DK168864B1

DK168864B1 - Farmaceutiske præparater, der indeholder telluriumforbindelser, disse forbindelser til brug som terapeutikum, samt anvendelse af forbindelserne til fremstilling af et farmaceutisk præparat

Info

Publication number: DK168864B1
Application number: DK487085A
Authority: DK
Inventors: Michael Albeck; Benjamin Sredni
Original assignee: Univ Bar Ilan
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1985-10-23
Publication date: 1994-06-27
Also published as: US4761490A; JP2528268B2; EP0194393A2; CA1327046C; JPH0791286B2; CN1018640B; AU595487B2; AU625922B2; EP0194393B1; DK9892D0; AU5502290A; IL76909A; DK487085D0; JPH07179351A; DK487085A; DE3578176D1; DK9892A; EP0194393A3; AU4912885A; JPS61215386A

Description

DK 168864 B1

Opfindelsen angår farmaceutiske præparater, der indeholder telluriumforbindelser, disse forbindelser til brug som tera-peutikum, samt anvendelse af forbindelserne til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

5 Det er velkendt, at væksten af normale lymfocyter ikke blot afhænger af kontakten med et antigenisk stof eller et mitogen, _men også af tilstedeværelsen af visse vækstfaktorer, der kendes som lymfokiner. Én af disse vækstfaktorer er kendt som T-celle-vækstfaktor (TCGF), bedre kendt som interleukin-2 10 (IL-2). Opdagelsen af denne vækstfaktor (Gillis et al.,

Nature 268, 1977, s. 154; og Ruscetti et al., J. Immunol.

119, 1977, s. 131) resulterede i dyrkning i stor målestok og kloning af T-lymfocyter som kilde til IL-2.

Lymfocyterne eller de hvide blodceller i dyrelegemet findes i 15 to typer, B-celler og T-celler. B-cellerne danner antistoffer i form af immunoglobuliner, som binder til indtrængende organismer, medens T-cellerne danner lymfokiner, som er ansvarlige for, at B-cellerne bliver tændt eller slukket.

Jfr. fx Cell. Immunol. 36, 1978, s. 15; J. Cell. Physiol. 96, 20 1978, s. 53; Eur. J. Immunol. 8, 1978, s. 681; Immunol. Rev.

54, 1981, s. 188; Immunol. Rev. 54, 1981, s. 158; J. Exp.

Med. 154, 1981, s. 1500; National Cancer Institute Mon. 60, 1982, s. 211; Int. J. Cancer 28, 1981, s. 157; The Potential Role of T-Cell Subpopulations in Cancer Therapy, red. A.

25 Fefer og A. Goldstein, Raven Press, New York, 1982, s.

173 ff.; J. Immunol. 128, 1982, s. 258.

De kendte typer lymfokiner omfatter ud over IL-2 B-cellefaktorer, makrophag-aktiveringsfaktor (MAF), interleukin-3 (IL-3), kolonistimulerende faktor (CSF), tumornekrosefaktor og 30 andre faktorer, der dannes af monocyter såsom interleukin-1 (IL-1) og γ-interferon. Alle disse faktorer udskilles af de hvide blodceller og kendes under den samlende betegnelse cytokiner. Der er blevet viet megen opmærksomhed til anvendelsen af forskellige rekombinante DNA-teknikker og andre 35 metoder til kloning af normale T- og B-cellelinjer, som kan DK 168864 B1 2 danne disse stoffer. Jfr. fx Nature 259, 1976, s. 130; Immunology 32, 1977, s. 319; Exp. Hemat. 8, 1980, s. 494; Nature 283, 1980, s. 581; Proc. Natl. Åcad. Sci. U.S.Å. 78, 1981, s. 1858; J. Immunol. Methods 49, 1982, s. 1; Nature 29424/31, 5 1981, s. 697-699, hvortil der henvises.

Den foreliggende opfindelse er baseret på opdagelsen af en klasse af syntetiske organiske derivater af .tellur som er i stand til at stimulere cytokin-producerende celler til at producere betydelige mængder af cytokiner både in vivo og in 10 vitro, samt at inducere receptorer for disse cytokiner. Denne opdagelse muliggør en hidtil ukendt terapeutisk fremgangsmåde ved behandlingen af cancer, immundefekter, autoimmune sygdomme og infektiøse sygdomme.

Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at 15 tilvejebringe hidtil ukendte forbindelser baseret på tellur, som er nyttige som terapeutiske præparater.

Det er også et formål med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte farmaceutiske præparater, som er baseret på tellurforbindelser, som danner cytokiner in vivo og in vitro.

20 Det er også et formål med opfindelsen tilvejebringe disse kemiske tellurforbindelser til brug som farmaceutika.

Et yderligere formål med opfindelsen er anvendelsen af disse tellurforbindelser til fremstilling af farmaceutiske præparater.

25 Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser en infrarød analyse af forbindelsen ifølge eksempel 1 i KBr, og fig. 2 viser en infrarød analyse af forbindelsen ifølge 30 eksempel 2 i KBr.

DK 168864 B1 3

Opfindelsen angår således et farmaceutisk præparat, der er ejendommeligt ved, at det omfatter en farmaceutisk acceptabel bærer og en forbindelse med den almene formel

X R

(A) I 0-C-Rjl nh4 + X Te \ (R4“i-R5)u \ (R6-?-R7^v X o- C-R0 i o

R9 J

5 eller (B)

X o-K

\ / (R2TR3}t

Te (E4-C-E5)u

/ \ (R6-|f-R7,V

X 0—---C-Rq i 8 R9 eller (C) Te02 eller 10 (D) PhTeCl3 eller (E) (C6H5)4P+(TeCl3(02C2H4))‘ eller F: . O-CH-R1:) i >< i R13 CH-0-CH-R14 DK 168864 B1 4 hvor t er 1 eller 0; u er 1 eller 0; v er l eller 0; R, Rlf R2, R3, R4/ R5, Rg, R7, Rs og R9 er ens eller forskellige og uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxy, alkyl med 1-5 carbonatomer, 5 halogen, halogenalkyl med 1-5 carbonatomer, carboxy, alkyl-carbonylalkyl med 2-10 carbonatomer, alkanoyloxy med 1-5 carbonatomer, carboxyalkyl med 1-5 carbonatomer, formyl, amido, cyano, amidoalkyl med 1-5 carbonatomer, N-monoalkyl-amidoalkyl med 2-10 carbonatomer, Ν,Ν-dialkyIamidoalkyl med ID 4-10 carbonatomer, cyanoalkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, alkoxyalkyl med 2-10 carbonatomer og -COR10, hvor R10 betegner alkyl med 1-5 carbonatomer; og X betegner halogen; Rllf R12, Ri3 og R14 uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, 15 hydroxy og alkyl med 1-5 carbonatomer. Forbindelserne med de 5-leddede ringe foretrækkes.

I nærværende beskrivelse og krav omfatter udtrykket "alkyl med 1-5 carbonatomer" ligekædede og forgrenede alkylgrupper såsom methyl, ethyl, n-propy1, n-butyl og lignende; udtrykket 20 "hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer" omfatter hydroxymethyl, hydroxyethy1, hydroxy- n-butyl; udtrykket "halogenalkyl med 1-5 carbonatomer" omfatter chlormethyl, 2-iodethyl, 4-brom-n-butyl, iodethyl, 4-brom-n-pentyl og lignende; udtrykket "alkanoyloxy med 1-5 carbonatomer" omfatter acetyl, propio-25 nyl, butanoyl og lignende; udtrykket "carboxyalkyl" omfatter carboxymethyl, carboxyethyl, ethylencarboxy og lignende; udtrykket "alkylcarbonylalkyl" omfatter methanoylmethyl, ethanolyethyl og lignende; udtrykket "amidoalkyl" omfatter -CH2CONH2, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2CH2CONH2 og lignende; udtryk-30 ket "cyanoalkyl" omfatter -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN og lignende; udtrykket "alkoxy med 1-5 carbonatomer" omfatter methoxy, ethoxy, n-propoxy, n-pentoxy og lignende; udtrykket "halogen" anvendes til at betegne chlor, brom, iod og fluor; udtrykket "aryl" omfatter phenyl, alkylphenyl og naphthyl; 35 udtrykket "N-monoalkylamidoalkyl" omfatter -CH2CH2CONHCH3, -CH2CONHCH2CH3; udtrykket "Ν,Ν-dialkylamidoalkyl" omfatter DK 168864 B1 5 -CH2CON(CH3)2, CH2CH2CON(CH2CH3) . De tellurforbindelser, som foretrækkes, har den almene formel — — x\ /0"“ch2 nh4+ Γν /° —«2-α3 NV Te 4 og ^Te /i \ /i \

Xx X ch2J χ/X ^0—CH2 hvor_X betegner halogen. Den foretrukne halogen er chlor.

5 Disse forbindelser er i stand til at inducere IL-2-dannelse samt formering af IL-2-producerende celler og aktivering af IL-2 -receptorsteder.

Andre forbindelser, som er baseret på tellur, og som kan anvendes ved udøvelsen af opfindelsen, omfatter PhTeCl3, Te02 10 og (C6H5)4P+ (TeCl3 (02C2H4)' (jfr. Z. Naturforsh. 36B, 1981, s. 307-312). Den forbindelse, som beskrives nedenfor i eksempel 2, har følgende struktur:

Cl.. o ch2

Cl "^0— ch2

Andre forbindelser, som er nyttige ved udøvelsen af opfindelsen, omfatter: ^-CH-_° ^,0 CH-R12 R13—CH—0 -CH-r14 15 hvor R11, R12, R13 og R14 uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxy og alkyl med 1-5 carbonatomer.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en kemisk forbindelse til anvendelse som terapeutikum, hvilken kemisk 20 forbindelse er ejendommelig ved, at den har formlen A, B, C, D, E eller F som defineret ovenfor.

DK 168864 B1 6

Den foreliggende opfindelse angår endvidere anvendelsen af forbindelsen med formel A, B, c, D, E eller F til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af cancer, immundefekter, autoimmune sygdomme eller infektiøse sygdomme.

5 Nyttige dihydroxyforbindelser til anvendelse ved fremstillingen af forbindelser med strukturen A eller B omfatter de forbindelser med den almene formel I, hvor EL, R1# Ra og R9 har de i nedenstående tabel viste betydninger: R Ro

10 I I

OH - C - C - OH I

I I

Ri R9 TABEL I

15 R R-l Rg Rg

Η Η Η H

H Cl Η H

H 0CH3 Η H

H COOCH3 Η H

20 Η H CN H

H CHO Η H

Η H COOH H

H CH2C00H Η H

Η H CHCOOCH3 H

25 Η I Η H

. Η H Br H

Η H CONH2 H

Η H CH2OH H

H COOH Η H

DK 168864 B1 7

Andre dihydroxyforbindelser til anvendelse ved fremstillingen af forbindelser A og B omfatter de forbindelser med den almene formel II, hvor R, Rx, R2, R3, R8 og R9 har de i nedenstående tabel viste betydninger: 5 R R2 Rg

I I I

OH - C - C - C - OH _ II

I I I

Ri R3 R9

10 TABEL II

R R-L R2 R3 K-8 Rg

Η Η Η Η Η H

Η H Cl Η Η H

H CH20H Η Η Η H

15 Η H OH Η Η H

Η Η H CH3 Η H

Η Η H C12C1 Η H

Η Η H COOH Η H

Η Η H CH2C00H Η H

20 Η Η H CHO Η H

Η Η Η Η H CH2CH0 Η H CONH2 Η H CH3

Η Η H CN Η H

Η Η Η H CH2CONH2 H

25 Η Η H COOCH3 Η H

Η H OCH3 Η Η H

Andre dihydroxyforbindelser til anvendelse ved fremstillingen af forbindelserne med formlen A og B omfatter de forbindelser DK 168864 B1 8 med den almene formel III, hvor R, R1# R2, R3, R4, R5, R8 og R9 har de i nedenstående tabel viste betydninger: R R2 R4 Rg III!

5 OH - C - C - C - C - OH III

I I I I

R-l R3 R5 Rg —

TABEL III

R R^. R2 Rg R4 Rg Rg Rg

10 HH Η Η Η H HH

HH Cl Η H HHH-

HH Η H Br HHH

Η H OCH3 Η H HHH

Η H CONH2 Η H HHH

15 H Br Η H Br HHH.

HH HH CH2C00H HHH

HH Cl Cl H HHH

H CH2C00H Η Η H HHH

Η H CH3H Η H HHH

20 H CH3 Η Η H HHH

H CH2C1 Η Η H HHH

HH Η I H HHH

H CH2CN Η Η H HHH

HH HH CH2CH20H HHH

25 Yderligere dihydroxyforbindelser omfatter de forbindelser med den almene formel IV, hvor R, Rlr R2, R3, R4, R5, Rs, R7, R8 og Rg har den i nedenstående tabel viste betydning: DK 168864 B1 9 R R2 R4 Rg R8 I I I I I -

OH — C — C — C — C — C — OH IV

I I I I I

5 R2 R3 Rg R·^ Rg

TABEL IV

R Rj R2 R3 R4 R5 Rg R7 Rg Rg

HH H HH HH HHH

HH Cl HH H Cl HHH

10 Η H Cl Cl H HH HHH

Η H CONCH3 HH H Br HHH

HH Br Η Η H CON(CH3)2 HHH

HH H OCH3 H HH HHH

HH HH OCH3 HH HHH

15 Η Η Η H CH2COOH HH HHH

Η H COOH HH HH HHH

HCH3 H HH HH HHH

CH3 Η H HH CH3 H HHH

H CH2CH3 H HH HH Cl HH

20 H CH2CN Η H CH2OH HH HHH

HH H IH HH HCNH

H CH2CH2COOH H HH HH HHH

Η H CHO HH HH HHH

HH HFH HH HHH

DK 168864 B1 10

Forbindelserne med de almene formler X R15

I I

X — Te — 0R1;l og X — Te — OR12

5 I I

X X

hvor X, R11# R12 °9 ^15 har den ovenfor anførte betydning, kan fremstilles ved at omsætte det relevante di-, tri- eller tetrahalogentellurid med den relevante hydroxyforbindelse, 10 som kan have den almene formel

H0-R1S

hvor R16 betegner alkyl med 1-5 carbonatomer, halogenalkyl med 1-5 carbonatomer, aryl, alkylaryl, alkylamido med 1-5 carbonatomer, alkylcarbonyl med 1-5 carbonatomer, cyanoalkyl 15 med 1-5 carbonatomer og alkoxyalkyl med 2-10 carbonatomer. Specifikke eksempler på R16 omfatter methyl, ethyl, n-propyl, phenyl, tolyl, amidoethyl, cyanomethyl, methyloxymethyl og ch2ch2cooh.

Forbindelserne fremstilles ved at kombinere i det væsentlige 20 ækvimolære mængder af reaktanterne i en hensigtsmæssig reaktionsbeholder ved stuetemperatur eller ved forhøjede temperaturer op til tilbagesvalingstemperaturen. Det foretrækkes at anvende et opløsningsmiddel, som er i stand til at opløse reaktanterne, såsom acetonitril, benzen, toluen, xylen, 25 dimethylsulfoxid, blandinger deraf og lignende. Forbindelserne med strukturen A fås kun i acetonitril. Den foretrukne fremgangsmåde kræver opvarmning af reaktionsblandingen til opløsningsmidlets tilbagesvalingstemperatur, idet reaktionsblandingen omrøres med en hensigtsmæssig magnetisk eller 30 mekanisk omrører. Reaktionen kan udføres i et tilstrækkeligt tidsrum til at sikre fuldstændig omsætning af reaktanterne. Dette tidsrum varierer afhængigt af reaktionsbetingelserne, DK 168864 B1 11 den bestemte forbindelse, der fremstilles, og arten af opløsningsmidler. Reaktionen kan udføres ved -atmosfærisk tryk, men kan om ønsket udføres ved reduceret eller forhøjet tryk. Reaktionen udføres mest praktisk i nærværelse af en oxygen-5 holdig atmosfære såsom luft, men der kan om ønsket anvendes inerte atmosfærer såsom nitrogen, argon, helium eller blandinger deraf. Reaktionstider på fra 1 minut til 168 timer kan anvendes, selv om reaktionstider på 6-16 timer foretrækkes.

Reaktionsbeholderen bør være en glaskonstruktion eller være 10 foret med glas eller et andet keramisk materiale, som er inert i forhold til reaktanterne.

De ved fremgangsmåden fremstillede forbindelser vil sædvanligvis fælde ud, efterhånden som reaktionsblandingen afkøles til stuetemperatur. Udfældning kan også udføres ved at tills sætte et hensigtsmæssigt udfældningsmiddel såsom en flydende alkan såsom hexan eller ved koncentration af reaktionsblandingen ved opløsningsmiddelfjernelse ved afdampning med eller uden vakuum. Produktet kan opsamles i et sintret glasfilter, vaskes med et koldt opløsningsmiddel og tørres under anven-20 delse af konventionelle teknikker. Produktet opbevares i en hensigtsmæssig beholder, beskyttet mod lys, og fortrinsvis ved reduceret temperatur for at undgå nedbrydning.

Opløsningsmiddelsystemet til administration af forbindelserne ifølge opfindelsen kan være baseret på dimethylsulfoxid eller 25 lavere alkanoler såsom ethanol og propanol, glycoler såsom ethylenglycol, glycerol, propylenglycol og lignende. Det foretrukne opløsningsmiddelsystem er en phosphatpufret saltopløsning, som indeholder en mængde natriumsyrephosphat og natriumphosphat i vand, der giver en pH-værdi på 7,1-7,2 30 (PBS).

Det vil være klart for fagfolk, at tilstedeværelsen af en reaktiv gruppe, som griber ind i syntesen af en bestemt forbindelse, vil kræve anvendelse af en beskyttelsesgruppe, som kan fjernes under anvendelse af kendte metoder.

DK 168864 B1 12

Præparaterne ifølge opfindelsen kan administreres til pattedyr til behandling af cancer, immundefekter, autoimmune sygdomme og infektiøse sygdomme under anvendelse af mængder, der er virksomme til hver lidelse. Behandlingen vil lette 5 symptomerne på disse sygdomme ved at få pattedyrets krop til at producere forøgede mængder lymfokiner. Det påtænkes, at præparatet ifølge opfindelsen kan anvendes i kombination med andre kemoterapeutiske anti-cancermidler såsom cyclophospha-mid.

10 Udtrykket "cancer" omfatter leukæmi og faste tumorer, som opstår spontant, ved kontakt med et carcinogent middel, ved bestråling eller ved onkovira. Disse tilstande er velkendte for fagfolk og omfatter sådanne tilstande som adrenaltumorer, knogletumorer, gastrointestinale tumorer, hjernetumorer, 15 brysttumorer, hudtumorer, lungetumorer, ovarialtumorer, geniturinære tumorer og lignende. Merck Manual, 13. udgave, Merck & Co., 1977, beskriver mange af disse tilstande. Der henvises til siderne 647-650, 828-831, 917-920, 966, 970-974, 1273, 1277, 1371-1376, 1436-1441, 1563 og 1612-1615 i denne 20 publikation.

Udtrykket "immundefekt-sygdomme" anvendes til at beskrive en forskelligartet gruppe af tilstande såsom erhvervet immunde-fektsyndrom (AIDS) , der hovedsagelig er karakteriseret ved en forøget modtagelighed for forskellige infektioner med en 25 påfølgende svær, akut, tilbagevendende og kronisk sygdom, som skyldes én eller flere defekter i de specifikke eller ikke-specifikke immunsystemer. På s. 205-220 i Merck Manual, 13. udgave, er mange af disse tilstande beskrevet, og der henvises dertil.

30 Udtrykket "autoimmune sygdomme" omfatter lidelser, hvor immunsystemet producerer autoantistoffer mod et endogent antigen med påfølgende beskadigelse af væv. På s. 241-24-3 i Merck Manual, 13. udgave, er disse lidelser beskrevet, og der henvises dertil.

DK 168864 B1 13

Udtrykket "infektiøse sygdomme" omfatter de patologiske tilstande, som skyldes bakterielle, virale .eller svampeorganismer, som invaderer og nedbryder den normale funktion af pattedyrskroppen. På s. 3-149 i Merck Manual, 13. udgave, er 5 disse tilstande beskrevet, og der henvises dertil.

Præparaterne kan administreres oralt, parenteralt, trans-cutant, topisk eller ved kontakt mellem slimhindemembraner. Præparaterne kan administreres oralt i kapsler eller tabletter, som kan fremstilles under anvendelse af konventionelle 10 excipienser, bindemidler, desintegrationsmidler og lignende. Den parenterale vej foretrækkes for tiden, og der kan fremstilles præparater ved at opløse forbindelsen i et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel såsom en vandig puffer og dimethyl-sulfoxid eller glycerol. Den parenterale vej kan være intra-15 muskulær, intravenøs, intradermal under anvendelse af en bærer med forlænget afgivelse eller subcutan. Koncentrationen af forbindelserne i kombination med en farmaceutisk bærer er ikke kritisk og er et spørgsmål om valg. Remingtons Practice of Pharmacy, 9., 10. og 11. udgave, beskriver forskellige 20 farmaceutiske bærere, og der henvises dertil.

Det har vist sig, at nogle af de tellurforbindelser, der er nyttige ved udøvelsen af opfindelsen, hydrolyseres i nærværelse af vand. Disse hydrolyserede præparater er aktive in vivo og in vitro, selv om de hydrolyserede præparater til 25 slut nedbrydes og mister deres evne til at inducere lymfokin-udskillelse. Af denne grund bør præparaterne være frisk fremstillet. Hvis forbindelserne administreres oralt i tør form, er de aktive til induktion af lymfokindannelsen. Forbindelserne bør fortrinsvis holdes under vandfrie betingelser 30 indtil lige før deres anvendelse.

Det har vist sig, at visse forbindelser såsom Te02 alene inducerer lymfokindannelse i T-celleproducerende lymfocyter in vitro og in vivo, men ikke forårsager formering af IL-2-producerende celler eller aktivering af receptorsteder i 35 responder-T-celle-lymfocyter. Opfindelsen angår således også DK 168864 B1 14 anvendelse af Te02 alene og tellurforbindelser, som er aktive som lymfokininducere.

Topiske præparater kan fremstilles ved at dispergere forbindelserne i en hydrofil eller hydrofob kosmetisk base. Der 5 kan anvendes vaseline eller kommercielt tilgængelige præparater såsom "Oil of Olay". Koncentrationen kan være 0,0001-5% på vaegt/vægt-basis.

Den dosis af præparaterne ifølge opfindelsen, der anvendes for at stimulere lymfokindannelsen eller til behandling af 10 den specifikke lidelse, der er beskrevet heri, kan varieres afhængigt af den bestemte lidelse og lidelsens stadium. Generelt kan der administreres en mængde af præparatet, som sikrer at forbindelsen tilføres i en mængde, som ligger i området fra 0,05 x 10"3 til 1 x 10"3 g/kg legemsvægt, for-15 trinsvis fra 0,1 x 10'3 til 0,5 x 10'3 g/kg legemsvægt. Fx antages en dosis på 1-3 mg daglig for et pattedyr med en vægt på 75 kg at være en tilstrækkelig mængde til at inducere lym-fokindannelse, men dosen kan tilpasses i overensstemmelse med det individuelle respons og den bestemt lidelse, der behand-20 les.

Udover til behandling de ovenfor beskrevne lidelser hos pattedyr kan præparaterne anvendes til veterinære formål ved behandling af virale og immune sygdomme, som rammer heste, hovdyr og fjerkræ. Disse lidelser kan behandles under an~ 25 vendelse af mængder af forbindelsen, der kan anvendes til behandling af de ovenfor beskrevne lidelser hos pattedyr.

Til in vitro-anvendelse kan celler stimuleres til at danne lymfokiner ved anvendelse af 1 x 10"8 til 1 x 10'4, fortrinsvis 1 x 10"7 til 1 x 10"5 g forbindelse pr. 106 celler/ml.

30 Foreløbige toxicitetsundersøgelser på mus har vist en LD50-værdi på 300 μg/25 g legemsvægt hos 6 uger gamle mus for forbindelsen ifølge eksempel 1. Forbindelserne kan anvendes som antibakterielle eller antivirale midler i planter eller DK 168864 B1 15 dyr. Virusinfektioner såsom West Nile-virusinfektioner hos mus er modtagelige over for forbindelsen ifølge eksempel 1 i en dosis på 10 ^g/dag/mus. Bakterieinfektioner i planter såsom krongalle, der skyldes Agrobacterium turnefaciens, kan 5 behandles eller forebygges ved anvendelse af et præparat ifølge opfindelsen, som består af en 0,1%'s opløsning af ovennævnte forbindelser.

En særligt velegnet fremgangsmåde til opløsning af ovennævnte forbindelser i en vandig bærer skal beskrives i det følgende. 10 Denne fremgangsmåde omfatter anvendelsen af ultralyd eller mekanisk omrøring i en længere periode, hvilket vil opløse forbindelsen. Ultralyd frembringes generelt af en transformer, som omformer 50/60 Hz, linjespændings-vekselstrøm til højfrekvent elektrisk energi, som kobles til en transducer.

15 Ved at anvende piezoelektrisk keramik omdannes den elektriske frekvens til mekanisk vibration. Typiske amplituder på 0,0003 for et 40 kHz udstyr og 0,00007-0,001 for et 20 kHz udstyr er anvendelige. Transduceren kan være udstyret med en spændings-forhøjer, der er forbundet med en tragt, som har organer til 20 at føre ultralyden til en beholder, som indeholder væsken til opløsning af forbindelserne ifølge opfindelsen. Nyttige organer omfatter små ultrasoniske renseanordninger såsom Bronson-instrumentet. Det har vist sig, at opløsninger indeholdende ca. 5 mg/100 ml af forbindelsen ifølge opfindelsen 25 kan fremstilles ved at påføre ultralyd i et tilstrækkeligt tidsrum til at tilvejebringe en vandig væske, der indeholder forbindelsen. Den tid, der kræves hertil, er sædvanligvis 3-24 timer. Mekaniske rysteapparater med høj hastighed såsom et Tutenhauer-rysteapparat eller waring-blendere kan anvendes 30 til dette formål. Anvendelsen af en elektrisk drevet røremaskine vil få forbindelserne til at danne en opløsning eller dispersion efter ca. 3-4 timers omrøring.

Det har vist sig, at glycerol kan anvendes til fremstilling af vandige væsker, som indeholder forbindelsen. Disse præ-35 parater fortyndes derefter med et vandigt injicerbart for- DK 168864 B1 16 tyndingsmiddel såsom vand, saltopløsning, etc. Det foretrukne fortyndingsmiddel er PBS.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler. EKSEMPEL 1 5 0,01 mol ethylenglycol og 0,01 mol tellur-tetrachlorid op løstes i 35 ml tørt acetonitril og blev anbragt i en kolbe forsynet med en tilbagesvalingskondensator og en magnetom-rører. Reaktionsblandingen blev tilbagesvalet i 6 timer. Opløsningen blev filtreret varm gennem et sintret glasfilter. 10 Filtratet blev opsamlet og lodes antage stuetemperatur, hvilket resulterede i dannelsen af et hvidt bundfald. Bundfaldet blev filtreret og opsamlet på et sintret glasfilter og blev vasket med koldt acetonitril. Det blev tørret i 10 timer under et vakuum på 0,05 mm Hg. Smeltepunkt ca. 200°C (sønder-15 deling). Hvilket gav forbindelsen ifølge den almene formel A og med strukturen

Cl 0-CH- - NH.+ i / I 2 4

Cl-Te^ 1 \ ’

Cl o—ch2

Analyse:

Beregnet: C 7,70 H 2,57 N 4,49 Cl 34,06 0 10,26 Te 40,92 20 Fundet: C 7,87 H 2,5 N 4,5 Cl 33,38 O 10,13

Te 41,12.

^-NMR-Spektrum (deutereret DMF) : 6 (ppm) = 4,43 (4H, s), 7,7 (4H, t).

Massespektrum m/e: 130, 160, 165, 180, 190, 200, 222, 224, 25 247, 251, 258, 260.

DK 168864 B1 17 13C-NMR-Spektrum bekræfter tilstedeværelsen af CH2-grupper; 125Te- NMR-spektrum bekræfter tilstedeværelsen af ét Te-atom i molekylet.

Forskellen i Cl-analysen kan skyldes tilstedeværelsen af en 5 lille mængde af forbindelserne med den almene formel II i prøven.

EKSEMPEL 2 0,01 mol ethylenglycol sattes til 0,01 mol tellur-tetra-chlorid i 50 ml tørt benzen i en kolbe forsynet med en tilba-10 gesvalingskondensator og en magnetomrører. Reaktionsblandingen blev tilbagesvalet i 16 timer og filtreret varm gennem et sintret glasfilter og oparbejdet som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af benzen som vaskevæske. Smeltepunkt ca.

250°C (sønderdeling). Hvilket gav forbindelsen ifølge den 15 almene formel B og med strukturen EKSEMPEL 3

En opløsning af forbindelsen ifølge eksempel 1 blev fremstillet som følger: 5 mg blev anbragt i en volumetrisk kolbe, hvortil sattes 100 ml af en opløsning af 40%'s dimethylsul-20 foxid (DMSO) og 60%'s phosphatpuffer/saltopløsning (PBS), hvilket gav en koncentration på 10 yug/0,2 ml. Hvis opløsningen bliver uklar, centrifugeres den ved 2000 omdr./minut i 10 minutter, og den klare supernatantdel anvendes.

Forsøgsdyrene var Balb-c-hanmus, alder 6-8 uger. Alle in-25 jektioner blev foretaget intraperitonealt under anvendelse af 0,2 ml af opløsningen af forbindelsen ifølge eksempel 1 med en 0,5 x 16 mm kanyle.

Dyrene fik følgende injektioner: a) Kontrol (ingen injektion) 30 b) Kontrol (0,2 ml DMSO) DK 168864 B1 18 c) 1 μg af forbindelsen ifølge eksempel 1 (i 0,2 ml DMSO/PBS-opløsning) d) 10 ^g af forbindelsen ifølge eksempel 1 (i 0,2 ml DMSO/PBS-opløsning) 5 Hver af grupperne a, b, c og d bestod af 21 dyr. Fra 24 timer til 7 dage efter injektionen blev der dagligt aflivet et antal dyr.

På hver dag blev miltceller fra 3 af dyrene fra hver kontrolgruppe samlet sammen i pulje og bearbejdet ved at lede milt-10 cellerne gennem et net af rustfrit stål med en maskevidde på 0,250 mm i en 5 mm Petri- skål indeholdende PBS for at adskille cellerne. Cellerne blev opsamlet og centrifugeret ved 1000 omdr./minut i 10 minutter. Supernatanten blev kasseret, og cellerne blev behandlet i 2 minutter med 5 ml hypotonisk 15 puffer (0,15 M NH4C1, 0,01 M KHC03 opløst i dobbeltdestil-leret vand, pH 7,2) for at dræbe erythrocyterne. Derefter blev PBS sat til cellerne, og cellerne blev centrifugeret i 10 minutter ved 1000 omdr./minut. Cellerne blev vasket to gange med PBS og talt i et hæmocytometer under anvendelse af 20 trypan-blåt for at undersøge levedygtigheden. Cellerne blev bragt til en koncentration på 107 celler/ml ved hjælp af beriget RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum (Ser Lab, Sussex, England) , 5 x 10'5 M 2-mercaptoethanol og 3% d-gluta-min (Bio Lab, Israel) (stamopløsning 2m M x 1000 ikke-essen-25 tielle aminosyrer) (Bio Lab, Israel) (stamopløsning x 100) og natriumpyruvat (Bio Lab, Israel) (stamopløsning lm M x 100) .

Yderligere 3 dyr fra hver af forsøgsgrupperne blev aflivet, og hver af miltene blev bearbejdet separat under anvendelse af samme fremgangsmåde.

30 Celleblandingen blev opdelt i to grupper.

a) Celler med en koncentration på 107 celler/ml beriget med RPMI, hvortil var sat 2 ftg/ml concanavalin-A (CON A) (DiFCO, Batch 352) . Disse celler blev inkuberet i 5 mm Petri-skåle DK 168864 B1 19 (NUNC) i 24 timer ved 37°C, 7,5% C02. Supernatanterne blev opsamlet, centrifugeret ved 1600 omdr./minut i 10 minutter og opbevaret ved 4°C indtil anvendelsen. Disse supernatanter blev analyseret for IL-2- og CSF-aktivitet.

5 b) Celler med en koncentration på 107 celler/ml beriget med RPMI, som blev inkuberet ved 37°C, 7,5% C02 i 96 timer uden tilsætning af CON A. Supernatanterne blev opsamlet, centrifugeret og opbevaret ved 4°C indtil anvendelsen. Disse supernatanter blev analyseret for CSF-aktivitet.

10 Før inkubation af cellerne blev prøver fjernet fra kulturpladerne, og udstrygningspræparater af kulturerne blev fremstillet ved cytocentrifugering. Objektglassene blev farvet med May-Grunwald-Giemsa- opløsning (1:10) og bedømt morfologisk. Et radioaktivt thymidin-assay blev anvendt for at 15 bestemme IL-2-aktiviteten.

Assay for IL-2-aktivitet 1. Supernatanterne blev testet for IL-2-aktivitet ved formering af den IL-2-afhængige cellelinje CTLD. IL-2-assayet er baseret på disse dyrkede T-cellelinjers vækstafhængighed af 20 IL-2. T-celler, der høstes fra en IL-2-afhængig kultur, vaskes og igen anbringes i kultur i fraværelse af IL-2, dør uundgåeligt inden for 24 timer. Ved at anvende tritieret thymidin-inkorporering (3H-TdR) som et index for dyrket T-cellereplikation giver IL-2-mikroassayet en i høj grad repro- 25 ducerbar og kvantitativ indikation af mængden af IL-2-aktivitet i den som ovenfor beskrevet fremstillede supernatant.

2. For at analysere et konditionsmedium for IL-2-aktivitet blev en prøve indeholdende 5 x 104 CTLD-celler, 10% føtalt kalveserum og 50% af den omhandlede supernatant suspenderet i 30 et slutvolumen på 1 ml RPMI. Alikvoter på 0,2 ml fra hver prøve blev anbragt i 4 replikatbrønde med 96 mikrobrønde vævskulturplader (NUNC) . Det konditionerede medium blev vundet fra kulturer af miltceller fra Charles River-rotter, DK 168864 B1 20 der var stimuleret med CON A indeholdende en kendt mængde IL-2 som reference i alle assays.

3. Mikrobrøndene blev inkuberet i 24 timer ved 37°C, hvorefter der tilsattes 1 ^Ci/brønd 3H-methylthymidin. Cellerne 5 blev derefter inkuberet yderligere natten over, høstet med en cellehøster og talt i en β-scintillator.

Resultaterne, udtrykt som tællinger pr. minut (CPM) , var som følger og viser den relative mængde IL-2, som er til stede i supernatanterne: 10 a) Kontrol (ingen injektion) b) Kontrol (0,2 ml DMSO) c) 1 |ig af forbindelsen ifølge eksempel 1 (i 0,2 ml DMSO/PBS-opløsning d) 10 /1g af forbindelsen ifølge eksempel 1 (i 0,2 ml 15 DMSO/PBS-opløsning dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 6 dag 7 a) 1 37.695 32.055 24.758 45.029 25.065 36.775 b) 1 16.323 30.824 24.861 30.555 48.921 38.626 20 c) 25.919 21.398 10.130 31.999 41.261 66.854 c) 34.326 22.050 13.235 14.226 80.314 58.094 C) 16.718 9.338 2.176 17.228 42.485 51.268 d) 24.335 31.901 20.316 26.644 22.040 85.216 d) 21.193 36.390 18.288 18.051 74.043 6.299 25 d) 25.381 22.066 12.126 65.963 43.838 ......

Miltene fra kontroldyr blev samlet i pulje efter fjernelse fra dyrene.

EKSEMPEL 4 30 I dette eksempel beskrives stimuleringen af IL-2-produktion fra humane énkernede celler under anvendelse af forbindelsen ifølge eksempel 1.

DK 168864 B1 21

Venøst helblod (med heparin, Evans: 10 IU/ml blod) blev fortyndet med RPMI i et forhold på 1:1. Det fortyndede blod blev forsigtigt anbragt på Lymphoprep (Nylgard & Co., Oslo, Norge, densitet 1,077 g/ml), to dele fortyndet blod på én del 5 Lymphoprep. Hvert rør blev forsynet med 3 ml Lymphoprep og 6-7 ml fortyndet blod. Rørene blev centrifugeret i 30 minutter ved 1600 omdr./minut ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen blev énkernede celler opsamlet fra interfase- fraktionen og vasket 3 gange med RPMI. Cellerne blev resuspenderet i 10 RPMI, talt på et hæmocytometer under anvendelse af trypan-blåt for at teste for levedygtighed og bragt til en koncentration på 1 x 106 celler/ml i beriget RPMI. Varierende koncentrationer af forbindelsen ifølge eksempel 1, gående fra 50 ^g/ml til 5 pg/ml, blev tilsat i en mængde på 10% af 15 celleblandingen. Alikvoter på 0,2 ml fra hver prøve blev anbragt i brønde på mikroplader (NUNC) (triplikater). Mi-kropladerne blev inkuberet i 72 timer ved 37°C, hvorefter 3H-methylthymidin, 1 /iCi/brønd (Nuclear Research Center, Israel) , blev sat til kulturerne. Cellerne blev yderligere 20 inkuberet natten over og høstet med en cellehøster. Formeringen af humane énkernede celler blev forøget 5-6 gange i området 1 10 ng/ml celler af forbindelsen ifølge eksempel 1, hvilket antyder, at forbindelsen ifølge eksempel 1 enten inducerede produktion af IL-2 i en delmængde af de énkernede 25 celler, hvilket resulterede i den observerede formering og/eller den inducerede receptordannelse i en given population, hvilket også ville resultere i formering.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel belyser in vivo-virkningen af forbindelsen 30 ifølge eksempel 1 på en eksperimentelt induceret tumor.

En opløsning af 0,2% methylcholanthren (MCA, Sigma, USA) blev fremstillet ved at opløse 2 mg af carcinogenet i 1,0 ml olivenolie (jfr. Petra et al., Cancer 19, 1961, s. 302) med kontinuerlig omrystning ved 37°C i 30 minutter. 6-8 uger DK 168864 B1 22 gamle C3Heb-mus blev injiceret subcutant med 0,6 mg MCA/0,3 ml opløsningsmiddel/mus i låret på højre bagben.

Efter 21-30 dage blev den inducerede tumor fjernet kirurgisk og skubbet gennem net af rustfrit stål, maskevidde 0,250 mm, 5 for at få isolerede celler. Disse celler blev derefter yderligere injiceret subcutant i låret på højre bagben på C3Heb-mus, .alder 5-8 uger, i en koncentration på 1.06 celler/0,3 ml PBS/mus med en 0,5 x 16 mm kanyle, for yderligere at inducere tumordannelse.

10 5 dage efter injektion af tumorcellerne blev der induceret en følelig tumor. Dyrene blev derefter behandlet som følger: a) Kontrol (0,2 ml 40% DMSO 60% PBS, intraperitonealt 1 dag, efter at den inducerede tumor var følelig).

b) 10 /xg af forbindelsen ifølge eksempel 1, intraperito- 15 nealt til 5 mus (i 0,2 ml 40% DMSO 60% PBS, 3 dage efter at den inducerede tumor var følelig, og en anden injektion på 10 jixg forbindelse i det samme opløsningsmiddel blev administreret 5 dage efter den første, injektion til 3 af de 5 mus.

20 Tumorerne blev skåret ud efter 13 dage, og volumenet blev bestemt og er anført i tabel 1 nedenfor. Alle dyrene døde 35-38 dage efter den initiale inokulation.

} TABEL 1 DK 168864 B1 23

Forbindelse ifølge eks. 1 Tumorvolumen Gruppe Mus Administration (13 dage) 5a* 1 -- 4,01 a* 2 -- 3,7 a* . 3 -- - 3,9 b 7 dag 3 0,77 b .8 dag 3 1,66 10 b 4 dag 3 og 5 0,7 b 5 dag 3 og 5 0,52 b 6 dag 3 og 5 0,31 *) Kontrol 15 EKSEMPEL 6

Balb-c-mus med en alder på 7 uger fik injiceret methylcho-lanthren for at inducere dannelse af fibrosarcoma-celler i henhold til fremgangsmåden ifølge eksempel 5. Forsøgsdyrene blev opdelt i to grupper: 20 a) Kontrol (0,2 ml intraperitonealt 40% DMSO og 60% PBS).

b) 10 μg af forbindelsen ifølge eksempel 1 (i 0,2 ml 40% DMSO 60% PBS, intraperitonealt med de i tabel 2 viste intervaller).

DK 168864 B1 24 TABEL 2

Dage efter inokulering Dage efter injektion % over- med tumorceller med forb. ifølge eks. 1 levelse 5 a)* 24 -- 100 25 -- S3 34 -- 55 46 -- 45 60 -- 35 10 67 -- 18 69 -- 0 b) 4 4 100 9 9 100 23 23 100 15 30 30 100 37 37 100 391 39 100 41 41 100 43 43 100 20 46 46 80 48 48 80 50 50 80 53 53 60 60 60 40 25 67 -- 20 68 -- 0 *) Kontrol 1) Dag 39 var starten på et forøget doseringsregimen for at bestemme 30 toxiciteten af forbindelsen ifølge eksempel 1. Mortalitetsresul- taterne for gruppe b) var 0% indtil lige efter det forøgede doseringsregimen.

EKSEMPEL 7 I dette eksempel beskrives in vitro-fremstillingen af IL-2 og 35 CSF ud fra musemiltceller under anvendelse af forbindelsen ifølge eksempel 1 som det ydre stimuleringsmiddel.

Milten blev fjernet fra 15 Balb-c-hanmus med en alder på 6-8 uger. Milt cellerne blev skubbet gennem net af rustfrit stål, DK 168864 B1 25 maskevidde 0,250 mm, i 5 mm Petri-skåle indeholdende PBS for at adskille cellerne. Cellerne blev derefter opsamlet i centrifugerør og centrifugeret ved 1000 omdr./minut i 10 minutter. Supernatanten blev kasseret, og cellerne blev 5 behandlet med 5 ml hypotonisk puffer (0,15 M NH4C1, 0,01 M KHCO3 opløst i dobbeltdestilleret vand, pH 7,2) i nøjagtigt to minutter. Derefter blev PBS sat til cellerne, og reagensglassene blev centrifugeret i 10 minutter ved 1000 omdr./minut. Cellerne blev skyllet to gange og talt i et hæmocytome-10 ter under anvendelse af trypan- blåt for at teste for levedygtighed. Cellerne blev bragt til en koncentration på 107 levedygtige celler/ml. Cellerne blev bragt i kontakt med varierende mængder af forbindelsen ifølge eksempel 1 i 1 ml 40% DMSO 60% PBS. I tabel 3 vises den induktion af IL-2-15 aktivitet og kolonistimulerende faktor, som blev opnået med varierende mængder af forbindelsen ifølge eksempel 1.

TABEL 3

Forbindelsen ifølge eks. 1 IL-2 (cpm) CSF (kolonier/skål) 20 _ 50 rø 5.000 2 5 jLtg 5.000 5 500 ng 5.000 25 50 ng 6.000 75 25 5 ng 15.000 120 500 pg 30.000 175 50 pg 38.000 260 5 pg 12.000 140 30 ^g = mikrogram ng = nanogram pg = picogram

Kontroldyr injiceret med DMSO-opløsningsmiddel viste sig at have en IL-2-grundlinje på 4.000-5.000 cpm og en CSF på 70-80 35 kolonier/skål.

DK 168864 B1 EKSEMPEL 8 26

Humane énkernede celler blev vundet som beskrevet ovenfor og dyrket i 72 timer i en koncentration på 106 celler/ml beriget RPMI i nærværelse af varierende koncentrationer af forbindel-5 sen ifølge eksempel 1. Supernatanter fra kulturen blev opsamlet, centrifugeret og testet for IL-2-aktivitet ved anvendelse af 50% af mængden af supernatanten, idet deres evne til at støtte formeringen af den IL-2-afhængige cellelinje CTLD blev analyseret. Resultaterne af dette assay er vist i tabel 4.

10 TABEL 4

Forbindelse ifølge eks. 1 Tællinger pr. minut 1 /ig 250 100 μg 280 15 10 ng 1.500 1 ng 11.000

Kontrol: CTLD-celler 3.500 20 EKSEMPEL 9 I dette eksempel beskrives stimuleringen af IL-2-produktionen ud fra humane énkernede celler under anvendelse af forbindelsen ifølge eksempel 2.

Venøst helblod (med heparin, Evans: 10 IV/ml blod) blev 25 fortyndet med RPMI i et forhold på 1:1. Det fortyndede blod blev forsigtigt anbragt på Lymphoprep (Nylgard & Co., Oslo, Norge, densitet 1,077 g/ml), to dele fortyndet blod på én del Lymphoprep. Hvert rør blev forsynet med 3 ml Lymphoprep og 6-7 ml fortyndet blod. Rørene blev centrifugeret i 30 minutter 30 ved 1600 omdr./minut ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen blev énkernede celler opsamlet fra interfase- fraktionen og vasket 3 gange med RPMI. Cellerne blev resuspenderet i DK 168864 B1 27 RPMI, talt på et hæmocytometer under anvendelse af trypan-blåt for at teste for levedygtighed og bragt til beriget RPMI. Varierende koncentrationer af forbindelsen ifølge eksempel 2, gående fra 50 ^g/ml til 1 ng/ml, blev tilsat i en 5 mængde på 10% af celleblandingen. Alikvoter på 0,2 ml fra hver prøve blev anbragt i triplikatbrønde på mikroplader (NUNC). Mikropladerne blev inkuberet i 72 timer ved 37°C, hvorefter 3H-methylthymidin, 1 μα/brønd (Nuclear Research Center, Israel), sattes til kulturerne. Cellerne blev yderli-10 gere inkuberet natten over og høstet med en cellehøster.

Formering af de humane énkernede celler blev forøget 10 gange i området 1-10 ng af forbindelsen ifølge eksempel 2/ml celler, hvilket antyder, at forbindelsen ifølge eksempel 2 enten inducerede produktion af IL-2 i en delmængde af de énkernede 15 celler, hvilket resulterede i den observerede formering og/eller den inducerede receptordannelse i en given population, hvilket også ville resultere i formering.

EKSEMPEL 10

Til en 100 ml opløsning af PBS1 sættes 5,0 mg af forbindelsen 20 ifølge eksempel 1 under sterile betingelser. Blandingen anbringes i en sonikator og sonikeres i 4 timer. Efter de 4 timer opløses forbindelsen, hvilket giver en koncentration på 10 μg/0,2 ml.

NaCl 8,0 g 25 KC1 200 mg

Na2HP04 1150 mg KH2P04 200 mg

CaCl2 (vandfri) 100 mg/1

MgCl2.6H20 100 mg/1 30 H20 op til 1 liter EKSEMPEL 11 DK 168864 B1 28

Under anvendelse af 100 ml af det i eksempel 10 nævnte PBS opløses 5,0 mg af forbindelsen ifølge eksempel 1 ved omrystning i et elektrisk drevet rysteapparat i 4 timer under 5 sterile betingelser, hvilket giver en 10 ^g/0,2 ml opløsning.

EKSEMPEL 12

Under omrøring opløses 5,0 mg af forbindelsen ifølge eksempel 1 under sterile betingelser i 20 ml glycerol. Derefter tilsættes 80 ml PBS til dannelse af en opløsning indeholdende 10 10 ^g/0,2 ml.

Det blev bestemt, at forbindelsen ifølge eksempel 1 opløses som følger:

6,0 g/1 i 40% glycerol/60% PBS

1,3 g/1 i 20% glycerol/80% PBS 15 1,0 g/1 i 10% glycerol/90% PBS

EKSEMPEL 13 I dette eksempel vises virkningen af oral administration af forbindelserne ifølge eksempel 1 og 2 på induktionen af lymfokiner.

20 Forbindelserne blev administreret til Balb-c-hanmus, alder 6-8 uger, ved administration af forbindelserne ifølge eksempel 1 og 2 i drikkevandet i en koncentration på 10 μg/ml vand og 1 Mg/ml vand for forbindelsen ifølge eksempel 1 og 25 μg, 10 μg og 1 μg/ml vand for forbindelsen ifølge eksempel 2. Vand-25 opløsningen blev fremstillet ved at opløse forbindelserne i PBS i en koncentration på 50 μg/ml PBS og fortynde den resulterende opløsning til den ønskede koncentration. Forbindelserne blev administreret i løbet af 4 dage. Den nøjagtige mængde væskeindtagelse blev optegnet daglig. Efter 4 dage 30 blev musene aflivet, og milten blev fjernet og bearbejdet som DK 168864 B1 29 beskrevet i eksempel 3. Cellerne blev inkuberet i en koncentration på 107 celler/ml i beriget RPMI -indeholdende 2 jug/ml CON A i 24 timer ved 37°C. Supernatanterne blev opsamlet og testet for IL-2-indhold.

5 Forbindelse jug/ml h20 Indtagelse/dyr cpm

Eksempel 1 10 jug/ml 248 μg

Eksempel 1 1 μg/ml 23 μg 49179 [+50%]*

Eksempel 2 25 μg/ml 406 μg 44500 [+35%]* 10 Eksempel 2 10 μg/ml 123 μg 36815

Eksempel 2 1 μg/ml 17 μg 42500 [+30%]*

Kontrol 32843 *) Procentvis stigning i sammenligning med kontrol.

15 Forbindelsen ifølge eksempel 1 blev grundigt blandet med pulveriseret saccharose, og 10 μg af forbindelsen ifølge eksempel 1 i 25 mg pulveriseret saccharose blev anbragt i munden på hver mus.

Efter 24 timer blev musene aflivet, og milten blev bearbejdet 20 som beskrevet ovenfor. IL-2-indholdet var som følger:

Test 1 cpm A 250.175 [+117%]* B 166.475 [+ 50%]* 25 Kontrol 110.853 DK 168864 B1 30

Test 2 cpm A 55.382 [+69%]* B 41.938 [+28%]* 5 C 29.172 [ 0]

Kontrol 32.980 *) Beregnet som procentvis stigning i sammenligning med kontrol 10 Dette forsøg viser, at forbindelsen ifølge eksempel 1 er virksom til induktion af lymfokinproduktion, når den gives i tør form eller hydrolyseres i et vandigt fortyndingsmiddel.

EKSEMPEL 14 0,5 mol tellurdioxid blev suspenderet i 250 ml 1,2 ethandiol 15 (overskud), og blandingen blev opvarmet under tilbagesvaling ved 90°C under et let vakuum i 16 timer. Man fik et hvidt krystallinsk produkt. Materialet blev adskilt ved filtrering, tørret og derefter oprenset ved sublimering ved 150°C (0,25 mm Hg), smeltepunkt 206-210°C, jfr. JACS 103, 1981, s. 2340-20 2347.

Analyse:

Beregnet for C4H804Te: C 19,2 H 3,3 0 25,07 Te 51,2

Fundet: C 19,91 H 3,12 0 24,98 Te 49,99.

MS m/e: 250.

25 Forbindelsen har følgende struktur: h2c-0^ q-ch2

Te h2c — 0 — ch2 EKSEMPEL 15

Til en omrørt opløsning af 0,015 mol TeCl4 og 0,03 mol 1,2-propandiol i 70 ml tetrahydrofuran ved -40°C blev dråbevis DK 168864 B1 31 sat 0,06 mol triethylamin i 30 ml tetrahydrofuran. Det hvide bundfald af triethylaminhydrochlorid blev fjernet ved filtrering. Filtratet blev koncentreret ved stuetemperatur, og man fik hvide olieagtige krystaller, som blev oprenset ved 5 sublimering ved 120°C (0,25 mm Hg). MS m/e: 204, 278. Denne forbindelse har følgende struktur: H3C— CH-0^ ^^0-CH—CH3

Te J

H2C-— CH2 EKSEMPEL 16

Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel l blev følgende forbindelser fremstillet under anvendelse af tellur-10 tetrachlorid og den tilsvarende diol: a) _ 0- CHCEL· - NH.+ / I 3 4

Cl3 Te I

O-CH2 1,2-propandiol MS: 165, 200, 239. b) y0-CHCH~ - NH.+ X 3 4

Cl i Te 3 \ ^0-CHCH3 15 2,3-butandiol MS: 165, 200, 253.

DK 168864 B1 32 c) — “ O-CH0 - NH.+ X i 2 4 C13 TV ?H2 o-ch2 1,3-propandiol MS: 165, 200, 239.

d) p O-CH„ - NH.+ / i 2 4

Cl-, Te CH- \ ?H2 L . 0-Ca2 5 1,4-butandiol EKSEMPEL 17

De nedenfor anførte forbindelser blev testet in vitro i forskellige koncentrationer, som gik fra 10 jug/ml celler til 1 x 10"6 ^g/ml celleblandinger. Celler blev vundet fra milten 10 på Balb/c-hanmus, alder 6-8 uger. Miltene blev skubbet gennem et filter af rustfrit stål, maskevidde 0,250 mm, for at adskille cellerne. Erythrocyterne blev lyseret ved behandling med hypotonisk puffer (0,15 M NH4C1, 0,001 M KHC03 opløst i dobbeltdestilleret vand, pH 7,21) i to minutter. De resteren-15 de celler blev skyllet to gange og bragt til en koncentration på 107 celler/ml beriget RPMI. Cellerne blev derefter inoku-leret med testforbindelsen og inkuberet i 24 timer ved 37°C i nærværelse af 7,5% C02. Supernatanterne blev derefter opsamlet og testet for IL-2-aktivitet ved formeringen af den IL-2-20 afhængige cellelinje CTLD. Disse forsøg viste, at ved 1 /ig/ml celleblanding havde de fleste af forbindelserne maksimal virkning på IL-2-udskillelse.

DK 168864 B1 33

Forbindelse Miltceller (cpm)

Eksempel 1 14.600 (+472%)

Eksempel 14 10.300 (+304%) 5 Eksempel 2 18.000 (+605%)

Ph2Te (OCOCH3) 2* 3.500

Ph2TeCl2* 2.300

Ph2Te (OCOPh) 2* 4.3 0 0_

Ph2TeCl* 2.100 10 PhTeCl3 18.000 (+605%) (pCH3OPh)2TeCl2 2.148

Eksempel 16 a) 13.540 (+435%)

Eksempel 16 b) 10.650 (+318%)

Eksempel 16 c) 15.720 (+516%) 15 Eksempel 16 d) 18.075 (+608%)

Te02 17.055 (+508%)

Kontrol 2.550 *) Ingen signifikant aktivitet i det testede niveau.

20 EKSEMPEL 18 I dette eksempel vises den stimulerende virkning af forbindelserne ifølge eksempel 1, eksempel 16 a) og Te02 på induktionen af IL-2- receptorer af humane énkernede celler.

Humane énkernede celler blev bragt til en koncentration på 25 106 celler/ml RPMI + 10% FCS. Alikvoter på 0,2 ml blev an bragt i duplikatbrønde eller mikroskåle, og pladerne blev inkuberet ved 37°C i 24 timer. Derefter blev brøndene skyllet to gange med RPMI, og cellerne blev resuspenderet med 20 IU/ml rekombinant IL-2 i RPMI og 10% FCS. Pladerne blev 30 yderligere inkuberet i 48 timer og mærket med 3H-thymidin 24 timer før høst.

Formeringen blev målt ved 3H-thymidinoptagelse som beskrevet af Gillis et al., J. Immunol. 120, 1978, s. 2027. Resultaterne er udtrykt i tællinger pr. minut.

DK 168864 B1 34

Test A Forb. fra Forb. fra Forb. fra Forb.fra (/zg/ml) eks. l eks. 1 eks. 16 a) Te02 eks. 16 b) 1 28625 27593 21910 1563 1018 5 5x10"1 120755 105943 145208. 4667 1195 7X10'1 164538 115195 130845 2475 2102 5x10"2 20022 5702 8752 2515 1602 lxlO'2 1952 3963 9543 3108 5883 lxlO'3. 3652 5055 6685 2867 1093 10 lxl O"4 3558 4047 6447 5540 1138 lxlO"5 2474 4063 8177 3442 2146 a) Kontrol - 2338 (intet kemikalie) b) Celler plus rekombinant IL-2 (humant) Biogen, 1,5 x 10'6 enheder 15 - 3260 c) Phytohæmagglutinin M (Difco) - 195.432

Test B Forbindelse Forbindelse Forbindelse ^g/ml) fra eks. 1 fra eks. 2 Te02 fra eks. 14 20 1 23488 9315 3275 2620 5x10_1 66910 8688 5405 2402 7x10’1 17620 5250 4302 2000 5x10’2 5390 5538 4280 3290 lxlO'2 6057 6418 3077 3928 25 lxlO'3 5865 5167 3800 3007 lxlO-4 4960 5372 2925 2327 lxlO’5 7155 6397 3645 2242 a) Kontrol 5573 (intet kemikalie) 30 b) Celler plus rekombinant IL-2 (humant) Biogen, 1,5 x 10‘6 enheder - 6858 c) Phytohæmagglutinin M (Difco) - 125.272 EKSEMPEL· 19 I dette eksempel vises den stimulerende virkning af forbin-35 delserne ifølge opfindelsen på formeringen af humane énkeme-de celler.

Humane énkemede celler blev vundet ved at lægge heparini-seret blod i et lag over en Ficoll/Hypague-gradient. De DK 168864 B1 35 énkernede celler blev resuspenderet i beriget RPMI, skyllet tre gange og bragt til en koncentration på 5xl05 celler/ml beriget RPMI. Varierende koncentrationer af forbindelserne ifølge eksempel 1 og eksempel 2, gående fra 0,005 /zg til 5 5 ^g/celleblanding, blev sat til cellerne. Alikvoter på 0,2 ml af hver prøve blev anbragt i brønde på mikroplader (triplika-ter). Mikropladerne blev inkuberet i 72 timer ved 37°C, hvorefter de blev mærket med 3H-methylthymidin, JL μΟΐ/^Γ0ηά, i yderligere 24 timer. Cellerne blev derefter høstet med en 10 cellehøster.

Forbindelse Forbindelse (μg/ml) ifølge eks. 1 ifølge eks. 1 1 873 4700 15 5X10'1 18515* 33700* lxlO"1 2735 708 5xl0'2 3865 910 lxlO'2 3235 1362 lxlO’3 2553 2180 20 lxlO'4 3838 2387 1X10-5 3218 2442

Kontrol 2700 2943 DK 168864 B1 36

Forbindelse Forbindelse Forbindelse ^g/ml) ifølge eks. 1 ifølge eks. 1 ifølge eks. 16 a) Te02 5 5 μg/ml 5008 5182 4118 3028 1 rø/ml 6000 5600 4557 2842 5xl0_1 20488* 13600* 18415* 4773 lxlO:1 7037 10382* 12435* 4825 5xl0"2 5520 5765 5953 5802 10 1x10"2 6898 5712 6000 4730 lxlO'3 5800 6000 6300 6168 lxlO-4 5513 6212 4587 5331

Kontrol 3600 6117 6113 4912 15 *) De koncentrationer, som inducerede formering, går fra 5x10_1 til lxlO'1 ^g. Der fandtes ingen signifikant virkning for Te02 i nogen af de koncentrationer, der blev undersøgt.

Forbindelse Forbindelse (^g/ml) ifølge eks. 2 ifølge eks. 2 20 _· 4557 943 5X10'1 18415 23957* lxlO'1 12435 31424* 5x10"2 5953 5532 25 lxlO'2 6000 2987 lxlO'3 6300 1510 lxlO'4 4321 2332 lxlO'5 5118 2481

Kontrol 4587 2018 30 _ *)De koncentrationer, som inducerede formering, går fra 5x10'1 til lxlO'1 μg. Der fandtes ingen signifikant virkning for Te02 i nogen af de koncentrationer, der blev undersøgt.

EKSEMPEL 20 37 DK 168864 B1

Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 4 blev humane énker-nede celler testet for deres evne til at producere IL-2 efter induktion med PHA eller i ikke-stimulerede celler fra normale 5 donorer og fra patienter, der led af systemisk lupus erythematous (SLE). IL-2-indholdet blev undersøgt i henhold til den i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde under anvendelse af den IL-2-afhængige cellelinje CTLD. Resultaterne er vist i tabel 5.

10 TABEL 5 IL-2-produktion af forbindelsen ifølge eksempel 1 5 /ig 0,2

Patienter PHA ml PBS 1:50 PBS* 1:100 PBS* 1:200 PBS* 15 Normale 1 - 2,3** 43,6 38,4 30,1 + 36,4 48,2 46,2 38,6 2 - 2,1 52,2 50,3 47,1 + 30,4 38,9 54,2 49,8 20 3 - 2,1 50,8 46,1 31,3 + 38,9 53,5 44,8 38,3

SLE

1 - 2,0 37,3 32,1 26,1 + 6,3 24,2 19,7 15,4 25 2 - 2,4 43,6 35,1 30,3 + 8,2 28,1 24,0 18,6 3 - 2,4 19,2 18,1 14,4 + 4,1 23,8 20,2 16,8 30 *) Fortynding af 1 del 0,2 ml PBS indeholdende 5 μg af for bindelsen ifølge eksempel 1 i 50, 100 eller 200 dele PBS.

**) CPM x 10 "3 3H-thymidin af 5xl04 CTLD-celler i nærværelse af 1:2 fortynding af supernatanterne som beskrevet i eksempel 3.

DK 168864 B1 38 EKSEMPEL 21 I dette eksempel er der tilvejebragt et assay for at detektere tilstedeværelsen af receptorsteder for IL-2. Humane énkemede celler blev inkuberet i 24 timer i nærværelse af 5 forbindelsen ifølge eksempel 1 og Te02. Cellerne blev vasket to gange med PBS og derefter inkuberet med et specifikt fluoresceineret antistof mod IL-2-receptorer, som beskrevet af Uchiyama et al., J. Immunol. 126, 1981, s. 1398. Resultaterne var, at i kontrollen var 2% af cellerne positive, i nærværel-10 se af PHA var 80% af cellerne positive, og med 1 /tg/ml af forbindelsen ifølge eksempel 1 viste 20% af cellerne sig at være positive. Det viste sig, at Te02 gav 5% positive celler ved et niveau på 1 ^g/ml.

EKSEMPEL 22 15 Virkningen af forbindelsen ifølge eksempel 1 på en infektion med West Nile-virus (WNV) blev bestemt. WNV er et togavirus fra flavivirusgruppen, en positiv enkeltstrenget RNA-virus, som, når det injiceres intraperitonealt i mus, sædvanligvis dræber dem inden for 5-8 dage på grund af omfattende beskadi-20 gelse af centralnervesystemet. Til denne undersøgelse blev ICR-mus (3 uger gamle) injiceret intraperitonealt med viruset i en koncentration på 103 eller 104 LD50 enheder/mus. Injektioner af 10 ^g/0,2 ml PBS/mus af forbindelsen ifølge eksempel 1 blev givet på dag -1 (én dag før injektion af virus) 25 og 6 dage efter injektion af virus. Tabel A viser foreløbige resultater af et sådant forsøg. Som det fremgår, døde efter 8 dage alle de dyr, der var injiceret med virus alene, hvorimod 3 ud af 4 dyr, der modtog behandling med forbindelsen ifølge eksempel 1, forblev i live.

DK 168864 B1 39

TABEL A

Behandling 10¾¾ 103LD50 1 04LD50 104]¾) O

Forb. ifølge

eks. 1 injiceret NEJ JA NEJ JA JA

5 _

Antal levende/ samlet antal dyr 0/6 3/5 0/6 3/5 6/6 I et andet forsøg blev musene injiceret med l03IPLD50-virus 10 og modtog injektioner af forbindelsen ifølge eksempel 1 (1 ^g/0,2 ml/PBS/mus) på dag -1, 1, 2 og 4. Foreløbige resultater af et sådant forsøg på dag 8 efter injektion er vist i tabel B. Som det fremgår, døde på dag 8 alle de dyr, der var injiceret med virus alene, hvorimod 3 ud af 5 dyr, der modtog 15 forbindelsen ifølge eksempel 1, forblev i live. 2 ud af de resterende 3 overlevede i yderligere 8 dage, hvorimod den tredje forblev i live uden nogen manifestationer af kliniske symptomer.

TABEL B

20 Behandling 103IPLD50 103IPLD50 + Forbindelse ifølge forbindelse eksempel 1 ifølge eks. 1

Antal levende/ 25 samlet antal 0/8 3/5 5/5 EKSEMPEL 23 I dette eksempel vises, at interaktionen af WNV med kulturer af ICR-musemakrophag resulterer i en produktiv infektion.

30 Varierende mængder af forbindelsen ifølge eksempel 1 (5 |ig, 1 μg, 0,1 μg) blev inkuberet med et enkeltlag af musemakropha-ger i 24 timer. Efter 24 timer døde de makrophager, der var inkuberet med 5 ^g af forbindelsen ifølge eksempel 1, hvorimod de øvrige forblev upåvirkede. Alle kulturerne blev 35 derefter inficeret med 104 PFU/plade. Efter 72 timers inkuba-

Claims

15 PATENTKRAV

1. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en farmaceutisk acceptabel bærer og en forbindelse med den almene formel i— R ή - NH. + A* 1 4 X O- C-R-, x— Te (V^Vt V <R4-<fVu \ <ν?-νν

0-C-Rq

20 I 8 R9 X eller B: ? x o- C-R^ \ / (R2-fR3),: Te (E4-C-R5)u \ (e6-c-R7)v 0-^8 R9 DK 168864 B1 41 eller C: Te02 eller D: PhTeCl3 5 eller E: (C6H5)4P+(TeCl3(02C2H4) )- eller F: Rirf-^-0-CB-R12 I ^Te\ I Ri3 CH-0^ 0-CH-R14 hvor t er 1 eller 0; u er 1 eller 0; v er 1 eller 0; R, R1#

10 R2, R3, R4/ R5, Rg, R7, R8 og R9 er ens eller forskellige og uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxy, alkyl med 1-5 carbonatomer, halogen, halogenalkyl med 1-5 carbonatomer, carboxy, alkyl-carbonylalkyl med 2-10 carbonatomer, alkanoyloxy med 1-5 15 carbonatomer, carboxyalkyl med 1-5 carbonatomer, formyl, amido, cyano, amidoalkyl med 1-5 carbonatomer, N-monoalkyl-amidoalkyl med 2-10 carbonatomer, Ν,Ν-dialkylamidoalkyl med 4-10 carbonatomer, cyanoalkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxy med 1-5 carbonatomer, alkoxyalkyl med 2-10 carbonatomer og -20 COR10/ hvor R10 betegner alkyl med 1-5 carbonatomer; og X betegner halogen; R11# R12, R13 og R14 uafhængigt af hinanden er valgt blandt hydrogen, hydroxyalkyl med 1-5 carbonatomer, hydroxy og alkyl med 1-5 carbonatomer. 1 Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at forbindelsen har den almene formel DK 168864 B1 42 X .0 — CH- NH.+ I / 2 4 X-Te • i ^O-CHj

3. Farmaceutisk præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at forbindelsen har formlen Cl .0—CH0 NH„ + i i 2 4 Cl-Te I \ » Cl ^0- ch2

4. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet 'ved, at forbindelsen har den almene 5 formel X\ /°-f2 / \ I -ch2

5. Farmaceutisk præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at X betegner Cl.

6. Farmaceutisk præparat ifølge krav l, kendetegnet ved, at forbindelsen har formlen Te02, 10 PhTeCl3 eller H-C-C) 0-CH_ 21 \ / I 2 Te 1 / \ I h2c-0 0—ch2

7. Kemisk forbindelse til brug som terapeutikum kendetegnet ved, at den har formlen A, B, C, ’D, E, eller F, som defineret i krav i. DK 168864 B1 43

8. Anvendelse af forbindelsen med formlen A, B, C, D, E, eller F, som defineret i krav 1, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af cancer, immundefekter, autoimmune sygdomme eller infektiøse sygdomme.