EA003212B1 - Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature - Google Patents
Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature Download PDFInfo
- Publication number
- EA003212B1 EA003212B1 EA200200266A EA200200266A EA003212B1 EA 003212 B1 EA003212 B1 EA 003212B1 EA 200200266 A EA200200266 A EA 200200266A EA 200200266 A EA200200266 A EA 200200266A EA 003212 B1 EA003212 B1 EA 003212B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- acetone
- fraction
- hexane
- mixture
- polar
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения биологически активных соединений: убихинонов 0-9 и 0-10. β-каротина, ликопина, эргостерина, фосфолипидов (лецитин и др.), жирных кислот.The invention relates to the field of biotechnology and for the preparation of biologically active compounds: ubiquinones 0-9 and 0-10. β-carotene, lycopene, ergosterol, phospholipids (lecithin, etc.), fatty acids.
Использование в медицинских и профилактических целях биологически активных соединений, в частности убихинонов, эргостерина, β-каротина, ликопина, лецитина, полученных путем микробиологического синтеза, является актуальным.The use of biologically active compounds, in particular, ubiquinones, ergosterol, β-carotene, lycopene, lecithin obtained by microbiological synthesis, for medical and preventive purposes is relevant.
В настоящее время установлено, что убихинон-10 является перспективным кардиотоническим средством для лечения ишемической болезни сердца (1). Учитывая многочисленные исследования, предложено использование убихинона при язве желудка, для терапии эмфиземы легких, простатомегалии, облысения, в качестве хорошего радиопротекторного препарата, для лечения бронхиальной астмы, для усиления функции поджелудочной железы и других заболеваний (2, 3, 4, 5).Currently, it has been established that ubiquinone-10 is a promising cardiotonic agent for the treatment of coronary heart disease (1). Considering numerous studies, the use of ubiquinone in gastric ulcers has been proposed, for the treatment of emphysema, prostatomegaly, baldness, as a good radioprotective drug, for the treatment of bronchial asthma, to enhance pancreatic function and other diseases (2, 3, 4, 5).
Ликопин и β-каротин - каротиноиды, широко распространенные в мире растений и микроорганизмов. В основе применения каротиноидов в медицине лежит их способность нейтрализовывать свободные радикалы и синглетный кислород, которые, как известно, реагируют с генетическим материалом клеток человека, способствуя появлению злокачественных новообразований, нарушению иммунитета, развитию процессов старения, гормональным сдвигам, диабету. Отмечается, что диета, обогащенная каротиноидами, способствует снижению риска возникновения злокачественных новообразований, повышению иммунитета, увеличению продолжительности жизни человека. Проведенные исследования показали, что ликопин более эффективно тормозит развитие раковых клеток, чем β-каротин. Это свидетельствует о том, что ликопин более сильный антиоксидант, чем βкаротин. Кроме того, установлено, что способность тушить синглетный кислород у ликопина выше не только по сравнению с другими каротиноидами, но и такими известными антиоксидантами, как, например, токоферол (6).Lycopene and β-carotene are carotenoids widely distributed in the world of plants and microorganisms. The use of carotenoids in medicine is based on their ability to neutralize free radicals and singlet oxygen, which, as you know, react with the genetic material of human cells, contributing to the appearance of malignant neoplasms, impaired immunity, the development of aging processes, hormonal changes, and diabetes. It is noted that a diet enriched with carotenoids helps to reduce the risk of malignant neoplasms, increase immunity, and increase the human lifespan. Studies have shown that lycopene inhibits the development of cancer cells more effectively than β-carotene. This suggests that lycopene is a stronger antioxidant than β-carotene. In addition, it was found that the ability to extinguish singlet oxygen in lycopene is higher not only in comparison with other carotenoids, but also with such well-known antioxidants as, for example, tocopherol (6).
Эргостерин - предшественник витамина Ό2, который получается при облучении эргостерина ультрафиолетовыми лучами. Ό2 играет важную роль в обеспечении организма кальцием, прежде всего, за счет правильного использования кальция, поступающего с пищей. При недостатке витамина Ό2 в организме происходит нарушение минерализации в процессе костеобразования, что приводит к серьезным изменениям в костном скелете.Ergosterol is a precursor of vitamin Ό2, which is obtained by irradiating ergosterol with ultraviolet rays. Ό2 plays an important role in providing the body with calcium, primarily due to the proper use of calcium from food. With a lack of vitamin Ό2 in the body, there is a violation of mineralization in the process of bone formation, which leads to serious changes in the skeleton.
Любые заболевания печени, независимо от этиологии (действие алкоголя, лекарственных препаратов, промышленных и бытовых токсинов, неправильного питания, вирусных инфекций и т.д.), вызывают повреждение мембран клеток с потерей фосфолипидов, которые являются основными структурными компонентами мембран. Потеря собственных фосфолипидов приводит сначала к инактивации, а затем и к гибели клеток печени. Фосфатидилхолин (лецитин), входящий в состав фосфолипидов, является основным структурным компонентом всех клеточных мембран. При прероральном введении в организм фосфатидилхолин восстанавливает целостность мембран клеток, в первую очередь, печени. Фосфатидилхолины используются во многих отраслях промышленности благодаря их прекрасным диспергирующим и эмульгирующим свойствам.Any liver disease, regardless of the etiology (the effects of alcohol, drugs, industrial and household toxins, malnutrition, viral infections, etc.) causes damage to cell membranes with a loss of phospholipids, which are the main structural components of the membranes. Loss of intrinsic phospholipids leads first to inactivation, and then to the death of liver cells. Phosphatidylcholine (lecithin), which is part of phospholipids, is the main structural component of all cell membranes. When pre-oral administration to the body, phosphatidylcholine restores the integrity of cell membranes, primarily the liver. Phosphatidylcholines are used in many industries due to their excellent dispersing and emulsifying properties.
Жирные кислоты имеют широкий спектр применения в парфюмерии, фармакологии, медицине. Наиболее ценными являются полиненасыщенные жирные кислоты. Они должны поступать в организм человека с пищей. При их недостаточности наблюдается отставание в росте, развиваются характерные поражения со стороны кожи и волосяного покрова.Fatty acids have a wide range of applications in perfumery, pharmacology, medicine. The most valuable are polyunsaturated fatty acids. They must be ingested with food. With their insufficiency, a growth lag is observed, characteristic lesions from the skin and hair cover develop.
Известны многочисленные способы получения отдельных соединений (убихинонов 0-9 и 0-10, β-каротина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот) с использованием различных микроорганизмов-продуцентов путем проведения ряда последовательных операций: экстракции различными органическими растворителями, отделения липидной фракции, кристаллизации необходимого вещества, его выделения и очистки (7, 8, 9).Numerous methods are known for producing individual compounds (ubiquinones 0-9 and 0-10, β-carotene, ergosterol, phospholipids, fatty acids) using various producer microorganisms by a series of sequential operations: extraction with various organic solvents, separation of the lipid fraction, crystallization of the necessary substances, its isolation and purification (7, 8, 9).
В частности, известен способ получения кристаллического β-каротина (патент РФ № 2112808). В соответствии с изобретением, описанным в патенте РФ № 2112808, экстракцию β-каротина из биомассы гриба В1. (порога ведут растительным маслом. Экстракцию начинают в реакторе в соотношении биомасса: растворитель, равном 1:3-1:15 (мас.), в течение 15-60 мин и завершают на фильтре тем же растворителем, нагретым до 60-90°С, затем насыщенные экстракты промывают в этиловом спирте в соотношении 10:1-3:1 (об.) при 40-55°С, кристаллизацию ведут при 10-20°С в течение 1-3 суток. После этого полученную суспензию нагревают до 40-60°С, кристаллы фильтруют, промывают их этиловым спиртом в соотношении 1:3-1:2,5 (мас.) при 5055°С. Выход β-каротина составляет 25-27%, массовая доля β-каротина 90%.In particular, a known method for producing crystalline β-carotene (RF patent No. 2112808). In accordance with the invention described in the patent of the Russian Federation No. 2112808, the extraction of β-carotene from the biomass of the fungus B1. (thresholds are carried out with vegetable oil. Extraction is started in the reactor in the ratio of biomass: solvent equal to 1: 3-1: 15 (wt.), for 15-60 minutes and is completed on the filter with the same solvent heated to 60-90 ° С , then the saturated extracts are washed in ethyl alcohol in a ratio of 10: 1-3: 1 (vol.) at 40-55 ° C, crystallization is carried out at 10-20 ° C for 1-3 days. After that, the resulting suspension is heated to 40 -60 ° C, the crystals are filtered, washed with ethyl alcohol in a ratio of 1: 3-1: 2.5 (wt.) At 5055 ° C. The yield of β-carotene is 25-27%, the mass fraction of β-carotene is 90%.
Недостатками способа являются получение в качестве конечного продукта только кристаллического β-каротина, а также длительность процессов экстракции и кристаллизации и значительный расход растворителя на стадии кристаллизации.The disadvantages of the method are to obtain as the final product only crystalline β-carotene, as well as the duration of the extraction and crystallization processes and a significant consumption of solvent at the crystallization stage.
Известны также способы получения эргостерина и убихинона 0-9 авт.св. СССР № 1739633, а также способ получения убихинона 0-10 совместно с фосфотидилэтаноламином, описанный вThere are also known methods for producing ergosterol and ubiquinone 0-9 ed. USSR No. 1739633, as well as a method for producing ubiquinone 0-10 together with phosphotidylethanolamine, described in
А.С. СССР № 1706213.A.S. USSR No. 1706213.
Способ получения 0-10 (А.С. № 1706213) основан на выращивании бактерий р. АсейЬас(ег ше111у1оуогап5 или Асе1оЬас1ет теШуНсит. Из биомассы бактерий липиды экстрагируют хлороформом или этанолом. Экстрагент упаривают и затем фильтруют через слой адсорбента. В качестве элюата применяют хлороформ или 2% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор упаривают и фракцию убихинона 0-10 растворяют в органическом растворителе (этаноле). Кристаллизацию убихинона 0-10 ведут при 1525°С в течение 4-24 ч. Для получения продукта с содержанием основного вещества более 97% проводят 1-3 ступени перекристаллизации. После элюирования 0-10 с адсорбента элюируют фракцию фосфатидилэтаноламинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей, содержащей от 20 до 70% гидрофильного органического растворителя. Использование этого приема позволяет удалить с адсорбента фракцию фосфатидилэтаноламинов, включающую фосфатидилэтаноламин и ряд других фосфолипидов с более высокими адсорбционными свойствами, чем 0-10, но более низкими, чем фосфатидилхолины. Затем с адсорбента элюируют фракцию фосфотидилхолинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей и воды, содержащей от 40 до 95% гидрофильного растворителя и от 2 до 15% воды. Данный подход позволяет получать фосфатидилхолины с высоким содержанием основного вещества (9098%). Выход 0-10 из 100 г биомассы составляет 0,06-0,08 г, фосфатидилхолинов - 0,4-0,6 г.The method of obtaining 0-10 (AS No. 1706213) is based on the cultivation of bacteria p. Acebac (echocardiolactone or Acinobactylate. Acid from the biomass of bacteria, the lipids are extracted with chloroform or ethanol. The extractant is evaporated and then filtered through an adsorbent bed. Chloroform or a 2% acetone solution in hexane is used as an eluate. The resulting solution is evaporated and the solution is evaporated. organic solvent (ethanol). Crystallization of ubiquinone 0-10 is carried out at 1525 ° C for 4-24 hours. To obtain a product with a basic substance content of more than 97%, 1-3 stages of recrystallization are carried out. After elution, 0-10 sec. A fraction of phosphatidylethanolamines eluting with a mixture of hydrophobic and hydrophilic solvents containing from 20 to 70% hydrophilic organic solvent is eluted on the basis of this technique. than phosphatidylcholines. Then the fraction of phosphotidylcholines is eluted from the adsorbent with a mixture of hydrophobic and hydrophilic solvents and water containing from 40 to 95% hydrophilic solvent and from 2 to 15% water. This approach allows to obtain phosphatidylcholine with a high content of the main substance (9098%). The yield of 0-10 from 100 g of biomass is 0.06-0.08 g, phosphatidylcholine 0.4-0.6 g.
Согласно способу получения эргостерина и 0-9 (А.С. СССР № 1739633), включающему омыление липидов, выделенных из биомассы дрожжей, раствором щелочи, осуществляют экстракцию неомыленной фракции, кристаллизацию и выделение эргостерина из раствора неомыленной фракции, обработку неомыленной фракции адсорбентом, элюирование с адсорбента фракции, содержащей 0-9, отгонку растворителя и выделение 0-9 из полученной фракции. После элюирования фракции, содержащей 0-9, с адсорбента элюируют гидрофильным растворителем фракцию, содержащую эргостерин при соотношении гидрофильный растворитель: адсорбент 2:1-20:1 (по массе). Затем объединяют полученный раствор эргостерина в гидрофильном растворителе с экстрактом неомыленной фракции, а перед кристаллизацией эргостерина неомыляемую фракцию обрабатывают гидрофильным растворителем, содержащим 0,58,0% воды при соотношении растворитель: неомыляемая фракция 8:1-50:12, и отделяют нерастворимый осадок. В соответствии с предлагаемым способом выход эргостерина составляет 2,0-2,2%, убихинона 0,1-0,45%.According to the method for producing ergosterol and 0-9 (AS USSR No. 1739633), including saponification of lipids isolated from yeast biomass, an alkaline solution, the unsaponifiable fraction is extracted, crystallized and ergosterol is extracted from the unsaponified fraction solution, the unsaponified fraction is treated with adsorbent, elution from the adsorbent of a fraction containing 0-9, distilling off the solvent and isolating 0-9 from the obtained fraction. After elution of the fraction containing 0-9, the fraction containing ergosterol is eluted from the adsorbent with the hydrophilic solvent at a ratio of hydrophilic solvent: adsorbent 2: 1-20: 1 (by weight). Then the resulting solution of ergosterol in a hydrophilic solvent is combined with an extract of the unsaponifiable fraction, and before crystallization of ergosterol, the unsaponifiable fraction is treated with a hydrophilic solvent containing 0.58.0% water at a solvent: unsaponifiable fraction ratio of 8: 1-50: 12, and the insoluble precipitate is separated. In accordance with the proposed method, the yield of ergosterol is 2.0-2.2%, ubiquinone 0.1-0.45%.
Описанные выше способы имеют определенные недостатки. Например, в А.С. СССР № 1706213 разделение липидов на фракции ведут непосредственно на хроматографической колонке без предварительного разделения, что приводит к большому расходу растворителей. В А.С. № 1739633 предусмотрена предварительная обработка липидов дрожжей перед стадией хроматографии, однако, процесс омыления ведут при использовании токсичного реагента - метанола, что также затрудняет использование этого метода на практике.The methods described above have certain disadvantages. For example, in A.S. USSR No. 1706213 separation of lipids into fractions is carried out directly on a chromatographic column without prior separation, which leads to a large consumption of solvents. In A.S. No. 1739633 provides for the preliminary processing of yeast lipids before the chromatography stage, however, the saponification process is carried out using a toxic reagent - methanol, which also complicates the use of this method in practice.
Эти три способа: патент РФ № 2112808, А.С. СССР № 1706213, АС. СССР № 1739633 для получения отдельных компонентов, таких как убихинон 0-10, β-каротин, эргостерин, в которых используют различные микроорганизмы-продуценты и для каждого из веществ разработан свой способ выделения, использованы авторами как прототипы.These three methods: RF patent No. 2112808, A.S. USSR No. 1706213, AC. USSR No. 1739633 to obtain individual components, such as ubiquinone 0-10, β-carotene, ergosterol, which use various producer microorganisms and for each of the substances developed its own isolation method, used by the authors as prototypes.
Задача изобретения заключается в разработке единого технологического процесса для получения определенной гаммы биологически активных соединений путем комплексного подхода к переработке микробных липидов с достижением при этом более полного использования сырья и получения биологически активных соединений, таких как убихиноны, эргостерин, β-каротин, ликопин, фосфолипиды, жирные кислоты, в единой технологической цепочке, включающей культивирование, экстракцию и выделение.The objective of the invention is to develop a single technological process for obtaining a specific gamut of biologically active compounds through an integrated approach to the processing of microbial lipids, while achieving a more complete use of raw materials and obtaining biologically active compounds, such as ubiquinones, ergosterol, β-carotene, lycopene, phospholipids, fatty acids, in a single process chain, including cultivation, extraction and isolation.
Данная цель достигается путем использования в качестве продуцента гриба В1аке§1еа (порога, а также путем ведения специального технологического процесса и подбора экстрагентов, позволяющих получить и выделить в одной схеме убихиноны, каротиноиды (βкаротин, ликопин), эргостерин и фосфолипиды.This goal is achieved by using the B1ake §1ea fungus (threshold) as a producer, as well as by conducting a special technological process and selecting extractants that allow one to obtain and isolate ubiquinones, carotenoids (β-carotene, lycopene), ergosterol and phospholipids.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.The proposed method is as follows.
Биомассу гриба В1аке§1еа 1г1зрога с влажностью 7-75% экстрагируют полярным растворителем (например, ацетоном или этанолом) или смесью полярного и неполярного растворителей (например, ацетон:гексан или этанол: гексан) при температуре 40-70°С в три ступени при соотношении биомасса:экстрагент, равном 1:3,5 на первой ступени, до 1:1,5 на последней. Отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60°С. После чего экстракт ставят на кристаллизацию каротиноидов в смеси полярного и неполярного растворителей при 5-20°С в течение 3-24 ч при слабом перемешивании. Выпавшие кристаллы каротиноидов отделяют фильтрованием и промывают этанолом. После отделения кристаллов каротиноидов из раствора липидов выделяют фосфолипиды при температуре 520°С в течение 1-5 ч при слабом перемешивании. Кристаллизацию фосфолипидов проводят в ацетоне или смеси ацетона и неполярного растворителя (например, гексана). Полученные фосфолипиды направляются на дальнейшее фракционное разделение в растворе этанола с целью выделения фракции лецитина. Полученный раствор нейтральных липидов омыляют в среде ацетона в водном растворе гидроксида калия при 50-70°С в течение 20-60 мин. Затем омыленную фракцию разбавляют водой и гидролизуют серной кислотой для получения смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию упаривают, перерастворяют в гексане и кристаллизуют эргостерин при 0-20°С в течение 4 ч при соотношении гексан:неомыляемая фракция, равном 1:3-1:50, а затем отфильтровывают полученный в процессе кристаллизации эргостерин. Эргостерин на фильтре промывают органическим растворителем или проводят при необходимости повторную кристаллизацию. Далее эргостерин счищают с фильтра и высушивают при 60°С.The biomass of the fungus B1ake§1ea 1g1zrog with a moisture content of 7-75% is extracted with a polar solvent (e.g. acetone or ethanol) or a mixture of polar and non-polar solvents (e.g. acetone: hexane or ethanol: hexane) at a temperature of 40-70 ° C in three steps at the ratio of biomass: extractant equal to 1: 3.5 in the first stage, up to 1: 1.5 in the last. The extract obtained is separated from bio-meal by hot filtration at 50-60 ° C. Then the extract is placed on the crystallization of carotenoids in a mixture of polar and non-polar solvents at 5-20 ° C for 3-24 hours with gentle stirring. Precipitated carotenoid crystals were separated by filtration and washed with ethanol. After separation of the carotenoid crystals from the lipid solution, phospholipids are isolated at a temperature of 520 ° C for 1-5 hours with gentle stirring. Crystallization of phospholipids is carried out in acetone or a mixture of acetone and a non-polar solvent (e.g. hexane). The obtained phospholipids are sent for further fractional separation in a solution of ethanol in order to isolate the lecithin fraction. The resulting solution of neutral lipids is saponified in acetone in an aqueous solution of potassium hydroxide at 50-70 ° C for 20-60 minutes. Then the saponified fraction is diluted with water and hydrolyzed with sulfuric acid to obtain a mixture of fatty acids. The unsaponifiable fraction is evaporated, redissolved in hexane, and ergosterol is crystallized at 0-20 ° C for 4 h at a ratio of hexane: unsaponifiable fraction equal to 1: 3-1: 50, and then the ergosterol obtained during crystallization is filtered off. Ergosterol on the filter is washed with an organic solvent or, if necessary, recrystallization is carried out. Next, ergosterol is cleaned from the filter and dried at 60 ° C.
После отделения эргостерина фильтрат упаривают или без предварительного упаривания наносят на колонку с адсорбентом, например силикагелем. С адсорбента элюируют неполярным растворителем побочные фракции, а затем смесью полярного и неполярного растворителя элюируют фракцию убихинонов. В качестве неполярного растворителя используют гексан, в качестве полярного - ацетон. Причем для селективного разделения фракции используют 1-5% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фракции убихинонов упаривают и кристаллизуют убихиноны в этиловом спирте при (-15)-(+5)°С. Затем отделяют образовавшийся в процессе кристаллизации осадок суммарных (09,10) убихинонов. При необходимости проводят дальнейшую их очистку.After separation of ergosterol, the filtrate is evaporated or, without prior evaporation, is applied to a column with an adsorbent, for example, silica gel. Side fractions are eluted from the adsorbent with a non-polar solvent, and then the ubiquinone fraction is eluted with a mixture of polar and non-polar solvents. Hexane is used as a non-polar solvent, and acetone is used as a polar solvent. Moreover, for the selective separation of the fractions, a 1-5% solution of acetone in hexane is used. The resulting solution of the ubiquinone fraction is evaporated and the ubiquinones are crystallized in ethanol at (-15) - (+ 5) ° С. Then, the precipitate of the total (09.10) ubiquinones formed during crystallization is separated. If necessary, conduct further cleaning.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают применение заявленного способа.The following examples illustrate but do not limit the application of the claimed method.
Пример 1.Example 1
Биомассу гриба В1аке§1еа 1г15рога - продуцента β-каротина - в количестве 100 г (влажность 7%) экстрагируют в три ступени ацетоном при 58°С. Затем экстракты объединяют, ацетон упаривают. В результате получают 57 г липидов, имеющих следующий фракционный состав (см. табл. 1).The biomass of the fungus B1ake§1ea 1g15 horn - producer of β-carotene - in an amount of 100 g (humidity 7%) is extracted in three stages with acetone at 58 ° C. Then the extracts are combined, the acetone is evaporated. The result is 57 g of lipids having the following fractional composition (see table. 1).
Таблица 1 Состав липидов гриба В1. йгарогаTable 1 The composition of the lipids of the fungus B1. yaroga
Липиды перерастворяют в ацетоне в соотношении 1:5 и охлаждают раствор до +5°С в течение 3 ч при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы отфильтровывают. Полученный β-каротин в количестве 1,2 г промывают этило вым спиртом, в результате, получают кристаллы с содержанием основного вещества не менее 9092%. После отделения β-каротина из раствора липидов выделяют фосфолипиды при -5°С, для чего частично упаривают растворитель до соотношения липиды:ацетон, равном 1:3, и кристаллизуют фосфолипиды в течение 5 ч. В результате процесса, получают 2,56 г фосфолипидов. Раствор липидов в ацетоне омыляют в 25% водном растворе гидроксида калия при 50°С в течение 20 мин. Омыленную фракцию разбавляют 200 мл воды и гидролизуют Н2§04. Полученные жирные кислоты экстрагируют гексаном. Неомыленную фракцию экстрагируют гексаном в три ступени по 150 мл на каждой, экстракты объединяют, частично упаривают и кристаллизуют эргостерин при 0°С и соотношении гексан:липиды, равном 1:3. Выпавший в осадок эргостерин фильтруют, промывают и сушат при 60°С, в результате, получают 1,25 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 89,9%. После отделения эргостерина фильтрат наносят на колонку с силикагелем марки АСКГ и элюируют побочные фракции гексаном. Затем элюируют фракцию убихинонов, используя 5% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фракции убихинонов упаривают и получают 4,1 г фракции. Эту фракцию растворяют в этиловом спирте при соотношении 1:20, охлаждают раствор до -15°С, выдерживают при этой температуре 24 ч. Затем отделяют выпавшие кристаллы убихинонов и промывают. В результате получают 0,48 г суммарных убихинонов.The lipids are redissolved in acetone in a ratio of 1: 5 and the solution is cooled to + 5 ° C for 3 hours with gentle stirring, the precipitated crystals are filtered off. The resulting β-carotene in an amount of 1.2 g is washed with ethyl alcohol, and, as a result, crystals are obtained with a basic substance content of at least 9092%. After separation of β-carotene from a lipid solution, phospholipids are isolated at -5 ° C, for which the solvent is partially evaporated to a lipid: acetone ratio of 1: 3, and phospholipids crystallize within 5 hours. As a result of the process, 2.56 g of phospholipids are obtained . A solution of lipids in acetone is saponified in a 25% aqueous potassium hydroxide solution at 50 ° C for 20 minutes. The saponified fraction is diluted with 200 ml of water and hydrolyzed with H 2 §0 4 . The resulting fatty acids are extracted with hexane. The unsaponifiable fraction was extracted with hexane in three steps of 150 ml each, the extracts were combined, ergosterol was partially evaporated and crystallized at 0 ° C and a hexane: lipid ratio of 1: 3. The precipitated ergosterol is filtered, washed and dried at 60 ° C, resulting in 1.25 g of ergosterol. The content of the main substance in the ergosterol sample is 89.9%. After separation of ergosterol, the filtrate is applied to a ASKG silica gel column and side fractions are eluted with hexane. The ubiquinone fraction is then eluted using a 5% solution of acetone in hexane. The resulting solution of the ubiquinone fraction was evaporated to obtain 4.1 g of the fraction. This fraction is dissolved in ethyl alcohol at a ratio of 1:20, the solution is cooled to -15 ° C, maintained at this temperature for 24 hours. Then, the precipitated crystals of ubiquinones are separated and washed. The result is 0.48 g of total ubiquinone.
Пример 2.Example 2
То же, что и в примере 1, но экстракцию биомассы проводят этанолом. Экстракцию ведут при температуре 70°С. В результате, получают 43 г липидов, имеющих следующий фракционный состав (см. табл. 2).The same as in example 1, but the extraction of biomass is carried out with ethanol. Extraction is carried out at a temperature of 70 ° C. As a result, 43 g of lipids are obtained having the following fractional composition (see table. 2).
Таблица 2table 2
Липиды перерастворяют в гексане и кристаллизуют при 20°С в течение суток при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы отфильтровывают. Полученные кристаллы βкаротина в количестве 0,6 г промывают этиловым спиртом. После отделения β-каротина из раствора липидов выделяют фосфолипиды путем добавления в раствор ацетона, процесс ведут при 20°С в течение 1 ч при перемешивании. В результате, получают 11,6 г фосфолипидов, которые направляются на стадию выделения фракции лецитина в растворе этанола. Раствор нейтральных липидов перерастворяют в ацетоне и омыляют в 20% водном растворе гидроксида калия при 70°С в течение 60 мин. Омыленную и неомыленную фракции обрабатывают так же, как в примере 1. Эргостерин кристаллизуют при 0°С и соотношении гексан: липиды 1:50. В результате, получают 1,16 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 89%. После отделения эргостерина липиды обрабатывают на стадии колоночной хроматографии, как описано в примере 1. Убихиноны кристаллизуют при температуре 5°С в течение суток. Получают 0,14 г кристаллов желто-оранжевого цвета.The lipids are redissolved in hexane and crystallized at 20 ° C during the day with gentle stirring, the precipitated crystals are filtered off. The resulting crystals of β-carotene in an amount of 0.6 g are washed with ethyl alcohol. After separation of β-carotene from the lipid solution, phospholipids are isolated by adding acetone to the solution, the process is carried out at 20 ° C for 1 h with stirring. As a result, 11.6 g of phospholipids are obtained, which are sent to the stage of isolating the lecithin fraction in an ethanol solution. A solution of neutral lipids is redissolved in acetone and saponified in a 20% aqueous potassium hydroxide solution at 70 ° C for 60 minutes. The saponified and unsaponified fractions are treated in the same manner as in Example 1. Ergosterol is crystallized at 0 ° C and a hexane: lipid ratio of 1:50. As a result, 1.16 g of ergosterol are obtained. The content of the main substance in the ergosterol sample is 89%. After separation of ergosterol, the lipids are processed at the column chromatography stage, as described in Example 1. Ubiquinones crystallize at 5 ° C during the day. 0.14 g of yellow-orange crystals are obtained.
Пример 3.Example 3
Биомассу гриба В1акек1еа Бкрога - продуцента ликопина - в количестве 400 г (влажность 75%), выращенную в условиях лабораторного ферментера, экстрагируют в три ступени смесью гексан:этанол:вода=48:39:13 (мас.%) при температуре 40°С. Содержание воды в смеси рассчитывают, учитывая влажность биомассы, пошедшей на экстракцию. Экстракты со всех ступеней объединяют и получают 32 г липидов, имеющих следующий фракционный состав (см. табл. 3).The biomass of the fungus B1akek1aa Bkrog - producer of lycopene - in an amount of 400 g (humidity 75%), grown under the conditions of a laboratory fermenter, is extracted in three stages with a mixture of hexane: ethanol: water = 48: 39: 13 (wt.%) At a temperature of 40 ° C . The water content in the mixture is calculated taking into account the moisture content of the biomass used for extraction. The extracts from all stages are combined and get 32 g of lipids having the following fractional composition (see table. 3).
Таблица 3Table 3
Кристаллизацию ликопина ведут так же, как описано в примере 2. В результате, получают 1,1 г кристаллического ликопина. Выделение фосфолипидов ведут путем добавления в раствор ацетона, получают 3,1 г фосфолипидов. Ацетоновый раствор нейтральных липидов омыляют в 10% растворе гидроксида калия. Количество гидроксида калия рассчитывают, исходя из числа омыления для данных липидов. Процесс омыления ведут при 60°С в течение 50 мин. Омыленную фракцию обрабатывают, как описано в примере 1. Эргостерин из неомыленной фракции кристаллизуют при 20°С и соотношении гексан:липиды 1:10. Выпавший осадок эргостерина промывают и сушат при 50°С, при необходимости проводят повторную перекристаллизацию. В результате, получают 0,77 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 90,1%. После отделения эргостерина фильтрат наносят на колонку с силикагелем марки АСКГ и элюируют побочные фракции гексаном. Затем элюируют фракцию убихинонов, используя 1% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фрак ции убихинонов упаривают и получают 0,8 г фракции. Эту фракцию растворяют в этиловом спирте при соотношении 1:20, охлаждают раствор до -5°С, выдерживают при этой температуре 24 ч. Затем отделяют выпавшие кристаллы убихинонов и промывают их. В результате, получают 0,14 г суммарных убихинонов.Crystallization of lycopene is carried out as described in example 2. As a result, 1.1 g of crystalline lycopene is obtained. Isolation of phospholipids is carried out by adding acetone to the solution, and 3.1 g of phospholipids are obtained. Acetone solution of neutral lipids is saponified in a 10% potassium hydroxide solution. The amount of potassium hydroxide is calculated based on the saponification number for these lipids. The saponification process is carried out at 60 ° C for 50 minutes. The saponified fraction is treated as described in Example 1. Ergosterol from the unsaponified fraction is crystallized at 20 ° C and a hexane: lipid ratio of 1:10. The precipitated ergosterol precipitate is washed and dried at 50 ° C; if necessary, recrystallization is carried out. As a result, 0.77 g of ergosterol is obtained. The content of the main substance in the ergosterol sample is 90.1%. After separation of ergosterol, the filtrate is applied to a column with ASKG silica gel and side fractions are eluted with hexane. The ubiquinone fraction is then eluted using a 1% solution of acetone in hexane. The resulting solution of the ubiquinone fraction was evaporated, and 0.8 g of the fraction was obtained. This fraction is dissolved in ethyl alcohol at a ratio of 1:20, the solution is cooled to -5 ° C, maintained at this temperature for 24 hours. Then, the precipitated crystals of ubiquinones are separated and washed. As a result, 0.14 g of total ubiquinone is obtained.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200200266A EA003212B1 (en) | 2002-01-25 | 2002-01-25 | Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200200266A EA003212B1 (en) | 2002-01-25 | 2002-01-25 | Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200200266A1 EA200200266A1 (en) | 2003-02-27 |
| EA003212B1 true EA003212B1 (en) | 2003-02-27 |
Family
ID=28685813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200200266A EA003212B1 (en) | 2002-01-25 | 2002-01-25 | Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA003212B1 (en) |
-
2002
- 2002-01-25 EA EA200200266A patent/EA003212B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200200266A1 (en) | 2003-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9200236B2 (en) | Omega 7 rich compositions and methods of isolating omega 7 fatty acids | |
| US6743953B2 (en) | Process for the preparation of xanthophyll crystals | |
| US6329557B1 (en) | Purification of xanthophylls from marigold extracts that contain high levels of chlorophylls | |
| US6740778B2 (en) | Method for the preparation of oleanolic acid and/or maslinic acid | |
| WO1999020587A1 (en) | Process for extraction and purification of lutein, zeaxanthin and rare carotenoids from marigold flowers and plants | |
| JP5795572B2 (en) | Method for separating carotenoid crystals from various plants | |
| JP7259034B2 (en) | Very long chain fatty acid composition | |
| WO2009116264A1 (en) | Dry defatted cereal bran comprising health functional ingredient adsorbed and concentrated therein, health functional ingredient concentrate prepared from the bran and method of producing the same | |
| US3192111A (en) | Method of inducing therapeutic tranquilization with psilocybin and psilocin | |
| JPH0873396A (en) | Lipid having high natural menaquinone-7 content | |
| US8481769B2 (en) | Isolation and purification of cartenoids from marigold flowers | |
| WO2000049116A1 (en) | Method for refining a seed oil having micronutrients | |
| Priyanka et al. | Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) of zeaxanthin from marine microalgae Dunaliella tertiolecta (NIOT 141) using response surface methodology | |
| EA003212B1 (en) | Method of obtaining of antioxidants and bioactive compounds of lipidic nature | |
| JPH10218786A (en) | Medicine comprising buckwheat chaff extract as active ingredient | |
| KR20140004674A (en) | Method for extracting silk extract containing lutein | |
| RU2102416C1 (en) | Method of lycopine producing | |
| RU2270868C1 (en) | METHOD FOR PREPARING LICOPIN, PHOSPHOLIPIDS, FATTY ACIDS AND ERGOSTEROL BY COMBINED CULTURING (+)= AND (-)-STRAINS OF FUNGUS Blakeslea trispora | |
| JP7133306B2 (en) | Acyl steryl glucoside, method for producing acyl steryl glucoside, composition, antioxidant, blood lipid-lowering agent, anti-obesity agent, anti-tumor agent, and prophylactic or therapeutic agent for atherosclerosis | |
| US2163659A (en) | Vitamin | |
| RU2166868C1 (en) | Method for obtaining biologically active product | |
| US20210322502A1 (en) | Purified xanthophyll composition comprising (trans,r,r)- lutein and(trans,r,r)- zeaxanthin and process for the preparation thereof | |
| US20050214389A1 (en) | Beta-carotene enriched extract from water hyacinth eichhornia crassipes | |
| CN112516621A (en) | Preparation method of high-content Chinese prickly ash flavone | |
| KR20220088902A (en) | Concentrated polyunsaturated fatty acid composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |