DK167775B1 - Plasmid psg5, fremgangsmaade til isolering heraf, dets anvendelse til konstruktion af plasmidvektorer, hybridplasmider indeholdende psg5 eller dettes intakte replikationsregion samt streptomyces ghanaensis dsm 2932 - Google Patents
Plasmid psg5, fremgangsmaade til isolering heraf, dets anvendelse til konstruktion af plasmidvektorer, hybridplasmider indeholdende psg5 eller dettes intakte replikationsregion samt streptomyces ghanaensis dsm 2932 Download PDFInfo
- Publication number
- DK167775B1 DK167775B1 DK145185A DK145185A DK167775B1 DK 167775 B1 DK167775 B1 DK 167775B1 DK 145185 A DK145185 A DK 145185A DK 145185 A DK145185 A DK 145185A DK 167775 B1 DK167775 B1 DK 167775B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plasmid
- psg5
- dna
- construction
- replication region
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
DK 167775 B1
Den foreliggende opfindelse angår det hidtil ukendte plasmid pSG5, som kan isoleres ud fra Streptomyces ghanaensis DSM 2932, en fremgangsmåde til isolering af pSG5, anvendelse af pSG5 eller fragmenter heraf, der indeholder den intakte 5 replikat ionsregion, til konstruktion af plasmidvektorer, hybridplasmider, der indeholder pSG5 eller dettes intakte replikat ionsregion samt mikroorganismestammen Streptomyces ghanaensis DSM 2932.
Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 66.701 kendes 10 streptomyces-plasmidet pSG2, som er blevet isoleret fra S. ghanaensis-stammen ATCC 14672. Dette plasmid er som endogent plasmid egnet til konstruktion af plasmidvektorer, som skal indsættes i S. ghanaensis.
Det har nu vist sig, at der i S. ghanaensis-stammen 15 DSM 2932 forekommer et plasmid, der er blevet betegnet pSG5. Dette plasmid er kendetegnet ved restriktions snittene eller -overskæringerne i tabel I og ved restriktionskortet i fig.
1. Der indeholdes pr. celle 10-20 plasmider. Plasmidet har en molekyllængde på ca 12,7 kilobasepar (kb) og er således 20 noget mindre end pSG2. Hybridiseringsdata viser, at der ikke består noget slægtskab mellem pSG2 og pSG5.
Foruden den noget mindre størrelse udmærker pSG5 sig i forhold til pSG2 ved mindst fire singulære overskæringssteder for restriktionsenzymerne EcoRI, EcoRV, Xhol og Bell.
25 Der findes derfor flere muligheder for at anvende dette plasmid til genteknologiske formål, f.eks. til konstruktion af plasmidvektorer.
Det har desuden vist sig, at pSG5 frembyder et udvidet værtsområde i forhold til pSG2. Plasmidvektorer, der er 30 fremstillet ud fra pSG5, kan f.eks. transformeres til S. lividans og S. geysirensis.
Det er en yderligere fordel, at pSG5-repliconet er forligeligt med andre streptomyces-repliconer, f.eks. med plasmiderne pSG2 fra S. ghanaensis, pSVHl (EP offentlig-35 gørelsesskrift nr. 70.522), fra S. venezuelae DSM 40755, SLP1,2 [US patentskrift nr. 4.360.597); C.J. Thompson, J.M.
UlV I0///0 B I
2
Ward og D.A. Hopwood, Nature 286. 525 (1980), C.J. Thompson, T. Kieser, J.M. Ward og D.A. Hopwood, Gene 20, 51 (1982)], fra S. lividans, og pIJlOl [T. Kieser, D.A. Hopwood, H.M. Wright og C.J. Thomson, Mol. Gen. Genet. 185, 223 (1982) 5 fra S. lividans. pSG5 kan derfor desuden indføres i stammer, som allerede bærer et af disse plasmider.
Dette har betydning, når enkelte gener skal klones i forskellige plasmider, og disse skal indføres i én og samme celle. At der findes forligelige vektorplasmider med forskello ligt kopiantal, tillader desuden kombination af enkelte gener i forskelligt antal i en streptomyces-stamme. Både for undersøgelsen af biosynteseveje og for udbytteoptimering er det, at der findes plasmidvektorer med forskellig forligelighed, af afgørende betydning.
15 Plasmidet pSG5 med molekyllængde på ca. 12,7 kb, der ikke overskæres af restriktionsenzymerne Bgll, Hpal, Hindlll og Clal, overskæres én gang af restriktionsenzymerne EcoRV, EcoRI, Xhol og Bell, overskæres to gange af restriktionsenzymerne Sphl og Bglll, har et restriktionskort som vist i 20 fig. 1 på tegningen og kan fås ud fra en kultur af Strep-tomyces ghanaensis DSM 2932, frembyder på grund af dets fire singulære overskæringssteder, dets udvidede værtsområde og dets ikke-forudsigelige kompatibilitet mangeartede fordele, jf. ovenfor og det følgende.
25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til isolering af plasmidet pSG5 er ejendommelig ved, at en kultur af Strep-tomyces ghanaensis DSM 2932 lyseres, og plasmidet udvindes ud fra lysatet.
Ifølge opfindelsen kan plasmidet pSG5 eller fragmenter 30 heraf, der indeholder den intakte replikationsregion, anvendes til konstruktion af plasmidvektorer, navnlig vektorer for streptomyceter og pendulvektorer mellem streptomyces-stammer og andre mikroorganismer.
Opfindelsen angår også hybridplasmider, der indeholder 35 plasmidet pSG5 eller dettes intakte replikationsregion, samt mikroorganisme-stammen Streptomyces ghanaensis DSM 2932, jf. det følgende.
O
3 DK 167775 B1
Ved hjælp af transposon-mutagenese og kloninger har det vist sig, at replikationsregionen ligger - på det største BamHI-fragment (4,45 kb), dvs. i området fra l· til 3 kb svarende til fig. 1. Derfor er denne 5 "essentielle region" tilstrækkelig til konstruktion af vektorer, som replicerer i streptomyceter.
Til konstruktion af et "minimalreplicon" kan der f.eks. være tale om det nævnte 4,45 kb lange BamHI--fragment. Lukker man dette fragment til en cirkel, 10 fås et plasmid, som udmærker sig ved individuelle snitsteder for Bell, Shpl, BamHI, EcoRI og Xhol. For de fire. sidstnævnte snitsteder har det vist sig, at de er til rådighed for kloning. Desuden ligger der på dette fragment yderligere snitsteder for PvuII (ved 12,6, 3,2 15 og 3,6 kb ifølge fig. 1), som ligger uden for den "essentielle region" og derfor er til rådighed for kloning eller yderligere forkortning(er). Der er endvidere fundet snitsteder for Sstll (ved 0,6, 1,8 og 3,65 kb i fig. 1), hvoraf formodentlig det midterste ligger i 20 den "essentielle region". Desuden findes der mindst 5 snitsteder for Sall.
Hvis det 4,45 kb lange BamHI-fragment ligate-res med det 1,1 kb lange BclI-fragment fra plasmidet pIJ6 (Thompson m.fl., Nature, ovenfor), der har thio- 25 strepton-resistensgenet (tsr) , fås hybridplasmidet pGMl, som replicerer i streptomyceter og på grund af sin thio-strepton-resistens let kan udvælges. Især står de individuelle snitsteder for EcoRI og Xhol til rådighed for indføring af fremmedgener. På fig. 2 vises restriktions-30 kortet for pGMl (hvor der i repliconet kun er kortlagt tre Sall-snitsteder).
Hvis piamidet pGMl f.eks. åbnes med Xhol og ligateres med det 2,55 kb lange Xhol-fragment fra Tn5 [Jorgensen m.fl., Mol. gen. Genet. 27, 131 (1984)3, der 35 bærer det i streptomyceter og i E.coli virksomme neomv-cin-res is tensgen aphll, fås hybridplasmidet pGM2 (fig.
3, hvor der i repliconet kun er kortlagt tre Sall-snit-
UK I0///0 D I
0 4 steder). Dette plasmid har også to markører, der er effektive i streptomyceter, og er med sin molekylstørrelse se på 8,1 kb og individuelle snitsteder for EcoRI,
Hindlll, Bglll, Clal og EcoRV en god kloningsvektor.
5 Bglll-snitstedet ligger i aphll-genet, og Clal og EcoRV
skærer inden for tsr-genet. Kloningen med disse enzymer kan også let verificeres ved indsætningsinaktivering.
Plasmidet pSG5 og dele heraf, som indeholder den"essentielle region", er også egnet til kon-1Q struktion af såkaldte pendulvektorer. Hvis man f.eks. fusionerer plasmidet pSG5 med E.coli-plasmiderne pACYC184 eller pBR325, kan hybridplasmidet formeres både i E.coli- og i Streptomyces-arter, især i S. gey-sirensis og S. lividans.
I5 Hvis plasmidet pACYC184 [Chang m.fl., J. Bac- teriol. 134, 1141 (1978)] åbnes med Bell,og det linea-riserede plasmid ligateres med det 1,1 kb lange BclI-fragment fra plasmidet pIJ6, fås hybridplasmidet pSLE41.
Hvis f.eks. plasmiderne pSG5 og pSLE41 via de-2o res EcoRI-snitsteder fusioneres, fås hybridplasmidet pSW344E (fig. 5), som stabilt kan repliceres både i E. coli på grund af pACYC18 4~ repliconet og i Streptomyceter på grund af pSG5-repliconet. Udvælgelsen i E.coli sker via tetracyclin-resistensen i pACYC184-andelen, me-25 dens thiostreptoftresistensen kan tjene til udvælgelse i streptomyceter. Plasmidet pSW344E udgør derfor en i-deel pendulvektor mellem E.coli og Streptomyces-stam-mer. Til kloning af fremmed-DNA findes bl.a. restriktionsstederne Xhol, Hindlll og Bglll. Pendulvektorens 30 fordel består i, at et klonet Stretomyces-gen kan ændres genteknologisk i E.coli,og dens funktion kan afprøves efter tilbageførsel i Streptomyces-cellen.
Hvis pSLE41 åbnes med BamHI og ligateres med det 4,45 kb-lange BamHI-fragment af pSG5, resulterer 35 dette i hybridplasmidet pGMIOl (fig. 6, hvor der i re-pliconet kun er kortlagt 3 Sall-snitsteder). Dette plasmid råder over individuelle snitsteder for Hindlll 5 DK 167775 B1
O
og Xhol i ikke-essentielle regioner. Til udvælgelse findes markørerne chloramphenicol-resistens (i E.coli) og thiostrepton-resistens (i Streptomyces). Molekylstørrelsen er 9,9 kb.
5 Hvis man fra pGMIOl eliminerer det 1 kb lange
Hindlll-Xhol-fragment og i stedet for indsætter det 1,6 kb lange Hindlll-Xhol-fragment fra Tn5, som bærer aphll-resistensgenet for neomycin, opstår hybridplasmi-det pGM102 (fig. 7, hvor der i repliconet kun er kort-10 lagt 3 Sall-snitsteder). Dette replicerer i E.coli og S. lividans. Til udvælgelse i E.coli står chloramphenicol- og neomycinresistens, i S, lividans thiostrepton-og neomycinrisistens til rådighed. Til kloning kan tjene i E.coli de individuelle snitsteder for EcoRI (inakti-15 vering af chloramphenicol-resistens) og Bglll (inaktivering af neomycin-resistens), i streptomyceter dem for EcoRV (inaktivering af thiostrepton-resistens) og lige« • ledes Bglll, foruden de individuelle snitsteder for"
Hindlll og Xhol.
20
Pendulvektorer af denne art er genstand for samtidig indleveret dansk patentansøgning nr. 1449/85.
De egner sig til fremstilling af antibiotika, enzymer eller biologisk aktive polypeptider, således som det er 25 beskrevet for streptomyces-plasmider i US.' patentskrifterne nr. 4.273.875, 4.332.900, 4.338.400, 4.340.674, 4.343.906, 4.362.816, 4.362.817, 4.393.137. 4.401.761 og 4.416.994.
Isoleringen af plasmidet pSG5 fra stammen S.
ghanaensis DSM 2932 kan ske på i og for sig kendt måde, 30 således som det f.eks. er beskrevet i EP offentliggørelsesskrifterne nr. 66.701 og 70.522. Dyrkningen af stammen kan ske ifølge førstnævnte EP offentliggørelsesskrift eller US patentskrift nr. 3.674.866, eksempel 2.
35 DK 16777b bl 6
Streptomyces ghanaensis DSM 2932 er i henhold til Budapesttraktaten deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen d. 26. marts 1984 for et tidsrum af 30 år, og prøver af organismen er tilgængelige for offentligheden.
5 Streptomyces ghanaensis DSM 2932 er en morfologisk mutant af S. ghanaensis nov. sp. 4092 (også betegnet S. ghanaensis ATCC 14672), der er beskrevet i DE offentliggørelsesskrift 1.113.791, og er fremstillet ved behandling af sidstnævnte stamme med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-10 din. Streptomyces ghanaensis DSM 2932 adskiller sig fra Streptomyces ghanaensis ATCC 14672 ved at farven af luftmyceliet og af sporerne er gullig på Emerson-agar.
Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler, hvori procentangivelser er beregnet 15 på vægt, medmindre andet er anført.
Eksempel 1
Stammedyrkning
Til dyrkning til en efterfølgende lyse egner 20 følgende medier sig:
Lysemedium A_ Lysemedium B_Lysemedium C_
Glucose 10 g Gærekstrakt 3 g "CASO"-bouillon
Pepton 4 g Pepton 5 g (Merck nr. 5459) 25 Gærekstrakt 4 g Maltekstrakt 3 g 30 g KH2PO4 2 g Glucose 10 g Glycin 10 g Κ2ΗΡ0^ 4 g Saccharose 340 g H20 1 1
MgSO^ 0,5 g Glycin 5 g
Glycin 10 g MgCl2.6H20 1 g 30 h2o 1 1 h2o 1 1 1 en 500 ml Erlenmeyerkolbe podes ca. 100 ml næringsmedium med en homogeniseret enkeltkoloni af den 35 omhandlede stamme og inkuberes 2-3 dage ved 30°C i en rundryster (120 omdr./min.).
Eksempel 2 DK 167775 B1
O
7
Plasmidisolering
Ca. 50 ml af en 3 dage gammel homogeniseret væskekultur høstes i "JA-20"-bægre i en Beckman-kølecen-5 trifuge "J21C" (10 minutter, 10000 omdr./min., 25°C) og vaskes en gang i TESu (10 mmolær Tris-HCl, 1 mmolær EDTA (pH 8), 10% saccharose). 2 g celler resuspenderes i 5 ml lysozymopløsning (0,3 molær saccharose, 25 mmolær Tris-HCl (pH 8) , 25 mmolær EDTA (pH8) , 4 mg/ml lysozym) 10 og inkuberes ved 37°C i en rundryster (100 omdr./min.) ved 37°C. Efter 30-45 min. er cellerne protoplasteret.
Ved tilsætning af 2,5 ml lyseblanding (0,3 mmolær NaOH, 2% natriumdodecylsulfat) og omgående kraftig blanding sker opløsningen af cellemembranen og en denaturering 15 af DNA'et. En varmebehandling ved 70°C i 10 minutter fuldender lysen og denatureringen. Ved stuetemperatur tilsættes 800^ul sur phenol/chloroformopløsning: (50.0 ml chloroform, 200 ml ^O, 500 g phenol, 0,5 g hydroxychinolin blandes, og den nederste fase anvendes) for at denature-20 re proteinerne og renaturere DNA'et. Blandingen blandes i ca. 20 sekunder i en ryster ("Vortex'® og pelle-teres derpå i kølecentrifugen (15 minutter, 12.000 omdr./ min., 4°C).
7 ml af den plasmidholdige ovenstående væske 25 renses yderligere i ultracentrifuge.· 7 g CsCl, 7 ml lysat og 0,2 ml ethidiumbromidopløsning (30 mg/ml) blandes og centrifugeres i en ultracentrifuge ("Kontron TGA50'®) i 48 timer ved 34.000 omdr./min. og 20°C. Plas-midbåndet gøres synligt efter UV-bestråling over fluore-30 scens og udtages med sprøjte. Opløsningen affarves og dialyseres og er derpå til rådighed for yderligere undersøgelse. Den indeholder ca. l^ug plasmid-DNA/20 yul opløsning.
35 8 0
Eksempel 3 υκ Tb///o di
Plasmidkarakterisering pSG5-DNA'et måles efter fremstillingen i elek-5 tronmikroskop. Fremstillingen sker ifølge de kendte metoder [J. Ferguson/ R.W. Davis i "Advanced Techniques in Biological Electron Microsopy II", Springer-Verlag, Berlin, 123 (1978)]. Længdemålingen viser et plasmid på 4,2^um.
10 For at bestemme antallet af res friktions s teder ne for forskellige enzymer behandles pSG5-DNA med forskellige restriktionsendonucleaser under tilsvarende inkubationsbetingelser i en time (se tabel II).
Reaktionen sker i et samlet volumen på 20^ul 15 med følgende sammensætning: 2^,ul 10-dobbelt koncentreret inkubationspuffer x^,ul DNA-oplØsning (indeholder ca. 0,5^,ug DNA) l^,ul restriktionsenzym (indeholder 1 enhed) 17-x^,ul H2O.
20 Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 5^,ul brom-
phenolblåtopløsning. Fragmenterne fraskilles ved agaro-segelelektrophorese (1% agarose i trisacetatpuffer (0,04 mol trisacetat, 0,002 mol EDTA). Ved en varighed på 4 timer er spændingen 4 volt /cm gellængde. Ved sammen-25 ligning med en længdestandard (Isoleret DNA fra phagen X
spaltes med EcoRI og Hindlll, hvilket giver DNA-fragmenter med kendt længde /Phillipsen & Davis, Focus 1, 5 (1979)7) kan fragmentlængden udregnes.
Ud fra restriktionsanalyser fås foruden antal-30 let af snits tederne fragment længderne samt plasmidets samlede længde. Ved hjælp af egnede flerdobbeltfordøjeiser kan restriktionskortet til sidst fremstilles.
35
O
9 DK 167775 B1
Eksempel 4
Konstruktion af hybridplasmider a) Konstruktion af pSLE41. pACYC184-DNA kan udvindes ud fra plasmidbærende celler ved hjælp af kendte 5 metoder [Maniatis m.fl., Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor 1982]. Vildtype-E.coli-celler har en Dam-methyla-se, der modificerer DNA'et således, at den nødvendige restriktion med Bell ikke er mulig. Til isolering af DNA anvendes i dette tilfælde altså en Dam -mutant af E.coli.
10
Plasmidet pIJ6 kan isoleres ud fra Streptomyces lividans TC14 ved kendt streptomyces-teknik (jfr. ovenfor).
Til kloning lineariseres plasmidet pACYC184 med restriktionsenzymet Bell.
1 ,ug DNA inkuberes i spaltningspuffer i nærvær 15 / af 1 enhed Bell (producent: BRL, Neu-Isenburg) en time ved 50°C. Reaktionen afbrydes ved phenolisering, og DNA'et renses ved ethanolfældning. En efterfølgende behandling med alkalisk phosphatase (ud fra kalvetarme, producent: Boehringer Mannheim) fjerner 5’-phosphatender- 20 ne i DNA'et og forhindrer religatering af pACYC184. Til udvinding af DNA-fragmentet, som bærer thiostreptonresi-stensen, snittes pIJ6-DNA med Bell (fremgangsmåde jfr. ovenfor).
De to DNA-prØver (i spaltningspuffer) blandes (0,lyug pACYC184, l^ug pIJ6) og opvarmes til 70°C for at åbne H-broer. Ved tilsætning af mercaptoethanol (slutkon-centration 10 mmolær) og ATP (0,1 mmolær) justeres reaktionsbetingelserne. DNA'et inkuberes i nærvær af 1 enh.
T4-DNA-ligase (Boehringer Mannheim) ved 4°C i 12 timer.
30 E.coli transformeres med DNA-blandingen (Maniatis in.fl.)/ og cellerne udvælges efter tetracyclin- og chloramphenicolresistens.
Enkeltkolonier underkastes hurtiglyse med hen-35 blik på størrelsesbestemmelse. I agarosegel søges et plasmid med en størrelse på 5,4 kb (pACYCl84 4,3 kb +
Thior 1,1 kb). Ud fra celler, som bærer et plasmid med
LMV I Ό / / /3 D I
0 10 den krævede længde, isoleres DNA (jfr. ovenfor), og det afklares, om det rigtige DNA-fragment er indsat. Fragmentets restriktionssnit er kendt (Kieser m.fl.), så at den heldige kloning kan verificeres.
Herved fås plasmidet pSLE41 (fig. 4).
5 b) Fremstilling af plasmidet pSW344E. Plasmidet pSLE41 kan udvindes ud fra E.coli ved hjælp af kendte metoder (Maniatis m.fl.). Plasmidet pSG5 isoleres ud fra S.ghanaensis 2932 som ovenfor beskrevet.
10 Til kloning lineariseres begge plasmider parallelt med EcoRI. l^ug DNA inkuberes i spaltningspuffer i nærvær af 1 enh. EcoRI (producent: Boehringer Mannheim) en time ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved phenolisering, og DNA1et renses ved ethanolfældning. pSLE41-DNA behand-15 les formålstjenligt yderligere med alkalisk phosphatase for at hindre religatering. DNA-prøverne (i spaltningspuffer) blandes derpå (0,2^,ug pSLE41, l^ug pSG5) , opvarmes til 70°C og indstilles ved tilsætning af mercaptoehan-ol (slutkoncentration 10 mmolær) og ATP (0,1 mmolær) på 20 ligase-reaktionsbetingelserne. I nærvær af 1 enh. T4- -DNA-ligase (Boehringer Mannheim) inkuberes blandingen i 12 timer ved 4°C. Derpå transformeres blandingen til E.coli (Maniatis m.fl.) og selektioneres efter kolonier med tetracyclinresistens og chloramphenicolsensibilitet.
25 Kolonier med tilsvarende resistensmønster under kastes hurtiglyse med henblik på størrelsesbestemmelse.
Ud fra celler, som indeholder et plasmid med den krævede længde (18,1 kb), isoleres DNA,og det klarlægges ved restriktionsanalyse, om DNA'et giver det tilsvarende re-30 striktionsmønster, som må kræves ved ligatering af pSLE41 og pSG5.
Herved fås plasmidet pSW 344E (fig. 5).
På lignende måde kan hybridplasmiderne pGMl, pGM2, pGMIOl og pGMl02 fremstilles.
35 DK 167775 Bl 11 o
Eksempel 5
Konstruktion af et minimalreplicon ud fra pSG5
Plasmidet pSG5 isoleres ud fra S.ghanaensis DSM 2932 som ovenfor beskrevet. Plasmidet pSLE41 kan ifølge 5 kendte metoder udvindes ud fra E.coli (Maniatis m.fl.).
I pSLE41 klones fragmenter af pSG5, nemlig Sphl-, BamHI- og Bglll-fragmenterne i Sphl-, BamHI- og Bglll-snitstederne i pSLE41. Til kloning lineariseres begge plasmider parallelt med de ovennævnte enzymer (pro-10 ducent og inkubationsbetingelse/ jfr. tabel II). Reaktionen afbrydes ved phenolisering, og DNA'et renses ved ethanolfældning (Maniatis m.fl.).
pSLE41-DNA behandles formålstjenligt yderligere med alkalisk phosphatase for at hindre religateringen 15 (Maniatis m.fl.) DNA-Prøverne (i spaltningspufferen) blandes derpå (0,2^ug pSLE41, l^ug pSG5), opvarmes til 70°C og indstilles ved hjælp af tilsætning af mercaptoethanol (slutkoncentration 10 mmolær) og ATP (0,1 mmolær) på li- 20 gase-reaktionsbetingelserne. I nærvær af 1 enh. T.4-DNA--ligase (Boehringer Mannheim) inkuberes blandingen i 12 timer ved 4°C. Derpå transformeres blandingen til E.coli (Maniatis m.fl.) og selektioneres efter kolonier med chloramphenicol-resistens og tetracyclinsensibi-25 litet. Kolonier med tilsvarende resistensmønster underkastes hurtiglyse med henblik på størrelsesbestemmelse (T. Ekchardt, Plasmid 1, 584 (1978)]. Ud fra celler, som indeholder et plasmid med den krævede længde, isoleres DNA, og det klarlægges ved restriktionsanalyse, om 30 de forventede fusionsplasmider er opstået.
Disse plasmider transformeres ved de gængse metoder til S.lividans TK 23 [K.F. Chater, D.A. Hop- wood, T. Kieser og D.J. Thompson, Gene Cloning in Strep- tomyces, Current Topics in Microbiol, and Immunol. 96, 69-95 (1982)] og selektioneres efter thiostreptonresi-stens. Ud fra thiostreptonresistente S.lividans-kolo- 35
Ulv ΙΟ/ 1 ΙΌ D I
12 Ο nier isoleres plasmid-DNA ved standardmetoder [T. Kie-ser, Factors Affecting the Isolation of ccc DNA from Streptomyces lividans and E. coli, Plasmid 12, 19 (1984)],
Og dets sammensætning afprøves.
5 Alle plasmider, som fås ud fra thiostreptonre sistente kolonier, bærer pSG5-plasmidets gener, som er nødvendige til replikation. Således kan ud fra det samlede resultat et formålstjenligt "minimalreplicon" identificeres (her det 4,45 kb lange BamHI-fragment), som ved 10 hjælp af andre kloningseksperimenter og ved sammenlignende overlappende kloning kan gøres endnu mindre.
Tabel I
Antal snitsteder i pSG5-plasmidet til udvalgte restrik- 15 tionsenzymer_
Kpnl 0 Clal 0 Bell 1 Sall > 5
Bgll 0 EcoRV 1 Sphl 2 SstI > 5
Hpal 0 EcoRI 1 Bglll 2 Smal > 6
Hindi 11 0 Xhol 1 PstI 3 BamHI ^7 20 - 25 1 35
O
Tabel II
DK 167775 B1 13
Restriktionsbetingelser Inkubations- 5 Enzym_temp., °C_Producent Inkubationspuffer
BamHI 37 Boe
Bgll 37 Boe
Bglll 37 BRL
Bell 60 Boe 10 EcoRI 37 Boe
EcoRV 37 Boe
Clal 37 BRL Proau'
Hindlll 37 Boe centens “νΐ8-
Hpar 37 Boe ninger
15 Kpnl 37 BEL
PstI 37 Boe
Sall 37 BRL
Smal 37 Boe
Sphl 37 Boe
20 SstI 37 BRL
Xhol 37 BRL
Boe = Boehringer Mannheim, Mannheim BRL = BRL, Neu-Isenburg 25 1 35
Claims (7)
1. Plasmid pSG5 med en molekyllængde på ca. 12,7 kb, der ikke overskæres af restriktionsenzymerne Bgll, Hpal, Hindlll og Clal, overskæres én gang af restriktionsenzymerne
2. Fremgangsmåde til isolering af plasmidet pSG5, 10 kendetegnet ved, at en kultur af Streptomyces ghanaensis DSM 2932 lyseres, og plasmidet udvindes ud fra lysatet.
3. Anvendelse af plasmidet pSG5 eller af fragmenter heraf, der indeholder den intakte replikationsregion, til 15 konstruktion af plasmidvektorer.
4. Anvendelse ifølge krav 3 af plasmidet pSG5 eller fragmenter heraf, der indeholder den intakte replikationsregion, til konstruktion af plasmidvektorer for strepto-myceter.
5. Anvendelse ifølge krav 3 af plasmidet pSG5 eller fragmenter heraf, der indeholder den intakte replikationsregion, til konstruktion af pendulvektorer mellem Strep-tomyces-stammer og andre mikroorganismer.
5 EcoRV, EcoRI, Xhol og Bell, overskæres to gange af restriktionsenzymerne Sphl og Bglll, har et restriktionskort som vist i fig. 1 på tegningen og kan fås ud fra en kultur af Streptomyces ghanaensis DSM 2932.
6. Hybridplasmider, der indeholder plasmidet pSG5 25 eller dettes intakte replikationsregion.
7. Streptomyces ghanaensis DSM 2932.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3412093 | 1984-03-31 | ||
| DE19843412092 DE3412092A1 (de) | 1984-03-31 | 1984-03-31 | Das streptomyceten-plasmid psg5, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| DE19843412093 DE3412093A1 (de) | 1984-03-31 | 1984-03-31 | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
| DE3412092 | 1984-03-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK145185D0 DK145185D0 (da) | 1985-03-29 |
| DK145185A DK145185A (da) | 1985-10-01 |
| DK167775B1 true DK167775B1 (da) | 1993-12-13 |
Family
ID=25819922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK145185A DK167775B1 (da) | 1984-03-31 | 1985-03-29 | Plasmid psg5, fremgangsmaade til isolering heraf, dets anvendelse til konstruktion af plasmidvektorer, hybridplasmider indeholdende psg5 eller dettes intakte replikationsregion samt streptomyces ghanaensis dsm 2932 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4880746A (da) |
| EP (1) | EP0158872B1 (da) |
| JP (1) | JP2526203B2 (da) |
| AU (1) | AU582149B2 (da) |
| CA (1) | CA1246475A (da) |
| DE (1) | DE3567676D1 (da) |
| DK (1) | DK167775B1 (da) |
| ES (1) | ES541716A0 (da) |
| GR (1) | GR850797B (da) |
| PT (1) | PT80188B (da) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3614903A1 (de) * | 1986-05-02 | 1987-11-05 | Hoechst Ag | Gentamycin-resistenzgene und ihre verwendung als marker |
| DE3809692A1 (de) * | 1988-03-23 | 1989-10-12 | Hoechst Ag | Verwendung von psg5 als temperatursensitives plasmid |
| GB2338236B (en) * | 1998-06-13 | 2003-04-09 | Aea Technology Plc | Microbiological cell processing |
| JP4258874B2 (ja) * | 1999-02-10 | 2009-04-30 | チッソ株式会社 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
| JP5582541B2 (ja) * | 2011-11-08 | 2014-09-03 | 三井造船株式会社 | 活性汚泥処理法、活性汚泥処理剤、活性汚泥処理装置および活性汚泥処理システム |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| DE3117131A1 (de) * | 1981-04-30 | 1982-11-25 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "plasmid psg 2 und verfahren zu seiner gewinnung" |
| US4513086A (en) * | 1981-10-15 | 1985-04-23 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US4416994A (en) * | 1981-10-19 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| DE3412093A1 (de) * | 1984-03-31 | 1985-10-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
-
1985
- 1985-03-23 DE DE8585103461T patent/DE3567676D1/de not_active Expired
- 1985-03-23 EP EP85103461A patent/EP0158872B1/de not_active Expired
- 1985-03-29 CA CA000477966A patent/CA1246475A/en not_active Expired
- 1985-03-29 JP JP60064033A patent/JP2526203B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-29 GR GR850797A patent/GR850797B/el unknown
- 1985-03-29 DK DK145185A patent/DK167775B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-29 AU AU40599/85A patent/AU582149B2/en not_active Ceased
- 1985-03-29 ES ES541716A patent/ES541716A0/es active Granted
- 1985-03-29 PT PT80188A patent/PT80188B/pt not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-10-14 US US07/110,105 patent/US4880746A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK145185A (da) | 1985-10-01 |
| DK145185D0 (da) | 1985-03-29 |
| AU4059985A (en) | 1985-10-03 |
| ES8603572A1 (es) | 1985-12-16 |
| ES541716A0 (es) | 1985-12-16 |
| JPS60256384A (ja) | 1985-12-18 |
| EP0158872B1 (de) | 1989-01-18 |
| US4880746A (en) | 1989-11-14 |
| EP0158872A1 (de) | 1985-10-23 |
| CA1246475A (en) | 1988-12-13 |
| DE3567676D1 (en) | 1989-02-23 |
| PT80188B (pt) | 1987-09-18 |
| AU582149B2 (en) | 1989-03-16 |
| GR850797B (da) | 1985-11-25 |
| PT80188A (de) | 1985-04-01 |
| JP2526203B2 (ja) | 1996-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bibb et al. | Excision of chromosomal DNA sequences from Streptomyces coelicolor forms a novel family of plasmids detectable in Streptomyces lividans | |
| JPH0239889A (ja) | ストレプトマイセスおよびその他の生物で使用するためのマクロライド生合成遺伝子 | |
| WO1992014819A1 (en) | A positive selection vector for the bacteriophage p1 cloning system | |
| EP0118367B1 (en) | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes | |
| DK167775B1 (da) | Plasmid psg5, fremgangsmaade til isolering heraf, dets anvendelse til konstruktion af plasmidvektorer, hybridplasmider indeholdende psg5 eller dettes intakte replikationsregion samt streptomyces ghanaensis dsm 2932 | |
| US4703009A (en) | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes | |
| Gust | Cloning and analysis of natural product pathways | |
| US4992371A (en) | Hybrid plasmids having a streptomycetes replicon and an escherichia coli replicon | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| EP0281356A1 (en) | DNA segment conferring high frequency transduction of recombinant DNA vectors | |
| US5665564A (en) | Isolation and characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics | |
| US20040096974A1 (en) | Methods and materials for generating genetic disruptions in bacterial cells | |
| Rodicio et al. | Cloning and expression of the Sal I restriction-modification genes of Streptomyces albus G | |
| US6048694A (en) | Bacterial positive selection vector | |
| AU615524B2 (en) | The use of psg5 as a temperature-sensitive plasmid | |
| Margolin et al. | Isolation and characterization of a DNA replication origin from the 1,700-kilobase-pair symbiotic megaplasmid pSym-b of Rhizobium meliloti | |
| US4918015A (en) | Gentamicin-resistance genes and their use as markers | |
| AU610411B2 (en) | Isolation and characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics | |
| EP0620280A1 (en) | Cosmid vectors for streptomycetes genomic DNA cloning | |
| JP3946300B2 (ja) | ビフィズス菌用シャトルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子 | |
| US4889809A (en) | Tylosin resistance-conferring gene, designated tlrC, for use in streptomyces fradiae | |
| US4876202A (en) | Chimeric plasmids | |
| EP0115936A1 (en) | Chimeric plasmids | |
| Birch | Plasmid replication and recombination in Streptomyces | |
| JPH0249592A (ja) | メチル特異性制限系によるｄｎａ分子の微生物中への組込み方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |