DK168301B1 - Anvendelse af nisin eller en nisinproducerende kultur ved fremstilling eller opbevaring af øl til undertrykkelse af ølødelæggende organismer - Google Patents

Description

i DK 168301 B1

Opfindelsen angår anvendelse af ni sin eller en ni si nproducerende kultur ved fremstilling eller opbevaring af øl til undertrykkelse af øl ødelæggende organismer.

5 Ni sin, der er et antimikrobi elt stof, som produceres af visse stammer af streptococcus lactis. er kendt som værende anvendeligt til levnedsmiddel konservering. Det har den egenskab, at det hæmmer væksten af visse gram-positive bakterier, men ikke gram-negative sådanne, gær eller svampe. En klassisk anvendelse har været til forhindring af clostridial ødelæggelse af ostefremstillingsproduk-ter. Ni sin er et polypeptid med 34 aminosyrerester og en molekyl-størrelse på 3510 dalton. Det er blevet beskrevet som både værende et antibiotikum og et bakteriocin. Nisin indeholder 5 indre disul-fidbroer, hvilket gør det meget stabilt over for varme under sure 15 forhold, medens der over pH 7 indtræder irreversibel inaktivering ved stuetemperatur. Nisin er mest aktivt under sure forhold, hvor det virker som en kationisk, overfladeaktiv detergent og en inhibitor for syntesen af murein, en peptidglycan, der er en vigtig komponent i cellevæggen på gram-positive bakterier; Hurst, A., 20 Advances in Applied Microbiology, 1981, £7, 85 og Reisinger et al, Archives of Microbiology, 1980, 127. 187. Nisin (der markedsføres som Nisaplin® af Aplin and Barrett, Ltd., Trowbridge, Wiltshire) er internationalt accepteret som et 1evnedsmiddelkonserveringsmiddel.

25 Anvendelsen af nisin i ostefremstillingsprodukter har været genstand for tidligere patenter, se GB patent nr. 713.251 og US patent nr. 2.744.827 udstedt i 1954 henholdsvis 1956. Disse patenter angår fremstilling eller konservering af ost af den slags, der har tendens til pustning eller udspil ing på grund af vækst af ødelæggende 50 organismer, der er anaerobe sporedannere, typisk bakterier kendt som Clostridia. De angår også osteprodukter, der hår tendens til ødelæggelse som anført ovenfor. De nisinniveauer, der omtales i disse patentskrifter, ligger i området fra 50 til 375 enheder per gram. En enhed er ækvivalent med en international enhed (I.U.) 55 ni si naktivitet og ækvivalent med 0,025 mikrogram nisin.

Anvendelse af nisin som antibotulinmiddel til forhindring af fremvækst af spirede cl ostri d i um botuli num-sporer i levnedsmiddelprodukter generelt og ostefremstillingsprodukter med høj fugtighed i 2 DK 168301 B1 særdeleshed er genstand for US patent nr. 4.584.199 (1986) og nr. 4.597.972 (1986).

01 er et forholdsvis uvenligt miljø for bakteriel vækst, og ødelæg-5 gel se af øl er følgelig begrænset til nogle få bakteriearter, Hough et al, Halting and Brewing Science. 2. udgave, bind 2, London, Chapmann & Hall, 1983, kap. 21 samt Ingledew, Journal of American Society of Brewing Chemists, 1979, 37, 145. 01-ødelægge!sesproblemer forekommer imidlertid, og måder hvorved øllets biologiske stabilitet 10 kan forbedres er af interesse for bryggeriindustrien. Visse ølsorters tilsyneladende resistens mod bakteriel ødelæggelse er foreløbig blevet tilskrevet metabolitter, der frembringes af de gærarter, der anvendes ved fermenteringen. Identifikation og rådighed over disse coprodukter eller andre acceptable antibakterielle midler ville 15 tilvejebringe midler til hindring af vækst af ødelæggende bakterier under bryggeprocessen eller i øllet. Anvendelsen af zymociner, der er aktive over for de vildgærtyper, som optræder ved brygning, er blevet rapporteret, Young et al, Proceedings of the European Brewery Convention, Berling (Vest), 1979, 817, og den genetiske konstruktion 20 af bryggestammer, der er i stand til selv at producere et zymosin under fermenteringen, er blevet beskrevet.

Tilsvarende ødelæggelsesproblemer forekommer i andre alkoholiske drikkevarer, som omfatter ikke blot vin og cider, men også 23 destillerede produkter, opstrammere, likør og lignende.

Et til øl egnet antibakterielt middel skal være aktivt over for et omfattende antal bakterier eller i det mindste over for de arter, som hyppigt optræder. Mælkesyrebakterier (Lactobacilli og 30 Pediococci) beskrives af litteraturen som værende hovedårsagen til ødelæggelse af ikke-pasteuriseret øl og at give anledning til den største andel af infektioner under fermenteringen. Antibakterielle stoffer, der er aktive over for mælkesyrebakterier, er derfor af særlig interesse for bryggeriindustrien.

35

Der findes allerede et antal antibiotika, der anvendes som levnedsmiddelkonserveringsmidler (se Chichester et al, Handbook of Food Additives. Red. T.E. Furia, Cleveland, Ohio, C.R.C. Press, 1972, kap. 3), og konservering af emballeret øl med antibiotika er 3 DK 168301 B1 tidligere blevet overvejet (Strandskov et al, Proceedings of the Annual Meeting of the American Society of Brewing Chemists, 1958, 5).

5 Af flere grunde er deres anvendelse imidlertid ikke blevet nogen anerkendt praksis, blandt andet fordi: (i) udviklingen af antibiotikaresistente stammer af patogene bakterier ville kunne blive fremmet, 10 (ii) allergiske reaktioner hos forbrugeren ville kunne opstå, (iii) fordøjelsessystemets mikrobielle økologi ville kunne blive forstyrret, og (iv) antibiotikummet ville måske være toksisk i de konsumerede mængder.

15

Fra CS patentskrift nr. 172045 (jvf. FTSA abstract heraf) er det kendt at stabilisere vine ved tilsætning af fra 3 vægt% (dvs. 30.000 /ig/ml) til 5 vægt% (dvs. 50.000 /ig/ml) nisin til udpresset druesaft og efterfølgende vinfremstilling heraf på sædvanlig måde. Den 20 tilsatte nisin virker som en inhibitor på mælkesyre- og eddikesyrebakterier, således at nedbrydning af vinsyre undgås. Herved kan tilsætningen af sædvanlige stabilisatorer nedsættes til 60-70% af det normale.

25 Anvendelsen af så store mængder af nisin som 3-5 vægt% til stabil i -sering/konservering af øl ville imidlertid ganske givet bibringe øllet ikke-ønskede smagsændringer.

Det har imidlertid nu vist sig, at ølødelæggende mikroorganismer 30 (navnlig mælkesyrebakterier) er følsomme over for langt mindre koncentrationer af nisin end de ovenfor angivne til stabilisering af vin, idet der kun kræves koncentrationer på 0,25-2,5 ug nisin/ml, hvorfor nisin vil kunne anvendes til stabil isering/konservering af øl uden at give øllet nogen uheldig smagsændring.

35

Den foreliggende opfindelse angår derfor anvendelse af nisin eller en nisinproducerende kultur ved fremstilling eller opbevaring af øl til undertrykkelse af ølødelæggende organismer, idet nisinet eller den nisinproducerende kultur tilsættes inden pasteuriseringen eller 4 DK 168301 B1 anvendes i en opløsning til vask af påsætningsgær for at gøre gæren genanvendelig til brygning eller i en opløsning til anvendelse som skyllevæske til produktionsudstyr og -anlæg.

5 Nisin har ingen medicinsk værdi i sig selv, og resistens over for nisin er derfor ikke forbundet med nogen anden medicinsk betydningsfuld antibiotikaresistens; nisin, der er et polypeptid, ødelægges i mavetarmkanalen og er ikke toksisk.

10 Anvendelsen af nisin til forhindring af øl-ødelæggelse kan anskues på flere forskellige måder. Det er blevet konstateret, at nisin har en ubetydelig virkning på øllets karakteristika, f.eks. aroma, smag, udseende og fysiske stabilitet, og det kan således finde anvendelse til forøgelse af opbevaringsholdbarheden af upasteuriseret, fad-15 eller flaskekonditioneret øl. Da det er varmestabilt ved øllets pH, er der mulighed for at sætte det til øllet inden pasteurisering, hvorved der gives mulighed for at reducere behandlingstid og -temperatur. Nisin synes ikke at påvirke bryggerigærsvækst, hvilket indebærer, at det vil kunne tilsættes forgæringen uden at ændre 20 gæringsforløbet. Det vil kunne anvendes som et additiv til urten og derved nedsætte den risiko for ødelæggelse, der opstår som følge af mælkesyrebakterier. Når nisin tilsættes på et hvilket som helst af disse trin, overlever det fermenteringen og føres videre til det færdige øl. Alternativt vil nisin kunne anvendes som et afbødende 25 middel, som kun anvendes, når det er påkrævet til behandling af de forgæringer eller øl, som viser sig at indeholde mælkesyrebakterier.

En nisinopløsning vil kunne anvendes som en renseskylning af produktionsudstyr og -anlæg eller til vask af påsætningsgær for at 30 gøre gæret egnet til genanvendelse i brygningsprocessen. Kontamine-ret påsætningsgær erstattes for tiden enten med friskt propageret gær, eller det syrevaskes til fjernelse af bakterier, hvilken syrevask imidlertid undertiden nedsætter gærets levedygtighed betydeligt eller ændrer gærets evne til at fermentere og flokkulere 35 under den fermentation, der følger efter behandlingen.

Opfindelsen angår anvendelsen af nisin ved bl.a. brygning af øl i bryggerier. Mælkesyrebakterier, der er kendt som kontaminanter ved fermenteringsprocessen i forbindelse med maltwhiskyproduktion, har 5 DK 168301 B1 imidlertid også vist sig at være følsomme over for nisin. Nisin kan derfor formentlig også benyttes til eliminering eller udøvelse af en vis grad af kontrol over disse bakterier.

5 Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere, bl.a. under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et fotografi af en agarpiadekultur med tydelige zoner med vækst i nhi bering af Lactobacillus sp. BSO 375 i 10 MRS agar omkring brønde med indhold af nisin i koncentra tioner på 10 og 100 enheder/ml i forhold til en kontrol-brønd uden indhold af nisin; fig. 2a. viser grafer over drabshastigheden på en ølødelæggende 15 Lactobacillus (105 cfu/ml) i MRS-næringsvæske forårsaget af nisin i koncentrationer på 100 enheder/ml (o) og 10 enheder/ml () i sammenligning med en nisinfri dyrkningskontrol (·); 2° fig. 2b. viser grafer over drabshastigheden på en ølødelæggende

Lactobacillus (10* cfu/ml) i MRS-næringsvæske forårsaget af nisin i koncentrationer på 100 enheder/ml (o), 10 enheder/ml () og 1 enhed/ml (□) i sammenligning med en nisinfri dyrkningskontrol (·); 25 fig. 2c. viser grafer over drabshastigheden på en ølødelæggende

Lactobacillus (103 cfu/ml) i MRS-næringsvæske forårsaget af nisin i koncentrationer på 10 enheder/ml () og 1 enhed/ml (□) i sammenligning med en nisinfri 30 dyrkningskontrol (·); fig. 2d. viser grafer over hæmningsgraden på Lactobacillus sp. BSO 343 (10* cfu/ml) i MRS-næringsvæske forårsaget af nisin i koncentrationer på 100 enheder/ml (o) og 10 enheder/ml () 3® i sammenligning med en nisinfri dyrkningskontrol (·).

Lactobacillus sp. BSO 343 blev klassificeret som nisinre-sistent ved en agar-diffusionsprøve;

fig. 3 viser grafer over virkningen på væksten af bryggegær NCYC

6 DK 168301 B1 240 i bryggeurt i fravær af nisin (Δ), henholdsvis i nærværelse af forskellige ni s i npræparater (A), (□) og () fortyndet til 100 iu/ml; 5 fig. 4 viser grafer over virkningen af forskelllige koncentrationer af papain på nisin-stabilitetet i pasteuriseret og upasteuriseret øl.

Note: "cfu/ml" betyder kolonidannede enheder pr. milliliter og er et udtryk for antallet af levende celler pr. milliliter.

Stammer og vækstbetingelser

Otte stammer, der ved anvendelse af system API 50CH identificeredes som Lactobacilli, blev frisk isoleret fra et Britisk bryggeri. Tre stammer af Streptococcus og seks af de otte stammer af Leuconostoc blev erhvervet som typestammer fra The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), the National Collection of Type Culture (NCTC) eller the National Collection of Dairy Organisms (NCDO), der 20 alle er beliggende i Storbritanien. Fem Lactobacillistammer, som var isolerede fra maltwhiskyfermentationer blev leveret af Penti ands Scotch Whisky Research Ltd, Edinburgh, GB. Alle andre stammer blev indhentet hos the Brewing Research Foundations samling af øl-ødelæggende organismer (BSO: Beer Spoilage Organism), (Redhill, Surrey, 25 GB), hvilke organismer alle oprindeligt er blevet isoleret fra øl og bryggerier rundt omkring i verden. Stammerne var klassificeret ifølge Bergey ved indføringen i BSO-samlingen og opbevaret i frysetørrede ampuller. Bryggerigær blev erhvervet fra the National

Collection of Yeast Cultures (NCYC, Colney Lane, Norwich, GB).

30

Arbejdskulturer blev enten dyrket i næringsvæskekiilturer (10 ml) eller alternativt på et medium, der var størknet med 2,0% (vægt/ volumen) agar, og blev opbevaret ved 0-4°C. Til gram-positive bakteriestammer (Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Micrococ-55 cus og Streptococcus) blev der benyttet MRS-medium (Oxoid)(beskrevet mere detaljeret af de Hann, Rogosa and Sharp (1960) Appl. Bact. 23, pp. 130-135), medens gram-negative stammer blev opretholdt i enten MacConkey-næringsmedium (Oxoid; Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella og Hafnia) eller i WL-næringsmedium (Oxoid; Acetobacter, 7 DK 168301 B1

Zymomonas, Flavobacter og Kluyvera). Bryggeri gær blev vedligeholdt i YM-næringsvæske (Difco). Alle medier blev fremstillet ifølge fabrikanternes vejledninger.

5 Undersøgelse af nisinfølsomhed

Stammer blev opformeret som væskekulturer (10 ml) i MacCart-ney-flasker forsynet med skruelåg ved 25°C i 2 dage. Kulturer af stammer, der kræver aerobe forhold, blev omrystet kontinuerligt på 10 et reciprokerende rysteapparat (100 cykluser-min"1); andre blev opbevaret i fast position. En portion (200 μΐ) af hver væskekultur blev blandet med 20 ml af det krævede medium, der indeholdt agar, og som blev holdt smeltet ved 48-50°C, og blev derpå udhældt i Petriskåle. For at fremme diffusionen af nisin ind i agaren (Trammer et 15 al, Journal of the Science of Food and Agriculture, 1964, 8, 522) med MacConkey-, WL- og YM-mediet blev der per 100 ml tilsat 1 ml 50:50 blanding af Tween 20 og sterilt vand ved 48-50°C inden ud-hældning. For MRS-mediet var dette ikke nødvendigt, eftersom det indeholder 0,1% Tween 80. Prøver (100 μΐ) af sterilt vand indehol-20 dende 0, 10 eller 100 enheder nisin (Aplin and Barret Ltd.; 30.000 enheder mg"1) blev tilført brønde, som havde en diameter på 1 cm og var udskåret i agaren. Plader blev inkuberet ved 25°C i 2-3 dage, efter hvilket tidspunkt nisinfølsomheden kunne observeres som en zone med vækstinhi bering omgivende de brønde, der indeholdt nisin.

25

Fig. 1 viser de inhiberingszoner, der frembringes af 0, 10 og 100 enheder nisin, når det afprøves ved en "brøndafprøvningsmetode", hvorved nisinopløsningen sættes til brønde, der er udskåret i MRS-agar, som forinden er podet med Lactobacillus, sp. BS0 375 30 (LC6), der er en følsom øl-ødelæggende bakteriestamme, hvorefter der foretages måling af de inhiberingszoner, som fremkommer efter inkubering af agarprøverne.

Tabel 1 angiver følsomheden for brygnings/destillations-kontami-33 nanter og øl ødelæggende bakterier over for nisin. Blandt disse arter er de første fem gram-positive, og de øvrige er gram-negative.

Ialt blev 154 bakteriestammer, i det væsentlige øl-ødelæggende organismer, som anses for at være repræsentative og tilhørende 8 DK 168301 B1 tretten slægter, undersøgt for deres følsomhed over for nisin; 122 af disse var gram-positive, medens 32 var gram-negative stammer. Resultaterne viser de opnåede forskellige grader af sensitivitet over for nisin. Af de afprøvede gram-positive stammer, overvejende 5 Lactobacilli og Pediococci. var 113 stammer (dvs. 93¾) nisinfølsomme. Nogle var kun svagt følsomme, men størsteparten (65%) var følsomme eller meget følsomme, idet der fremkom en inhiberingszone ·* 0,5 cm i diameter rundt om de brønde, der indeholdt 100 enheder nisin. Ingen af de fra desti11ationsanlæg isolerede organismer var 1° resistente over for nisin.

Af de gram-negative stammer var kun de tre, der tilhører slægten F1avobacter. nisinføl somme. Af de øvrige 29 stammer, der tilhører syv slægter, var der ingen der udviste væksthæmningszoner. Ved 15 undersøgelse af disse stammer blev en gram-positiv stamme, der er kendt for at være nisinfølsom, medtaget i hvert enkelt tilfælde som en kontrol. Selvom denne stamme (BSO 375) kun voksede dårligt på de benyttede medier (MacConkey- og WL-næringsmedier), var væksten tilstrækkelig til at demonstrere zoner med inhibering til bekræf-20 telse af, at nisinen virkelig diffunderede ind i agaren. Disse resultater bekræfter, at nisin er en bredspektret inhibitor over for gram-positive stammer, men ikke over for gram-negative stammer. Hæmningen af F1avobacter-stammer var overraskende.

25 Tolv stammer af bryggerigær, 8 overgær og 4 pilsnergær, blev undersøgt for nisinfølsomhed. Ingen af disse stammer blev hæmmet af nisin. Denne iagttagelse giver anledning til den konklusion, at nisin vil kunne anvendes i nærværelse af bryggerigærtyper til forhindring eller mindskning af fordærvelse uden at påvirke gær-30 væksten eller fermentationsforløbet ugunstigt.

At nisinet er effektivt i koncentrationer, der er forenelige med brug i praksis i urt og øl, er blevet bekræftet ved forsøg med MRS-næringsvæske, der er podet i forskellig grad med følsomme, øl-33 ødelæggende stammer af Lactobacillus. Hundrede enheder nisin ml * forhindrede fuldstændigt væksten af ca. 10^ celler ml"* ved 20°C under anaerobe forhold. Alle bakterieceller blev dræbt på mindre end 10 timer (fig. 2A).

9 DK 168301 B1 x— <0 +->

C

to ω ε s- +j ε α) rtiooconoMMOoooo i— o E in ro i—i

ce to E

4-» I— « 0 ® +j I— *·— €Λ s- . ω s- CO .¾ . co m r—i o o o o o o o o o o <— -σ o cu o ε \

r-H O CDO

E O C

i—i · CVJ 00 00 lO CM O O O O O O O O S- O O O

co corn

Qi ·<β "O *H C O C -Q

<u ES. CSi— i »“

SgS o in co^h co c

9 _ I § S- -C -- -r- CU

* « ° I . <u ω o c-o c 1 % _ frt (Λ 4-> O C ^ c QL +J · IDCOi—HCSJt—HOOCOOOOOO cu c *5 9 ^ 9 S! o. *-> fg ΊΟ CU T3 T- •r- s- s- cu s- a> σ»

-σ cu a) .c a) .c E

TJ -Μ c Ε c ο -ο cu ω a) α> ω *· Ε *<β Ε S ι Ε Τ3 «ο 0.0 ο V- ι c ·ι- ο ο a3s_ ι ωβ -ΟΗφΗΐη 2 5 ι c s- c *> _ to i ι on -o s- o s-o

·>- Ε ι N (DON O

+J to (0 φΓ-iNOOOCOOHMNCON i W C Ε "O CO "O "O

r ni ±j i—I ι Ol β> ι— Dli— C

< *- ” ; 5 s- i s_a> o a s o æ-r ι a> > NT3 «Ό s. w i X) -r- to c jq c a) *r- ι ·ι— οι οι·*- ·ι- ·«- E c x: E c f J lCO-i-S.CS-*«JS- m ι -,- s Φτ Φ ao £ r ι cu ο)Ό -σ -σ S ffi ICS-XSCOQ) _ ς g I cutd ·!- -0) -cn

a 0) Ε I", i-« csi 00 to o 00 co >—ι co cvj co cm i c -CO "2 S S

g i js - : B“i .^ο=Λ®κω SSt, iEcs-ES- cno

**· 3 ^ ι OStCHOUCH

I to CU CO 0) CO -τι r"“* r— 'r— C 1“ CSS

I -Q r— Ε «Ο S 01 (U æ I tl·- CU - Μ- XIΌ I SES S- T- r— l·· Ε οι o oil·· or o oo oo ι ουτ3 w > οι > cr 3 3 s_ i ftj CU I— ·γ- σ>τ- ·γ- cu r- to CO U O s. s. S- CU · c c c I— a 3 o a cu tu an-> «ο ι to-ccc-EEEce .^(JO+JO+JCO+J +J Ur- I = O CU = Ο- Ο ®t UCJCJtOUOteCJCOOrti— · «OOOOrtCflSlOXlO)

ώ U U C+JX OJ3 OH o-r IB I

+J OOOOQ-OEO>OS-C0t- i D UT S U a)4J O > >|S OH C I · *

M UO O 3 S 0) E « 3+>4J Oil· I CO ·· CO

r— co CU M- CU +J U >51— p— T Cl— <β · ‘ _ co jq.s:-I(/)<nll^uuj^z i 3 co >· DK 168301 B1 10 3 -1 Når podekulturen var på 10 celler ml , blev væksten tilsvarende forhindret af 10 enheder nisin ml"1 (fig. 2C). Selv én enhed nisin ml"1 havde en væsentlig virkning med hensyn til nedsættelse af væksthastigheden, når podekulturen var på 10 celler ml (fig. 2B).

5 I MRS-næringsvæske forhindrede 100 enheder ml"1 endvidere fuldstæn-4 -1 digt væksten af 10 celler ml af en stamme af lactobacillus, som var klassificeret som ni si nresi stent ved anvendelse af brøndafprøvningsmetoden (fig. 2D).

10

Det er kendt, at stabiliteten og aktiviteten af nisin øges med stigende aciditet (Hurst, A., 1981, Adv. Appl. Microbiol., 2Z, side 85-123).

15 Både urt (-pH 5) og øl (-pH 4) er mere sure medier end MRS-næringsvæske (pH 6,2). Da både urt og øl er mere surt, skulle nisin i koncentrationer på 100 enheder ml"1 forhindre væksten af i det mindste 10® mælkesyrebakterieceller ml"1. Sådanne antal af bakterier repræsenterer en massiv infektion og ligger rigeligt over det, som 2° let frembringer påviselige fordærvelseskarakteristika i øl; det er rapporteret, at 20.000 Pediococci ml’1 er tilstrækkelig til at ødelægge øl.

Nisintilsætnino til fermentationer 25

Tre forskellige nisinpræparater (1000 i.u. mg"1, 2500 i.u. mg"1 og 44000 i.u. mg"1) blev tilsat i den mængde, der kræves til at frembringe en endelig koncentration på ca. 100 i.u. ml’1 i pilotbryg-ningsurtforgæringer (/27 liter) med overgær, NCYC 240. Disse tilsæt-30 ninger havde lille virkning på bryggegærens fermentationsformåenhed, som vist i fig. 3. Under anvendelse af høje fermenteringsrør (1,5 liter) blev der opnået tilsvarende resultater for fire andre brygge-gærstammer: NCY 1062, 1123, 1236 og 1245.

35 Nisin, der tilsættes under fermenteringstrinet, forefindes i det færdige øl uden målelig tab af aktivitet. Nisinet adsorberes derfor ikke og nedbrydes ej heller af bryggegær, men overlever både filtrering og pasteurisering. Ingen af nisinpræparaterne synes at bibringe ølsmagen nogen oplagt ufordelagtige karakteristika.

11 DK 168301 B1

NisintiTsætning til emballerede produkter

Risikoen for ødelæggelse af fad- og flaskekonditioneret øl, som ikke pasteuriseres, vil kunne reduceres ved tilsætning af nisin. Eftersom 5 nisin ikke påvirkes ved pasteurisering, foreligger der også den valgmulighed at sætte det til øllet inden pasteurisering og derved eventuelt tillade udførelse af en mindre streng pasteuriseringsbehandling.

10 Papain, der er et ikke-specifikt proteolytisk enzym, tilsættes mange øl sorter til stabilisering af dem mod dannelse af uklarhed. Det kløver peptidbindinger, som forbinder et antal forskellige aminosyrer, når disse aminosyrer har L-konfiguration. Der kræves mindst 6 aminosyrer til udfyldning af enzymets "aktive område". På grund af 15 nisinets femringsstruktur kan papainet følgelig kun angribe de seks aminosyrer i molekylets C-terminale ende. α-Chymotrypsin inaktiverer nisin ved kløvning af et tripeptid fra C-terminal enden af bakterio-sinet. Det var derfor muligt, at papain ville inaktivere nisin i øl sorter. Det har imidlertid vist sig, at papain kun reducerer 20 nisinaktivitetsniveauerne, når enzymet er til stede i koncentrationer på ca. 100 gange dem, der anvendes i praksis, se fig. 4. Nisin er mere stabilt over for høje temperaturer end papain. Nisin-aktiviteten blev følgelig ikke reduceret af papain, når de blev tilsat sammen og derpå pasteuriseret. Tværtimod blev der ved høje 25 papainkoncentrationer observeret en forøgelse af ni sinaktiviteten.

Anvendelse af nisin i vin, cider oa destillerede drikkevarer

Nisin synes at egne sig til bekæmpelse af infektioner i destilla-20 tionsvirksomheder, hvor mælkesyrebakterier kan være et større kontamineringsproblem. Det antages, at ved whiskyfremstillingen opstår nogle af de endelige smagskarakteristika fra forekomsten af mælkesyrebakterier under fermenteringen. Nisin vil derfor kunne anvendes til at begrænse bakteriel vækst snarere end fuldstændigt 25 eliminere bakterier fra gærfermenteringen. Det skulle f.eks. være muligt at anvise en situation, i hvilken en ønsket Lactobacillus-stamme er mere resistent over for nisin end uønskede kontamimanter.

En tilsvarende fremgangsmåde vil kunne anvendes til regulering eller 5 12 DK 168301 B1 forhindring af omdannelse af maleat til lactat (malolactatfermen-tering) under fremstillingen af vin eller cider.

10 15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Anvendelse af nisin eller en nisinproducerende kultur ved fremstilling eller opbevaring af øl til undertrykkelse af 5 øl ødelæggende organismer, idet nisinet eller den nisinproducerende kultur tilsættes inden pasteuriseringen eller anvendes i en opløsning til vask af påsætningsgær for at gøre gæren genanvendelig til brygning eller i en opløsning til anvendelse SOm skyllevæske til produktionsudstyr og -anlæg. 10

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mængden af det til øllet satte nisin er på fra g 25 til 2,5 pg pr. ml.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, kencjetegnet ved, at der også sættes papain til øllet. 20 25 30 35