DK172622B1 - Fremgangsmåde til at bestemme indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse i individuelle emner, apparat til brug ved u - Google Patents

Description

i DK 172622 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til at bestemme indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse i individuelle emner, et apparat til brug ved udøvelse af fremgangsmåden og en fremgangsmåde til detektion eller 5 sortering af individuelle emner på grundlag af indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse.

Den først nævnte fremgangsmåde er især udviklet med henblik på at bestemme indholdet af fedtopløselige forbindelser, der har sammenhæng med hangriselugt, i 10 individuelle kødemner.

Kødudskæringer fra ukastrerede hangrise eller orner kan under og efter kogning eller stegning udvikle en ubehagelig aroma, såkaldt hangriselugt eller ornelugt, hvorimod sådanne lugtgener sjældent forekommer 15 ved en sådan tilberedning af kød fra kastrerede hangrise. Til undgåelse af sådanne lugtgener kastreres hangrise derfor ofte i en ung alder. Imidlertid bliver herved fodereffektiviteten lavere og sygdomshyppigheden forøges, og samtidig fås en formindsket kødprocent i 20 slagtekroppene.

Der har være foreslået metoder til at detektere, om individuelle slagtekroppe vil udvikle hangriselugt ved tilberedning af udskæringer deraf, således at det bliver muligt at frasortere disse kroppe inden videre-25 forarbejdning til udskæringer beregnet for detailhandelen og at anvende de frasorterede kroppe industrielt, eksempelvis til konserves eller pølsefremstilling, hvor lugtudviklingen vil være uden betydning.

Sådanne metoder er baseret på, at man på en ek-30 strakt af en prøve fra de individuelle slagtekroppe bestemmer analytiske data for deri indeholdte forbindelser, der har sammenhæng med hangriselugt, f.eks. ska-tol, indol, androstenon eller andre stoffer, og sammenligner sådanne data med forud fremstillede standarder.

35 I denne forbindelse beskriver dansk patent nr. 155.200 omsætning af ekstrakten med en farvedanner for deri in- 2 DK 172622 B1 deholdte forbindelser med sammenhæng med hangriselugt og påfølgende spektrofotometrisk bestemmelse, dansk patent nr. 145.356 beskriver anvendelse af IR-spektrofo-tometriske transmissionsdata, og dansk patent nr.

5 154.667 beskriver anvendelse af spektrofluorometriske data.

J.A. Garcia-Regueiro et. al., J. High Res.

Chrom. & Chrom. Comm., 9,1986,362-3, angiver, at 5a-androst-16-en-3-on (androstenon) og skatol er for-10 bindeiser med sammenhæng med hangriselugt og beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af skatol og indol i prøver af rygspæk fra grise, hvorved man udtager en fedtstofholdig prøve af et enkeltindivid , 15 sønderdeler prøven og ekstraherer den med et op løsningsmiddel for den fedtstofholdige forbindelse (her indol og skatol), foretager en rensning af ekstrakten, og udfører en HPLC-analyse på en analyseprøve af 20 den rensede ekstrakt ved at injicere prøven i en mobil fase, der ledes gennem en separationskolonne med en detektor, hvis signaler omsættes til et udtryk for indholdet af forbindelserne.

Den omtalte ekstraktrensning involverer foruden 25 frysning, filtrering, inddampning og genopløsning en passage gennem en kolonne pakket med Florisil. Da en sådan kolonne regelmæssigt må udskiftes, er metoden, trods angiveligt gode resultater, næppe egnet til udførelse af lange serier af analyser.

30 Sep-pak minikolonner er forsøgt anvendt ved rensningen, men disse blev vraget, da de gav mindre reproducerbare resultater end kolonner med Florisil.

Det er opfindelsens formål at angive en fremgangsmåde, der er egnet til lange serier af analyser og 35 således kan anvendes industrielt. Det er ligeledes opfindelsens formål at angive en fremgangsmåde til 3 DK 172622 B1 detektering eller sortering af individuelle emner ud fra analyseresultaterne, såsom til frasortering af slagtede, ukastrerede hangrise, der ved tilberedning vil kunne give afvigende lugt.

5 Det har nu overraskende vist sig, at man trods den ovennævnte fordom mod rensning ved hjælp af minikolonner, og trods den kendsgerning, at forkolonner ifølge kendt HPLC-teknik almindeligvis anvendes til opkoncentrering af en prøve eller til beskyttelse af en ko-10 lonne mod partikler stammende fra injiceringsudstyr o.l., kan benytte en forkolonne til at retardere fedtstoffer i en analyseprøve og således beskytte den egentlige separationskolonne mod tilstopning med disse, og at man, mens den fedtstofrensede analyseprøve er 15 under passage i separationskolonnen, i det væsentlige fuldstændigt kan regenerere forkolonnen.

I overensstemmelse hermed er den første fremgangsmåde ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at analyseprøven i den mobile fase føres gennem en fedtstofretar-20 derende forkolonne, der er anbragt foran separationskolonnen, og at forkolonnen efterfølgende vaskes separat i et forud bestemt tidsrum, fortrinsvis ved at strømretningen i forkolonnen vendes, i hvilket tidsrum analyseprøven i den mobile fase fortrinsvis ledes 2 ζ videre gennem separationskolonnen. Apparatet til brug ved udøvelse af denne fremgangsmåde er ejendommeligt ved, at det omfatter en fedtstofretarderende forkolonne, der er anbragt mellem og forbundet til pumpeindretningerne og separationskolonnen, og ventiler til at indkoble forkolonnen i en separat fortrinsvis revers vaskestrøm i et forud bestemt tidsrum uden at strømretningen i separationskolonnen ændres.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden er ejendommelig ved følgende trin: 35 at den mobile fase ledes gennem forkolonnen og separationskolonnen, 4 DK 172622 B1 at der fra et lager af separat fremstillede og opbevarede ekstrakter automatisk udtages en analyseprøve repræsenterende et emne, at en forud bestemt mængde af prøven injiceres i 5 den mobile fase og med denne føres gennem forkolonnen, at analyseprøven i den mobile fase føres videre i separationskolonnen, medens strømretningen i forkolonnen vendes og denne kolonne vaskes med en eller flere, fortrinsvis fedtopløsende skyllefaser og - om øn-10 sket - til slut med samme middel som den mobile fase, og at strømretningen i forkolonnen derefter vendes igen.

En foretrukket udførelsesform af det omhandlede 15 apparat er ejendommelig ved, at det omfatter en autosampler med en injektionsventil for en analyseprøve, to seksportventiler, der hver kan stå i to stillinger, en første pumpe, der kan pumpe en mobil fase fra et reservoir for dette gennem en udvalgt port i en af seksport-20 ventilerne, en anden pumpe, der efter valg kan pumpe en mobil fase, en yderligere mobil fase og skyllefaser fra reservoirer for disse gennem en anden udvalgt port i en af seksportventilerne, en fedtstofretarderende forkolonne, eiL_separationskolonne, en detektor og rør- ^ forbindelser mellem delene, der er forbundet på en sådan måde, at forkolonnen ved en første kombination af ventilstillinger indgår i følgende første serieforbindelse : første pumpe, autosampler, forkolonne med ret-30 vendt flow, separationskolonne og detektor, ved en anden kombination af ventilstillinger indgår i følgende anden serieforbindelse: anden pumpe, forkolonne med revers flow, autosampler og afløb, 35 og ved en tredie kombination af ventilstillinger indgår i følgende tredie serieforbindelse: anden pumpe, autosampler, forkolonne med retvendt flow og afløb.

5 DK 172622 B1

Hvis opløsningsmidlet, der anvendes ved ekstrak- n tion af den fedtholdige prøve, og det^ mobile fase kromatograferer væsentligt forskelligt, vi der være en øvre grænse for rumfanget af den prøve, der injiceres 5 i den mobile fase, over hvilken der optræder en topbredning i det optagne kromatogram og en tilsvarende reduktion i selektiviteten for den foretagne analyse.

Det har vist sig, at denne ulempe kan undgås eller væsentligt formindskes, hvis prøven inden passage 10 af separationskolonnen fortyndes med en udvalgt yderligere mobil fase.

En hertil svarende udførelsesform for fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man yderligere lader den mobile fase passere et blandekammer, der er anbragt 15 foran forkolonnen, og at man medens den afmålte mængde analyseprøve passerer blandekammeret via en åbning i dette tilblander en yderligere mobil fase. Et apparat til brug ved udøvelse af denne udførelsesform er ejendommeligt ved, at det yderligere omfatter et 20 blandekammer med tre åbninger, hvoraf den første er rørforbundet til autosamplerens injektionsventil og den anden til forkolonnen, og at forkolonnen ved en første og anden kombination af ventilstillinger indgår i den første, henholdsvis anden serieforbindelse som ovenfor 25 nævnt, idet samtidig den tredie åbning til blandekammeret er afspærret, og at forkolonnen ved en tredie kombination af ventilstillinger indgår i den første serieforbindelse som ovenfor nævnt, idet samtidig den tredie åbning til blandekammeret er forbundet til den anden 30 pumpe.

Detektionsprlncippet for detektoren er fortrinsvis fluorescens.

Til kontrol af de foretagne analyser kan det være fordelagtigt, at analyseprøven indeholder en kendt 35 mængde af en med forbindelserne til analyse beslægtet referenceforbindelse. I overensstemmelse hermed er en 6 DK 172622 B1 udførelsesform for fremgangsmåden ejendommelig ved, at man til den fedtstofholdige prøve før eller under ekstraktionen af denne sætter en forud bestemt mængde af en referenceforbindelse, der er beslægtet med den 5 fedtopløselige forbindelse, der skal påvises ved HPLC-analysen, fortrinsvis, 2-, 4-, 5-, 6- eller 7-methylin-dol til bestemmelse af skatol og/eller indol.

Ved udførelse af fremgangsmåden kan det være fordelagtigt i forbindelse med påvisning ^ af flere fedtopløselige forbindelser ved HPLC-analysen at ændre den mobile fase og/eller ændre den mobile fases løbehastighed til hurtigere gennemløb, efter at analyseprøven er ført ind i separationskolonnen. På denne måde kan analysetiden forkortes, uden at nøjag-15 _tiqheden forringes.

En yderligere udførelsesform for fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man til påvisning af en ikke-fluorescerende, fedtopløselig forbindelse sammen med en eller flere andre fedtopløselige forbin-20 delser, der er fluorescerende, til ekstrakten eller analyseprøven sætter et derivatiseringsmiddel, der gør forbindelsen fluorescerende.

I stedet for en sådan præ-kolonnederivatisering kan der udføres en postkolonnederivatisering, d.v.s.

25 ved omsætning af et eluat fra separationskolonnen med et derivatiseringsmiddel og efterfølgende detektion af derivatet i detektoren.

Hvis den ikke-fluorescerende fedtopløselige forbindelse til påvisning sammen med en eller flere andre 30 fedtopløselige forbindelser, der er fluorescerende, er androstenon, vil den sidstnævnte foretrukne udførelses-form for fremgangsmåden være ejendommelig ved, at man derivatiserer androstenon med et derivatiseringsmiddel udvalgt blandt dansylhydrazin, 4-hydrazino-2-stilbazol 35 0g 4'-hydrazino-2-oxo-l,3-diazol, fortrinsvis dansylhydrazin.

7 DK 172622 B1

Foretrukne ekstraktionsmidler for den fedtstofhold ige prøve er udvalgt blandt methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, acetonl-trll, tetrahydrofuran, acetone, formamid, dioxan og 5 blandinger af disse med hinanden og/eller med vand, fortrinsvis methanol.

Ved den omhandlede fremgangsmåde er den mobile fase fortrinsvis valgt blandt methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, l-butanol, 2-butanol, acetoni-10 tril, tetrahydrofuran, formamid, dioxan og blandinger af disse med hinanden og/eller med vand, eventuelt tilsat en puffer, den yderligere mobile fase er valgt blandt ovennævnte mobile faser, idet den dog fortrinsvis indeholder mere vand, og skyllefaserne er fortrins-15 vis valgt blandt samme opløsningsmidler som nævnt under ekstraktionsmidler.

En særlig foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden er ejendommelig ved, at den fedtstofholdige prøve er en spækprøve fra en svineslagtekrop, og at der 20 på samme analyseprøve analyseres for indholdet af skatol, indol og/eller androstenon, idet anstrostenonen forud er blevet præderivatiseret til opnåelse af en fluorescerende forbindelse.

Den anden fremgangsmåde ifølge opfindelsen til 25 detektion eller sortering af individuelle emner på grundlag af indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse er ejendommelig ved, at man bestemmer indholdet af forbindelsen eller forbindelserne ved udøvelse af den første fremgangsmåde og automatisk 30 sammenholder det med fastsatte parametre i en detek-tions- eller sorteringsmodel.

En foretrukket udførelsesform for denne fremgangsmåde til detektion eller sortering af kødemner med hangriselugt er ejendommelig ved, at man bestemmer 3^ indholdet af skatol, androstenon og eventuelt indol i samme analyseprøve og sammenholder det med parametrene i detektions- eller sorteringsmodellen, idet man om 8 DK 172622 B1 nødvendigt frasorterer emner, for hvilke indholdet af skatol, androstenon og eventuelt indol i en analyseret spækprøve overskrider forudbestemte tærskelværdier.

En anden foretrukket udførelsesform for den anden 5 fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man tilsætter en mængde af en referenceforbindelse, fortrinsvis 2-me-thylindol, der er afpasset frasorteringsgrænsen, til spækprøverne og vurderer, om tærskelværdien for de analyserede forbindelser er overskredet ved at sammen-10 lignet analyseværdier såsom tophøjde eller topareal for de analyserede forbindelser med de tilsvarende værdier for referenceforbindelsen.

Opfindelsen er ovenfor blevet beskrevet under henvisning til fedtopløselige forbindelser med relation 15 til hangriselugt, men kan også anvendes til analyse af indholdet af fedtopløselige aktive midler i fedtstof-holdige farmaceutiske præparater, eller til restkoncentrationsbestemmelse af fedtopløselige sporforbindelser, såsom pesticider eller antibiotika, i biologiske mate-20 rialer.

Opfindelsen vil nu blive nærmere beskrevet under henvisning til tegningen, på hvilken:

Figur 1 på skematisk form viser et apparat i tre forskellige indstillinger til brug ved udøvelse af den 25 første fremgangsmåde ifølge opfindelsen,

Figur 2 viser indstillingerne i en anden udførelsesform af apparatet,

Figur 3 viser kromatografisk adskillelse af indol, skatol og derivatiseret androstenon, og

Figur 4 illustrerer selektiviteten i det kromatografiske system ved tre udførelsesformer for den første fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

9 DK 172622 B1 På et slagteri udtages spækprøver af svineslag-tekroppe på slagtelinien eller i kølerummet. De enkelte prøver mærkes tydeligt, så de kan tilbageføres til hver sin slagtekrop. Prøverne transporteres til et laborat-5 orium på slagteriet, hvor en laborant forbereder prøverne for HPLC-analyse:

Der afvej es omhyggeligt en forud bestemt mængde af prøven, f.eks. 0,5 g fedtvæv. Prøven kommes i et glas, og der tilsættes en bestemt mængde, f.eks. 2 ml 10 af et opløsningsmiddel for den eller de fedtopløselige forbindelser, der skal bestemmes. Opløsningsmidlet opløser eller oplukker eventuelt også de bestanddele, hvori forbindelserne er bundet. Om ønsket kan der tilsættes en bestemt mængde, f.eks. 0,02-1,00 ppm af en 15 referenceforbindelse, som detekteres ved den senere HPLC-analyse og anvendes som intern standard, til at korrigere resultaterne for den/de undersøgte forbindelser .

Glasset anbringes i en homogenisator, i hvilken 20 fedtvævet finhakkes, så forbindelserne lettere udtrækkes af opløsningsmidlet.

Derefter underkastes ekstrakten en rensning til fjernelse af i det mindste en stor del af det uopløste materiale, idet glasset centrifugeres i en almindelig 25 laboratoriecentrifuge, der eventuelt kan være kølet.

Laboranten overfører derefter ekstrakten til et autosamplergias og anbringer det i autosamplerens magasin sammen med andre glas, der indeholder ekstrakter fra andre spækprøver, som er blevet behandlet på til-30 svarende måde.

Hvis en af de søgte forbindelser skal derivati-seres før den kan detekteres ved HPLC-analysen, kan laboranten sætte en forud bestemt mængde derivatiserings-middel til hvert glas i magasinet.

35 Når der i autosamplerens magasin er opsamlet tilstrækkelig mange glas med ekstrakt, kan laboranten 10 DK 172622 B1 starte analyseudstyret, som automatisk analyserer ekstrakterne for indholdet af de søgte indholdsstoffer og derefter registrerer og lagrer resultaterne i et permanent eller flygtigt medium. Dette kan f.eks. startes 5 ved arbejdstids ophør, således at resultaterne foreligger næste dag ved arbejdstidens påbegyndelse.

Der benyttes et HPLC-udstyr omfattende en autosampler, kolonnetermostat, to pumper, en enhed med to seksportventiler og rørforbindelser, en fluorescensde-10 tektor og EDB-udstyr og software til styring af HPLC-udstyret og opsamling og bearbejdning af data. De anvendte komponenter er gængse handelsvarer.

Endvidere benyttes en forkolonne i en forkolon-neholder og en separationskolonne. Disse er også han-15 delsvarer. Den indre kolonnediameter er sædvanligvis 1-10 mm, fortrinsvis 4 mm. Længden af forkolonnen er 1-25 mm, fortrinsvis 4 mm, og længden af separationskolonnen, der må afpasses efter partikelstørrelsen og arten af kolonnefyldmaterialet, den ønskede omtrentlige 20 gennemløbstid, arten af de fedtopløselige forbindelser til analyse og den eller de mobile faser ligger sædvanligvis i området 20-150 mm.

Fyldmaterialet til kolonnerne er et sådant C10-materiale med en middelpartikelstørrelse i området 25 2-10 y.

Ved den i figur 2 viste udførelsesform benyttes et blandekammer med tre åbninger. Rumfanget er 1-10 yl.

Den videre analysegang illustreres af figur 1 og 30 2.

På figur 1 ses to pumper 1,2, to seksportventiler 3,4, hver med 6 porte 3a-3f, 4a-4f. Hver ventil kan stå i to stillinger, hvor den første stilling betegner forbindelse mellem portene 3a-3b, 3c-3d og 3e-3f, hen-35 holdsvis 4a-4b, 4c-4d og 4e-4f, og den anden stilling betegner forbindelse mellem portene 3b-3c, 3d-3e og 11 DK 172622 B1 3f-3a, henholdsvis 4b-4c, 4d-4e og 4f-4a. Endvidere ses en autosampler 5, en forkolonne 7 en separationskolonne 8 og en fluorescensdetektor 9. Rørforbindel-serne er følgende: 5 fra pumpe 1 til ventilporten 3a, fra ventilporten 3b til autosampleren 5, fra autosampleren 5 til forkolonnen 7, fra forkolonnen 7 til ventilporten 3e, fra ventilporten 3f til separationskolonnen 8, 10 fra separationskolonnen 8 til detektoren 9, fra pumpen 2 til ventilporten 4d, fra ventilporten 4e til ventilporten 3d, fra ventilporten 3c til ventilporten 4c, og to forbindelser, fra ventilporten 4b, henholdsvis 15 4f til afløb, idet endvidere ventilporten 4a er ubenyttet.

I situationen vist på figur la står ventilen 3 i første stilling og ventilen 4 står i anden stilling. Pumpen 1 pumper en fase fra et ikke vist re-20 servoir gennem autosampleren 5, forkolonnen 7, separationskolonnen 8 og detektoren 9. Pumpen 2 står i stand-by niveau og pumper en ganske ringe mængde af samme fase til afløb. Nu afmåles en forud bestemt mængde ekstrakt af autosampleren 5 og denne analyse-25 prøve injiceres automatisk via samplerens injektionsventil og føres gennem forkolonnen 7. Her vil vævsrester fortrinsvis fanges af kolonnefilteret, men fedtstoffer bindes af kolonnefyldmaterialet. De søgte fedtopløselige forbindelser passerer hurtigt forkolonnen 30 7. Når de påbegynder kromatografering gennem separationskolonnen 8 omskiftes apparatet automatisk til situationen vist på figur lb, idet ventilen 3 skiftes til den anden stilling. Pumpen 1 vil nu, og i øvrigt også i situationen beskrevet nedenfor i forbindelse med 35 figur lc, pumpe den mobile fase gennem separationskolonnen 8 og detektoren 9; herunder kromatograferer 12 DK 172622 B1 de fedtopløselige forbindelser og kan efterhånden påvises i detektoren 9 som enkeltstående toppe, om ønsket kan man, eventuelt via en gradient, skifte fra en mobil fase til en anden (eller endog flere) mobile faser 5 og/eller forøge løbehastigheden, hvis der ønskes et hurtigere gennemløb af senere fedtopløselige forbindelser .

Pumpe 2 vil i situationen vist på fig. Ib pumpe et skyllemiddel fra et ikke vist reservoir baglæns 10 gennem forkolonnen 7 og autosampleren 5. Idet skyllemidlet er valgt, så fedt hurtigt afgives af forkolonnens fyldmateriale, vil fedt og vævsrester skylles ud af systemet og gå til afløb. Hvis det ønskes, kan man til opnåelse af bedre rensning af forkolonnen 15 7 etc. undervejs skifte skyllemiddel. Pumpen 2 skal herefter for at fjerne skyllemiddel fra systemet benytte den første mobile fase.

Herefter drejes ventilen 4 til den anden stilling, og man har situationen vist på figur lc, hvor au-20 tosampleren 5 og forkolonnen 7 forlæns gennemløbes af den første mobile fase, pumpet af pumpen 2. Herefter drejes ventilerne, og pumpen 2 neddrosles til stand-by niveau til genoprettelse af situationen vist på figur la, og en ny analyse kan foretages.

25 Den mobile fase skal være udvalgt blandt sådan ne, der bringer de fedtopløselige forbindelser til at kromatografere gennem separationskolonnen 8 i et tidsrum på f.eks. ca. 1-10 min.

De anvendte skyllemidler skal have stor opløs-30 nlngskraft for fedtstoffer, der bindes af forkolonnen 7.

Den videre analysegang, når man benytter et apparat med et blandekammer, ses af figur 2. Idet henvisningstallene 1-5 og 7-9 har samme betydning som på fi-35 gur 1, vil man på figur 2 yderligere se et blandekammer 6 med tre åbninger, indskudt mellem autosampleren 5 og forkolonnen 7. Rørforbindelserne er følgende: 13 DK 172622 B1 fra pumpen 1 til ventilporten 3a, fra ventilporten 3b til autosampleren 5, fra autosampleren 5 til blandekammeret 6, fra blandekammeret 6 til forkolonnen 7, 5 fra forkolonnen 7 til ventilporten 3e, fra ventilporten 3f til separationskolonnen 8, fra separationskolonnen 8 til detektoren 9, fra pumpen '2 til ventilporten 3d, fra ventilporten 3c til ventilporten 4f, og 10 fra ventilporten 4a til blandekammeret 6, idet ventilportene 4c, 4d ikke benyttes, og ventilporten 4b er blokeret.

I situationen vist på figur 2a står begge ventiler 3,4 i den første stilling, og pumpen 1 pumper 15 den mobile fase gennem autosampleren 5, blandekammeret 6 (idet dettes tredie åbning er afspærret), forkolonnen 7, separationskolonnen 8, og detektoren 9. Pumpen 2 pumper en yderligere mobil fase til afløb. Nu afmåles en forud bestemt mængde ekstrakt af 20 autosampleren 5 og injiceres i den mobile fase. I det øjeblik, hvor ekstrakten som en "pakke" i den mobile fase passerer blandekammeret 6, vil en ikke vist automatik sørge for, at ventilen 4 drejes til den anden stilling, hvilket medfører, at pumpen 2 pumper den 25 yderligere mobile fase, der fungerer som fortyndingsmiddel, ind i blandekammeret 6 via den tredie åbning.

Denne situation ses på figur 2b. Når prøven har passeret, drejes ventilerne til situationen i figur 2c, og det videre forløb er i princippet som ovenfor nævnt i 30 forbindelse med figur l, således viser figur 2c situationen, hvor pumpen l pumper mobil fase gennem separationskolonnen 8 og detektoren 9 under fortsat kromatografi, mens pumpen 2 baglæns sender skyllemiddel gennem forkolonnen 7, blandekammeret 6 og autosam-35 pieren 5. Når disse efter endt skylning er bragt i ligevægt ved hjælp af den mobile fase er situationen genoprettet, og en ny analyse kan foretages.

14 DK 172622 B1

Ligesom i forbindelse med udførelsesformen for den omhandlede fremgangsmåde illustreret på figur i kan man benytte flere mobile faser/skyllemidler.

5 FORSØG 1

Egnet ekstraktionsmiddel

Det anvendte ekstraktionsmiddel skal fortrinsvis 10 have en mindre massefylde end det i prøverne indeholdte fedtstof, så ekstrakten let kan adskilles fra faste stoffer og uopløst fedt ved centrifugering. Desuden skal det være egnet til at ekstrahere de søgte stoffer på pålidelig måde. Dette forsøg undersøger forskellige 15 opløsningsmidlers egnethed.

Spækprøver med et skatolindhold på 0,06 ppm blev spiket med 0,2 ppm skatol og 0,2 ppm indol, samt til intern standardisering endvidere med 0,2 ppm 2-methyl-indol. Prøverne blev derefter ekstraheret, som nærmere 20 beskrevet nedenfor i Eksempel 1, med en række opløsningsmidler. Ekstrakterne blev derefter analyseret på den ovenfor beskrevne måde for skatol og indol med anvendelse af 2-methylindol som intern standard.

Analyseresultaterne viste, at blandinger af met-25 hanol og 2-propanol med blandingsforhold i området 25:75-75:25 samt blandinger af methanol og acetone i blandingsforhold i området 90:10-50:50 var rimeligt anvendelige, medens ren methanol, ren acetonitril og blandinger af disse 1 området 75:25-25:75 var udmærket 30 anvendelige.

På grund af arbejdsmiljømæssige problemer med acetonitril blev methanol foretrukket i det følgende som ekstraktionsmiddel.

DK 172622 B1 15 FORSØG 2

Bestemmelse af indol, skatol og androstenon 1 samme analyseprøve 5

Til vurdering af muligheden for kromatografisk at adskille og bestemme indol, skatol og derivatiseret androstenon ekstraherede man en spækprøve med methanol (se nærmere Eksempel 1), idet man spikede med 0,2 ppm 10 indol, 0,2 ppm skatol og 2 ppm androstenon. Efter centrifugering blev 700 μΐ af denne methanolekstrakt tilsat 100 yl 1% TCA (w/v i methanol), 100 μΐ 2% dansylhy-drazin (v/v i methanol) samt 100 yl methanol, anbragt i 30 min. ved 60*C og derefter analyseret på et HPLC-15 system omfattende en forkolonne og en separationskolonne, men intet tilbagevaskningssystem.

Som mobile faser benyttedes: a: Acetonitril/vand (900:100 v/v), og 20 b: Acetonitril/vand (100:900 v/v).

Flow var 1,2 ml/min. indtil 4 min., derefter 1,5 ml/min., og indtil 2 min. benyttede man 45% a/55% b, fra 2-3 min. ændredes dette som gradient til 100% a, 25 der opretholdtes indtil 8 min., fra 8-8,5 min. ændredes dette i gradient tilbage til ovenstående, der opretholdtes forsøget ud (ca. 12½ min.) detektionen var indtil 6 min. ved 280/340 nm og heref-30 ter ved 365/520 nm (excitation/emission).

Figur 3 viser tydeligt adskilte toppe for indol og skatol ved henholdsvis ca. 3½ min. og ca. 4½ min., en top for 2-methylindol ses lige før skatol. Endelig ses en skarp top for dansylandrostenon ved ca. 9½ min.

35 Forsøget viser, at man kan bestemme indol, ska tol, referenceforbindelsen 2-methylindol og derivatise- 16 DK 172622 B1 ret (her med dansyl) androstenon i samme analyseforløb og derfor kan foretage en sådan bestemmelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette betyder, at der kan foretages en meget sikker detektion af slagtekroppe 5 med hangriselugt, idet både skatol og androstenon og om ønsket også indol kan inddrages i bestemmelsen. Dette kræver ikke væsentlige omkostninger til nye analyser eller andet udstyr.

10 EKSEMPEL 1

Dette Eksempel illustrerer udførelsesformen vist på figur 1.

Der anvendes en fluorescensdetektor med excita- 15 tion ved 285 nm og emission ved 340 nm samt til styring en PC'er med passende software og interface.

Forkolonne og separationskolonne er som ved Foret søg 2, kolonnen er termostateret ved 40 C.

Den mobile fase er 20 acetonitril/vand/kaliumphosphatpuffer pH 3,0 (1000:875: 125 v/v/v), og vaskemidlerne er acetone/vand (950:50 v/v) og acetoni-tril/vand (950:50 v/v).

25 Fremstilling af ekstrakt Nøjagtigt 0,500 g af en spækprøve blev afvejet og anbragt i et 16 mm centrifugeglas, og man tilsatte 2,00 ml af en opløsning (0,05 ppm) af 2-methylindol i 30 methanol.

Herefter findelte man forsigtigt prøven ved hjælp af en homogenisator, anbragte homogenatet 5 min. på ultralydbad, afkølede til ca. 15°C, centrifugerede glasset i kølecentrifuge i 5 min. ved 15°C og overførte 35 endelig supernatanten til et autosamplerglas med henblik på analyse.

DK 172622 B1 17

Analyse

Under analysen kørte pumpen l konstant ved 1,2 ml/min. De nedenfor angivne tider er regnet fra 5 analysetesttidspunktet. Fasen illustreret på figur la varede 0,3 min., herefter omstillede man til fasen illustreret på figur lb og vaskede i tidsrummet 0,9-1,7 min. forkolonne og autosampler med 1,5 ml/min acetonitril/vand og derefter, indtil 2,9 min. med 10 acetone/vand. Bagudskylningen fortsatte med løbemidlet indtil 3,5 min., og efter 4 min. var skylningen fremadrettet (figur lc) med 1,2 ml/min. løbemiddel. Analysen varede i alt 4,8 min.

Autosampleren udtog ved forskellige forsøg prø-15 ver på 10-30 μΐ, og man fandt, at resolutionen i det optagne kromatogram aftog med voksende prøvestørrelse, et tegn på, at den methanol, der som en pakke omgiver analyseprøven under dennes passage af det kromatografiske system, til en vis grad vil forstyrre kromato-20 grafien.

Metoden blev valideret på prøver spiket med henholdsvis 0,04, 0,2 og 0,4 ppm skatol og indol. Resultaterne ses i nedenstående Tabel.

DK 172622 B1 18 TABEL 1

Validering af fremgangsmåde ifølge opfindelsen (udført som på figur 1) 5 _

Niveau Spækstykke 1 Spækstykke 2 Spækstykke 3 indol skatol indol skatol indol skatol 0,04 ppm 10 Fundet (n=5) 0,047 0,046 0,047 0,040 0,048 0,036 st.afv. 0,003 0,003 0,006 0,009 0,003 0,010 genfin- ding% 118,0 117,0 118,4 100,6 121,0 90,6 15 0,2 ppm Fundet (n=5) 0,222 0,206 0,223 0,203 0,229 0,196 20 st.afv. 0,007 0,006 0,006 0,008 0,008 0,018 c.v.% (n=5) dag til dag 3,2 3,0 3,1 4,1 3,8 9,2 c.v.% (n=7) 25 samme dag 5,4 2,7 7,9 5,5 7,0 3,9 genfin- ding% 111,2 103,1 111,5 101,7 114,6 98,2 0,4 ppm 30

Fundet (n=5) 0,436 0,403 0,433 0,398 0,450 0,395 st.afv. 0,021 0,014 0,024 0,009 0,019 0,016

Genfin- 35 dinq%_109,1 100,9 108,4 99,5 112,6 98,8 c.v. = variationskoefficient 19 DK 172622 B1

Endvidere undersøgte man selektiviteten i det kromatografiske system, idet man ved den omhandlede fremgangsmåde analyserede: A: en 0,2 ppm (af skatol og indol) standardopløsning, 5 B: en spækprøve tilsat 0,2 ppm 2-methylindol, og C: samme prøve spiket med 0,2 ppm skatol og indol.

Resultaterne ses på figur 4a.

Tabel 1 viser meget konstante genvindingsprocenter for skatol, henholdsvis indol ved 0,2 og 0,4 10 ppm, men det ses også, at standardafvigelsen er tilstrækkelig lille til at der kan opnås en nøjagtighed, der er fuldt tilfredsstillende for detektion af hangri-selugt.

Hvis man anvender den omhandlede fremgangsmåde 15 til frasortering af slagtede, ukastrerede hangrise, kan man til alle analyseprøver sætte en bestemt mængde 2-methylindol, der svarer til frasorteringsgrænsen. Et kriterium for frasortering af en sådan slagtekrop kan da være, at skatoltoppen er højere end toppen for 2-me-20 thylindol.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel illustrerer udførelsesformen vist 25 på figur 2.

HPLC-systemet omfatter et 3,1 μΐ blandekammer.

Den mobile fase var som ovenfor nævnt. Til fortynding af analysen benyttedes som yderligere mobil fase acetonitril/vand (50:950 v/v), og til skylning be-30 nyttedes acetonitril/vand (950:50 v/v).

Hastigheden af pumpen 1 blev umiddelbart efter påbegyndt analyse sat op fra 0,7 ml/min til 1,2 ml/min og ved analyseafslutning (ved 4,9 min.) tilbage til 0,7 ml/min.

35 Pumpen 2 pumpede ved 0-0,1 min. 0,7 ml/min.

fortyndingsmiddel ind i blandekammeret, i perioden 20 DK 172622 B1 0,9-3,0 min. bagudskylledes forkolonne, blandekammer og autosampler med skyllemiddel og i perioden 3,2-4,6 min. med løbemidlet.

Resolutionen var ved denne fremgangsmåde væsent-5 ligt forbedret.

Selektiviteten i det chromatografiske system blev undersøgt som i Eksempel 1, og resultaterne ses grafisk i figur 4b.

10 EKSEMPEL 3

Eksempel 1 blev gentaget med en anden separationskolonne med hurtigere gennemløb. Den opnåede selektivitet vises grafisk på figur 4c. Trods den hurti-15 gere gennemløbstid (ca. 2½ min) ses en tydelig adskillelse af indol, skatol og 2-methylindol.

EKSEMPEL 4 20 Dette eksempel illustrerer kromatografisk ad skillelse af indol, skatol og derivatiseret androste-non, idet der som interne standarder benyttedes 2-methylindol (for indol og skatol) og derivatiseret an-drostanon (for androstenon). Kun afvigelserne fra for-25 søgsbetingelserne i eksempel 1 vil blive beskrevet nedenfor .

Der anvendtes en anden mobil fase omfattende acetonitril/tetrahydrofuran/kaliumphosphatpuffer pH 6/ eddikesyre (34%:31%:33%:2% v/v).

30 Til ekstrakten blev som interne standarder sat 0,2 yg/g 2-methylindol og 0,5 yg/g androstanon og man foretog en derivatisering til opnåelse af kraftigt fluorescerende derivater af androstenon og androstanon, idet man til 300 yl methanolekstrakt satte 40 yl 2% 35 dansylhydrazin i methanol og som katalysator for deri-vatiseringen 40 yl 25% bortrifluorid i methanol, under 21 DK 172622 B1 disse betingelser varer derivatlseringen 3 min. ved stuetemperatur.

Under analysens første del benyttedes samme mobile fase som i Eksempel 1 og fluorescensdetektion ved 5 285/340 nm. Efter 3 minutters forløb ændredes den mobi le fase uden gradient til ovennævnte anden mobile fase, og efter 5 minutter ændredes fluorescensdetektionen til et bølgelængdesæt på 346/541 nm.

Indol,2-methylindol og skatol kunne som tidlige-10 re påv ises som 3 tydelige toppe {efter 2 1/4, 3 og 3 1/4 minut), og herudover sås tydelige toppe for dan-sylderivatiseret androstenon og androstanon efter henholdsvis ca. 8 1/4 og 9 1/4 minutters forløb af analysen.

15 ved en række forsøg som ovenfor beskrevet fandt man genfindingsprocenter som ovenfor beskrevet for indol og skatol, hvorimod genfindingen for androstenon fandtes til 125%. Selv om denne værdi afveg en hel del fra idealværdien 100%, var den reproducerbar, og forsø-20 get viser således, at man i en enkelt analysegang samtidig kan påvise indol, skatol og androstenon i spækekstrakter og således kan opnå større sikkerhed, hvis en sådan analyse benyttes som hjælp ved frasortering af sådanne slagtekroppe fra ukastrerede hangrise, der mis-25 tænkes for at kunne give hangriselugt ved tilberedning.

Levetiden af separationskolonnen anses at være særdeles god ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, idet en kolonne skønnes kunne behandle 30 2000-5000 injektioner. Den billigere forkolonne har også en længere levetid og kan udskiftes rutinemæssigt efter f.eks. 200-300 injektioner.

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til at bestemme indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse i individuelle emner, såsom individuelle kødemner for indholdet af stoffer, der har sammenhæng med hangriselugt, hvilken 5 fremgangsmåde for hvert emne omfatter gentagelse af arbejdstrin, der består i, at man udtager en fedtstof-holdig prøve af emnet, sønderdeler prøven og ekstra-herer den med et opløsningsmiddel for den fedtopløselige forbindelse, foretager en rensning af ekstrakten 10 og udfører en HPLC-analyse på en analyseprøve af den rensede ekstrakt ved at injicere prøven i en mobil fase, der ledes gennem en separationskolonne med en detektor, hvis signaler automatisk omsættes til et udtryk for indholdet af forbindelsen, kendeteg-15 net ved, at analyseprøven i den mobile fase føres gennem en fedtstofretarderende forkolonne, der er anbragt foran separationskolonnen, og at forkolonnen efterfølgende vaskes separat i et forud bestemt tidsrum, fortrinsvis ved at strømretningen i forkolonnen vendes, 20. hvilket tidsrum analyseprøven i den mobile fase fortrinsvis ledes videre gennem separationskolonnen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved følgende trin: at den mobile fase ledes gennem forkolonnen og 25 separationskolonnen, at der fra et lager af separat fremstillede og opbevarede ekstrakter automatisk udtages en analyseprøve repræsenterende et emne, at en forud bestemt mængde af prøven inj iceres i 30 den mobile fase og med denne føres gennem forkolonnen, at analyseprøven i den mobile fase føres videre i separationskolonnen, medens strømretningen i forkolonnen vendes og denne kolonne vaskes med en eller flere, fortrinsvis fedtopløsende skyllefaser og - om øn-35 sket - til slut med samme middel som den mobile fase, og DK 172622 B1 at strømretningen i forkolonnen derefter vendes igen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at man yderligere lader den mobile 5 fase passere et blandekammer, der er anbragt foran forkolonnen, og at man medens den afmålte mængde analyseprøve passerer blandekammeret via en åbning i dette tilblander en yderligere mobil fase.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kende-10 tegnet ved, at man til den fedtstofholdige prøve før eller under ekstraktionen af denne sætter en forud bestemt mængde af en referenceforbindelse, der er beslægtet med den fedtopløselige forbindelse, der skal påvises ved HPLC-analysen, fortrinsvis 2-, 4-, 5-, 6-15 eller 7-methylindol til bestemmelse af skatol og/eller indol.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man i forbindelse med påvisning af flere fedtopløselige forbindelser ved HPLC-analysen aen-2 Π drer den mobile fase og/eller den mobile fases løbeha-stighed til hurtigere gennemløb, efter at analyseprøven er ført ind i separationskolonnen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man til påvisning af en ikke-fluorescerende, fedtopløselig forbindelse sammen med en eller flere andre fedtopløselige forbindelser, der er fluorescerende, til ekstrakten eller analyseprøven sætter et derivatiseringsmiddel, der gør forbindelsen fluorescerende, fortrinsvis ved at man derivatiserer androstenon med et derivatiseringsmiddel udvalgt blandt 30 dansylhydrazin, 4’-hydrazino-2-stilbazol og 4'-hydra-zino-2-oxo-l,3-diazol, fortrinsvis dansylhydrazin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at den fedtstofholdige prøve er en spækprøve fra en svineslagtekrop, og at der på samme analyseprøve analyseres for indholdet af skatol, indol DK 172622 B1 og/eller androstenon, idet androstenonen forud er blevet præderivatiseret til opnåelse af en fluorescerende forbindelse.

8. Apparat til brug ved udøvelse af fremgangsmåden 5 ifølge krav 1 med en separationskolonne (8) og pumpeindretninger (l, 2) til at føre en mobil fase gennem kolonnen, kendetegnet ved, at det omfatter en fedtstofretarderende forkolonne (7), der er forbundet til pumpeindretningerne (1,2) og separations-10 kolonnen (8) og ventiler (3,4) til at indkoble forkolonnen (7) i en separat fortrinsvis revers vaskestrøm i et forud bestemt tidsrum uden at strømretningen i separationskolonnen (8) ændres. __

9. Apparat ifølge krav 8, kendeteg-15 net ved, at det omfatter en autosampler (5) med en injektionsventil for en analyseprøve, to seksportventi-ler (3,4), der hver kan stå i to stillinger, en første pumpe (1), der kan pumpe en mobil fase fra et reservoir for dette gennem en udvalgt port i en af seksportven-20 tilerne (3,4), en anden pumpe (2), der efter valg kan pumpe en mobil fase, en yderligere mobil fase og skyl-lefaser fra reservoirer for disse gennem en anden udvalgt port i en af seksportventilerne (3,4), en fedtstofretarderende forkolonne (7), en separationskolonne 25 (8), en detektor (9) og rørforbindelser mellem delene, der er forbundet på en sådan måde, at forkolonnen (7) ved en første kombination af ventilstillinger indgår i _følgende første serieforbindelse: første pumpe (1), autosampler (5), forkolonne 30 (7) med retvendt flow, separationskolonne (8) og detektor (9), ved en anden kombination af ventilstillinger indgår i følgende anden serieforbindelse: anden pumpe (2), forkolonne (7) med revers flow, autosampler (5) og afløb, og ved en tredie kombination af ventilstillinger indgår i følgende tredie serieforbindelse: _25 DK 172622 B1 anden pumpe (2), autosampler (5), forkolonne (7) med retvendt flow og afløb.

10. Apparat ifølge krav 8-9, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et blandekammer 5 (6) med tre åbninger, hvoraf den første er rørforbundet til autosamplerens (5) injektionsventil og den anden til forkolonnen (7), og at forkolonnen (7) ved en første og anden kombination af ventilstillinger indgår i den første, henholdsvis anden serieforbindelse ifølge 10 krav 9, idet samtidig den tredie åbning til blandekam-meret (6) er af spærret, og at forkolonnen (7) ved en tredie kombination af ventilstillinger indgår i den første serieforbindelse ifølge krav 9, idet samtidig den tredie åbning til blandekammeret (6) er forbundet 15 til den anden pumpe (2).

11. Fremgangsmåde til detektion eller sortering af individuelle emner på grundlag af indholdet af mindst en fedtopløselig forbindelse, kendetegnet ved, at man bestemmer indholdet som angivet i krav 1 og 20 automatisk sammenholder det med fastsatte parametre i en detektions- eller sorteringsmodel.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11 til detektion eller sortering af kødemner med hangriselugt, kendetegnet ved, at man bestemmer indholdet af 25 skatol, androstenon og eventuelt indol i samme analyseprøve og sammenholder det med parametrene i detektions-eller sorteringsmodellen, idet man om nødvendigt frasorterer emner, for hvilke indholdet af skatol, androstenon og eventuelt indol i en analyseret spæk-30 prøve overskrider forudbestemte tærskelværdier.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at man tilsætter en mængde af en referenceforbindelse, fortrinsvis 2-methylindol, der er afpasset frasorteringsgrænsen, til spækprøverne og 35 vurderer, om tærskelværdien for de analyserede forbindelser er overskredet ved at sammenligne analysevær DK 172622 B1 dier såsom tophøjde eller topareal for de analyserede forbindelser med de tilsvarende værdier for referenceforbindelsen .