DK175094B1 - Anvendelse af N-butyl-derivatet af deoxynojirimycin til fremstilling af farmaceutisk præparat - Google Patents

Description

DK 175094 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af N-butyl-derivatet af 1,5-dideoxy-1,5-imino-D-glucitol (deoxynojirimycin) ved behandlingen af det erhvervede immundefekte syndrom (AIDS).

Λ „ 5 Erhvervet immundefekt syndrom, der for kun nogle få år siden var en medi cinsk kuorisitet, er nu en alvorlig sygdom. Som en følge heraf har der været gjort store anstrengelser for at udvikle lægemidler og vacciner til bekæmpelse af AIDS. AlDS-viruset, der først blev identificeret i 1983, er blevet beskrevet med en hel række navne. Det er det tredje kendte T-lymphocyt-vims 10 (HTLV-III) og er i stand til at opformeres inden i cellerne fra imunsystemet og derved føre til en dybtgående ødelæggelse af T4 T-celler (eller CD4 -celler).

Se for eksempel Gallo et al., Science 224, 500-503 (1984) og Popovic et al.,

Ibid., 497-500 (1984). Dette retrovirus er blevet kendt som lymphadenopathi-associeret virus (LAV) eller det AlDS-relaterede virus (ARV) og for nylig som 15 det humane immundefekte virus (HIV). To adskilte AIDS-vira, HIV-1 og HIV-2, er blevet beskrevet. HIV-1 er det oprindelige vims identificeret i 1983 af Montagnier og medarbejdere ved Pasteur-instituttet i Paris [Virol. Inst. Pasteur 135 E, 119-134 (1984)], medens HIV-2 for nylig er blevet isoleret af Montagnier og medarbejdere i 1986 [326, 662 (1987)]. I foreliggende 20 beskrivelse med krav betyder HIV disse vira på en generisk måde.

Skønt den molekylære biologi af AIDS er begyndt at blive afsløret og defineret, skal der undersøges betydeligt mere for at forstå denne sygdom. I mellemtiden har der været foretaget adskillige undersøgelser for at finde po-25 tentielle anti-AIDS-lægemidler og vacciner. Udviklingen af en AlDS-vaccine er vanskeliggjort, fordi man ikke forstår mekanismen ved den beskyttende k. immunitet over for HIV, størrelse af genetisk variation af dette virus, og man gelen på effektive dyremodeller til HIV-infektion. Se for eksempel Koff og Hoth, Science 241,426-432 (1988).

30

Det første lægemiddel, der er blevet godkendt af U.S. Food and Dmg Administrations (FDA) til behandling af AIDS, var zidovudin, bedre kendt under forbindelsens tidligere navn azidothymidin (AZT). Kemisk er dette lægemid-

L/Γν I i O I

2 del 3‘-azido-3‘-deoxythymidin. Dette lægemiddel blev oprindelig udvalgt som et potentielt våben over for AIDS, fordi det havde vist sig at hæmme opformering af virus in vitro. Sådanne in vitro-forsøg er værdifulde og bogstavelig talt den eneste praktiske metode til en første afsøgning og un- r 5 dersøgelse af potentielle anti-AIDS lægemidler. En alvorlig ulempe ved AZT er imidlertid forbindelsens toxiske bivirkninger. Derfor fortsætter undersøgelsen efter bedre anti-AIDS-lægemidler.

For nylig er visse glycosidase-hæmmere blevet undersøgt for aktivitet over 10 for AlDS-virus. Tre sådanne forbindelser foreslået som potentielle anti-AIDS-lægemidler er castanospermin, 1-deoxynojirimycin (DNJ) og 2,5-dihy-droxymethyl-3,4-dihydroxy-pyrrolidin (DMDP). Se for eksempel Sunkara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148(1), 206-210 (1987); Tyms et al.,

Lancet, Oct. 31, 1987, p. 1025-1026; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

15 USA 84, 8120—8124 (1987); og Gruters et al., Nature 330, 74-77 (1987).

OH OH

HO Js. OH H0 JL ,0H

X T* \ Ί *

20 H

^ N ^ N CH20H

\_y

Castanospermine Deoxynojirimycin (DNJ) 25

H0 OH

W

hoh2c ^n^ ch2oh

ΟΛ H

30

Dihydroxymetbyl-dihydroxypyrrolidine (DMDP) DK 175094 B1 3

Castanospermin, der er et alkaloid isoleret fra frøene af australsk kastanjetræ, har vist sig at gribe ind i den normale glycosylering af HlV-virioner, hvorved glycoprotein-omhylningen ændres og indtrængen af HIV i målceller forhindres. Imidlertid fandtes kun en moderat reduktion med hensyn til viriol 5 infektivitet.

I PCT-international ansøgning WO 87/03903, offentliggjort 2. juli 1987, er omhandlet N-methyl-derivatet af deoxynojirimycin (DNJ), der udviser virkning over for HIV i udstrakt grad baseret på forbindelsens glycosidase I hæm-10 mende virkning. Imidlertid blev det herefter vist af Fleet et al., FEBS Lett, i tryk i 1988, at ikke alle glucosidase l-hæmmere er effektive hæmmere af HIV.

Derfor kan anden mekanisme været ansvarlig for den HIV-hæmmende virkning.

15 Opfindelsen angår således anvendelse af n-butyl-derivatet af deoxynojirimycin, der har vist sig at have væsentligt forøget hæmmende virkning over for det humane immunodefekte virus (HIV) i ikke-toxiske koncentrationer i forhold til den virkning, der udvises af de tilsvarende n-methyl- og n-ethyl-derivater. N-butyl-deoxynojirimycin reducerer unikt virustiteren med over fem 20 log-enheder i ikke-cytotoxiske koncentrationer, medens N-methyl- og N ethyl-deoxynojirimycin-derivaterne kun forårsager en to til fire log-orden reduktion af graden af infektiøs HIV. Som sådan har n-butyl-derivatet exceptionel og signifikant potentiel anvendelse ved behandlingen af det erhvervede immundefekte syndrom (AIDS). Denne enestående HIV-hæmmende virkning var 25 overraskende og uventet, dersom, og kun dersom glucosidase I hæmmende virkning er den operative mekanisme, da glucosidase I hæmmende virkning - af n-methyl- og n-butyl-derivaterne af deoxynojirimycin var angivet at være bogstavelig talt identiske af Schweden et al., Arch. Biochem. Biophys.

248(1), 335—340 (1986).

30 N-butyl-derivatet af deoxynojirimycin har følgende kemiske formel:

i/l\ I « U I

4

OH

»".X...»

5 V

^ CH2OH

(CH2)3CH3

For at vise stereoisomerismen viser fuldt optrukne og stiplede linier bind-10 inger, der er rettet henholdsvis over eller under papirets plan.

Opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til følgende tegning, hvor fig. 1 er en skematisk opstilling af forsøgsmetoden anvendt til at undersøge 15 den cytotoxiske virkning af forsøgsforbindelseme på T-celler, enten inficeret eller ikke-inficeret med HIV og parallelt hermed den HIV-hæmmende virkning af forsøgsforbindelseme. TCID er den vævskultur-infektiøse dosis. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640 medium med 10% fetal kalveserum indeholdende 100 enheder/ml penicillin G og 100 pg/ml streptomycin, 20 fig. 2 er en skematisk angivelse af forsøgsmetoden anvendt til at bestemme den relative del af HIV-inficerede celler i kulturer indeholdende 0,1 mg/ml af den hæmmende forsøgsforbindelse. Til forskellige tider blev prøver af de inficerede cellesuspensioner overført til inhibitor-frit medium, og den tid, det tog 25 for cellerne at udvise cytopatisk virkning (CPE) blev registreret,

fig. 3 er en grafisk afbildning, hvori hæmningen af HIV associeret CPE

(_% CPE) reduktion og forsøgsforbindelse-associeret cytotoxicitet (- % celledød) er afsat over for koncentrationen i mediummet i mg/ml af flere 30 forsøgsforbindelser (lægemidler). Cellelevedygtighed blev bestemt for ikke-HlV-inficerede celler. Forsøgsforbindelseme var N-methyl-, N-ethyl- og N-butyl-derivaterne af deoxynojirimycin (DNJ), castanospermin (Cast), N-(5- DK 175094 B1 5 carboxymethyl-1 -pentyl)-1,5-imino-L-fucitol (LFT) og 1,4-dideoxy-1,4-imino-L-arabinitol (LAB), Λ fig. 4 er en grafisk afbildning, hvor den virale titer (bestemt som TCID) er af-5 sat over for koncentrationen i mg/ml af forskellige af forsøgsforbindelseme (lægemidler) fra fig. 3 i afsnit (a) og (b), og fig. 5 er en grafisk afbildning, der viser forholdet mellem den tid, det tager for HIV-inficerede celler dyrket i nærværelse af 0,1 mg/ml n-butyl-10 deoxynojirimycin (lægemiddel) til at frembringe CDE, nar der anvendtes lægemiddelfrit substrat (dage inden CPE-udtrykkelse) og dyrkningstiden i nærværelse af lægemidlet udtrykt i dage. Efter 55 dages dyrkning (0) i nærværelse af lægemiddel forekom ingen virus under 100 yderligere dyrkningsdage uden lægemiddel (efter fjernelse af lægemidlet).

15 N-butyl-derivatet af deoxynojirimycin er en kendt forbindelse. Den kan fremstilles ved N-butylering af 1,5-dideoxy-1,5-imino-D-glucitol (deoxynojirimycin). Fremstillingsmetoder er for eksempel beskrevet i USA-patentskrifteme nr. 4 182 767 og 4 639 436.

20

Effektiviteten af de aktive N-butyl-deoxynojirimycin til den beskrevne anvendelse er blevet demonstreret ved den positive hæmmende virkning over for replikation af HIV in vitro. I dette forsøgssystem anvendtes humane T-celler, der er følsomme over for HIV-infektion, for visuelt at bestemme den 25 relative aktivitet af flere forsøgsforbindelsers evne til at hæmme opformering af HIV-inficerede celler. Da forskellige analoge forbindelser udviste ^ væsentligt afvigende resultater som beskrevet nedenfor, er det klart, at effek

tiviteten af en given forbindelse som inhibitor for HIV ikke kan forudses. Man har hidtil foreslået forskellige teorier med hensyn til virkningen af tidligere 30 kendte HIV-hæmmere. Videnskabelige undersøgelser på adskillige laboratorier har vist, at den gensidige indvirkning mellem omhylnings glycoproteinet, gp120, og en vis del af CD4 antigenet er involveret i genkendelsen af HIV og de fleste af de celler, som HIV inficerer, og bindingen af HIV til disse celler. I

Ul\ 1 / DU94 Dl 6 en artikel, der sammenligner den positive virkning af glycosidase-inhibitoren deoxynojirimycin (DNJ) på HIV’s infektiøse evne mod virkningen af fravær af ammonidase I inhibitoren deoxymannojirimycin (DMJ), der er den 2-epimere af DNJ, blev det således foreslået, at den ødelagte kulhydratstruktur af 5 gp120 eller precursoren herfor blokeringen af den N-knyttede oligosaccharid tilpasningsvej således er ansvarlig for denne virkning. Gruters et al., Natur 330. 74-77 (1987).

Den uforudsigelige virkning af en forsøgsforbindelse over for HIV er demon-10 streret i adskillige sammenlignende undersøgelser af strukturelt analoge sukkerderivater. Medens den kendte inhibitor for den cytopatiske virkning (CPE) af α-glucosidasen I inhibitoren castanospermin for eksempel er bekræftet, har hverken den epimere L-1,6-di-epicastanospermin eller den stereo-isomere af castanospermin, L-6-epicastanospermin, vist sig at virke hæm-15 mende. Se Fleet et al., FEBS Lett., i tryk, 1988.

Skønt begge enantiomere af 1,4-dideoxy-1,4-imino-arabinitol således også er velkendte glucosidase-inhibitorer [Fleet et al., Tetrahydron Lett. 26, 3127-3130 (1985); Fleet et al., Chemistry Lett. 1051-1054 (1986)], har den L-20 enantiomere stærk HIV-hæmmende virkning (se også verserende ansøgning US nr. 136 219, indleveret 21. december 1987), medens den D-enantiomere kun har meget ringe virkning på HIV opformering. For begge enantiomere reducerer N-methylering snarere end forøger anti-HIV virkningen. Hverken azofuranose-analogen af glucose eller N-benzyl-derivatet viste sig at have 25 nogen virkning på CPE. På lignende måde sås ingen HIV-hæmning for fagomin, den 2-deoxyglucose-analoge, skønt denne forbindelse også er velkendt for at have α-glucosidase-hæmmende virkning. (Se Fleet et al., FEBS Lett., i tryk, 1988.

30 Den hæmmende virkning af N-butyl-deoxynojirimycinet over for HIV i forhold til den hæmmende virkning af analoge forsøgsforbindelser er specifikt påvist ved hjælp af et in vitro undersøgelsessystem, i hvilket T-celler dyrkes i passende næringsdyrknings substrat og eksponeres for et HIV-inokkulum med DK 175094 B1 7 eller uden forsøgsforbindelse og sammenlignes med kontrolceller, der dyrkes i dyrkningssubstrat alene. Efter en passende inkubationsperiode bedømmes kulturerne for tilstedeværelsen af såkaldte syncytiale celler (kæmpe-celler). Typiske eksempler på et sådant forsøg til bedømmelse af inhibitorer for HIV 5 er omtalt af Fung et al., Bio/Technology 5, 940-946 (1987); Tyms et al., Lancet, October 31, 1987, (1987); og Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8120-8124(1987).

I nærværende tilfælde blev en human leukæmisk T-celle-linie anvendt, der er 10 beskrevet af Karpas, Leuk. Res. i, 35-49 (1977). Denne celle-linie (T-45) var etableret fra et barn med akut lyphoblastisk leukæmi. En anden T-celle-linie, der anvendes til at demonstrere den hæmmende virkning af N-butyl-deoxynojirimycin, er MOLT-4-cellelinien. Denne cellelinie stammede oprindelig fra det perifere blod fra en patient med akut lymphoblastisk leukæmi.

15 Yderligere oplysning om oprindelse og egenskaber ved denne cellelinie kan opnås fra Minowada, J. Nati. Cancer Inst. 48, 891-895 (1972). MOLT-4-cellelinien er deponeret uden begrænsning i den permanente samling i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under registreringsnummeret ATCC CRL 1582. Prøver af dellelinien kan fås frit til-20 gængeligt ved henvendelse til depotet.

Cellefri suspensioner af HIV blev fremstillet ud fra inficerede kulturer. Koncentrationen af inféktiøse partikler blev bestemt ved endepunktstitreringsun-dersøgelses-metoden under anvendelse af ti-fold rækkefortyndinger. Det til-25 nærmerede nummer infektiøse partikler i hvert præparat blev bestemt ved den højeste fortynding, der indeholder infektiøs HIV bestemt ved syncytial dannelse, cytopathicitet [Leonard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3570-3574 (1988); Barre-Sinoussi et al., Science 220, 868-870 (1983)] og HIV-antigen [Karpas et al., Lancet 1, 695-697 (1985)] syntese efter 10 dages 30 dyrkning med 104 T-celler. Dette repræsenterer koncentrationen af infektiøse partikler, i det efterfølgende defineret som den vævsdyrknings-infektiøse dosis (TCID).

ui\ i ν ι/νατ υ i 8

Undersøgelsen blev foretaget I 96 brønds plast-mikro-titterplader, hvori 0,2 ml dyrkningssubstrat indeholdende 104 T-celler er udsået i hver brønd. RPMM640 tilsat 10% fetal kalveserum blev anvendt som dyrkningssubstrat.

I hver undersøgelse anvendtes 6 brønde. Tre (1-3) er inficeret med 104 5 TCID/brønd HIV-1 eller HIV-2, og til de andre tre (4-6) sættes udelukkende dyrkningssubstrat. Substratet udskiftes med samme mellemrum for hver forsøgsforbindelse. Den detaljerede forsøgsmetode er angivet i fig. 1 og 2.

Følgende eksempler illustrerer opfindelsen mere detaljeret.

10 EKSEMPEL 1

Den HIV-hæmmende aktivitet af N-n-butyldeoxynojirimycin (BuDNJ) blev undersøgt i forskellige sammenligninger med N-methyl (MeDNJ) og N-ethyl 15 (EtDNJ) analoge og med castanospermin (Cast), 1,4-dideoxy-1,4-imino-L-fucitol (LAB) og N-(4-carboxymethyl-1-pentyl)-1,5-imino-L-fucitol (LFT) og andre aminosukkerderivater omtalt tidligere.

Forsøgsforbindelsemes effektivitet i dette eksempel blev undersøgt på føl-20 gende måde: 0,2 ml dyrkningssubstrat indeholdende 104 T-45 celler blev overført til hver brønd af en 96-brønds fladbundet vævsdyrkningsplastplade, og cellerne fik lov til at henstå for at falde til ro ved 37eC (se fig. 1). Efter 4 timers forløb blev substratet suget af og ombyttet med substrat, der indeholdt forsøgsforbindelsen. Efter inkubation natten over blev substratet fjernet, og 25 1 04 TCID virus (HIV-1 eller HIV-2) blev sat til hver brønd. Inkubationen blev fortsat ved 37CC i 1 time i 5% CO2. Herefter blev vækstsubstratet indeholdende forskellige forbindelser tilsat, og inkubation ved 37°C blev fortsat. Kon-trolkulturerne blev holdt som angivet i fig. 2. På den fjerde dag blev cellesuspensionerne for hver brønd opdelt og udsået i to ny brønde, og 0,2 ml frisk 30 substrat med forbindelserne blev tilsat. Dette blev gentaget på den syvende dag. Cellerne blev undersøgt mikroskopisk på dagene 1-10 for tilstedeværelsen af syncytia, væksthastighed og forekomsten af cytopatisk virkning. (CPE) (kæmpe-celler, pycnotiske kerner, tab af refraktilitet). CPE (100%) blev de- DK 175094 B1 9 fineret som at der ikke var nogen runde, refraktile, ensartede celler tilbage; kun kæmpestore, opblæste pycnotiske celler forefandtes. Levedygtigheden af HIV-inficerede kulturer blev bestemt ved hjælp af en grovtæl-ling/bedømmelse af celler, der undergik CPE i forhold til runde refraktile en-5 sartede (normale) celler i en given kultur. Celler i brønde, der var inkuberet med forbindelser, der synes at hæmme eller reducere HIV-formering, og hvori der var markant celleproliferation, blev enten overført til større brønde (fra en 24-brønds plade) eller opdelt for at opretholde en omtrentlig konstant celletæthed for at fremme kontinuert celledeling.

10

For at bestemme om der var en gradvis reduktion af HIV-inficerede celler i kulturerne, opretholdt med BuDNJ, blev prøver af celler inficeret med 104 TCID HIV-1 og dyrket i tilstedeværelse af 0,1 mg/ml BuDNJ på forskellige tidspunkter overført til særskilte brønde og dyrket i lægemiddelfrit substrat 15 som angivet i fig. 3. Kulturerne blev herefter kontrolleret for udvikling af CPE, hvilket var en indikation på aktiv HIV opformering.

Tiderne for forekomst af fremskreden CPE blev registreret. For at bekræfte, at HIV-1 eller HIV-2 var årsagen til CPE, blev celler fikseret på glas-20 objektglas for at verificere udtrykkeisen af det tilsvarende virale antigen under anvendelse af metoden beskrevet af Karpas et al., Lancet 1, 695-697 (1985). Forbindelser, der viste sig at hæmme HIV-1 og HIV-2 opformering i T-45 celler blev herefter anvendt med den MOLT-4 humane leukæmiske T-celle-linie.

25 Resultaterne af de nævnte forsøg var følgende:

Virkningen af forskellige koncentrationer af henholdsvis MeDNJ, EtDNJ,

Cast, BuDNJ, LFT og LAB på CPE-dannelse er angivet i figur 3. Disse resultater viser en klokkeformet dosisafhængighed for MeDNJ, EtDNJ og Cast.

30 Cellelevedygtighedsresultaterne angivet i fig. 3 og væksthastighederne i tabel 1 for ikke-inficerede celler dyrket i tilstedeværelse af MeDNJ, EtDNJ og Cast antyder, at disse forbindelser mangler selektiv anti-viral aktivitet og er cytotoxiske, hvilket ville forventes af inhibitorer af oligosaccharid-biosyntese.

DK 175094 B1 10

Derfor skyldes det tilsyneladende tab i anti-viral aktivitet (klokkeformet dosisafhængig) for disse lægemidler ved høje koncentrationer den cytotox-iske virkning af lægemidlerne, der efterligner og bedømmes som en HIV-induceret cytopatisk virkning. I modsætning hertil viste forbindelserne 5 BuDNJ, LFT og LAB ingen cytotoxicitet inden for det anvendte koncentrationsområde. BuDNJ forhindrede fuldstændigt CPE i HIV-inficerede celler i alle undersøgte koncentrationer. Forskellen i opførsel mellem BuDNJ og de andre alkylanaloge af DNJ (MeDNJ og EtDNJ) antyder, at dens virkningsmekanisme må være en anden. På lignende måde fandt man, åt a-10 glucosidase inhibitoren LFT, der ikke ødelægger oligosacchaiide-biosyntesen, ikke var cytotoxisk. Egenskaberne ved LAB svarede til egenskaberne af LFT. Aktiviteten af LAB som en α-glucosidase-inhibitor er angivet af Fleet et al., FEBS Lett., i tryk, 1988, men skal endnu afprøves for aktivitet over for de arbejdende α-glucosidaser (dvs. I og II). Den HIV-15 hæmmende virkning af LFT og LAB er omhandlet i tilsvarende ansøgning US nr. 136 219, indleveret 21. december 1987.

Kvantitative resultater over virkningen af de forskellige forbindelser på ikke-inficerede celler (cytotoxicitet) blev opnået ved at sammenligne deres 20 væksthastighed med kontrolcellers væksthastighed, der ikke var udsat for lægemidler (tabel 1). Fig. 4 og tabel 2 viser relationen mellem TCID-titeren af dyrkningssupematanterne fra T-45 celler inficeret med HIV efter 10 dages dyrkning, og koncentrationen af lægemiddel. Disse resultater viser, at LAB og LFT kun var i stand delvis til at reducere TCID, selv ved meget høje koncen-25 trationer af lægemidler. På samme måde reducede DNJ, MeDNJ og EtDNJ kun delvis TCID, skønt i større grad end LAB og LFT. Disse lægemidlers manglende evne til alene totalt at reducere TCID kan skyldes heterogenecitet af virusproduktionen eller spredning. Fig. 4 og tabel 2 viser, at kun BuDNJ var i stand til at opnå uvæsentlige virus TCID titre ved koncentrationer, der 30 var ikke cytotoxiske. Disse resultater antyder sammen med resultaterne angivet i fig. 3 en viral-specifik aktivitet for forbindelsen. Tabel 2 viser resultaterne af en direkte jævnbyrdig sammenligning af anti-viral aktivitet (reduktion i TCID) af SNJ og dens derivater over for HIV-1 og HIV-2. Herudover DK 175094 B1 11 blev MOLT-4 cellelinien alene anvendt. Disse resultater viser, at lignende anti-viral aktivitet ses over for HIV-1 og HIV-2, og at denne aktivitet ikke er begrænset til virus dyrket i T-45 cellelinien.

Λ 5 For at bestemme, om der var eller ikke var en egentlig reduktion i HIV-inficerede celler i tilstedeværelse af BuDNJ, overførtes prøver af den inficerede cellesuspension dyrket gennem forskellig tid tilstedeværelse af lægemidlet til lægemiddelfrit substrat som angivet i fig. 2 Kulturerne blev herefter kontrolleret for udviklingen af CPE og kæmpecelledannelse (indika-10 tion på aktiv HIV-opformering). Forøgelse i den tid, det tager for cellerne at udvikle CPE, når først lægemiddeifrit substrat var anvendt (fig. 5) , antyder, at længere tids udsættelse for BuDNJ reducerer mængden af inficerede celler i kulturerne. Medens dette enten antages som en reduktion i fordoblingstiden af de inficerede celler i forhold til uinficerede T-45 celler eller som viral 15 opformering med cytolyse ændrer ikke den konklusion, at den naturlige omsætning af cellepopulationen in vivo til sidst vil reducere antallet af inficerede celler dramatisk og muligvis bryde re-infektionscycklussen.

i 12 TABEL 1

Cvtotoxicitet oq T-cellevækst

Forbindelse Dosis Bestemt cellevækst 5 _(mg/ml)_Virus-uinficeret, Dag 7

Intet lægemiddel - 1,2 x 106 DNJ 0,50 1,4x106 0,25 · 1,4 x106 10

MeDNJ 0,50 5,0x106 0,25 1,0 x106 0,10 1,0 x106 0,05 1,2x106 15 0,01 1,2 x106

EtDNJ 0.10 1,3x106 0,05 1,2x106 0,01 1,2x106 20

BuDNJ 0,10 1,4 x106 0,05 1,2x106 0,01 1,2 x106 25 LAB 0,50 1,0x106 0,25 1,5x106 0,10 1,5 x106

Cast 0,70 Toxisk 30 0,35 8,0x105 0,18 8,0 x105 0,09 1,0x106 0,02 1,2x10® DK 175094 B1 13 TABEL 2 SAMMENLIGNING AF DNJ-DERIVATER* 5 Virus Dosis HIV-1 HIV-2 _(mg/ml)_(TCID)_(TCID)_

Kontrol - 106 106 DNJ 0,10 105 105 10 MeDNJ 0,10 102 102

EtDNJ 0,10 103 103

BuDNJ_O10_<10_<10_ + Identiske resultater blev fundet, hvad enten 104 T-45 celler eller MOLT-4 15 celler blev behandlet med DNJ og forbindelsens tre derivater inden infektion af cellerne med HIV-1 og for sig med HIV-2 (104 TCID). HIV-1, der blev anvendt til at inficere T-45 cellelinien, var først gået gennem T-45 celler. På samme måde havde HIV-1, der blev anvendt til at inficere MOLT-4, først gået gennem MOLT-4 celler. Det samme blev foretaget med HIV-2. TCID-værdier 20 blev målt efter dag 10.

EKSEMPEL 2

For specielt at illustrere den HIV-hæmmende virkning af N-butyl-4 25 deoxynojirimycin ifølge opfindelsen i forhold til virkningen af de N-methyl- og N-ethyl-analoge såvel som det ikke alkykerede deoxynojirimycin og ubehandlede kontroller er resultatet i tabelform af forsøgene angivet nedenfor, idet metoden var som beskrevet i eksempel 1 for både T-45 celler og MOLT-4 celler, der blev inficeret med HIV-1 for sig og HIV-2 for sig. Det vil sige, HIV-1 30 blev først passeret ind i T-45 celler; på samme måde blev HIV-1 passeret gennem MOLT-4 celler. Den samme passage blev foretaget med HIV-2. Forsøgsforbindelserne blev anvendt i en koncentration på 0,1 mg/ml. 104

Ul\ I f 9U9H D I

14 TCID HIV-1 for sig og HIV-2 for sig blev anvendt til at inficere 104 celler. Efter afslutning af forsøget var virustitrene følgende: TABEL 3 5

Virus-titer _Kontrol DNJ MeDNJ EtDNJ BuDNJ_ HIV-1 106 105 102 103 10 10 HIV-2 106 105 102 103 10_ '

Disse resultater viser således, at N-butyl-deoxynojirimycinet overraskende ikke alene er to log størrel sesordener mere effektive som en inhibitor af HIV end N-methyl-deoxynojirimycinet, men også tre logstørrelsesordener mere 15 effektive end N-ethyl-deoxynojirimycinet ved dobbelte forsøg (tabel 2 og 3) hver med to virusstammer i to forskellige cellelinier.

EKSEMPEL 3 20 Den omhandlede N-butyl-DNJ-inhibitor blev yderligere skelnet fra DNJ og N-methyl-DNJ ved at sammenligne indarbejdningen af radiomærket galactose, mannose, glucose og tymidin i B16-F10 musemelanom-celler efter inkubation af cellerne med forsøgsforbindelsen. Følgende resultater opnåedes: 25 1. DNJ og N-butyl-DNJ hæmmer hver især mannose-udnyttelsen, medens N- methyl-DNJ enten stimulerer indarbejdningen eller konsekvent ikke havde nogen virkning.

2. DNJ og N-butyl-DNJ hæmmede hver især i væsentlig grad galactose-30 indarbejdningen i cellerne ved 1,0 m eller mindre, medens N-methyl-DNJ kun svagt virkede hæmmende.

DK 175094 B1 15 3. I glucoseudnyttelses/hæmningsforsøg havde N-methyl-DNJ en omvendt dosis-responskurve, medens N-butyl-DNJ havde ringe eller ingen virkning, og DNJ hæmmede på en normal dosisafhængig måde.

5 4.3H-thymidin-optagelsen i cellerne var ikke påvirket af N-butyl-DNJ indtil 2,0 mM, medens N-methyl-DNJ hæmmede indarbejdelsen ved 1,0 mM.og DNJ hæmmede hæmmede indarbejdelsen ved 2,0 mN.

Det her beskrevne antivirale middel kan anvendes til administrering til pa-10 tienter inficeret med det humane immundefekte virus på almindelig måde, fortrinsvis i formuleringer med farmaceutisk acceptable fortyndingsmidler og bærestoffer. Dette middel kan anvendes i den fri aminform eller i saltformen heraf. Farmaceutisk acceptable saltderivater er for eksempel HCI-saltet. Mængden af administreret aktivt middel skal være en effektiv mængde, dvs, 15 en mængde, der er medicinsk helbredende, men som ikke frembyder toxiske virkninger, der overvejer fordelene ved anvendelsen af forbindelsen. Det er at forvente, at en voksen human dosis normalt vil ligge fra ca. 1 mg aktiv forbindelse. Den foretrukne administreringsmåde er peroral i form af kapsler, tabletter, siruper, elixirer og lignende, skønt parenteral administrering også kan 20 anvendes. Passende præparater af den aktive forbindelse i passende acceptable fortyndingsmidler og bærestoffer i terapeutisk dosisform kan fremstilles således, som det er angivet generelt inden for fagområdet, fx i Remington’s Pharmaceutical Sciences, udg. Arthur Osol, 16. udgave, 1980, Mack Publishing Co., Easton, PA.

25

Claims (1)

1. UlV 1 f DU34 Bl Anvendelse af N-butyl-derivatet af deoxynojirimycin eller et farmaceutisk acceptabelt salt heraf til fremstilling af et farmaceutisk præparat til at hæmme 5 human immundefekt virus hos en patient. *