для определения видовой принадлежности микобактерий требует выделения чистой культуры микроорганизма. Наконец, наличие повторяющихся коротких мотивов или даже достаточно протяженных последовательностей, характерное для многих микроорганизмов, представляет значительные сложности для анализа описанным методом гибридизации на микрочипах.

Данные недостатки устраняются в настоящем изобретении.

Сущность изобретения

Разработан способ анализа последовательностей НК на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды. Биологический микрочип состоит из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр. Разработанный способ включает получение очищенных препаратов олигонуклеотидов, иммобилизацию олигонуклеотидов в объеме трехмерных гидрофильных микроячеек биологического микрочипа, подготовку анализируемого образца, анализ образца путем гибридизации или ПЦР, регистрацию и интерпретацию результатов анализа. В предложенном способе в качестве анализируемого образца используют различные объекты, содержащие нуклеиновые кислоты, включающие очищенные препараты нуклеиновых кислот, чистые и накопительные культуры микроорганизмов и вирусов, клинический материал, выделенный от пациента, и другие образцы естественного происхождения, включая воду, почву, смывы, специально подготовленные пробы воздуха. Указанные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, представленные в клетке как большим, включая рРНК, так и малым числом копий, и ДНК, также представленные в клетке как большим, включая ДНК плазмид, вирусов, транспозонов и мобильных 18-элеменов, так и малым числом копий.

В том случае, когда анализируют известные последовательности НК, предварительно проводят рас

- 4 006512 чет первичной и вторичной структуры олигонуклеотидов, иммобилизуемых в ячейках микрочипа, и выбирают только те из них, которые необходимы и достаточны для однозначной идентификации известных мутаций, полиморфных или аллельных вариантов анализируемых последовательностей, а также для изготовления контрольных ячеек. Если же целью является обнаружение неизвестных мутаций, полиморфных или аллельных вариантов известных последовательностей, а также при анализе неизвестных последовательностей нуклеиновых кислот вместо набора дискриминирующих олигонуклеотидов используют полный набор всех возможных олигонуклеотидов заданной длины.

Для проведения анализа путем гибридизации при выборе дискриминирующих олигонуклеотидов с учетом размера и сложности анализируемой последовательности и, в частности, наличия повторов и протяженных гомополимерных последовательностей определяют длину дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающую их специфичность в отношении анализируемой последовательности. Для каждой позиции, для которой известны мутации, полиморфизм или аллельные варианты, подбирают набор специфичных дискриминирующих олигонуклеотидов, способный выявлять известные замены, делеции и инсерции. Используя компьютерные программы, рассчитывают температуры плавления олигонуклеотидов и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления олигонуклеотидов составлял не более 4-5°С. Избегают таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Положение детектируемых вариабельных нуклеотидов и других нуклеотидных перестроек выбирают по возможности не далее 1-4 нуклеотида от середины соответствующего дискриминирующего олигонуклеотида.

При проведении анализа путем гибридизации подготовка анализируемого образца включает выделение, необязательно фрагментацию, необязательно синтез кДНК, необязательно амплификацию при помощи ПЦР и флуоресцентное мечение указанных нуклеиновых кислот. При анализе рибосомальной РНК подготовка анализируемого образца включает выделение рРНК, фрагментацию выделенной рРНК и ковалентное мечение фрагментированной рРНК флуоресцентной меткой. При анализе РНК, представленных в клетке малым числом копий, подготовка анализируемого образца включает выделение РНК, синтез кДНК на матрице выделенной РНК, амплификацию кДНК с помощью ПЦР, необязательно фрагментацию амплифицированной ДНК и мечение амплифицированной ДНК флуоресцентной меткой. Флуоресцентную метку можно вводить как после ПЦР во фрагментированную амплифицированную ДНК, так и непосредственно во время амплификации с помощью стандартной ПЦР с использованием одного или двух флуоресцентно меченных праймеров с получением двухцепочечного флуоресцентно меченного продукта или с помощью двухстадийной ПЦР, включающей стандартную ПЦР на первой стадии и асимметричную ПЦР с использованием флуоресцентно меченого праймера на второй стадии с получением одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта. При анализе ДНК, представленных в клетке большим числом копий, подготовка анализируемого образца включает выделение указанной ДНК, фрагментацию выделенной ДНК и мечение фрагментированной ДНК флуоресцентной меткой. При анализе ДНК, представленных в клетке малым числом копий, подготовка анализируемого образца включает выделение ДНК, амплификацию выделенной ДНК с помощью ПЦР, необязательно фрагментацию амплифицированной ДНК и мечение амплифицированной ДНК флуоресцентной меткой. Флуоресцентную метку можно вводить как после ПЦР во фрагментированную амплифицированную ДНК, так и непосредственно во время амплификации с помощью стандартной ПЦР с использованием одного или двух флуоресцентно меченных праймеров с получением двухцепочечного флуоресцентно меченного продукта или с помощью двухстадийной ПЦР, включающей стандартную ПЦР на первой стадии и асимметричную ПЦР с использованием флуоресцентно меченого праймера на второй стадии с получением одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта.

Разработанный способ предусматривает анализ образца путем гибридизации на биологическом микрочипе в гибридизационном растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и необязательно дестабилизирующий водородные связи агент, в герметичной гибридизационной камере при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе дискриминирующих олигонуклеотидов. В качестве дестабилизирующего водородные связи агента используют гуанидин тиоцианат, мочевину или формамид.

Регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью регистрирующих устройств на базе широкопольной оптики, оснащенных источником света для возбуждения флуоресценции, или лазерных сканаторов различного типа. При использовании устройств на базе широкопольной оптики изображение микрочипа в люминесцентном свете может быть зарегистрировано при помощи фотопленки или цифрового детектора изображения, например ПЗС-камеры. При использовании лазерных сканаторов регистрация результатов гибридизации может быть осуществлена либо путем сплошного сканирования микрочипа с последующим анализом полученного изображения, либо путем избирательного сканирования только участков микрочипа, на которых расположены ячейки.

Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивностей сигнала в ячейках, выявляющих образование совершенных и несовершенных гибридизационных дуплексов. При проведении анализа с целью определения присутствия специфических последовательностей нуклеиновых кислот интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивностей

- 5 006512 сигнала в ячейках, содержащих специфичные дискриминирующие олигонуклеотиды, и контрольных ячейках, содержащих неспецифичные олигонуклеотиды. При проведении анализа с целью выявления мутаций, полиморфизма или аллелизма генов интерпретацию результатов осуществляют путем сравнения интенсивностей сигналов в ячейках, содержащих дискриминирующие олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям дикого типа, и в ячейках, содержащих дискриминирующие олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям мутантных типов или полиморфных или аллельных вариантов указанных нуклеиновых кислот.

Для проведении анализа с помощью ПЦР при выборе дискриминирующих праймеров устанавливают их специфичность в отношении анализируемой последовательности. Для каждой позиции, для которой известны мутации, полиморфизм или аллельные варианты, подбирают набор специфичных дискриминирующих праймеров, различающихся по своему З'-концу и способных выявлять известные замены, делеции и инсерции. Используя компьютерные программы, рассчитывают температуры плавления праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. Избегают таких праймеров, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления.

При проведении анализа с помощью ПЦР подготовка анализируемого образца включает выделение нуклеиновых кислот и необязательно синтез кДНК. При анализе РНК подготовка анализируемого образца включает выделение РНК и синтез кДНК на матрице выделенной РНК. При анализе ДНК подготовка анализируемого образца включает выделение ДНК.

Разработанный способ предусматривает анализ образца с помощью ПЦР на биологическом микрочипе с использованием пары внешних прямого и обратного праймеров, причем прямой праймер иммобилизован в ячейке биологического микрочипа, а флуоресцентно меченный обратный праймер находится в растворе над микрочипом. Для выявления известных замен, делеций, инсерций и нуклеотидных перестроек анализируемой последовательности разработанный способ предусматривает анализ образца с помощью аллель-специфичной ПЦР на микрочипе, в ячейках которого иммобилизованы прямые дискриминирующие праймеры. Для ускорения анализа на 5-10 циклов за счет эффективной преамплификации анализируемой последовательности в растворе над микрочипом в реакционную смесь может быть добавлен внешний прямой праймер. С целью одновременного обнаружения нескольких последовательностей разработанный способ предусматривает анализ образца с помощью мультиплексного варианта ПЦР, включающего амплификацию каждой анализируемой последовательности своей парой специфичных внешних праймеров, причем прямые праймеры иммобилизуют в соответствующих ячейках микрочипа, а меченные флуоресцентной меткой обратные праймеры находятся в растворе над микрочипом. Для ускорения анализа на 5-10 циклов за счет эффективной преамплификации анализируемых последовательностей в растворе над микрочипом в реакционную смесь могут быть добавлены внешние прямые праймеры. Внешний прямой праймер, используемый для преамплификации, одновременно может служить и дискриминирующим праймером, иммобилизованным в ячейке микрочипа. В качестве дискриминирующих праймеров, иммобилизованных в ячейках микрочипа, для выявления известных мутаций, инсерций, делеций в конкретной позиции анализируемой последовательности также могут быть использованы внутренние прямые праймеры, отличающиеся от внешнего прямого праймера, используемого для преамплификации.

Регистрацию результатов ПЦР осуществляют в процессе проведения ПЦР на микрочипе с использованием оптического регистрирующего устройства, включающего термостатированный столик, оснащенный термоконтроллером, позволяющим осуществлять программируемое циклическое изменение температуры, на который помещают герметичную реакционную камеру, флуоресцентный микроскоп, оснащенный источником света для возбуждения флуоресценции, ПЗС-камеру, компьютер, позволяющий осуществлять постоянный мониторинг флуоресцентного сигнала в процессе проведения ПЦР и преобразование его в цифровой вид, и компьютерную программу для обработки данных.

Интерпретацию результатов ПЦР на микрочипе осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, выявляющих образование специфичного продукта ПЦР. При проведении анализа с целью определения присутствия специфических последовательностей нуклеиновых кислот интерпретацию результатов ПЦР осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, содержащих специфичные дискриминирующие праймеры, и контрольных ячек, содержащих неспецифичные праймеры. При проведении анализа с целью выявления мутаций, полиморфизма или аллелизма генов интерпретацию результатов ПЦР осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, содержащих специфичные дискриминирующие праймеры, соответствующие последовательностям дикого типа, и ячеек, содержащих специфичные дискриминирующие праймеры, соответствующие последовательностям мутантных типов или полиморфных или аллельных вариантов указанных нуклеиновых кислот.

Разработанный способ может быть применен для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, детерминирующих синтез диагностически важных белков, используемых в дальнейшем для диагностики патологических состояний. Способ также может быть использован для обнаружения микроорганизмов и вирусов по специфическим последовательностям нуклеиновых кислот, для детекции точеч

- 6 006512 ных нуклеотидных мутаций, делеций, инсерций, инверсий и транслокаций, для детекции транспозонов и коротких мобильных Ιδ-элементов, для определения вида возбудителя заболевания, выявления генов, детерминирующих синтез токсинов, для определения лекарственной устойчивости возбудителя, определения гомозиготного и гетерозиготного состояния мутаций, для целей эпидемиологического генотипирования. Способ позволяет определять уровни экспрессии известных генов в различных органах и тканях, при различных патологических состояниях на разных стадиях развития организма, а также при различных воздействиях на организм.

Осуществление предложенного способа анализа последовательностей нуклеиновых кислот предусматривает использование набора, включающего биологический микрочип, содержащий соответствующий конкретным задачам специфичный набор иммобилизованных дискриминирующих олигонуклеотидов, и по необходимости - реагенты для выделения образцов НК, реагенты для фрагментации образцов НК, флуоресцентные красители для мечения фрагментированных образцов НК, праймеры, в том числе меченные флуоресцентным красителем, для амплификации и/или мечения образцов НК, реагенты для получения кДНК, буферы для проведения гибридизации на микрочипе и отмывки, буфер и другие реагенты для проведения ПЦР на микрочипе, а также по необходимости - регистрирующее устройство.

На основе предложенного способа анализа последовательностей нуклеиновых кислот на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды, разработаны способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), методом гибридизации на микрочипе, способ обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе способами мультиплексной ПЦР и аллельспецифичной ПЦР, способ обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе и способ обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

На основе предложенного способа анализа последовательностей нуклеиновых кислот на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды, разработан набор для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), методом гибридизации на микрочипе, набор для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину способами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР на микрочипе, набор для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе и набор для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьтса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

На основе предложенного способа анализа последовательностей нуклеиновых кислот на микрочипе, содержащем иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды, разработан микрочип для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), методом гибридизации на микрочипе, микрочип для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину способами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР на микрочипе, микрочип для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе и микрочип для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

На основе предложенного способа анализа последовательностей нуклеиновых кислот на микрочипе, содержащем иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды, разработаны дискриминирующие олигонуклеотиды для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов) методом гибридизации на микрочипе, дискриминирующие олигонуклеотиды для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину способами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР на микрочипе, дискриминирующие олигонуклеотиды для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе и дискриминирующие олигонуклеотиды для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Преимущества способа при использовании микрочипов

Основными преимуществами являются низкая себестоимость проводимого анализа; универсальность изготовления микрочипов с применением стандартных технологий синтеза и очистки олигонуклеотидов; возможность одновременного анализа большого количества последовательностей НК на одном микрочипе; многофункциональное применение (различные типы методик, различные объекты, оба типа нуклеиновых кислот).

Перечень чертежей

Изобретение иллюстрируется 16 чертежами, где приведены:

на фиг. 1 - схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе;

- 7 006512 на фиг. 2 - гибридизационная картина, полученная при анализе последовательности РНК клеток линии НЬ-60 на микрочипе;

на фиг. 3 - гибридизационная картина, полученная при анализе последовательности РНК клеток линии К-562 на микрочипе;

на фиг. 4 - гибридизационная картина, полученная при анализе последовательности РНК клеток линии ΝΒ4 на микрочипе;

на фиг. 5 - расположение олигонуклеотидов по номерам на микрочипе для обнаружения рифампицин-устойчивых штаммов М. ТиЬегси1ок1к;

на фиг. 6 - соответствие между расположением олигонуклеотидов на микрочипе и выявляемыми ими мутациями в аминокислотной последовательности;

на фиг. 7 - соответствие между расположением олигонуклеотидов на микрочипе и выявляемыми ими мутациями в нуклеотидной последовательности (указаны триплеты);

на фиг. 8 - картина, полученная при гибридизации образца, содержащего ДНК штамма М. 1иЬетси1о818 дикого типа, чувствительного к рифампицину;

на фиг. 9 - картина, полученная при гибридизации образца, содержащего ДНК мутантного штамма М. 1иЬегси1о818. резистентного к рифампицину;

на фиг. 10 - картина, полученная при гибридизации образца, содержащего ДНК мутантного штамма М. 1иЬегси1о515, резистентного к рифампицину;

на фиг. 11 - расположение праймеров на микрочипе для проведения ПЦР при детекции генов токсинов и гена резистентности к антибиотикам пенициллинового ряда;

на фиг. 12 - принципиальная схема ПЦР и аллель-специфичной ПЦР для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе;

на фиг. 1 3 - накопление флуоресцентного сигнала в ячейках микрочипа, содержащих специфические праймеры к фрагментам гена рад4 и кЫ, в процессе амплификации образцов, содержащих гены рад4 (А) или 8111 (Б);

1. накопление сигнала в ячейке, содержащей праймер к фрагменту рад4;

2. накопление сигнала в ячейке, содержащей праймер к фрагменту 8111;

ось ординат - интенсивность флуоресценции, у.е.;

ось абсцисс - амплификационные циклы.

На фиг. 1 4 - картина ПЦР-амплификации на микрочипе;

А. Амплификация образца, содержащего ген протективного антигена В. ап111гас18 и ген устойчивости к ампициллину.

Б. Амплификация образца, содержащего ген устойчивости к ампициллину и ген, детерминирующий синтез шигеллезного токсина.

Стрелками показан положительный результат ПЦР.

На фиг. 15 - картина ПЦР на микрочипе, детектирующем точечные мутации в гене гроВ М. 1иЬетси1о818;

На фиг. 1 6 - схема расположения праймеров в ячейках микрочипа для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1 методом аллель-специфичной ПЦР (I) и результаты ПЦР (II), полученные при анализе препаратов, содержащих: А - ДНК, не имеющую мутаций; Б - ДНК, имеющую мутацию (С>Т) в гомозиготном состоянии; В -ДНК, имеющую мутацию (С>Т) в гетерозиготном состоянии.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

I. Общие принципы создания диагностического микрочипа для анализа последовательностей НК.

Диагностический микрочип создается по следующей схеме.

1. Выбирают специфические последовательности НК (молекулы-мишени) для детекции или дискриминации при помощи микрочипа.

2. Выбирают тип анализируемой НК (РНК или ДНК).

3. Исходя из особенностей локализации вариабельных участков, типа изучаемого объекта и с учетом специфических требований, предъявляемых к микрочипу (времени проведения анализа, прогностической значимости положительных и отрицательных результатов и др.), решают, какой из подходов (гибридизационный или ПЦР и ее варианты) является оптимальным для анализа выбранной последовательности НК.

4. По необходимости выбирают специфические наборы олигонуклеотидов (праймеров) в сответствии с пунктами, изложенными в разделе «Выбор олигонуклеотидов для анализа последовательностей НК при помощи микрочипа».

5. Выбирают способ выделения НК и ее последующей подготовки для анализа при помощи микрочипа (см. раздел «Обработка изучаемого образца»).

Выбор специфических последовательностей НК (молекулы-мишени) для детекции или дискриминации при помощи микрочипа

В каждом конкретном случае выбор молекулы-мишени для анализа при помощи микрочипа определяется конкретной задачей. Например, для видовой диагностики микроорганизмов целесообразно использовать последовательности генов рибосомальной РНК, которые секвенированы для большого числа

- 8 006512 микрорганизмов и которые широко используются в геносистематике. При определении устойчивости микроорганизма к антибиотику естественно анализировать последовательности тех генов, которые вовлечены в механизм устойчивости, если таковые известны.

Принципы выбора типа нуклеиновой НК для анализа на микрочипе

Выбор типа НК - РНК или ДНК для анализа на микрочипе диктуется специфическими свойствами содержащего эти НК объекта. В том случае, когда объект содержит только РНК или ДНК, как, например, некоторые вирусы, выбор является однозначным.

Использование РНК оправдано тогда, когда дифференциально анализируют экспрессию тех или иных генов в разных тканях или органах или на разных стадиях дифференцировки в одной и той же ткани, или, например, активаторов или супрессоров при раковой трансформации клеток. При злокачественных заболеваниях крови (лейкозах) также целесообразно анализировать последовательности и-РНК, поскольку в данном случае не только может быть получена информация об образовании в клетке химерных транскриптов в результате произошедших хромосомных транслокаций, но и однозначно установлено, какие гены и по какому положению оказываются слитыми. В таком случае используют обратную транскрипцию для получения кДНК, которую затем амплифицируют с помощью ПЦР.

В настоящее время при проведении филогенетического анализа и установлении таксономического положения того или иного микроорганизма принято использовать последовательности рибосомальной РНК (рРНК) - 58, 168, 238 и спейсерных участков. При наличии такой информации в международных базах данных подобный же подход может быть реализован и с использованием микрочипов. В связи с тем, что рРНК в клетках микроорганизмов представлена большим числом копий, отпадает необходимость в предварительной амплификации таких последовательностей с помощью, например, ПЦР, и выделенный препарат рРНК после соответствующей стадии флуоресцентного мечения может быть прямо использован для анализа с помощью микрочипов.

Вследствие крайней нестабильности РНК к действию РНКаз ко всем манипуляциям с РНК предъявляются чрезвычайно жесткие требования. В частности, выделяется специальная чистая от РНКаз зона лаборатории со специально зарезервированным для работы с РНК набором автоматических пипеток, расходных материалов, реактивов и т. д. Все растворы готовятся на специально обработанной для необратимой инактивации РНКаз воде или же подвергаются деконтаминации диэтилпирокарбонатом.

В отличие от РНК, манипуляции с ДНК не требуют таких предосторожностей, поэтому во всех прочих случаях для анализа последовательностей нуклеиновых кислот предпочтительно использовать ДНК.

Выбор олигонуклеотидов для анализа последовательностей НК при помощи микрочипа

При использовании гибридизационной техники олигонуклеотиды для создания микрочипа подбирают, используя следующие критерии:

а) с учетом размера и сложности анализируемой последовательности (наличие повторов, протяженных гомополимерных участков) выбирают длину дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающую их специфичность в отношении анализируемой последовательности; обычно используют олигонуклеотиды длиной 15-23 нуклеотида; в случае, когда для анализа используется амплифицированный фрагмент ДНК длиной не более 150-200 оснований, минимальный размер специфических дискриминирующих олигонуклеотидов может быть уменьшен до 12;

б) для каждой позиции, для которой известны мутации, полиморфизм или аллельные варианты, подбирают набор специфических дискриминирующих олигонуклеотидов (СНО), способный выявлять известные замены, делеции и инсерции;

в) для одновременного анализа сразу нескольких полиморфных сайтов количество СНО соответствует количеству анализируемых сайтов;

г) каждый выбранный СНО должен обладать уникальной специфичностью в отношении изучаемого участка последовательности нуклеиновых кислот;

д) используя компьютерные программы, рассчитывают температуры плавления олигонуклеотидов для каждого из выбранных СНО;

е) варьируя длину дискриминирующих олигонуклеотидов, добиваются того, чтобы разброс температур плавления олигонуклеотидов внутри СНО и между различными СНО не превышал 4-5°С;

ж) избегают таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления;

з) детектируемые вариабельные нуклеотиды и другие нуклеотидные перестройки должны по возможности приходиться на 1 -4 положение от середины соответствующего дискриминирующего олигонуклеотида; допускается располагать вариабельный нуклеотид ближе к тому или иному концу, но не ближе 6-й позиции от конца; в некоторых случаях именно такая локализация вариабельного основания обеспечивает наилучшую дискриминацию между совершенным и несовершенным дуплексами, хотя абсолютная интенсивность гибридизационных сигналов заметно снижается, что не позволяет регистрировать результаты простым фотографирующим устройством.

При использовании ПЦР и ее модификаций на микрочипе дискриминирующие олигонуклеотиды для его создания подбирают согласно следующим критериям:

а) для каждой позиции, для которой известны мутации, полиморфизм или аллельные варианты,

- 9 006512 подбирают набор специфических дискриминирующих праймеров, различающихся только по своему 3'концу, способный выявлять известные замены, делеции и инсерции;

б) каждый выбранный набор олигонуклеотидов (СНО) должен обладать уникальной специфичностью в отношении изучаемого участка последовательности НК;

в) температура плавления праймеров при проведении реакции на микрочипе выбирается выше, чем при аналогичной ситуации в пробирке; оптимальной представляется температура плавления выше 65°С;

г) длина олигонуклеотидов, выполняющих роль праймеров, определяется выбранной температурой плавления и их последовательностью;

д) используя компьютерные программы, рассчитывают температуры плавления дискриминирующих праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления праймеров внутри набора не превышал 3-4°С;

е) для одновременного анализа сразу нескольких полиморфных сайтов количество специфических наборов олигонуклеотидов соответствует количеству анализируемых сайтов;

ж) при использовании аллель-специфичной ПЦР на микрочипе возможен выбор праймеров, комплементарных любой из двух цепей анализируемой ДНК; следует избрать ту цепь, праймеры на которую не формируют шпилек в области своего З'-конца;

з) праймеры для проведения ПЦР на микрочипе следует выбрать так, чтобы размер амплифицируемого фрагмента составлял 70-250 пар оснований (п.о.); амплификация более длинных фрагментов увеличивает время проведения реакции, в то время как более короткие ампликоны не позволяют контролировать специфичность реакции с помощью флуоресцентно меченного зонда, комплементарного к внутреннему участку достроенного в гелевой ячейке праймера;

е) избегают таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления.

Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΡΝΛ зугИйеб/ег (Аррйеб Вю8у81еш8, И8А) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Для синтеза олигонуклеотидов для гибридизационного микрочипа использовали 3'Ашшо-МобЖег СЗ (или С7) СРС 500 (С1еп Кезеагсй, И8А), так что синтезированный олигонуклеотид содержал на своем 3'-конце спейсер со свободной аминогруппой. Олигонуклеотиды, используемые для проведения ПЦР на микрочипе, модифицировали по 5'-концу при помощи 5'-Ашшо-Моб1йег С6 (или С12) (С1еп Кезеагсй, И8А).

Микроматрица, содержащая ячейки размером 100x100x20 мкм, приготовлена путем фотополимеризации 5%-го полиакриламидного геля, как описано ранее [Уегзйоу. С., Вагзку, V., Ве1доубк1у, А., Кш11оу, Ей., Кгешбйп, Е., 1уапоу, I., Рагшоу, 8., Сибсйьп, Ό., БгоЫбйеу, А., БиЫ1еу, 8. & Мй/авеком, А. 1996. ^NΑ апа1у818 апб бьадпозбсб оп ойдопис1ео11бе шкгосЫрб. Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 93, 4913-4918].

Гель активировали 2% трифторуксусной кислотой при комнатной температуре в течение 10 мин, отмывали водой и высушивали. Далее гель последовательно обрабатывали в Кере1-811апе (2% раствор (вес/объем) диметилдихролсилана в 1,1,1 -трихлорэтане, ЬКВ-РгобикЬег АВ, 8\гебеп) - 30 с; дихлорметаном - 10 с; этанолом (95 об.%) - 10 с; промывали водой - 3 мин и высушивали.

1мМ раствор олигонуклеотидов наносился иглой робота дважды в объеме 1 нл. Для стабилизации ковалентных связей между аминогруппами спейсеров, фланкирующих один из концов олигонуклеотидов, и альдегидными группами геля матрицу помещали в 0.1 М раствор пиридинборанового комплекса (А1бг1сй Сйеш1са1 Со., И8А) в хлороформе, наслаивали верхнюю водную фазу и выдерживали 12-16 ч при комнатной температуре. Далее микрочип дважды промывали этанолом (95 об.%) и водой. Непрореагировавшие альдегидные группировки восстанавливали свежеприготовленным раствором 0,1 М NаВΗ₄ (А1бг1сй) в течение 20 мин при комнатной температуре. Микрочип промывали водой, высушивали и хранили при комнатной температуре.

Подготовка анализируемого образца

В качестве первичного образца для анализа последовательности используют очищенные препараты НК, а также чистые и накопительные культуры микроорганизмов и вирусов, клинический материал, полученный от пациентов, другие образцы естественного происхождения, включающие воду, почву, смывы, образцы проб воздуха.

В зависимости от характера образца, содержащего НК, и наличия примесей, присутствующих в образце, проводится специализированная обработка пробы с целью обеспечения доступа к НК и удаления примесей, могущих мешать проведению анализа при помощи микрочипа.

В зависимости от подхода, который будет в дальнейшем использован, и типа НК применяют следующие способы подготовки образца к проведению анализа на микрочипе:

а) выделение НК (ДНК или РНК), фрагментация и флуоресцентное мечение для последующей гибридизации на микрочипе;

б) выделение РНК, представленной малым числом копий в клетке, получение кДНК в реакции обратной транскрипции и амплификация ДНК при помощи ПЦР; введение флуоресцентной метки может

- 10 006512 осуществляться одновременно с проведением амплификации путем добавления в реакционную смесь одного или обоих флуоресцентно меченных праймеров или же после фрагментации амплифицированной ДНК; еще один способ состоит в проведении двухстадийной ПЦР: на первой стадии проводится стандартная ПЦР, на второй стадии с целью получения одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта проводится асимметричная ПЦР с использованием праймера, содержащего флуоресцентную метку; полученный одним из описанных выше способов флуоресцентно меченный продукт используется для гибридизации на микрочипе;

в) выделение ДНК и ее амплификация при помощи ПЦР; введение флуоресцентной метки может осуществляться одновременно с проведением амплификации путем добавления в реакционную смесь одного или обоих флуоресцентно меченных праймеров или же после фрагментации амплифицированной ДНК; еще один способ состоит в проведении двухстадийной ПЦР: на первой стадии проводится стандартная ПЦР, на второй стадии с целью получения одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта проводится асимметричная ПЦР с использованием праймера, содержащего флуоресцентную метку; полученный одним из описанных выше способов флуоресцентно меченный продукт используется для гибридизации на микрочипе;

г) выделение РНК и синтез кДНК в реакции обратной транскрипции; полученная кДНК используется для анализа при помощи ПЦР на микрочипе;

д) выделение ДНК для проведения ПЦР на микрочипе.

Способы анализа последовательностей НК на микрочипе

Анализируемый препарат НК, полученный, как описано в разделе «Подготовка анализируемого образца», используют для проведения следующих реакций на микрочипе:

а) метод РНК-дезоксиолигонуклеотид гибридизации, который может быть использован, например, для идентификации микроорганизмов по различиям в последовательностях 58, 168, и 238 РНК и спейсерных регионов, а также для определения точечных мутаций в РНК изучаемого объекта;

б) метод ДНК-дезоксиолигонуклеотид гибридизации, который может быть использован для анализа последовательностей НК, детермиинирующих синтез диагностически важных белков; идентификации точечных мутаций и различных перестроек в последовательности ДНК (делеции, инверсии, инсерции, транслокации); определения транспозонов и коротких мобильных элементов (18-элементов); дифференциального анализа экспрессии генов;

в) метод аллель-специфичной ПЦР на микрочипе и ее модификации, который может быть использован для одновременного определения точечных мутаций, находящихся в одном или различных участках анализируемой НК;

г) метод мультиплексной ПЦР на микрочипе, который может быть использован для одновременного анализа сразу нескольких последовательностей НК, детерминирующих синтез диагностически важных белков; различных перестроек в последовательности НК (делеции, инверсии, инсерции, транслокации); транспозонов и коротких мобильных элементов (18-элементов);

д) дополнительный контроль специфичности амплификации можно осуществлять путем гибридизации флуоресцентно меченных обратного праймера или зонда, комплементарного внутреннему участку цепи, достроенной в ходе ПЦР с иммобилизованного в ячейке микрочипа прямого праймера.

Регистрация и интерпретация результатов анализа

В зависимости от типа проведенной реакции могут быть использованы различные способы регистрации результатов.

1. Регистрацию гибридизационной картины проводят с помощью регистрирующих устройств на базе широкопольной оптики, включающих источник света для возбуждения флуоресценции и оборудование для регистрации флуоресцентного сигнала. В простейшем случае гибридизационная картина может быть зарегистрирована при помощи фотопленки. Более совершенным является использование цифрового детектора изображения, например ПЗС-камеры, в качестве оборудования для регистрации флуоресцентного сигнала. Примером использования такого оборудования является автоматический комплекс, состоящий из флуоресцентного микроскопа, 512x512 ПЗС-камеры (3x3 мм² поле зрения) и компьютера. Для регистрации и последующей обработки изображений применяют программу ^ίηνίοη (Ргшсе1опе 1и81гитеи18, И8А), обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят при помощи программ, использующих Γ;·ιόνΐΕ\ν интерфейс (Νηΐίοηηΐ 1п81гитеп18, И8А).

2. Регистрацию гибридизационной картины можно также проводить с использованием лазерных сканаторов различного типа. Одним из вариантов является сканирование всей поверхности микрочипа с последующим анализом полученного изображения. Другим вариантом является избирательное сканирование только тех участков микрочипа, на которых расположены ячейки.

3. Регистрацию результатов, полученных с применением ПЦР, проводят на автоматическом комплексе, подобном тому, что используют для регистрациии гибридизационной картины. Помимо флуоресцентного микроскопа, 512x512 ПЗС-камеры (3x3 мм² поле зрения) и компьютера, такой комплекс включает оснащенный термоконтроллером термостатированный столик, что позволяет осуществлять программируемое циклическое изменение температуры в помещенной на столик герметичной реакционной камере. При этом регистрацию результатов проводят по ходу реакции, что позволяет получить до- 11 006512 полнительную информацию, например, в случае аллель-специфичной ПЦР.

Интерпретацию результатов гибридизации проводят следующим образом. Визуально или с использованием программного обеспечения сравнивают интенсивности сигналов ячеек, выявляющих образование совершенных и несовершенных гибридизационных дуплексов. Когда целью анализа является определение той или иной специфической последовательности, сравнивают интенсивности сигналов ячеек, содержащих специфические в отношении этой последовательности дискриминирующие олигонуклеотиды, по сравнению с контрольными ячейками, содержащими неспецифические олигонуклеотиды. Когда целью анализа является выявление мутаций, полиморфизма или аллелизма генов, сравнивают интенсивности сигналов ячеек, содержащих дискриминирующие олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям дикого и мутантного типов или полиморфным или аллельным вариантам анализируемой последовательности. Сопоставление интенсивностей сигналов проводят только между теми ячейками, которые содержат иммобилизованные дискриминирующие олигонуклеотиды, принадлежащие одному и тому же СНО и предназначенные для анализа единичного вариабельного нуклеотидного остатка или делеции, инсерции или инверсии. Нуклеотидную последовательность изучаемого образца считают строго комплементарной тому олигонуклеотиду, который иммобилизован в ячейке, обладающей максимальной интенсивностью сигнала. Аналогичным образом проводят сравнение интенсивностей сигналов для других локусов изучаемого образца. Обобщая результаты анализа различных локусов, выдают заключение о наличии мутаций или специфических нуклеотидных последовательностей в изучаемом образце нуклеиновых кислот.

Сходным образом интерпретируют результаты, полученные с применением ПЦР. Отличие заключается в том, что вместо гибридизации иммобилизованного в ячейке олигонуклеотида с фрагментом НК изучаемого образца в гелевых ячейках происходит реакция амплификации ДНК, в результате которой и иммобилизованный прямой праймер, и находящийся в растворе обратный флуоресцентно меченный праймер достраиваются, образуя ампликон специфического размера, который по сути представляет собой аналог гибридизационного дуплекса. Существуют дополнительные методы контроля специфичности достраивания иммобилизованного праймера, основанные на гибридизации его после проведения ПЦР либо с меченым обратным праймером, либо с меченым внутренним зондом.

Примеры

Приведенные далее примеры являются предпочтительными, предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не должны стать основанием для ограничения объема притязаний заявителя. Специалист в данной области техники без труда найдет возможности иных воплощений изобретения, безусловно, подпадающих под притязания заявителя, отраженные в формуле изобретения, приводимой ниже.

Пример 1. Идентификация хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), методом гибридизации на биологическом микрочипе.

Пример показывает применение способа гибридизации на биологическом микрочипе для анализа последовательности РНК с целью идентификации хромосомных транслокаций и верификации последовательности в точке слияния генов, участвующих в транслокации.

Клинический образец костного мозга или периферической крови подвергается гемолизу с целью выделения лейкоцитов, из лейкоцитов выделяют РНК, проводят реакцию обратной транскрипции, полученный образец кДНК используют как матрицу в ПЦР. Двухцепочечный продукт ПЦР фрагментируют ДНКазой I, включают флуоресцентно меченные аналоги дезоксинуклеотидтрифосфатов с помощью терминальной трансферазы и используют в гибридизации.

Фрагментированный и меченный продукт гибридизуют на микрочип, содержащий олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации, как из смысловой так и из антисмысловой цепей.

Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы с соответствующими олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек микрочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на микрочипе, определяют какие гены участвуют в транслокации, а также определяют последовательность в точке слияния этих генов.

Олигонуклеотидный микрочип для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях крови.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΡΝΑ 8уп111еДхег (Аррйей ВюкуДешк, И8А ) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержал спейсер со свободной аминогруппой, который вводился в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования З'-Атшо-МойЖет С7 СРС 500 (с1еи Кекеатей, И8А).

Микрочип был изготовлен как описано в п. «Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа».

- 12 006512

Структура микрочипа для идентификации хромосомных транслокаций при злокачественных заболеваниях крови.

Микрочип содержал 31 тип иммобилизованных олигонуклеотидов, список которых представлен в табл. 1. Схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе приведена на фиг. 1. Левый вертикальный ряд включал олигонуклеотиды гена АБЬ, который служил позитивным контролем для определения качества препарата РНК, эффективности процедуры обратной транскрипции, фрагментации и мечения пробы. В горизонтальных рядах ячеек располагались олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, вовлеченных в транслокации. Набор олигонуклеотидов в горизонтальном ряду для каждой транслокации включал олигонуклеотид из участка гена, входящего во все варианты химерных транскриптов для данной транслокации, далее олигонуклеотиды - последовательности в точке слияния, причем половина нуклеотидов в данном олигонуклеотиде принадлежала одному гену, вторая - другому гену, участвующему в транслокации. Для каждого олигонуклеотида был также синтезирован вариант, содержащий в середине две однонуклеотидные замены. Такие олигонуклеотиды обозначены на фиг. 1, как т.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, используемые в гибридизации. Знаками (+) и (-) обозначена принадлежность к смысловой и антисмысловой цепи, соответственно. Химерные олигонуклеотиды, представляющие собой последовательности из точки слияния, обозначены добавлением _) к названию олигонуклеотида.

ТИП ’ тпанслокащш	ген	Вариант слияния	обозначение олигонуклеотида	последовательность от 5’ к 3’
норма	АВЕ		АЯЫ(-)	ТСТАСТГССТТСССАСССАСССТГО
1(9:22) Ь3/а2 Ь2/а2	век		СМЦ-)	АОТТТСАСАСАСОАОТТООТСАОСА
СМЦ+)	ТССТОАССААСТСОТОТОТОАААСТ
векАВЕ	Ь3/а2	СМЕ-С(-)	ССТОААОСОСТТТТОААСТСТОСТТ
СМЕ-С(+)	ААССАСАСТТСАЛААССССГГСАОС
Ь2/а2	СМЬ-В(·)	ССТСААССКК.’ТТСП'ССГГАТТСАТ
€ΜΕ·Ώ(+)	АТСААТААСОААОААССССТТСАОС
1(9;22) е1/а2	ВСЯ		ЛЕЕ (9;22) (-)	АСАТСТ6ССС06ТСТТОСООАС6СС
ΑΖΖ (9;22Х+)	(ЗССОТССССААСАССССССАСАТС
ВСЯАВЕ	е1/а2	ΑΕΕί(-)	ССТСААССССТТСТОССТСТССАТС
АЕЕК+)	САТСОАОАСОСАОААОСССТТСАСС
ί(4;11)	АР4		АР4(-)	ТАОСгССТ АТОТАТТОСТОТСАААОО
АР4(+)	ССТТТОАСАОСААТАСАТАСОССТА
МЬЕ- АР4	е10/е4	АРЩ-)	ССАОТАССТСТССТТАААОТССАСГ
АГЩ+)	АСТССАСТТТААССА6АССТАСТСС
е10/е5	АР]2(-)	АТОООТСАТТТССТТАААОТССАСТ
АР)2(+)	АОТООАСТТТААООАААТОАСССАТ
е10/е4*	АР]3(-)	АТТСОАОТАООТСТТАААОТССАСТ
АР]3(+)	АОТООАСТТТААОАССТАСТССААТ
ί(15;17)	ВАКА		КАКА(-)	А Л С ОСТТОТ АО АТ ОС О ОС ОТ АО АОС
КАКА(+)	ССТСТАССССССАТСТАСААСССТТ
РМЕ КАКА	5-ίοπη (Ьсг 3)	КАКАЩ-)	ОСОТСТСААТСССТТТССССТССОТ
ВАВАЩ+)	АСССЛСООСАААОССАТТСАСАССС
Ь-ίοπη (Ьсг 1)	КАВА]2()	6ООТСТСААТСССТСССТССССООС
КАКА]2(+)	ОССООСОАСОСАОССАТТСАОАССС
1(12:21)	Ами		ТЕЦ-)	ААСОССТСОСТСАТСТТОССТО6СС
ТЕЦ+)	6СССАСОСААОАТОАОСОАООСОТТ
ТЕЕΑΜΕΙ	1уре 1	ТЕЕЦ(.)	СААОТАТ6САТТСТОСТАТТСТССС
ΤΕΕΪΚ+)	ССОАОААТАОСАОААТ6САТАСТТО
(уре2	ТЕЦ2(-)	ТСОТССТООСЛТСТОСТАТТСТССС
ТЕЕ}2(+)	ОСОАОААТАОСАОАТОССАОСАСОА

Микрочип способен анализировать 4 типа транслокаций и суммарно 10 вариантов слияния между генами, участвующими в транслокациях.

Обработка клеточных линий или клинического образца.

1. Использовали следующие клеточные линии, несущие специфические хромосомные транслокации: К-562, МУ-4-11, ΝΒ4, ВЕН. Клетки выращивали на среде ΒΡΜΙ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. За 18 часов перед выделением РНК клетки рассевали в концентрации 500 000 клеток/мл.

2. Клинический образец (костный мозг или кровь), предварительно смешанный с антикоагулянтом (не гепарином!), подвергали гемолизу в растворе 0,8 % ΝΗ₄ί.Ί и последующему центрифугированию в течение 20 мин при 3000 об/мин для выделения фракции лимфоцитов.

- 13 006512

3. Выделение РНК проводили по общепринятой методике экстракцией кислым фенолом или с помощью набора реактивов «ΡΝΛςυοουδ» фирмы «ЛтЬюп». И8Л.

Получение кДНК и амплификация химерных транскриптов методом двухраундовой мультиплексной «пек1еб»-ПЦР с целью наработки двухцепочечного фрагмента гибридного гена, специфичного для каждой транслокации.

4. Перед проведением обратной транскрипции препарат РНК обрабатывали ДНКазой I (01Ьсо. ВВБ) по стандартной методике для удаления примеси ДНК. РНК (2-4 мкг) инкубировали при 70°С в течение 5 мин со смесью специфичных для указанных транслокаций кДНК-праймеров (10 пкмоль каждого ) и затем проводили обратную транскрипцию с ферментом 8ирегкспр1 II. 01Ьсо ВВБ в количестве 200 ед. на 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 ед. ингибитора РНКазы ( Впаке шЫЬйот. ЛтЬюп. ϋδΆ), по 1 тМ каждого из 4ΝΤΡ (Рготеда), 10 мМ дитиотрейтол, 50 мМ Трис-НС1, рН 8.3, 75 тМ КС1 и 3 мМ МдС1₂ при 42°С в течение 1 ч.

5. В 25 мкл ПЦР-смеси первого раунда вносили 1 мкл образца, полученного в п.4. Состав ПЦРсмеси: 67 мМ Трис- НС1, рН 8,6, 16,6 мМ (ΝΗ₄)₂δΟ, 0,01% Тритон Х-100, 1,5 мМ МдС1₂, 0,2 мМ каждого из 4ΝΤΡ (Рготеда. ϋδΆ), смесь праймеров первого раунда (Табл. 2) по 5 пмоль каждого и 1.5 единицы фермента Тас.|-полимераза фирмы «Силекс» (Россия). Всю смесь нагревали при 94°С в течение 5 мин, затем проводили 25 циклов амплификации по следующей схеме: 94°С - 30 с, 58°С - 30 с, 72°С - 1 мин.

6. В 100 мкл ПЦР-смеси второго раунда вносили 5 мкл продукта первого раунда ПЦР. Состав ПЦРсмеси был тот же, что и в первом раунде, с той разницей, что вместо праймеров первого раунда в реакцию брали смесь праймеров второго раунда (табл. 2) по 12,5 пмоль каждого и 5 единиц фермента Тас.|полимераза фирмы «Силекс» (Россия). Последовательности праймеров первого и второго раунда были взяты из работы [РаШкдаатб N.. Нок1апб Р.. Викко] Ό. С, е! а1. 1998. МиШр1ех теуетке (гапкспрЦопро1утегаке скат геасйои £от кшшкапеоик кстеепшд о£ 29 1тап81оса1юпк апб скготокота1 аЬеттабопк ίπ аси!е 1еикет1а. В1ооб. 92: 574-588], см. также табл. 1. Условия реакции были те же, что и в п.5, но после 25 циклов амплификации следовал этап достраивания цепи при 72°С в течение 10 мин.

7. Еще 1 мкл продукта обратной транскрипции из п.4 использовали для параллельной амплификации фрагмента гена ЛВЬ, постоянно экспрессирующегося в любой культуре. Амплификацию фрагмента гена ЛВЬ проводили в 100 мкл ПЦР-смеси того же состава, что и п.5, вместо праймеров второго раунда добавляли праймеры, специфичные для гена ЛВЬ: ЛВЕ5' (5'ТТСЛ6СС6ССЛ6ТЛ6СЛТСТОЛСТТ3') и ЛББЗ' (5'Л6ЛТЛСТСЛ6С66СЛТТО3'). 25 циклов амплификации были проведены: 94°С - 30 с, 58°С -30 с, и 72°С - 1 мин; и заканчивались стадией достраивания цепи при 72°С в течение 7 мин.

Фрагментация и мечение двухцепочечного ПЦР-продукта.

8. Продукт второго раунда мультиплексной ПЦР из п.6 и продукт ПЦР из п.7 смешивали и очищали на колонке О^сцпск РипПсабоп Кй (01адеп. И8Л). Очищенный ПЦР- продукт фрагментировали с помощью фермента ДНКазы I ( 01Ьсо. ВВБ). Фрагментацию проводили в 40 мкл буфера, содержащего 40 мМ

Таблица 2. Праймеры, используемые для проведения мультиплексной ПЦР

Тип транслокации	прямые праймеры	обратные праймеры
название	Последовательность от 5’ к 3’	название	последовательность от5* к 3’
1(9;22)
1 раунд	ВСК:1698и19	СОСТСТСССТСОСАОААСТ	АВЬ: 6611.23	ТТТГОСТТТбСССТГСАСАС
	ВСК:3060и23	ОАОТСААСССТОСТ6СТТАТОТС
2 раунд	ВСЯ:17771119	АСТОСССООТТСТСОТОТС	АВЬ:642Ь23	АСАССАТТССССАТТОТОАТТАТ
	ВСВ:3128и22	САСОТТССТОАТСТССТСТОАС
К4;11)
1 раунд	№±.37301120	СССССТСА6ССАССТАСГАС	АГ4:1636±29	СААТТТОАОТОАОТТТТТОААСАТСТАТС
	МЪЪ:39551124	АССАСТСТСГССААТ6ССААТАСТ
2 раунд	МЬЬ.37511120	ССАСССССААСААААОАА6Т	АГ4:1606125	СТТТТТООТТТСЗОСТТАСАОААСТ
	М1±:39961124	АОСАОАТООАСТССАСАООАТСАО
Й15;17)
1 раунд	РМЬЗ:121ИЛ9	СААОАААСССАОСССАОАО	ВАВА:540и9	ААОСССТТОСАОСССТСАС
	РМ±3:861Ш9	ОТОССССАСОТООТАОСТС
2 раунд	РМЬЗ :13701121	СССАОТОТАСОССТТСТССАТ	КАКА:508Ь22	СССАТАОТООТА6ССТОАСОАС
	РМЬЗ:930Ч20	СА6ССССАСТАСОАООАОАТ
1(12;21)
1 раунд	ТЕ1.:8711123	САСГССОТСОАТТТСАААСАОТС	АМЫА:1891Ь23	А6ССОАОТАОТТТТСАТСАТТСС
2 раунд	ТЕЕ:9441123	СГСАТСССОААОАССТСССТТАС	АМЕ1А:1772Ь21	А6САСООА6САСАООААОТТО

Трис- НС1, рН 8,0, 55 мМ КС1 и 2 мМ МдС1₂ с добавлением 0,04 ед. фермента на каждые 2 мкг

- 14 006512

ПЦР-продукта. Фрагментация проводилась при 37°С в течение 20 мин с последующей инактивацией при 70°С в течение 10 мин. При этом основная часть фрагментов должна была иметь длину 50-100 п.о.

9. Флуоресцентное мечение продукта проводили с помощью фермента терминальная трансфераза (Рготеда. И8А). Для этого к 40 мкл продукта из п.8 добавляли реакционную смесь, содержащую 100 мМ какодилатного буфера, рН 6,8, 1 мМ СаС1₂, 0,1 мМ дитиотрейтол, 450 пмоль флуоресцентно меченного нуклеотида тетраметилродамин-6-дУТФ ( ΝΕΝ, И8Л ) и 10 ед. терминальной трансферазы. Смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч и очищали на колонке О1Ас.|шск М.1с1еоЦбе Кетоуа1 Κίΐ (01адеп. и8А).

Гибридизация меченого продукта на микрочипе.

0. 25 мкл образца, полученного в п.9, использовали для гибридизации на микрочипе в буфере следующего состава: 10% формамид (01Ьсо ВКЬ). 6х 88РЕ. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурировали при 94°С в течение 5 мин, охлаждали во льду и наносили на микрочип в гибридизационную камеру объемом 30 мкл (81дта. И8А). Гибридизацию проводили в течение ночи (16-18 ч) при комнатной температуре (22-24°С). Отмывку проводили в буфере 1х 88РЕ при комнатной температуре в течение 30 мин. Гибридизационную картину регистрировали на влажном чипе, в той же гибридизационной камере в буфере 1х 88РЕ.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.

Регистрацию гибридизационной картины проводят на автоматическом комплексе, состоящем из флуоресцентного микроскопа, 512x512 ПЗС-камеры (3x3 мм² поле зрения) и компьютера. Для сканирования и последующей обработки изображений применяют программу \УтУ|е\у (РппсеЮпе ИМгытепК И8А), обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят при помощи программ, использующих интерфейс ЬаЬУ1Е^ (№11юпа1 ИМгитепК И8А).

Интерпретацию результатов проводили следующим образом. Гибридизационный сигнал в ячейках крайнего левого вертикального ряда, где иммобилизованы олигонуклеотиды, относящиеся к гену АВЬ. должен присутствовать на всех гибридизационных картинах. Он свидетельствует о том, что такие этапы подготовки пробы, как выделение РНК, обратная транскрипция, фрагментация, флуоресцентное мечение и сама гибридизация прошли нормально. Отсутствие гибридизационного сигнала в ячейках, расположенных правее в горизонтальных рядах, свидетельствует об отсутствии в клиническом образце химерных транскриптов, принадлежащих вышеперечисленным транслокациям. Наличие сигнала в ячейках, расположенных правее в горизонтальных рядах, свидетельствует о наличии в образце химерного транскрипта, принадлежащего одной из перечисленных транслокаций. По уровню расположения строки относительно левого столбца можно определить тип транслокации, а по тому, в каких ячейках регистрируется гибридизационный сигнал вдоль самой строки, определить вариант химерного транскрипта и, таким образом, верифицировать последовательность в точке слияния двух генов, участвующих в данной транслокации.

На фиг. 2 представлена картина гибридизации образца, полученного из клеточной культуры НЬ-60. Гибридизационные сигналы наблюдаются только в ячейках левого вертикального ряда. В ячейках, расположенных правее в горизонтальных строках, сигналы отсутствуют. Делается заключение, что в образце отсутствуют клетки, содержащие вышеперечисленные транслокации.

На фиг. 3 представлена картина гибридизации образца, полученного из клеточной культуры К-562. Наличие гибридизационных сигналов в левом вертикальном ряду свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов в ячейках, расположенных в строке правее, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, можно определить, что это транслокация (9;22). Появление сигналов в определенных ячейках вдоль строки позволяет определить вариант слияния между участвующими в транслокации генами ВСЯ и АВЬ как Ь3/а2. Следует отметить, что в данном случае в гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из смысловой цепи. Гибридизационные сигналы в ячейках, в которых иммобилизованы олигонуклеотиды с мисматчами, также регистрируются, но их интенсивность в 2-3 раза ниже, чем в ячейках, где иммобилизованы олигонуклеотиды, образующие совершенные дуплексы.

На фиг. 4 представлена картина гибридизации образца, полученного из клеточной культуры NВ4. Наличие гибридизационных сигналов в левом вертикальном ряду свидетельствует о том, что все этапы приготовления образца прошли нормально. Появление сигналов с ячеек, расположенных в строке, свидетельствует о наличии транслокации. Ориентируясь по схеме микрочипа, можно определить, что это транслокация (15; 17). Появление сигналов в определенных ячейках вдоль строки позволяет определить, что данная транслокация в этой культуре представлена двумя вариантами слияния между участвующими в транслокации генами РМЬ и ВАКа. Следует отметить, что в данном случае в гибридизации участвуют иммобилизованные олигонуклеотиды из антисмысловой цепи.

Представленный способ позволяет в короткие сроки определить наличие или отсутствие в клетках определенных хромосомных перестроек, в том числе используя для анализа непосредственно клинический образец. Метод отличается от существующих в настоящее время аналогов (ПЦР с последующей гибридизацией по Саузерну) простотой выполнения и позволяет резко сократить время, требуемое для скрининга пациента по нескольким транслокациям, и существенно повысить достоверность обнаружения

- 15 006512 транслокации в анализируемом образце по сравнению со стандартным ПЦР анализом.

Пример 2. Определение точечных нуклеотидных замен, приводящих к возникновению устойчивости микроорганизмов к рифампицину, в ДНК микобактерий туберкулеза на микрочипе.

Пример показывает применение способа гибридизации на биологическом микрочипе для анализа последовательности ДНК с целью идентификации точечных мутаций; определения специфических последовательностей хромосомной, фаговой и плазмидной локализации, детерминирующих синтез диагностически важных белков; детекции различных перестроек в последовательности ДНК (делеции, инверсии, инсерции), а также определения транспозонов и коротких мобильных элементов (18-элементов).

Клинический образец обрабатывают для обеспечения доступа к ДНК и деконтаминации. Специфический фрагмент гена гроВ накапливают с помощью ПЦР, затем получают при помощи асимметричной ПЦР одноцепочечный меченый продукт, используя флуоресцентно меченный праймер.

Полученный продукт гибридизуют на микрочип, содержащий дискриминирующие олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям гена, как имеющим мутации, так и не имеющим таковых (дикий тип).

Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы с соответствующими олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек микрочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на микрочипе, определяют мутации, присутствующие в изучаемой последовательности ДНК, и делают заключение об устойчивости (или чувствительности) изучаемого объекта к рифампицину.

Олигонуклеотидный микрочип для выяления рифампицин-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΚΝΑ 8уп111смхсг (Аррйеб Вю^уйспъ. И8А) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержал спейсер со свободной аминогруппой, который вводился в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Аш1ио-Мобгйег С7 СРО 500 (О1еи Кскеагсй. И8А).

Микрочип был изготовлен как описано в п.«Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа».

Структура микрочипа для выяления рифампицин-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза.

Микрочип содержал 31 иммобилизованный олигонуклеотид, список которых представлен в табл. 3 и 4. Схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе приведена на фиг. 5. Верхний ряд микрочипа включает олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа, присутствующей в рифампицин-чувствительных микобактериях туберкулеза. Под каждой ячейкой с иммобилизованным олигонуклеотидом, комплементарным ДНК дикого типа, расположены ячейки с иммобилизованными олигонуклеотидами, комплементарными последовательностям ДНК мутантных типов (из рифампицинустойчивых микобактерий туберкулеза). Каждый столбец ячеек содержит СНО, позволяющий анализировать известные точечные замены или нуклеотидные перестройки в аминокислоте, номер которой приведен над верхним рядом ячеек на фиг. 6. Микрочип способен регистрировать 22 аминокислотные замены, затрагивающие 7 аминокислотных остатков (см. фиг. 6), или соответствующие им 22 нуклеотидные замены (см. фиг. 7); и одну делецию, захватывающую 2 аминокислоты, что соответствует 6 нуклеотидам.

- 16 006512

Табл. 3. Расположение олигонуклеотидов относительно последовательности гена гроВ М. 1иЬегси1о818

505 510 515 520 525 530 533

О1и РЬе РЬе 61у ТЬг Зег О1п Ьеи Зег С1п РЬе Мег Азр 61п Азп Азп Рго Ьеи Зег 61у Ьеи ТЬг ΗΪ3 Ьуз Аг§ Аг§ Ьеи Зег А1а Ьеи аде ттс ттс сос асс аос сас сте лес саа ттс атс сас сас аас аас ссс ста тсс осе ттс асс сас аас ссс сса стс тсс осе стс -з’ СТС ААСаас ссс тсс тсс стс сас тсс стт ААС тас стс стс ттс ттс вес сас асс ссс аас тсс стс ттс ссс ССТ сас асс ССС САС -5' ϋΕΙ507Ν(15ΙΙΒ) 69

ОЕ1_507(2) 70

СЬЫ51О 51 <3ίΝ510>ΗΙ5 52 1_ЕЫ511 (_Е11511>РЯО 54 ЬЕи511>ААС 55 8ЕН512 8ЕВ512>ТНН 57

5ЕП512>АА6 58 СТТ ААС ТАС СТС СТС ТТС ТТС С СТТ ААС ТАС АТС СТС ТТС ТТС С СТТ ААС ТАС ССС СТС ТТС ТТС С СТТ ААС ТАС САС СТС ТТС ТТС С СТТ ААС ТАС СТС СТС ТТС ТТС С 8ЕА522 8ЕН522>1_£и

ΑΘ ААС ССЗ ТОО ТСТ СТС С ААС ААС-------------ТСС СТС САС ТСС С сс тес тсс стс сас тсс с тсс тсс ста сас тсс ст

ТСС СТС САС тсс стт аа ТСССТССССТСССТТАА » ТСС СТС ССС ТСС СТТ АА СС СТС САС ТСС СТТ ААС ТА СС СТС САС ТСС СТТ ААС ТА СТС САС ОСС СТТ ААС ТА

ΗΙ5526 ΗΙ$526>ΤΥΗ ΗΙ8526>Α8Ρ ΗΙ8526>Α8Ν ΗΙ$526>ΡΡΟ ΗΙ8526>ΟίΝ2 ΗΙ8526>ΟΙ.Ν1 ΗΙδ526>ΟΥ5 ΗΙ$526>ί-Εϋ

А8Р516

Α8Ρ516>ΤΥΗ Α8Ρ516>ΘίΥ А8Р516>1/АЬ

А8Р516>С1.и СС САС АСС ССС ААС ТСС СССАС ААС ССС ААС ТСС

87 2 4 39 7 с аас тее сто ттс есе θ С ААС ТОО ΑΤΟ ТТС ОСО О С ААС ТОО СТО ТТС ОСО О С ААС ТОО ТТО ТТС ОСО О С ААС ТОО ООО ТТС ОСО О С ААС ТОО ОТТ ТТС ОСО О С ААС ТОО ОТС ТТС ОСО О С ААС ТОО АСО ТТС ОСО О С ААС ТОО ОАО ТТС ОСО О 8ЕН531 2ΕΗ531>ίΕυ 8ЕА531>СУ5 8ЕА531>ТАР 8ΕΗ531>ΟίΝ

ССТ САС АСС ССС САС ССТ САС ААС ССС САС ССТ САС АСА ССС САС ССТ САС АСС ССС САС ССТ САС СТС ССС САС

Пояснение: Верхний ряд цифр показывает номер позиции аминокислоты; под цифрами расположены названия аминокислот и кодирующие их триплеты нуклеотидов в направлении 5' > 3'. Ниже расположена комплементарная последовательность в направлении 3’>5’.

Последовательности олигонуклеотидов расположены строго под комплементарной им последовательностью гена.

Рядом с последовательностью олигонуклеотида приведено его название я номер в Табл. 3. Жирным шрифтом выделены нуклеотиды, соответствующие мутантному типу.

Таблица 4. Список олигонуклеотидов, используемых в дифференцирующем микрочипе, для выявления рифампицин-устойчивых штаммов М. 1иЬегси1о818

N олиг-а	Название	Последовательность 5’>3’	Позиция в гене
1	А8Р516	ОСТ ТОТ ТСТ ССТ ССА ТОА АТТ С	1333	1312
2	А5Р516>УАЬ	ОСТ ТОТ ТСТ СОА ССА ТОА АТТ О	1333	1312
4	А8Р516>С1Ьи	ООТ ТОТ ТСТ ОСТ ССА ТОА АТТ 0	1333	1312
7	ЗЕК522>ЬЕИ	ОСТ САА ССС САА САО СО	1350	1334
10	Н18526>А8Р	ОСС ОСТ ТСТ ССС ТСА АС	1360	1344
12	Н15526>ЬЕЫ	ООС ОСТ ТОА ОСО ТСА АС	1360	1344
15	Н18526>ОЬ№	ОСС ОСТ ТТТ ООО ТСА АС	1360	1344
16	ΗΙ8526>ΟΕΝ1	ООС ОСТ ТСТ ООО ТСА АС	1360	1344
17	ΗΙ8526>ΟΥ8	ООС ОСТ ТОС АОО ТСА АС	1360	1344
18	5ЕК531	САО СОС СОА САО ТСС	1374	1360
20	8ЕК531>ТВР	САО СОС ССА САО ТСС	1374	1360
27	ΗΙ8526>Α5Ν	ООС ОСТ ТОТ ТСС ТСА АС	1360	1344
31	8ЕК531>ОЬИ	САО ССС СТО САС ТСО	1374	1360
39	8ЕК522	ООТ САА ССС ССА САО СС	1350	1334
51	0124510	ОСТ САО СТО ОСТ ООТ ОС	1311	1295
52	СЬИ510>Н15	ТОО СТС АСА ТСО СТО ОТО	1313	1296
54	ЬЕи511>РКО	ДАТ ТОО СТС ССС ТОО ст	1316	1300
55	ΙΈϋ511>ΑΚΟ	ААТ ТОО стс ссс тсс ст	1316	1300
56	8ЕК512	ΑΤΟ ААТ ТОО СТС АОС ТОО С	1319	1301
57	8ЕК512>ТНК	АТС ААТ ТОО ОТС АОС ТОО С	1319	1301
58	8ЕК512>АКО	АТО ААТ ТОО СОС АОС ТО	1319	1303
69	ОЕЬ507Ы(13ЦВ)	ССТ ОТС ТОО ТОС СОА АОА	1306	1289
70	ИЕЬ507(2)	СОС ТСА ОСТ ООС ТОА АОА А	1312	1288
81	ЬЕи511	ААТ ТОО СТС АОС ТОО СТ	1316	1300
86	Α8Ρ516>ΤΥΚ	СОТ ТСТ ТСТ СОТ АСА ТОА АТТ О	1333	1312
87	А8Р516>СЬУ	ООТ ТСТ ТСТ ССС ССА ТОА АТТ С	1333	1312
89	ΗΙ3526>ΤΥΚ	ООС ОСТ ТСТ АОО ТСА АС	1360	1344
92	Н15526>РКО	ООС ОСТ ТСС ССС ТСА АС	1360	1344
93	5ЕК531>ЬЕи	САО СОС САА САО ТСО	1374	1360
94	ЗЕК531>СУ8	САО СОС АСА САО ТСО	1374	1360
99	ΗΙ8526	СОС ОСТ ТОТ ООС ТСА АС	1360	1344

- 17 006512

Обработка клинического образца.

1. Клинический образец (мокрота, экссудат, смыв, бронхо-альвеолярный лаваж) смешивали в соотношении 1:1 по объему со свежеприготовленным 0,5% раствором Ν-ацетил-Ь-цистеина (ΝΆΣΟ) в 2% ΝαΟΗ. Образец тщательно перемешивали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре в течение 40 мин. К образцу добавляли фосфатный буфер рН 6,8 в соотношении 1:5 по объему и центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. При использовании спинномозговой жидкости ее центрифугировали в центрифуге Эппендорф течение 10 мин при 10000 об/мин. При анализе крови выделяли лимфоцитарную фракцию по общепринятой методике с использованием фиколла. Дальнейшая обработка образцов проводилась одинаково.

2. Осадок клеток суспендировали в 1,5 мл ТЕ буфера, рН 8,0, и осаждали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Отмывку повторяли еще раз.

3. К полученному осадку добавляли 30-70 мкл ТЕ буфера, рН 8,0, содержавшего 1% (об/об) Тритон Х-100, и выдерживали в сухом термостате при 95°С в течение 15 мин.

4. Образец центрифугировали при 1 0000 об/мин в течение 1 0 мин в центрифуге Эппендорф и надосадочную жидкость (3 мкл) использовали для проведения ПЦР.

Амплификация фрагмента гроВ гена и получение одноцепочечного меченого продукта методом ПЦР.

5. В 50 мкл ПЦР-смеси вносят 3 мкл образца, полученного в п.4.

Состав ПЦР-смеси:

1х ПЦР-буфер: 50мМ КС1, 10мМ ТЙ8-НС1 (рН 9.0 при 25°С), 0,1% Тгйои Х-100 (Рготеда, И8Л);

1,5 мМ МдС1₂ (Рготеда, И8Л);

200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (6ΝΤΡ) (81дта, И8Л);

пмоль каждого праймера (гро105 и гро273);

1,5 ед. термостабильной Тад ДНК полимеразы (Рготеда, И8Л).

Праймеры:

Праймеры гро105 (5'-сд! дда ддс да! сас асс дса дас д!! д) и гро273 (5'-дас с!с сад ссс ддс асд с!с асд !), фланкирующие фрагмент гена гроВ размером 193 п.о. (позиции 1224-1416, Асс. № Ь27989), были синтезированы с использованием стандарной фосфоамидитной процедуры и очищены методом обращеннофазовой ВЭЖХ.

6. Амплификацию проводили на программируемом термостате М1шСус1ег (М1 Ке8еагсЬ, И8Л) со следующим режимом: 95°С - 30 с, 68°С - 40 с, 72°С - 20 с; 33 цикла (в первом цикле время денатурации увеличивали до 5 мин, в последнем - время элонгации до 5 мин).

7. 1 мкл (~100 нг) амплифицированного препарата двуцепочечной ДНК переносили в 100 мкл ПЦРсмеси для получения одноцепочечного меченого фрагмента гена гроВ.

Состав ПЦР-смеси:

1х ПЦР-буфер: 50мМ КС1, 10мМ ТЙ8-НС1 (рН 9.0 при 25°С), 0.1% Тгйои Х-100 (Рготеда, И8Л);

1,5 мМ МдС1₂ (Рготеда, И8Л);

200 мкМ каждого άΝΊΕ (81дта, И8Л);

пмоль праймера 1272Г;

пмоль праймера 1378г;

1,5 ед. термостабильной Тад ДНК полимеразы (Рготеда, И8Л).

Праймеры.

Праймеры 1272Г (5'- сдс сдс да! саа дда д!! с!) и 1378г (5'- !са сд! дас ада ссд ссд дд), фланкирующие фрагмент гена гроВ размером 127 п.о. (позиции 1272 -1398 Асс. № Ь27989), были синтезированы с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры и очищены методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Праймер 1272Г содержал на 5'-конце 5'-Лт1ио-Моб1йег С6 (С1еи Ке8еагсй, И8Л), к аминогруппе которого был ковалентно присоединен Теха8 Кеб-8и1Гоиу1 сЫойбе (Мо1еси1аг РгоЬе8 Ес., И8Л) по протоколу, рекомендуемому фирмой-изготовителем.

8. Амплификацию проводили, как описано п.6, с некоторыми модификациями: вместо 30 циклов проводили 36; отжиг проводили при температуре 65°С вместо 68°С. 12 мкл полученного продукта (смесь преимущественно одноцепочечной ДНК с двухцепочечной и праймерами) использовали для гибридизации на микрочипе.

Г ибридизация амплифицированного меченого продукта на микрочипе

9. 12 мкл образца, полученного в асимметричной ПЦР (~1,2 мкг оцДНК), используют для гибридизации на микрочипе в буфере следующего состава: 1М гуанидин тиоцианат, 50тМ НЕРЕ8, рН 7,5. 5тМ ЕЭТЛ. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибридизационной камере объемом 30 мкл (81дта, И8Л) в течение ночи (16-18 ч) при 37°С. Отмывку проводят трижды в буфере: 6,7х 88РЕ; 10% Тгееи 20 при 37°С. Микрочип высушивают струей воздуха при комнатной температуре.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.

Регистрацию гибридизационной картины проводят на автоматическом комплексе, состоящем из флуоресцентного микроскопа, 512x512 ПЗС-камеры (3x3 мм² поле зрения) и компьютера. Для сканирования и последующей обработки изображений применяют программу \УЕУ|е\у (Ргтсе!оие ^Читеий,

- 18 006512

И8А), обработку интенсивности флуоресцентного сигнала проводят при помощи программ, использующих интерфейс ЬаЬ У1Е\У (Ыайопа1 1пк1гишеп1к. И8Л).

Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Внутри каждого столбца гелевых ячеек визуально или с использованием программного обеспечения сравнивают интенсивности флуоресцентных сигналов. Если интенсивность сигнала верхней ячейки больше, чем в ячейках, расположенных ниже ее, то по данному столбцу, каждый из которых соответствует определенному аминокислотному остатку, анализируемый образец относят к дикому типу, т.е. не имеющему мутации. Если в каком-либо столбце одна из расположенных ниже ячеек имеет большую интенсивность, чем самая верхняя ячейка, то анализируемый образец нуклеиновой кислоты имеет точечную мутацию. Тип и локализацию мутации устанавливают путем сравнения со схемой расположения олигонуклеотидов на микрочипе. В случае, если по каждому столбцу, т. е. аминокислотному остатку, изучаемый образец определен как не имеющий мутаций, его относят к дикому типу, и выдается заключение, что в изученном клиническом образце микобактерий туберкулеза, не чувствительных к рифампицину, не определено. В том случае, если хотя бы по одному столбцу анализируемый образец определен как имеющий точечную мутацию, его относят к «мутантному типу», и выдается заключение, что в анализируемом клиническом образце определены микобактерии туберкулеза, устойчивые к рифампицину.

На фиг. 8-10 представлены результаты анализа последовательности ДНК трех различных штаммов микобактерий методом гибридизации на микрочипе.

На фиг. 8 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из чувствительного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза.

Внутри каждого столбца верхняя ячейка имеет большую интенсивность флуоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Следовательно, ДНК изучаемого объекта образует совершенные гибридизационные дуплексы с олигонуклеотидами, комплементарными последовательности ДНК дикого типа. Из этого следует, что в изученном клиническом образце микобактерий, устойчивых к рифампицину, не определено.

На фиг. 9 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из резистентного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза.

Внутри каждого столбца верхняя ячейка имеет большую интенсивность флуоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Исключение составляет образование совершенного дуплекса в ячейке, обозначенной стрелкой. Интенсивность сигнала в данной ячейке превосходит интенсивность, регистрируемую в верхней ячейке данного столбца. Следовательно, ДНК изучаемого объекта имеет точечную нуклеотидную замену А>Т в позиции 1322, что приводит к замене аминокислоты Акр на Уа1 в позиции 516 и ведет к возникновению резистентности изучаемого штамма к рифампицину. Выдается заключение, что в изученном клиническом образце определены микобактерии туберкулеза, резистентные к рифампицину. Резистентность обусловлена заменой аминокислоты Акр на Уа1 в позиции 516.

На фиг. 1 0 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из резистентного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза.

Внутри каждого столбца верхняя ячейка имеет большую интенсивность флуоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Исключение составляет образование совершенного дуплекса в ячейке, обозначенной стрелкой. Интенсивность сигнала в данной ячейке превосходит интенсивность, регистрируемую в верхней ячейке данного столбца. Следовательно, ДНК изучаемого объекта содержит две точечные нуклеотидные замены С>Т в позиции 1351 и А>С в позиции 1352, что приводит к замене аминокислоты Ηίκ на Сук в позиции 526 и ведет к возникновению резистентности изучаемого штамма к рифампицину. Выдается заключение, что в изученном клиническом образце определены микобактерии туберкулеза, резистентные к рифампицину. Резистентность обусловлена заменой аминокислоты Ηίκ на Сук в позиции 526.

Представленный способ позволяет в короткие сроки идентифицировать устойчивые к рифампицину формы микобактерий туберкулеза, в том числе используя для анализа непосредственно клинический образец. Метод выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов простотой выполнения и низкой себестоимостью. Применение микрочипа, содержащего набор дискриминирующих олигонуклеотидов, позволяет также выполнять типирование микобактерий туберкулеза на генотипическом уровне.

Пример 3. Определение генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР на микрочипе

Метод относится к способу одновременного определения нескольких генов, детерминирующих синтез диагностически важных белков, и детекции точечных мутаций в ДНК микроорганизмов.

В данном примере рассматривается применение методов ПЦР на микрочипе для одновременной детекции следующих продуктов: гена рад4 - ответственного за синтез протективного антигена В. агИНгаак: гена κιχ - ответственного за синтез шигеллезного токсина у рода 81лде11а; гена кН - ответственного за синтез шига-подобного токсина у рода ЕксНепсЫа; гена Ь1а - ответственного за синтез бета-лактамазы у пенициллин-устойчивых микроорганизмов.

Олигонуклеотидный микрочип для определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР.

- 19 006512

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΚΝΑ 8уп111е51/ег (Аррйеб Вюкуйетк, И8А) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'-Конец олигонуклеотидов содержал 5'-Атто-МойШег С6 (61еп Векеагсй, И8А), свободная аминогруппа которого позволяла иммобилизовать праймеры в ячейках полиакриламидного геля.

Микрочип был изготовлен как описано в п.«Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа».

Структура микрочипа для определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР.

Микрочип содержал 5 иммобилизованных праймеров, список которых представлен в табл. 5 (отмечены буквой I). Расположение праймеров на микрочипе представлено на фиг. 11.

Таблица 5. Список олигонуклеотидов, используемых для детекции генов рад4, Ыа, §11 и 811, на микрочипе. (Используемые обозначения: Р- прямой праймер; В - обратный праймер; Р - зонд; I - иммобилизованный).

Олигонуклеот ид	Позиция*	Последовательность 5' —> 3'	Тш, °с **
ραχ4-Β[	1931	СААОТТСССАООООТТАСТАОа	54
ρα%4-Ά	2178	САСТТСТТООТСАТСТАСССАС	54
ра/;4-Р	2155	ТГОТТАСАТСАТТАТСАОСаСАА	54
Ыа-Р1	2656	ССОССТССАТССАСТСТАТТ	53
Ыа-В.	2748	СТ6ТА6СААТОССААСААСО	53
ίΛί-Ρ(Τ)Ι	1619/1648 Т	ТТСТТГОТТАТСТТТТСАСТТААТОТаОТ!	56
^г-Р(О)1	1619/1648 С	ТТСТТТОТТАТСТТТТСАОТТААТСТаСТк	56
	1619	ТТС1ТГОТТАТСТТТТСАОТТААТСТССТ	55
ьЫ-В	1757	ТАССТССТСАТСАААТАОТСТСТААТСО	55

* - положение праймера относительно последовательности гена; ** Т_ап - рассчитанная температура отжига.

Олигонуклеотиды рад4-Р1 и рад4-В являлись специфическими праймерами для амплификации фрагмента гена, детерминирующего синтез протективного антигена В. ап1йгас18. рад4-Р - олигонуклеотидный зонд, несущий флуоресцентную метку Техак Веб на 3'-конце, был комплементарен внутреннему участку рад4-ампликона.

Олигонуклеотиды Ыа-Р1 и Ыа-В являлись специфическими праймерами для амплификации фрагмента гена, детерминирующего синтез бета-лактамазы.

Олигонуклеотиды 8Й1-Р1 и 8Й1-В являлись специфическими праймерами для амплификации фрагмента гена, детерминирующего синтез шигеллезного (§11) и шига-подобного (к11) токсинов. Праймеры 8Й-Р(Т)1 и 811-Р(С)1 являлись специфическими прямыми праймерами для амплификации фрагмента генов §11 и §11, соответственно, и различались 3'-концевым основанием, которое является дискриминирующим для генов двух токсинов, различающихся точечной нуклеотидной заменой.

Подготовка образца для проведения ПЦР на микрочипе.

Образцы обрабатывали стандартными экспресс-методами, обеспечивающими доступ к бактериальной ДНК.

Проведение ПЦР для определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе.

Подготовленный образец ДНК вносили в камеру для проведения ПЦР, содержавшую реакционную смесь конечным объемом 28 мкл.

Состав ПЦР-смеси:

1х реакционный буфер для фрагмента Стоффеля Тад ДНК полимеразы (Регкш Е1тег, И8А)

2,5 мМ МдС1₂ (Рготеда, И8А);

200 мкМ каждого άΝΊΤ (81дта, И8А);

пмоль каждого праймера;

мг/мл бычьего сывороточного альбумина (V фракция, 81дта, И8А);

мкг/мл ДНК спермы лосося (81дта, И8А);

2,5 ед. фрагмента Стоффеля Тад ДНК полимеразы (Регкш Е1тег, И8А).

Амплификацию проводили на микрочипе, помещенном на не отражающую световые лучи алюминиевую подложку, оснащенную элементами Пелтье, управляемыми термоконтроллером и компьютером. Объем камеры по периметру ограничивал полиэтиленовый спейсер толщиной 70 мкм, имеющий форму прямоугольной рамки с шириной стенок 1 мм. Сверху объем ограничивался прямоугольной формы кварцевым стеклом, имеющим два отверстия диаметром 1 мм для подвода и отвода растворов. Г ерметичность камеры во время реакции обеспечивали стяжкой, прижимающей кварцевое стекло через спейсер к микрочипу. Отверстия после добавления в камеру всех необходимых реакционных компонентов также гер

- 20 006512 метично закрывались с помощью силиконовых прокладок. Данное устройство помещали на предметный столик флуоресцентного микроскопа, что позволяло следить за изменениями уровня флуоресценции в каждой ячейке в процессе реакции. Перед амплификацией устройство прогревалось в течение 10 мин при 95°С.

Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация при 95°С в течение 120 с; денатурация при 95°С - 30 с; отжиг при 53°С - 60 с; достройка цепи при 72°С - 40 с.

Проведение ПЦР на микрочипе можно осуществлять в нескольких различных вариантах (см. фиг.

12).

Простейший вариант, в котором прямой праймер был иммобилизован, а обратный флуоресцентно меченный находился в растворе над микрочипом, представлен на схеме В.

Второй вариант предусматривал предварительное накопление ампликона на стадиях А и Б (прямой праймер находился в растворе), после которых выполняли стадию В или Г. Стадия Г отличается тем, что иммобилизованный прямой праймер не идентичен прямому праймеру, помещенному в реакционную смесь, а комплементарен внутреннему региону ампликона.

Введение стадии А или Б уменьшало время проведения эксперимента (на 5-10 циклов амплификации) за счет более интенсивной наработки ампликона в растворе над микрочипом в сравнении с амплификацией, протекающей в ячейках микрочипа.

Аллель-специфичная ПЦР проводилась по аналогичной схеме (рис. 12В), но для иммобилизации использовали такие дискриминирующие праймеры (8Й!-Б(Т)1 и 511-Е(С)1). которые различались только по 3'-концевому основанию и позволяли выявлять известные точечные замены в комплементарной данному основанию позиции анализируемого гена, как, например, в случае генов шигеллезного и шига-подобного токсинов, отличающихся наличием основания Т или С в позиции 1648, соответственно.

Регистрация и интерпретация результатов определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами ПЦР и аллель-специфичной ПЦР на микрочипе

О том, идет ли в той или иной ячейке ПЦР или нет, судили по накоплению в ней флуоресцентного сигнала, обусловленного формированием гибридизационного дуплекса между достроенным иммобилизованным праймером и вновь образовавшимся в результате амплификации продуктом с включенным в его состав меченым праймером (см. фиг. 12Ж и З).

Увеличение флуоресцентного сигнала в соответствующих ячейках микрочипа в процессе специфической амплификации фрагмента гена рад4 представлено на фиг. 13А. Контролем служила ячейка, содержавшая праймер, специфичный для гена 8Й1. На фиг. 13Б показано накопление флуоресцентного сигнала в процессе специфической амплификации фрагмента гена 8Й1 (контрольной служила ячейка, содержавшая праймер, специфичный в отношении гена рад4).

На фиг. 14А представлена картина, полученная при амплификации образца, содержащего гены рад4 и Ыа. Положительная амплификация зафиксирована в ячейках, отмеченных стрелками.

На фиг. 14Б представлена картина, полученная при регистрации амплификации образца, содержащего фрагменты генов 5Й1 и Ыа. Положительная амплификация зафиксирована в ячейках, отмеченных стрелками.

Контроль специфичности амплификации.

В соответствии со схемой (см. фиг. 12Д и Е) после проведения амплификации микрочип отмывали от прогибридизовавшихся меченых продуктов в 0,1 М №-1С1 при 95°С в течение 10 мин. На отмытый таким образом микрочип наносили реакционный буфер для проведения ПЦР, содержавший флуоресцентно меченный обратный праймер (фиг. 1 2Д) или меченый зонд, комплементарный внутреннему участку ампликона (фиг. 12Е). Например, для контроля специфичности при амплификации гена рад4 использовали флуоресцентно меченный зонд рад4-Р (см. табл. 5). В случае успешного прохождения ПЦР на микрочипе добавленные меченые олигонуклеотиды образовывали гибридизационные дуплексы с достроенным в ходе реакции иммобилизованным праймером, что сопровождалось появлением флуоресцентного сигнала.

Методом контроля специфичности также являлся электрофорез продуктов, содержащихся в реакционной смеси после завершения ПЦР, размер которых должен соответствовать ожидаемому.

Пример 4. Метод определения точечных мутаций в гене гроВ М. 1ийегси1о515, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Метод относится к способу детекции точечных мутаций в хромосомной ДНК микроорганизмов методом амплификации на микрочипе. Принцип метода состоит в следующем. Известно, что в подавляющем большинстве случаев (более 95%) устойчивость микобактерий туберкулеза к рифампицину обусловлена точечными мутациями или короткими, не более 6 п.о., инсерциями или делециями, сохраняющими нормальную рамку считывания, которые располагаются в коровом участке гена гро В длиной 81 п.о. Для этого участка были выбраны следующие праймеры: гроВ-Ε и гроВ-К являются общими внешними прямым и обратным праймерами, соответственно, для амплификации в растворе над микрочипом. Для каждой аминокислотной позиции, для которой описаны вызывающие устойчивость микобактерий к рифампицину мутации, подбирается набор специфических дискриминирующих праймеров, различаю

- 21 006512 щихся только находящимися в 3'-положении основаниями и позволяющих выявлять все известные точечные замены в комплементарной данному основанию позиции гена гроВ. Наборы дискриминирующих праймеров по всем выбранным вариабельным позициям иммобилизуются в ячейках микрочипа. Таким образом, метод сочетает в себе признаки иейей''-ПЦР и аллель-специфической ПЦР.

Олигонуклеотидный микрочип для определения точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1ок1к методом аллель-специфичной ПЦР.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΚΝΑ 8уп111ек1/ег (Аррйей ВюкуЧетк. И8А) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'-Конец олигонуклеотидов содержал 5'-Атто-МойШег С6 (С1еи Кекеагсй, И8А), свободная аминогруппа которого позволяла иммобилизовать праймеры в ячейках микрочипа.

Микрочип был изготовлен как описано в п.«Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа».

Структура микрочипа для определения точечных мутаций в гене гроВ М. 1нЬегсн1ок1к методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Микрочип содержал 23 иммобилизованных праймера (обозначены буквой I), список которых приведен в табл. 6. Размещение олигонуклеотидов в ячейках микрочипа, как видно из фиг. 15, определяется номером столбца и буквенным обозначением ряда, что отражено в названии праймера в виде аббревиатуры типа 1А, 2В и т.д. (см. табл. 6). Буквы Р и К использованы для обозначения прямых и общего обратного праймеров, соответственно. Общий обратный праймер гроВ-К содержал на своем 5'-конце флуоресцентную метку Техак Ней.

Ячейки верхнего ряда микрочипа содержат праймеры, специфичные к ДНК дикого типа, представленной в чувствительных к рифампицину микобактериях туберкулеза. В данном примере под «специфичным» следует понимать праймер, имеющий на своем 3'-конце основание, соответствующее последовательности ДНК дикого типа. Под каждой ячейкой с иммобилизованным праймером, специфичным к ДНК дикого типа, расположены ячейки с иммобилизованными праймерами, специфичными к ДНК мутантных типов (из рифампицин-устойчивых микобактерий туберкулеза). Каждый столбец ячеек представляет собой специфический набор праймеров, позволяющий детектировать все известные нуклеотидные замены внутри триплета, кодирующего конкретный аминокислотный остаток.

Подготовка образцов для проведения анализа.

Подготовку клинических образцов для анализа методом ПЦР на микрочипе проводили как описано в примере 2 в разделе «Обработка клинического образца».

Определение точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1ок1к методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Амплификацию проводили по способу, аналогичному используемому для выявления генов, детерминирующих синтез шигиллезного и шигаподобного токсинов (см. пример 3. «Определение генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами мультиплексной ПЦР и аллельспецифичной ПЦР на микрочипе» и фиг. 12Г).

Таблица 6. Список олигонуклеотидов, используемых для детекции точечных мутаций в гене гроВ М. 1иЬегси1ок1к, ответственных за возникновение устойчивости к рифампицину, методом аллельспецифичной ПЦР на микрочипе. (Используемые обозначения: Р- прямой праймер; К - обратный праймер; I- иммобилизованный)

Олигонуклеотид	Позиция*	Последовательность 5’ -> 3’	т„, «ж
гроВ-Р	1275	ССССАТСААООАОТТСТТССЮСАСС	68
гроВ-К	1377	ССССОСООТСТОТАСОТОА	65
τροΒ-ΤΡΪΑ	1295/1323 IV	ОСАССАСССАбСТОАОАСААТТСАТСОАС	70
гроВ-ΧΡΐΆ	1295/1322 А->Т	ОСАССА6ССАСЗСТОАОАСААТТСАТ6С1	70
гроВ-1Г1С	1295/1321 О->Т	ОСАССАСССАОСТОАОССААТТСАТО!	70
ζροΒ-ΙΡΙΟ	1295/1323 С-ИЗ	ССАССАОССАССГОАОАСААТТСАТООАв	70
грс£МР2А	1308/1336 те	САаССААТТСАТаОАССАаЛАСААСССОС	70
гроВ-1Е2В	1306/1336 С^А	СГОАОССААТТСАТООАССАОААСААСССОа	70
гро£МРЗА	1310/1340	ОССААТТСАТООАССАОААСААСССОСТОТС	71
фо/?-1РЗВ	1310/1340 С->Т	ОССААТТСАТаОАССАОААСААССС(ЗСТОТ(	71
гро/?-1Г4А	1323/1351	ССАСААСТАСССОСТОТССТООТТСАССС	71
φοβ-1Ε·4Β	1323/1351 С->Т	ССАОААСТАСССССТОТСОТбОТТОАСа	71
	1323/1351 С^О	ССАОААСТАСССССТОТССТССТГОАССе	71
	1323/1351 С—.А	ССАОААСТАСССССТСТСОТООТТСАССа	70
гроВ-1Р5А	1325/1352 те	АСААСТАССС6СТСТССТССТТСАСССА	71
>роВ-1В5В	1325/1352	АСААСТАСССбСТОТСОТаОТТбАССС®	71
гроВ-1Р5С	1325/1352 А-»Т	АОААСТАСССОСГОТСОТССТТСАССС1	71
/роВ-1Р5П	1325/1352 А—»С	АОААСТАСССОСТОТСбТООТТОАСССс	71
гроВ-1Р6А,7 А	1343/1367 те	ООТТОАСССАСААОСОССОАСТОТС	70
грй»/?-1Р6В,7В	1343/1367 С->Т	6СТТ0АСССАСААССССССАСТаТ1А	70
гррВ-1Р6С,ТС	1342/1367 С-»6	ОООТТСАССААСААОСОСССАСТОТ®!	70
	1342/1367 С-ИЗ	ОООТТОАССААСААОСОСССАСТОТвО	70
гроВ-КПП	1342/1367 С->А	ССОТТОАССААСААССОСССАСТСТаС	70
гроБ-1Р#А	1349/1373 XV	СССАСААССТСССАСТСТАСОСССГ	71
гроВ-]Р8В	1349/1373 Т—>С	СССАСААОСТССОАСТСТАООСОСс	71

- 22 006512 * - положение праймера относительно последовательности гена: первая цифра - положение с 5'конца значимой цепи; вторая цифра - позиция мутации; первая буква - основание, находящееся в 3'- концевом положении, соответствующее дикому типу; буква после стрелки - 3'-основание, соответствующее мутантному типу; дикий тип;

** Т_т - рассчитанная температура плавления.

Для амплификации применяли камеру, описанную в примере 3 в разделе «Проведение ПЦР для определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе».

Предварительную амплификацию в растворе над микрочипом проводили согласно фиг. 12 А и Б. Использовали следующий режим амплификации: предварительная денатурация при 95°С - 120 с; денатурация при 95°С - 30 с; отжиг при 65°С - 60 с; достройка цепи при 72°С - 40 с.

Регистрация и интерпретация результатов определения точечных мутаций в гене гроВ М. !иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, методом аллельспецифичной ПЦР на микрочипе.

Наличие амплификации регистрировали по накоплению флуоресцентного сигнала в ячейках микрочипа, обусловленному формированием гибридизационных дуплексов между достроенным иммобилизованным праймером и вновь образовавшимся в ходе ПЦР продуктом с включенным в его состав флуоресцентно меченным праймером (см. фиг. 1 2З).

Интерпретацию результатов проводили по схеме, аналогичной описанной в примере 2 в разделе «Регистрация и интерпретация результатов гибридизации».

На фиг. 15-1 представлена картина, полученная при амплификации образца ДНК М. !иЬегси1о818. чувствительного к рифампицину (ДНК дикого типа). Как и в случае гибридизации (см. пример 2), верхняя ячейка в каждом столбце, соответствующая последовательности ДНК дикого типа, имеет наибольшую интенсивность флуоресценции. При амплификации образца ДНК, полученного из штамма, устойчивого к рифампицину, интенсивность флуоресценции одной из нижерасположенных ячеек внутри одного столбца начинает превышать таковую в верхней ячейке. На фиг. 15-11 представлена амплификационная картина, полученная при проведении ПЦР на микрочипе с ДНК штамма, имеющего аминокислотную замену в 531 позиции 8ег>Ьеи (с>1). Две ячейки (В6 и В7), соответствующие последовательности мутантного типа, обладают большей интенсивностью флуоресценции в сравнении с расположенными выше ячейками (А6 и А7), соответствующими последовательности дикого типа.

Пример 5. Метод определения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Метод относится к способу детекции точечных мутаций в хромосомной ДНК эукариот методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Ген Ьгса1, локализованный в участке хромосомы 17ц 11 человека, обычно функционирует как один из супрессоров, регулирующих рост и дифференцировку эпителиальных клеток. Люди с наследственными мутациями в этом гене имеют повышенный риск развития рака молочной железы. Мутация действует по рецессивному типу. Определение же гетерозиготного типа также является актуальным для прогнозирования заболевания у потомства.

Олигонуклеотидный микрочип для определения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1 методом аллель-специфичной ПЦР.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 ΌΝΑ/ΒΝΑ 8уп(11е81хег (Аррйеб Вю8У81ет8. И8А) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'-Конец олигонуклеотидов содержал 5'-Ат1ио-Моб1йег С6 (С1еп Ве8еагс11. И8А). свободная аминогруппа которого позволяла иммобилизовать праймеры в ячейках микрочипа.

Микрочип был изготовлен как описано в п.«Методика изготовления микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения микрочипа».

Структура микрочипа для определения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1 методом аллельспецифичной ПЦР.

Дискриминирующий микрочип содержал 4 иммобилизованных праймера, представленных в табл. 7 (обозначены буквой I). Иммобилизованные праймеры различались только своим 3'-концевым основанием, соответствующим всем возможным точечным заменам в позиции 2713 гена Ьгса1 (СепВапк Ассе88юи №-АР005068).

Расположение праймеров на микрочипе представлено на фиг. 16-1.

- 23 006512

Таблица. 7. Список олигонуклеотидов для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе. __________________________________________________________________

Олиго нуклеотид	Позиция*	Последовательность 5’ —э 3'	т °г 1 ап»
Ьгса-СГ	2695-2713	АСС ССС АСТ САТ ТТС СТС С	56
Ьгса-А1	2695-2713	АСС ССС АСТ САТ ТТС СТС А	54
Ьгса-СГ	2695-2713	АСС ССС АСТ САТ ТТС СТС С	55
Ьгса-ΤΙ	2695-2713	АСС ССС АСТ САТ ТТС СТС Т	53
Ьгса-Г	2579-2601	САА ССС ТТТ ААС ТАТ ССА ТТС СС	53
Ъгса-к	2724-2745	САТ ТСС ТСТ ТСС САТ ТТС СТС С	57

Положение показано относительно последовательности, депонированной в ОепВапк (Ассеззюп №АЕ005068).

Подготовка образца.

Подготовку образца для амплификации на микрочипе осуществляли стандартной процедурой выделения ДНК.

Определение точечных нуклеотидных замен мутаций в гене Ьгса1 методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Амплификацию проводили по способу, аналогичному используемому при дискриминации генов, детерминирующих синтез шигеллезного и шига-подобного токсинов (см. пример 3 «Определение генов токсинообразования и резистентности к ампициллину методами мультиплексной ПЦР и аллельспецифичной ПЦР на микрочипе» и фиг. 12Г).

Для амплификации применяли камеру, описанную в примере 3 в разделе «Проведение ПЦР для определения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе».

Предварительную амплификацию в растворе над микрочипом проводили согласно фиг. 1 2А и Б с праймерами Ьгса-Е и Ьгса-К. Общий обратный праймер Ьгса-К имел на 5'-конце флуоресцентную метку Техаз Кеб.

Использовали следующий режим амплификации: предварительная денатурация при 95°С - 120 с; денатурация при 95°С - 30 с; отжиг при 53°С - 60 с; достройка цепи при 72°С - 40 с.

Регистрация и интерпретация результатов определения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1 методом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.

Наличие амплификации регистрировали по накоплению флуоресцентного сигнала в ячейках микрочипа, обусловленному формированием гибридизационных дуплексов между достроенным иммобилизованным праймером и вновь образовавшимся в ходе ПЦР продуктом с включенным в его состав меченым праймером (см. фиг. 12З).

Интерпретацию результатов проводили по схеме, аналогичной описанной в примере 2 в разделе «Регистрация и интерпретация результатов гибридизации».

На фиг. 16-11 представлены картины, полученные при амплификации трех образцов ДНК. На фиг. 16-11 А показана амплификация фрагмента ДНК здорового пациента. В позиции 2713 находится цитозин, что было зарегистрировано на ячейке с иммобилизованным праймером Ьгса-С1. В случае, если обе копии хромосомы 17 несут мутантный аллель гена Ьгса1, содержащий точечную замену С>Т, наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала наблюдали в ячейке с иммобилизованным праймером Ьгса-Т1 (фиг. 16-11 Б). Такого пациента относят к группе, предрасположенной к развитию рака молочной железы, т.е. имеющего рецессивную мутацию в гомозиготном состоянии. На фиг. 16-11 В представлена картина, полученная при амплификации ДНК, содержащей тимин в гетерозиготном состоянии. В этом случае пациента относят к группе, способной при репродукции передать мутантный аллель потомству.

Claims (71)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ анализа последовательностей нуклеиновых кислот (НК) с использованием биологического микрочипа, включающий получение очищенных препаратов олигонуклеотидов, иммобилизацию этих олигонуклеотидов в трехмерных гидрофильных микроячейках, подготовку анализируемого образца НК, анализ образца НК путем его гибридизации с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами, регистрацию результатов анализа и интерпретацию результатов анализа, характеризующийся тем, что в указанном способе используют биологический микрочип, состоящий из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр и содержащих набор иммобилизованных олигонуклеотидов.
2. 2. Способ по п. 1, в котором получают очищенные препараты дискриминирующих специфических олигонуклеотидов, выбранных на основе предварительного расчета их первичной и вторичной структур,

   - 24 006512 и которые необходимы и достаточны для идентификации известных мутаций, полиморфных или аллельных вариантов анализируемых последовательностей НК, а также для изготовления контрольных ячеек, и которые удовлетворяют следующим условиям:

   а) длина специфических дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающая их специфичность в отношении анализируемой последовательности НК, определяется размером и сложностью анализируемой последовательности и, в частности, наличием в ней повторов и протяженных гомополимерных последовательностей;

   б) специфические дискриминирующие олигонуклеотиды способны выявлять известные замены, делеции и инсерции для каждой позиции анализируемой НК, для которой известны такие мутации, полиморфизм или аллельные варианты;

   в) разброс значений температуры плавления (Т_пл) специфических дискриминирующих олигонуклеотидов находится в диапазоне 4-5°С и подбирается путем варьирования длины олигонуклеотидов;

   д) специфические дискриминирующие олигонуклеотиды не обладают способностью формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления;

   е) позиция детектируемых вариабельных нуклеотидов и других нуклеотидных перестроек в анализируемой НК находится по возможности не далее 1-4 нуклеотидов от середины соответствующего дискриминирующего олигонуклеотида.
3. 3. Способ по п.1, в котором получают полный набор очищенных препаратов всех возможных олигонуклеотидов заданной длины.
4. 4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором анализируемый образец НК - ДНК или РНК выбирают из группы, включающей

   а) очищенные препараты НК;

   б) НК, выделенные из чистых и накопительных культур микроорганизмов и вирусов;

   в) НК, выделенные из клинического материала, полученного от пациента;

   г) НК, выделенные из других образцов естественного происхождения, в том числе воды, почвы, смывов, проб воздуха.
5. 5. Способ по любому из пп. 1 -4, в котором гибридизацию на биологическом микрочипе проводят в гибридизационном растворе, содержащем буферный компонент, соль для создания ионной силы, в герметичной гибридизационной камере при температуре, определяемой температурой плавления иммобилизованных на биологическом микрочипе олигонуклеотидов.
6. 6. Способ по п.5, в котором гибридизационный раствор дополнительно содержит агент, дестабилизирующий водородные связи.
7. 7. Способ по п.4, в котором образцы НК представляют собой РНК.
8. 8. Способ по п.7, в котором подготовка анализируемого образца включает выделение РНК, фрагментацию выделенной РНК и ковалентное мечение этой РНК флуоресцентной меткой.
9. 9. Способ по п.7, в котором подготовка анализируемого образца включает выделение РНК, синтез кДНК на матрице выделенной РНК, амплификацию кДНК с помощью ПЦР, фрагментацию амплифицированной ДНК и мечение этой ДНК флуоресцентной меткой.
10. 1 0. Способ по п.7, в котором подготовка анализируемого образца включает выделение РНК, синтез кДНК на матрице выделенной РНК и амплификацию кДНК с одновременным мечением амплифицированной ДНК с использованием одного или двух флуоресцентно меченных праймеров с помощью ПЦР.
11. 11. Способ по п.7, в котором подготовка анализируемого образца включает выделение РНК, синтез кДНК на матрице выделенной РНК и амплификацию кДНК с одновременным мечением амплифицированной ДНК с получением одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта с помощью двухстадийной ПЦР, включающей стандартную ПЦР на первой стадии и асимметричную ПЦР с использованием флуоресцентно меченного праймера на второй стадии.
12. 12. Способ по п.4, в котором образцы НК представляют собой ДНК.
13. 13. Способ по п.12, в котором подготовка анализируемого образца включает выделение ДНК, ее фрагментацию и мечение этой ДНК флуоресцентной меткой.
14. 14. Способ по п.4, в котором образцы НК представляют собой ДНК.
15. 1 5. Способ по п. 1 4, в котором подготовка анализируемого образца ДНК включает выделение, амплификацию выделенной ДНК с помощью ПЦР, фрагментацию этой амплифицированной ДНК и мечение этой ДНК флуоресцентной меткой.
16. 16. Способ по п.14, в котором подготовка образца ДНК включает выделение и амплификацию выделенной ДНК с одновременным мечением амплифицированной ДНК с использованием одного или двух флуоресцентно меченных праймеров при помощи ПЦР.
17. 17. Способ по п.14, в котором подготовка анализируемого образца ДНК включает выделение и амплификацию выделенной ДНК с одновременным мечением амплифицированной ДНК с получением одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта с помощью двухстадийной ПЦР, включающей стандартную ПЦР на первой стадии и асимметричную ПЦР с использованием флуоресцентно меченного праймера на второй стадии.
18. 18. Способ по п.6, в котором дестабилизирующий водородные связи агент выбирают из группы,

    - 25 006512 включающей гуанидин тиоцианат, мочевину или формамид.
19. 19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором регистрация результатов гибридизации включает использование регистрирующих устройств на базе широкопольной оптики, оснащенных источником света для возбуждения флуоресценции или лазерных сканаторов различного типа.
20. 20. Способ по п.19, в котором гибридизационную картину, полученную при помощи регистрирующего устройства на базе широкопольной оптики, регистрируют на фотопленку или цифровым детектором изображения, например ПЗС-камерой.
21. 21. Способ по п.19, в котором регистрацию результатов гибридизации осуществляют путем сплошного сканирования микрочипа при помощи лазерного сканатора с последующим анализом полученного изображения или путем избирательного сканирования при помощи лазерного сканатора тех участков микрочипа, на которых расположены ячейки.
22. 22. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивностей сигнала в ячейках микрочипа, выявляющих образование совершенных и несовершенных гибридизационных дуплексов.
23. 23. Способ по п.3, в котором интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивностей сигнала в ячейках микрочипа, выявляющих образование совершенных и несовершенных гибридизационных дуплексов.
24. 24. Способ по п.22, в котором интерпретацию результатов гибридизации с целью выявления специфических последовательностей в анализируемом образце НК осуществляют путем сравнения интенсивностей сигнала в ячейках, содержащих специфичные дискриминирующие олигонуклеотиды, и в контрольных ячейках, содержащих неспецифичные олигонуклеотиды.
25. 25. Способ по п.22, в котором интерпретацию результатов гибридизации с целью выявления мутаций, полиморфизма или аллелизма генов осуществляют путем сравнения интенсивностей сигнала в ячейках, содержащих дискриминирующие олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям дикого типа, и в ячейках, содержащих дискриминирующие олигонуклеотиды, соответствующие последовательностям мутантных типов или полиморфных или аллельных вариантов НК.
26. 26. Способ по любому из пп.1-25 для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, детерминирующих синтез диагностически значимых белков; детекции точечных нуклеотидных мутаций, делеций, инсерций, инверсий и транслокаций, а также транспозонов и мобильных 18-элементов.
27. 27. Способ по любому из пп.1-25 для обнаружения микроорганизмов и вирусов по специфическим последовательностям нуклеиновых кислот.
28. 28. Способ по любому из пп.1-25 для выявления вида возбудителя заболевания; выявления генов, детерминирующих синтез токсинов; определения лекарственной устойчивости возбудителя; выявления гомозиготного и гетерозиготного состояния мутаций; а также для целей эпидемиологического генотипирования.
29. 29. Способ по любому из пп.1-25 для определения уровня экспрессии известных генов в различных органах и тканях, при патологических состояниях, на разных стадиях развития организма, а также при разного рода воздействиях на организм.
30. 30. Способ по любому из пп.1-25 для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов) методом гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом.
31. 31. Способ анализа последовательностей нуклеиновых кислот с использованием биологического микрочипа, включающий получение очищенных препаратов специфических олигонуклеотидов, выполняющих роль праймеров при проведении ПЦР, иммобилизацию этих олигонуклеотидов в трехмерных гидрофильных микроячейках, подготовку анализируемого образца НК, анализ образца НК путем проведения ПЦР на микрочипе, регистрацию результатов анализа и интерпретацию результатов анализа, характеризующийся тем, что в указанном способе используют биологический микрочип, состоящий из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр и содержащих набор иммобилизованных специфических олигонуклеотидов.
32. 32. Способ по п.31, в котором получают очищенные препараты специфических дискриминирующих праймеров, выбранных на основе предварительного расчета их первичной и вторичной структур, и которые необходимы и достаточны для идентификации известных мутаций, полиморфных или аллельных вариантов анализируемых последовательностей НК, а также для изготовления контрольных ячеек, и которые удовлетворяют следующим условиям:

    а) длина специфических дискриминирующих праймеров, обеспечивающая их специфичность в отношении анализируемой последовательности НК, определяется размером и сложностью анализируемой последовательности и, в частности, наличием повторов и протяженных гомополимерных последовательностей;

    б) специфические дискриминирующие праймеры, различающиеся по своему 3'-концу, способны выявлять известные замены, делеции и инсерции для каждой позиции анализируемой НК, для которой известны такие мутации, полиморфизм или аллельные варианты;

    - 26 006512

    в) разброс значений Т_пл специфических дискриминирующих праймеров находится в диапазоне 34°С и подбирается путем варьирования длины олигонуклеотидов;

    г) специфические дискриминирующие праймеры не способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления.
33. 33. Способ по п.31, в котором анализируемый образец НК - ДНК или РНК выбирают из группы, включающей

    а) очищенные препараты НК;

    б) НК, выделенные из чистых и накопительных культур микроорганизмов и вирусов;

    в) НК, выделенные из клинического материала, полученного от пациента;

    г) НК, выделенные из других образцов естественного происхождения, в том числе воды, почвы, смывов, проб воздуха.
34. 34. Способ по п.31, в котором анализ образца включает проведение ПЦР на биологическом микрочипе с использованием пары специфических олигонуклеотидов, один из которых является внешним прямым праймером, а второй - внешним обратным праймером, причем прямой праймер иммобилизован в микроячейках биологического микрочипа, а флуоресцентно меченный обратный праймер находится в растворе над микрочипом.
35. 35. Способ по п.33, в котором образец НК представляет собой РНК, а подготовка анализируемого образца включает выделение РНК и синтез на матрице выделенной РНК кДНК с помощью ПЦР.
36. 36. Способ по п.33, в котором образец НК представляет собой ДНК, а подготовка анализируемого образца включает выделение ДНК.
37. 37. Способ по п.34, в котором анализ образца НК включает проведение аллель-специфичной ПЦР на биологическом микрочипе, в ячейках которого иммобилизованы прямые дискриминирующие праймеры, обеспечивающие выявление известных замен, делеций, инсерций и нуклеотидных перестроек анализируемой последовательности.
38. 38. Способ по п.37, в котором в раствор над микрочипом дополнительно добавляют свободный внешний прямой праймер.
39. 39. Способ по п.31, в котором анализируют несколько последовательностей НК.
40. 40. Способ по п.39, в котором применяют мультиплексный вариант ПЦР, включающий амплификацию каждой анализируемой последовательности своей парой специфических внешних праймеров, причем прямые праймеры иммобилизуют в соответствующих ячейках биологического микрочипа, а меченные флуоресцентной меткой обратные праймеры находятся в растворе над микрочипом.
41. 41. Способ по п.40, в котором в раствор над микрочипом дополнительно добавляют свободные внешние прямые праймеры.
42. 42. Способ по п.41, в котором внешний прямой праймер, используемый для преамплификации, одновременно служит и дискриминирующим праймером, иммобилизованным в ячейке биологического микрочипа.
43. 43. Способ по п.41, в котором дискриминирующие внутренние прямые праймеры, иммобилизованные в ячейках микрочипа, позволяющие выявлять известные мутации, инсерции, делеции в конкретной позиции анализируемой последовательности, отличаются от внешнего прямого праймера, используемого для преамплификации.
44. 44. Способ по любому из пп.31-43, в котором регистрацию результатов ПЦР осуществляют в процессе проведения ПЦР на биологическом микрочипе.
45. 45. Способ по любому из пп.31-44, в котором интерпретацию результатов ПЦР осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, выявляющих образование специфичного продукта ПЦР.
46. 46. Способ по п.45, в котором интерпретацию результатов ПЦР с целью выявления специфических последовательностей в анализируемом образце НК осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, содержащих специфичные дискриминирующие праймеры, и контрольных ячеек, содержащих неспецифичные праймеры.
47. 47. Способ по п.45, в котором интерпретацию результатов ПЦР с целью выявления мутаций, полиморфных или аллельных вариантов генов осуществляют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, содержащих дискриминирующие праймеры, соответствующие последовательностям дикого типа, и ячеек, содержащих дискриминирующие праймеры, соответствующие последовательностям мутантных типов или полиморфных или аллельных вариантов НК.
48. 48. Способ по любому из пп.31-47 для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, детерминирующих синтез диагностически важных белков; точечных нуклеотидных мутаций, делеций, инсерций, инверсий и транслокаций, а также транспозонов и мобильных Е-элементов.
49. 49. Способ по любому из пп.31-47 для обнаружения микроорганизмов и вирусов по специфическим последовательностям нуклеиновых кислот.
50. 50. Способ по любому из пп.31-47 для выявления и идентификации вида возбудителя заболевания; выявления генов, детерминирующих синтез токсинов; определения лекарственной устойчивости возбудителя; определения гомозиготного и гетерозиготного состояния мутаций; а также для целей эпидемио

    - 27 006512 логического генотипирования.
51. 51. Способ по любому из пп.31-47 для определения уровня экспрессии известных генов в органах и тканях при различных патологических состояниях, на разных стадиях развития организма, а также при разного рода воздействиях на организм.
52. 52. Способ по п.31 для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе способами мультиплексной ПЦР и аллель-специфичной ПЦР.
53. 53. Способ по п.31 для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. !иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности возбудителя туберкулеза к рифампицину, способом аллельспецифичной ПЦР на микрочипе.
54. 54. Способ по п.31 для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом аллель-специфичной ПЦР на микрочипе.
55. 55. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-30, включающий

    а) биологический микрочип, состоящий из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр и содержащих набор иммобилизованных олигонуклеотидов;

    б) буферы для проведения гибридизации на микрочипе и отмывки.
56. 56. Набор по п.55, дополнительно содержащий по меньшей мере один из следующих компонентов: реагенты для выделения образцов НК; реагенты для фрагментации образцов НК; флуоресцентные красители для мечения фрагментированных образцов НК; праймеры, в том числе, меченные флуоресцентным красителем, и другие реагенты для амплификации и/или мечения образцов НК; реагенты для получения кДНК.
57. 57. Набор для осуществления способа по любому из пп.31-54, включающий

    а) биологический микрочип, состоящий из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр и содержащих набор иммобилизованных олигонуклеотидов;

    б) буферы и другие реагенты для проведения ПЦР на микрочипе.
58. 58. Набор по п.57, дополнительно содержащий по меньшей мере один из следующих компонентов: реагенты для выделения образцов НК, праймеры и другие реагенты для амплификации образцов НК; реагенты для получения кДНК.
59. 59. Набор по п.55 для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), способом по п.30.
60. 60. Набор по п.57 для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе способом по п.52.
61. 61. Набор по п.57 для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. !иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом по п.53.
62. 62. Набор по п.57 для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом по п.54.
63. 63. Биологический микрочип с дискриминирующими олигонуклеотидами для осуществления способа по любому из пп.1-54, состоящий из трехмерных гидрофильных микроячеек, нанесенных в заданном пространственном порядке на поверхность общей подложки с частотой нанесения не менее 5 на квадратный миллиметр и содержащих набор иммобилизованных олигонуклеотидов.
64. 64. Микрочип по п.63 для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), способом по п.30.
65. 65. Микрочип по п.63 для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе способом по п.52.
66. 66. Микрочип по п.63 для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. !иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом по п.53.
67. 67. Микрочип по п.63 для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом по п.54.
68. 68. Дискриминирующие олигонуклеотиды для изготовления микрочипа по п.63 для идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), способом по п.30.
69. 69. Дискриминирующие олигонуклеотиды для изготовления микрочипа по п.65 для обнаружения генов токсинообразования и резистентности к ампициллину на микрочипе способом по п.52.
70. 70. Дискриминирующие олигонуклеотиды для изготовления микрочипа по п.66 для обнаружения точечных мутаций в гене гроВ М. !иЬегси1о818, ответственных за возникновение резистентности микроорганизмов к рифампицину, способом по п.53.
71. 71. Дискриминирующие олигонуклеотиды для изготовления микрочипа по п.67 для обнаружения точечных нуклеотидных замен в гене Ьгса1, ответственном за предрасположенность к раку молочной железы, способом по п.54.