DK167149B1

DK167149B1 - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 14-amino-3-monosaccharidsubstituerede steroidderivater

Info

Publication number: DK167149B1
Application number: DK379383A
Authority: DK
Inventors: Francois-Xavier Jarreau; Jean-Jacques Koenig
Original assignee: Nativelle Sa Ets
Priority date: 1982-08-20
Filing date: 1983-08-19
Publication date: 1993-09-06
Also published as: DK379383A; AU575783B2; EP0101659A3; PT77214A; NZ205293A; IE56018B1; DE3362189D1; DK379383D0; CA1216282A; EP0101659A2; PT77214B; GR78668B; IE831941L; AU1813783A; EP0101659B1

Description

DK 167149 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 14-amino-3-monosaccha-ridsubstituerede steroid-derivater med den i krav 1' s indledning angivne formel (1).

5 I fransk offentliggørelsesskrift nr. 2 464 270 omtales forbindelser af typen 14-aminosteroider, især hydroxyl-gruppeholdige derivater af 14-aminoandrostan og af 14-amino-21-norpregnan. Man kender ligeledes steroidiske al-10 kaloider af pregnan-serien og af androstan-serien, der er substitueret i 14-stillingen med en aminogruppe, således er f.eks. 145-amino-35,20a-pregnandiol omtalt af A. Astier et al., Bull, Soc. Chim. nr. 9-10, side 1581-1582 (1976); andre 145-amino-pregnaner og 145-amino-androstan-15 er er ligeledes omtalt af A. Astier et al., Tetrahedron Letters, bind 34, side 1481-1486, (1978). Man har dog ikke omtalt nogen som helst farmakologisk egenskab og heller ikke nogen terapeutisk anvendelse af disse derivater.

20 I øvrigt kendes aminogruppeholdige derivater af steroider, der er nyttige inden for terapien, og f.eks. angives 1 fransk offentliggørelsesskrifter nr. 2 494 697 og 2 494 698 3-amino-(5α)-17a,20-pregnandioler, 3-amino- (5a)-19-nor-20-pregnanol samt aminogruppeholdige deriva- 25 ter deraf som værende i besiddelse af immunoterapeutiske egenskaber, som gør det muligt at anvende dem som lægemidler ved behandlingen af autoimmune sygdomstilstande, som skyldes mangel på visse lymphocyter.

30 Det har nu overraskende vist sig, at ukendte aminogruppeholdige steroid-derivater, især derivater af serien 20-pregnanol og af 21-nor-20-pregnanol, der er substitueret i 14-stillingen med en aminogruppe samt i 3-stillingen med en monosaccharidrest, og som eventuelt indeholder en 35 supplerende hydroxygruppe i 12-stillingen, er i besiddelse af positive inotrope egenskaber, såvel som supraven-trikulære antiarythmiske egenskaber.

2 DK 167149 B1

Den foreliggende opfindelse angår derfor en analogifremgangsmåde til fremstilling af 14-aminosteroid-derivater, der er substitueret i 3-stillingen med et monosaccharid-derivat, ud fra et 3,20-dihydroxy-14-aminosteroid-derivat 5 eller ud fra et 3,12,20-trihydroxy-14-aminosteroid-deri-vat.

De omhandlede 14-aminosteroid-deri vater, der er substitueret i 3-stillingen med ovennævnte grupper, finder anven-10 delse inden for den humane og den veterinære terapi som cardiotoniske lægemidler ved behandling af hjerteinsufficiens, ligesom de omhandlede forbindelser indgår i farmaceutiske præparater indeholdende som aktiv bestanddel mindst ét af disse hidtil ukendte 14-aminosteroid-deriva-15 ter eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf sammen med et eller flere passende strækkemidler.

De hidtil ukendte 14-aminosteroid-derivater fremstillet ifølge opfindelsen har følgende almene formel (I): 20 it2 ' - CHROH ' ·

25 Γ T

nh2

Rl° h 30 hvori R betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, R1 betegner en monosaccharidrest eller en desoxy-monosaccharidrest, som eventuelt er substitueret med en amino- eller methoxygruppe, og R2 betegner et hydrogenatom, en hydroxygruppe eller en OR.^-gruppe, 35 hvor R1 har den ovenfor anførte betydning.

DK 167149 B1 3

De omhandlede 14-aminosteroid-derivater med den almene formel (I) indeholder adskillige asymmetriske carbonatom-er i molekylet, især carbonatomerne i følgende stillinger 3, 5, 14, 17 og 20, såvel som carbonatomet i 12-stillin-5 gen, når R2 ikke betegner et hydrogenatom, og forbindelserne kan således eksistere i forskellige stereoisomere former. De omhandlede forbindelser med den almene formel (I) kan således foreligge som separerede isomere former eller i sammenblanding.

10

De omhandlede forbindelser kan ligeledes foreligge som salte af 14-aminosteroid-derivater med den almene formel (I), nemlig som salte opnået ved indvirkning af en organisk eller uorganisk syre under anvendelse af almindelig 15 kendt teknik. Den anvendte syre kan være valgt blandt saltsyre, oxalsyre, vinsyre, fumarsyre, mælkesyre, phos-phorsyre, p-toluensulfonsyre, myresyre, hydrogenbromid, maleinsyre, sulfaminsyre etc.

20 1 ovenfor anførte almene formel (I) betegner R fortrins vis et hydrogenatom eller methylgruppe.

er en monosaccharidrest eller en desoxy-monosaccharid-rest, især en pentoserest eller en hexoserest, der even- 25 tuelt er substitueret, som f.eks. 2-desoxy-hexose eller 6-desoxy-hexose, 2,6-didesoxy-hexose, 2-desoxy-2-amino-hexose, 3-desoxy-3-amino-hexose, 3-desoxy-3-methoxy-hexo-se, 2,3,6-tridesoxy-hexose, 4,6-didesoxy-4-methoxy-hexose eller 2,3,6-tridesoxy-2,3-didehydro-hexose.

30

Man kan som eksempler på monosaccharider, der er anvendelige inden for opfindelsens område nævne sådanne, der i det efterfølgende er omtalt under beskrivelsen af de aktiverede sukkerarter.

Som allerede tidligere nævnt kan de omhandlede 14-aminosteroid-derivater eksistere i forskellige stereoisomere 35 4 DK 167149 B1 former som et resultat af tilstedeværelsen af flere asymmetriske carbonatomer i steroid-skelettet. Opfindelsen angår især fremstillingen af derivater med den almene formel (I), hvori 0R1-substituenten i 3-stillingen, hy-5 drogenatomet i 5-stillingen, I^-gruppen i 12-stillingen,

Nl^-gruppen i 14-stillingen samt CHROH-substituenten i 17-stillingen har konfigurationen 5. Denne konfiguration er imidlertid ikke begrænsende, og f.eks. kan hydrogenatomet i 5-stillingen befinde sig i a-konfigurationen.

10 OH-gruppen i 20-stillingen kan have den ene eller den an den af konfigurationerne # og ¢, når R betegner en alkyl-gruppe.

Opfindelsen angår især fremstillingen af 14-aminosteroid-15 derivater bestående af 3-0-(α-L-rhamnopyranosyl)-145-ami- no-21-nor-55-35,20-pregnandiol, 3-0-(a-L-rhamnopyrano- syl)-145-amino-55-35,20-pregnandiol og dennes 205-isome-re, 3-0-(5-D-digitoxosyl)-145-amino-55-35,20a-pregnandi-ol, 3-0-(4-amino-2,3,6-tridesoxy-a-L-lyxohexopyranosyl)-20 145-amino-55-35-20e-pregnandiol, 3-0-(«-L-rhamnopyrano syl )~145-amino-21-nor-55-35, 125, 20-pregnantriol, 3-0-(«-L-rhamnopyranosyl)-145-amino-55-35,125,205-pregnantriol og dennes 20«-isomere, 3-0-(5-D-digitoxosyl)-145-amino-5b-35,125,205-pregnantriol og dennes 20a-isomere samt 25 3,12-di-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-145-amino-55-35,125,205- pregnantriol .

Analogifremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

30

De aktiverede monosaccharider eller desoxy-monosacchari-der kan f.eks. være tri-O-acetyldigitoxose, tri-0-acetyl-α-L-rhamnosylbromid, acetyl-3-0-benzoyl-2,4,6-tridesoxy-4-trifluoracetamido-a,5-L-lyxohexopyranosid, 2,3-di-0-35 acetyl-4,6-didesoxy-4-trifluoracetamido-glycopyranosyl- bromid, tetra-O-acetyl-a-D-glucosylbromid etc.

DK 167149 B1 5

Beskyttelsen af N^-gruppen i 14-stillingen og af 0H-gruppen i 20-stillingen gennemføres ved kendt teknik, f.eks. kan -N^-gruppen omdannes til en trifluoracetami-dogruppe -NHCOCFg ved indvirkning af trifluoreddikesyre-5 anhydrid i nærvær af triethylamin, eller til en formamid-gruppe ved indvirkning af eddikesyreanhydrid i myresyre. OH-gruppen kan acetyleres ved indvirkning af eddikesyreanhydrid i myresyre. OH-gruppen kan acetyleres ved indvirkning af eddikesyreanhydrid i et passende opløsnings-10 middel, såsom pyridin.

De funktionelle grupper i monosaccharid-derivaterne beskyttes, før man gennemfører koblingsreaktionen med 14-aminosteroid-derivatet. Hydroxylgrupperne i monosaccha-15 rid-derivaterne kan beskyttes ved sædvanlige metoder, især ved acylering eller ved benzylering. F.eks. kan hydroxylgrupperne i en digitoxose eller en rhamnose omdannes til acetoxygrupper ved acetylering ved hjælp af eddikesyreanhydrid. Man kan især henvise til den metode, 20 der er beskrevet af E. Fisher et al., i Chem. Ber. nr.

53, -side 2362 (1920) angående en beskyttelsesteknik over for sukkerarter. De aminogrupper, der eventuelt er tilstede i monosaccharidderivatet, beskyttes ligeledes forinden ved hjælp af en acylgruppe, fortrinsvis ved hjælp 25 af en trifluoracetylgruppe.

Efter koblingen mellem monosaccharidderivatet og 14-ami-nosteroid-derivatet fjernes beskyttelsesgrupperne derpå under anvendelse af sædvanlig teknik, f.eks. gennem op-30 varmning i et basisk medium.

Koblingsreaktionen kan gennemføres, idet man ved det ano-mere carbonatom omsætter monosacchariderivatet, der forinden er blevet beskyttet, og 14-aminosteroid-derivatet 35 med hydroxylgruppen i 3-stillingen, hvor man har indført beskyttelsesgrupper på stederne for substituenterne i 14-stillingen og i 20-stillingen, idet omsætningen foregår i 6 DK 167149 B1 et passende organisk opløsningsmiddel. Man anvender i almindelighed et ækvivalent monosaccharidderivat i forhold til steroidet; men man kan også anvende monosaccharid-derivatet i overskud, man kan f.eks. anvende mellem 1,5 5 og 2,5 mol monosaccharidderivat pr. mol 14-aminosteroid-derivat.

Reaktionsbetingelserne kan vælges analogt med sædvanlige fremgangsmåder, og man kan f.eks. anvende den koblingsme-10 tode, der er omtalt af D.M. von Niekerk et al., i Expe-rientia nr. 28 side 123 (1972), eller den metode, der er beskrevet af W. Meyer et al., i Chem. Ber. nr. 104 side 1 (1971), især når det drejer sig om en aminogruppeholdig sukkerart. Når man anvender monosaccharidderivatet 2,6-15 didesoxy-hexose eller 4-amino-2,4,6-tridesoxy-hexose, kan man med fordel gennemføre koblingen ved hjælp af den metode, der er beskrevet af J. Boivin, C. Monneret og M.

Pais i Tetrahedron Letters side 1111 (1980).

20 Koblingsreaktionen kan gennemføres ved klassisk teknik i et opløsningsmiddel, såsom benzen eller toluen, acetoni-tril, methylenchlorid eller dioxan, hver for sig eller i blanding, ved omgivelsernes temperatur, idet det dog kan være nyttigt at opvarme reaktionsblandingen for at frem-25 skynde omsætningen, alt afhængig af de anvendte reaktionskomponenter .

Koblingsreaktionen gennemføres med hydroxylgruppen i 3-stillingen i 14-aminosteroid-derivatet, der er beskyttet 30 i 14-stillingen og i 20-stillingen, men som ikke er beskyttet i 12-stillingen, idet reaktionsdygtigheden for hydroxylgruppen i 3-stillingen er betydelig større end reaktionsdygtigheden for den hydroxylgruppe, der eventuelt er tilstede i 12-stillingen. Man kan let adskille 35 forbindelserne med formlen I med monosaccharidderivatet i 3-stillingen og i 3- og 12-stillingen, der er dannet som et sekundært reaktionsprodukt under koblingsreaktionen.

DK 167149 B1 7

For på dominerende måde at danne forbindelserne med formlen I med monosaccharidderivatet i 3-stillingen og i 12-stillingen kan man bringe monosaccharidderivatet til omsætning i overskud.

5

De 14-aminbsteroid-derivater med den almene formel (II), der anvendes som udgangsmaterialer, og hvori betegner et hydrogenatom, kan fremstilles som anvist i fransk patentansøgning nr. 82.14038 jvf. dansk ans. nr. 3644/83 10 ved reduktion og påfølgende acetylering af et tilsvarende 3,14-dihydroxysteroid-derivat, der i 17-stillingen bærer en acylgruppe -C0R, idet R betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe, til dannelse af et 3,14,20-trihydroxy-steroid-derivat, der er 0-acetyleret i 3-stillingen og i 15 20-stillingen, som man behandler med et bortrifluorid/hy-drogenazidkompleks forud for gennemførelsen af en reduktion med et metalhydrid eller ved katalyseret hydrogenering. Tilsvarende kan 14-aminosteroid-derivaterne med den almene formel (II), hvori R^ betegner en hydroxylgruppe, 20 fremstilles ved den samme fremgangsmåde ud fra et tilsvarende 3,12,20-trihydroxysteroid-derivat, således som det er angivet i fransk patentansøgning nr. 83.10031, jvf. ligeledes dansk ans. nr. 3644/83.

25 Man kan f.eks. opnå 140-amino-50-30,20«-pregnandiol, der er gengivet med formlen (II), hvori R betegner en methyl-gruppe, og R^ er et hydrogenatom, ud fra 20-oxo-50-30,14å-pregnandiol, på hvilket man gennemfører en reduktion med kaliumborhydrid og derpå en acetylering med ed-30 dikesyreanhydrid i pyridin til dannelse af 3,20-di-0-ace-tyl-5/>-3/5,14/5,20/5-pregnantriol, som man behandler med hy-drogenazid i nærvær af bortrifluoridetherat til påfølgende gennemførelse af en reduktion med et blandingshydrid af lithium og af aluminium. Man kan ligeledes anvende den 35 metode, der er beskrevet af Astier et al., i Tetrahedron nr. 34 side 1481-1486 (1978).

8 DK 167149 B1

Som tidligere anført besidder 14-aminosteroid-derivaterne med den almene formel (I) interessante farmakologiske egenskaber, især positive inotrope egenskaber samt supra-ventrikulære antiarythmiske egenskaber, der omtales mere 5 detaljeret i det følgende, hvorfor de finder anvendelse ved human og veterinær terapi til behandling af hjerteinsufficiens .

De efterfølgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen.

EKSEMPEL 1 3-0-( 0-D-digitoxosyl)-140-amino-21-nor-50-30,20-pregnan-15 diol

Man sætter under omrøring 1 ml eddikesyreanhydrid til en opløsning af 3,2 g 140-amino-21-nor-50-30,20-pregnandiol i 40 ml pyridin, som er afkølet til 0 °C.

20

Efter 30 minutters omrøring ved 0 °C sættes til reaktionsblandingen en opløsning af isafkølet natriumhydro-gencarbonat, man lader henstå under omrøring i yderligere 10 minutter, hvorpå man ekstraherer med methylenchlorid 25 og inddamper til tørhed.

Ved omkrystallisation af inddampningsresten (3,62 g) fra blandingen benzen/hexan opnår man 3,0 g (udbytte 835) 20-0-acetyl-14 0-amino-21-nor-50-30,20-pregnandiol.

30

Til en opløsning af 3,66 g af det ovenfor opnåede derivat i 100 ml vandfrit methylenchlorid, der er kølet til 0 °C, tilsætter man under anvendelse af magnetomrører 3,4 ml triethylamin og 3,1 ml trifluoreddikesyreanhydrid. Der 35 omrøres yderligere 20 minutter, idet man lader temperatu ren stige til omgivelsernes temperatur, hvorpå man inddamper til tørhed. Inddampningsresten opløses påny i me- DK 167149 B1 9 thylenchlorid, og den derved opnåede opløsning vaskes med en mættet opløsning af natriumhydrogencarbonat, derpå med vand, hvorpå der tørres på sædvanlig måde og inddampes til tørhed. Det opnåede reaktionsprodukt opløses i 600 ml 5 methanol, hvorpå det passeres langsomt i løbet af 5 timer gennem en søjle med 300 ml harpiks "IR 45" (OH-fasen). Søjlen vaskes med 300 ml methanol. De indsamlede opløsninger inddampes til tørhed, hvilket fører til 4,52 g 20-0-acetyl-14 5 -trifluoracetamid-21-nor-55-35,20-pregnandi-10 ol, der er i ren tilstand ifølge tyndtlagskromatografi, og som ikke udkrystalliserer.

Man sætter til en opløsning af 0,33 g af det ovenfor fremstillede derivat og 0,40 g tri-O-acetyl-digitoxose i 15 30 ml benzen 0,35 g tørt p-toluensulfonsyre. Efter 1 times omrøring ved omgivelsernes temperatur sættes reaktionsblandingen til en mættet opløsning af natriumhydro-gencarbonat, og der ekstraheres med methylenchlorid. Ind-dampningsresten (0,6 g) kromatograferes over siliciumoxid 20 af typen Merck® H60 (elueringsmiddel hexan/AcOEt 75/25).

Man opnår 0,4 g af en blanding af 3-0-(3,4-di-0-acetyl og 5-D-digitoxosyl)-20-0-acetyl-145-trifluoracetamid-21-nor-55-35,20-pregnandiol.

25 Man sætter til en opløsning af denne blanding i 16 ml methanol under omrøring 4 ml 5 N natriumhydroxid, og der opvarmes til tilbagesvaling i 2 timer og 30 minutter. Efter dette tidsforløb fortyndes med vand, og der ekstraheres med methylenchlorid. Det således opnåede produkt 30 (0,27 g) kromatograferes over siliciumoxid Merck® H60 (elueringsmiddel CJ^CD^/MeOH/NH^OH 93/9/0,4). På denne måde opnås 0,15 g af 5-D-derivatet, som udkrystalliserer fra blandingen methanol/ether, såvel som 0,11 g af den a-D-anomere, som udkrystalliserer fra den samme blanding af 3 5 opløsningsmidler.

10 DK 167149 B1

Smeltepunkt = 198-199 °C (Ø-D-anomer)

Smeltepunkt = 226 °C (a-D-anomer).

/«D/ = -31 °C (c=l, CHC13) 5 NMR spektrum (CDCl^) δ = 0,93 (CH3-19) 0,98 (CH3-18) 1,30 (CHg-6') 4,87 (H-l') ppm (Ø-D-anomere) δ = 0,95 (CH3-19) 1,00 (CH3-18) 1,31 (CHg-6') 4,99 (H-l1) 10 ppm (α-D-anomer).

EKSEMPEL 2 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-21-nor-50-30,20-preg-15 nandiol

Man sætter 4,96 g mercuricyanid til en opløsning indeholdende 4,6 g 2 0-acetyl-145-trifluoracetamid-21-nor-50-30,20-pregnandiol, der er opnået som vist i eksempel 1, 20 og 6,95 g 2,3,4-tri-O-acetyl-a-L-rhamnosylbromid i 235 ml acetonitril. Efter ca. 1 times omrøring ved omgivelsernes temperatur fortyndes med methylenchlorid, og man ekstra-herer under vask med en mættet opløsning af natriumhydro-gencarbonat. Det således opnåede råprodukt (7,82 g) kro-25 matograferes over siliciumoxid Merck© H60 (elueringsmid-del CH2Cl2/Me0H 0,3%).

Man opnår 5,36 g 30-0-(2,3,4-tri-0-acetyl-e-L-rhamnopyra-nosyl)-20-0-acetyl-140-trifluoracetamid-21-nor-50-30,20-30 pregnandiol i ren tilstand, som ikke udkrystalliserer.

Man sætter til 4,6 g af det ovenfor fremstillede derivat i opløsning i 130 ml methanol 32 ml 5 N natriumhydroxid, og der opvarmes til tilbagesvaling i 4 timer. Derpå for-35 tyndes med methylenchlorid, og man vasker med vand, og derpå med en opløsning af natriumchlorid i halvmættet tilstand (idet man opretholder en tilstrækkelig høj kon- DK 167149 B1 11 centration af methanol). Man opnår 3 g af det rene produkt, som bestemt ved tyndtlagskromatografi, og som udkrystalliserer fra en blanding af methanol og ether.

5 Smeltepunkt = 244 °C

/aD/ = -53 0 (o=l, CHCl3/MeOH 80/20) NMR spektrum (CDCl^) 6 = 0,90 (CH3-19) 0,95 (CH3-18) 1,20 (CH3-6') 4,82 (H-l') 10 ppm EKSEMPEL 3 3-0-(4-amino-4,6-didesoxy-fl-D-glucopyranosyl)-14g-amino-15 21-nor-5/)-3fl,20-pregnandiol

Man sætter 0,35 g mercuricyanid og 0,24 g mercuribromid til en opløsning i benzen indeholdende 0,6 g 20-0-acetyl-14/5-trifluoracetamid-21-nor-50-3/),20-pregnandiol, der er 20 opnået som anvist i eksempel 1. Man opvarmer til tilbagesvaling og tilsætter 0,27 g 2,3-diacetyl-4,6-didesoxy-4-trifluoracetamid-glucopyranosylbromid i opløsning i 6 ml benzen. Efter 1 times kogning under tilbagesvaling tilsættes yderligere den samme mængde brom-sukkerforbindelse 25 (0,27 g i 6 ml benzen) og efter yderligere 1 time på ny 0,27 g brom-sukkerforbindelse i 4 ml benzen. Man lader fortsat tilbagesvale 2,5 timer, hvorpå man afkøler, fortynder med methylenchlorid og ekstraherer under vaskning med en mættet opløsning af natriumhydrogencarbonat. Det 30 organiske opløsningsmiddel afdampes, og efterlader en inddampningsrest (1,05 g), som kromatograferes over siliciumoxid Merck® H60 (elueringsmiddel CH2Cl2/Me0H 0,4%).

Man opnår 0,46 g af det rene produkt bestemt ved tyndtlagskromatograf i, som udkrystalliserer fra en blanding af 35 acetone og hexan.

12 DK 167149 B1

Man sætter 3,5 ml 5 N natriumhydroxid til en opløsning af 0,35 g af det ovenfor fremstillede reaktionsprodukt i 14 ml methanol, og der opvarmes under tilbagesvaling i 3 timer. Derpå fortyndes med vand, og man ekstraherer med me-5 thylenchlorid. Man opnår 0,18 g af reaktionsproduktet, som udkrystalliserer fra blandingen ethanol og ether.

Smeltepunkt = 233 °C

10 /<*D/ = -34 0 (c-1, CHClg) EKSEMPEL 4 3-0-(4-amino-2,4,6-tridesoxy-a-L-lyxohexopyranosyl )-140-15 amino-21-nor-50-3fl,20-pregnandiol

Man sætter ved omgivelsernes temperatur 24 ml eddikesyre-anhydrid til en opløsning af 1,8 g 140-amino-21-nor-50-30,20-pregnandiol, der er omtalt i eksempel 6 i fransk 20 patentskrift nr. 2 464 270 i 39,6 ml myresyre. Blandingens temperatur bringes op på 60 “C i løbet af 30 minutter og derpå til 100 °C. Derpå tilsættes 8 ml eddikesyre-anhydrid, og man lader reaktionen foregå i ca. 1 time ved samme temperatur.

25

Efter afkøling og fortynding med vand ekstraherer man med dichlormethan, der vaskes med hydrogencarbonatholdigt vand, der tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed under vakuum. Der er blevet dannet 2,17 g af en blan-30 ding af de to neutrale produkter, hvortil man tilsætter 42 ml 0,25 N ethanolisk natriumhydroxid, der er kølet ned til +5 °C. Efter 1 time ved almindelig temperatur fortyndes med vand, der ekstraheres med methylenchlorid, og man opnår efter vask 2,28 g af en inddampningsrest i form af 35 et skum (kvantitativt rå-udbytte).

DK 167149 B1 13 I et bad af is og salt køles til -15 °C en opløsning af 2,18 g af det ovenfor nævnte reaktionsprodukt i 12 ml py-ridin. Der tilsættes 0,55 g eddikesyreanhydrid, og man lader temperaturen stige til omgivelsernes temperatur 5 uden udtagning fra badet og i løbet af 2 timer. Derpå gennemføres to tilsætninger af eddikesyreanhydrid på hver 0,16 g og ved -15 °C, idet man lader temperaturen stige imellem hver tilsætning.

10 Der tilsættes 120 ml vand. Man ekstraherer med benzen, og vasker med 5% vandig opløsning af citronsyre og derpå med vand.

Det således opnåede råprodukt kromatograferes over en si-15 liciumoxidsøjle; man anvender som elueringsmiddel en blanding af dichlormethan og methanol (98/2) for at adskille, efter omkrystallisation med en blanding af benzen og isopropylether, 1,23 g 20-acetyl-14/)-formylamino-2l-nor-50-30,20-pregnandiol (udbytte 60%).

20

Til .en opløsning af 0,60 g af det ovenfor omtalte reaktionsprodukt og 1,16 g acetyl-3-0-benzyl-2,4,6-tridesoxy- 4-trifluoracetamid-e,Ø-L-lyxohexopyranosid i 80 ml af en blanding af lige dele benzen og methylenchlorid sætter 25 man 0,5 g tør p-toluensulfonsyre, og man lader henstå under omrøring ved omgivelsernes temperatur i 3 timer, hvorpå man tilsætter en mættet vandig natriumhydrogencar-bonatopløsning og ekstraherer med methylenchlorid. Det opnåede råprodukt (1,66 g) kromatograferes over 50 g si-30 liciumoxid Merck® H60 (elueringsmiddel: hexan/acetone 3/1) og fører til 0,84 g af en blanding af de e- og 0-L-anomere. Ved omkrystallisation fra blandingen af acetone og hexan udskiller man 0,50 g af den rene a-L-anomere.

35 Den α-L-anomere bringes i opløsning i 24 ml methanol, man tilsætter 6 ml 5 N natriumhydroxid og opvarmer under tilbagesvaling i 1 time. Man fortynder med vand og ekstrahe- DK 167149 B1 14 rer med chloroform. På denne måde fjernes beskyttelsesgrupperne, og man opnår 0,36 g af det ønskede reaktionsprodukt, som udkrystalliserer fra en blanding af methanol og ether.

5

Smeltepunkt = 219-220 °C

/aD/ = -91 0 (c=l, CHClg) NMR spektrum (CDCl^) 10 6 = 0,93 (CH3-19) 1,00 (CH3-18) 1,17 (CHg-6') 4,91 (H-l') ppm.

EKSEMPEL 5 15 3-0-( Ø-D-digitoxosyl )-140-amino-50-30, 20 a-pregnandiol

Idet man følger den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1, behandler man med eddikesyreanhydrid 1,7 g 140-amino-50-30,20a-pregnandiol, hvorpå man omsætter det 20 således opnåede reaktionsprodukt (ikke krystalliseret) med. trifluoreddikesyreanhydrid til dannelse af 2,4 g 20-0-acetyl -14 0-1ri f luor acetamid- 5 0-30,20 a-pregnandiol, som udkrystalliserer fra en blanding af ether og hexan.

25 Idet man går frem analogt med eksempel 1 omsætter man 1,1 g tri-O-acetyl-digitoxose med 0,9 g af det ovenfor beskrevne reaktionsprodukt i 120 ml benzen i nærvær af 0,8 g tør p-toluensulfonsyre.

30 Efter vask og ekstraktion og påfølgende behandling med natriumhydroxid under opvarmning til tilbagesvaling og påfølgende oprensning opnår man 0,35 g af den Ø-D-anomere såvel som 0,26 g af den α-D-anomere, der begge udkrystalliserer fra en blanding af methanol og diethylether.

35 15 DK 167149 B1

Smeltepunkt = 208 °C (0-D-anomere) /«D/ = -26 0 (c=l, CHC13) 5 EKSEMPEL 6 3-0-(α-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-50-30,20a-pregnandiol

Man går frem analogt med eksempel 5, idet man erstatter 10 tri-O-acetyl-digitoxose med 2,3,4-tri-O-acetyl-a-L-rham- nosylbromid i acetonitril i nærvær af mercuricyanid.

Efter 1 times omsætning ved omgivelsernes temperatur, fortynding med methylenchlorid og vask med en mættet na-15 triumhydrogencarbonatopløsning opnår man 30-(2,3,4-tri-0- acety1-a-L-rhamnopyranosy1)-20-0-acetyl-140-trifluoracet-amid-50-30,20a-pregnandiol, som man renser ved kromato-grafering over en siliciumoxidsøjle.

20 Til ovennævnte produkt opløst i methanol sættes 5 N natriumhydroxid, og der opvarmes til tilbagesvaling i 8 timer. Efter fortynding med vand og ekstraktion med methylenchlorid opnår man 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-50,20a-pregnandiol, der udkrystalliserer fra en blanding 25 af ethanol og diethylether.

Smeltepunkt = 265 °C

/aD/ = -49 0 (c=0,8, CHCl3/MeOH 80/20) 30 NMR spektrum (CDC13 + CD^O) 6 = 0,96 (CH3-19) 1,00 (CH3-18) 1,06 (CH3-21) 1,28 (CR^-6') 4,90 (H-l*) ppm.

35 DK 167149 B1 16 EKSEMPEL 7 3-0-( a-L-rhamnopyr anosy 1 )-14 5-amino-5 5-3 5,205- pregnandiol 5 Idet man går frem analogt med eksempel 1 fremstiller man 20-acetoxy-145-trif luoracetamid-55-35,20/)-pregnandiol, idet man omsætter eddikesyreanhydrid og derpå trifluored-dikesyreanhydrid med 145 -amino-5/5-3/5,20/)-pregnandiol.

10 Man omsætter det således opnåede reaktionsprodukt med 2,3,4-tri-O-acetyl-a-L-rhamnosylbromid i acetonitril i nærvær af mercuricyanid i overensstemmelse med den koblings-fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 2. Efter behandling med natriumhydroxid i methanol under opvarm-15 ning til tilbagesvaling opnår man 3-0-(a-L-rhamnopyrano-syl)-145-amino-55-35,205-pregnandiol, som udkrystalliserer fra ethanol.

Smeltepunkt = 263-264 °C

20 /«D/ = -52 0 (c=0,7, CHClg/MeOH 80/20) NMR spektrum (CDClg + CD^O) δ = 0,95 (CH3-19) 1,16 (CH3-18) 1,30 (CH3-21) 1,30 (CHg-6') 4,83 (H-l’) ppm.

25 EKSEMPEL 8 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-145-amino-35,20a-pregnandiol 30 Man går frem analogt med eksempel 6, idet man dog erstatter 145-amino-55-35,20a-pregnandiol med den isomere 145-amino-35,20a-pregnandiol, hvori protonet i 5-stillingen indtager konfigurationen 5a, og idet man gennemfører koblingsreaktionen med 2,3,4-tri-0-acetyl-a-L-rhamnosylbro-35 mid under de samme reaktionsbetingelser.

17 DK 167149 B1

Efter behandling med natriumhydroxid i opløsning i methanol under opvarmning til tilbagesvaling opnår man 30-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-30,20a-pregnandiol, som udkxystalliserer fra blandingen ethanol og ether.

5

Smeltepunkt = 271 °C

NMR spektrum (CDCl^ + CD^O) 6 = 0,78 (CH3-19) 0,98 (CHg-18) 1,03 (CHg-21) 1,25 (CHg-10 6') 4,76 (H-l') ppm.

EKSEMPEL 9 3-0-(4-amino-2,4,6-tridesoxy-g-L-lyxohexopyranosyl)-140-15 amino-50-30,20a-pregnandiol

Man går frem analogt med eksempel 4, idet man dog erstatter 140-amino-21-nor-50-30,20-pregnandiol med 140-amino-50-30,20e-pregnandiol til opnåelse af det ønskede pro-20 dukt, som udkrystalliserer fra blandingen methanol og ethylether.

Smeltepunkt = 224 °C

25 /«D/ = -79 0 (c-1, CHC13) EKSEMPEL 10 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-50-30,120,200-pregnantriol 30

Man sætter 1 ml eddikesyreanhydrid til en opløsning af 50 ml pyridin nedkølet til 0 "C og indeholdende 3,5 g 140-amino-50-30,120,200-pregnantriol, idet man holder reaktionsblandingen under omrøring. Man lader reaktionen fo-35 regå i 30 minutter ved 0 °C under omrøring, hvorpå man tilsætter en isafkølet opløsning af natriumhydrogencarbo-nat. Efter 10 minutters forløb ekstraherer man med methy- DK 167149 B1 18 lenchlorid og fjerner derpå opløsningsmidlet ved afdampning.

På denne måde opnås 3,7 g 20-0-acetyl-140-amino-50-5 30,120,205-pregnantriol, som man kan rense ved omkrystal lisation.

Det ovenfor beskrevne reaktionsprodukt opløses i 100 ml methylenchlorid ved 0 °C, hvorpå man tilsætter 3,5 ml 10 triethylamin og 3,1 ml trifluoreddikesyreanhydrid. Man holder reaktionsblandingen under omrøring i ca. 20 minutter, hvorpå man fjerner opløsningsmidlet ved afdampning.

Den således opnåede inddampningsrest renses ved genopløs-15 ning i methy lenchlorid, hvorpå man vasker med en opløsning af natriumhydrogencarbonat, idet man følger de sædvanlige fremgangsmåder. Efter opløsning i methanol og passage igennem en kolonne med harpiks "IR 45", opnår man 4,6 g 20-0-acetyl-140-trifluoracetamid-50-30,120,200-20 pregnantriol.

Man sætter 1,9 g mercuricyanid til en opløsning af 3 g af det ovenfor opnåede derivat og 2,7 g 2,3,4-tri-0-acetyl-L-rhamnosylbromid i 160 ml acetonitril. Efter 1 times om-25 røring ved omgivelsernes temperatur fortyndes med methy- lenchlorid, og man ekstraherer under vask med en mættet opløsning af natriumcarbonat. Efter kromatografering over siliciumoxid Merck® H60 under anvendelse som eluerings-middel af en blanding af methylenchlorid og methanol 30 (98,5/1,5) opnår man 3 g 3-0-(2,3,4-tri-0-acetyl-a-L- rhamnopyranosyl) -20-0-acetyl-140-trif luoracetamid-50-30, -120,200-pregnantriol.

Det således opnåede produkt opløses i 60 ml methanol, og 35 der tilsættes 6 ml 10 N natriumhydroxid. Man opvarmer til tilbagesvaling i 6 timer, hvorpå man fortynder med vand og ekstraherer med methylenchlorid. På denne måde opnås 1 19 DK 167149 B1 g 3-0-(a“L-rhamnopyranosyl)-140-ainino-50-30,120,200-preg-nantriol i rå tilstand, som man renser ved kromatografe-ring over siliciumoxid Merck® H60, idet man som elue-ringsmiddel anvender en blanding af methylenchlorid, me-5 thanol og ammoniak (80/20/2).

Man fremstiller det tilsvarende hydrogenchloridsalt ved indvirkning af koncentreret hydrogenchlorid i methanolisk opløsning. Det således dannede reaktionsprodukt frafil-10 treres, opløses i isopropanol og udfældes med ether.

Smeltepunkt = 260 °C

NMR spektrum (CDC13/CD30D 4/1) 15 δ = 0,93 (s, Mel9) 1,06 (s, Mel8) 1,26 (d, j = 7, Me21) 1,27 (d, j = 6, Me6') 3,28 (m, H12) 4,78 (m, Hl') ppm.

EKSEMPEL 11 20 3,12-di-0-( g-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-5iB-3g,12g,20g-pregnantriol

Man sætter 3,2 g mercuricyanid til en opløsning af 3 g 25 20-0-acetyl-140-trifluoracetamid-50-30,120,200-pregnan- triol, der er opnået som beskrevet i eksempel 10, og 4,4 g 2,3,4-tri-O-acetyl-L-rhamnosylbromid i 160 ml acetoni-tril.

30 Man lader reaktionen foregå i 1 time under omrøring ved omgivelsernes temperatur, der fortyndes med methylenchlorid og ekstraheres under vaskning med en mættet natrium-carbonatopløsning. Det således opnåede produkt opløses i 100 ml methanol, og man tilsætter 10 ml 10 N natriumhydr-35 oxid. Der opvarmes til tilbagesvaling i ca. 6 timer, opløsningsmidlet afdampes, og man tilsætter 50 ml vand. Der dannes et bundfald, som frafiltreres og genopløses i en 20 DK 167149 B1 blanding af methylenchlorid og methanol (90/10) -

Efter ekstraktion, tørring og inddampning ifølge sædvanlig fremgangsmåde opnår man 3,1 g af det ønskede reak-5 tionsprodukt, som renses ved omkrystallisation fra absolut ethanol.

Smeltepunkt = 240 °C

10 IR spektrum (Nujol) a = 3440, 3370, 3260, 1620, 1590 cm-1

De eksperimenter, som man har gennemført med 14-amino-steroid-derivaterne med den almene formel (I), har især påvist en positiv inotrop aktivitet såvel som supraven-15 trikulære antiarythmiske egenskaber.

De omhandlede forbindelser udviser ganske særligt en positiv inotrop aktivitet, der er større end eller lig med den aktivitet, som opnås med velkendte referenceproduk-20 ter, såsom ouabain og digoxin.

Den inotrope aktivitet er blevet verificeret på marsvins isolerede hjerteforkamre under sædvanlige forsøgsbetingelser, idet man registrerede størrelsen af kontraktio-25 nerne ved forskellige indgivne doser i forhold til kontrolværdierne .

I efterfølgende tabel 1 er vist forøgelsen af kontraktions-kraften som en funktion af koncentrationen for dio-30 goxin (sammenligningsforbindelse) samt for sådanne af de omhandlede produkter, som er beskrevet i eksemplerne 6 og 7.

35 TABEL 1 21 DK 167149 B1

Størrelsen af kontraktioner i forhold til kontrolværdierne 5

Koncentration (mol/liter)

Forbindelse 2 x 10~^ 10-^ 2 x 10-^ 6 x 10 ® 10 ®

Digoxin +38% +100% +114% +128% +128% 10------

Eksempel nr. 6 - + 43% + 63% +143% +148%

Eksempel nr. 7 +50% + 97% +178% +233% +206%

Herudover blev opnået nedenstående resultater ved yderli-15 gere undersøgelser, hvor marsvineforkamrene blev stimuleret ved 3,3 Hz. Den inotrope virkning (% aktiv kraft) blev målt som en funktion af den indgivne dosis.

20 25 30 35

TABEL 1A

DK 167149 B1 22

Forbin delse fra Dosis (mol/liter) 5 eksempel nr. 2 X 10-7 5 x ΙΟ-7 10-6 5 x 10~6 10"5 5 x ΙΟ-5 10-4 1 31.50 81.80 100.50 77.10 2 8.30 52.00 87.50 79.50 75.00 3 73.60 87.30 10 4 49,00 65,20 104.40 120,80 116.40 5 30,10 84.90 93,70 6 5.90 17.50 39,60 75.20* 18.30 18.30 7 **20,30 45.60 74,30 93.10 118,20 74.80 8 25.00 60,40 67.40 68.60 15 9 46.90 118,60 86,20 79,80

Disse resultater viser, at de omhandlede produkter ved de nævnte koncentrationer fremkalder forøgelse af kontraktions-kraften, som klart er større end forøgelserne, som 20 fremkaldes af digoxin.

De omhandlede 14-aminosteroid-derivater udviser iøvrigt en inhiberingskapacitet for molekylær, membran ATPase som er større end eller lig med den, der udvises af dogixin 25 eller ouabain, som anvendes som referenceforbindelse.

Når man sammenligner de omhandlede forbindelser, som er beskrevet i eksemplerne 2, 6 og 7, med sammenligningsprodukter bestående af quabain og digoxin, opnår man således 30 f.eks. de resultater, som er anført i efterfølgende tabel 2.

I denne tabel er værdierne EDj-q den dosis, som fremkalder 50%'s inhibering af membran-ATPase.

35 TABEL 2 DK 167149 B1 23 ED50 _g

Ouabain 3,6 x 10 M

-9

5 Digoxin 5,3 x 10 M

-10

Eksempel nr. 2 1,3 x 10 M

Eksempel nr. 6 1,8 x 10** M

Eksempel nr. 7 7,0 x 10-11 M

10 De omhandlede forbindelser adskiller sig fra kendte og lignende forbindelser af digitalis-serien såsom digoxin og ouabain ved en fordelagtig nedsættelse af den toxiske virkning.

15 Forbindelsen, der er beskrevet i eksempel 6, muliggør således f. eks., at man på anæstiserede hunde uden tegn på toxicitet opnår en forøgelse af den cardiale kontraktili-tet på 150%, medens man under de samme forsøgsbetingelser med digoxin finder forekomster af toxiske virkninger, når 20 den cardiale kontraktilitet er blevet forøget med ca.

50%.. Derudover er toxiciteten af de omhandlede forbindelser reversibel, dvs., at standsningen af indgiften deraf er tilstrækkelig til, at de forstyrrelser, som man har kunnet iagttage på elektrocardiogrammet, forsvinder.

25

Disse resultater viser, at de omhandlede forbindelser med fordel kan anvendes ved human og veterinær terapi, især til behandling af hjerteinsufficiens.

30 Derivaterne med den almene formel (I) og de farmaceutiske acceptable salte deraf kan indgives på sædvanlige måder, idet den aktive bestanddel fortyndes med et passende udvalgt farmaceutisk acceptabelt bærerstof, f.eks. i form af tabletter, gelatinekapsler, drageer, suppositorier, 35 opløsninger til injektionsbrug eller sirupper.

DK 167149 B1 24

Tabletter kan f.eks. fremstilles ved, at man blander den omhandlede forbindelse med den almene formel (I) eller et salt deraf med et eller flere faste fortyndingsmidler, såsom lactose, mannitol, stivelse, polyvinylpyrrolidon, 5 magnesiumstearat, talkum etc. Tabletterne kan om ønsket bestå af flere lag, der er anbragt oven på hverandre rundt om en kerne i overensstemmelse med kendt teknik for at sikre en progressiv frigivelse eller en forsinkende virkning af den aktive bestanddel. Overtrækket kan f.eks.

10 bestå af et eller flere lag polyvinylacetat, carboxyl-methylcellulose eller celluloseacetophthalat.

Man har fremstillet tabletter svarende til efterfølgende formuleringer: 15

Tablet A; 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-amino-50~30,120,200-pregnantriol 0,2 mg 20 (hydrogenchlorid)

Strækkemiddel op til 100 mg (Strækkemiddel: stivelse, talkum, lactose, magnesiumstea-25 rat).

Tablet B: 3-0-(a-L-rhamnopyranosyl)-140-30 amino-50-30,200-pregnandiol 0,2 mg

Strækkemiddel op til 100 mg (Strækkemiddel: stivelse, talkum, lactose, magnesiumstea-35 rat).

25 DK 167149 B1

Man kan ligeledes indgive de omhandlede forbindelser i form af en drikkelig sirup eller opløsning, som er opnået ved opløsning af forbindelsen med formlen (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf i f.eks. vand eller i 5 glycerol, og idet man om ønsket tilsætter et af de sædvanlige additiver, såsom et sødemiddel og en antioxidant.

Man kan fremstille opløsninger til injektionsbrug under anvendelse af velkendte fremgangsmåder, og sådanne kan 10 f.eks. bestå af en opløsning indeholdende en af de omhandlede forbindelser med formlen (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf opløst i dobbelt destilleret vand, i vandig-alkoholisk opløsning, i propylenglycol etc. eller i en blanding af disse opløsningsmidler. Man 15 kan om ønsket tilsætte et passende additiv, såsom et konserveringsmiddel .

De doser, der indgives, bestemmes af lægen som en funktion af den valgte indgivningsmetode, af omfanget af den 20 sygdomstilstand, der skal behandles, af behandlingens varighed etc. Doseringerne kan f.eks., når det drejer sig om peroral indgift til mennesker, være på mellem 0,05 og 2 mg/kg, når det drejer sig om en forbindelse, såsom dem, der er beskrevet i eksemplerne 2, 6 eller 7. Doseringerne 25 kan om ønsket være mindre, f.eks., når det drejer sig om forbindelsen beskrevet i eksempel 10, er de fortrinsvis på mellem 0,01 og 0,05 mg/kg.

30 35

Claims

26 DK 167149 B1 Patentkrav :

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 14-amino-3-5 monosaccharidsubstituerede steroid-derivater med den almene formel 1 *2 JL CHROH 10 p ^-r (I) A J NH? H 15 hvori R betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, betegner en monosaccharidrest eller en desoxy-monosaccharidrest, som eventuelt er substi-20 tueret med en amino- eller methoxygruppe, og R£ betegner et hydrogenatom, en hydroxygruppe eller en OR^-gruppe, hvor R^ har den ovenfor angivne betydning, kendetegnet ved, at man 25 a) på i og for sig kendt måde beskytter NH2-gruppen i stilling 14 og OH-gruppen i stilling 20 af et 14-amino steroid-derivat med den almene formel II i'2

30. CHROH (II) Λ.. J NH2 ao 35 „ 27 DK 167149 B1 hvori R har ovenfor anførte betydning, og betegner et hydrogenatom eller en hydroxylgruppe; b) kobler det således beskyttede 14-aminosteroidderivat 5 med et aktiveret monosaccharid med formlen R^OX, hvor R'^ er en monosaccharidrest eller en desoxy-monosac-charidrest, som eventuelt er substitueret med en amino- eller methoxygruppe, idet de funktionelle grupper heri forud er beskyttet på i og for sig kendt måde 10 ved acylering eller benzylering, og X betegner et ha logenatom eller en acetylgruppe og c) på i og for sig kendt måde fjerner de beskyttende grupper. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man tilsætter monosaccharidderivatet med formlen R'^-OX i overskud.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved,- at man har beskyttet Nl^-gruppen i 14-stillingen ved omdannelse til en trifluoracetamidgruppe ved indvirkning af trifluoreddikesyre i nærvær af triethylamin, eller til en formamidgruppe ved indvirkning af eddikesyreanhydrid i 25 myresyre, og ved, at OH-gruppen i 20-stillingen er beskyttet ved acetylering med eddikesyreanhydrid i pyridin. 30 35