DK166154B - Vasopressin- og oxytocin-analoge peptider og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og metalsalte, fremgangsmaade til fremstilling deraf, samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse peptider - Google Patents

Description

i

DK 166154B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte vasopressin-og oxytocin-analoge peptider med psykofarmakologiske egenskaber samt farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og metalsalte heraf, en fremgangsmåde til fremstilling af disse pepti-5 der samt et farmaceutisk præparat, der indeholder disse peptider som den aktive bestanddel.

Både oxytocin og vasopressin er peptider, der ifølge deres hormonale virkninger også beskrives som neuropeptider, nemlig 10 som peptider, der blandt andet påvirker hukommelsesprocesser.

Man har nu fundet peptider, der kun besidder en del af amino-syresekvensen fra oxytocin og vasopressin, og som har en meget stærkere og mere specifik indflydelse på hukommelsesprocesser, 15 mens de hormonale virkninger af oxytocin og vasopressin ikke længere er til stede.

Sådanne peptider, der er afledt af enten vasopressin eller oxytocin, er allerede blevet beskrevet i de hollandske patent-20 ansøgninger nr. 82/03,949 og 82/04,881, der ikke er offentliggjorte. Disse peptider har aminosyresekvensen 4-8 og 4-9 fra oxytocin og vasopressin, bortset fra, at aminosyreresten i stilling 4 er en pyroglutamylrest i stedet for en glutaminyl-rest, og at aminosyresekvensen i stilling 6 er cystin (Cyt).

25

Eftersom fragmentet 5-9 (Cyt^) fra oxytocin ikke var så interessant i visse hukommelsestests, har det hidtil været antaget, at aminosyren i stilling 4 udgjorde et væsentligt bidrag til nævnte virkning på hukommelsesprocesser, og at denne aminosyre 30 derfor ikke kunne udelades.

Det har imidlertid nu overraskende vist sig, at aminosyresekvensen 5-8 (Cyt6) fra oxytocin og vasopressin stadig udviser en mindst lige så stærk indflydelse på hukommelsen som de 35 ovennævnte (længere) fragmenter.

Den foreliggende opfindelse angår derfor peptider, som er ejendommelige ved den almene formel: 2

DK 166154B

R

X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-A-Y I

5 hvori A betegner aminosyreresten Arg, Lys eller Leu, og R be-

I I

tegner gruppen X-L-Cys-Y eller X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-A-Y, hvor X er H eller acyl, hidrørende fra en alifatisk carboxylsyre, der har 1-6 C-atomer, og Y er OH, NH2, NHR*, NR*2 eller OR', 10 hvor hver R' er alkyl med 1-6 C-atomer, og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og metalsalte.

Disse peptider og peptidderivater ifølge formel I fremstilles på en for peptider sædvanlig måde. En sædvanlig fremgangsmåde 15 til fremstilling af de omtalte forbindelser er at koble de krævede aminosyrer ved hjælp af kondensation enten i den homogene fase eller f.eks. i en såkaldt fast fase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 20 kobler de krævede (om nødvendigt beskyttede) aminosyrer ved hjælp af kondensation enten i den homogene fase eller på en såkaldt fast fase, fjerner de eventuelle beskyttelsesgrupper og om ønsket omdanner det opnåede peptid til et andet derivat med formel I som defineret i krav 1.

25

Kondensationen i den homogene fase kan udføres som følger: a) kondensation af en aminosyre eller et peptid, der har en fri carboxyl gruppe og beskyttede andre reaktive grupper, med 30 en aminosyre eller et peptid, der har en fri aminogruppe og beskyttede andre reaktive grupper, i nærværele af et kondensationsmi ddel, 35 DK 166154Β •'-ίρ-'ΪΓΓ- 3 b) kondensation af en aminosyre eller et peptid, der har en aktiveret carboxylgruppe og eventuelt beskyttede andre reaktive grupper, med en aminosyre eller et peptid, der har en fri ami- nogruppe og eventuelt beskyttede andre reaktive grupper, 5 c) kondensation af en aminosyre eller et peptid, der har en fri carboxylgruppe og beskyttede andre reaktive grupper, med en aminosyre eller et peptid, der har en aktiveret aminogruppe og eventuelt bekyttede andre reaktive grupper.

10

Aktivering af carboxylgruppen kan bl. a. udføres ved at omdanne carboxylgruppen til et syrehalogenid, et azid, et anhydrid , et imidazolid eller en aktiveret ester, såsom N-hydroxy-succini-mid -,Ν-hydroxy-benztriazol-eller p-nitrophenylesteren.

15

Aminogruppen kan aktiveres ved at omdanne den til et phosphit-amid eller ved at anvende "phosphorazo"-metoden.

De mest almindelige metoder til de ovenstående kondensations-2(J reaktioner er : carbodiimid-metoden, azid-metoden, den blandede anhydrid-metode og den aktiverede ester-metode, som beskrevet i "The Peptides", bind I, 1965 (Academic Press) E. Schroder og K.Liibke.

Forbindelserne ifølge formel I kan også fremstilles ved "fast- 2 5 fase"-metoden (Merrifield, J.Amer.Chem.Soc. 85, 2149 (1963)). Koblingen af aminosyrerne i det peptid, der skal fremstilles, starter fra den side, der har carboxylendegruppen. Til denne reaktion er en fast bærer, hvorpå reaktive grupper er til stede eller hvorpå hvilken sådanne grupper kan fæstnes, nødvendig.

3 U

Denne bærer kan f.eks. være en copolymer af benzen og divinyl-benzen, der har reaktive chlormethylgrupper, eller en polymer bærer, der er blevet gjort reaktiv med hydroxymethyl eller benzylamin.

Hvis der f.eks. anvendes en bærer indeholdende chlormethylgrupper ,finder binding af den første α-aminobeskyttede aminosyre til bæreren sted via en esterbinding. Ved syntesen af et 35 4

DK 166154B

peptid ifølge formel I, hvori A betegner L~Leu, giver dette så f.eks. i første omgang: R -N-CH-C-0-CHo-polymer Pi H» 2 ^ 1 5 H 0 ir. fastfasebærer VH2

CH

^ \ CH3 CH3 10 hvori R er en a-aminobeskyttelsesgruppe_

P

Efter fjernelse af gruppen R^ kan den næste a-aminobeskyttede aminosyre (i dette tilfælde prolin, hvori α-aminogruppen er beskyttet) f.eks. kobles på ved hjælp af en kondensationsreaktion, og efter fjernelse af beskyttelsesgruppen fra a-amino-15 gruppen, kan den næste aminosyre kobles på etc. I mange tilfælde er det ønskeligt at anvende et signifikant overskud af hver α-aminobeskyttet aminosyre.

Efter syntese af den ønskede aminosyresekvens frigøres pepti-det fra bæreren ved hjælp af f.eks. HF eller trifluormethan-sulfonsyre. Peptidet kan også fjernes fra bæreren ved transforestring med en lavere alkohol, fortrinsvis methanol eller ethanol, hvorved en lavere alkylester af peptidet dannes direkte.

^ Tilsvarende giver frigørelse med f.eks. ammoniak det C-terminale amidderivat af peptiderne I.

De reaktive grupper, som ikke skal deltage i kondensationsreakt ionen, beskyt tes ved hjælp af grupper, der nemt kan ..fjernes icren, f.eks. ved hydrolyse eller reduktion. En car-30 boxylgruppe kan således beskyttes effektivt ved f.eks. forestring med methanol, ethanol, tetiær butanol, benzylalkohol eller p-nitrobenzylalkohol,*

Grupper, der effektivt kan beskytte en aminogruppe, er sædvanlig-3 5 vis syregrupper, f.eks. en syregruppe hidrørende fra en ali-fatisk, aromatisk eller heterocyklisk carboxylsyre, såsom a-cetyl, benzoyl eller pyridincarboxylgruppen, eller en syregruppe hidrørende fra carbonsyre, såsom ethoxycarbonyl-,benzyloxy- * 5

DK 166154B

carbonyl-, tert-butoxycarbonyl- eller p-methoxybenzyloxycar-bonylgruppen, eller en syregruppe hidrørende fra en sulfon-syre, såsom p-toluensulfonylgruppen, men andre grupper kan også anvendes, såsom substituerede eller usubstituerede aryl- eller 5 aralkylgrupper, f.eks. benzyl og triphenylmethyl,eller grupper såsom ortho-nitrophenylsulphenyl eller 2-benzoyl-l-methylvinyl.

Det tilrådes, at ε-aminogruppen i lysin og guanidingruppen i arginin også beskyttes. Sædvanlige beskyttelsesgrupper i den-ne sammenhæng er en tertiær butoxycarbonylgruppe eller en tosyl (Tos)-gruppe for lysin og en nitrogruppe, Mbs-gruppe, Tosgruppe eller Pms-gruppe for arginin.

Selv om aminosyren cystin kan anvendes i de ovenfor omtalte ^ aminosyrekondensationer, er det ikke desto mindre foretrukket i første tilfælde at anvende aminosyren cystein, hvori thiol-gruppen (-SH) er beskyttet ved hjælp af en sædvanlig SH-beskyt-telsesgruppe, såsom acetamidomethyl eller trityl. Efter at den fuldstændige, ønskede aminosyresekvens (med cysteinyl i stedet ^ for cystinyl) er blevet syntetiseret, kobles thiolgruppen af det cysteinradikal, der er tilstede i peptidet, derpå - eventuelt efter separat fjernelse af thiolbeskyttelsesgruppen -på kendt måde til thiolgruppen af et andet cysteinmolekyle eller til thiolgruppen af et andet molekyle af det samme peptid.

25

Beskyttelsesgrupperne kan afspaltes i overensstemmelse med forskellige sædvanlige metoder, afhængig af naturen af den pågældende gruppe, f.eks. ved hjælp af trifluoreddikesyre eller methansulfonsyre.

30

Med funktionelle derivater af peptiderne ifølge den almene formel I menes: 1. især de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte og me- 35 talsalte af de pågældende peptider 1 N-acylderivater, hidrørende fra en alifatisk carboxylsyre, der har 1-6 carbonatomer, og fortrinsvis eddikesyre, 6

DK 166154B

3. amider eller monoalkyl- eller dialkylsubstituerede amider, hvori alkyl gruppen har 1-6 C-atomer, 4. estere, hidrørende fra alifatiske alkoholer, der har 1-6 C- atomer.

5

Syreadditionssaltene kan opnås direkte ved at isolere pep-tidet fra det ønskede sure medium, eller det opnåede peptid kan efterfølgende omdannes til et syreadditionssalt ved omsætning af peptidet med en syre, såsom HC1, HBr, phorphorsyre, svovlsyre, eddikesyre, maleinsyre, vinsyre, citronsyre eller polyglutaminsyre.

Metalsaltene , nemlig alkalimetalsaltene, opnås ved at omsætte peptidet med den ønskede metalbase, såsom NaOH, Na2CC>2, NaHCO^ l5 etc. eller, ved "fastfase"-metoden,ved at frigøre peptidet fra den faste bærer med et alkalimetalhydroxid.

N-acyIderivater, hvormed især menes de N-terminale acylderi-vater, fremstilles fortrinsvis under anvendelse af en amino-20 syre, der allerede er forsynet med den ønskede acylgruppe.

Denne acylgruppe virker derpå også som en beskyttelsesgruppe under peptidsyntesen. På denne måde fremstilles det ønskede acyIderivat direkte. Det er imidlertid også muligt at indføre den Ønskede-acylgruppe efter peptidsyntesen ved at acylere 25 peptidet på sædvanlig måde.

Den foretrukne N-acylgruppe er acetylgruppen.

Estere og amider af peptiderne ifølge formel I fremstilles 30 fortrinsvis under anvendelse (ved peptidsyntesen ifølge den homogene kondensationsmetode) af en aminosyre, der allerede er forsynet med den ønskede ester- eller amidgruppe. De kan imidlertid også fremstilles ved efterfølgende af forestre det opnåede peptid, eller ved at omdanne det til et amid, 35 hvor disse reaktioner udføres på sædvanlig måde. Ved "fast-fase"-metoden, kan estere opnås ved transforestring af peptid-f astfasekombinationen, og amiderne kan opnås ved behandling med ammoniak.

•rrgfls::"' 7

DK 166154B

Der anvendes fortrinsvis de lavere, alifatiske estere, hidrørende fra en alkanol, der har 1-6 C-atoxner, såsom methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, sec.-butyl-, pentyleller hexylesteren.

5

De amider, der fortrinsvis anvendes, er det usubstituerede amid, monomethylamidet, dimethylamidet, monoethylamidet eller diethylamidet.

10

Peptiderne ifølge opfindelsen har, som allerede nævnt ovenfor, en psykofarmakologisk virkning og udviser især en indflydelse på hukommelsesprocesser. Denne indflydelse er udtalt og er overraskende stærkere end den fra kendte neuropeptider, såsom oxytocin og vasopressin.

15

Peptider ifølge den foreliggende opfindelse, hvor A betegner L-Lys eller L-Arg,fremmer kraftigt konsolideringen og generhvervelsen af hukommelsen og kan sædvanligvis anvendes i tilfælde, hvor en stimulering af hukommelsesprocesser (eller den 20 mentale ydeevne er ønsket, såsom ved behandling af depressioner, men især ved behandling af forstyrrelser i indlæringsprocesser og hukommelsesprocesser, såsom de, der f.eks. kan forekomme i alderdommen (senilitet).

25

Peptider ifølge opfindelsen, hvori A betegner L-Leu,hæmmer konsolideringen og generhvervelsen af hukommelsen. Disse peptider bør almindeligvis anvendes i tilfælde, hvor en hæmning af centralnervesystemet og især af indlærings- og hukommelsesprocesser er ønskelig. De kan sædvanligvis anvendes som f.eks.

30 sedativer og mere specielt ved behandling af tvangsneuroser.

Peptider med formlen X, der foretrækkes, er de, hvor Asx betegner asparaginyl.

35 8

DK 166154B

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder peptidet som aktiv bestanddel i blanding med en bærer, der er egnet til farmaceutisk administration.

5

Peptiderne ifølge opfindelsen kan administreres oralt, rektalt, parenteralt, sublingualt eller intranasalt. Parenteral og intranasal administration er særlig foretrukket, idet absorptionen af peptidet i disse tilfælde er størst. Til dette 1 o formål blandes peptiderne fortrinsvis med farmaceutxsk acceptable hjælpestoffer, der gør peptiderne egnede til parenteral eller intranasal administration, hvilket resulterer i opløsninger, suspensioner (evt. via mikro-indkapsling), emulsioner og sprays.

15

Blandet med egnede hjælpestoffer eller fyldstoffer kan de omtalte peptider også anvendes i en form, der er egnet til oral administration, såsom piller, tabletter og coatede tabletter. De omtalte peptider kan også administreres i form 20 af en stikpille.

Peptiderne eller peptidderivaterne ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis i en dosis fra 1 ng til 5 jig pr. kg legemsvægt pr.

dag til parenteral eller intranasal administration. Den anbe-25 falede dosis til human administration er mellem 1 og 100 jug pr. dag. Til oral og rektal administration er dosen sædvanligvis en faktor 10-100 gange højere.

Med hensyn til eksemplerne bør følgende bemærkes.

30 I. Hvor der ikke er angivet nogen optisk konfiguration menes L-formen.

II. De følgende forkortelser anvendes for de anvendte beskyttelses- eller aktiveringsgrupper:

Scm =S-carbomethoxysulphenyl tBu =tertiær butyl 35 9

DK 166154B

Boc =tertiær butoxycarbonyl

Mbs =4-methoxybenzensulphonyl

Pxns =pentamethylbenzensulphonyl

Me =methyl g Trt =trityl III. De følgende forkortelser anvendes for de anvendte opløsningsmidler eller reagenser:

EtOH = ethanol 10 BuOH = butanol

Py = pyridin HOAc = eddikesyre t.BuOH = tert.-butanol

MeOH = methanol 15 DMF = dimethylformamid THF = tetrahydrofuran DCC = dicyclohexylcarbodiimid DCU = dicyclohexylurinstof TFA = trifluoreddikesyre 20 To = toluen HOBt = N-hydroxybenzotriazol IV. De følgende forkortelser anvendes for aminosyregrupperne: 25 Lys = ^Y1

Arg = arginyl

Pro = prolyl

Cys = cysteinyl

Asx = aspartyl eller asparaginyl 30 Asp = aspartyl

Asn = asparaginyl

Cyt = cystinyl

Leu - leucyl 35 Eksempel 1 1. Boc-Asn-Cys(Trt)-Pro-Arg(Mbs)-OtBu.

3,00 g (3,56 mmol) Η-Cys(Trt)-Pro-Arg(Mbs)-OtBu og 0,83 g (3,56 mmol) Boc-Asn-OH blev opløst i 30 ml DMF og afkølet 10

DK 166154B

til -20°C. Ved denne temperatur tilsattes 0,58 g (4,27 mmol) HOBt og 0,81 g (3,92 mmol) DCC,og blandingen blev omrørt i en time. Derefter omrørtes i yderligere en time ved 0 C og natten over ved stuetemperetur, hvorefter det dannede DCU 5 blev frafiltreret. Filtratet blev inddampet og resten opløst i 100 ml af en 3:2 methylenchlorid/2-butanolblanding. Derpå blev opløsningen ekstraheret successivt med 3 x 30 ml 5%

NaHC03-, 3 x 30 ml 5% KHSC>4- og 3 x 30 ml 30% NaCl-opløsninger.

Det organiske lag blev tørret med Na2S04 og peptidet blev ud-10 fældet ved tilsætning af ether.

Udbytte: 3,25 g. Rf er 0,22 i en 8:2 To:EtOH-blanding.

[a]p°= -1,9° (c = 1, DMF) .

15 2. Boc-Asn-Cys(Scm)-Pro-Arg(Mbs)-OtBu.

3,00 g (2.84 mmol) Boc-Asn-Cys (Trt)-Pro-Arg(Mbs)-OtBu (1) blev opløst i en blanding af 10 ml methanol og 50 ml methylen-chlorid. 0,4 ml Scm-chlorid blev tilsat under omrøring/og ef-20 ter 5 minutter blev stoffet udfældet med ether. Bundfaldet blev frafiltreret og derpå vasket med ether og tørret.

Udbytte: 2,56 g, [a]^° = -66,9° (c = 1, DMF).

Rf = 0,17 i en 8:2 To:EtOH-blanding.

25 H-Cys-OH

3. Boc-Asn-Cys-Pro-Arg(Mbs)-OtBu.HC1.

2,40 g (1,47 mmol) af det i 2. opnåede peptid, i 200 ml ethanol, blev anbragt i en kolbe indeholdende 650 mg (3,71 mmol) H-Cys-30 OH.-HCl.I^O i 10 ml methanol under nitrogen og under omrøring .Blandingen blev derpå omrørt i yderligere 40 minutter. Opløsningen blev inddampet, og peptidet blev udfældet med ether. Det dannede bundfald blev derpå frafiltreret og tørret. Udbytte: 2,48g. Peptidet blev derpå opløst i en 2:3-blanding af 2-butanol/methy-3 5 lenchlorid ,og opløsningen blev ekstraheret med vand. Peptidet i det organiske lag blev udfældet, og bundfaldet blev frafiltreret og tørret. Udbytte: 850 mg.

Rf er 0,52 i en 70:30:5 methylenchlorid:methanol:vand-blanding.

11

DK 166154B

H-Cys-OH

4. H-Åsn-Cys-Pro-Arg-OH.

850 mg (0,88 mmol) af det i 3. opnåede peptid blev opløst i en blanding af 15 ml TFA og 2,2 ml (35,2 mmol) MSA og 0,2 5 ml thioanisol,og opløsningen blev omrørt i 5 timer. Reaktionsblandingen blev hældt i ether, og det dannede bundfald blev frafiltreret og vasket med ether. Derefter blev bundfaldet opløst i en 1:1 tert.-butanol/vand-blanding, underkastet udbytning på en ionbytter i acetatform og frysetørret. Udbytte: 10 639 mg. Stoffet blev derpå oprenset ved hjælp af en silicagel- kolonne, under anvendelse af butanol/eddikesyre/vand (2:1:1) som elueringsmidlet. Udbytte:315 mg.

[a]p° = -136,3°, (c = 0,25, 10% HOAc).

15 Eksempel 2 1. Boc-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-OtBu.

2,50 g (2,86 mmol) Trt-Cys(Trt)-Pro-Leu-OtBu blev opløst i 20 25 ml eddikesyre, hvorpå der blev tilsat 2,5 ml vand.

Blandingen blev derpå omrørt i en time, hvorefter der blev tilsat 10 ml vand, og det dannede bundfald blev frafiltreret. Den opløsning, der blev tilbage, blev derefter inddampet og resten opløst i ethylacetat, hvorpå opløsningen blev vas-25 ket med 3 x 50 ml 5% NaHCO^- og 3 gange med en mættet NaCl-opløs-ning. Det organiske lag blev tørret og derpå inddampet. Resten blev opløst i 25 ml DMF, hvorpå der blev tilsat 655 mg (2,86 mmol) Boc-Asn-OH. Blandingen blev afkølet til -15°C, hvorpå der blev tilsat 464 mg (3,43 mmol) HOBt og 651 mg (3,15 mmol) 30 DCC i rækkefølge. Efter at blandingen var blevet omrørt i nogen tid, blev den afkølet yderligere til -25°C, hvorefter DCU blev frafiltreret og opløsningen inddampet. Resten blev opløst i 50 ml ethylacetat og vasket med 3 x 25 ml 5% NaHC03~opløsning, 3 x 25 ml 5% KHSO^-opløsning og 3 x 25 ml mættet NaCl-opløsning. 35 Det organiske lag blev derpå tørret over Na2S04 og inddampet.

Efter at resten varblevet opløst i ether, udkrystalliserede pep-tidet. Disse krystaller blev derpå frafiltreret og tørret.

DK 166154B

12

Udbytte: 1,64 g. Smeltepunkt 127-128°C, [ajp° = -18,1° (c = 1, DMF).

2. Boc-Asn-Cys(Scm)-Pro-Leu-OtBu.

5 1,50 g (1,78 mmol) af det i 1. opnåede peptid blev opløst i 10 ml methylenchlorid, hvorpå der blev tilsat 0,3 mml Scm-chlorid. Efter at blandingen var blevet omrørt i 5 minutter, blev det dannede bundfald frafiltreret, vasket med ether og 10 tørret. Udbytte 0,95 g. [a]^ = 103,8° (c = 1, DMF), smeltepunkt 123°C (dekomponering).

H-Cys-OH

3. Boc-Asn-Cys-Pro-Leu-OtBu.HCl.

15 500 mg (0,71 mmol) af det i 2. opnåede peptid blev opløst i 10 ml trifluorethanol, hvorpå 249 mg (1,42 mmol) cystein. H2O.HCI i 1 ml methanol blev tilsat til denne opløsning. Efter omrøring i 4 timer blev opløsningen inddampet,og resten blev 20 omrørt med ether.

Udbytte : 600 mg.

H-Cys-OH

4. H-Asn-Cys-Pro-Leu-OH.

25 600 mg (0,71 mmol) af det i 3. opnåede peptid blev opløst i 10 ml TFA med en styrke på 90%, og opløsningen blev omrørt i 45 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev hældt ud i ether, og det dannede bundfald blev frafiltreret, vasket med 30 ether og tørret. Dette bundfald blev opløst i vand og blev underkastet udbytning på en ionbytter i acetatform og derpå frysetørret. Dette frysetørrede materiale blev oprenset ved modstrømsfordeling (system: BuOH/HOAc/vand (4:1:5)). Det således opnåede stof blev yderligere renset på en silicagelkolonne.

35 Udbytte: 200 mg.

Rf = 0,18 i BuOH/Py/HOAc/vand (8:3:1:4)).

5 13

DK 166154B

Eksempel 3

H-Cys-OH

i

H-Asn-Cys-Pro-Lys-OH

blev fremstillet på en måde, svarende til eksempel 1, og H-Cys-OH

H-Asn-Cys-Pro-Leu-OMe 10

H-Cys-OH

H-Asn-Cys-Pro-Leu-NH2 blev fremstillet på en måde, svarende til eksempel 2.

15

Eksempel 4 1. (Boc-Asn-Cys-Pro-Leu-OtBu) 20 500 mg (0,58 mmol) Boc-Asn-Cys-(Trt)-Pro-Leu-OtBu (eksempel 2.1) blev opløst i 127 ml af en 0,005 molær opløsning af jod, og blandingen blev omrørt i en time. Derpå blev der tilsat tilstrækkeligt 1 N natriumthiosulfat til at forårsage, at den brunrøde farve forsvandt. Efter tilsætning af 0,7 ml 1 N NaOH 25 og 150 ml vand dannedes et bundfald, og dette blev frafiltreret. Resten blev opløst i methylenchlorid, hvorpå den blev udfældet igen med ether/hexan (1:1), frafiltreret og tørret. Udbytte: 310 mg.

Rf = 0,70 i methylenchlorid:MeOH:vand (70:30:5) på Si02· 30 2. (H-Asn-Cys-Pro-Leu-OH)2.

300 mg (0,24 mmol) af det i 1. opnåede peptid blev opløst i 10 ml 90% TFA-opløsning, og opløsningen blev omrørt i en time. Den 35 blev hældt ud i ether ,og det dannede bundfald blev frafiltreret.

14

DK 166154B

Dette bundfald blev genopløst i vand, hvorpå opløsningen blev behandlet med en ionbytter i acetatform. Derpå blev opløsningen yderligere renset over en siIcagelkolonne, under anvendelse af BuOH:Py:HOAc:vand (8:3:1:4) som elueringsmidlet.

5 Udbytte: 105 mg.

Rf i det ovennævnte opløsningsmiddel (elueringsmidlet) = 0,18 på Si02· 10 Eksempel 5

Det i eksempel 1.1. opnåede peptid blev behandlet med jod på den i eksempel 4.1 beskrevne måde, hvorpå peptidet (H-Asn-Cys-15 Pro-Arg-0H)2 blev opnået på samme måde som beskrevet i eksempel 1.4.

Rf i BuOH:HOAc:vand (1:2:1) = 0,20 på Si02.

Følgende blev fremstillet på tilsvarende måde:

20 I

(H-Asn-Cys-Pro-Lys-OH)2, (H-Asn-Cys-Pro-Leu-OMe)2 og

25 I

(H-Asn-Cys-Pro-Leu-NH2)2.

Eksempel 6 30 Til belysning af virkningen af peptiderne ifølge opfindelsen udførtes følgende adfærdsforsøg.

35

DK 166154 B

15

Adfærdsforsøg Passiv afværqeadfærd.

5 Hanrotter af en indavlet stamme (CPB-TNO, Zeist, Holland) med en vægt på 140-160 g blev holdt under standardbetingelser (stuetemperatur, 22 ± 1°C, lys tændt fra kl. 5.00 til kl.

19.00) og huset i grupper på fem med vand og føde ad libitum. Forsøgene udførtes i lyddæmpede rum mewllem kl. 9.00 og 17.00.

10

Dyrene blev trænet i et passivt afværgeforsøg med et-forsøgs-indlæring og af typen "step-through". Forsøgsapparatet bestod af en oplyst platform forbundet til et stort, mørkt rum, der var udstyret med et gittergulv. Efter tilvænning til det mørke 15 rum (2 min.), placeredes rotterne på platformen og fik lov til at gå ind i det mørke rum. Fordi rotter foretrækker mørke frem for lys, går de normalt ind i løbet af 15 sek. Næste dag efter yderligere tre forsøg leveredes et uundgåeligt fodchok (0,25 mA, 2 sek.) gennem gittergulvet i det mørke rum (betingnings-20 forsøg). Rotterne blev fjernet fra chokkassen 10 sek. efter afslutning af fodchokket. Passiv afværgelatenstid blev målt 24 og 48 timer efter betingningsforsøget (retentionsforsøg), idet rotten blev placeret på platformen, hvorefter latenstiden for indtræden i det mørke rum måltes i en periode på maksimalt 300 25 sek. For at vurdere peptidernes indflydelse på konsolideringsprocesser injiceredes peptiderne umiddelbart efter indlæringsforsøget ("postindlæringsbehandling"), medens deres indflydelse på generhvervelsesprocesser bestemtes ved injektion 1 time før den første retentionsrække (præretentionsbehandling). For 30 at vise OXT-fragmenters svækkende virkning var chokintensiteten i forsøg med disse peptider 0,50 mA for at inducere længere afværgelatenstider under retention.

Resultaterne af forsøget er vist i nedenstående tabeller.

35 16

DK 166154B

Tabel 1

Virkning af forskellige AVP-fragmenter, injiceret subkutant i forskellige doser, på afværgeadfærd 5

Behandling Dosis13 Efter Præretention

Afværge- indlæring passiv adfærd3_p assiv_ 10 AVP-(1-9) Placebo 86c 78c 0,1 110 -d 0,3 177* 103 1 221** 136* 3 300** 176** 15 10 - d 282** AVP-(1-8) Placebo 76 77 0,1 107 103 0,3 146* 142* 1 192** 240** 20 3 232** 300** AVP-(3-9) Placebo 77 81 0,3 80 -d 1 131* 116 3 220** 180* 25 10 - d 232** AVP-(4-9) Placebo 79 88 0,01 124 -d 0,03 179* 103 0,1 240** 142* 30 0,3 300** 264** 1 - d 300** AVP-(4-8) Placebo 80 80 0,01 120 -d 0,03 141* 103 35 0,1 251** 155* 0,3 300** 182** 1 - d 274**

DK 166154 D

17 AVP-(4-7) Placebo 74 73 0,3 73 -d 1 130 60 3 156* 81 5 10 171* 109 AVP-(5-9) Placebo 81 77 0,01 - d 93 0,03 102 150* 0,1 146* 243** 10 0,3 180** 300** 1 263** -d AVP-(5-8) Placebo 83 73 0,003 110 -d 0,01 148* -d 15 0,03 230** 91 0,1 300** 132* 0,3 300** 171* 1 - d 238** 3 - d 300** 20 AVP-(6-8) Placebo 72 81 3 83 78 10 112 117 a Peptider eller placebo administreredes subkukant umiddelbart efter betingningsforsøget (passiv afværgeadfærd, chok: 25 0,25 mA, 2 sek.) eller 1 time før det første retentionsforsøg for passiv afværgeadfærd (præretention). Grupper på 5 til 11 rotter injiceredes med peptid, og grupper på 12 til 21 rotter med placebo.

b Mængde injiceret per dyr.

3° c Middelafværgelatenstid (sek.) for det første retentionsforsøg (24 timer). d - ikke bestemt.

* Forskellig fra placebobehandlede kontroller (*P<0,05; **p<0,02).

Som det fremgår af tabel 1, var det mest potente fragment til at lette passiv afværgeadfærd efter behandling efter indlæring 35

DK 166154 B

18 AVP-(5-8), der var signifikant mere potent end AVP-(l-9), AVP-(1-8), AVP-(3-9) og AVP-(5-9). Peptidet AVP-(5-8) var også det korteste aktive fragment, idet AVP-(4-7) og AVP-(6-8) viste sig at være inaktive.

5

Tabel 2

Virkning af forskellige OXT-fragmenter, injiceret subkutant i forskellige doser, på retention af passiv afværgeadfærd.

10

Behandl inqa_Dosisb_Efter indlæring_Præretention ug 0XT-(1-9) Placebo 171c 185c 0,3 110 120 15 1 46* 53* 3 63* 71* OXT-(1-8) Placebo 171 185 0,3 120 112 1 51* 62* 20 3 83* 85* OXT-(3-9) Placebo 159 172 1 106 123 3 46* 65* OXT-(4-9) Placebo 163 165 25 0,1 109 116 0,3 50* 51* OXT-(4-8) Placebo 163 182 0,1 119 93 0,3 57* 54* 30 OXT-(5-9) Placebo 156 165 0,03 -d 91 0,1 -d 58* 0,3 157 34* 1 110 -d 35 3 72* -d OXT-(5-8) Placebo 172 167 0,1 101 -d

Claims (6)

20 Patentkrav.

1. Peptid, kendetegnet ved den almene formel:

25 R X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-A-Y I hvori A betegner Arg, Lys eller Leu, og R betegner gruppen 30 I .I X-L-Cys-Y eller X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-A-Y, hvor X er H eller acyl, hidrørende fra en alifatisk carboxylsyre, der har 1-6 C-atomer, og Y er OH, NH£, NHR', NR'2 eller OR', hvor hver R' er alkyl med 1-6 C-atomer, og deres farmaceutisk acceptable syre-35 additionssalte og metalsalte.

2. Peptid ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved formlen: DK 166154 B Ri X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-Leu-Y

3. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved formlen: R2 X-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-Arg(el ler L-Lys)-Y 15 hvori R2 betegner gruppen H-L-Cys-OH eller gruppen H-L-Asx-L- Cys-L-Pro-L-Arg(el ler L-Lys)-0H, og X og Y har de i krav 1 de-20 finerede betydninger.

4. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder peptidet ifølge krav 1 som aktiv bestanddel i blanding med en bærer, der er egnet til farmaceutisk administra- 25 tion.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man kobler de krævede (om nødvendigt beskyttede) aminosyrer ved hjælp af kondensation enten 30. den homogene fase eller på en såkaldt fast fase, fjerner de eventuelle beskyttelsesgrupper og om ønsket omdanner det opnåede peptid til et andet derivat med formel I som defineret i krav 1.

5. I hvori Ri betegner H-L-Cys-OH eller gruppen H-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-Leu-OH, og X og Y har de i krav 1 definerede betydninger.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at beskyttelsesgruppen (-grupperne) og/eller den fastfasebæ-rer, der er til stede i et peptid med den almene formel: DK 166154B R B-L-Asx-L-Cys-L-Pro-L-Ai-Q 5 hvori R har den ovenfor angivne betydning, B betegner hydrogen, en N-acyl (1-6 C)-del eller en N-beskyttelsesgruppe, Q betegner hydroxy, acyloxy (1-6 C), en eventuelt mono- eller dialkyl(l-6C)substitueret amidgruppe, en O-beskyttelsesgruppe 10 eller en fastfasebærer og Al har de samme betydninger som A, men desuden kan betegne en e-beskyttet lysylgruppe eller guanidinbeskyttet arginylgruppe, med den forudsætning, at såfremt Q ikke betegner en fastfase-bærer, må der mindst være én beskyttelsesgruppe til stede (en-15 ten i B, Q eller Al), fjernes, hvorpå det opnåede peptid om ønsket omdannes til et andet derivat deraf med formel I som defineret i krav 1. 20 25 30 35